WO2003083108A1 - Technique d'examen de gene permettant d'estimer le risque de survenue de glaucome - Google Patents

Technique d'examen de gene permettant d'estimer le risque de survenue de glaucome Download PDF

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WO2003083108A1
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glaucoma
gene
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seq
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Kaoru Asano
Takayuki Takahata
Shigehiro Numada
Akinori Masago
Yasuhiro Kouchi
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Sysmex Corporation
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    • G01N2800/168—Glaucoma

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing glaucoma-related genes in the field of clinical testing, and a method for predicting the risk of developing glaucoma using mutations in the genes as indices. For example, it detects abnormalities in the myosin gene (hereinafter referred to as “MYOC”) known as the glaucoma gene, and diagnoses glaucoma using the detected abnormality, that is, a mutation in a base at a specific position of the gene as an index.
  • MYOC myosin gene
  • the present invention relates to a method for testing a gene, particularly a method for predicting the possibility that an individual will develop the disease in the future. Background art
  • Glaucoma is a condition in which the aqueous humor in the eyes is not drained and the pressure in the eyes rises, resulting in a decline in eye function. If left unchecked, the range of vision will be reduced or vision will be reduced, resulting in blindness. However, the optic nerve may be damaged even though the intraocular pressure is normal.
  • Glaucoma is classified into five pathologies: primary open-angle glaucoma (POAG), normotensive glaucoma (NTG), primary closed-angle glaucoma (PACG), congenital glaucoma, and secondary glaucoma. 20% are said to be hereditary. Of these, POAG is the most common. A national epidemiological survey conducted by the Japan Ophthalmologists Association from 1988 to 1989 reported that 3.56% of the population aged 40 years or older had glaucoma.
  • TIGR trabecular meshwork-induced darcocorticoid response
  • WO 01/88120 A1 discloses a method for detecting a mutation in the gene at position ⁇ 153, which is the promoter region of the MYOC gene, shown in the sequence listing of the publication. It has been shown that it can be used as a glaucoma screen in patients who are concerned about an onset carrier. However, here, we focus on one mutation at position -153 and use this as an index only.
  • an object of the present invention is to provide a method for testing a gene for effectively predicting the risk of developing glaucoma from the relationship between glaucoma-related genes and glaucoma onset.
  • the present inventors have focused on the fact that the onset of glaucoma is involved in gene mutation, analyzed the gene sequence of the upstream region and the coding region of the glaucoma-causing gene in glaucoma patients and non-patients, and conducted extensive research. As a result, it was found that there was a genetic polymorphism in the gene in which a difference in frequency was observed between the patient group and the non-patient group. We also found that the presence or absence of this genetic polymorphism caused a statistically significant change in the prevalence of glaucoma when compared to the prevalence of the general population, and completed the present invention.
  • the glaucoma is primary open-angle glaucoma and / or normotensive glaucoma. Inspection method according to any one of the preceding items 1 to 8,
  • the mutation is detected by using an oligonucleotide capable of specifically forming a hybrid in a part of the gene region including the coding region and / or the upstream region of the glaucoma-related gene.
  • the inspection method according to any one of to 9;
  • An oligonucleotide capable of specifically forming a hybrid in a portion of the gene region including the coding region and / or upstream region of the glaucoma-related gene is an oligonucleotide having the sequence shown below.
  • oligonucleotide capable of hybridizing with the oligonucleotide according to 1) or 2) under stringent conditions.
  • an oligonucleotide comprising a mutated base sequence in which one or several bases are substituted, ⁇ lost, inserted or added, among the oligonucleotides according to 1) to 4) above,
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of the MYOC gene and the positional relationship of the primers. (Example 1)
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the Bayes theorem. (Embodiment 2) Best mode for carrying out the invention
  • the inventors have determined that in glaucoma patients and non-patients, the upstream region extending from the translation initiation point of the glaucoma-causing gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to 420 nucleotides and the coding region after the translation initiation point The gene sequence of was determined. In the process, it was confirmed that there was a genetic polymorphism in the upstream region and the coding region of the gene in which a difference in frequency was observed between the patient group and the non-patient group. Furthermore, examination of the presence or absence of this genetic polymorphism revealed that the prevalence of glaucoma changed statistically significantly when compared to the prevalence of the general population.
  • the present invention is configured based on the above new findings. (Glaucoma-related genes)
  • an example of a glaucoma-related gene is the trabecular meshwork-induced darcocorticoid response (TIGR) gene.
  • This TI GR gene is also known as the MYOC gene.
  • the structure and sequence of the upstream and coding regions of the MYOC gene are as shown in FIG. 1 and SEQ ID NO: 1, for example, an upstream region having a promoter element and a code coding for a protein. There are areas as well as other factors.
  • the positions of the bases of the MYO C gene are in accordance with the base numbers defined in SEQ ID NO: 1 (Genbank accession number NT-029874).
  • the region encoding this MY OC protein is composed of three exons. Positions 1 to 4120 of SEQ ID NO: 1 are the upstream region, and positions 4120 to 4722 represent exon 1. (Gene mutation)
  • the mutation of the glaucoma-related gene of the present invention refers to a substitution, deletion and / or insertion of a base at a specific position in the base sequence of the MYOC gene with a different base.
  • the specific position means, for example, substitution with a different base.
  • the specific position is position 194, position 199, position 324, position 1051, position 1084, position 1627, position 1685 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, It refers to a position selected from 1756, 1853, 2830, 3371, 4037 and / or 4346.
  • specific substitution of a base at a specific position is as follows: C to A at position 194; A to C at position 199; G at position 324 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. From A to 1; 105 from C to D at 1; C from D at 84 to D; D from T at 1627; from T to C at 1685; From position 6 to T; from position 1853 to position G; 28 from position 30 to position G; from position 33 to position A to position G; from position 4037 to position G to position A; 4 Replacement of G at position 346 with A.
  • the method for testing the mutation of the gene is not limited as long as a specific mutation of the MYOC gene disclosed by the present invention can be detected. Instead, various methods that are known or that can be obtained in the future can be widely used.
  • various methods for analyzing the nucleotide sequence containing the mutation position can be used. These methods include, for example, the Southern hybridization method, the dot hybridization method (see J. Mol. Biol., 98: 503-517 (1975), etc.), the dideoxy nucleotide sequencing method ( Sanger method), various detection methods combining DNA amplification techniques [eg PCR—Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP), PCR—Single-chain higher-order structural polymorphism analysis ( Natl. Acad.
  • PCR Restriction fragment length polymorphism analysis
  • PCR Single-chain higher-order structural polymorphism analysis
  • the test sample used for the test method of the present invention for analyzing the MYOC gene of the subject is not particularly limited as long as it is a biological sample containing the MYOC gene of the subject.
  • biological samples include tissues collected from living bodies such as biological material tissues, surgically resected tissues, and oral mucosa tissues, as well as blood, serum, feces, ejaculated semen, sputum, saliva, cerebrospinal fluid, and hair. And the like.
  • a biological sample such as a tissue is crushed using a blender, and MYO is extracted by a known gene extraction method such as the phenol-oral mouth-holm method.
