WO2003074710A1

WO2003074710A1 - Polynucléotides, polypeptides et leur procédé de production

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Publication number: WO2003074710A1
Application number: PCT/JP2002/001978
Authority: WO
Inventors: Eiji Ichishima; Byung Rho Lee; Kenichi Hirano; Keiichi Ando
Original assignee: Amano Enzyme Inc.
Priority date: 2002-03-04
Filing date: 2002-03-04
Publication date: 2003-09-12
Also published as: JPWO2003074710A1; JP4347062B2

Description

明細書ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドの製造方法技術分野

本発明は、新規なプロテアーゼの遺伝子機能を有するポリヌクレオチド、かかるプ口テアーゼ活性を有するポリペプチド、及ぴかかるプロテアーゼ活性を有するポリぺプチドの製造方法に関する。背景技術

従来、ぺプチド中の塩基性アミノ酸残基に作用し、そのぺプチド結合を加水分解するプロテア一ゼには、アルギニン残基、リジン残基の双方に作用する動物由来のトリプシンが知られており、そのプロテアーゼとしての作用が食品分野での蛋白質分解物の製造、工業分野での皮革製造、生絹の処理等に利用されている他、その血液凝固、血圧低下、抗炎症作用は医療分野で利用されている。またアルギニン残基、リジン残基の双方に作用する微生物由来のトリプシン様のプロテアーゼも知られている（特開 2000- 1163 77 号）。

しかし、上記のアルギニン残基、リジン残基の双方に作用するプロテアーゼでは基質特異性が広く、蛋白質に作用させると該蛋白質の低分子化を生じ、蛋白質が本来有している乳化性、保水性等の機能性が消失すると言う問題があった。かかる事情から、食品業界においては、ハム、ソーセージや水産練り製品、低アレルゲン性の卵製品や豆腐等の製造用途に供される大豆蛋白、小麦蛋白、卵蛋白等の分解物の乳化性、保水性、溶解性、分散性等の機能性を選択的に調節し、当該機能性の多様化を図ることができるプ口テアーゼ、即ち蛋白質を極めて限定的に分解して蛋白質の機能性の改善ができる基質特異性の狭いプロテア一ゼの開発が要望されている。

—方、例えばアルギニン残基に特異的に作用するプロテアーゼとして、人、猿、ノヽムスター等の動物細胞中に存在するプロテアーゼ（プロプロテイン'コンバターゼ）が知られてレヽる力 ^s (Handbook of Proteolyti c Enzyme, Academic Press, 1998, p349— 36 8) 、動物由来のプロテアーゼには、動物臓器の供給 ftに制限があると共に狂牛病等のプリオン病の懸念もあるため、量産性のある微生物に由来する新規なプロテア一ゼの開発が強く要望されている。発明の開示

本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、プロテアーゼとしての基質特異性が狭く、量産性のある微生物に由来する新規なポリべプチド、このポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、及びプロテアーゼ活性を有するポリぺプチドの製造方法を提供することを課題とする。そこで本発明者らは、上記課題を解決すベく鋭意検討した結果、ァスペルギルス（ Aspergi l lus) 属由来の菌株が新規なプロテアーゼを生産することを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、第 1に、配列番号 1に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。又、配列番号 1に示す塩基配列又はこれと相補的な塩基配列を有する D N Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、プロテアーゼ遺伝子、好ましくはセリンプロテアーゼ遺伝子もしくはシスティンプロテアーゼ遺伝子として機能するポリヌクレオチドをも提供する。

上記において「ポリヌクレオチド」とは 1本鎖又は 2本鎖の DNA及び/又は RNA を言う。「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする」とは、公知の適宜なハイブリダィゼーシヨン法において、以下の条件下で一方のポリヌクレオチド（DNA ) 又は該ポリヌクレオチドの断片に対して他方のポリヌクレオチド（DNA ) がハイブリダイズできることを言う。即ち、フィルターに固定化された一方のポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの断片に対し、 0. 7〜 1M の NaClの存在下、所定温度（X ° C ) 下で他方のポリヌクレオチドのハイプリダイゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2 倍程度の SSC 溶液（1 倍濃度の SSC 溶液の組成は、 150mM塩化ナトリゥム、 15mMクェン酸ナトリウムよりなる）を用いて X ° Cの条件下でフィルターを洗浄した場合に、他方のポリヌクレォチドを同定できることを言う。そして「X ° C」とは、少なくとも 50° C以上であり、より好ましくは 60° C以上であり、更に好ましくは 65° C以上である。

