WO2003087826A1 - Procede d'analyse de molecule et analyseur de molecule - Google Patents

Procede d'analyse de molecule et analyseur de molecule Download PDF

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Tohru Natsume
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
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    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells

Definitions

  • the present invention relates to analytical techniques useful in the fields of biochemistry, molecular biology, and the like. Specifically, molecules that are particularly useful for analyzing the sequence and structure of “target molecules” that interact with “detection molecules” immobilized on the detection surface of the sensor chip of the biosensor device in advance. Related to analysis technology.
  • biosensor devices in which a sensor chip having a detection surface portion is incorporated, have become widespread.
  • This biosensor device is currently used to analyze amino acid, peptide, protein, nucleotide, low molecular weight compounds, lipids, and other intermolecular interactions such as antigen-antibody reactions, hybridization, enzyme response reactions, and the like. It is a useful tool for kinetic analysis.
  • the detection surface portion of the sensor chip may be a substance having a functional group (for example, a carboxyl group, an amino group, an aldehyde group, a thiol group, etc.) suitable for immobilizing a molecule for detection, or streptavidin. It has been solid-phased in advance.
  • a functional group for example, a carboxyl group, an amino group, an aldehyde group, a thiol group, etc.
  • the detection molecule immobilized by binding to the detection surface shows a specific interaction if the target molecule is present in the sample solution sent on the detection surface, and binds the target molecule. Will be captured.
  • the biosensor detects the binding and dissociation states of this interaction in real time using principles such as the surface plasmon resonance principle and the crystal oscillator principle.
  • a method has been recently devised in which the target molecule captured by the detection molecule is collected in an extremely small volume of a predetermined solution, and further detailed molecular analysis (for example, mass spectrometry) is performed. ing.
  • a sample solution including target molecules
  • mass spectrometry a method has been recently devised in which the target molecule captured by the detection molecule is collected in an extremely small volume of a predetermined solution, and further detailed molecular analysis (for example, mass spectrometry) is performed. ing.
  • a sample solution including target molecules
  • mass spectrometry mass spectrometry
  • the present invention provides a technique for transferring and collecting target molecules captured on a detection surface of a sensor chip to a membrane, and provides a molecular analysis method and a molecular analysis apparatus using this technique. Aim. Disclosure of the invention
  • the present application describes a molecular transfer procedure for transferring a target molecule, which has interacted with a detection molecule bound to a detection surface of a biosensor device for analyzing an interaction between molecules, to a solid phase.
  • a molecular analysis method devised to include at least.
  • the detection surface portion is removed from the sensor unit and transferred to a predetermined solid phase.
  • transcription broadly means a procedure for transferring or copying a molecule captured on a detection surface to a solid phase which is a transcript, and is not interpreted narrowly.
  • molecular transfer procedure one procedure selected from electrical transfer, pressure transfer, and suction transfer can be adopted, and these procedures may be appropriately combined.
  • the “detection surface” refers to, for example, a process provided on a sensor chip disposed in a sensor unit for detecting an interaction based on the plasmon resonance principle or the crystal oscillator principle and capable of performing an intermolecular interaction. Surface area.
  • a sensor 03 03943 In carrying out the method according to the present invention, a sensor 03 03943
  • the sensor section be configured so that the sensor chip can be attached and detached as easily as possible.
  • the molecular analysis method according to the present invention has a technical idea which is a drastic change from the conventional very general idea of recovering a molecule captured on a detection surface into a liquid phase, and detects a chip of a biosensor device.
  • the theme is to provide a completely novel molecular recovery technology that recovers target molecules captured on the surface by transferring them to a solid phase, especially a membrane.
  • Solid phase includes solids and semi-solids that have at least the property of receiving and retaining target molecules captured on the detection surface.
  • the “membrane body” is a liquid-permeable porous body and includes, for example, a polyvinyl alcohol (PVA) membrane, a nylon membrane, a nitrocellulose membrane, and a membrane filter.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the reason that the membrane is suitable as the solid phase to be transferred is that the detection surface is easily adhered due to the flexibility and the liquid permeability is provided, so that post-treatment such as washing can be suitably performed.
