WO2003087144A2 - Proteines insecticides photorabdus luminescens - Google Patents

Proteines insecticides photorabdus luminescens Download PDF

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seq
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Eric Duchaud
Frank Kunst
Philippe Glaser
Carmen Buchrieser
Lionel Frangeul
Farid Chetouani
Christophe Rusniok
Sead Taourit
Christina Nielsen-Le Roux
Noël BOEMARE
Alain Givaudan
Rachel Vincent
Vincent P. M. Wingate
Kerrie M. Powell
Richard Derose
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Institut Pasteur
Institut National De La Recherche Agronomique
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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Definitions

  • the invention relates in particular to nucleotide sequences isolated from
  • Photorhabdus luminescens toxins coded by said sequences, methods for obtaining such toxins, compositions comprising such toxins intended for the control of insect pests of crops or pests (as vectors of diseases) for humans and animals , transformed plants expressing such toxins.
  • insects are the cause of serious damage to field crops, including cereals, flowers, fruit.
  • Various alternative techniques have been developed, in particular biological control by other insects or by biological agents such as bacteria capable of producing insecticidal toxins.
  • Transgenic plants are also known which express such insecticidal toxins.
  • WO 99/54472 describes insecticidal toxins isolated from Xenorhabdus nematophilus, and nucleotide sequences coding for such toxins.
  • Photorhabdus luminescens is an entomopathogenic, intestinal commensal bacterium of a nematode of the genus Heterorhabditis.
  • the invention aims to obtain plants and / or compositions containing such toxins capable of inactivating or destroying insect pests of cultivated plants or harmful insects carrying pathogens for humans, animals or plants.
  • the invention also relates to the use of such toxins, for treatment - preventive or curative - of crops against pests.
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • nucleotide sequences coding for insecticidal toxins which are particularly effective against dipterans, in particular the species mosquitoes Aedes aegypti, Culex pipiens, Anopheles gambiae and Anopheles stephensie, and lepidoptera including the genus Plutella.
  • the subject of the invention is, according to a first aspect, a nucleotide sequence isolated from Photorhabdus luminescens comprising a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 4, said nucleotide sequence coding for at least one polypeptide active against insects.
  • sequence SEQ ID N ° 2 corresponds to nucleotides nt 81 13 to nt 8514 of the sequence SEQ ID N ° 1 which is the nucleotide sequence of a BAC, designated BAC 1A2, deposited on July 12, 2001 at the CNCM under number 1 -2699.
  • BAC1A2 is a fragment of genomic DNA from Photorhabdus luminescens subsp.laumondii, strain TTOl (Fischer-Le Saux M. et al., 1998., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 64: 4246), cloned into the vector pBeloBACl 1 (Kim VJ et al., 1996, Genomics, vol. 34: 213) in the bacteria E. coli DH10B TH (Calvin NM and Hanawalt PC, 1998, J. Bacteriol., 170, 2796).
  • sequence SEQ ID No. 4 corresponds to nucleotides nt 8544 to nt 9803 of the sequence SEQ ID No. 1 of this BAC1 A2.
  • the invention also relates to the nucleotide sequences chosen from: a) a nucleotide sequence comprising at least 70% identity with SEQ ID No 2 or SEQ ID No 4; b) a nucleotide sequence hybridizing under conditions of high stringency with SEQ ID No. 2 or SEQ ID No.
  • the expression “nucleotide sequence with insecticidal expression” will be used to denote these nucleotide sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 2
  • sequence SEQ ID N ° 2 corresponds to a designated open reading frame
  • sequence SEQ ID No. 4 corresponds to an open reading frame designated
  • ORF2 and code for the protein of 419 amino acids of sequence SEQ ID No. 5.
  • sequences SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 are clearly distinguished from the prior art. No significant similarity has been identified, using for example the BESTFIT program known to those skilled in the art, between these sequences and the sequences SEQ ID Nos. 12, 13, 14 of the document US
  • insecticidal activity or “active compound against insects” means that the toxins are capable of fighting against insects, by killing or inactivating them, for example by a decrease or loss of appetite vis- with regard to the plants of interest cultivated. The result is typically the destruction, or reduced growth and / or reproduction of the target pest.
  • insecticide is also meant “biopesticide”.
  • insects diptera, in particular the mosquito species belonging to the genera Aedes, Culex, Anopheles, and lepidoptera in particular Plutella
  • the insecticidal efficacy of the sequences according to the invention on other insects can be screened without excessive effort by a person skilled in the art, now that the BAC1A2 and the biological activity test protocol are known, in particular using the appropriate techniques presented in the detailed description, in particular examples 2 and 3. Similar tests, for example using another target insect species, also make it possible to measure said insecticidal activity.
  • nucleic acid nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or region of a nucleic acid, which may or may not contain unnatural nucleotides, and which may correspond to both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNAs.
  • These nucleic acids are isolated from their natural environment, and are natural or artificial.
  • homologous nucleotide sequence is meant any nucleotide sequence which differs from the nucleotide sequences comprising SEQ ID No 2 or SEQ ID No 4 (in particular which differs from the sequences SEQ ID No 2 and SEQ ID No 4) , deletion, and / or insertion of a nucleotide or of a reduced number of nucleotides, at positions such that these homologous nucleotide sequences have an insecticidal activity as described above.
  • such a homologous nucleotide sequence is identical to at least 70.75% of the nucleotide sequences SEQ ID No 2 and SEQ ID No 4, preferably at least 80.85%, more preferably at least 90.92, 95, 98, 99%.
  • percentage of identity between two nucleic acid sequences is meant a percentage of identical nucleotides between the two sequences to be compared, obtained after their best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length. Optimal alignment of sequences for comparison can be achieved using mathematical algorithms.
  • BLAST2 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402
  • BLASTN BLASTN
  • BLAST2 Altschul et al., 1999, "Blast 2 sequences- a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250
  • gapped BLAST Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402
  • such a homologous nucleotide sequence hybridizes specifically to the sequence complementary to a sequence coding for an insecticidal toxin, under stringent conditions.
  • the following conditions will be used: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20mM, pH 7.5) containing 5X SSC (IX SSC corresponds to a 0.15M NaCl + 0.015 M solution of sodium citrate ), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10X of Denhardt's solution, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) hybridization proper for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (for example 42 ° C for a probe larger than 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C in 2X SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes at 20 ° C in 0.1 X SSC + 0.1% SDS.
  • nucleotide fragment is meant on the one hand any fragment of a nucleotide sequence comprising SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4 (in particular any fragment of SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4), or any fragment of sequences homologous to these sequences, said fragments coding for a peptide with insecticidal activity as defined above.
  • These nucleotide fragments have at least 10 nucleotides, preferably at least 10, 15, 30, 45, 75, 150, 300 consecutive nucleotides of the sequence from which they are derived.
  • these nucleotide fragments code for peptides having an insecticidal activity preferably of at least 10, 20, 30, 50, 80, 90%, or even more than 100%, of the insecticidal activity of the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 coded by the sequences with insecticidal expression SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 4.
  • an insecticidal activity preferably of at least 10, 20, 30, 50, 80, 90%, or even more than 100%, of the insecticidal activity of the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 coded by the sequences with insecticidal expression SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 4.
  • probes or primers which can be used in methods of detection, identification, assay or amplification of nucleic sequences.
  • These methods can involve amplification techniques of the PCR type (described for example in the document US 4,683,202) or PCR like, such as for example the techniques known to those skilled in the art SDA (Strand Displacement Amplification), TAS (Transcription-based Amplification System), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) LCR (Ligase Chain Reaction) .
  • a probe or primer is defined, within the meaning of the invention, as being a fragment of single-stranded nucleic acid or a denatured double-stranded fragment comprising at least 8 bases, preferably at least 10, 15, 20, 25 and 30 bases , and having a specificity of hybridization under conditions determined to form a hybridization complex with a target nucleic acid.
  • Such probes will in particular be used in marker-assisted selection programs, for example for monitoring the integration of the toxin gene in the transformed plant.
  • at least one of these probes is labeled, for example with a radioactive isotope, then brought into contact with the genomic DNA of the plant, previously digested with restriction enzymes, under conditions allowing specific hybridization of the probe labeled with the DNA in question.
  • the subject of the present invention is also the use of nucleotide sequences of fragments representative of the sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4, or of their complementary sequence as primers or probes for detection, identification, the assay or amplification of the sequences SEQ ID No 2 or SEQ ID No 4 or their complementary sequence.
  • the methods targeting such uses using these said fragments as primers or probes are also part of the invention.
  • modified nucleotide sequence any nucleotide sequence typically obtained by mutagenesis according to appropriate techniques, and comprising modifications with respect to the nucleotide sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 4, or the variant sequences (nucleotide sequences defined in a ) to e) previously). These modifications can, according to a preferred variant, increase the level of insecticidal expression.
  • the invention relates to an insecticidal polypeptide encoded by a nucleotide sequence with insecticidal expression as described above.
  • the invention also relates to the polypeptides chosen from: a) a polypeptide of sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 5; b) a polypeptide homologous to the polypeptide defined in a) comprising at least
  • polypeptide has insecticidal activity as described above.
  • insecticidal polypeptide or insecticidal toxin is used interchangeably to denote a polypeptide according to the invention having insecticidal activity as described above.
  • polypeptide is used to also denote a protein or peptide.
  • a polypeptide according to the invention is a polypeptide consisting of the sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 5 or of a sequence having at least 80% identity, preferably at least 85%, 90% , 95%, 98% and 99% identity with SEQ ID N ° 3 or SEQ ID N ° 5 after optimal alignment.
  • polypeptide whose amino acid sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% after optimal alignment with a reference sequence is intended to denote the polypeptides having certain modifications with respect to the reference polypeptide, such as in particular one or more deletions, truncations, an elongation, a chimeric fusion, and / or one or more substitutions.
  • polypeptide fragment is intended to denote a polypeptide comprising at least 10 consecutive amino acids, preferably at least 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100 consecutive amino acids.
  • the polypeptide fragments according to the invention obtained by cleavage of said polypeptide by a proteolytic enzyme, by a chemical reagent, or also by placing said polypeptide in a very acidic environment are also part of the invention.
  • one or more consecutive or non-consecutive amino acids can be replaced by “equivalent” amino acids.
  • the expression “equivalent” amino acid is intended here to denote any amino acid capable of being substituted for one of the amino acids of the basic structure without, however, modifying the essential functional characteristics or properties desired, in this case not resulting in not a loss of insecticidal activity.
  • These equivalent amino acids can be determined either on the basis of their structural homology with the amino acids for which they are substituted, or on the results of cross-biological activity tests to which the different polypeptides are liable to give rise.
  • substitutions which may be carried out without resulting in an in-depth modification of the biological activities of the corresponding modified polypeptides, the replacements, for example, of leucine by valine or isoleucine , aspartic acid by glutamic acid, glutamine by asparagine, arginine by lysine etc., the reverse substitutions being naturally possible under the same conditions.
  • variant polypeptide will be understood to mean all of the mutated polypeptides which may exist naturally, and which correspond in particular to truncations, substitutions, deletions and / or additions of amino acid residues.
  • a variant polypeptide, a homologous polypeptide or a polypeptide fragment according to the invention has at least 10%, preferably at least 20, 30, 50, 80, 90%, or even more than 100, 120, 150%, of the insecticidal activity of the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5.
  • the invention also relates to the nucleotide sequences coding for the polypeptides as described above.
  • isolated and “purified” refer to a level of purity achievable using current knowledge of those skilled in the art.
  • the molecules according to the invention need not be absolutely pure (that is to say containing absolutely no molecule other than cellular macromolecules), but should be sufficiently pure so that a person skilled in the art identifies that they are no longer present in the environment in which they were originally found (the cellular environment).
  • the invention relates to an expression cassette comprising a promoter sequence operably linked in the transformed plant to a nucleotide sequence according to the invention coding for an insecticidal toxin, and with a transcription termination region.
  • a DNA expression cassette can be carried out in various ways suitable for those skilled in the art. For example, at least one nucleotide sequence with insecticidal expression as defined above, can be cloned downstream of the promoter using restriction enzymes to ensure its insertion in an appropriate orientation with respect to the promoter so that it is expressed. Once this sequence of interest is operatively linked to the promoter, the expression cassette thus formed can be cloned into a plasmid or other vector.
  • the promoter sequence controls transcription into a functional messenger RNA coding for an insecticidal protein.
  • the expression cassette can be chimeric or natural, but typically it is heterologous towards the host, which implies introduction into the host by a transformation.
  • a large number of plant promoters are known, recalled in particular in document WO 01/70778.
  • the expression of the gene of interest is regulated, in addition to the promoter sequence, by the use of appropriate sequences capable of enhancing the activity of this promoter sequence, such as introns, for example the actin 1 or 2 intron, the DSV intron of the tobacco yellow mosaic (Morris et al., 1992, Virology, 187: 633), “enhancer” sequences, for example certain elements of the CaMV35S promoter and octopine synthase genes (US 5,290,924), “leader” sequences (typically sequences located between the transcription initiation site and the start of the coding sequence, in particular consensus leader sequences which stabilize mRNA and prevent inappropriate initiation of transcription), for example the leader EMCV (Leroy-Stein et al., 1989, PNAS USA, 86: 6126-6130), the leader TMV (Gallie et al., 1989, Molecular Biology of RNA , pages 237-256).
  • introns for example the actin 1 or 2 intron, the DSV
  • the expression cassette contains subcellular addressing sequences, in particular a sequence coding for a signal peptide allowing the secretion of the protein, or a sequence coding for a transit peptide addressing the toxin in the chloroplasts (by example the optimized transit peptide described in document EP 0 508 909).
  • the invention relates to a cloning and / or expression vector comprising an expression cassette as described above.
  • the vector is a virus type and comprises in its genome a polynucleotide sequence according to the invention, operatively linked to an appropriate inducible or constitutive promoter.
  • the invention relates to a host cell transformed with the nucleic acid sequences described above.
  • the invention relates to a host cell comprising such an expression cassette.
  • the host organism is a bacterium, a yeast, a plant cell, a fungus.
  • the invention relates to a process for the preparation of a polypeptide using at least one vector or a cell as described above.
  • the invention also relates to a recombinant polypeptide capable of being obtained by this method.
  • the invention relates to a process for the preparation of a synthetic polypeptide using an amino acid sequence of an insecticidal polypeptide as defined above.