本発明は、第 2に、配列番号 1に示すァミノ酸配列を有するポリぺプチドを提供する。又、配列番号 1に示すアミノ酸配列を有するポリぺプチドにおいて 5個以下の任意のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、プロテアーゼ活性を示すポリぺプチドをも提供する。更に、上記各種のポリヌクレオチドによりコードされるポリぺプチドをも提供する。

本発明は、第 3に、ァスペルギルス（Aspergi llus ) 属に属する菌株を栄養培地に培養し、培地中に上記各種のプロテア一ゼ活性を有するポリペプチドを生成蓄積させ、これを精製採取するポリぺプチドの製造方法を提供する。前記菌株としてはァスペルギルス 'ォリゼ一（Aspergi llus oryzae) 種に属する菌株が特に好ましく、ァスペルギルス .オリゼ一 IAM2609株がとりわけ好ましい。図面の簡単な説明

第 1図は本発明に係るプロテアーゼの SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。第 2図は本発明に係るプロテアーゼの p H特性を示す図である。第 3図は本発明に係るプロテアーゼの p H安定性を示す図である。第 4図は本発明に係るプロテアーゼの温度安定性を示す図である。発明の実施形態

先ず、本発明のポリペプチド（プロテアーゼ）の製造法について説明する。本発明のポリペプチド（以下「本酵素」ともいう。）は、ァスペルギルス属に属する菌株を栄養培地で培養し、培地中に本酵素を生成蓄積させ、これを精製採取して得ることができる。ァスペルギルス属に属する菌株としては、本酵素生産能を有するものであればいかなる菌株でも使用することができ、これらの菌株の変異株も使用することができる。好ましい菌株としては、ァスペルギルス 'オリゼ一種に属する菌株及ぴこれらの菌株の変異株が挙げられる。本酵素生産能を有する菌株の具体例としては、例えば、ァスペルギルス 'ォリゼ一 IAM2609 (寄託番号 FERM BP- 7913 として 2002年 2 月 25日に経済産業省 ·工業技術院 ·生命工学工業技術研究所 ·特許微生物寄託センタ一へ国際寄託）菌株が挙げられる。本菌株の菌学的性質は次の通りである。

1 . 形態分生子頭：放射状。

分生子柄：粗面、 1300〜2000 X 5 〜10 /^ 111。

頂のう：フラスコ形、直径 11〜22 Ζ ΙΠ、上部 1/2〜3/4 よりフィアラィドあるいはメトレを形成。

フィアライド：アンプル形、 9 〜18 Χ 4 〜5 μ m。

メトレ：形成する場合メトレ先端にフィアラィドを形成、 6 - 12 X 4 〜6 μ m。分生子：球状〜亜球状、滑面〜不規則な粗面（光学顕微鏡下）、裂片状〜編目状（走査型電子顕微鏡下）、 4 〜8 X 4 〜6 μ πι。

2 . 生育状態

マルトエキス寒天平板培地：黄色がかった灰色〜灰緑色の表面色調である。裏面は黄色がかった灰色である。

ッァペックィ一ストエキス寒天平板培地：黄色がかった灰色〜白色の表面色調である。裏面は黄色がかった灰色である。

本菌株は、その集落の色調及び組織、分生子形状構造、分生子の形状及び表面構造等から、ァスペルギルス ·ォリゼ一種に分類され、ァスペルギルス ·オリゼー ΙΑΜ260 9菌株として、東京大学分子細胞生物学研究所 ΙΑΜカルチャーコレクションにおいて分譲可能なように保存され、何人も容易に入手することができる。

次に、ァスペルギルス属菌の培養法しては、液体培養法、固体培養法のいずれも使用することができる。固体培養法の場合、培地としては、通常は小麦ふすま培地が用いられ、水を小麦ふすま 100 重量部に対して 40〜200 重量部、好ましくは 60〜120 重量部の割合で添加する。必要ならば、その際の培地添加物として黄粉、大豆粉等の有機窒素源或いは硫酸アンモ-ゥム、硝酸アンモニゥム等の無機窒素源を添加することができる。培養条件としては、 20〜40°C、好ましくは 25〜37°Cで、 24〜120 時間培養を行い、培養後得られたふすま麹より水又は PH5 〜8 の緩衝液を用いて抽出し、遠心分離、ろ過等により、本酵素（プロテアーゼ）を含む抽出液（以下「粗酵素液」ともいう。）を得る。