  • employing the molecular transcription procedure of the present invention has the advantage that multiple target molecules can be transcribed, recovered and analyzed separately and simultaneously without mixing, without mixing.
  • the recovery of target molecules captured by each detection molecule on the detection surface is performed using a partitioned flow path system. And it had to be done sequentially and under independent work, which was very time-consuming and time-consuming.
  • the target molecule may be dissociated or denatured during the long-term recovery operation.
  • the molecular transfer procedure of the present invention a plurality of types of target molecules captured on the detection surface can be transcribed and recovered at a time, so that the recovery operation can be completed in a short time without any trouble.
  • the recovery operation does not take much time, there is no problem of dissociation or denaturation of the target molecule.
  • a solution containing a target molecule is brought into contact with a detection surface of a pyrosensor device for analyzing an interaction between molecules.
  • the target molecule captured on the detection surface (the target molecule that has actively reacted with the detection molecule) is transferred to a membrane, and the target molecule transferred to the membrane is placed in a liquid phase using, for example, enzyme digestion. After the elution, the sample solution is analyzed by mass spectrometry.
  • mass spectrometry can identify the molecular species of the target molecule and perform structural analysis. For example, when the target molecule is a protein, the amino acid sequence, phosphorylation state, carbohydrate addition state, and the like are analyzed. When the target molecule is a lipid, the side chain length is analyzed. it can.
  • a target molecule that has interacted with a detection molecule bound to a detection surface of a biosensor device for analyzing an interaction between molecules can be automatically transferred to a membrane.
  • a molecular analysis device provided with at least an automatic molecular transfer means devised as described above.
  • the sensor chip (or the detection surface site) is removed from the biosensor device, and the sensor chip (or the detection surface site) is set at a predetermined location.
  • the detection molecule is automatically transferred to a solid phase, such as a membrane or the like, which is set in advance at a position facing one sensor chip by one means selected from transfer, compression transfer, and suction transfer.
  • the apparatus may be provided with means that can automatically execute procedures such as washing, modification, enzymatic digestion, and extraction that are useful for subsequent analysis.
  • the molecular analysis method or the molecular analysis device according to the present invention improves the working efficiency by collecting the molecules captured on the detection surface of the biosensor device into a solid phase, and improves the accuracy of the subsequent molecular analysis.
  • FIG. 1 is a diagram simply showing the concept of a molecular transfer procedure of a molecular analysis method and a molecular transfer means of a molecular analysis device according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the state of the membrane (2) after the molecular transfer operation.
  • FIG. 3 is a block diagram schematically showing the basic concept of the molecular analyzer according to the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram (graph) showing a real-time response curve by surface plasmon resonance.
  • FIG. 5 is a diagram (photograph) showing a state of transfer to a film body.
  • FIG. 1 is a diagram simply showing the concept of the molecular transfer procedure of the molecular analysis method according to the present invention and the molecular transfer means of the molecular analyzer.
  • Reference numeral 1 in FIG. 1 indicates a detection surface of a sensor chip detached from a sensor unit of a biosensor device after an intermolecular interaction using the device.
  • the type of the biosensor device and the configuration of the detection surface can be appropriately selected and are not narrowly limited.
  • Reference numeral 2 in FIG. 1 indicates a membrane such as a PVA membrane, a nylon membrane, a nitrose layer membrane, and a membrane filter.
  • the reaction surface 101 of the detection surface 1 is opposed to the film 2, and thereafter, the state where the reaction surface 101 is in contact with the transfer surface 201 of the film 2 is secured. Subsequently, the reaction of the detection surface 1 is performed by applying electricity to the detection surface 1, pressing the detection surface 1 against the transfer surface 201 and pressing the same, or using a suction force such as vacuum suction.
  • the target molecule T is transferred from the surface 101 to the transfer surface 201 of the membrane 2 (molecular transfer procedure).
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a state of the film body 2 after the molecular transfer operation.
  • the target molecule T moves from the detection surface 1 to the transfer surface 201 of the membrane 2, and the target molecule T moves to the transfer surface 201. It will be in a state of attachment. That is, the target molecule T that has interacted with the detection molecule D in the solid phase is surely recovered in the solid phase.