  • the invention relates to the use of a nucleotide sequence, of a vector, of a host cell, as described above for the biosynthesis of insecticidal polypeptides.
  • the term “one” obviously refers to "at least one”.
  • the invention relates to the nucleotide sequences according to the invention, recorded on a support, called a recording support, the shape and nature of which facilitate the reading, analysis and exploitation of said sequences.
  • a support called a recording support, the shape and nature of which facilitate the reading, analysis and exploitation of said sequences.
  • supports supports readable by a computer, such as magnetic, optical, electric or hybrid supports such as for example floppy disks or discs, CD-ROMs or recording cassettes.
  • the invention relates to plant cells transformed by a vector as defined above, using such a cellular host capable of infecting said plant cells by allowing integration into the genome of the latter, promoter nucleotide sequences initially contained in the genome of the vector used.
  • transformation refers to a genetic manipulation of plant cells capable of being transformed, such as callus cells, embryos, cells suspended in cultures (cultures derived for example from calluses, embryos, leaves, young inflorescences, anthers) of plants.
  • transgenic or “transformed” in reference to a plant cell, a part of a plant, refers to these elements comprising a DNA segment (preferably a nucleotide sequence or an expression cassette according to the invention ) preselected isolated purified which has been introduced into said element by a method of genetic transformation. These include: transformation of protoplasts, biolistic techniques or microprojectile bombardment, transformation using bacteria including ⁇ Agrobacterium or viral vectors, directly in planta processes.
  • the protoplasts are typically isolated, either mechanically or enzymatically to separate the cell walls.
  • Protoplasts are typically obtained from callus cell lines obtained from immature embryos, immature inflorescences, mesocotyls, anthers.
  • the protoplasts can be transformed by Agrobacterium or by direct insertion of DNA facilitated by treatment with polyethylene glycol or by electroporation (Lazzeri, Methods Mol. Biol., 49: 95-106,1995).
  • the protoplasts of mesophylls can be isolated, a method which makes it possible to obtain results independent of the genotype.
  • Agrobacterium tumefaciens can be used, such as those described in the document Zupan, J. et al., 2000, The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant J., 23: 1 1-28; US 6,037,522; US 6,265,538.
  • the transformation by Agrobacterium tumefaciens can be carried out for Dicotyledons (tobacco, potato) and Monocotyledons (wheat, barley, sorghum, corn, rice in particular) even if the latter are not generally their natural host.
  • Dicotyledons tobacco, potato
  • Monocotyledons wheat, barley, sorghum, corn, rice in particular
  • marker genes such as genes conferring resistance to an antibiotic or to herbicides
  • positive selection systems cited for example in Gelvin 1998, in particular the system based on a selection on mannose, in the presence of the gene for selection of the MPI (Mannose-6-phosphate isomerase) (Hansen and Wright, 1999), or selection systems coupled with the elimination of marker genes after selection (Ebinuma et al., 1997).
  • the transformed plants can also be selected by PCR screening in the absence of selection marker genes (McGarvey and Kaper, 1991).
  • the invention relates to a process for obtaining a plant expressing at least one insecticidal toxin according to the invention in its tissues, comprising the introduction of an expression cassette comprising a nucleotide sequence with insecticidal expression as previously described in at least one plant cell, then culturing the cell thus transformed so as to regenerate a plant containing in its genome said expression cassette.
  • Said cassette is stably integrated into the genome.
  • the method further comprises the identification and selection of transformed cells capable of regenerating plants expressing insecticidal toxins compared to an untransformed plant.
  • transformation products that is to say immediately resulting from the transformation process, and of the transgenic plants resulting therefrom, can be carried out in different ways.
  • Techniques for growing plant cultures are known to those skilled in the art, for example in McCormick, 1986, Plant Cell Reports, 5: 80-84.
  • the recombinant DNA comprising at least one nucleotide sequence according to the invention is transmitted during a reproductive cycle of the transgenic plant to its descendants so as to be expressed in the plants of the descendants.
  • the invention therefore also relates to the tissues or parts of plants, plants, or seeds containing the nucleic acid sequences according to the invention described above.
  • plant tissue refers to any tissue of a plant, in a plant or in a crop.
  • This term includes whole plants, plant cells, plant organs, plant seeds, protoplasts, calluses, cell cultures and all other plant cells organized as a functional and / or structural unit. Parts of regenerated plants such as flowers, seeds, leaves, stems, fruits, pollen, tubers and the like are also within the scope of the invention.
  • the tissues, parts of plants, plants or seeds, are resistant to insects.
  • the invention includes the fertile transgenic plants obtained as well as their progeny and the product of this progeny.
  • Transgenic hybrid plants obtained by crossing at least one plant according to the invention with another, also form part of the invention.
  • the transgenic plants according to the invention comprise in particular a transgenic plant T0 or R0, that is to say the first plant generated from cells of transformed plants, the transgenic plant Tl or RI, that is to say the first generation offspring, and the plants of the offspring of subsequent generations obtained which comprise and express recombinant DNA.
  • T0 or R0 that is to say the first plant generated from cells of transformed plants
  • the transgenic plant Tl or RI that is to say the first generation offspring
  • the plants of the offspring of subsequent generations obtained which comprise and express recombinant DNA.
  • a large number of suitable techniques can be used, for example PCR analysis or techniques Southern blot hybridization, to determine the structure of recombinant DNA, detection of RNA transcribed from DNA of the gene of interest expressed in cells of transformed plants, techniques for tracking protein production encoded by the gene of interest, such as gel electrophoresis of proteins, Western blot techniques.
  • the plants transformed according to the methods described can be monocots or dicots, in particular corn, wheat, barley, sorghum, potato, peas, soybeans, tobacco, rapeseed, tomatoes, sunflower, cotton, rice, bean, cauliflower, broccoli, lettuce, radish, celery, spinach, onion, garlic, carrot, apple, pear, melon, cherry, peach, apricot, raspberry, strawberry, pineapple, avocado, banana, sugar cane.
  • the subject of the invention is a composition for combating harmful insects as well as methods using such compositions, these compositions comprising at least one insecticidal toxin or insecticidal compound according to the invention as described above .
  • insecticidal composition means a phytosanitary or pharmaceutical composition comprising as active material an effective amount of insecticidal toxin according to the invention.
  • compositions When used for crop protection, compositions will typically be in combination with a solid or liquid support, acceptable in agriculture and / or a surfactant also acceptable in agriculture.
  • the pharmaceutical compositions will comprise the appropriate pharmaceutically acceptable transporters associated with the insecticidal toxin. Such transporters are known to those skilled in the art, for example described in document US 5,877,322.
  • the insecticide compound is used in effective but non-phytotoxic amounts.
  • effective and non-phytotoxic amount is meant an amount of active material sufficient to allow the control or destruction of insects present or likely to appear on the crops, and not causing for said crops any significant symptom of phytotoxicity.
  • Such an amount is likely to vary within wide limits depending on the insect to be controlled, the type of crop, the climatic conditions, and the compounds included in the insecticidal composition according to the invention. This amount can easily be determined by systematic field tests, within the reach of the skilled person.
  • an insecticidal composition comprises at least one host cell as described above.
  • the various insecticidal compositions according to the invention are typically associated with a support, solid or liquid, usable in the field of agriculture, and optionally with at least one surfactant and / or one or more agents auxiliary.
  • the inert and usual supports can be used; just as, as surfactants, the usual surfactants can be used in the field of formulating compositions intended for uses in agriculture, in particular for the treatment or protection of crops.
  • the insecticidal compositions according to the invention typically comprise between 0.00001 and 100%, preferably between 0.001 and 80%, of insecticidal compound.
  • the proportions and percentages used or described in this text are proportions or percentages by weight.
  • support in the present description, we mean an organic or mineral, natural or synthetic material, with which the active material is associated to facilitate its application, in particular on the plant, or on seeds or on the soil. This support is therefore generally inert and it must be acceptable in agriculture, in particular by the treated plant.
  • the support optionally used for the formulation of compositions according to the invention can be solid or liquid.
  • solid supports which can be used for the formulation of compositions according to the invention, mention may be made of natural or synthetic silicates, resins, waxes, fine powders or granules of clay, in particular kaolin clay, diatoms, bentonite or acid clay, synthetic hydrated silicon oxide, talcs, ceramics, other minerals including sericite, quartz, sulfur, activated carbon, calcium carbonate, hydrated silica , or industrial fertilizers such as ammonium sulphate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea or ammonium chloride.
  • natural or synthetic silicates resins, waxes, fine powders or granules of clay, in particular kaolin clay, diatoms, bentonite or acid clay, synthetic hydrated silicon oxide, talcs, ceramics, other minerals including sericite, quartz, sulfur, activated carbon, calcium carbonate, hydrated silica , or industrial fertilizers such as ammonium sulphate, ammonium phosphate, am
  • liquid carriers which can be used for the formulation of compositions according to the invention, mention may be made of water, alcohols and in particular methanol or ethanol, ketones and in particular acetone, methyl ethyl ketone or cyclohexanone, fractions petroleum, aromatic hydrocarbons including benzene, toluene, xylene, ethylbenzene or methylnaphthalene, non-aromatic hydrocarbons including hexane, cyclohexane, kerosene or diesel, liquefied gas, esters including ethyl acetate and butyl acetate, nitriles including acetonitrile and isobutyronitrile, ethers including diisopropyl ether or dioxane, amides including N, N-dimethylformamide or N, N-dimethylacetamide, halogenated hydrocarbons including dichloromethane, trichloroethane or carbon
  • the surfactant can be an emulsifying, dispersing or wetting agent of ionic or nonionic type.
  • the presence of at least one surfactant is generally suitable when at least one of the active materials and / or the inert support is not
  • the insecticidal compositions according to the invention can also contain any kind of other ingredients or agents such as, for example, protective colloids, adhesives, thickening agents, thixotropic agents, penetrating agents, stabilizing agents including phosphate isopropyl acid, 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, 2-tert-butyl-4-methoxyphenol and 3-tert-butyl-4-methoxyphenol, vegetable or mineral oils, acids fatty or their esters, sequestering agents, dispersing agents including casein, gelatin, saccharides and in particular starch powder, gum arabic, certain derivatives of cellulose or alginic acid, derivatives of lignin, bentonite, synthetic polymers soluble in water, in particular polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyacrylic acids, etc., as well as other active materials known for their pesticidal properties, in particular insect icides or fungicides; or for their properties favoring the growth of plants, in
  • insecticidal compound can be combined with all the solid or liquid additives corresponding to the usual techniques of formulation, particularly the formulation of products or compositions intended for uses or uses in agriculture or in public hygiene.
  • compositions according to the invention can take the form of quite a number of formulations among which mention may be made of oily solutions, emulsifiable concentrates, wettable powders, fluid formulations and in particular aqueous suspensions or aqueous emulsions, granules, powders, aerosols, formulations for nebulization, in particular formulations for misting, very low volume formulations, pastes, emulsions, concentrated suspensions, as well as possible mixtures, associations or combinations of these different forms.
  • oily solutions emulsifiable concentrates, wettable powders, fluid formulations and in particular aqueous suspensions or aqueous emulsions, granules, powders, aerosols, formulations for nebulization, in particular formulations for misting, very low volume formulations, pastes, emulsions, concentrated suspensions, as well as possible mixtures, associations or combinations of these different forms.
  • the content of insecticidal compound can range up to 100%; similarly, for formulations in the form of granules, in particular those obtained by extrusion, by compaction, by impregnation of a granulated support, by granulation from a powder, the content of insecticidal compound in these granules is most often understood. between 0.5 and 80%.
  • compositions according to the invention comprising an insecticidal compound which are in the form of emulsifiable or soluble concentrates most often comprise from 25 to 100% of active materials, the emulsions or solutions ready for application containing, as to them, from 0.00001 to 20% of active ingredients.
  • the active material A is combined, where appropriate, with at least one other active material or insecticidal compound derived from Photorhabdus luminescens or other microorganisms.
  • the emulsifiable concentrates can contain, when necessary, 2 to 20% of suitable additives such as stabilizers, surfactants, penetrating agents, corrosion inhibitors, dyes or adhesives previously cited.
  • the insecticide compositions according to the invention in the form of concentrated suspensions, also applicable in spraying, are prepared so as to obtain a fluid, stable product, which does not deposit; they usually contain from 2 to 75% of active material, from 0.5 to 15% of surfactants, from 0.1 to 10% of thixotropic agents, from 0 to 10% of suitable additives, such as anti - foam, corrosion inhibiting agents, stabilizing agents, penetrating agents and adhesives; and, as a support, water or an organic liquid in which the active material (s) is sparingly or not soluble, or alternatively mixtures of several of these solvents, organic or not.
  • insecticidal compositions according to the invention which take the form of wettable or sprayable powders are usually prepared so that they contain from 20 to 95% of active ingredients.
  • ком ⁇ онентs usually contain, in addition to a solid support, from 0 to 5% of a wetting agent, from 3 to 10% of a dispersing agent, and, where appropriate, from 0 to 10% of one or more stabilizers and / or other additives, such as penetrating agents, adhesives, or anti-caking agents, coloring agents, etc.
  • the active ingredient (s) are intimately mixed in appropriate mixers with the additional substances, and are ground with mills or other suitable grinders. Powders to be sprayed are thus obtained, the wettability and the suspension of which are particularly advantageous.
  • They can be suspended with water at any desired concentration.
  • insecticide compositions according to the invention can be produced which are in the form of pastes.
  • aqueous dispersions and emulsions for example the insecticidal compositions obtained by diluting with water a wettable powder or an emulsifiable concentrate according to the invention, are included in the general scope of the present invention .
  • the emulsions can be of the water-in-oil or oil-in-water type and they can have a thick or fairly thick consistency.
  • compositions according to the invention can take many forms of formulations; thus, these compositions can be used comprising an insecticidal compound in aerosol generator; bait (ready to use); concentrate for bait preparation; bait in stoc; suspension of capsules; product for cold nebulization; powder for dusting; emulsifiable concentrate; aqueous / aqueous type emulsion; oily / reverse type emulsion; encapsulated granule; fine granulate; concentrated suspension for seed treatment; compressed gas; gas generating product; bait on grain; granulated bait; granulated; product for hot nebulization; macrogranulate; microgranulated; powder to disperse in oil; suspension concentrated dilutable in oil; liquid miscible in oil; dough ; stick for agropharmaceutical use; bait in wafer; powder for dry seed treatment; broken bait; treated or coated seeds; smoke candle; smoke cartridge; smoke; smoke granule; smoke stick; smoke tablet; smoke box; soluble concentrate;
  • insecticidal compositions described in document FR 2 805 971 can be used with the toxins according to the invention.
