WO2003079013A1

WO2003079013A1 - Substrat pour essai biologique, appareil d'essai biologique et appareil de lecture

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Publication number: WO2003079013A1
Application number: PCT/JP2003/003089
Authority: WO
Inventors: Motohiro Furuki; Hisayuki Yamatsu
Original assignee: Sony Corporation
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2003-03-14
Publication date: 2003-09-25
Also published as: EP1486786B1; US20110008879A1; KR20040099098A; DE60324112D1; KR100994306B1; CN1547668A; TWI252255B; TW200305648A; EP1486786A1; US20050014286A1; CN1288446C; EP1486786A4; US8211380B2

Description

明細書バイオアツセィ用基板とバイオアツセィ装置及び読み取り装置技術分野

本発明は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において有用なバイオアツセィツールとなる円盤状の情報記録媒体等に関する。より詳細には、検出用物質が固相化された基板表面部位に標識化されたターゲット物質を含む溶液を滴下することにより、ハイブリダィゼーションその他の分子間相互反応が高精度に起こるように工夫されたバイオアツセィ用基板、該基板を用いたバイオアツセィ方法及び該基板を利用したバイオアツセィ装置並びにその記録情報の読み取り装置に関する。背景技術

本発明の主たる従来技術を以下説明する。現在、マイクロアレィ技術によって所定の D NAが微細配列された、いわゆる D NA チップ又は D N Aマイクロアレイ（以下、「D N Aチップ」と総称。）と呼ばれるパイオアッセィ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、 S N P s (—塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創藥、臨床診断、薬理ジエノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。

この D NAチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種 ·多数の D NAオリゴ鎖ゃ c D N A (complementary DNA) 等が集積されていることから、ハイブリダィゼ一シヨン等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。 T/JP03/03089

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D N Aチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化された D N Aプロ一ブに対して、細胞、組織等から抽出した mR N Aを逆転写 P C R反応等によって蛍光プローブ d N T Pを組み込みながら P C R増幅し、前記基板上においてハイブリダィゼーシヨンを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うという手法である。

ここで、 D N Aチップは二つのタイプに分類できる。第 1 の夕イブは、半導体露光技術を応用したフォトリソグラフィ一の技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、ァフィメトリクス社（A f f y m e t r i x社）によるものが代表的である。この種のチップは、集積度は高いが、基板上での D NA合成には限界があって、数十塩基程度の長さである。第 2のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを用いて、予め用意された D N Aを基板上に分注 · 固相化していくことによって作製されるものである。この種のチップは、集積度は前者に比べて低いが、 1 k b程度の D N A 断片を固相化できるという利点がある。

しかしながら、上記した従来の D N Aチップ技術では、該 D N Aチップ自体の集積数、集積密度が少なかったので、一度のアツセィで達成できる解析量が充分とは言えなかった。また、検出用物質の種類と数、更にはその基板上における配置分け（グルーピング）を、ュ一ザ一が自由に設定することが困難であった。

また、 Tm (melting Temperature) 又は G C含有率が揃っていない D N Aプローブが二次元の平面的な広がりを持つ基板表面上に検出用物質が配列された構成の従来の D N Aチップにおいては、同一のハイブリダィゼーシヨン条件、洗浄条件に晒されて偽陽性又は偽陰性を示す危険性が高いという問題があった。また、基板表面に D N Aプローブ等の検出用物質を固相化するとともに、ターゲット物質を含むサンプル溶液を滴下（スポッテイング）するアツセィ装置と、該検出用物質と前記標識夕ーゲット物質の間の相互反応結果を読み取る、「リーダー」又は「スキャナ一」とも称される解析装置が、従来別個独立の構成であったので、バイオアツセィとそれに続く読み取り及び解析作業を一連化できなかったので、非常に不便であった。

更に、 D N Aプローブ等の検出用物質やサンプル溶液の微小滴の量や形状が不均一であったので、蛍光強度読み取り精度が低いという技術的課題があった。

そして、チップ 1枚当たり、更には集積量当りの単価が高く、解析装置も非常に高価な装置であった。

そこで、本発明は、固相化される検出用物質の集積量が多く、また、該物質のグルーピングが自在で、かつ安価なバイオアツセィ基板と、該基板の好適な製造方法並びにバイオアツセィを効率的かつ確実に行えるバイオアツセィ装置とアツセィと読み取り解析作業を一連化できる基板記録情報の読み取り装置を提供することを主な目的とする。発明の開示

上記技術的課題を解決するために、まず、本発明においては、以下の「バイオアツセィ用基板」を提供する。なお、本発明において「バイオアツセィ」とは、物質間の相互反応に基づく生化学的分析を意味する。

第 1 に提供するバイオアツセィ用基板は、光学的に記録情報の読み取りが可能とされた円盤状基板の表面に検出用物質を固相化できる検出表面を備え、この検出表面を、前記基板に上方視放射方向に延びるように設けられた溝構造内に設けるように工夫した。