  • the C gene can be used as a test sample.
  • the extracted MYOC gene can be amplified and concentrated to be used as a test sample.
  • the test sample may be a full-length DNA of the MYOC gene or a DNA fragment (partial DNA).
  • the DNA fragment is subjected to the test, it is necessary to specify at least one, preferably two or more, more preferably three or more mutations, including the upstream region and / or the coding region of the MYO C gene. It is necessary to include the location.
  • the DNA fragment can be used for detecting the gene mutation of the present invention, that is, if it has a measurable base length as a test DNA to be used for measurement of base substitution, particularly, There is no limit on the length.
  • a base length of such a DNA a base length of usually about 10 bases or more, preferably about 20 bases or more can be selected, and is generally about 100 to 1,000, preferably about 100 to 1,000. Is selected from those having a base length of about 200 to 300.
  • the test sample may be either DNA or a DNA transcript.
  • messenger RNA (mRNA) transcribed from DNA may be used, and cDNA transcribed from the mRNA or complementary DNA may be used.
  • mRNA messenger RNA
  • cDNA transcribed from the mRNA or complementary DNA
  • Various operations that can be employed in the method for detecting a gene mutation of the present invention for example, synthesis of DNA or DNA fragment, enzymatic treatment for cleavage, deletion, addition or binding of DNA, isolation and purification of DNA, Replication, selection, amplification of DNA fragments, and the like can all be performed in accordance with ordinary methods (see, eg, Experimental Methods for Molecular Genetics, published by Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 1983). Further, these can be appropriately modified and used according to a conventional method as needed.
  • Amplification of a nucleic acid for preparing a test sample can be performed, for example, according to the PCR method or a modification thereof (see PCR Technology, Takara Shuzo Co., Ltd., 1990, etc.).
  • a specific glaucoma-related gene An oligonucleotide capable of forming an hybrid, specifically, an oligonucleotide having a primer function appropriately selected so as to specifically amplify a desired DNA fragment having at least one or more of the above-described specific positions involved in mutation is used. I can do it.
  • Examples of the oligonucleotide having a primer function include: 1) an oligonucleotide having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 2 to 27, 2) a complementary strand of the oligonucleotide according to 1), 3) a 1 ) Or an oligonucleotide capable of hybridizing under stringent conditions with the oligonucleotide of 2), 4) about 60% homology with the oligonucleotide of any one of 1) to 3) above 5) Oligonucleotides having a mutated base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted or added, among the oligonucleotides described in 1) to 4) above. .
  • the oligonucleotide can be designed by a method known per se, for example, can be chemically synthesized.
  • a natural nucleic acid can be cleaved with a restriction enzyme or the like, modified to have the above-described nucleotide sequence, or ligated.
  • it can be synthesized by using an oligonucleotide synthesizer (Expedite Model 8909 DNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems).
  • a method for synthesizing an oligonucleotide in which one or several bases are mutated, such as substitution, deletion, insertion or addition can also use a production method known per se.
  • PCR polymerase chain amplification
  • Stringent hybridization conditions can be selected from those commonly known, such as 50% formamide, 5xS SC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate, pH 7.6, 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and a solution containing 20 g / m 1 of DNA at 42 ° C, and then primary in 2xSSC'0.1% SDS at room temperature Washing, then secondary washing at 0.1 ° Sx ⁇ 0.1% SDS at about 65 ° C.
  • DNA mutation can be detected, for example, by determining the base sequence of the MYOC gene contained in the test sample by the Sanger method.
  • a primer is used to synthesize a complementary strand in the 5 'to 3' direction by DNA polymerase.
  • the oligonucleotide used at this time for example, the oligonucleotide described above (oligonucleotide having a primer function) can be used as a primer.
  • dd NTP dideoxynucleotide triphosphate
  • d NTP deoxynucleotide triphosphate
  • the synthesized DNA is labeled, and the reaction product is electrophoresed on a modified polyacrylamide gel to obtain a base sequence. Can be determined.
  • a primer or dNTP labeled with a chemiluminescent substance or a radioisotope (RI) to the reaction system, the synthesized DNA is labeled, and the reaction product is electrophoresed on a modified polyacrylamide gel to obtain a base sequence. Can be determined.
  • DNA polymerase used in the Sanger method examples include Klenow enzyme, T7 phage and DNA polymerase derived from thermophilic bacteria. They all have the exonuclease activity removed by genetic engineering. Initially, the target gene was used in the single-stranded DNA in the Sanger method, but nowadays, a method in which the double-stranded plasmid is directly denatured with alkali is often used.
  • the sequence reaction can be performed by the Sanger method or the cycle sequence method.
  • the cycle sequence method is a combination of the Sanger method and PCR.It is not necessary to make Type I DNA single-stranded, and the reaction system includes DNA and one primer, dNTPS, ddNTPS, and Perform by adding heat-resistant DNA polymerase. ? During the 11 reactions, (1d NTPS is incorporated, elongation stops, and as a result, DNA with the same base at the 3 'end is synthesized as in the Sanger method.
  • the sequence of the automatic sequencer is the same as in the Sanger method.
  • the reaction includes the Dye primer method in which primers are fluorescently labeled, the Dye terminator method in which ddNTP is fluorescently labeled, and the internal-label method in which dNTP as a substrate is labeled.
  • the present invention also includes a test reagent and a test reagent kit used in a method for testing glaucoma genetics.
  • the test reagent include any of the reagents used in the method of the present invention, such as a primer for amplification of a test sample, a primer for determining the nucleotide sequence of a test sample, various polymerases, base substrates, and labeling substances. It may be.
  • the test reagent kit may be any kit as long as it uses at least two or more of all the reagents used in the method of the present invention.
  • the blood provided by the subject was processed according to a conventional method, and DNA was extracted from nucleated cells.
  • DNA was extracted using the product name “Gen Toru-kun TM (for blood)” (manufactured by Takara Shuzo) as a DNA extraction kit according to the protocol specified in the product.
  • the obtained DNA extract was designated as type II, and the MYOC gene was amplified by PCR using a PCR amplification kit, product name "LAT aq (manufactured by Applied Biosystems)".
  • M_F1 SEQ ID NO: 2
  • M—R3 SEQ ID NO: 3
  • M-F1 is the nucleotide sequence shown in the region at positions 22-46 based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • M-R3 is the complement of the nucleotide sequence shown in the region at positions 5992-5968. Consists of a simple array.
  • Fig. 1 shows the relationship between the structure of the exon, translation initiation site, and upstream region of the MYOC gene and the region amplified by the primer.
  • the DNA sequence of the DNA fragment obtained by the above PCR was determined using an automatic DNA sequencer ABI Prism3100 (manufactured by Applied Biosystems) according to the protocol specified by the product. At this time, a cycle sequence reaction was performed using the following primers.