  • the invention relates to a method for combating insects comprising the application to plants infected with said insects of an insecticide-effective amount of an insecticide composition as described above or of recombinant vectors as described previously.
  • the invention also relates to a process for obtaining insecticidal toxins comprising: - obtaining at least one host cell as described above,
  • the invention also relates to a strain comprising a vector as described above, deposited at the CNCM under the reference plbacla2 CNCM 1-2699.
  • sequenced ends of fragments of the medium-sized library and those of the BAC library, and the sequencing of combinatorial PCR products, made it possible to link these contiguous sequences and to obtain the genomic sequence, in the form of a contig of 5 , 7 Mb.
  • the inventors proceeded in parallel with two methods.
  • the inventors have identified, by researching similarity "in silico", from genomic sequences, genes potentially responsible for entomotoxic activity.
  • the BAC library containing DNA fragments of Photorhabdus was screened in full in order to identify clones of Escherichia coli having insecticidal activity.
  • This bank constructed using the vector pBeloBACl 1, was deposited (CNCM n ° 1-2478) on July 12, 2001.
  • BAC1A2 clone having entomotoxic activity.
  • EXAMPLE 1 Sequencing and Analysis of the Photorhabdus Luminescens Genome
  • the inventors used the DNA of the TTO1 strain of Photorhabdus luminescens to undertake the sequencing of its genome, the size of which is 5.7 million base pairs.
  • Different genomic DNA libraries of Photorhabdus luminescens have been constructed for these purposes. From clones of these different libraries, 65,000 sequence readings of approximately 500 quality base pairs were performed - corresponding to a coverage of 7 times the length of the genome -, thus covering approximately 98-99% of this genome with non-redundant sequences. The assembly of these sequences using computer tools (Ewing B. et al., 1998, Genome Res. 8: 175-185; Ewing B.
  • a "scaffold" was constructed covering the entire genome.
  • the inventors used genomic DNA libraries of Photorhabdus luminescens, in particular a library constructed using BAC vectors (one copy per cell), the average sizes of the inserted DNA fragments being d 'around 50 kb. The sequencing of the ends of these fragments allows the prediction of the links between adjacent contigs.
  • the genomic DNA library was obtained in the bacterial vector (pBeloBACl 1, California Institute of Technology) according to the following steps: Step 1: bacterial culture and molding of the caps
  • caps are used immediately for restriction, they are stored in the TE IX solution at 4 ° C overnight.
  • Step 2 partial digestion of DNA in pieces of agarose
  • the agarose pieces are transferred to a water bath at 37 ° C and incubated for 10 minutes to 30 minutes (depending on the DNA contained in the agarose pieces);
  • Step 4 preparation of the vector
  • the ligation is carried out in 50 ⁇ l of a solution containing pBeloBACII (2 ⁇ l), of T4 ligase (1 ⁇ l at 1:10), a T4 lOx buffer (5 ⁇ l), and the DNA / agarose solution (42 ⁇ l), incubation for 20 hours at 16 ° C;
  • the ligation medium is heated for 15 minutes at 65 ° C;
  • the ligation medium is dialyzed against a Tris-EDTA buffer using Millipore membranes with a pore size VS 0.025 mM;
  • E. coli DH10B cells Gibco BRL
  • electroporation cuvettes with a width of 2 mm with the following settings 2.5 kV, 25 ⁇ F and 200 ⁇ ;
  • the cells are resuspended in 600 ⁇ l of SOC or NYZ medium and then incubated for 45 minutes at 37 ° C with shaking;
  • Step 6 Extraction of the plasmid DNA and sequencing of the inserts
  • Plasmid DNA extraction was carried out by the alkaline lysis technique in 24-well plates.
  • the sequencing of the clone inserts was carried out by the KIT PE Big Dye according to the conditions recommended by the manufacturer using the specific oligonucleotides of each vector.
  • the reactions are then introduced into the thermocycler in order to undergo 35 cycles composed of the following three stages: denaturation 10 seconds at 96 ° C, hybridization 10 seconds at 50 ° C, elongation 4 minutes at 56 ° C.
  • Precipitation is then carried out with 76% ethanol for 20 minutes at room temperature.
  • the plates are then centrifuged for 35 minutes at 2,200 g and then drained on absorbent paper and then centrifuged inverted on absorbent paper for 1 minute at 500 g so as to leave no trace of ethanol.
  • Step 7 mapping of the BAC clones on the genome of Photorhabdus luminescens
  • EXAMPLE 2 Entomopathogenic activity tests on Aedes larvae, carried out from the BAC library described above 1) Protocol used
  • Step 1 For screening the bank of BACs, the test first comprises two steps: Step 1
  • the BACs are cultivated in plates comprising 96 wells closed with a parafilm in LB (Luria-Bertani) / chloramphenicol medium at 12 ⁇ g / ml overnight at 37 ° C., with stirring at 250 rpm. Volume: 200 ⁇ l / well. 2nd step
  • the plates are centrifuged at 1100 g for 10 minutes and the LB (which is toxic to Aedes larvae) is aspirated. 200 ⁇ l of sterile water are then added.
  • Step 1 The bacteria can then bind and a measurement is made of OD 595. Similarly for the screening of individual BACs, the test comprises two first steps. Step 1
  • Step 2 the culture of BACs in a bottle is carried out on LB / chloramphenicol overnight until the log of the DO 595 is at least 1.
  • the bacteria are then centrifuged for 10 minutes at 5000 rpm and the pellet is washed with distilled water and again centrifuged.
  • the bacteria are then resuspended in water and sampled in triplicate (or more), in 96-well plates. A series of water dilutions can be made to assess the potential activity of these samples. The maximum concentration can result in an OD 595 of 1 (go to step 3).
  • the activity evaluation can also be carried out on samples of dry frozen bacteria.
  • the bacteria are cultured, washed with sterile water, resuspended in a small volume of water and frozen.
  • step 3 Following these steps 1 and 2, varying according to the type of screening, we proceed to step 3.
  • Step 5 measurement of the results As a positive control, wild strains of Photorhabdus are used.
  • an E. coli DH10B strain is used (the strain used for BACs and a control BAC, that is to say the strain DH 10B containing the BAC vector without inserted fragment. 2) Results In these tests on larvae of ⁇ edes, where they are fed Aedes with E. coli expressing each BAC clone were screened the complete BAC library. The inventors have identified a positive BAC. The results have been repeated with this BAC many times and are reproducible.
  • This BAC plate 1 line A, column 2, designated BAC1A2 causes paralysis and / or death of the larvae ⁇ edes.
  • the controls used in these tests include: a random BAC clone which has no effect against the larvae of Aedes, the E. coli DH10B strain (the strain in which the BAC library was cloned), a wild type strain Photorhabdus luminescens TTOl.
  • the activity observed with BAC1A2 is similar to that observed with a sample of wild Photorhabdus, while the strain of E. coli DH10B is inactive. In 96-well plates using Photorhabdus luminescens, there is the dead larvae with a DO595 for bacteria to 0.1 before the addition of larvae ⁇ edes. Death is also noted with an OD of 0.5 for BAC1 A2.
  • the percentage of mortality was 100% with the wild-type Photorhabdus, and of the order of 90 to 95% for the BAC1 A2.
  • Tests on BAC1A2 also show stability up to 60 ° C, the larvae die in wells containing BAC1A2 which were heated to 60 ° C.
  • larvae were able to feed on bacteria heated to all the temperatures tested.
  • the toxins obtained by the inventors typically retain their insecticidal activity for several weeks stored at approximately 4 ° C.
  • the clone BAC1A2 (deposit CNCM 1-2699), the size of the inserted fragment of which is 60131 bpd, comprises:
  • plgl ⁇ gl and plgl6el2 were transformed into E. coli strain DH10B.
  • 200 ⁇ l of each culture were pipetted into 12 wells from a 96-well plate. Plates were shaken for 10 minutes at 1000 rpm. The supernatant was removed. 200 ⁇ l of sterile water were added to each well and the bacteria were resuspended. OD 595 was measured, each well containing about 10 larvae ⁇ edes aegypti.
  • the two clones, plgl ⁇ gl and plgl6el2 have an insecticidal effect on the larvae, which is even faster and stronger than the effect of Photorhabdus and BAC1A2 This result is probably linked to the higher number of copies (5 copies per cell) of the vector pSYX34 in comparison with the vector pBELOBACl 1 (1 copy per cell).
  • the control larvae (DH10B and water) are not affected and remain very active.
  • the larvae in contact with Photorhabdus or BAC1A2 show slow motion and remain in the bottom of the well.
  • the larvae in contact with the clones plgl ⁇ gl and plgl6el2 are immobile and appear to be dead.
  • the larvae were prepared analogously to those of Aedes.
  • the inventors have prepared: - a subclone (construction deposited at the CNCM under No. 1-2752) containing the genes of sequences SEQ ID No. 2 (ORF 1) and SEQ ID No. 4 (ORF 2): these genes were amplified by PCR and stretch clones at the EcoRV site of pBluescript SK. This plasmid is named pDIA700 clones No.
  • Each well contains an agar support containing 15 g / l of agar (Difco) and 1.5 g / l of antifungal (nipagine, Sigma).
  • the larvae used for this test are larvae in the late phase of the L2 stage (2 nd larval stage), selected just before their moult towards the L3 stage.
  • the inventors observed that the larvae were clearly more sensitive to the bacterium at this stage L2 and that the tests there were much more reproducible.
  • the tests were carried out at 28 ° C. with a photoperiod of 11 hours: 13 hours (night: day). After 2 days, the treated leaves were replaced by untreated leaves. The larval mortality level was observed at 48 h, 72 h and 144 h after contact of the larvae with the treated leaves. Controls were used for the screening tests, including: Photorhabdus TTOl, and / or BAC8dl0 (containing the te locus) as positive controls. The negative controls corresponding to the constructions without insert were used adequately (pBeloBACl 1 in E. coli DH10B for the BAC clones, pSYX34 in E. coli XL10 for the plgl plgl subclone, E. coli XLlBlue for the pDIA subclones ). All these bioassays were carried out with a strain of Plutella xylostella from Martinique.
  • the larval mortality rate was corrected for the negative control using the Abbott equation (Abbott W.S., J. Econ. Entomol., 18: 265-267).
  • the inventors have demonstrated, according to a first series of tests, the insecticidal activity of BAC 1 A2 against lepidoptera, in particular Plutella xylostella, when the larvae were at the late L2 larval stage.
  • the wild strain of Photorhabdus has a strong insecticidal effect on the larvae of Plutella.
  • the effect obtained with BAC1A2 is significantly greater compared to the control.
  • the negative control corresponds to the dialysis elution buffer
  • the agar support contains 15 g / 1 of agar (Difco) and 30 mg / 1 of antifungal (Sigma).
  • Floral dip a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735-743. Gelvin 1998.

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Abstract

L'invention concerne notamment des séquences nucléotidiques isolées de Photorhabdus luminescens, des toxines codées par lesdites séquences, de procédés d'obtention de telles toxines, des compositions comprenant de telles toxines destinées à la lutte contre des insectes ravageurs des cultures ou nuisibles (car vecteurs de maladies) pour l'homme et les animaux, des plantes transformées exprimant de telles toxines.

Description

PROTEINES INSECTICIDES PHOTORABDUS LUMINESCENS
L'invention concerne notamment des séquences nucléotidiques isolées de
Photorhabdus luminescens, des toxines codées par lesdites séquences, des procédés d'obtention de telles toxines, des compositions comprenant de telles toxines destinées à la lutte contre des insectes ravageurs des cultures ou nuisibles (car vecteurs de maladies) pour l'homme et les animaux, des plantes transformées exprimant de telles toxines.
Il existe un très grand nombre d'agents insecticides chimiques destinés à lutter contre les insectes. Toutefois, certains des produits existants posent des problèmes de sélectivité contre telle ou telle catégorie d'insectes et de résistance contre ces substances.
De très nombreux types d'insectes sont à l'origine de graves dégâts sur les plantes de grande culture, notamment céréalières, florales, fruitières. Différentes techniques alternatives ont été développées, en particulier la lutte biologique par d'autres insectes ou par des agents biologiques tels que des bactéries capables de produire des toxines insecticides. On connaît également des plantes transgéniques exprimant de telles toxines insecticides.
Par exemple, le document WO 99/54472 décrit des toxines insecticides isolées de Xenorhabdus nematophilus, et des séquences nucléotidiques codant pour de telles toxines.
Le document US 6,281,413 décrit des toxines insecticides isolées de
Photorhabdus luminescens. Photorhabdus luminescens est une bactérie entomopathogène, commensale intestinale d'un nématode du genre Heterorhabditis.
Ces nématodes colonisent les larves d'insectes qu'ils détruisent et sur lesquelles ils se développent.
Le document FFRENCH-CONSTANT RICHARD H et al. (Appl. Environ. Microbiol., 2000 Aug., 66(8):3310-29) concerne l'identification de gènes codant pour des facteurs potentiellement virulents présents chez Photorhabdus luminescens. Les auteurs ont effectué un séquençage au hasard à partir de la librairie génomique de la souche W14, ce qui leur a permis d'isoler environ 2000 clones. Chacun de ces clones a été déposé dans la banque de données DDBJ/EMBL/GenBank (Accession no. AQ989457 à AQ991805). Le document DDBJ/EMBL/GenBank Accession no. BH 132741 a pour objet une séquence nucléotidique répertoriée BH 132741 dans GenBank, et correspond à un clone issu de la librairie d'ADN génomique à'Entamoeba histolytica.
Il existe toujours un besoin important de trouver des toxines efficaces contre les insectes nuisibles, en particulier contre des diptères (moustiques notamment) et des lépidoptères. L'invention vise à obtenir des plantes et/ou des compositions contenant de telles toxines capables d'inactiver ou de détruire des insectes ravageurs des plantes cultivées ou des insectes nuisibles vecteurs d'agents pathogènes pour l'homme, les animaux ou les plantes. L'invention vise également l'utilisation de telles toxines, pour des traitements -préventifs ou curatifs- des cultures contre des ravageurs.