液体培養法の場合、培地としては、当該菌株が良好に生育し、本酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩類、必要な栄養源等を含有する合成培地または天然培地があげられる。例えば、炭素源としては、澱粉またはその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及び a—澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロぺクチン、アミロース等があげられる。

窒素源としては、ポリぺプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティ一プリカ一又は大豆もしくは大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム等の無機塩窒素化合物、グルタミン酸等のァミノ酸類が挙げられる。

そして、無機塩類としては、リン酸 1カリウム、リン酸 2力リゥム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリゥム等のナトリウム塩等が用いられる。

培養は振盪培養、通気撹袢培養等の好気的条件下で培地を Ρ Η 4〜10、好ましくは ρΗ5〜8 に調製し、 20〜40°C、好ましくは 25〜37°Cで、 24〜96時間培養する。培養後菌体を遠心分離、ろ過等により除去し、粗酵素液を得る。

次に、上記の固体培養法及び液体培養法により得られた粗酵素液からの本酵素の精製には、酵素の精製に用いられる通常の方法、即ち、硫安塩析法、アルコール分画法、各種ク口マトグラフィー（イオン交換樹脂、疎水クロマト用樹脂、ァフィ二テイクロマト用樹脂、ゲルろ過用樹脂等によるクロマ 1、グラフィー)等による精製法を適宜組み合わせて用いることができ、該精製法により高純度の本酵素を得ることができる。

更に、本酵素は、該酵素を夾雑物として含む市販の酵素製剤から上記精製法により得ることができる。市販の酵素剤としては、ァスペルギルス 'ォリゼ一種の微生物から製造されたプロテアーゼ「アマ'ノ j A (天野ェンザィム株式会社製）、プロテアーゼ「ァマノ」 M (天野ェンザィム株式会社製）等を用いることができる。該市販の酵素製剤からの本酵素の精製は、該市販の酵素製剤を _PH4〜_PH7 の緩衝液に溶解後、酵素の精製に用いられる通常の方法、即ち、硫安塩析法、アルコール分画法、各種クロマトグラフィ一（イオン交換樹脂、疎水クロマト用樹脂、ァフイエテイクロマト用樹脂、ゲル濾過用樹脂等によるクロマトグラフィー）による精製法等を適宜組み合わせることにより行うことができ、これにより高純度の本酵素を得ることができる。実施例

〔実施例 1 ：ァスペルギルス ·オリゼー IAM2609による本酵素の培養〕

ポテトデキストロース寒天培地（極東製薬製）に 30 ；、 5 日間培養したァスペルギルス ·オリゼー IAM260⁹を、滅菌した 8 gの小麦ふすま懸濁液 lOOmL (pH5. 6 ) を入れた培養フラスコに接種し、 30°C、 40時間、 140rpmの条件下振盪培養し、種培養とした。

これを小麦ふすま 1000g に 900mL (900g) の水を散水し、殺菌した培地に全量接種し、 30°Cにて 68時間、静置培養して本酵素を産生させた。培養後、水 4200mLを加え、産生した酵素を抽出し、粗酵素液 3000mLを得た。

〔実施例 2 (実施例 1の粗酵素液からの本酵素の精製〕

実施例 1で得た粗酵素液を分画分子量 6000の限外ろ過膜で 300mL まで濃縮し、冷ェタノール 1200mLを添加し粗酵素沈殿物を得た。該粗酵素沈殿物を遠心分離により分取後真空乾燥し、 60g の粗酵素粉末を得た。この粗酵素粉末の本酵素活性はキログラム当たり 19. lnkatであった。得られた粗酵素粉末 60g を緩衝液（ 10mmol/Lのクェン酸緩衝液、 PH5. 0 ) 200mL に溶解後、硫酸アンモニゥム分画（50%飽和）を行った。沈殿物を 4 °C、 6000 X g の条件で 30分間遠心分離を行い、上清をフエニールトヨパール 650MM (東ソ一株式会社製）に添力□し、吸着した蛋白を硫酸アンモニゥム濃度 1. 4 モル〜 0 モルのリニアグラジェントで溶出した。溶出した酵素活性画分を回収し、アルギニン一セファロース 4B (アマジャム ' フアルマシア社製) に添加し、 0. 1 モル〜 0. 3 モルの食塩濃度でリ二アグラジェント溶出を行い、酵素活性画分を回収した。この酵素溶液を U F膜（ミリポア社製）で濃縮を行い、次いでスーパー口一ス 6 (アマジャム 'フアルマシアバイオテク社製）に添加し、活性画分を回収し精製酵素液（以下「本酵素液」ともいう。）を得た。精製酵素の活性は 28. 8 (mkat/kg 蛋白質）であった。収率は 0. 9 %であり、純度は 510 倍に増加した。