ここで、本発明において「検出用物質」とは、検出表面に直接的に、又はリンカ一を介して間接的に固相化され、蛍光物質等により標識された夕ーゲット物質と特異的な相互結合反応を発揮する低分子、高分子及び生体物質等を広く包含し、狭く解釈されない。また、基板に形成される「溝構造」とは、例えば、筋状に延設されたマイクロチャンネル構造又は溝構造部位であり、この溝構造内にはピッ卜やセル構造等によって放射方向に区切りがあってもよく、また、ピットやセル構造の集合体から構成され、これらのピットゃセル構造が配列された部位を上方視したときに略筋状の外観を呈するような構造であってもよく、狭く解釈されない。この溝構造を備えるバイオアツセィ用基板が属する一つの分野は、円盤状のマイクロチャネルアレイである。

このバイオアツセィ用基板は、検出用物質を固相化するための基板として、例えば、直径 1 0 c m程度の円盤状基板が採用されているので、検出用物質を固相化できる検出表面又は該検出表面を備えるピット、ダル一ブ等を多数集積できるという利点がある即ち、記録情報の集積量が多い D N Aチップやバイオセンサ一チップ等を提供できる。

また、前記基板上に上方視放射状をなすように、互いにコンタミネーションしないように所定間隔で設けられた溝構造内に検出表面を設けた構成を採用しているので、溝構造毎に検出用物質の種類をグルーピングできる。例えば、疾病発症のマーカ一遺伝子を溝構造単位でグルーピングしたり、 T m又は G C含有率の違いに基づいて、溝構造単位に固相化するヌクレオチド（検出用物質）をグルーピングしたりすることが可能となる。これにより、検出用物質の至適反応が得られるバッファ一組成、濃度等のハイブリダィゼ一シヨン条件その他の反応条件、洗浄条件、サンプル溶液濃度等を変えることが可能になるので、解析作業において偽陽性又は偽陰性が示される危険性を格段に減少させることがでさる。

また、円盤状基板の中心側から外周側に延びる上方視放射状の溝構造を該基板上に形成したことによって、毛細管現象を利用した送液や、円盤状の基板を所定の方法で回転させることによって生じる遠心力を生かした送液も利用することができる。例えば、反応後にアクティブに結合しなかった余分な夕ーゲット物質を除去する際には、洗浄液を基板中心領域から溝構造内（の各検出表面部位）に、円滑かつ確実に送液することが可能となる。

続いて提供するバイオアツセィ用基板は、前記検出表面部位の位置情報と回転同期情報を提供する手段を備えるものであり、また、この手段が前記基板上に設けられたゥォブリングまたはアドレスピットによるものとすることができる。なお、「ゥォブリング」とは、ディスク上の物理的な番地（ァドレス）の情報を予めディスク上に記録するために、ユーザ一によるデータを記録するグループ（案内溝）をトラックの中心に対してわずかに左右に蛇行させることである。通常、トラッキングサ一ポ帯域より高い周波数に対し、わずかな周波数の偏向（D ev i a t i o n) を有する F M 変調を行われ、正弦波変調信号振幅をグループ半径方向変位として基板上に刻まれる。このバイオアツセィ用基板は、位置情報と回転同期情報に基づいて、検出用物質含有溶液並びに夕一ゲット物質含有溶液を所定の検出表面部位に正確に追従させて滴下する場合に好適に利用することができる。

更に提供するバイオアツセィ用基板は、上記基板上に形成された上記検出表面部位に、ヌクレオチド鎖、ペプチド、タンパク質、脂質、低分子化合物、リボソームその他の生体物質のいずれかが少なくとも固相化された構成を備えるものである。

この基板は、一本鎖ヌクレオチド鎖間の相互反応、即ちハイプリダィゼーションを行わせる D N Aチップ二本鎖ヌクレオチド鎖とペプチド（又はタンパク質）の相互反応、抗原抗体反応その他の分子間相互反応を行わせるバイオセンサ一チップとして広く利用できる。

ここで、「ヌクレオチド鎖」とは、ヌクレオチドが重合した D N Aプローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチォドが重合した D N A (全長あるいはその断片）、逆転写により得られる c D N A ( c D N Aプローブ）、 R N A等を広く含む。一本鎖の場合は、標的ヌクレオチド分子とのハイブリダィゼ一シヨン反応に基づく分析を行う。二本鎖の場合は、タンパク質と D N A (特定の配列部位）との反応に分析を行うことができ、例えば、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプ夕一分子と応答配列 D N A部分の結合等を分析することができる。「ペプチド」は、複数のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものである。「タンパク質」は、 L— α —アミノ酸がペプチド結合によって連結したポリぺプチド鎖を主要構成成分とする生体高分子であって、単純タンパク質、複合タンパク質のいずれも含む。以上には、ストレプトアビジンと強固に結合するピオチンが結合された D N A断片や種々のリガンド分子が含まれる。「脂質」には、リン脂質膜が含まれ、検出表面を膜モデルとして利用できる。「低分子化合物」には、シランカップリング剤が含まれる。該剤はシリコン表面又はガラス表面に結合され、ペプチド、タンパク質等のリンカ一として機能する架橋剤の一種である。「生体分子」には、細胞やウィルス粒子も含まれる。なお、検出表面処理の構成は、固相化する検出用物質によって適宜選択でき、場合によっては吸着防止剤であるポリリシンで処理される。