  • M—SF3 region 1093-1110 (SEQ ID NO: 6), ⁇ —SF4 region 1456-1475 (SEQ ID NO: 7), M—SF5 region 1800-1817 (SEQ ID NO: 8), ⁇ — SF 6 region 2148-2165 (SEQ ID NO: 9), M—SF 7 region 2498-2516 (SEQ ID NO: 10),
  • ⁇ -SF 8 region positions 2857-2875 (SEQ ID NO: 11), M—SF 9 region, 3227-3246 (SEQ ID NO: 12), ⁇ -SF 10 region, 3601-3620 (SEQ ID NO: 13) ), ⁇ -SF11 region 3910-3927 (SEQ ID NO: 14), reverse strand: ⁇ —SR4 region 4730-4712 Complementary sequence (SEQ ID NO: 15), ⁇ -SR5 region 4337-4319 Position Complementary sequence (SEQ ID NO: 16) M-SR 6 region 4022-4003 complementary sequence (SEQ ID NO: 17),
  • M-SR 9 region 2950-2933 Complementary sequence (SEQ ID NO: 20), MM——SS RR1100 region 2593-2575 Complementary sequence (SEQ ID NO: 21), M—SR 11 region 2259-2241 Complementary sequence (SEQ ID NO: 22), M-SR12 region 1950-1933 position Complementary sequence (SEQ ID NO: 23), M-SR13 region 1556-1538 position Complementary sequence (SEQ ID NO: 24), M — Complementary sequence of the SR14 region at positions 1170-1153 (SEQ ID NO: 25), M— Complementary sequence of the SR15 region at positions 824-807 (SEQ ID NO: 26),
  • M-SR16 region 470-453 position Complementary sequence (SEQ ID NO: 27) Of the above primers, M-F1 to M-SF11 are normal chains, and M-SR4 to M_SR16 are Used to determine the sequence of the reverse strand. (4) Ligation of DNA fragments and nucleotide sequence of MYOC gene
  • sequence of the DNA fragment for each blood donor was linked using Phred / Phrap software (Washington University, USA) to obtain one base sequence for each blood sample donor.
  • Blood obtained from a control non-patient volunteer group of 67 patients was processed according to the above-described method, and the nucleotide sequence of the MYOC gene, which accounts for the majority of the non-patient group (SEQ ID NO: 1), was determined.
  • Table 1 shows the position of the base sequence of the MYOC gene represented by SEQ ID NO: 1
  • the second row shows the bases that occupy the majority in the non-patient group at each position
  • the third row shows each base in the non-patient group.
  • the frequency of mutation at the position shows the frequency of mutation at each base position in the patient group
  • the fifth row shows the change in the base detected as a mutation.
  • mutations were found at base positions 324, 4037 and 4346 in the non-patient group at a frequency of about 3%, and in the patient group, mutations were found at a frequency of 6.8 to 10.2%. At other positions, no mutation was observed in the non-patient group, whereas the mutation was observed in the patient group at a frequency of about 1 to 3.4%.
  • the results are shown in Table 2.
  • the first row of Table 2 shows the nucleotide position, and the second and subsequent rows show the presence or absence of the mutation in each subject.
  • the case where there is one or more mutations in the sequence of the MYOC gene is defined as M, and the probability that a subject having M will develop glaucoma in the future is defined as a conditional probability P (GIM).
  • P (GIM)> P (G) the subject carrying the mutation M has a higher probability of developing glaucoma in the future than the general population, and is determined to be at high risk.
  • conditional probability P (GIM) is calculated as follows.
  • the probability of having M in the glaucoma patient group is P (MIG), and the probability of having M in non-patients is P (MIN).
  • P (MIN) is given by Eq.
  • P (G) the probability of mutation of the base of the MYO C gene at each position of glaucoma patients and non-patients was calculated using the formula 1, P (MIG), respectively. Value, P (MIN) value.
  • glaucoma development risk can be determined by detecting either the mutation at position 4037 or the mutation at position 4346 and using it as an index.