酵素活性測定法 ( Z—アルギニル一アルギ-ン M C A法)

50mmol/L濃度のクェン酸緩衝液（pH4. 0 ) 0. 945mL に 0. 0⁵mLの酵素液を加え、 30°C で 10分間加温する。これに 10mraol/l濃度の Z—アルギニル一アルギ-ン MCA (Z-アルギ二ルーアルギニンと 7 -ァミノ- 4- メチルクマリンとの脱水縮合体）溶液を 0. 005mL 添加し酵素反応を開始する。蛍光光度計を用いて、本酵素による加水分解により遊離される 7 -ァミノ- 4- メチルクマリン（以下、「 AMC j とレヽう。）量を励起波長 360nm 、蛍光波長 440nm で蛍光強度の増加を経時的に測定する。上記反応条件下、 1秒間あたり 1モルの AMC を遊離させる本酵素量を lkatal (kat ) とした。

〔実施例 3 ：市販酵素剤からの本酵素の精製〕

市販酵素剤のプロテアーゼ M 「ァマノ」（天野ェンザィム株式会社製） 20g を緩衝液（10誦 ol/lのクェン酸緩衝液、 pH5. 0 ) 200mL に溶解後、硫酸アンモニゥム分画（5 0%飽和）を行った。沈殿物を 4 °C、 6000 X g の条件で 30分間遠心分離を行い、上清をフヱニールトヨパール 650M (東ソ一株式会社製）に添加し、吸着した蛋白を硫酸アンモユウム濃度 1. 4 モル〜 0 モルのリニアグラジェントで溶出した。溶出した酵素活性画分を回収し、アルギニン一セファロース 4B (アマジャム ' フアルマシア社製）に添加し、 0. 1 モル〜 0. 3 モルの食塩濃度でリニアグラジェント溶出を行い、酵素活性画分を回収した。この酵素溶液を UF膜（ミリポア社製）で濃縮を行い、次いでスーパ一ロース 6 (ァマジャム ·フアルマシア社製）に添加し、活性画分を回収し本酵素液を得た。本酵素の活性は 29. 8 (mkat/kg 蛋白質）であった。収率は 0. 4 %であり、純度は 106 倍に増加した。本酵素は糖鎖が結合した糖蛋白質であるので、糖鎖を N—グリカナ一ゼ（ロシュ- ダイァグノスティックス製）で分解した後に、蛋白質部分のみを SDS -ポリアクリルァミドゲル電気泳動を行った結果、図 1の（3 ) のように、単一なバンドであり、分子量は 61300 であった。

〔実施例 4 ：本酵素の理化学的性質〕

( 1 ) 作用，基質特異性

表 1に示したぺプチド研究所製の各合成基質を用いて、実施例 3で得られた本酵素の基質特異性を測定した。即ち、 50mm01/L (_PH4. 0 、クェン酸緩衝液） 0. 945mL と本酵素液 0. 05mLを混合後、 lOmmol/じ濃度の各合成基質液（50mraol/L、 pH4. 0 、クェン酸緩衝液）を 0. 005mL 添加し、酵素反応を開始する。蛍光光度計を用いて、本酵素による加水分解により遊離される AMC 量を励起波長 360nm 、蛍光波長 440nm で蛍光強度の増加を経時的に測定し活性を算出した。 Z -アルギニル一アルギニン MCA に対する活性を 100 %として、相対値で表した。その結果、表 1に示すように、本酵素は MCA に隣接するァミノ酸残基（以下「 P1アミノ酸残基」という。）のうちで、ペプチド結合を 1個有するぺプチドである Arg - MCA 、 Lys-MCA 、 Leu - MCA 、 Phe-MCA 、 Ala - MCA 、 Met - MCA 、 Pyr-MCA の各 PIァミノ酸残基には作用しなかった。