A cet effet, les inventeurs ont réussi à identifier à l'aide d'une banque de BAC (chromosome artificiel bactérien), préparée à partir de Photorhabdus luminescens, des séquences nucléotidiques codant pour des toxines insecticides particulièrement efficaces contre des diptères, notamment les espèces de moustiques Aedes aegypti, Culex pipiens, Anophèles gambiae et Anophèles stephensie, et des lépidoptères notamment du genre Plutella.
A cet effet, l'invention a pour objet selon un premier aspect une séquence nucléotidique isolée de Photorhabdus luminescens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4, ladite séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.
La séquence SEQ ID N° 2 correspond aux nucléotides nt 81 13 à nt 8514 de la séquence SEQ ID N° 1 qui est la séquence nucléotidique d'un BAC, désigné BAC 1A2, déposé le 12 juillet 2001 à la CNCM sous le numéro 1-2699. Le BAC1A2 est un fragment d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens subsp.laumondii, souche TTOl (Fischer-Le Saux M. et al., 1998., Appl. Environ. Microbiol., vol. 64:4246), clone dans le vecteur pBeloBACl l (Kim V.J. et al., 1996, Genomics, vol. 34:213) dans la bactérie E. coli DH10B TH (Calvin N. M. and Hanawalt P.C, 1998, J. Bacteriol., 170, 2796).
La séquence SEQ ID N° 4 correspond aux nucléotides nt 8544 à nt 9803 de la séquence SEQ ID N° 1 de ce BAC1 A2.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques choisies parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 70 % d'identité avec SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 ; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 ; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence définie en a) ou b) ; d) un fragment représentatif d'une séquence définie en a), b) ou c), d'au moins 10, de préférence au moins 20 paires de base ; e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c), d) ou e) ; de préférence, ladite séquence code pour au moins un polypeptide actif contre des insectes. Dans le présent document, on utilisera l'expression « séquence nucléotidique à expression insecticide » pour désigner ces séquences nucléotidiques SEQ ID N° 2, SEQ
ID N° 4, et les séquences variantes définies en a) à f).
La séquence SEQ ID N° 2 correspond à un cadre ouvert de lecture désigné
ORF1 et code pour la protéine de 133 acides aminés de séquence SEQ ID N° 3. La séquence SEQ ID N° 4 correspond à un cadre ouvert de lecture désigné
ORF2 et code pour la protéine de 419 acides aminés de séquence SEQ ID N° 5.
Les séquences SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 se distinguent nettement de l'art antérieur. Aucune similarité significative n'a été identifiée, en utilisant par exemple le programme BESTFIT connu de l'homme du métier, entre ces séquences et les séquences SEQ ID N° 12, 13, 14 du document US
6,281,413.
Seule une faible similarité (toujours inférieure à 50 %) entre la séquence SEQ ID
N° 3, et les protéines codées par l'ORF 1 du document WO 99/54472 (SEQ ID N° 2,
SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 13) a été notée. De même, seule une faible similarité (toujours inférieure à 50 %) entre la séquence SEQ ID N° 5, et les protéines codées par l'ORF 2 du document WO 99/54472
(SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 1 1, SEQ ID N° 14) a été notée. Par l'expression « activité insecticide » ou « composé actif contre des insectes », on entend que les toxines sont capables de lutter contre des insectes, en les tuant ou en les inactivant par exemple par une baisse ou une perte d'appétit vis-à-vis des plantes d'intérêt cultivées. Le résultat est typiquement la destruction, ou la baisse de croissance et/ou de la reproduction de l'insecte nuisible cible. Par « insecticide », on entend également « biopesticide ».
La liste d'insectes ci-dessus (diptères, notamment les espèces de moustiques appartenant aux genres Aedes, Culex, Anophèles, et lépidoptères notamment Plutella) n'est pas exhaustive : l'efficacité insecticide des séquences selon l'invention sur d'autres insectes peut être criblée sans effort excessif par l'homme du métier, maintenant que sont connus le BAC1A2 et le protocole de test d'activité biologique, notamment à l'aide des techniques appropriées présentées dans la description détaillée, en particulier des exemples 2 et 3. Des tests semblables, utilisant par exemple une autre espèce d'insecte cible, permettent également de mesurer ladite activité insecticide. Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN. Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel, et sont naturels ou artificiels.
Par "séquence nucléotidique homologue", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère des séquences nucléotidiques comprenant SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 (en particulier qui diffère des séquences SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4) par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucleotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues possèdent une activité insecticide telle que décrite précédemment. De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 70, 75 % des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4, de préférence au moins 80, 85 %, de préférence encore au moins 90, 92, 95, 98, 99 %. Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après leur meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé à l'aide d'algorithmes mathématiques. D'une manière préférée, non limitative, on peut citer différents algorithmes rappelés dans le document Fundamentals of database searching (review) Stephen F., Altschul, Bioinformatics : A trends Guide, 1998, 5:7-9, notamment les algorithmes de Kariin et Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modifié dans Kariin et Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. On pourra utiliser en particulier les programmes :
- BLAST, notamment BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999, "Blast 2 séquences- a new tool for comparing protein and nucleotide séquences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), gapped BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17):3389- 3402),
- FASTA (Altschul S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410),
- Clustal W (Thompson, J. D. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-80),
- BESTFIT.
L'algorithme BLAST est décrit en détail sur le site du NCBI http:ww.ncbi.nih.gov.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire d'une séquence codant pour une toxine insecticide, dans des conditions stringentes. On utilisera par exemple les conditions suivantes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20mM, pH 7,5) contenant 5X SSC (IX SSC correspond à une solution 0.15M NaCl + 0.015 M de citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10X de solution de Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (par exemple 42°C pour une sonde de taille supérieure à 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2X SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0.1 X SSC + 0,1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0.1 X SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille supérieure à 100 nucléotides.
Les conditions d'hybridations de fortes stringences décrites ci-dessus peuvent être adaptées par l'homme du métier pour les polynucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon les enseignements appropriés connus de l'homme du métier, notamment décrits dans Sambrook et al., (1989, Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), Maniatis et al., 1982 (Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.CSH, N.Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions et dans Ausubel et al., Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N.Y.).
Par « fragment nucléotidique », on entend d'une part tout fragment d'une séquence nucléotidique comprenant SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 (en particulier tout fragment de SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4), ou tout fragment de séquences homologues à ces séquences, lesdits fragments codant pour un peptide à activité insecticide telle que définie précédemment. Ces fragments nucléotidiques présentent au moins 10 nucléotides, de préférence au moins 10, 15, 30, 45, 75, 150, 300 nucléotides consécutifs de la séquence dont ils sont issus. De préférence, ces fragments nucléotidiques codent pour des peptides présentant une activité insecticide de préférence d'au moins 10, 20, 30, 50, 80, 90 %, voire plus de 100 %, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 5 codées par les séquences à expression insecticide SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4. Pour tester cette activité insecticide, l'homme du métier dispose notamment de la méthode présentée dans les exemples détaillés décrits ci-après. Le présent document enseigne ainsi à l'homme du métier d'utiliser également les fragments ou les homologues définis précédemment, notamment d'utiliser les éléments fonctionnels de ces séquences qui déterminent l'expression insecticide, et donc de ne pas utiliser nécessairement les éléments non essentiels à cette expression. L'invention concerne ainsi selon un aspect les séquences nucléotidiques qui comprennent au moins un tel fragment et codent pour un polypeptide ayant une activité insecticide.
Par fragments représentatifs selon l'invention on entend également des sondes ou amorces, qui peuvent être utilisées dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléiques. Ces procédés peuvent faire intervenir des techniques d'amplification du type PCR (décrite par exemple dans le document US 4,683,202) ou PCR like, comme par exemple les techniques connues de l'homme du métier SDA (Strand Displacement Amplification), TAS (Transcription- based Amplification System), NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) LCR (Ligase Chain Reaction). Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acide nucléique simple brin ou un fragment double brin dénaturé comprenant au moins 8 bases, de préférence au moins 10, 15, 20, 25 et 30 bases, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible. De telles sondes seront en particulier utilisables dans des programmes de sélection assistée par marqueur, par exemple pour suivre l'intégration du gène de la toxine dans la plante transformée. Pour cela au moins une de ces sondes est marquée, par exemple par un isotope radioactif, puis mise en contact avec de l'ADN génomique de la plante, préalablement digéré par des enzymes de restriction, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de la sonde marquée à l'ADN en question. Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques de fragments représentatifs de la séquence SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4, ou de leur séquence complémentaire comme amorces ou sondes pour la détection, l'identification, le dosage ou l'amplification des séquences SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 ou de leur séquence complémentaire. Les procédés visant de telles utilisations mettant en œuvre ces dits fragments en tant qu'amorces ou sondes font également partie de l'invention.
Par séquence nucléotidique modifiée, on entend toute séquence nucléotidique obtenue typiquement par mutagenèse selon des techniques appropriées, et comportant des modifications par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4, ou les séquences variantes (séquences nucléotidiques définies en a) à e) précédemment). Ces modifications peuvent entraîner selon une variante préférée une augmentation du niveau d'expression insecticide. On peut par exemple utiliser la mutagenèse dirigée site spécifique, décrite dans Upender et al., 1995, Biotechniques 18(l):29-30, ou des techniques de mutagenèse du type DNA shuffling décrite dans le document US 5,605,793. On peut par exemple obtenir des séquences mutées de SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4, par délétions, et cribler des mutants actifs pour identifier des régions toutes particulièrement associées au niveau d'activité insecticide. L'invention concerne selon un autre aspect un polypeptide insecticide codé par une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que décrite précédemment. L'invention concerne également les polypeptides choisis parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 ; b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) comportant au moins
80 %, de préférence au moins 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; c) un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15, 20, 23, 25, 30, 40, 50, 100 amino-acides consécutifs d'un polypeptide défini en a), ou b) ; d) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a), b), ou c) ; de préférence, ledit polypeptide a une activité insecticide telle que décrite précédemment. On emploie dans ce texte indifféremment le terme polypeptide insecticide ou toxine insecticide pour désigner un polypeptide selon l'invention ayant une activité insecticide telle que décrite précédemment. Le terme polypeptide est utilisé pour désigner également une protéine ou un peptide.
De préférence, un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 ou d'une séquence possédant au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité avec la SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 après alignement optimal. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimum 10 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100 amino-acides consécutifs. Les fragments de polypeptide selon l'invention obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l'invention.
Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, peuvent être remplacés par des acides aminés « équivalents ». L'expression acide aminé « équivalent » vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles souhaitées, en l'occurrence n'entraînant pas une perte de l'activité insecticide. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'amino-acides. Un polypeptide variant, un polypeptide homologue ou un fragment de polypeptide selon l'invention possède au moins 10 %, de préférence au moins 20, 30, 50, 80, 90 %, voire plus de 100, 120, 150 %, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 5.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides tels que décrits précédemment.
Dans le présent document, les expressions « isolé » et « purifié » se réfèrent à un niveau de pureté réalisable en utilisant les connaissances actuelles de l'homme du métier.
Les molécules selon l'invention n'ont pas besoin d'être absolument pures (c'est- à-dire ne contenant absolument aucune molécule autre que des macromolécules cellulaires), mais devraient être suffisamment pures de sorte que l'homme du métier identifie qu'elles ne sont plus présentes dans l'environnement dans lequel elles ont été initialement trouvées (le milieu cellulaire).
L'invention concerne selon un autre aspect une cassette d'expression comprenant une séquence promoteur liée de manière opérationnelle dans la plante transformée à une séquence nucléotidique selon l'invention codant pour une toxine insecticide, et à région de terminaison de la transcription. La préparation d'une cassette d'expression ADN peut être réalisée de différentes manières appropriées par l'homme du métier. Par exemple, au moins une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que définie précédemment, peut être clonée en aval du promoteur en utilisant des enzymes de restriction pour assurer son insertion dans une orientation appropriée au regard du promoteur de manière qu'il soit exprimé. Une fois cette séquence d'intérêt liée opérationnellement au promoteur, la cassette d'expression ainsi formée peut être clonée dans un plasmide ou autre vecteur. La séquence promoteur contrôle la transcription en un ARN messager fonctionnel codant pour une protéine insecticide. La cassette d'expression peut être chimérique ou naturelle, mais typiquement elle est hétérologue vis-à-vis de l'hôte, ce qui implique l'introduction dans l'hôte par une transformation. On connaît un grand nombre de promoteurs de plantes, rappelés notamment dans le document WO 01/70778. On peut utiliser un promoteur constitutif ou inductible, un promoteur spécifique d'un tissu, d'un organe, d'un stade de développement, par exemple spécifique du phloème afin de lutter contre des insectes qui prélèvent la sève élaborée.
Selon un mode de réalisation, l'expression du gène d'intérêt est régulée, en plus de par la séquence promoteur, par l'utilisation de séquences appropriées capables de renforcer l'activité de cette séquence promoteur, telles que des introns, par exemple l'intron de l'actine 1 ou 2, l'intron DSV de la mosaïque jaune du tabac (Morris et al., 1992, Virology, 187:633), des séquences « enhancers », par exemple certains éléments du promoteur CaMV35S et de gènes de l'octopine synthase (US 5,290,924), des séquences « leaders » (typiquement des séquences situées entre le site d'initiation de la transcription et le début de la séquence codante, en particulier des séquences leader consensus qui stabilisent l'ARNm et empêchent une initiation inappropriée de la transcription), par exemple le leader EMCV (Leroy-Stein et al., 1989, PNAS USA, 86:6126-6130), le leader TMV (Gallie et al., 1989, Molecular Biology of RNA, pages 237-256). Parmi les séquences terminateurs, on peut citer le terminateur nos (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res., l l(2):369-385), et le terminateur de gène d'histone (EP 0 633 317).
Selon une variante, la cassette d'expression contient des séquences d'adressage subcellulaire, en particulier une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion de la protéine, ou une séquence codant pour un peptide de transit adressant la toxine dans les chloroplastes (par exemple le peptide de transit optimisé décrit dans le document EP 0 508 909).
Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant une cassette d'expression telle que décrite précédemment.