  • the information on the mutation of the gene according to the present invention is effective for predicting the onset of glaucoma in the future. If the onset of open-angle glaucoma can be predicted, in particular, by detecting a mutation in the MYOC gene by the genetic test method of the present invention, it becomes possible to prevent the onset of the disease or treat it at an early stage before the onset.

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Description

明 細 書 緑内障発症リスク判断のための遺伝子検査方法 技術分野
本発明は、 臨床検査の分野における緑内障関連遺伝子の検査方法およ び該遺伝子の変異を指標として緑内障発症リスクを予測するための検査 方法に関する。 例えば緑内障遺伝子として知られているミオシリ ン （以 下 「M Y O C」 という。） 遺伝子の異常を検出し、 該検出された異常、 す なわち遺伝子の特定位置における塩基の変異を指標として緑内障を診断 する遺伝子の検査方法、 特に個体について将来発症する可能性を予知す るための検査方法に関する。 背景技術
緑内障は、 目の中にある房水が排出されない状態となり、 目圧が上が つて目の機能が落ちる疾患である。 放置しておくと、 見える範囲が狭ま つたり、 視力が落ちたり して失明する。 ただし、 眼圧が正常にも関わら ず、 視神経に障害をきたす場合がある。
緑内障は、 原発性開放隅角緑内障 （P O A G )、 正常眼圧緑内障 （N T G )、 原発性閉鎖隅角緑内障 （P A C G )、 先天性緑内障および続発性緑 内障の 5つの病態に分類され、緑内障の 20%が遺伝性のものと言われて レ、る。 これらのうち、 最も多いのが P O A Gである。 1988年力 ら 1989 年にかけて社団法人日本眼科医会が実施した全国疫学調査によると、 40 歳以上の人口のうち 3.56%が緑内障患者であると報告されている。
緑内障の主な危険因子は家族歴であり、 その発症には遺伝子が関与し ていることが強く示唆される。 1996年 5月 17日に出願された Nguyen らの米国特許第 5，789，169号において、 緑内障関連遺伝子として T I G R (小柱網誘導ダルココルチコイ ド応答） タンパク質をコードする遺伝 子が開示された。 T I G R遺伝子は、 別名 M Y O C遺伝子としても知ら れている。 Nguyen らの米国特許第 5,789, 169号はまた、 そのタンパク 質の c D N A配列、 タンパク質自身、 それに結合する分子、 および結合 分子をコードする核酸分子を開示しており、 また緑内障および関連疾患 の診断、 ならびに心血管疾患、 免疫疾患または該タンパク質の発現ゃ活 性に影響する他の疾患や状態といった他の疾患または状態の診断のため の改善された方法および試薬を提供した。 また、 緑内障関連遺伝子のう ち C Y P 1 B 1遺伝子における突然変異を検出し、 該突然変異の存在を 緑内障の指標として個体における緑内障の診断を行う方法も開示されて いる （特表 2001-512969号公表公報）。 しかしながら、 これらは緑内障 関連遺伝子と緑内障の関係に着目しているものの、 将来における緑内障 の発症リスクを効果的に予知する手段を開示するものではない。
一方、 WO 01/88120 A1 国際公開公報では、 該公報の配列表に示す M Y O C遺伝子のプロモーター領域である- 153 位の遺伝子の変異を検出 する方法が開示され、 遺伝性が心配される家系や未発症キヤリァーであ ることが心配される患者においては、 緑内障のスクリーニングとして使 用することができることが示されている。 しかしながら、 ここでは- 153 位の 1箇所の変異に着目し、 これを指標としているのみである。
緑内障は潜行性であるため、 視神経に対し重大な損傷が起こる前に予 防また軽減する方法をとることができるように、 緑内障が発生する可能 性を早期に診断または効果的に予測する一層優れた方法が要望されてい る。 発明の開示 (発明が解決しようとする課題）
遺伝的に緑内障の危険因子を保有し、 将来における発症リスクが高い 個体を特定し、 その個体に関して重点的に緑内障の検査を実施すること ができれば、 効率的に緑内障の早期発見、 早期治療をなしうると考えら れる。 係る状況に鑑みて、 本発明は緑内障関連遺伝子と緑内障発症の関 係から、 緑内障の発症リスクを効果的に予知するための遺伝子の検査方 法を提供する事を課題とする。
(課題を解決するための手段）
本発明者らは、緑内障の発症が遺伝子の変異に関与することに着目し、 緑内障患者および非患者の緑内障原因遺伝子の上流領域およびコード領 域の遺伝子配列の分析を行い、 鋭意研究を重ねた結果、 該遺伝子に患者 群と非患者群で頻度に差が観察される遺伝的多型が存在することを見出 した。 さらに、 この遺伝的多型の有無により緑内障の有病率が一般集団 の有病率と比較した場合に統計的に有意に変化することを見出し、 本発 明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
1 . 緑内障関連遺伝子のコード領域および Zまたは上流領域を含む遺伝 子領域における少なく とも 2箇所以上の塩基の変異を検出し、 該変異を 指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検 査方法、
2 . 緑内障関連遺伝子がミオシリン （M Y O C ) 遺伝子である前項 1に 記載の検査方法、
3 . 連遺伝子領域が配列番号 1で示される塩基配列である前項 1または 2に記載の検查方法、
4 . 塩基の変異が、 置換、 欠失および/または揷入である前項 1 〜 3の いずれか 1に記載の検査方法。
5. 配列番号 1で示される塩基配列における 1 94位の Cから Aへの置 換； 1 9 9位の Aから Cへの置換； 3 24位の Gから Aへの置換； 1 0 5 1位の Cから Tへの置換； 1 0 84位の Cから Tへの置換； 1 6 2 7 位の Tから Cへの置換； 1 6 8 5位の Tから Cへの置換； 1 7 5 6位の Cから Tへの置換； 1 8 53位の Gから Cへの置換； 28 30位の Gか ら Aへの置換； 3 3 7 1位の Aから Gへの置換； 40 3 7位の Gから A への置換； 4 346位の Gから Aへの置換からなる群のいずれかを検出 する前項 3に記載の検査方法、
6. 配列番号 1で示される塩基配列における 1 94位の Cから Aへの置 換； 1 0 84位の Cから Tへの置換； 1 6 2 7位の Tから Cへの置換； 40 3 7位の Gから Aへの置換； 4 34 6位の Gから Aへの置換からな る群の少なく とも 2以上の同時置換を検出する前項 3に記載の検査方法,
7. 配列番号 1で示される塩基配列における 1 0 5 1位の Cから丁への 置換； 1 6 8 5位の Tから Cへの置換； 1 7 5 6位の Cから Tへの置換；
1 8 5 3位の Gから Cへの置換からなる群の少なく とも 2以上の同時置 換を検出する前項 3に記載の検査方法、
8. 配列番号 1で示される塩基配列における 1 9 9位の Aから Cへの置 換； 3 24位の Gから Aへの置換； 1 0 5 1位の Cから Tへの置換； 1 084位の Cから Tへの置換； 1 6 2 7位の Tから Cへの置換； 1 6 8 5位の Tから Cへの置換； 1 7 5 6位の Cから Tへの置換； 1 8 5 3位 の Gから Cへの置換； 28 30位の Gから Aへの置換； 3 3 7 1位の A から Gへの置換からなる群の少なく とも 1の置換を検出し、 該変異を指 標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検査 方法、
9. 緑内障が原発性開放隅角緑内障および/または正常眼圧緑内障であ る前項 1〜 8のいずれか 1に記載の検査方法、