  • the detection molecule D may be transcribed to the membrane 2 at the same time.In this case, it is possible to distinguish between the two by the subsequent analysis. There is no problem in analyzing the structure of the target molecule ⁇ .
  • the target molecule transcribed and collected on the membrane 2 is subjected to necessary washing, modification, enzymatic digestion, extraction, etc., depending on the subsequent analysis method, and identification and structural analysis of the molecular species are performed.
  • FIG. 3 is a block diagram schematically showing the basic concept of the molecular analyzer according to the present invention.
  • Reference numeral 3 in FIG. 3 denotes a biosensor using the Surface Plasmon Resonance (SPR) principle, which is an example of a biosensor device. . PT / JP03 / 03943
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • the configuration of a main part of the sensor device is simply shown, and the biosensor device 3 is provided with a sensor unit indicated by a reference symbol U.
  • the sensor unit U includes SPR detection means 301 for optically detecting surface plasmon resonance that occurs when surface plasmons are excited at a metal-liquid interface.
  • the SPR detection means 301 detects a subtle mass change occurring on the detection surface of the sensor chip as an SPR signal due to the binding and dissociation of the detection molecule and the target molecule.
  • the sensor unit section U generally includes a microphone opening channel system 302 for performing accurate liquid supply control to the detection surface 1 and a sensor chip 303.
  • a detection surface 1 is formed at a predetermined position of the sensor chip 303.
  • the detection surface 1 has, for example, a configuration in which a gold thin film is deposited on a glass substrate, and the detection molecule D immobilized on the gold thin film side and the liquid are controlled and sent by the microchannel system. Provides a field for the interaction of the target molecules T contained in the solution.
  • the sensor unit U may employ a cuvette method instead of the microchannel system 302.
  • the sensor chip 303 is removed from the device 3 and transferred to the automatic molecular transfer device 4 I do.
  • the sensor chip 303 (or the detection surface 1 removed from the sensor chip 303) is set at a predetermined transfer point 410a of the automatic transfer unit 401.
  • the procedure for setting the sensor chip 303 at the transfer location 4Ola may be automated.
  • the film body 2 is installed in advance at the above-described transfer location 401 a, and the sensor chip 303 is installed so as to face the detection surface 1 force S and the film body 2. .
  • the transfer may be performed by appropriately selecting any of electrical transfer, pressure transfer, and suction transfer. Note that a transfer means combining these procedures is used. For example, it is possible to employ a means of suction-pressing the transfer portion 401a in a sealed state.
  • the membrane 2 is taken out from the transfer location 401 a and transferred to a predetermined location 402 a of the analysis sample adjustment unit 402.
  • the procedures for removing the membrane 2 from the transfer site 401 a and transferring it to the analytical sample preparation unit 402 may be fully automated.
  • the analysis sample preparation section 402 has a configuration in which the pretreatment procedures for obtaining a sample S suitable for subsequent molecular analysis, such as washing, modification, enzymatic digestion, and extraction, can be appropriately selected. 'Enable the procedure to be performed automatically.
  • FIG. 3 illustrates a configuration in which the automatic transfer unit 401 and the analysis sample preparation unit 402 are divided.
  • the automatic transfer unit 401 and the analysis sample adjustment unit 402 may be integrated, and the transfer and the pretreatment procedure may be continuously performed in the automatic transfer unit 401 without transferring the membrane 2.
  • the sample S obtained by preprocessing in the analysis sample adjusting unit 402 is applied to a molecular analyzer M such as a mass spectrometer to identify the molecular species and analyze the structure of the molecule. .
  • a molecular analyzer M such as a mass spectrometer
  • the inventor of the present application conducted an experiment for verifying whether or not the target molecule captured on the detection surface of the sensor chip was transferred to the membrane.
  • the biosensor device used was a Biacore surface plasmon resonance sensor; BIACORE300, and the sensor chip used was Biacore CM5.
  • Glutathione S-transferase antibody was immobilized on the sensor chip surface by the amine coupling method. After that, GST, which is a target molecule, was sent to and reacted on the sensor chip surface.
  • the transfer efficiency was evaluated by the Western plot method.