また、ぺプチド結合を 2個以上有するぺプチドのうち、 P1ァミノ酸残基が酸性ァミノ酸のァスパラギン酸残基である Ac-Tyr- Val- Ala- Asp- MCA、 Ac- Asp-Glu - Val- Asp - MCA、グルタミン酸残基である Z - Leu- Leu - Glu - MCA 、P1ァミノ酸残基が中性ァミノ酸のグリシン残基である Z- Leu- Arg- Gly- Gly - MCA 、チロシン残基である Sue- Leu- Leu- Val- Tyr-MCA

、ロイシン残基である Z-Leu - Leu - Leu- MCA 、フェニールァラニン残基である Sue-Ala- Ala- Pro - Phe - MCA 、ァラニン残基である Sue - Ala-Pro- Ala- MCA 、 Sue - Ala- Al a-Al a-MCA にも本酵素は作用しなかった。

さらに、ぺプチド結合を 2個以上有するぺプチドのうち、 P1ァミノ酸残基が塩基性ァミノ酸のプロリン残基である Gly-Pro - MCA 、 Sue - Gly- Pro- Leu- Gly- Pro- MCA 、トリプトフアン残基である Sue- lie - l ie- Trp- MCA に本酵素は作用を示さなかった。また、塩基性アミノ酸残基がリジン残基である Boc- Glu - Lys- Lys-MCA については、本酵素は、僅かな相対活性で作用を示したものの、 Boc- Val- Leu-Lys- MCA については、作用を示さなかつた。

一方、ぺプチド結合を 2個以上有するぺプチドのうち、 P1ァミノ酸残基が塩基性ァミノ酸のアルギニン残基である Boc- Leu- Arg- Arg- MCA 、 Z- Arg - Arg- MCA 、 Boc-Gly - Arg - Arg - MCA 、 Boc - Gin - Arg - Arg - MCA 、 Pyr - Gly - Arg - MCA 、 Boc - Gly -し ys - Arg - MCA 、 Boc - Leu-Lys-Arg-MCA 、 Boc - Gin - Gly - Arg - MCA 、 Boc Leu - Gly- Arg - MCA 、 Boc - li e - Glu - Gly - Arg - MCA 、 Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA 、 Boc - Leu - Thr - Arg - MCA 、 Z - Phe - Arg - MCA 、 Bo c - Ala - Gly - Pro - Arg - MCA 、 Boc - Val - Pro - Arg - MCA 、 Boc - Asp (OBzl) - Pro- Arg - MCA 、 Boc -Phe-Ser-Arg-MCA 、 Boc-Glu- (OBzl) - Ala- Arg- MCAについては、本酵素は幅広い相対活性で作用し、該アルギニン残基のカルボキシル基側のぺプチド結合を加水分解した。

以上のように、本酵素は、ぺプチド結合を 2個以上有するぺプチドであって P1ァミノ酸残基が塩基性アミノ酸のアルギニン残基であるぺプチドに対し作用し、ぺプチド結合を 1個有するぺプチドには作用せず、またべプチド結合を 2個以上有するぺプチドであって P 1ァミノ酸残基が中性、酸性及びアルギニン以外の塩基性ァミノ酸残基であるぺプチドに対しては、リジン残基に対して僅かに作用したことを除き、ァスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、チロシン、ァラニン、プロリン、ロイシン、フエ-一ルァラニン、トリブトファンの各アミノ酸残基を切断しないことから、アルギユンに対して極めて高い加水分解特異性を有していることが明らかになった。

【表 1】合に紂る特異 1¾

一 9—

差替え用銑（規則 26) 表 1中の用語について、以下に説明する。

MCA ： 4-メチルクマリンアミド（4 -メチル- 7- ァミノクマリンとの脱水縮合体） Boc ： t -ブチロキシカルボ二ノレ

Z ：ベンジルォキシカルボニル

Pyr ：ピログノレタミノレ

OBzl ：ベンジルォキシ

Ac ：ァセチノレ

Sue ：サクシニノレ

( 2 ) 至適 pH

pH2 〜4 の 50mmol/L クェン酸緩衝液、 pH5 の 50mmol/L 酢酸緩衝液、 pH6 〜8 の 50mmol/L リン酸緩衝液、 pH9 〜10の 50ramol/L トリス緩衝液のそれぞれ 0. 945mL に本酵素液の 0. 05mLを混合後、 10画 ol/L 濃度の各合成基質液（50mmol /し、 pH4. 0 、クェン酸緩衝液）を 0. 005mL 添加し、酵素反応を開始する。蛍光光度計を用いて、本酵素による加水分解により遊離される AMC 量を励起波長 360nm 、蛍光波長 440nm で蛍光強度の増加を経時的に測定し活性を算出した。最も活性の高い所を 100 %として、各 pHで相対活性を算出し至適 pHを求めた。図 2に示すように、至適 pHは pH4 を中心に存在していることから、該至適 pHを約 4とした。