次に、本発明では、以下の「バイオアツセィ方法」を提供する。光学的に記録情報の読み取りが可能とされた円盤状基板の表面に、検出用物質を固相化できる検出表面を備え、前記基板に上方視放射状をなすように所定間隔を置いて形成された溝構造内に該検出表面が設けられた構成のバイオアツセィ用基板に対して、インクジエツトプリンティング法又はマイクロメカ二カルスポッティング法によって、前記検出表面部位に検出用物質含有溶液を滴下して前記検出用物質を固相化するバイオアツセィ用基板の製造方法を提供する。

この方法は、溝構造内の所定の検出表面部位に正確に追従させながら、検出用物質を含む微小滴、並んでいる標識夕一ゲット物質を含む微小滴を、正確に滴下する方法として、好適である。

ここで、「インクジェットプリンティング法」は、インクジェットプリン夕一で用いられるノズルを応用する方法であって、電気を用いてインクジエツトプリンターのようにプリン夕一へッドから基板に検出用物質を噴射し、固定する方法である。この方法には、圧電式インクジェット法、バブルジエツト法、超音波ジェット法がある。圧電式インクジェット法は、圧電体にパルスを印加することによって生じる変位の圧力によって液滴を飛ばす方法である。バブルジェット法は、熱方式であって、ノズル中のヒータ一を熱して発生させた気泡の圧力によって液滴を飛ばす方式である。ノズル内にヒーターとなるシリコン基盤を埋め込み、約 3 0 0 °Cノ sで制御して一様な気泡を作成し、液滴を押し出す。しかしながら、高温に液体が曝されることになることから、生体物質試料には適さないと考えられる。超音波ジエツト法は、超音波ビームを液体の自由面に当てて、局所的に高い圧力を与えることによってその箇所から小滴を放出させる方式である。ノズルを必要とせず、高速で直径約 1 x mの小滴を形成できる。

本発明においては、「インクジェットプリンティング法」として、「圧電式インクジエツティン.グ法」を好適に採用できる。印加するパルスの形状を変えることによって、液滴（微小滴）のサィズを制御することができるので、解析精度向上に好適である。液滴表面の曲率半径が小さいときは液滴を小さくし、液滴の曲率半径が大きいときは液滴を大きくすることができる。また、パルスを急激に負の方向に変化させることにより液滴表面を内側に引っ張り、曲率半径を小さくすることも可能である。

「マイクロメカニカルスポッティング法」は、マイクロスポッティングペン、キヤピラリー（細管）、あるいはピンセットを装着させたプリントへッドを用いて、検出用物質を含む微小滴を基板上の検出表面部位にスポットしていく方法である。

次に、本発明では、以下の構成の「バイオアツセィ装置」を提供する。

まず、第 1 に提供されるバイオアツセィ装置は、光学的に記録情報の読み取りが可能とされた円盤状基板の表面に、検出用物質を固相化できる検出表面を備え、前記基板に上方視放射方向に延びるように設けられた溝構造内に前記検出表面が設けられ、位置情報と回転同期情報を提供するバイオアツセィ用基板を用いるバイオアツセィ装置であって、次の（ 1 ) 〜（ 4 ) の手段等を少なくとも備える。

( 1 ) 前記バイオアツセィ用基板を回転可能に保持する基板回転手段、（ 2 ) 前記基板回転手段によって、前記バイオアツセィ用基板を回転させながら検出用物質含有溶液並びに標識ターゲット物質含有溶液を前記検出表面部位に滴下する滴下装置、（ 3 ) 該滴下装置と前記バイオアツセィ用基板との間の距離を一定に保持するためのフォーカスサーボ機構、（ 4 ) 前記位置情報と回転同期情報に基づいて、前記溶液の滴下を前記検出表面部位に追従させるトラッキングサーボ機構。

このバイオアツセィ装置では、円盤状のバイオアツセィ用基板を、該基板の位置情報と回転同期情報に基づいて回転させながらフォーカスサーボ機構によって、滴下距離を高精度に一定に維持することにより、所定位置に設けられた検出表面部位の一定の領域に均一形状の微小滴を滴下でき、蛍光強度を再現性良く検出することができる。また、トラッキングサーボ機構によって、検出用物質含有溶液とターゲット物質含有溶液を、順次所定の溝構造内の検出表面部位に追従させて確実に滴下することができる。この結果、検出用物質と標識ターゲット物質の反応を高精度に行わせることができるとともに、解析シグナルが安定し、解析精度が向上する。

ここで、上記バイオアツセィ装置において好適に採用できる滴下装置は、ィンクジエツトプリンティング装置又はマイクロメカ二カルスポッテリング装置のいずれかである。なお、インクジェットプリンティング装置は、既述した「インクジェットプリンティング法」を実施できる装置であって、マイクロメカニカルスポッテリング装置は、既述した「マイクロメカニカルスポッティング法」を実施できる装置を意味する。なお、インクジェットプリンティング装置を採用する場合は、既述した理由により、圧電式インクジエツトプリンティング法を実施できる装置が好適である。