  • the same anti-GST antibody used as the detection molecule was used for the western blotting.
  • the molecular analysis method or molecular analysis device of the present invention even a beginner can easily recover the target molecule captured on the detection surface to the solid phase, so that the time required for the molecular recovery operation can be greatly reduced, so It is convenient. In addition, there is no need for laborious preparation of a recovery column. In addition, since there is no need to recover the molecules for detection by using a solution, contamination present in the flow path system of the biosensor device does not mix into a very small amount of sample solution, and does not hinder analysis. Therefore, the accuracy of molecular analysis can be improved.
  • the efficiency of work related to molecular analysis can be greatly improved, and the accuracy of subsequent molecular analysis can be improved.

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Description

JP03/03943
明細書 分子解析方法及び分子解析装置
技術分野
本発明は、 生化学分野、 分子生物学分野等で有用な分析技術に関す る。 詳しくは、 バイオセンサー装置のセンサーチップ上の検出表面部 位に予め固相化された 「検出用分子」 と相互反応を示す 「標的分子」 の配列や構造等を解析するために特に有用な分子解析技術に関する。
背景技術
現在、 検出表面部位を備えるセンサーチップが組み込まれたバイォ センサー装置と称される分析装置が普及している。
このバイオセンサー装置は、 現在、 アミノ酸、 ペプチド、 タンパク 質、 ヌクレオチド、低分子化合物、脂質等の分子間相互反応、例えば、 抗原抗体反応、 ハイブリダィゼーシヨン、 酵素応答反応の分析やそれ らのカイネティタス解析等に有用なツールとなっている。
ここで、 前記センサーチップの検出表面部位は、 検出用分子を固定 化するために適する官能基 （例えば、 カルボキシル基、 アミノ基、 ァ ルデヒ ド基、 チオール基等） を有する物質やストレプトアビジン等が 予め固相化処理されている。
この検出表面に結合することにより固定化された検出用分子は、 検 出表面上に送液されてくる試料溶液中に標的分子が存在すれば、 特異 的な相互反応を示して前記標的分子を捕捉することになる。
バイオセンサーは、 この相互反応の結合 '解離状態を、 表面プラズ モン共鳴原理や水晶発振子原理等の原理を用いて、 リアルタイムに検 出する。
検出表面において相互反応を行った後は、 検出用分子に捕捉された 標的分子を極少容量の所定溶液で回収し、 さらに詳細な分子解析 （例 えば、 質量分析法） を行う方法が近年考案されている。 該方法では、 捕捉された標的分子を回収して質量分析法にかけるための （標的分子 を含む） 試料液を作製することになる。
バイオセンサー装置に続く、 質量分析計等を用いた分子解析の精度 は、 前記試料液中の試料濃度に大きく依存することから、 できるだけ 微量の回収液によって前記標的分子を回収することが重要である。