( 3 ) pH安定性

pH2 〜4 の 10mraol/L クェン酸緩衝液、 pH5 の 10mmol/L 酢酸緩衝液、 pH6 〜8 の l Ommol/L リン酸緩衝液、 pH9 の 10mmol/L トリス緩衝液に溶解した本酵素液を 30°C に 30分間放置後、 pHを 4. 0 にし酵素活性を測定した。その結果、図 3に示すように pH 3〜 6の範囲で元の活性の 90 %以上を維持していた。従って、本酵素は少なくとも pH 3〜 6の範囲で安定である。

( 4 ) 温度安定性

pH 4の 50mmol/L クェン酸緩衝液に溶解した本酵素液を 10~ 70°Cに 10分間放置した後、酵素活性を測定した。その結果、図 4に示すように、 40°C以下の温度において元の活性の 70%以上を維持していた。従って、本酵素は 40°C以下で安定である。 ( 5 ) 阻害剤

阻害剤として、シグマアルドリツチジャパン株式会社製のセリンブ口テアーゼ阻害剤であるフエユールメタンスルホニルフルオラィド、 0-フエナンスロリン、ロイぺプチン、アンチパイン、システィンプロテアーゼ阻害剤,である P-クロロマーキュリー安息香酸、 N-ェチルマレイミド、ロイぺプチン、アンチパイン及び金属プロテアーゼ阻害剤であるエチレンジァミン四酢酸を用いて検討を行った。なお、阻害剤の澳度は表 2に示した各漉度の条件下で行った。 30でで 30分間放置後に酵素活性を測定した。その結果、表 2に示すように、ロイぺプチン及びアンチパインにより、酵素活性が阻害されたことから、本酵素はセリンプロテア一ゼ又はシスティンプロテアーゼと示唆された。

【表 2】

( 6 ) 分子せ

SDS-ポリアクリルアミドゲル黧気泳動は Laemral i の方法準じて行った。標準蛋白赏（括弧内に分子惫を示す。）としては、 -ユーィングランドバイオラボ社製のマルト —スバイレディングプロテインヒユースドベータ一ガラクトシダーゼ（158000) 、ベーターガラクトシダーゼ（116000) 、ホスフォリラ一ゼ b ( 97200) 、牛血清アルブミン ( 66400) 、グルタミン酸脱水素酵素 ( 55600) 、マルト一スバインディングプロティン（ 42700) 、乳酸脱水素酵素 ( 36500) 、トリオ一スホスフヱ一トイソメラ一ゼ（ 26600) を使用し、ゲル染色は、 Coomassie Gri ll iant Blue R-250 (フアルマシア LKB 一 11一

差替え用銑（規則 6) 製）を用いた CBB 染色で行った。電気泳動図を図 1に示した。その結果、本酵素は図 1 の（2 ) に示したように、約 70000 から 100000の広い分子量を示していた。本酵素は糖鎖が結合した糖蛋白質であるので、糖鎖を N-ダリカナーゼ（ロシュ · 'ダイァグノスティックス社製）で分解した後に蛋白質部分のみを、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、図 1の（ 3 ) に示したように、単一なバンドであり、分子量は 61300 であった。

〔実施例 5 ：本酵素のゲノム DM 取得〕

1 ) 部分ァミノ酸配列決定

アミノ酸配列の決定は島津製作所（SHIMADZU) のプロテインシークェンサ一 PPSQ- 23 を用いた。本酵素の N 末端配列は GLN (T) VTNTDQLITPEXIRALYKIPSAXAAPであった。内部配列はピリジルェチル化した本酵素をリジルェンドぺプチダーゼ処理により断片化した後、本酵素のペプチド断片を HPLCにより分離し、配列を決めた。内部配列は XHNPP YPYYXGAXNL であった。 X は特定されなかったアミノ酸を示す。