Selon une réalisation, le vecteur est un type virus et comprend dans son génome une séquence polynucléotidique selon l'invention, liée opérationnellement à un promoteur inductible ou constitutif approprié.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une cellule hôte transformée avec les séquences nucléiques décrites ci-dessus.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une cellule hôte comprenant une telle cassette d'expression. Typiquement l'organisme hôte est une bactérie, une levure, une cellule de plante, un champignon.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'un polypeptide mettant en œuvre au moins un vecteur ou une cellule tels que décrits précédemment. L'invention concerne aussi un polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par ce procédé.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'un polypeptide synthétique utilisant une séquence d'acides aminés d'un polypeptide insecticide tel que défini précédemment.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique, d'un vecteur, d'une cellule hôte, tels que décrits précédemment pour la biosynthèse de polypeptides insecticides. Le terme « une » fait bien entendu référence à « au moins une ». Selon un autre aspect, l'invention concerne les séquences nucléotidiques selon l'invention, enregistrées sur un support, dénommé support d'enregistrement, dont la forme et la nature facilitent la lecture, l'analyse et l'exploitation desdites séquences. On pourra préférer parmi ces supports des supports lisibles par un ordinateur, tels que les supports magnétiques, optiques, électriques ou hybrides comme par exemple les disquettes ou disques « floppy », les CD-ROM ou les cassettes d'enregistrement.
Selon un autre aspect, l'invention concerne les cellules végétales transformées par un vecteur tel que défini précédemment, à l'aide d'un tel hôte cellulaire susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques promoteur initialement contenues dans le génome du vecteur utilisé.
La transformation des plantes peut être obtenue par différentes techniques appropriées connues de l'homme du métier, notamment rappelées dans les références : Ed. DUNOD Physiologie végétale, Tome 2 Développement Heller, Esnault et Lance, 2000, Methods of Molecular Biology: Plant gène transfer and expression protocols ; Hansen et al., 1999, Récent advances in the transformation of plants, Trends in plant science, vol. 4, n° 6, 226 ; S.B. Gelvin, The introduction and expression of transgenes in plants, Current opinion in biotechnology, 1998, 227 ; Hellens et al., 2000, Trends in plant science, vol. 5, n° 10, A guide to Agrobacterium binary Ti Vectors, 446 ; Franken et al., Recombinant proteins from transgenic plants, Current opinion in biotechnology, 8:41 1-416 ; Schuler et al., 1998, Insect-resistant transgenic plants, Tibtech, vol. 16, 168 ; Michelmore. M., 2000, Genomic approaches to plant disease résistance, Current opinion in biotechnology, 3: 125-131.
Le terme transformation fait référence à une manipulation génétique de cellules végétales susceptibles d'être transformées tels que des cellules de cals, d'embryons, des cellules en suspension dans des cultures (cultures issues par exemple de cals, d'embryons, de tissus de feuilles, d'inflorescences jeunes, d'anthères) des plantes. Le terme "transgénique" ou "transformée" en référence à une cellule de plante, une partie de plante, fait référence à ces éléments comprenant un segment d'ADN (de manière préférée une séquence nucléotidique ou une cassette d'expression selon l'invention) présélectionné isolé purifié qui a été introduit dans ledit élément par une méthode de transformation génétique. On citera notamment : la transformation de protoplastes, les techniques biolistiques ou de bombardements de microprojectiles, la transformation à l'aide de bactéries notamment ^Agrobacterium ou de vecteurs viraux, des procédés directement in planta.
Dans le cas d'une transformation de protoplastes, les protoplastes sont typiquement isolés, soit mécaniquement, soit par voie enzymatique pour séparer les parois cellulaires. Les protoplastes sont obtenus typiquement à partir de lignées cellulaires de cals obtenues d'embryons immatures, d'inflorescences immatures, de mésocotyles, d'anthères. Les protoplastes peuvent être transformés par Agrobacterium ou par insertion directe d'ADN facilitée par un traitement au polyéthylène glycol ou par électroporation (Lazzeri, Methods Mol. Biol., 49:95-106,1995). Dans certaines espèces, on peut isoler les protoplastes de mésophylles, méthode qui permet d'obtenir des résultats indépendants du génotype.
Parmi les méthodes biolistiques rappelées dans Finer et al., T. Parti cle bombardment-mediated transformation, Current Topics in Microbiology and
Immunology, Vol. 240, on pourra utiliser notamment le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt, en particulier en utilisant un canon à particules de tungstène ou d'or.
On pourra préférer aux méthodes biolistiques des méthodes agrolistiques décrites dans Hansen et al., Agrolistic transformation of plant cells : intégration of T- strands generated in planta. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93:14978-14983, notamment afin d'intégrer un faible nombre de copies du transgène.
De nombreuses techniques de transformation utilisant Agrobacterium sont utilisables, telles que celles décrites dans le document Zupan, J. et al., 2000, The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant J., 23: 1 1-28 ; US 6,037,522 ; US 6,265,538. La transformation par Agrobacterium tumefaciens peut être effectuée pour des Dicotylédones (tabac, pomme de terre) et des Monocotylédones (blé, orge, sorgho, maïs, riz notamment) même si ces dernières ne sont généralement pas leur hôte naturel. On utilisera notamment des techniques connues pour le blé (McCormac et al., Euphytica, vol. 99(1): 17-25, 1998), le maïs (Ishidia et al., Nat. Biotechnol.,14(6):745-750, 1996). En outre, dans la mesure où l'intégration des gènes se fait essentiellement au hasard dans le génome, on observe souvent une variabilité entre les plantes transgéniques. On cherchera à obtenir de préférence des transformants comprenant une copie unique du transgène, ségrégée comme un caractère mendélien avec une expression uniforme d'une génération à la suivante. On recherche ainsi une expression stable du transgène avec un niveau d'expression souhaité.
L'homme du métier connaît un grand nombre de plasmides utilisables dans le cadre de l'invention, rappelés notamment dans le document Trends in plant science, Oct. 2000, vol. 5, n° 10, p 446, et adaptera les conditions de transformation au plasmide utilisé. On pourra par exemple utiliser de manière préférée, certains plasmides Ti binaires, tels que pBIN19, pMON, pGREEN, dont la séquence accessible permet la définition de cartes de restriction précise. La transformation dite in planta, décrite notamment dans Bechtold et al., 1993,
In planta Agrobacterium-mediated gène transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants, C.R. Acad. Sci., Paris, Life Sciences 316: 1 194-1 199, et Clough et al., 1998, Floral dip.: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J., 16:735-743, a l'avantage de ne pas nécessiter d'étape de culture de tissus. Le transgène est introduit dans des plantes intactes sous forme d'ADN nu ou par Agrobacterium, généralement au stade de la formation du zygote.
Les techniques et les agents pour sélectionner les cellules végétales et/ou les tissus végétaux incorporant des séquences nucléotidiques marqueurs associées au gène d'intérêt sont également bien connues de l'homme de métier, et comprennent, de manière non exclusive, l'utilisation de gènes marqueurs tels que des gènes conférant des résistances à un antibiotique ou à des herbicides, ou de systèmes de sélection positive, cités par exemple dans Gelvin 1998, en particulier le système basé sur une sélection sur mannose, en présence du gène de sélection de la MPI (Mannose-6-phosphate isomérase) (Hansen et Wright, 1999), ou de systèmes de sélection couplés à l'élimination des gènes marqueurs après sélection (Ebinuma et al., 1997). Enfin, les plantes transformées peuvent également être sélectionnées par criblage PCR en l'absence de gènes marqueurs de sélection (McGarvey et Kaper, 1991).
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins une toxine insecticide selon l'invention dans ses tissus, comprenant l'introduction d'une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que décrite précédemment dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite cassette d'expression. Ladite cassette est intégrée de manière stable dans le génome.
Selon une réalisation, le procédé comprend en outre l'identification et la sélection des cellules transformées capables de régénérer des plantes exprimant des toxines insecticides par rapport à une plante non transformée.
La sélection de produits de la transformation, c'est-à-dire résultant immédiatement du processus de transformation, et des plantes transgéniques en résultant, peut être réalisée de différentes manières. Les techniques de croissance de cultures de plantes sont connues de l'homme du métier, par exemple dans McCormick, 1986, Plant Cell Reports, 5:80-84. L'ADN recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique selon l'invention est transmis au cours d'un cycle de reproduction de la plante transgénique à sa descendance de manière à être exprimé dans les plantes de la descendance. L'invention concerne donc également les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines contenant les séquences d'acide nucléique selon l'invention décrites précédemment. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules et analogues sont également dans le cadre de l'invention.
Les tissus, parties de plantes, plantes ou graines, sont résistants aux insectes. L'invention inclut les plantes transgéniques fertiles obtenues ainsi que leur descendance et le produit de cette descendance. Les plantes transgéniques hybrides, obtenues par le croisement d'au moins une plante selon l'invention avec une autre, font aussi partie de l'invention. Les plantes transgéniques selon l'invention comprennent notamment une plante transgénique T0 ou R0, c'est-à-dire la première plante générée à partir de cellules de plantes transformées, la plante transgénique Tl ou RI, c'est-à-dire la première génération de descendance, et les plantes de la descendance de générations suivantes obtenues qui comprennent et expriment l'ADN recombinant. Par exemple, on procédera selon les étapes suivantes : - obtention de plantes parentes d'une première lignée, et d'une deuxième lignée (lignée donneuse comprenant un transgène selon l'invention),
- pollinisation de fleurs du premier parent par le pollen du deuxième parent,
- récolte des graines produites par le premier parent. On peut effectuer des backcross afin d'obtenir l'introgression de l'ADN insecticide d'intérêt.
Pour confirmer la présence de la cassette d'expression, et en particulier du gène de toxine d'intérêt selon l'invention dans les plantes régénérées, on peut utiliser un grand nombre de techniques appropriées, par exemple l'analyse PCR ou des techniques d'hybridation Southern blot, pour déterminer la structure de l'ADN recombinant, la détection de l'ARN transcrit à partir de l'ADN du gène d'intérêt exprimé dans des cellules de plantes transformées, des techniques de repérage de la production de protéines codées par le gène d'intérêt, telles que l'électrophorèse de protéines sur gel, des techniques Western blot. Les plantes transformées selon les méthodes décrites peuvent être des monocotylédones ou des dicotylédones, notamment le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, la pomme de terre, le pois, le soja, le tabac, le colza, la tomate, le tournesol, le coton, le riz, le haricot, le chou-fleur, le brocoli, la laitue, le radis, le céleri, l'épinard, l'oignon, l'ail, la carotte, la pomme, la poire, le melon, la cerise, la pêche, l'abricot, la framboise, la fraise, l'ananas, l'avocat, la banane, la canne à sucre.
L'homme du métier sera en outre capable d'augmenter le niveau de production par les plantes transformées en augmentant le contenu en base GC des séquences codantes. En outre l'homme du métier utilisera des séquences le cas échéant modifiées pour obtenir une expression appropriée selon qu'il s'agisse de plantes monocotylédones ou dicotylédones.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une composition pour la lutte contre des insectes nuisibles ainsi que des procédés mettant en œuvre de telles compositions, ces compositions comprenant au moins une toxine insecticide ou composé insecticide selon l'invention telle que décrite précédemment. Par composition insecticide, on entend une composition phytosanitaire ou pharmaceutique comprenant comme matière active une quantité efficace de toxine insecticide selon l'invention. Dans l'utilisation pour la protection de cultures, les compositions seront typiquement en association avec un support solide ou liquide, acceptable en agriculture et/ou un agent tensioactif également acceptable en agriculture. Dans le domaine pharmaceutique, les moustiques étant vecteurs de maladies pour l'homme et les animaux, les compositions pharmaceutiques comprendront les transporteurs pharmaceutiquement acceptables appropriés associés à la toxine insecticide. De tels transporteurs sont connus de l'homme du métier, par exemple décrits dans le document US 5,877,322.
Au sein des différentes variantes de compositions insecticides pour la protection des cultures selon la présente invention, le composé insecticide est mis en œuvre dans des quantités efficaces mais non phytotoxiques. Par quantité efficace et non phytotoxique, on entend une quantité de matière active suffisante pour permettre le contrôle ou la destruction des insectes présents ou susceptibles d'apparaître sur les cultures, et n'entraînant pour lesdites cultures aucun symptôme notable de phytotoxicité. Une telle quantité est susceptible de varier dans de larges limites selon l'insecte à combattre, le type de culture, les conditions climatiques, et les composés compris dans la composition insecticide selon l'invention. Cette quantité peut aisément être déterminée par des essais systématiques au champ, à la portée de l'homme du métier.
Selon une réalisation, une composition insecticide comprend au moins une cellule hôte telle que décrite précédemment. Pour leur emploi dans la pratique, les différentes compositions insecticides selon l'invention sont typiquement associées à un support, solide ou liquide, utilisable dans le domaine de l'agriculture, et éventuellement à au moins un agent tensioactif et/ou un ou plusieurs agents auxiliaires.
En particulier, comme supports, sont utilisables les supports inertes et usuels ; de même que, comme agents tensioactifs, sont utilisables les agents tensioactifs usuels dans le domaine de la mise en formulation de compositions destinées à des usages en agriculture, notamment pour le traitement ou la protection des cultures.
Les compositions insecticides selon l'invention comprennent typiquement entre 0,00001 et 100 %, de préférence entre 0,001 et 80 %, de composé insecticide. Les proportions et pourcentages employés ou décrits dans ce texte sont des proportions ou pourcentages en poids. Par le terme support, dans le présent exposé, on désigne une matière organique ou minérale, naturelle ou synthétique, avec laquelle la matière active est associée pour faciliter son application, notamment sur la plante, ou encore sur des graines ou sur le sol. Ce support est donc généralement inerte et il doit être acceptable en agriculture, notamment par la plante traitée. Le support éventuellement mis en œuvre pour la formulation de compositions selon l'invention peut être solide ou liquide.