しかし、 極微量の回収液の調整及ぴ送液作業には高度な熟練技術が 必要であった。 また、 この溶液による回収作業は時間がかかることか ら、 これをハイスループッ ト化して作業効率を高めるための改良が試 みられているが、 限界があるという解決困難な技術的課題があった。 そこで、 本発明は、 センサーチップの検出表面に捕捉された標的分 子を膜体に転写して回収する技術を提供するとともに、 この技術を用 いた分子解析方法及び分子解析装置を提供することを目的とする。 発明の開示
上記技術的課題を解決するために、 本願では、 分子間の相互反応を 分析するバイォセンサー装置の検出表面に結合された検出分子と相互 反応を示した標的分子を固相に転写する分子転写手順を少なく とも含 むように工夫された分子解析方法を提供する。
具体的には、 バイォセンサー装置のセンサーチップに形成された検 出表面での分子間相互反応終了後に、 センサーュニッ ト部から検出表 面部分を取り外し、 所定の固相に対して転写する。
ここで、 「転写」 は、 検出表面に捕捉されていた分子を転写体であ る固相に移行させる手順又は写し取る手順を広く意味し、 狭く解釈さ れない。 分子転写手順としては、 電気的転写、 圧着転写、 吸引転写の 中から選択される一の手順を採用でき、 これらの手順を適宜組み合わ せてもよレ、。
「検出表面」 とは、 例えば、 プラズモン共鳴原理又は水晶発振子原 理によって相互反応検出を行うセンサーュニット部に配置されるセン サーチップに設けられた、 分子間相互反応が可能な処理が施された表 面領域である。 本発明に係る方法の実施に際しては、 センサーュ-ッ 03 03943
ト部において、 センサーチップができるだけ簡易に脱着できる構成と なっていることが望ましい。
本発明に係る分子解析方法は、 検出表面に捕捉された分子を液相中 に回収するという従来の極めて一般化した発想から大きく転換した技 術的思想を有し、 バイオセンサー装置のチップの検出表面に捕捉され た標的分子を、 固相、 とりわけ膜体に転写することによって回収する という全く新規な分子回収技術を提供することを主題としている。
「固相」 は、 検出表面に捕捉された標的分子を受け取って保持でき る性質を少なく とも備えている固体、 半固体が含まれる。
「膜体」 は、 液体透過性を有する多孔体であって、 例えば、 ポリ ビ ニルアルコール （P V A ) 膜、 ナイ ロン膜、 ニ トロセルロース膜、 メ ンブレンフィルターを挙げることができる。
転写対象の固相として膜体が適する理由は、 柔軟性を有するので検 出表面を密着させ易く、 液体透過性を備えるので、 洗浄等の後処理を 好適に行うことができるからである。
上記した分子転写手順を採用すれば、 初心者でも簡単に、 検出表面 に捕捉された標的分子を汚れを混入させることなく回収でき、 分子回 収作業に要する時間も、 大幅に短縮できる。 また、 手間のかかる回収 用カラムの作製作業も不要となる。
そして、 溶液による検出用分子の回収作業を行う必要がないため、 流路系に存在する汚れが微量な試料溶液中に混入し、 分析の障害にな るという従来の液相回収法が抱えていた問題を根本的に解決できる。 更に、 近年、 センサーチップの検出表面を区分けして、 複数種の検 出用分子を別々に固定化し、 それぞれの検出用分子と相互反応を示す 標的分子を検出、 分析するという技術が試みられる場合がある。
この場合において、 本発明の分子転写手順を採用すれば、 確実に複 数種の標的分子を混合することなく別々に、 かつ同時に転写回収し、 解析することができるようになるという利点がある。
具体的には、 従来の溶液による回収手順では、 検出表面上の各検出 用分子に捕捉された標的分子の回収作業を、 区分けされた流路系を用 いて、 順次、 別個独立の作業の下で行わなければならなかったので、 非常に手間と時間がかかっていた。 また、 長時間に及ぶ回収作業の間 に、 標的分子が解離したり、 変性したり してしまうことがあった。 一方、 本発明における分子転写手順は、 検出表面に捕捉された複数 種の標的分子を、 一度に転写し回収できるので、 手間がかからず、 回 収作業を短時間で終了できる。 また、 回収作業に時間がかからないの で標的分子の解離や変性の問題も発生しない。