ここで、上記バイオアツセィ装置における滴下装置としてインクジェットプリンティング装置を採用した構成では、バイオアツセィ用基板に対向配置されており、フォーカスサ一ポ及びトラッキングサーポを担うレーザ一光を前記基板に出射する対物レンズを収容する支持体に、インクジェットノズルを一体化する。

この支持体一体型のインクジエツトノズル構成は、フォーカスサーポ及びトラッキングサ一ポと同期させながら、基板に対して所定溶液の滴下を行うことができ、かつ装置をコンパクト化できる。

次に本発明では、以下の構成の「基板記録情報の読み取り装置」を提供する。

本発明で提供する基板記録情報の読み取り装置は、まず、上記バイオアツセィ装置とュニット化されている点に特徴を有し、そして、バイオアツセィ用基板に対して、フォーカスサ一ポとトラッキングサーポをかけるとともに、ピックアップレンズ等によつて集光したレーザー光を、前記検出表面において前記検出用物質と結合したる蛍光標識ターゲット物質に照射し、励起されて発光する蛍光色素強度を検出するという構成を備える。

この手段では、基板表面に D NAプローブ等の検出用物質を固相化し、続いてターゲット物質を含むサンプル溶液を滴下（スポッティング）して前記各物質間の相互反応を行うことができるバィオアッセィ装置と該検出用物質と前記夕ーゲット物質の間の相互反応情報に関する読み取り装置が一体化されているので、ァッセィ作業とそれに続く読み取り作業を一連化することができる。

以上のように、本発明は、 D N Aチップやバイオセンサーチップに係わる新規技術を提供するという技術的意義を有している。図面の簡単な説明

第 1 図は、本発明に係る好適な実施形態であるバイオアツセィ用基板（ 1 ) を上方視した

ときの外観図

第 2図は、（A) 同基板（ 1 ) の構成を一部誇張して示す模式図、（B ) 同基板（ 1 ) に配設された溝構造（ 3 ) 部分の一実施形態の構成を表す部分拡大図

第 3図は、同基板（ 1 ) の変形例を上方視したときの外観図第 4図は、本発明に係るバイオアツセィ装置（ 1 0 ) の好適な実施形態の構成を簡略に表すブロック図

第 5図は、（A) ノズル（ 3 0 ) 周辺部分の外観斜視図、（ B ) ノズル（ 3 0 ) の拡大平面図

第 6図は、本発明に係る好適な実施形態であるバイオアツセィ用基板（ 1 ) を用いて実施できるバイオアツセィプロセスのフロ一図発明を実施するための最良の形態

以下、添付図面に基づき、本発明の好適な実施形態について説明する。第 1 図は、本発明に係る好適な実施形態であるバイオアッセィ用基板を上方視したときの外観図、第 2図（A ) は、同基板の構成を一部誇張して示す模式図、第 2図（B ) は、同基板に配設された溝構造部分の一実施形態の構成を表す部分拡大図である。

まず、第 1 図の符号 1 は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の好適な一実施形態を示している。このバイオアツセィ用基板 1 (以下、「基板 1」と略称）は、 C D、 D V D , M D等の光情報記録媒体に用いられる円盤基板（ディスク）に採用される基材から形成されている。

該基材は、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレンその他の円盤状に成形可能な合成樹脂、好ましくは射出成形可能な合成樹脂によって円盤状に形成されている。なお、安価な合成樹脂基板を用いることで、従来使用されていたガラスチップに比して低ランニングコストを実現できる。基板 1の中心には、後述する基板回転手段に設けられたスピンドルに固定するための孔 2が形成されている。

この基板 1 の一方の表面には、反射膜である厚さ 4 0 n m程度のアルミ蒸着層が形成されており、該層は反射膜として機能している。この反射膜は、屈折率 1 . 5以上の基盤単体からの表面反射 4 %以上とする。この反射膜の上層には、透明なガラスや透明樹脂等からなる光透過層が成膜されている。なお、基材が高反射率の材料である場合には、基材表面自体が反射面として機能するので前記反射膜は形成しなくてもかまわない。また、金属膜などの高反射率膜を形成すれば蛍光標識されたターゲット物質の蛍光強度を、感度良く検出することができる。

前記光透過層には、基板 1 の中心部から上方視放射状に延びる溝構造 3が所定間隔で凹設されている。各溝構造 3内には、検出用物質を固相化できるように表面処理された検出表面部位 S (第 2図参照）が、半径方向に所定間隔で配列されている。なお、検出表面部位 Sは、各溝構造内に配列されたピット部分に形成してもよく、各溝構造 3の内側壁面全体に亘つて形成することも可能である。

また、基板 1 の変形例を表す外観図である第 3図のように、セル状のピット 3 aに検出表面部位 S を設け、そしてこのピット 3 aを放射状方向に複数配列し、更に放射状に並んだピット 3 aの列を、周方向に複数形成した構成を採用することも可能である。溝構造 3、該溝構造 3内のピット又はセル状のピット 3 aの検出表面に対して微小滴を滴下することによって、ほぼ同一のスポットサイズを実現できるので、再現性の良い蛍光強度検出を実現できる。なお、第 3図中の符号 4 aは、アドレスピット等を表している。