2 ) プローブ作製

N末端配列の中 NTDQLITP の配列をベースにセンスプライマー ao- N (5' - AAYACIG AYCARYTIATHACNCC-3' ) を作製した。また、内部配列 NPPYPYYをベースにアンチセンスプライマー ao- C1 (5' - RTARTAIGGRTAIGGNGGRTT - 3' )を作製した。（ここで Y は TC, I はイノシン酸、 R は A 力 G、 H は T 力 C 力 A， Nは A カ^ 力 T 力を示す）。プライマ一 ao- 及び ao - C1 を用い、ァスペルギルス 'オリゼー IAM2609のゲノム DNAを鐯型として PCRを行った。 PCR 反応は T0Y0B0の KOD DNA ポリメラーゼを用い、 95°Cで 3 分間 DNA を変性した後、 94Tで 0. 5 分間、 55°Cで 0. 5 分間、 68°Cで 2 分間を 25サイクル行った。その結果、 1. lkb の DNA 断片が増幅したので、この DNA 断片を pBluescript I I KS-の Ec。 RV部位へサブクローユングし塩基配列を決定した。塩基配列から予想されるアミノ酸配列は ao-N プライマー配列の後に続いて N 末端アミノ酸配列 ECIRALYKIPS ARAAPをコードしていたので、この DNA 断片は目的のものと判断し、 DNA クローニングの際にプローブとして用いた。

3 ) ライブラリ一作製ァスペルギルス ·オリゼー IAM2609のゲノム DNAを Sau 3AI で部分分解し、約 15k bの DNA 断片を得た。ベクターとしては T0Y0B0の； DASH I I を用い Bam HI部位へ DNA断片をライゲーシヨンした。このライゲートを Gi gapack I I I Gold in v itro packaging Ki tによりパッケージングし、宿主大腸菌 XL1- Blue MRA (P2)を用いて 1回増幅した。

4 ) クローニング

プラークハイプリダイゼーションにより陽性クローンを得た。プローブのラベルは口ッシュ（Roche ) 社製の DIG label systemを用いた。組換えファージ DNA から目的の D NA 断片を含む 4kb Xba I 断片を pBluescript I I KS-へサブクローニングし塩基配列の決定に用いた。

5 ) 塩基配列決定の決定には、日立製作所（ HITACHI) の SQ- 5500 DNA シークェンサ一を用いた。

〔実施例 6 ：本酵素の cDNA取得等〕

1 ) 1本鎖 cDNA の作製

ァスペルギルス ·ォリゼー IAM2609の培養菌体から全 RNA を精製した（キアゲン（Q IAGEN)社製の RNeasy Mini Kit 使用）。次にアンカー Tプライマー（ 5' - GACCACGCGTAT CGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTT - 3' ) と、 AMV 逆転写酵素を用い、全 RNA から 1本鎖 cDNA を合成した。 ·

2 ) 2本鎖 cDNA の作製

PCR 反応により cDNAの増幅を行った。鎳型としては 1本鎮 cDNA、プライマーは Apa - Spe2 (5' - AATCTCGCATACTAGTTCCACACAATG - 3'：)とアンカー（5' - GACCACGCGTATCGATGTCGA C-3' ) を用いた。 PCR 反応は T0Y0B0社製の KOD DNA ポリメラーゼを用い、 95°Cで 3 分間 DNA を変性した後、 94°Cで 0. 5 分間、 55でで 0. 5 分間、 68°Cで 2 分間を 25サイクル行った。その結果、 2. 2kb の DNA 断片が増幅したので、この DNA 断片を pBluescript I I KS -の Spe I , Cla I 部位へサブクローニングし塩基配列を決定した。