ここに、本発明に係る分子解析方法の一連の手順の具体例を示せば、 分子間の相互反応を分析するパイォセンサー装置の検出表面に対して 標的分子を含有する溶液を接触させ、 続いて、 該検出表面に捕捉され た標的分子 （検出用分子とアクティブに反応した標的分子） を膜体に 転写し、 この膜体に転写された標的分子を、 例えば、 酵素消化等を用 いて液相中に溶出させた後に、 試料液を質量分析法によって解析する という手順を挙げることができる。
なお、 質量分析法では、 標的分子の分子種を同定したり、 構造解析 を行ったりすることができる。 例えば、 標的分子がタンパク質である 場合には、 アミノ酸配列、 リン酸化の状態、 糖質の付加状態等を解析 し、 標的分子が脂質である場合には、 側鎖長の解析等を行うことがで きる。
次に本発明では、 上記分子解析方法に加えて、 分子間の相互反応を 分析するバイォセンサー装置の検出表面に結合された検出分子と相互 反応を示した標的分子を膜体に自動的に転写できるように工夫された 自動分子転写手段を少なく とも備える分子解析装置を提供する。
即ち、 検出表面での相互反応手順完了後に、 バイオセンサー装置か らセンサーチップ （又は検出表面部位） を取り出し、 該センサーチッ プ （又は検出表面部位） を所定箇所に設置し、 続いて、 電気的転写、 圧着転写、 吸引転写の中から選ばれる一の手段によって、 予めセンサ 一チップと対向する位置に設置されている膜体等の固相に対して検出 用分子が自動的に転写されるようにする。 JP03/03943
なお、 本装置には、 転写手段に加えて、 後続の分析に有用な洗浄、 修飾化、 酵素消化、 抽出等の手順を自動的に実行できる手段を設けて もよい。
以上のように、 本発明に係る分子解析方法又は分子解析装置は、 パ ィォセンサー装置の検出表面に捕捉された分子を固相に回収すること によって、 作業効率を向上させるとともに、 後続の分子解析精度を高 めることができるという技術的意義を有している。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明に係る分子解析方法の分子転写手順及び分子解析 装置の分子転写手段の概念を簡略に表す図である。
第 2図は、 分子転写作業後の膜体 （2 ) の状態を簡略に示す図であ る。
第 3図は、 本発明に係る分子解析装置の基本概念を簡略に示すプロ ック図である。
第 4図は、 表面プラズモン共鳴による実時間反応曲線を示す図 （グ ラフ） である。
第 5図は、 膜体への転写状態を示す図 （写真） である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明に係る分子解析方法及び分子解析装置の好適な実施形 態について、 添付図面を参照しながら説明する。
まず、 第 1図は、 本発明に係る分子解析方法の分子転写手順及び分 子解析装置の分子転写手段の概念を簡略に表す図である。
第 1図中における符号 1は、 バイオセンサー装置を用いた分子間相 互反応後に、 該装置のセンサーュニッ ト部から取り外されたセンサー チップの検出表面を表している。
この検出表面 1の反応面 1 0 1には、 予め検出用分子 Dが固定化さ れており、 分子間相互反応によって該検出用分子 Dには、 該分子 Dと アクティブに相互反応を示した標的分子 Tが結合している。 なお、 本 03 03943
発明において、 バイオセンサー装置の種類や検出表面の構成は、 適宜 選択可能であって、 狭く限定されることはない。
第 1図中における符号 2は、 P V A膜、 ナイロン膜、 ニ ト ロセノレ口 ース膜、 メンブレンフィルタ一等の膜体を示している。 この膜体 2に 対して、 前記検出表面 1の反応面 1 0 1を対向させて、 その後、 前記 反応面 1 0 1 と膜体 2の転写面 2 0 1を接触させた状態を確保し、 続 いて、 検出表面 1に電気を印加したり、 検出表面 1を転写面 2 0 1に 向けて押し付けて圧着させたり、 真空吸引等の吸引力を利用したり等 して、 検出表面 1の反応面 1 0 1から膜体 2の転写面 2 0 1へ標的分 子 Tを移行させる （分子転写手順） 。
第 2図は、 分子転写作業後の膜体 2の状態を簡略に示す図である。
この第 2図に示されるように、 分子転写作業完了後には、 検出表面 1 から膜体 2の転写面 2 0 1へ標的分子 Tが移行し、 該標的分子 Tが転 写面 2 0 1に付着した状態となる。 即ち、 固相中に検出用分子 Dと相 互反応を示した標的分子 Tが確実に固相中に回収される。