前記検出表面部位 Sは、 D N Aプローブ等の所望の検出用物質を固相化するために好適な表面処理が適宜選択されて施されている。例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で表面処理される。合成樹脂製基板であれば、その表面をプラズマ処理及び D U V ( D e e p U V、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理する。

また、表面に銅、銀、アルミニウム又は金をスパッ夕して成膜し、その表層にアミノ基、チオール基、力ルポキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、ストレプトアビジン等をコートしてもよい。また、検出表面には、必要に応じて検出用物質を固相化するためのリンカ一を結合させておいてもよい。

基板 1 の回転方向には、予め光ディスクマスタリングプロセスにより形成された多数のアドレスピット 4， 4 · · · が形成されている。ここで、基板 1の位置情報及び回転同期情報について説明すると、基板 1 を光ディスクとして考えた場合、滴下検出位置である溝構造 3 をユーザーデ一夕領域と考え、他の領域は、サンプルサーポ方式等により同期ピットを配列し、かつトラッキングサーポとしても利用し、更に、直後にアドレス部（ディスク上の地理的な番地）を挿入することによって位置情報を与える。

アドレス部は、先頭パターンであるセクタ一マークから始まり実際に回転しているディスクの回転位相を与える V F O (Variable Frequency Oscillator) とアドレスデ一夕の開始位置を与えるァドレスマークとトラックとセクタのナンパ一が入つた I D (Ideniifer) などが組み合わされてなる。

なお、上記アドレスピットを用いる代わりにトラック上にゥォプリングを形成し、位置に応じたクロック情報を持たせるようにゥォブリングの蛇行を調節して、ディスク上の位置情報を取得してァドレッシングを行うようにしても良い。同時に、ゥォブリング周波数成分を利用することでトラッキングサ一ポを行うことが出来る。さらに、アドレスピッ卜とゥォブリングを併せて形成することにより、より高精度のアドレッシングおよびトラツキンダサ一ポが可能となる。

次に、第 4図に基づいて、上記基板 1 を用いる本発明に係るパィオアッセィ装置の好適な実施形態について説明する。なお、第 4図は、同装置の構成を簡略に表すブロック図である。

まず、第 4図に示されたバイオアツセィ装置 1 0は、上記構成の基板 1 を用いるバイオアツセィ装置であって、前記基板 1 を回転可能に保持する基板回転手段 5 と、この基板回転手段 5によつて、前記基板 1 を回転させながら検出用物質含有溶液 D並びに標識ターゲット物質含有溶液 τを検出表面部位 Sに、所定の順序、タイミングで滴下する滴下装置 6 と、該滴下装置 6 と前記バイオアツセィ用基板との間の距離を一定に保持するためのフォー力スサーボ機構 7 と、基板 1からの位置情報と回転同期情報に基づいて、前記溶液 D， Tの滴下を基板 1 の検出表

面部位 Sに追従させるトラッキングサ一ポ機構 8 を備えている。

ここで、バイオアツセィ装置 1 0は、励起光源である青色半導体レーザー 1 1 と、フォーカスサーボ機構 7 とトラッキングサ一ポ機構 8 を担う赤色半導体レーザ一 2 1 を備えている。

青色半導体レーザ一 1 1 は、基板 1 の反応情報読み取りのための励起光源として機能する。まず、この青色半導体レーザー 1 1 から出射されたレーザ一光 Bは、反射ミラー 1 2で直角に反射され、該反射光の進行方向に並設されたレンズ 1 3、 1 4によって平行光とされる。

この平行光は、反射ミラー 1 5で直角に反射された後、 λ Ζ 4 板 1 6 を通過して円偏光とされる。この円偏光は、凹レンズ 1 7，凸レンズ 1 8 によってビームが拡大された後にダイクロイツクミラー 1 9 により反射され、基板 1 に対向配置された対物レンズ 2 0 に入射される。なお、対物レンズ 2 0は支持体 Gに収容されている。

ダイクロイツクミラ一 1 9は、青色半導体レーザー 1 1から出射されたレーザ一光 Bを中心とする波長帯の光を反射し、それ以外の光を透過するように設計されている。より詳しくは、レーザ —光 Bを反射し、後述する、レーザ一光 Bによって励起された基板 1上の蛍光物質からの蛍光を透過するように設計されている。

このようにして、対物レンズ 2 0の下方位置に、基板回転手段 5 に保持された基板 1 に対し、前記対物レンズ 2 0から青色レーザ一光 Bを照射する。この青色レ一ザ一光 Bによって励起された (ターゲット物質に標識として結合されている）蛍光物質からの蛍光は、対物レンズ 2 0 を通過し、更にダイクロイツクミラー 1 9， 2 6を通過し、反射ミラ一 2 7 により直角に反射されて、光電子増倍管及びアバランシェフオトダイオード検出器（ディテクタ一） 2 8によって検出される。この構成によって、蛍光強度を検出する。なお、ダイクロイツクミラ一 2 6は、後述する赤色レ一ザ一光 Rの波長を中心とする波長帯の光を反射し、蛍光を含む他の光を透過するように設計されている。