Comme exemples de supports solides utilisables pour la formulation de compositions selon l'invention, on peut mentionner les silicates naturels ou synthétiques, les résines, les cires, les poudres fines ou les granules d'argile, notamment d'argile kaolinique, de terre de diatomées, de bentonite ou d'argile acide, l'oxyde de silicium hydraté synthétique, les talcs, les céramiques, d'autres minéraux dont la séricite, le quartz, le soufre, le charbon actif, le carbonate de calcium, la silice hydratée, ou encore les engrais industriels comme le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'urée ou le chlorure d'ammonium. Comme exemples de supports liquides utilisables pour la formulation de compositions selon l'invention, on peut mentionner l'eau, les alcools et notamment le méthanol ou l'éthanol, les cétones et notamment l'acétone, la méthyléthylcétone ou la cyclohéxanone, les fractions de pétrole, les hydrocarbures aromatiques dont le benzène, le toluène, le xylène, l'éthylbenzène ou le méthylnaphtalène, les hydrocarbures non aromatiques dont l'hexane, le cyclohexane, le kérosène ou le gazole, le gaz liquéfié, les esters dont l'acétate d'éthyle et l'acétate de butyle, les nitriles dont l'acétonitrile et l'isobutyronitrile, les éthers dont l'éther diisopropylique ou le dioxanne, les amides dont le N,N-diméthylformamide ou le N,N-diméthylacétamide, les hydrocarbures halogénées dont le dichlorométhane, le trichloroéthane ou le tétrachlorure de carbone, le diméthylsulfoxyde, les huiles végétales dont l'huile de soja ou l'huile de coton.
L'agent tensioactif peut être un agent émulsionnant, dispersant ou mouillant de type ionique ou non ionique.
On peut, par exemple, citer des sels d'acides polyacryliques, des sels d'acides lignosulfoniques, des sels d'acides phénolsulfoniques ou naphtalènesulfoniques, des polycondensats d'oxyde d'éthylène sur des alcools gras ou sur des acides gras ou sur des aminés grasses, des phénols substitués, notamment des alkylphénols ou des arylphénols, des sels d'esters d'acides sulfosucciniques, des dérivés de la taurine, notamment des alkyltaurates, des esters phosphoriques d'alcools ou de phénols polyoxyéthylés ; on peut tout particulièrement citer les sels d'alkylsulfonates, les alkylarylsulfonates, les éthers alkylaryliques, leurs dérivés polyoxyéthyléniques, les polyéthylèneglycoléthers, les esters de polyalcools, les dérivés de sucres, alcools et autres. La présence d'au moins un agent tensioactif est généralement appropriée lorsque au moins une des matières actives et/ou le support inerte ne sont pas solubles, notamment dans l'eau, dans le cas où l'agent vecteur de l'application est l'eau.
Les compositions insecticides selon l'invention peuvent également contenir toute sorte d'autres ingrédients ou agents tels que, par exemple, des colloïdes protecteurs, des adhésifs, des agents épaississants, des agents thixotropes, des agents de pénétration, des agents stabilisants dont le phosphate acide d'isopropyle, le 2,6-di-tert- butyl-4-méthylphénol, le 2-tert-butyl-4-méthoxyphénol et le 3-tert-butyl-4- méthoxyphénol, des huiles végétales ou minérales, des acides gras ou leurs esters, des agents séquestrants, des agents dispersants dont la caséine, la gélatine, des saccharides et notamment la poudre d'amidon, la gomme arabique, certains dérivés de la cellulose ou l'acide alginique, des dérivés de la lignine, la bentonite, des polymères synthétiques solubles dans l'eau, notamment l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, les acides polyacryliques, etc., ainsi que d'autres matières actives connues pour leurs propriétés pesticides, notamment insecticides ou fongicides ; ou pour leurs propriétés favorisant la croissance des plantes, notamment des engrais ; ou pour leurs propriétés régulatrices de la croissance des plantes ou des insectes.
Plus généralement, le composé insecticide peut être associé à tous les additifs solides ou liquides correspondant aux techniques habituelles de la mise en formulation, particulièrement la mise en formulation de produits ou compositions destinées à des usages ou à des utilisations en agriculture ou en hygiène publique.
Ainsi, les compositions selon l'invention peuvent prendre la forme d'assez nombreuses formulations parmi lesquelles on peut citer les solutions huileuses, les concentrés émulsionnables, les poudres mouillables, les formulations fluides et notamment les suspensions aqueuses ou les émulsions aqueuses, les granulés, les poudres, les aérosols, les formulations pour nébulisation notamment les formulations pour brumisation, les formulations à très bas volume, les pâtes, les émulsions, les suspensions concentrées, de même que d'éventuels mélanges, associations ou combinaisons de ces différentes formes.
Le plus souvent, pour les formulations de type poudres pour poudrage ou dispersion, la teneur en composé insecticide peut aller jusqu'à 100 % ; de même, pour les formulations sous forme de granulés, notamment ceux obtenus par extrusion, par compactage, par imprégnation d'un support granulé, par granulation à partir d'une poudre, la teneur en composé insecticide dans ces granulés est le plus souvent comprise entre 0,5 et 80 %.
Les compositions insecticides selon l'invention, dites compositions concentrées, comprenant un composé insecticide qui sont sous forme de concentrés émulsionnables ou solubles comprennent le plus souvent de 25 à 100 % de matières actives, les émulsions ou solutions prêtes à l'application contenant, quant à elles, de 0,00001 à 20 % de matières actives.
Selon une réalisation, la matière active A est combinée le cas échéant à au moins une autre matière active ou composé insecticide issue de Photorhabdus luminescens ou d'autres microorganismes.
En plus du solvant, les concentrés émulsionnables peuvent contenir, lorsque c'est nécessaire, 2 à 20 % d'additifs appropriés tels les agents stabilisants, les agents tensioactifs, les agents de pénétration, les inhibiteurs de corrosion, les colorants ou les adhésifs précédemment cités.
Les compositions insecticides selon l'invention sous forme de suspensions concentrées, également applicables en pulvérisation, sont préparées de manière à obtenir un produit fluide, stable, ne se déposant pas ; elles contiennent habituellement de 2 à 75 % de matière active, de 0,5 à 15 % d'agents tensioactifs, de 0,1 à 10 % d'agents thixotropes, de 0 à 10 % d'additifs appropriés, comme des agents anti-mousse, des agents inhibiteurs de corrosion, des agents stabilisants, des agents de pénétration et des adhésifs ; et, comme support, de l'eau ou un liquide organique dans lequel la, ou les, matière active est peu ou pas soluble, ou encore des mélanges de plusieurs de ces solvants, organiques ou non. Certaines matières organiques solides ou des sels minéraux peuvent être dissous dans le support pour freiner ou interdire la sédimentation ; ou bien encore de telles matières peuvent être employées comme agents antigels pour l'eau. Les compositions insecticides selon l'invention qui prennent la forme de poudres mouillables ou à pulvériser sont habituellement préparées de sorte qu'elles contiennent de 20 à 95 % de matières actives.
Par ailleurs, elles contiennent habituellement, outre un support solide, de 0 à 5 % d'un agent mouillant, de 3 à 10 % d'un agent dispersant, et, le cas échéant, de 0 à 10 % d'un ou plusieurs agents stabilisants et/ou autres additifs, comme des agents de pénétration, des adhésifs, ou des agents anti-mottants, colorants, etc.
Pour obtenir ces poudres à pulvériser ou poudres mouillables, sont intimement mélangées la ou les matières actives dans des mélangeurs appropriés avec les substances additionnelles, et on les broie avec des moulins ou autres broyeurs appropriés. On obtient alors des poudres à pulvériser dont la mouillabilité et la mise en suspension sont particulièrement avantageuses.
On peut les mettre en suspension avec de l'eau à toute concentration désirée.
Plutôt que des poudres mouillables, on peut réaliser des compositions insecticides selon l'invention qui soient sous forme de pâtes.
Les conditions et modalités de réalisation et d'utilisation de ces pâtes sont similaires à celles des poudres mouillables ou à pulvériser.
Comme cela a déjà été dit, les dispersions et émulsions aqueuses, par exemple les compositions insecticides obtenues en diluant à l'aide d'eau une poudre mouillable ou un concentré émulsionnable selon l'invention, sont comprises dans le cadre général de la présente invention.
Les émulsions peuvent être du type eau-dans-1'huile ou huile-dans-1'eau et elles peuvent avoir une consistance épaisse ou assez épaisse.
De manière plus générale, les compositions selon l'invention peuvent prendre de nombreuses formes de formulations ; ainsi on peut employer ces compositions comprenant un composé insecticide en générateur d'aérosol ; appât (prêt à l'emploi) ; concentré pour préparation d'appâts ; appât en stoc ; suspension de capsules ; produit pour nébulisation a froid ; poudre pour poudrage ; concentré émulsionnable ; émulsion de type aqueux/aqueuse ; émulsion de type huileux/inverse ; granulé encapsulé ; granulé fin ; suspension concentrée pour traitement de semences ; gaz comprimé ; produit générateur de gaz ; appât sur grain ; appât granulé ; granulé ; produit pour nébulisation a chaud ; macrogranulé ; microgranulé ; poudre à disperser dans l'huile ; suspension concentrée diluable dans l'huile ; liquide miscible dans l'huile ; pâte ; bâtonnet à usage agropharmaceutique ; appât en plaquette ; poudre pour traitement de semences à sec ; appât sur brisures ; semences traitées ou enrobées ; bougie fumigène ; cartouche fumigène ; fumigène ; granulé fumigène ; bâtonnet fumigène ; comprimé fumigène ; boite fumigène ; concentré soluble ; poudre soluble ; liquide pour traitement de semences ; suspension concentrée (= concentré fluidifiable) ; poudre de piste ; liquide pour application à très bas volume ; suspension pour application à très bas volume ; produit diffuseur de vapeur ; granulés ou comprimés à disperser dans l'eau ; poudre mouillable pour traitement humide ; granulés ou comprimés solubles dans l'eau ; poudre soluble pour traitement de semences ; poudre mouillable.
De nombreux exemples (notamment A à E) de compositions insecticides décrites dans le document FR 2 805 971 peuvent être utilisés avec les toxines selon l'invention.
Par ailleurs, l'invention concerne un procédé de lutte contre des insectes comprenant l'application sur des plantes infectées par lesdits insectes d'une quantité efficace sur le plan insecticide d'une composition insecticide telle que décrite précédemment ou de vecteurs recombinants tels que décrits précédemment.
L'invention concerne également un procédé d'obtention de toxines insecticides comprenant : - l'obtention d'au moins une cellule hôte telle que décrite précédemment,
- la culture dans des conditions appropriées pour l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'invention conduisant à la production d'au moins une toxine active contre des insectes,
- la collecte de toxines produites. L'invention concerne également une souche comprenant un vecteur tel que décrit précédemment, déposée à la CNCM sous la référence plbacla2 CNCM 1-2699.
D'autres avantages de l'invention apparaîtront lors de la description détaillée qui suit. On décrit la démarche globale utilisée pour l'obtention d'une banque de BAC testés ensuite pour leur activité entomotoxique, puis les modes opératoires de manière détaillée. Dans un premier temps, la totalité de la séquence du génome de la bactérie entomopathogène Photorhabdus luminescens, souche TTOl a été identifiée (à l'exception de deux régions de séquences ambiguës). Plusieurs banques de fragments d'ADN génomique ont été construites selon des procédés décrits (L. Frangeul et al., 1999, Microbiology, 145:2625-2634) et introduites par transformation chez Escherichia coli DH 10B : une banque de petite taille ( 1 à 2 kb), une de taille moyenne (5 à 20 kb) et une banque BAC contenant des fragments de grande taille (50 kb en moyenne). L'approche choisie, de type "shotgun", implique le séquençage de fragments aléatoires de petite taille. Ces fragments ont été ensuite assemblés à l'aide des logiciels Phred et Phrap (développés par P. Green, Université de Washington) pour obtenir des séquences contiguës (contigs). Les extrémités séquencées de fragments de la banque de taille moyenne et celles de la banque BAC, et le séquençage de produits de PCR combinatoire, ont permis de relier ces séquences contiguës et d'obtenir la séquence génomique, sous forme d'un contig de 5,7 Mb. Pour identifier des BAC présentant une activité insecticide, les inventeurs ont procédé en parallèle à deux méthodes.
Selon une première méthode, les inventeurs ont identifié par des recherches de similitude "in silico", à partir des séquences génomiques, des gènes potentiellement responsables d'une activité entomotoxique.
Selon une deuxième méthode, la banque BAC contenant des fragments d'ADN de Photorhabdus a été criblée en totalité afin d'identifier des clones à Escherichia coli possédant une activité insecticide. Cette banque, construite à l'aide du vecteur pBeloBACl 1, a été déposée (CNCM n° 1-2478) le 12 juillet 2001.
Les inventeurs ont ainsi réussi à identifier un clone, désigné BAC1A2, ayant une activité entomotoxique. On décrit maintenant de manière détaillée les modes opératoires utilisés pour le séquençage et l'analyse du génome de Photorhabdus luminescens en particulier du BAC1A2 (EXEMPLE 1), et les tests d'activité entomopathogène sur les larves notamment à'Aedes (EXEMPLE 2), de Culex (EXEMPLE 3), de Plutella (EXEMPLES 4 et 5). EXEMPLE 1 : séquençage et analyse du génome de Photorhabdus luminescens
Les inventeurs ont utilisé l'ADN de la souche TTOl de Photorhabdus luminescens pour entreprendre le séquençage de son génome dont la taille est de 5,7 millions de paires de bases. Différentes banques d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens ont été construites à ces fins. A partir de clones de ces différentes banques 65 000 lectures de séquences d'environ 500 paires de bases de qualité ont été réalisées - correspondant à une couverture de 7 fois la longueur du génome -, couvrant ainsi environ 98-99 % de ce génome avec des séquences non redondantes. L'assemblage de ces séquences à l'aide d'outils informatiques (Ewing B. et al., 1998, Génome Res. 8: 175-185 ; Ewing B. & Green P., 1998, Génome Res., 8:186-194 ; Gordon et al., 1998, Génome Res., 8:195-202 ; Contigs-Tool-Box, L. Frangeul et al., Résultats non publiés, Laboratoire de Génomique des Microorganismes Pathogènes, Institut Pasteur, Paris) a permis d'obtenir environ 450 contigs (séquences contiguës), le but final étant de relier ces contigs pour obtenir un contig de 5 681 324 paires de bases correspondant à la séquence génomique totale de Photorhabdus luminescens.
Les contigs obtenus ont été reliés à l'aide de différentes techniques brièvement résumées ci-dessous.