なお、 検出表面 1に複数種の標的分子 Τ 2 , Τ 3， Τ 4が捕捉さ れている場合では、 これらの標的分子 Τ 〜！^が、 一度の分子転写作 業で、 膜体 2の転写面 2 0 1に転写されることになる。
なお、 膜体 2には、 標的分子 Τに加えて、 検出用分子 Dも同時に転 写される場合があるが、 この場合、 後続の分析により、 両者を区別す ることが可能であるので、標的分子 Τの構造等の解析には問題がない。 膜体 2に転写回収された標的分子は、 後続の分析方法に応じて、 必 要な洗浄、 修飾化、 酵素消化、 抽出等の処理が施され、 その分子種の 同定や構造解析等が行われる。
次に、 添付した第 3図に基づき、 本発明に係る分子解析装置の構成 を説明する。 第 3図は、 本発明に係る分子解析装置の基本概念を簡略 に示すプロック図である。
第 3図中の符号 3は、 バイオセンサー装置の一例である表面プラズ モン共鳴 （Surface Plasmon Resonance ： S P R ) 原理を用いたバイオ . P T/JP03/03943
センサー装置の要部構成を簡略に示しており、 このバイオセンサー装 置 3には、 符号 Uで示されたセンサーュニッ ト部が設けられている。
このセンサーュニッ ト部 Uは、 表面プラズモンが金属 液体界面で 励起した場合に起こる表面プラズモン共鳴を光学的に検出する S P R 検出手段 3 0 1 を備える。
S P R検出手段 3 0 1は、 検出用分子と標的分子の結合と解離に伴 つて、 センサーチップの検出表面で生じる微妙な質量変化を S P Rシ グナルと して検出する。
また、 センサーユニッ ト部 Uは、 一般に、 検出表面 1に対して正確 な送液の制御を行うマイク口流路系 3 0 2 と、 センサーチップ 3 0 3 と、 を備えている。
センサーチップ 3 0 3の所定箇所には検出表面 1が形成されている。 該検出表面 1は、 例えば、 ガラス基板に金の薄膜が蒸着された構成を 備え、 この金薄膜側に固定化された検出用分子 Dと、 前記マイクロ流 路系によって制御されて送液されてく る溶液中に含まれる標的分子 T の相互反応の場を提供する。
なお、センサーュニッ ト部 Uには、マイクロ流路系 3 0 2ではなく、 キュべッ ト方式が採用される場合がある。
上記構成のバイオセンサー装置 3において、 分子間 （Dと T ) の相 互反応を、 所定の手順に従って行った後、 該装置 3からセンサーチッ プ 3 0 3を取り外し、 自動分子転写装置 4に移送する。
そして、 センサーチップ 3 0 3 (又は該センサーチップ 3 0 3から 外した検出表面 1 ) を、 自動転写部 4 0 1の所定の転写個所 4 0 1 a に設置する。 なお、 センサーチップ 3 0 3の転写個所 4 O l aへの設 置手順は、 自動化してもよい。
前記した転写箇所 4 0 1 aには、 予め膜体 2が設置されており、 前 記センサーチップ 3 0 3は、 その検出表面 1力 S、 前記膜体 2に対向す るよ うに設置される。
転写は、 電気的転写、 圧着転写、 吸引転写のいずれかの手段を適宜 選択して行えばよい。 なお、 これらの手順を組み合わせた転写手段を 採用してもよく、 例えば、 転写箇所 4 0 1 aを密閉状態として、 吸引 圧着する手段を採用することができる。
続いて、転写作業終了後、転写箇所 4 0 1 aから膜体 2を取り出し、 分析サンプル調整部 4 0 2の所定箇所 4 0 2 aに移送する。 転写箇所 4 0 1 aからの膜体 2の取り出し並びに分析サンプル調製部 4 0 2へ の移送の各手順についても、 全自動化してもよい。
分析サンプル調製部 4 0 2では、 後続の分子解析に適したサンプル Sを得るための前処理手順である、 洗浄、 修飾化、 酵素消化、 抽出等 の手順を適宜に選択できる構成とし、 これらの'手順を自動的に実施で きるようにする。
第 3図では、 自動転写部 4 0 1 と分析サンプル調製部 4 0 2が区分 けされた構成を例示している。 自動転写部 4 0 1 と分析サンプル調整 部 4 0 2を一体化し、 膜体 2を移送することなく、 自動転写部 4 0 1 において転写と前処理手順を連続で行うようにしてもよい。
分析サンプル調整部 4 0 2で前処理されて得られたサンプル Sは、 質量分析計等の分子分析装置 Mにかけられて、 当該分子種の同定や当 該分子の構造解析が行われる。 .