1 0. 緑内障関連遺伝子のコード領域および または上流領域を含む遺 伝子領域の一部に特異的にハイプリ ッ ドを形成しうるオリゴヌク レオチ ドを用いて変異を検出することを特徴とする前項 1〜 9のいずれか 1に 記載の検査方法、
1 1. 緑内障関連遺伝子のコード領域および/または上流領域を含む遺 伝子領域の一部に特異的にハイプリ ッドを形成しうるオリゴヌク レオチ ドが、 以下に表される配列からなるオリ ゴヌクレオチドの群より少なく とも 1以上選択され、 プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド； 1 ) 配列番号 2から 2 7のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴ ヌク レオチド。
2) 前記 1 ) に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
3) 前記 1 ) または 2) に記載のオリゴヌクレオチドとス トリンジェン トな条件下でハイプリダイズしうるオリ ゴヌクレオチド。
4) 前記 1) 〜3) のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオチドと約 60% の相同性を有するオリ ゴヌクレオチド。
5) 前記 1 ) 〜4) に記載のオリ ゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個 の塩基が置換、 ^失、 挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を 含むオリゴヌクレオチド、
1 2. 前項 1 1に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なく とも 1のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅処理方法を行うことを含む前 項 1〜 9のいずれか 1に記載の検査方法、
1 3. 前項 1〜 1 0または 1 2のいずれか 1に記載の検査方法に使用す る試薬を含んでなる検査用試薬または検査用試薬キッ ト、 からなる。 図面の簡単な説明 第 1図は、 MYOC遺伝子の構造およびプライマーの位置関係を示す 図である。 （実施例 1 )
第 2図は、 ベイズの定理の説明を示す図である。 （実施例 2) 発明を実施するための最良の形態
発明者らは、 緑内障患者および非患者において、 配列番号 1に示され る塩基配列からなる緑內障原因遺伝子の翻訳開始点から 4 1 2 0塩基に わたる上流領域および翻訳開始点以降のコード領域の遺伝子配列の決定 を行った。 その過程において、 該遺伝子の上流領域およびコード領域に 患者群と非患者群で頻度に差が観察される遺伝的多型が存在することを 確認した。 さらに、 この遺伝的多型の有無の検討によって、 緑内障の有 病率が一般集団の有病率と比較した場合に統計的に有意に変化する事実 を見出した。 本発明は、 上記新知見に基づいて構成される。 (緑内障関連遺伝子）
本発明における、 緑内障関連遺伝子の例として T I GR (小柱網誘導 ダルココルチコィ ド応答）遺伝子が挙げられる。この T I GR遺伝子は、 別名 MYOC遺伝子としても知られている。 MYOC遺伝子の上流およ びコ一ド領域の構造および配列は、 第 1図および配列番号 1に表されて いるとおりであって、 例えばプロモータ一要素を有する上流領域および タンパク質をコ一ドするコード領域ならびに他の要素がある。 該 MYO C遺伝子の塩基の位置は、 配列番号 1において定めた塩基番号に従う (Genbank 受入番号 NT— 029874)。 この MY O Cタンパク質をコード する領域は、 三個のェキソンから構成される。 配列番号 1の 1〜4 1 2 0位は上流領域であり、 4 1 20〜4 7 2 2位はェキソン 1を表す。 (遺伝子の変異）
本発明の緑内障関連遺伝子の変異とは、 MYOC遺伝子の塩基配列中 の特定位置の塩基の、 異なる塩基への置換、 欠失および/または挿入が あることをいう。 該特定位置は、 たとえば、 異なる塩基に置換されるこ とをいう。 該特定位置は、 配列番号 1に示される塩基配列の 1 94位、 1 9 9位、 3 24位、 1 0 5 1位、 1 0 84位、 1 6 2 7位、 1 6 8 5 位、 1 7 5 6位、 1 8 5 3位、 2 8 30位、 3 3 7 1位、 4 0 3 7位お よび/または 4 34 6位から選択される位置をいう。
本発明における特定位置での具体的な塩基の置換は、 配列番号 1で示 される塩基配列の 1 94位の Cから Aへ； 1 9 9位の Aから Cへ； 3 2 4位の Gから Aへ； 1 0 5 1位の Cから丁へ； 1 0 84位の Cから丁へ； 1 6 2 7位の Tからじへ； 1 6 8 5位の Tから Cへ； 1 7 5 6位のじか ら Tへ； 1 8 5 3位の Gからじへ； 28 30位の Gから Aへ； 3 3 7 1 位の Aから Gへ ; 40 3 7位の Gから Aへ； 4 346位の Gから Aへの 置換が挙げられる。
好ましくは、 配列番号 1で示される塩基配列の 1 9 9位； 3 24位； 1 0 5 1位； 1 084位； 1 6 2 7位； 1 6 8 5位； 1 7 5 6位； 1 8 5 3位； 28 30位の； 3 3 7 1位の塩基について少なくとも 1の置換 を検出し、 遺伝子の検査を行う。 さらに、 1 94位； 1 9 9位； 3 24 位； 1 0 5 1位； 1 084位； 1 6 2 7位； 1 6 8 5位； 1 7 5 6位； 1 8 5 3位； 28 3 0位； 3 3 7 1位； 40 3 7位； 4 34 6位の塩基 から少なく とも 2以上の置換を検出することがより好ましい。
(検査方法）
当該遺伝子の変異の検査方法は、 本発明によって開示する MYOC遺 伝子の特定の変異を検出しうる限りにおいて、 その手法は何ら限定され るものではなく、 公知もしくは将来得られうる各種の方法を広く用いる ことができる。
被験者の M Y O C遺伝子について本発明で開示される変異を検查する ために、 当該変異位置を含む塩基配列を解析する各種の方法を用いるこ とができる。 これらの方法としては、 例えばサザンハイブリダィゼ一シ ョン法、 ドッ トハイプリダイゼーション法 (J. Mol. Biol., 98: 503-517 (1975)等参照）、 ジデォキシ塩基配列決定法 （サンガー法）、 D N Aの増 幅手法を組合せた各種の検出法 [例えば P C R—制限酵素断片長多型分 析法 (RFLP: Restriction fragment length polymorphism)、 P C R— 単鎖高次構造多型分析法 (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86: 2766-2770 (1989)等参照）、 P C R —特異的配列オリ ゴヌク レオチ ド法 （SSO: Specific sequence oligonucleotide)、 P C R— s S Oと ットノヽ ブリ ダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的ォリ ゴヌクレオチド法 (Nature, 324: 163 166 (1986)等参照）]等を例示することができる。本 発明によって検出すべき遺伝子変異の位置が開示され特定されている以 上、 当業者にとっては公知の方法を用いてその変異を検出することがで さる。
(検査用試料の調製）
被験者の M Y O C遺伝子を解析するために、 本発明の検査方法に供さ れる検査用試料は、 被験者の M Y O C遺伝子を含む生物学的試料であれ ば良く、 特に限定されない。 このような生物学的試料としては、 生体材 料組織、 手術切除組織、 口腔粘膜組織等の生体から採取した組織の他、 血液、 血清、 糞便、 射出精液、 喀痰、 唾液、 脳脊髄液、 毛髪等が挙げら れる。 例えばプレンダーを用いて組織等の生物学的試料を破砕し、 フエ ノール · ク口口ホルム法などの公知の遺伝子抽出方法で抽出した MY O C遺伝子を被検用試料とすることができる。 さらに抽出した MYOC遺 伝子を増幅し、 濃縮したものを被検用試料とすることができる。