次に、符号 2 1で示す赤色半導体レーザーから出射された赤色レーザー光 Rは、基板 1 と対物レンズ 2 0 との間の距離を一定に保つ役割を果たすフォーカシングのために利用される。

また、この赤色レーザー光 Rは、基板 1 のアドレスピット 4又は Z及びゥォブリングされたグループによって提供される位置情報及び回転同期情報に基づいて、上記対物レンズ 2 0が基板 1 に配設された溝構造 3 内の検出表面部位 S を追従するトラツキングサーポを行うために利用される。なお、符号 2 9は、赤色レ一ザ一光 Rの照射位置を調整するためのポジションセンサーディテク夕一（ P S D ) である。

具体的には、第 4図に示された赤色半導体レーザ一 2 1から出射されたレーザ一光 Rは、該レーザー光 Rの進行方向に並設された二枚のレンズ 2 2 , 2 3 によって平行光とされる。この平行光は、前方に配置された偏光ビームスプリッタ 2 4により分光され一方は更に λ Ζ 4板 2 5 を通過した後、ダイクロイツクミラー 2 6で直角に反射され、前記対物レンズ 2 0 に入射し、他方は P S D 2 9に導かれる。

このようにして、対物レンズ 2 0から出射される赤色レーザー光 Rを用いて、フォーカシンダサーポとトラッキングサ一ポを行いながら、基板 1 の所定の検出表面部位 Sの位置を正確に読み取つて、上記支持体 Gに対物レンズ 2 0 と一体化して設けられたィンクジェットノズル 3 0 (以下、単に「ノズル 3 0」と称する。）を介して、検出用物質含有溶液 D又は標識ターゲット物質含有溶液 Τを、検出表面部位 Sの真上に順次、所定タイミングで正確に滴下する。

次に、第 5図に基づいて、支持体 G内に対物レンズ 2 0 と一体化されたノズル 3 0の構成について詳説する。第 5 図（Α ) は、ノズル 3 0周辺部分の外観斜視図、同図（Β ) は、ノズル 3 0の拡大図である。

対物レンズ 2 0 を支持する矩形のァクチユエ一ターホルダー Ηの中央に、上記対物レンズ 2 0が設けられ、前記ホルダー Ηの対物レンズ 2 0 の後方側領域に、ノズル 3 0が設けられている。なお、このノズル 3 0は、複数設けてもよい。

また、ノズル 3 0は、圧電体に印加するパルスの形状を変えることで吐出される液滴の大きさを制御し易いという利点があるため、圧電式インクジェットノズルを採用するのが好ましい。なお、第 5図中の符号 Xで示す矢印は、基板 1の進行方向（回転方向）を示している。

ここで、ノズル 3 0には、ラジアル方向 Yに一列に並設されたノズル群 3 1が、矢印 X方向に沿つて複数列配設されている。このノズル群 3 1 は、同一の検出用物質含有溶液 Dを同時に滴下するためのノズル孔 3 2， 3 2 · · · の集合体である。ノズル群 3 1， 3 1 · · · からは、順次、異種の検出用物質含有溶液 Dが下方の基板 1 における溝構造 3 内の対応する検出表面部位 S に同時に滴下され、続いて、所定時間後に、異種又は同種の標識ターゲット物質含有溶液 Tが、同検出表面部位 Sに同時に滴下されるなお、検出用物質含有溶液 Dを検出表面部位 Sに滴下してからその上に標識夕一ゲット分子含有溶液を滴下させるまでの時間 Tは、次式にて算定できる。

T = [ L 0 + ( n - 1 ) L！ + 0 . 5 φ ] ÷ V _x - W / V ₂ なお、上記式において、 L。は、対物レンズ 2 0の中心と一列目のノズル群 3 1 aまでの距離、 L iはノズル群 3 1 の配置間隔、 φはプローブ D N Aの液滴の径、 V iは基板 1 の線速度、 Wはノズル 3 0 と基板 1 までの距離、 V ₂はノズル 3 0からの液滴速度、をそれぞれ表している。この式に従えば、検出用物質含有溶液の液滴の上に真上に、タ一ゲット物質含有溶液を滴下させることができる。

最後に、第 6図に基づいて、上記基板 1 を用いて実施できるバィオアッセィプロセスについて簡潔に説明する。なお、第 6 図 ( A ) 〜（E ) は、同基板 1 を用いて実施できるバイオアツセィプロセスのフロー図である。

まず、基板 1 の孔 2 を、基板回転手段 5 (第 4図参照）のスピンドル 5 1 (第 4図参照）に固定して回転させ、フォーカスサ一ポ機構 7又は Z及びトラッキングサーボ機構 8 により位置情報を検出しながら、基板 1 に対向配置されたノズル 3 0 (ノズル群 3 1 ) からインクジェットプリンティング法に基づき、検出用物質含有溶液 D _l D ₂ - · ' を基板 1上に設けられた所定の検出表面部位 S (第 2図参照）に滴下する（第 6図（A ) 参照）。

続いて、蛍光標識された夕一ゲット物質含有溶液 Tを、フォーカスサーボ機構 7又はノ及びトラッキングサーボ機構 8 (第 4図参照）により位置情報を検出しながら、基板 1 に対向配置されたノズル 3 0 (ノズル群 3 1 ) からインクジエツトプリンティング法により、上記検出表面部位 Sの上に滴下する（第 6図（B ) 参照）。