- A l'aide de vecteurs à bas nombre de copies a été construit un "échafaudage" couvrant la totalité du génome. Afin de réaliser celui-ci, les inventeurs ont utilisé des banques d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens en particulier une banque construite à l'aide de vecteurs BAC (une copie par cellule) dont les tailles moyennes des fragments d'ADN insérés sont d'environ 50 kb. Le séquençage des extrémités de ces fragments permet la prédiction des liens entre contigs adjacents.
- La comparaison des extrémités des contigs obtenus avec le génome "témoin" d'une bactérie phylogénétiquement proche (Escherichia coli), dont la séquence est connue, a été utilisée pour prédire des liens entre contigs adjacents dans le génome étudié (Photorhabdus).
- Différentes techniques de PCR (PCR combinatoire, reverse PCR, la technique de "marche sur le chromosome") ont ensuite été utilisées pour combler les brèches entre contigs adjacents.
La banque d'ADN génomique a été obtenue dans le vecteur bactérien (pBeloBACl 1, California Institute of Technology) selon les étapes suivantes : Etape 1 : culture bactérienne et moulage des bouchons
- ensemencement de 10 ml d'eau peptonée le soir avec une colonie unique de Photorhabdus luminescens, souche TTOl ;
- incuber une nuit avec agitation à 37°C ; - mesure de la densité optique à 600 nm ;
- prélever un volume de culture contenant 2.109 bactéries sachant qu'une unité de DO équivaut à 5.10 bactéries/ml ;
- équilibrer chaque tube en ajoutant de l'eau peptonée stérile pour obtenir un volume final de 10 ml ; - centrifuger les bactéries à 4°C pendant 20 min à 4000 rpm ;
- éliminer le surnageant et rependre le culot dans 5 ml de tampon de lavage (1M NaCl, 10mM Tris-HCl pH = 7.6) ;
- centrifuger les bactéries à 4°C pendant 20 min à 4000 rpm ;
- jeter le surnageant et reprendre le culot dans 1 ml de TE IX ; - faire fondre l'agarose low melting point et le conserver à 55°C ;
- préparer les moules pour la réalisation des bouchons en fermant un côté avec du parafilm et en les mettant sur glace ;
- mélanger dans un tube eppendorf de 2 ml, 1 ml du culot repris dans 1ml de TE IX et 1 ml de l'agarose low melting point à 55°C ; - bien homogénéiser le mélange et déposer 100 μl par moule. Laisser les bouchons 10 min sur la glace ;
- préparer la solution de Protéinase K. Pour une barrette de bouchon, préparer 5 ml de solution 0.5M EDTA/0.5 % N-lauryl sarcosine avec 2 mg/ml de la Protéinase K dans un tube falcon de 30 ml (la Protéinase K doit être ajoutée juste avant l'utilisation) ; - incubation overnight à 55°C sans agitation dans un bain sec ou un bain-marie ;
- sortir les tubes contenant les bouchons de l'étuve et les placer 15 min dans la glace ;
- ouvrir le tube et mettre l'égouttoir pour éliminer la solution de Protéinase K sans perdre les bouchons ;
- préparer la solution de PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride) en ajoutant 10 μl PMSF/lsopropanol (décongelé pendant 30 min à 55°C) dans 10 ml TE IX (préparée juste avant l'utilisation car le PMSF perd vite son activité en solution aqueuse) ;
- ajouter 5 ml de la solution PMSF/TE IX par tube et incuber 30 min a 55°C ; - placer les bouchons pendant 15 min sur la glace ;
- ouvrir le tube et mettre l'égouttoir pour éliminer la solution de PMSF/TE IX ;
- laver les bouchons en ajoutant 10 ml de TE IX pendant 20 min à température ambiante ; - ouvrir le tube et mettre l'égouttoir pour éliminer le TE IX sans perdre les bouchons ;
- laver les bouchons encore 2 fois de la même façon avec TE IX ;
- pour la conservation des bouchons, vider les tubes et ajouter 10 ml d'ETDA 0.5 M pH 8 ; conservation à 4°C pendant plusieurs mois ;
- si les bouchons sont utilisés tout de suite pour la restriction, on les conserve dans la solution de TE IX à 4°C pendant la nuit.
Etape 2 : digestion partielle de l'ADN dans des morceaux d'agarose
- les morceaux d'agarose sont lavés trois fois pendant 15 minutes à température ambiante dans une solution de TE (lx) sous agitation modérée ;
- on équilibre les morceaux d'agarose deux fois dans 300 μl d'un tampon de digestion Hind III (lx) (Boehringer ou Biolabs) pendant 30 minutes à température ambiante ;
- on enlève le tampon de digestion et on ajoute un tampon de digestion Hind III glacé (1 ml par morceau d'agarose) contenant 20 U de Hind III (Boehringer ou Biolabs) ;
- on incube pendant deux heures dans de la glace ;
- on transfère les morceaux d'agarose dans un bain-marie à 37°C et on incube pendant 10 minutes à 30 minutes (en fonction de l'ADN contenu dans les morceaux d'agarose) ; et
- on arrête la digestion par addition de 100 μl d'une solution d'EDTA 250 mM (pH 8). Etape 3 : sélection de la taille
Séparation de l'ADN partiellement digéré réalisée par PFGE au moyen de l'appareillage CHEF DRIII (Bio-Rad) :
- gel d'agarose à 1 % LMP dans un tampon Tris-acétate- EDTA (lx) à 13°C ;
- inverser le courant chaque 3 à 15 secondes à 6 V/cm pendant 16 heures ;
- charger au moins deux morceaux d'agarose et le marqueur ;
- colorer le marqueur et une ligne ou une partie de la ligne pour vérifier la digestion partielle ;
- exciser les bandes (partie non colorée) de différentes tailles (i.e. de 50 à 100 kb et de 150 à 250 kb) ; - les bandes d'agarose peuvent être stockées à 4°C dans une solution de TE. Etape 4 : préparation du vecteur
- isolement de pBeloBAC 1 1 par la méthode au chlorure de césium ;
- digestion par Hind III ; - déphosphorylation avec CIP (Calf Intestine Phosphatase). Etape 5 : ligation et transformation
- les banques d'agarose contenant l'ADN sont fondues à 60°C pendant 10 minutes ;
- on équilibre la solution fondue d'agarose/ ADN pendant 15 minutes à 45°C ;
- on ajoute de la gélase (Epicentre Technologies), à raison d'1 U pour 100 μl de bande de gel (ne pas ajouter de tampon de digestion qui provoque certains problèmes au moment de la ligation) ;
- on effectue la digestion pendant 1 heure à 45°C ;
- on effectue la ligation dans 50 μl d'une solution contenant pBeloBACII (2 μl), de la ligase T4 (1 μl à 1 :10), un tampon T4 lOx (5μl), et la solution d'ADN/agarose (42 μl), incubation 20 heures à 16°C ;
- on chauffe le milieu de ligation pendant 15 minutes à 65°C ;
- on dialyse le milieu de ligation contre un tampon Tris-EDTA en utilisant des membranes Millipore de taille de pore VS 0,025 mM ;
- 1 ou 2 μl de la solution de ligation sont introduites par électroporation dans les cellules E. coli DH10B (Gibco BRL) en utilisant des cuvettes d'électroporation de largeur 2 mm avec les réglages suivants 2,5 kV, 25 μF et 200 Ω ;
- après électroporation on resuspend les cellules dans 600 μl de milieu SOC ou NYZ puis on incube pendant 45 minutes à 37°C sous agitation ;
- on étale 10 et 100 μl de chaque suspension cellulaire dans un milieu agar LB contenant du chloramphénicol (12,5 μg/ml), X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactoside ; 50 μg/ml) et de l'IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside ; 25 μg/ml) ; et
- on incube les boîtes ainsi obtenues pendant la nuit ;
- la taille de l'insert moyen est de l'ordre de 50 kb. Etape 6 : extraction de l'ADN plasmidique et séquençage des inserts
L'extraction de l'ADN plasmidique a été effectuée par la technique de lyse alcaline en plaques 24 puits. Le séquençage des inserts des clones a été effectué par le KIT PE Big Dye selon les conditions préconisées par le fabricant en utilisant les oligonucléotides spécifiques de chaque vecteur.
Les réactions sont ensuite introduites dans le thermocycleur afin de subir 35 cycles composés des trois étapes suivantes : dénaturation 10 secondes à 96°C, hybridation 10 secondes à 50°C, élongation 4 minutes à 56°C.
On réalise ensuite une précipitation à l'éthanol à 76 % durant 20 minutes à température ambiante.
Les plaques sont ensuite centrifugées 35 minutes à 2 200 g puis égouttées sur papier absorbant puis centrifugées retournées sur du papier absorbant pendant 1 minute à 500g afin de ne laisser aucune trace d'éthanol.
Les culots d'ADN sont ensuite : - soit repris dans une solution de formamide-EDT A-bleu dextrane, puis dénaturés pendant 2 minutes à 96°C ; les plaques sont ensuite immédiatement mises dans la glace, un aliquot étant alors déposé sur gel d'acrylamide d'un séquenceur automatique PE-377 ; soit repris dans une solution d'EDTA 0,3mM ; un aliquot étant alors automatiquement déposé dans un séquenceur automatique PE-3700. Etape 7 : cartographie des clones BAC sur le génome de Photorhabdus luminescens
Connaissant la presque totalité de la séquence du génome de la bactérie Photorhabdus luminescens, ainsi que les séquences des extrémités des inserts des clones des différentes librairies, les inventeurs ont effectué une cartographie permettant de positionner l'ensemble de ces clones sur le génome.
EXEMPLE 2 : tests d'activité entomopathogène sur les larves d'Aedes, menés à partir de la banque de BAC décrite précédemment 1) Protocole utilisé
Pour le criblage de la banque de BACs, le test comprend tout d'abord deux étapes : Etape 1
Les BACs sont cultivés dans des plaques comprenant 96 puits fermés par un parafilm dans un milieu LB (Luria-Bertani)/chloramphénicol à 12 μg/ml une nuit à 37°C, sous agitation à 250 rpm. Volume : 200 μl/puits. Etape 2
Le jour suivant les plaques sont centrifugées à 1 100 g pendant 10 minutes et le LB (qui est toxique pour les larves Aedes) est aspiré. 200 μl d'eau stérile sont alors ajoutés.
Les bactéries peuvent alors se fixer et une mesure est effectuée de DO 595. De même pour le criblage de BACs individuels, le test comprend deux premières étapes. Etape 1
Dans ce cas, la culture de BACs en flacon est effectuée sur LB/chloramphénicol la nuit jusqu'à ce que le log de la DO 595 soit d'au moins 1. Etape 2
Les bactéries sont alors centrifugées 10 minutes à 5000 rpm et le culot est lavé à l'eau distillée et à nouveau centrifugé. Les bactéries sont alors remises en suspension dans l'eau et échantillonnées en trois exemplaires (ou plus), dans des plaques de 96 puits. Une série de dilution dans l'eau peut être effectuée pour évaluer l'activité potentielle de ces échantillons. La concentration maximale peut entraîner une DO 595 de 1 (aller à l'étape 3).
L'évaluation d'activité peut être effectuée également sur des échantillons des bactéries congelées secs. Dans ce cas, les bactéries sont mises en culture, lavées à l'eau stérile, remises en suspension dans un petit volume d'eau et congelées. Etape 3
Suite à ces étapes 1 et 2, variant selon le type de criblage, on procède à l'étape 3.
Les œufs d'Aedes aegypti sont agités dans l'eau pendant deux minutes ce qui entraîne leur éclosion. Environ 45 minutes après les larves nouvellement écloses sont réparties dans chaque puits. Chaque puits comprend 10 μl de cette solution de larves contenant 5 à 10 larves. La structure de la pipette est adaptée en conséquence. Les variations dans le nombre de larves par puits ne sont pas déterminantes puisque si le BAC est toxique, les larves sont tuées et les bactéries ne sont pas détruites. Etape 4
On laisse les plaques à température ambiante et on mesure la DO 595 à différents moments après l'addition de larves d'Αedes, notamment à 24 heures et 48 heures. On voit à l'œil nu si les larves se nourrissent de bactéries ou non. Généralement, l'altération de larves άΑedes est constatée à environ 20 heures, la mort éventuelle entre 24 et 48 heures. Etape 5 : mesure des résultats Comme contrôle positif on utilise des souches sauvages de Photorhabdus.
Comme contrôles négatifs on utilise une souche E. coli DH10B (la souche utilisée pour les BACs et un BAC témoin, c'est-à-dire la souche DH 10B contenant le vecteur BAC sans fragment inséré. 2) Résultats Dans ces essais sur larves d'Αedes, dans lesquels on nourrit les Aedes avec E. coli exprimant chaque clone de BAC, on a criblé la banque complète de BAC. Les inventeurs ont identifié un BAC positif. Les résultats ont été répétés avec ce BAC de nombreuses fois et sont reproductibles. Ce BAC, plaque 1 ligne A colonne 2, désigné BAC1A2, cause la paralysie et/ou la mort des larves d'Αedes. Les contrôles utilisés dans ces essais incluent : un clone aléatoire BAC qui n'exerce pas d'effet contre les larves d Aedes, la souche E. coli DH10B (la souche dans laquelle la banque de BAC a été clonée), une souche sauvage type Photorhabdus luminescens TTOl.
Les inventeurs ont observé l'altération des larves dans le cas du BAC1A2 environ 20 heures après que les plaques soient infectées avec les larves. Les différences sont particulièrement visibles au bout de 48 heures après l'infection. Les larves commencent par ralentir leurs mouvements puis n'ont plus l'air de se nourrir du milieu contenant les bactéries autant que dans les puits contenant le clone aléatoire BAC et le DH10B. Les larves se couchent ensuite dans le fond du puits, ne nagent plus jusqu'à la surface pour prélever de l'air. L'activité constatée avec le BAC1A2 est similaire à celle observée avec un échantillon de Photorhabdus sauvage, alors que la souche d'E. coli DH10B est inactive. Dans les plaques de 96 puits utilisant Photorhabdus luminescens, on constate la mort de larves avec une DO595 pour les bactéries de 0,1 avant l'addition de larves d'Αedes. La mort est constatée également avec une DO de 0,5 pour le BAC1 A2.
Dans les essais sur moustiques, le pourcentage de mortalité a été de 100 % avec le Photorhabdus de type sauvage, et de l'ordre de 90 à 95 % pour le BAC1 A2.