ここで、 被検用試料は、 MY OC遺伝子の全長 DN Aでもよく、 DN A断片 （部分 DNA) であってもよい。 DNA断片が検査に供される場 合には、 MYO C遺伝子の上流領域および/またはコード領域を含み、 少なく とも 1箇所以上、 好ましくは 2箇所以上、 より好ましくは 3箇所 以上の変異にかかる特定位置を含むことが必要である。 当該 DNA断片 は、 本発明の遺伝子変異の検出に利用できるもの、 即ち、 塩基置換の測 定のために供される被験 DN Aとしての測定可能な塩基長を有するもの であれば、 特にその塩基長について制限はない。 そのような DN Aの塩 基長として、 通常 1 0塩基長程度以上、 好ましくは 20塩基長程度以上 のものを選択することができ、 一般的には 1 00〜 1 000程度の、 好 ましくは 200〜 300程度の塩基長からなるものが選択される。
また、 被検用試料は、 DNA、 DNA転写産物のいずれであってもよ い。 具体的には、 DNAより転写されたメッセンジャー RNA (mRN A) でもよいし、 さらにその mRNAから逆転写された c DNA、 ある いは相補 DNAであってもよい。 本発明の遺伝子変異の検出法において 採用され得る各種の操作、 例えば、 DN Aまたは DNA断片の合成、 D NAの切断、 削除、 付加または結合を目的とする酵素処理、 DNAの単 離、 精製、 複製、 選択、 DNA断片の増幅などはいずれも常法に従うこ とができる （分子遺伝学実験法、 共立出版 （株） 1983年発行等参照）。 またこれらは必要に応じて、 適宜常法に従い修飾して用いることもでき る。
被検用試料を調製するための核酸の増幅は、 例えば P CR法またはそ の変法に従って実施することができる（P CRテクノロジー、宝酒造（株） 1990年発行等参照）。 この場合、 緑内障関連遺伝子の一部に特異的にハ イブリ ツ ドを形成しうるオリゴヌクレオチド、 具体的には変異にかかる 上記特定位置を少なく とも 1以上有する所望の D N A断片を特異的に増 幅するように適宜選択したプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド を利用するができる。
(プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド）
プライマー機能を有するオリゴヌクレオチドとして、 例えば 1 ) 配列 番号 2〜 2 7のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ ド、 2 ) 前記 1 ) に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、 3 ) 前記 1 ) または 2 ) に記載のオリ ゴヌクレオチドとス トリンジェントな条件下で ハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチド、 4 ) 前記 1 ) 〜 3 ) のいず れか 1に記載のオリゴヌクレオチドと約 60%の相同性を有するオリゴ ヌクレオチド、 5 ) 前記 1 ) 〜 4 ) に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、 挿入もしくは付加といった変異され た塩基配列を含むオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
オリゴヌクレオチドは、 自体公知の方法により設計することができ、 例えば化学的に合成することができる。 あるいは、 天然の核酸を制限酵 素などによって切断し、 上記のような塩基配列で構成されるように改変 し、 あるいは連結することも可能である。 具体的には、 オリゴヌクレオ チド合成装置 （アプライ ドバイオシステムズ社製 Expedite Model 8909 DNA合成機） 等を用いて合成することができる。 また、 1ないし 数個の塩基が置換、 欠失、 揷入もしくは付加といった変異させたオリゴ ヌクレオチドの合成法も、 自体公知の製法を使用することができる。 例 えば、 部位特異的変異導入法、 遺伝子相同組換え法、 プライマー伸長法 またはポリメラーゼ連鎖増幅法 （P C R ) を単独または適宜組み合わせ て、例えば、 Molecular Cloning; A Laboratory Manual、 2版、 Sambrook ら編、 コールド . スプリ ング . ハーバー . ラボラ トリー . プレス、 コー ルド · スプリング 'ハーバー、 ニューヨーク、 1989年； [ラボマ二ユア ル遺伝子工学]、 村松正實編、 丸善株式会社、 1988年； [P C Rテクノロ ジー、 DNA増幅の原理と応用]、 Ehrlich,HE.編、ス トック トンプレス、 1989年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施 することができ、 例えば U l m e rの技術 （Science(1983)219:666) を 利用することができる。
ストリンジェントなハイプリダイゼーション条件は一般に知られたも のを選択することができ、 その一例としては、 50%ホルムアミ ド、 5xS S C (150mMNaCl、 15mM クェン酸三ナトリ ウム）、 50mM リン酸ナ トリウム， pH7.6、 5xデンハーツ溶液、 10%デキス トラン硫酸、 および 20 g/m 1 の DN Aを含む溶液中、 42°Cでー晚ハイブリダイゼーショ ンした後、室温で 2xSSC'0.1% S D S中で一次洗浄し、次いで、約 65°C において 0. lxSSC · 0.1 % S D Sで二次洗浄といった条件があげられる。
(DNAの変異の検出）
DNAの変異は、 例えば、 被検用試料に含まれる MYOC遺伝子の塩 基配列をサンガー法により決定し、 検出することができる。
1本鎖の目的 MY OC遺伝子に相補的なオリ ゴヌク レオチドをハイブ リダィズさせ、 これをプライマーとして 5 'から 3 '方向に相補鎖を DN Aポリメラーゼによって合成させる。 このときに使用するオリ ゴヌクレ ォチドは、 例えば上記 （プライマー機能を有するオリ ゴヌクレオチド） で説明したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することができ る。
反応の基質として 4種のデォキシヌクレオチド三リン酸 （d NT P) のほかに少量のジデォキシヌクレオチド三リン酸 （d d NT P) を塩基 ごとに別々に加え、 相補鎖を合成させる。 d d NT Pはデォキシリボー スの 3 '位の- OH基が- H基になっている d NT Pのアナログ （類似物 質） で、 d NT Pの代わりに d d NT Pが取り込まれると、 それ以上相 補鎖が合成されなくなり、様々な長さの DN Aが合成される。反応系に、 例えば化学発光物質や放射性同位元素 （R I ) で標識したプライマーや dNT Pを加えることにより、 合成される DNAを標識し、 反応物を変 性ポリアクリルァミ ドゲルで電気泳動することにより塩基配列を決定す ることができる。
サンガー法に用いる D NAポリ メラーゼと して、 例えばク レノー (Klenow) 酵素、 T 7ファージゃ好熱性細菌由来の D N Aポリメラーゼ なとが挙げられる。 これらは共通してェキソヌクレアーゼ活性を遺伝子 工学的に除いてある。 当初、 サンガー法では目的の遺伝子を 1本鎖 DN Aにして用いていたが、 現在では 2本鎖プラスミ ドをそのままアルカリ 変性させて用いる方法も多用されている。
シークェンス反応はサンガー法またはサイクルシークェンス法により 行うことができる。 サイクルシークェンス法はサンガー法と P CRを組 み合わせた方法で、 铸型 DNAを 1本鎖にする必要はなく、 反応系に D NAとプライマー 1種類、 dNT P s、 d d NT P s、 そして耐熱性の DNAポリメラーゼを加えて行う。 ？じ11反応中に（1 d NT P sが取り 込まれ、 伸長が止まり、 結果として 3 '末端が同一の塩基の DNAが合成 される点はサンガー法と同じである。 自動シークェンサ一のシークェン ス反応には、 プライマーを蛍光標識した Dye primer法と、 d d NT P を蛍光標識した Dye terminator法、 さらに基質の d NT Pに標識した Internal-label法等がある。
(検査用試薬および検査用試薬キッ ト） 本発明はまた、 緑内障の遺伝子検査方法に使用する検査試薬および検 查試薬キットも含むものである。 検査試薬としては、 例えば被検試料増 幅用プライマー、 被検用試料の塩基配列決定用プライマー、 各種ポリメ ラ一ゼ、 塩基基質、 標識物質など本発明の方法に使用されるあらゆる試 薬のいずれであっても良い。 また、 検查用試薬キットは本発明の方法に 使用されるあらゆる試薬のうち少なく とも 2以上をキットとして使用す るものであれば良い。