次に、基板 1 の検出表面部位 Sにおいて、検出用物質と標識夕 —ゲット物質との間のハイブリダィゼ一ションその他の相互結合反応を至適に行うために、基板 1 を恒温恒湿槽 9において数時間加温する（第 6図（ C ) 参照）。

続いて、再びスピンドル 5 1 によって基板 1 を回転させながら該基板 1 に対向配置された洗浄ノズル Nから所定の洗浄液 Uを滴下することによって、アクティブな結合反応を示さなかった標識ターゲット物質を検出表面部位 Sから除去する。洗浄液は、例えば、界面活性剤 S D Sを含む S a 1 i n e — S o d i u m C i t r a t e ( S S C ) バッファー溶液を用いる（第 6図（D ) 参照）。

基板 1 に青色レーザー光 Bを照射して各検出表面部位 S を励起させ、蛍光強度の大きさを検出器 2 8 によって検出し、検出用物質と標識ターゲット物質の間の結合反応の状況を判断する。最後に、各検出表面部位 Sに対する蛍光強度を、 A/D変換して結合反応割合をコンピュータ Cの画面に分布表示することによつて、視覚化する（第 6図（E) 参照）。

実施例

直径 1 2 c mの石英ガラス基板を使用した。該基板の表面を、半径 2 0 mmから 4 0 mmまで、トラックピッチ 5 0 m > D u t y 7 0 %、溝深さ 5 0 0 n mのグループをエッチングして形成した。また、基板表面は、シランカップリング剤（日本ュニチカ： A l l 0 0 ) のエタノール溶液 0. 3 w t %を用いて、スピンコ —トにより処理した。その後 1 0 0 °Cで 2時間、ベーク炉にて乾燥させた。

更に、フォトピオチン； p h o t o b i o t i n ( S i g m a -A 1 d r i c h ： N - ( 4 - a z i d o - 2 - n i t r o p h e n y 1 ) - N， - ( 3 — b i o t i n y 1 a m i n o p r o p y 1 ) -N ' -m e t h y 1 - 1 , 3 -p r o p a n y d i a m i n e ( a c e t a t e ) を、 1 0 g /mL濃度になるように蒸留水に溶解し、前記シラン処理を施した基板表面にスピンコートした。

波長 6 8 O n mの赤外半導体レーザーを用いて、 N A 0. 4 5 のピックアップレンズで集光し、基板へフォーカスサーボ及びトラキングサーポをかけた。基板とレンズとの間の距離を一定に保つて、線速 1 m Z秒で、グループに追従させながら、フォトピオチン（ p h o t o b i o t i n ) を青色半導体レーザ一、波長 4 0 5 n m、 1 mW, 1 0 k H zで変調し、対物レンズ NA 0. 4 5 にて露光を行った。その後、蒸留水にて洗浄し、露光されたェリアのみフォトピオチン（ p h o t o b i o t i n ) パターンが形成され、ネガ型リソグラフィを得た。

アビジン： A v i d i n (V e c t o r L a b ： A v i d i n D ) 2 5 g /m 1 . P B S溶液を、インクジェットノズルから吐出し、上記フォトビォチンパターンの上に半径 r = 2 0 — 3 0 までをトラッキングサーポ及びフォーカスサーポをかけながら滴下を行った。

次に S S O ^ g /m l のアビジン（A v i d i n ) D . P B S 溶液を、半径 r = 3 0 — 4 0 に滴下した。その後、 p h o s p h a t e b u f f e r s o l u t i o n ( S u g m a : 1 0 0 3 ) 溶液にてスピンコート洗浄を行った。

再度波長 6 8 0 n mの赤外半導体レーザ一を用いて、基板にトラッキングサーボ及びフォーカスサ一ポをかけ、グループに追従させながら、更に青色半導体レーザーによって、出力 1 0 0 W、ビーム径 2 mmのレ一ザ一光を出射し、上記 N A O . 4 5の対物レンズを用いて、線速 5 m Z秒にて、蛍光強度を読み取った。検出器は、光電子増倍管（浜松ホトニクス： H 5 7 8 4 - 0 1 ) を使用した。読み取りに要した時間は r = 2 0 — 3 0で約 6. 3 秒、 r = 2 0 — 4 0で約 8 . 8秒であった。これにより、従来の読み取り装置に比べて非常に短時間で読み取ることができることが判明した。

また蛍光強度比は、濃度 2 5 g /m l のものは平均 1 2 0 m V， 2 5 0 g /m 1 のものは、平均 6 0 O mVという値が得られ、強度比 1 / 5 という値が得られた。また、どちらも強度ばらつきは、 σで 1 mVと非常に精度の高い結果が得られた。

( 1 ) 本発明に係るバイオアツセィ用基板は、上方視放射状に配設された溝構造内に検出表面部位が配列された構成を備えているので、多量 · 多数の検出用物質を集積することができる。また、複数の検出用物質をグルーピングして配列させて、溝構造毎に至適反応条件等を選択してアツセィを行うことができるので、偽陽性、偽陰性の結果の発生率が格段に減少する。従って、前記バイオアツセィ用基板によれば、網羅的かつ効率的で、しかも高精度な解析を行うことができる。また、記録情報当りのコストも安価である。