ぐ実施例〉
本願発明者は、 センサーチップの検出表面に捕捉された標的分子が 膜体に転写されるか否かの検証実験を行った。
実験条件及び方法。
バイオセンサー装置は、 ビアコア社製表面プラズモン共鳴センサ ； B I A C O R E 3 0 0 0を使用し、 センサーチップは、 ビアコア社の C M 5を使用した。
検出用分子として抗グルタチオン- S-トランスフェラーゼ
(Glutathione S- transferase： G S T )抗体をァミンカツプリング法に てセンサーチップ表面に固定化した。 その後、 標的分子である G S T をセンサーチップ表面に送液 ·反応させた。
その間、 第 4図に示す表面プラズモン共鳴による実時間反応曲線を 観察し、 +分な結合量が得られたことを確認し、 センサーチップをパ ィォセンサー装置から取り外した。 取り外したセンサーチップ表面に ポリ ビュルアルコール転写膜（P V A膜） を 1 0分間圧着した。 なお、 圧着した状態を第 5図 （写真） に示す。
その転写効率をウェスタンプロッ ト法で評価した。 ウェスタンプロ ッ ト法に用いたのは検出用分子として用いたのと同じ抗 G S T抗体で める。
実験結果と考察。
前記表面プラズモン共鳴による実時間反応曲線から、 標的分子は約 2ナノグラムがセンサーチップ上に結合したものと思われた。 そのセ ンサーチップ表面に P V A膜を圧着して転写操作を行ったところ、 標 的分子のシグナルが膜体から極めて有意に検出された。
このことは、 センサーチップ上に結合した任意の分が膜体上へ高効 率に回収され、 質量分析法等によって高感度に結合分子の解析ができ ることを意味する。 産業上の利用可能性
本発明に係る分子解析方法又は分子解析装置によれば、 初心者でも 簡単に、 検出表面に捕捉された標的分子を固相に回収できるので、 分 子回収作業に要する時間を大幅に短縮できるので大変便利である。 ま た、 手間のかかる回収用カラムの作製作業も必要がない。 加えて、 溶 液による検出用分子の回収作業を行う必要がないことから、 バイオセ ンサー装置の流路系に存在する汚れが微量な試料溶液中に混入し、 分 析の障害になることがないので、 分子解析精度を向上させることがで きる。
複数種の検出用分子を別々に固定化し、 それぞれの検出用分子と相 互反応を示す標的分子を検出、 分析する場合では、 一度の分子転写手 順又は分子転写手段を実行することによって、 迅速かつ確実に、 複数 種の標的分子を転写回収し、 解析することができる。
本発明に係る分子解析方法又は分子解析装置は、 パイォセンサー装 置の検出表面に捕捉された分子を固相に回収するように工夫した結果. 3
分子解析に係わる作業の効率を大幅に向上させることができるととも に、 後続の分子解析精度を高めることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 分子間の相互反応を分析するバイオセンサー装置の検出表面に結 合された検出分子と相互反応を示した標的分子を、 固相に転写する分 子転写手順を少なく とも含むことを特徴とする分子解析方法。
2 . 前記固相は、 膜体であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記 載の分子解析方法。
3 . 前記分子転写手順は、 少なく とも電気的転写、 圧着転写、 吸引転 写の中から選択される一の手順を含むことを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の分子解析方法。
4 . 前記検出表面は、 プラズモン共鳴原理又は水晶発振子原理によつ て前記相互反応の検出を行うセンサーュニッ ト部に配置されている検 出表面であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の分子解析方 法。
5 . 前記分子転写手順によって膜体上に回収された分子間の相互反応 を分析するバイォセンサー装置の検出表面に結合された標的分子を質 量分析法により解析する請求の範囲第 1項に記載の分子解析方法。
6 . 分子間の相互反応を分析するバイオセンサー装置の検出表面に結 合された検出分子と相互反応を示した標的分子を固相に自動的に転写 する自動分子転写手段を少なく とも備えることを特徴とする分子解析
7 . 前記固相は、 膜体であることを特徴とする請求の範囲第 6項に記 載の分子解析装置。
8 . 前記分子転写手段は、 少なく とも電気的転写、 圧着転写、 吸引転 写の中から選択される一の手段を含むことを特徴とする請求の範囲第 6項又は第 7項に記載の分子解析装置。
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