En outre, des tests de sensibilité à la chaleur ont été effectués. Photorhabdus, BAC1A2 et E.coli DH10B ont été chauffés à différentes températures pour déterminer l'activité insecticide restante. Pour cela, une culture de Photorhabdus d'une nuit a été collectée puis mise en suspension dans de l'eau stérile. Des échantillons de 1 ml ont été chauffés à 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C ou à 100°C pendant 15 minutes. Les résultats ont montré que les larves sont mortes lorsque Photorhabdus était chauffé à 70°C. Les larves ont survécu et ont absorbé les bactéries lorsque la température était de 80°C ou plus. L'ensemble des essais réalisés montre que la toxine insecticide sécrétée par Photorhabdus est stable jusqu'environ 60°C. Des essais sur le BAC1A2 montrent également une stabilité jusqu'à 60°C, les larves meurent dans les puits contenant du BAC1A2 qui étaient chauffés à 60°C. Pour les échantillons contrôle DH10B et BAC aléatoire, des larves étaient capables de se nourrir de bactéries chauffées à toutes les températures testées. A l'inverse, les toxines obtenues par les inventeurs conservent leur activité insecticide typiquement plusieurs semaines stockées à environ 4°C. Le clone BAC1A2 (dépôt CNCM 1-2699), dont la taille du fragment inséré est de 60131 pdb, comprend :
- un ensemble de gènes similaires à des gènes isolés chez Escherichia coli (gènes de ménage) ;
- le gène de séquence SEQ ID N° 4, codant pour la protéine de séquence SEQ ID N° 5, qui possède une homologie avec un gène d'estérase d'hormone juvénile de coleoptère, flanqué du gène de séquence SEQ ID N° 2 codant pour la protéine de séquence SEQ ID N° 3. De plus un gène, codant pour un régulateur transcriptionnel, jouxte cet opéron putatif. Ces gènes (SEQ ID N° 4 et SEQ ID N° 2) étant vraisemblablement responsables de l'activité entomotoxique observée les inventeurs ont tout d'abord restreint la séquence du BAC1A2 à une région contenant principalement les gènes SEQ ID N° 4 et SEQ ID N° 2. Les inventeurs ont en outre testé des sous-clones contenant les deux ORF du BAC1A2 cités précédemment, à savoir l'ORFl codant à SEQ ID N° 3 et 1ORF2 codant à SEQ ID N° 5.
Plus précisément, deux sous-clones, plglόgl et plgl6el2, ont été transformés dans E. coli souche DH10B. Le clone plglόgl, déposé à la CNCM le 12 Juillet 2001 sous le numéro 1-2698, est un fragment d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens, souche TTOl (Fischer - Le Saux M. et al., 1999, Int. J. Syst. Bacteriol., 49:1645-56), clone dans le vecteur pSYX34 (Xu S. et Fomenkov A., 1994, - Biotechniques, vol. 15:57) dans la bactérie E.coli XLIO-Gold Kanr (Stratagene). A partir d'échantillons congelés, on a mis en culture des bactéries Photorhabdus,
BAC1A2, DH10B, plglόgl et plgl6el2. 200 μl de chaque culture ont été pipetés dans 12 puits d'une plaque de 96 puits. Des plaques ont été agitées pendant 10 minutes à 1000 rpm. Le surnageant a été éliminé. 200 μl d'eau stérile ont été rajoutés dans chaque puits et les bactéries ont été remises en suspension. La DO 595 a été mesurée, chaque puits contenant environ 10 larves d'Αedes aegypti. Les deux clones, plglόgl et plgl6el2 ont un effet insecticide sur les larves, qui est encore plus rapide et fort que l'effet de Photorhabdus et de BAC1A2 Ce résultat est vraisemblablement lié au nombre de copies supérieur (5 copies par cellule) du vecteur pSYX34 en comparaison avec le vecteur pBELOBACl 1 (1 copie par cellule). Les larves de contrôle (DH10B et eau) ne sont pas affectées et restent très actives. Les larves au contact de Photorhabdus ou du BAC1A2 montrent un mouvement ralenti et restent dans le fond du puits. Les larves au contact des clones plglόgl et plgl6el2 sont immobiles et semblent être mortes. EXEMPLE 3 : tests d'activité entomopathogène sur les larves de Culex pipiens. menés à partir de la banque de BAC décrite précédemment
Les larves ont été préparées de manière analogue à celles d'Aedes. Les inventeurs ont préparé : - un sous-clone (construction déposée à la CNCM sous le N° 1-2752) contenant les gènes de séquences SEQ ID N° 2 (ORF 1) et SEQ ID N° 4 (ORF 2) : ces gènes ont été amplifiés par PCR et clones à bout droit au site EcoRV du pBluescript SK. Ce plasmide est nommé pDIA700 clones n° 10 (séquence vérifiée) ; - un sous-clone (construction déposée a la CNCM sous le N° 1-2753) contenant les gènes de séquences SEQ ID N° 2 (ORF 1) et SEQ ID N° 4 (ORF 2), avec délétion de la partie 3' du gène de séquence SEQ ID N° 4 ; le plasmide pDIA700 (n° 10) a été restreint par EcoRI pour éliminer le dernier tiers de SEQ ID N° 4. Ce plasmide est nommé pDIA701.
Les résultats obtenus ont été les suivants, démontrant que 1ORF2 est essentiel pour l'activité insecticide contre Culexpipiens.
Résultats sur larves de Culexpipiens
Figure imgf000034_0001
D'autres séries de tests sur différentes espèces de moustiques ont démontré l'efficacité notamment chez Culex pipiens, Anophèles gambiae, Anophèles stephensie, résumée sur le tableau 1. Tableau 1
Figure imgf000035_0001
EXEMPLE 4 : tests d'activité entomopathogène sur les larves de Plutella xylostella, menés à partir de la banque de BAC décrite précédemment
(i) Une série de tests a été effectuée selon le protocole suivant. Des bactéries (souche E. coli DH10B, contenant un plasmide pBeloBACl l) ont été mises en culture une nuit dans 5 ml LB+chloramphenicol à 28°C sous agitation à 200 rpm. La DO540 de chaque culture a été systématiquement prise. Chaque culture est diluée avec du LB jusqu'à obtenir une concentration de 5xl07 bactéries/ml. Six feuilles (3 cm de diamètre) sont incubées dans une culture diluée pendant une heure avec 0,05 % Tween 20 (Sigma). Les feuilles traitées sont mises dans des plaques 6 puits et 5 larves sont placées dans chaque puits, soient 30 larves testées par clone. Chaque puits contient un support gélose contenant 15 g/1 d'agar (Difco) et 1 ,5 g/1 d'antifongique (nipagine, Sigma). De préférence, les larves utilisées pour ce test sont des larves en phase tardive du stade L2 (2eme stade larvaire), sélectionnées juste avant leur mue vers le stade L3. En effet, les inventeurs ont observé que les larves étaient nettement plus sensibles à la bactérie à ce stade L2 et que les essais y étaient bien plus reproductibles.
Les essais ont été effectués à 28°C avec une photopériode de 1 1 h : 13 h (nuit : jour). Après 2 jours, les feuilles traitées ont été remplacées par des feuilles non traitées. Le niveau de mortalité des larves a été observé à 48 h, 72 h et 144 h après le contact des larves avec les feuilles traitées. Des contrôles ont été utilisés pour les tests de criblage, incluant : Photorhabdus TTOl, et/ou le BAC8dl0 (contenant le locus te) comme contrôles positifs. Les contrôles négatifs correspondant aux constructions sans insert ont été utilisés de façon adéquate (pBeloBACl l dans E. coli DH10B pour les clones BAC, pSYX34 dans E. coli XL10 pour le sous-clone plglόgl, E. coli XLlBlue pour les sous-clones pDIA). Tous ces bioessais ont été réalisés avec une souche de Plutella xylostella originaire de la Martinique.
Le taux de mortalité des larves a été corrigé par rapport au contrôle négatif à l'aide de l'équation Abbott (Abbott W.S., J. Econ. Entomol., 18 : 265-267).
Les inventeurs ont démontré selon une première série de tests l'activité insecticide du BAC 1 A2 contre des lépidoptères notamment Plutella xylostella, lorsque les larves étaient au stade larvaire tardif L2.
Figure imgf000036_0001
* un % de mortalité Abbott supérieur à 20 % est considéré comme significatif
# la concentration d'antifongique (nipagine) utilisée dans le milieu gélose (pour le support des feuilles) a été diminuée de 5 fois lors des bio-essais réalisés avec les sous- clones pDIA.
(ii) Une autre série de tests sur Plutella a démontré l'effet insecticide, en utilisant le protocole suivant. Initialement trois doses de bactéries gelées ont été testées sur Plutella : 0,014 g /
5 ml, 0,007 g / 5 ml et 0,035 g / 5 ml d'eau. 150 μ/1 de bactéries ont été ajoutées à la surface d'une coupelle de Plutella. La coupelle a été placée dans une hotte pour séchage. Une fois les coupelles séchées, chacune est infestée par 10 larves de Plutella (âgées de 4 jours). On observe : - 100 % de mortalité dans tous les traitements par Photorhabdus ;
- 95 % de mortalité pour le traitement à 0,0014 g / 5 ml de BAC1 A2 ;
- 90 % de mortalité pour le traitement à 0,007 g / 5 ml de BAC1 A2 ; - une certaine mortalité pour le contrôle DH10B avec 42 % pour le traitement 0,014 g / 5 ml.
Ainsi, la souche sauvage de Photorhabdus a un effet insecticide fort sur les larves de Plutella. L'effet obtenu avec le BAC1A2 est significativement supérieur par rapport au contrôle.
(iii) Une autre série de tests sur Plutella a démontré l'effet insecticide de la protéine codée par 1ORF2 issue du BAC1A2. La protéine produite in vitro en fusion avec His-tag (kit RTS, Roche) est purifiée par les colonnes nickel (NiNTA, Qiagen) puis dialysée contre du PBS IX. Le bio-essai est tel que décrit pour les bactéries, excepté les modifications suivantes :
- les feuilles sont badigeonnées avec la solution protéique à l'aide d'un pinceau,
- le contrôle négatif correspond au tampon d'élution dialyse,
- le support gélose contient 15 g/1 d'agar (Difco) et 30 mg/1 d'antifongique (Sigma).
Figure imgf000037_0001
* un % de mortalité Abbott supérieur à 20 % est considéré comme significatif
EXEMPLE 5 : tests d'activité entomopathogène sur les larves de Plutella xylostella : effet sur la croissance des larves de la protéine codée par 1ORF2 issue du BAC1A2
Une série de tests sur Plutella xylostella a montré l'effet sur la croissance des larves de la protéine codée par 1ORF2 issue du BAC1A2. La protéine produite in vitro a été purifiée comme indiqué précédemment (voir exemple 4). Le bio-essai est tel que décrit dans l'exemple 4.
Figure imgf000037_0002
total des larves petites (mortes et vivantes) # dépôt du même volume de tampon de purification de la protéine REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4, ladite séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.
2. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 70 % d'identité avec une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence définie en a) ou b) ; d) un fragment représentatif de la séquence SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4, ou de leur séquence complémentaire, d'au moins 10 paires de base ; e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c), d) ou e) ; ladite séquence codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.
3. Polypeptide insecticide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2.
4. Polypeptide insecticide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence polypeptidique choisie parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 ; b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) comportant au moins
80 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; c) un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a).
5. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide selon la revendication 3 ou 4.
6. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5, caractérisée en ce que la toxine est active contre des diptères, notamment les espèces de moustiques Aedes aegypti, Culex pipiens, Anophèles gambiae et Anophèles stephensie, et/ou des lépidoptères notamment Plutella xylostella.
7. Cassette d'expression comprenant une séquence promoteur liée de manière opérationnelle à une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6.
8. Vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon la revendication 7 ou une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6.
9. Vecteur de type virus caractérisé en ce qu'il comprend dans son génome une séquence polynucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 , 2, 5 et 6 liée opérationnellement à un promoteur inductible ou constitutif approprié.
10. Cellule hôte comprenant une cassette d'expression selon la revendication 7.
1 1. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en qu'il s'agit d'une bactérie, d'une levure, d'une cellule de plante, d'un champignon.
12. Composition insecticide caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon l'une des revendications 3 ou 4, ou une cellule hôte selon la revendication 10 ou 1 1 accompagnés d'un support approprié.
13. Procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins une toxine contre des insectes, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'une cassette d'expression selon la revendication 7 dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite cassette d'expression.
14. Plante ou partie de plante, comprenant une cassette d'expression selon la revendication 7, les plantes ou parties de plantes étant transformées et résistantes aux insectes.
15. Plante ou partie de plante selon la revendication 14 présentant une augmentation de l'expression d'une toxine contre les insectes par rapport à une plante non transformée.
16. Plante ou partie de plante selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une mono ou une dicotylédone, notamment le blé ou le maïs.
17. Procédé de lutte contre des insectes caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur des plantes infectées par lesdits insectes d'une quantité efficace sur le plan insecticide d'une composition insecticide selon la revendication 12 ou de vecteurs selon la revendication 8.
18. Procédé d'obtention de toxines insecticides caractérisé en ce qu'il comprend :
- l'obtention d'au moins une cellule hôte selon la revendication 1 1 ;
- la culture dans des conditions appropriées pour l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6 et conduisant à la production d'au moins une toxine active contre des insectes ;
- la collecte de toxines produites.
19. Procédé d'obtention d'une plante résistante aux insectes, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6, l'expression de ladite séquence nucléotidique étant à un niveau suffisant pour agir contre les insectes.
20. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment ADN de Photorhabdus luminescens d'environ 60 kb désigné plBAClA2 déposé le 12 juillet 2001 sous le numéro CNCM-2699, présent dans la souche E. coli DH10B.
21. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle correspond à SEQ
ID N° 1.
22. Souche comprenant un vecteur selon la revendication 8, déposée le 12 juillet 2001 à la CNCM sous la référence plbacla2 CNCM 1-2699.
23. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 , 2, 5 et 6, d'un vecteur selon la revendication 8, d'une cellule selon la revendication 10 ou
1 1, pour la préparation d'un polypeptide insecticide.
24. Composition pharmaceutique comprenant un polypeptide insecticide selon la revendication 3 ou 4.
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