(実施例）
以下、 本発明の内容を実施例を用いて具体的に説明する。 伹し、 本発 明はこれらに何ら限定されるものではない。
(実施例 1 MYO C遺伝子の DNA解析）
( 1 ) DNAの抽出
被験者から提供を受けた血液を常法に従って処理し、 有核細胞より D NA 抽出した。 DNA抽出キットとして製品名「Genとるくん TM (血 液用）」 （宝酒造社製） を用い、 同製品規定のプロ トコールに従って DN Aを抽出した。
(2) 铸型 DNAの増幅
得られた DNA抽出液を铸型とし、 P CR増幅用キット、 製品名 「L AT a q (アプライ ドバイオシステムズ社製）」を用いて P CRにより、 MYOC遺伝子の増幅を行った。 増幅用プライマーは M_ F 1 (配列番 号： 2) をセンスプライマー、 M— R 3 (配列番号： 3) をアンチセン スプライマーとして使用した。 M— F 1は配列番号 1に表された塩基配 列に基づく 22— 46 位の領域に表された塩基配列、 M—R 3は 5992— 5968位の領域に表された塩基配列の相補的な配列からなる。反応は、 9 4°C 1分の加熱の後、 94°C3 0秒、 6 0°C30秒、 7 2 °C 5分 3 0秒 のサイクルを 30回実施した。 MY OC遺伝子のェキソン、 翻訳開始点 および上流領域の構造と、 プライマーによって増幅される領域の位置関 係は第 1図のとおりである。
(3) DN A断片の配列決定
上記 P CRにより得られた DNA断片について、 自動 DNAシーケン サー ABI Prism3100 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用い、 同製 品規定のプロ トコールに従って DN Aの塩基配列を決定した。このとき、 次に示すプライマーを用いてサイクルシーケンス反応を行った。
配列番号 1に表された塩基配列に基づく領域に含まれる塩基配列また はその相補的な配列からなる次の各配列番号に表されたオリゴヌク レオ チドをプライマーとして使用した。
順鎖： M— F 1 領域 22·46位 （配列番号： 2)、
M— S F 1 領域 372-390位 （配列番号： 4)、 M— S F 2 領域 740-759位 （配列番号： 5)、
M— S F 3 領域 1093-1110位 （配列番号： 6 )、 Μ— S F 4 領域 1456-1475位 （配列番号： 7)、 M— S F 5 領域 1800-1817位 （配列番号： 8)、 Μ— S F 6 領域 2148-2165位 （配列番号： 9)、 M— S F 7 領域 2498-2516位 （配列番号： 1 0)、
Μ- S F 8 領域 2857-2875位 （配列番号： 1 1 )、 M— S F 9 領域 3227-3246位 （配列番号： 1 2)、 Μ- S F 1 0 領域 3601-3620位 （配列番号： 1 3)、 Μ- S F 1 1 領域 3910-3927位 （配列番号： 1 4)、 逆鎖： Μ— S R 4 領域 4730-4712位 相補配列（配列番号： 1 5 )、 Μ- S R 5 領域 4337-4319位 相補配列（配列番号： 1 6) M- S R 6 領域 4022-4003位 相補配列（配列番号： 1 7)、
M— S R 7 領域 3712-3695位 相補配列（配列番号： 1 8)、
M- S R 8 領域 3379-3360位 相補配列（配列番号： 1 9)、
M- S R 9 領域 2950-2933位 相補配列（配列番号： 20)、 MM—— SS RR 11 00 領域 2593-2575位 相補配列（配列番号： 2 1 )、 M— S R 1 1 領域 2259-2241位 相補配列（配列番号： 2 2)、 M— S R 1 2 領域 1950- 1933位 相補配列（配列番号： 2 3 )、 M- S R 1 3 領域 1556-1538位 相補配列（配列番号： 24), M— S R 1 4 領域 1170- 1153位 相補配列（配列番号： 2 5 )、 M— SR 1 5 領域 824-807位 相補配列（配列番号： 26 )、
M- S R 1 6 領域 470-453位 相補配列（配列番号： 2 7) 上記プライマーのうち、 M— F 1から M— S F 1 1までは順鎖、 M— S R 4から M_ S R 1 6までは逆鎖の配列を決定するために用いる。 (4) D N A断片の連結および M Y O C遺伝子の塩基配列
さらに、 各血液提供者毎の DN A断片の配列を、 Phred/Phrap ソフ ト ウェア （米国ワシントン大学製） を用いて連結し、 各血液サンプル提供 者毎に 1個の塩基配列を得た。
対照となる非患者ボランティア群 6 7名から得られた血液を上記手法 に従って処理し、非患者群で多数を占める MY OC遺伝子の塩基配列（配 列番号： 1 ) を決定した。
(実施例 2)
( 1 ) MYO C遺伝子の塩基配列の多型の解析 1
医療機関によって開放隅角緑内障と診断された患者 8 8名から得られ た血液を上記実施例の手法に従って処理し、 各提供者についての MYO C遺伝子の塩基配列を調べ、 非患者群の塩基配列と比較した。 その結果を表 1に示す。 表 1の第 1行は、 配列番号 1で表される MY OC遺伝子の塩基配列の位置、 第 2行は各位置における非患者群で多数 を占める塩基、 第 3行は非患者群における各塩基位置での変異の頻度、 第 4行は患者群における各塩基位置での変異の頻度、 第 5行が変異とし て検出された塩基の変化を示す。
その結果、塩基位置 3 24位、 40 3 7位および 4 34 6位において、 非患者群で約 3%の頻度で変異を認め、患者群では 6.8〜： 10.2%の頻度で 変異を認めた。 その他の位置では、 非患者群では全く変異を認めなかつ たのに対し、 患者群では約 1〜3.4%の頻度で変異を認めた。
(表 1)
Figure imgf000017_0001
(2) MY O C遺伝子の塩基配列の多型の解析 2
さらに、 塩基位置 40 3 7位および 4 346位に変異を有していた患 者 1 1名および非患者 2名について、 他の位置での変異を調べた。
その結果を表 2に示す。 表 2の第 1行は塩基位置、 第 2行以下は各被 験者での変異の有無を示す。
その結果、 非患者群では塩基位置 40 3 7位および 4 346位の他の 位置では変異を認めなかったのに対し、 患者群では 1 94位、 1 0 84 位および 1 6 2 7位に変異を認める群、 1 0 5 1位、 1 6 8 5位、 1 7 5 6位および 1 8 5 3位に変異を認める群および変異を認めない群が確 認された。
(表 2)
Figure imgf000018_0001
(3) リスク判定
べィズの定理にしたがって、 MYOC遺伝子の配列に変異を有する場 合の緑内障発症のリスクを予測する。
ある被験者が緑内障を将来発症する確率は、 事前に何の情報も無い場 合には、 疫学的に得られた一般集団における有病率で判断される。 この 有病率を P (G) とし、 緑内障を発症しない確率を P (N) とすると、 P (N) = 1 - P (G) とと表される。
一方、 MY OC遺伝子の配列に単一もしくは複数の変異を有する場合 を Mとして、 Mを保有する被験者が緑内障を将来発症する確率を条件付 確率 P (G I M) とする。 ここで、 もし P (G I M) > P (G) である ならば、 その変異 Mを保有している被験者は将来緑内障を発症する確率 が一般集団よりも高いことになり、 高リスク者と判定される。
条件付確率 P (G I M) は、 以下のように算出される。
緑内障患者群において Mを保有する確率を P (M I G)、非患者におい て Mを保有する確率を P (M I N) とする。 ベイズの定理 （第 2図） よ り、 P (M I N) は式 1で示される。 P (G) 値には、 1988年から 1989 年にかけて社団法人 S本眼科医会が実施した全国疫学調査によると、 40 歳以上の人口のうち 3.56%が緑内障患者であると報告されている数値 を引用することができる。 さらに、 緑内障患者および非患者の各位置に おける MYO C遺伝子の塩基の変異の確率を、 各々式 1、 P (M I G) 値、 P (M I N) 値にあてはめることができる。
(式 1 )
P (G) x P (M I G)
P (G I ) =
P (G) x P (M I G) +P (N) x P ( | N)