( 2 ) 本発明に係るバイオアツセィ用基板は、 D N Aチップやバイオセンサーチップとして、特に有用である。また、新規構造を備える円盤状のマイクロチャネルアレイを提供できる。本基板を D N Aチップとして利用する場合は、遺伝子の変異解析、 S N P s (一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用でき、創薬、臨床診断、薬理ジエノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用できる。本基板をバイオセンサ一チップとして利用する場合は、抗原坊体反応の検査、内分泌攪乱物質の検定等に利用できる。

( 3 ) 次に、本発明に係るバイオアツセィ装置は、基板上での検出用物質のスポッティング及び固相化作業、続く標識ターゲット物質のスポッティング及び反応、洗浄、反応結果の読み取り及び解析を一連の作業で円滑に行うことができるので、アツセィから解析に至る作業が効率化、迅速化し、大変便利である。

( 4 ) 本発明に係る前記アツセィ装置とュニット化された基板情報の読み取り装置を用いて、基板にファーカスサ一ポ及び又はトラッキングサーポをかけながら、一定量周期的に基板に検出用物質含有溶液を滴下し、続いて D N Aプローブ、抗体等の検出用物質を所定の検出表面に固相化し、更に、蛍光物質が標識された c D N A、抗原等のターゲット物質を，再度上記サーポをかけながら検出表面部位に滴下し、続いて、所定の相互反応促進プロセスを行い、所定条件下で洗浄し、最後にレーザ一光により蛍光物質を励起させて、蛍光発行量を検出して情報を読み取るという複雑な作業を、一連で行うことができる。

Claims

請求の範囲

1 . 光学的に記録情報の読み取りが可能とされた円盤状基板の表面に検出用物質を固相化できる検出表面を備え、

前記検出表面は、前記基板の表面に上方視放射方向に延びるように設けられた溝構造内に設けられたことを特徴とするバイオアツセィ用基板。

2 . 前記検出表面部位の位置情報と回転同期情報を提供する手段を備えることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のバイオアッセィ用基板。

3 . 前記手段は、前記基板上に設けられたゥォプリングまたはアドレスピットによることを特徴とする請求の範囲第 2項記載のバイオアツセィ用基板。

4 . 前記検出用物質は、ヌクレオチド鎖、ペプチド、タンパク質、脂質、低分子化合物、リボソームその他の生体物質のいずれかがであることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のバイオアッセィ用基板。

5 . 光学的に記録情報の読み取りが可能とされた円盤状基板の表面に、検出用物質を固相化できる検出表面を備え、前記基板に上方視放射方向に延びるように形成された溝構造内に該検出表面が設けられた構成のバイオアツセィ用基板に対して、

インクジエツトプリンティング法又はマイクロメカ二カルスポッティング法によって、前記検出表面部位に検出用物質含有溶液を滴下して前記検出用物質を固相化することを特徴とするバィオアッセィ方法。

6 . 光学的に記録情報の読み取りが可能とされた円盤状基板の表面に、検出用物質を固相化できる検出表面を備え、前記検出表面が前記基板表面に上方視放射方向に延びるように設けられた溝構造内に設けられ、位置情報と回転同期情報を提供するバイオアツセィ用基板を用いるバイオアツセィ装置であって、

前記バイオアツセィ用基板を回転可能に保持する基板回転手段と、

前記基板回転手段によって、前記バイオアツセィ用基板を回転させながら検出用物質含有溶液並びに標識ターゲット物質含有溶液を前記検出表面部位に滴下する滴下装置と、

該滴下装置と前記バイオアツセィ用基板との間の距離を一定に保持するためのフォーカスサーボ機構と、

前記位置情報と回転同期情報に基づいて、前記溶液の滴下を前記検出表面部位に追従させるトラッキングサ一ポ機構と、

を少なくとも備えることを特徴とするバイオアツセィ装置。

7 . 前記滴下装置は、インクジェットプリンティング装置又はマイクロメカニカルスポッテリング装置のいずれか一つから選択されることを特徴とする請求の範囲第 6項記載のバイオアツセィ装置。

8 . 前記滴下装置はインクジエツトプリンティング装置であつて、

前記バイオアツセィ用基板に対向配置され、フォーカスサ一ポ及びトラッキングサーポを担うレーザー光を前記基板に出射する対物レンズを収容する支持体に、インクジエツトノズルが一体化されていることを特徴とする請求の範囲第 6項記載のバイオアツセィ装置。

9 . 請求の範囲第 6項記載のバイオアツセィ装置とュニット化された、前記オアッセィ用基板上の記録情報を読み取る装置であつて、

前記バイオアツセィ用基板に対して、フォーカスサーポとトラッキングサ一ポをかけるとともに、集光したレ一ザ一光を、前記検出表面において前記検出用物質と結合したる蛍光標識ターゲット物質に照射し、励起されて発光する蛍光色素強度を検出することを特徴とする基板記録情報の読み取り装置。