3 ) 遺伝子配列の解析

ゲノム DNAと cDNAの配列を比較することにより、プロモーター配列及びイントロンを決定した。この遺伝子は 8個のィントロンを含んでいた。 4 ) 全ァミノ酸配列の決定

cDNA の塩基配列から本酵素の全アミノ酸配列を推定した。この遺伝子は 652 ァミノ酸残基をコードしており、成熟タンパク質は 437 アミノ酸からなっていた。

〔実施例 7 ：プラスミノ一ゲンの活性化〕

1 ) プラスミノーゲンの精製

市販プラスミノーゲン（ROCHE) は安定化のため多量の BSA が入っているので精製を試みた。 5 mMリン酸緩衝液 pH 7. 4に調整された 1 mg/ml プラスミノーゲン 200 1 を、 50 mM リン酸緩衝液（pH 7. 5)で平衡化した Lys- Sepharos e 4B ( 1. 0 X 10 cm)に供し、同緩衝液でよく洗浄する。 0· 5 M NaClを含む 50 mM リン酸緩衝液（pH 7. 5)でさらによく洗浄し、 0. 2 M ε -amino-n-capron i c aci dにて溶出した。溶出画分を 10 mM MES 緩衝液 (pH 5. 4)で透析し、 E— ami no— n— capron i c ac i dを除レヽた。この画分（こつレヽて SDS— PAGE により均一性を確認した。

2 ) プラスミノーゲンの活性化

精製したプラスミノーゲン 450 μ 1 に本酵素希釈液 50 μ ΐ を加え混合し、 37°Cで各時間反応させた後、 200niM Tri s-HCl緩衝液（pH 7. 5) 500 μ 1 を加えることにより本酵素の酵素反応を停止した。これに 10 mM Boc-Val-Leu-Lys-MCA 基質 5 μ 1 を加え活性化されたプラスミンの酵素反応を開始した。基質から遊離される AMC の量を島津製作所製の RF 5000 型分光蛍光光度計を用いて、励起波長 360nm と蛍光波長 440nm で測定した。プラスミンの活性は 37°C、 pH 7. 5で測定した。その結果、本酵素は 10分間反応でプラスミンノ一ゲンの活性化を最大にした。その以上の反応ではプラスミンの活性が徐々に下がっていたことから、活性化されたプラスミンを分解して行くものと考えられた。産業上の利用分野

本発明の新規ポリぺプチドは、蛋白質中のアルギニン残基のカルボキシル基側のぺプチド結合を特異的に加水分解するプロテアーゼ活性を示すことから、蛋白質を極めて限定分解して、蛋白質の機能性の改善ができる。具体的には、水に対して溶解性が低い小麦や大豆の蛋白質を分解して、蛋白質の有する乳化性、保水性等の機能性を保持したまま、溶解性を向上させることが挙げられ、ハム、ソーセージや水産練り製品等の増量剤として食品用途で利用され得る。

また、アルギユン残基を活性中心に有する蛋白質を、そのアルギニン残基部位で加水分解することにより、蛋白質を不活性化することができる。具体的には、大豆中の大豆トリプシンインヒビターを分解して不活性化ができ、消化性の良い大豆蛋白質を製造させうる。

さらに、アルギニン残基をアレルゲン性の活性中心とする蛋白質を加水分解してァレルゲン性を低減させ、低アレルゲン性の卵製品、豆腐等の食品製造の用途に利用され得る。このように本発明の新規プロテアーゼは、広く食品用に利用され得る。

また、遺伝子組替えによる蛋白質の機能性の発現にも利用されうる。機能性の蛋白質は、機能性を有しないプロ蛋白質として生産されるが、この蛋白質のアルギニン残基を分解することにより、機能性を有する蛋白質に変換することができる。例えば、ブラスミノーゲンをプラスミンに活性化することを例示できる。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号.1に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド。

2 .配列番号 1に示す塩基配列又はこれと相補的な塩基配列を有する D N Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、プロテアーゼ遺伝子として機能するポリヌクレオチド。

3 . 配列番号 1に示すアミノ酸配列を有するポリぺプチド。

4 .配列番号 1に示すァミノ酸配列を有するポリぺプチドにおいて 5個以下の任意のァミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたァミノ酸配列を有し、プロテアーゼ活性を有するポリぺプチド。

5 . 請求の範囲 2項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリべプチド。

6 . ァスペルギルス（Aspergi l lus ) 属に属する菌株を栄養培地に培養し、培地中に請求の範囲 3項〜 5項のいずれかに記載のポリぺプチドを生成蓄積させ、これを精製採取するポリぺプチドの製造方法。

7 . 前記菌株がァスペルギルス 'ォリゼ一（Aspergi l lus oryzae) 種に属する菌株である請求の範囲 6項に記載のポリぺプチドの製造方法。

8 . 前記菌株がァスペルギルス 'オリゼー IAM2609株である請求の範囲 7項に記載のポリぺプチドの製造方法。