以上の数式を用いて各変異について P (G I M) を算出したところ、 1 94位 = 28.1、 1 9 9位 = 28.1、 3 24位 = 2.184、 1 0 5 1位 = 28.1、 1 0 84位 = 28.1、 1 6 2 7位 = 28.1、 1 6 8 5位 = 28.1、 1 7 5 6位 = 28.1、 1 8 5 3位 = 28.1、 2 8 3 0位 = 28.1、 3 3 7 1位 = 28.1、 4 0 3 7位 = 3.2、 4 346位 = 3.2の割合で、 P (G) よりも P (G | M) の数値が高く算出され、 これらの位置で変異を有することが緑内障の高 リスク群であることを示すことが判明した。 このことより、 上記遺伝子 の位置における変異を検出することが、 開放隅角緑内障の発症リスクの 予知に有効であることが確認された。
(4) リスク判定のために有効な検査
さらに、 リスク判定を有効に行うための MY OC遺伝子の変異の位置 について解析し、 その結果を表 2に示した。
40 3 7位または、 4 346位に変異を有する患者の確率は約 1 0 % であるから、 当該位置に変異を有する者の緑内障発症のリスクがまず判 断できる。 また、 この位置に変異を有する患者はいずれもその双方に変 異を有している。 したがって、 40 3 7位または 4 34 6位のいずれか 一方の変異を検出し、 指標とすることにより緑内障発症リスク判定する ことができる。
しかし、 非患者群でも 4 Ό 3 7位、 4 34 6位に変異を有する患者の 確率は各々約 3%である。 一方、 40 3 7位、 4 34 6位に変異を有す る者のうち、 1 9 4位、 1 0 8 4位および 1 6 2 7位の全てに変異を有 する者は全て患者 （患者 1、 患者 2、 患者 3 ) であった。 したがって、 4 0 3 7位または 4 3 4 6位のいずれか一方の変異に加えて、 さらに 1 9 4位、 1 0 8 4位および 1 6 2 7位のいずれか少なく とも 1箇所の変 異を検出し指標とすることで、 偽陽性の判定を回避し緑内障発症の予測 を行うことができる。
また、 同様に 1 0 8 4位、 1 6 8 5位、 1 7 5 6位、 1 8 5 3位の全 てに変異を有する者も全て患者 （患者 1 0、 患者 1 1 ) であった。 した がって、 1 0 8 4位、 1 6 8 5位、 1 7 5 6位および 1 8 5 3位のいず れか少なくとも 1箇所の変異を検出し指標とすることで、 偽陽性の判定 を回避し緑内障発症の予測を行うことができる。 産業上の利用の可能性
以上説明したように、 本発明にかかる遺伝子の変異に関する情報は、 緑内障の将来における発症予測に有効である。 本発明の遺伝子検査方法 により M Y O C遺伝子の変異を検出することで、 特に開放隅角緑内障の 発症を予測することができれば、 発症前の段階で発症予防または早期に 治療することが可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 緑内障関連遺伝子のコード領域およびノまたは上流領域を含む遺 伝子領域における少なく とも 2箇所以上の塩基の変異を検出し、 該変異 を指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の 検査方法。
2. 緑内障関連遺伝子がミオシリン （MYOC) 遺伝子である請求の 範囲第 1項に記載の検査方法。
3. 遺伝子領域が配列番号 1で示される塩基配列である請求の範囲第 1項または第 2項に記載の検査方法。
4. 塩基の変異が、 置換、 欠失およびノまたは挿入である請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1に記載の検査方法。
5. 配列番号 1で示される塩基配列における 1 9 4位の Cから Aへの 置換； 1 9 9位の Aから Cへの置換； 3 2 4位の Gから Aへの置換； 1 0 5 1位の Cから Tへの置換； 1 0 8 4位の Cから Tへの置換； 1 6 2 7位の丁から Cへの置換； 1 6 8 5位の Tから Cへの置換； 1 7 5 6位 の Cから Tへの置換； 1 8 5 3位の Gから Cへの置換； 2 8 3 0位の G から Aへの置換； 3 3 7 1位の Aから Gへの置換； 4 0 3 7位の Gから Aへの置換； 4 3 4 6位の Gから Aへの置換からなる群のいずれかを検 出する請求の範囲第 3項に記載の検査方法。
6. 配列番号 1で示される塩基配列における 1 9 4位の Cから Aへの 置換； 1 0 8 4位の Cから Tへの置換； 1 6 2 7位の Τから Cへの置換； 4 0 3 7位の Gから Αへの置換； 4 3 4 6位の Gから Aへの置換からな る群の少なく とも 2以上の同時置換を検出する請求の範囲第 3項に記載 の検査方法。
7 . 配列番号 1で示される塩基配列における 1 0 5 1位の Cから丁へ の置換； 1 6 8 5位の Tから Cへの置換； 1 7 5 6位の Cから Tへの置 換； 1 8 5 3位の Gから Cへの置換からなる群の少なく とも 2以上の同 時置換を検出する請求の範囲第 3項に記載の検査方法。
8 . 配列番号 1で示される塩基配列における 1 9 9位の Aからじへの 置換； 3 2 4位の Gから Aへの置換； 1 0 5 1位の Cから Tへの置換； 1 0 8 4位の Cから Tへの置換； 1 6 2 7位の Tから Cへの置換； 1 6 8 5位の Tから Cへの置換； 1 7 5 6位の Cから Tへの置換； 1 8 5 3 位の Gから Cへの置換； 2 8 3 0位の Gから Aへの置換； 3 3 7 1位の Aから Gへの置換からなる群の少なく とも 1の置換を検出し、 該変異を 指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検 査方法。
9 . 緑内障が原発性開放隅角緑内障および Zまたは正常眼圧緑内障で ある請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれか 1に記載の検査方法。
1 0 . 緑内障関連遺伝子のコード領域および Zまたは上流領域を含む 遺伝子領域の一部に特異的にハイプリ ッ ドを形成しうるオリゴヌク レオ チドを用いて変異を検出することを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 9 項のいずれか 1に記載の検査方法。
1 1. 緑内障関連遺伝子のコード領域および/または上流領域を含む 遺伝子領域の一部に特異的にハイプリ ッ ドを形成しうるオリゴヌクレオ チドが、 以下に表される配列からなるオリゴヌクレオチドの群より少な く とも 1以上選択され、 プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド；
1)配列番号 2から 2 7のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴ ヌクレオチド。
2)前記 1)に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
3)前記 1)または 2)に記載のオリゴヌクレオチドとス トリンジェント な条件下でハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
4)前記 1)〜 3)のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオチドと約 60%の 相同性を有するオリゴヌクレオチド。
5)前記 1)〜 4)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩 基が置換、 欠失、 挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含む オリ ゴヌク レオチド。
1 2. 請求の範囲第 1 1項に記載のオリゴヌクレオチドから選択され る少なく とも 1のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅処理方法を行う ことを含む請求の範囲第 1項〜第 9項のいずれか 1に記載の検査方法。
1 3. 請求の範囲第 1項〜第 1 0項または第 1 2項のいずれか 1に記 載の検査方法に使用する試薬を含んでなる検査用試薬または検査用試薬 キッ ト。
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