WO2003072770A1 - Nouvelle deshydrogenase et gene codant cette derniere - Google Patents

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WO2003072770A1
WO2003072770A1 PCT/JP2003/002204 JP0302204W WO03072770A1 WO 2003072770 A1 WO2003072770 A1 WO 2003072770A1 JP 0302204 W JP0302204 W JP 0302204W WO 03072770 A1 WO03072770 A1 WO 03072770A1
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dehydrogenase
amino acid
dna
represented
enzyme
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Nobuyoshi Esaki
Hisaaki Mihara
Mari Hara
Makoto Ueda
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Mitsubishi Chemical Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine

Definitions

  • the present invention relates to a novel dehydrogenase, a DNA encoding the same, and a method for producing an N-alkylamino acid using the same.
  • N-alkylamino acids N-methylamino acids, in particular, are known to exist in a part of the structure of natural bioactive substances such as didemnin or dolastatin (J. Am. Chem. So 1981, 103, pl857-1859; Tetrahedron 1993, 49, p9151-917Q), a useful substance that has recently attracted attention as an intermediate for pharmaceuticals or agricultural chemicals. Background art
  • N-substituted amino acids can be produced by a method using azide by reductive alkylation (J. Org. Chem. 1995, 60, p4986-4987), a method by reductive ring-opening reaction from oxazolidine derivative (Tetrahedron Letter) 39 (1998) 1985-1986).
  • an object of the present invention is to provide a novel dehydrogenase having properties different from those of known dehydrogenases.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, succeeded in isolating a novel dehydrogenase from Pseudomonas putida ATCC 12633 strain, and completed the present invention.
  • a dehydrogenase having the following physicochemical properties is provided.
  • substrate specificity active for alkylamines or dialkylamines, but not for ammonia
  • the enzyme is stable when treated at 30 ° C for 30 minutes.
  • the pH is around 5 to 10.5.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) a polypeptide having a dehydrogenase activity, wherein the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and Z or added; or
  • any one of the following DNAs is provided.
  • R 1 represents a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group
  • R 2 represents an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group
  • R 3 represents an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group
  • R 1 represents a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group
  • R 2 represents an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group
  • R 1 3 ⁇ Pi 1 4 their respective independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group
  • R 3 and R 4 are not both hydrogen atoms.
  • R 3 is a C 1 -C 6 linear, branched or cyclic alkyl group optionally substituted with an amino group
  • R 4 is a hydrogen atom
  • the compound of the formula (I) is pyruvic acid, fenirubiric acid, j3-fluoropyruvic acid, 2-oxobutyric acid, 2-ketohexanoic acid or 2-keton monovaleric acid.
  • R 1 and R 2 have the same meanings as defined in the general formula (II)
  • An enzyme that can be converted to a compound and R 3 (R 4 ) NH (wherein R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group. However, R 3 and R 4 are not both hydrogen atoms.)
  • R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group. However, R 3 and R 4 are not both hydrogen atoms.
  • R 3 and R 4 are not both hydrogen atoms.
  • R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group. However, R 3 and R 4 are not both hydrogen atoms.
  • R 3 and R 4 are not both hydrogen atoms.
  • R 3 is a C 1 -C 6 linear, branched or cyclic alkyl group optionally substituted with an amino group
  • R 4 is a hydrogen atom.
  • aminocarboxylic acids represented by the general formula (II) are phenylalanine or methionine.
  • the enzyme capable of converting the aminocarboxylic acid represented by the formula (II) to the alkyl-substituted amine represented by the formula (I) is D-amino acid oxidase, L-amino acid oxidase, or D-amino acid.
  • Dehydrogenase, L-amino acid Dehydrogenase is an amino acid transferase.
  • FIG. 1 is a graph showing the optimum pH of N-methyl-L-phenylalanine dehydrogenase of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the optimum temperature of N-methyl-L-phenylaradin dehydrogenase of the present invention.
  • N- methyl invention - is a graph showing a P H stability of L- Fuweniruara two down dehydrogenase.
  • FIG. 4 is a graph showing the thermostability of the N-methyl-L-phenylalanine dehydrogenase of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of pH on N-methyl-L-phenylalanine dehydrogenase of the present invention.
  • FIG. 6 shows the results of HPLC analysis of the co-reaction product with D-amino acid oxidase.
  • FIG. 7 shows the result of mass spectrum analysis of peak-1 and peak-2 in FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the dehydrogenase of the present invention has the following physicochemical properties.
  • substrate specificity active for alkylamines or dialkylamines, but not for ammonia
  • the enzyme is stable when treated at 30 ° C for 30 minutes.
  • the pH is around 5 to 10.5.
  • the dehydrogenase of the present invention can be prepared, for example, by screening with a dicarbonyl group-containing compound such as phenylpyruvic acid and ammonia, alkylamine and dialkylamine in the presence of NAD PH and Z or NADH. Can be obtained.
  • a dicarbonyl group-containing compound such as phenylpyruvic acid and ammonia, alkylamine and dialkylamine in the presence of NAD PH and Z or NADH.
  • the enzyme has a stable pH around 5 to 10.5 and has a characteristic when the optimum pH is around 10.
  • the above dehydrogenase can be isolated, for example, from a microorganism belonging to Pseudomonas putida, particularly preferably from Pseudomonas putida ATCC 12633 strain.
  • Specific examples of the above dehydrogenase include a polypeptide represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and homologs thereof having dehydrogenase activity.
  • the properties of the dehydrogenase represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 also include the following properties in addition to the properties described in (1) to (4) above.
  • the molecular weight measured by gel filtration method using Superose 12HR10 / 30 is about 80 to 93 kDa, and at least about 36 kg in SDS-polyacrylamide electrophoresis.
  • the band of the polypeptide assumed to be dalton is shown.
  • the optimal temperature based on activity measurement using phenylrubic acid and methylamine as substrates is around 35 ° C.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 to a plurality (preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 7, (Especially preferably about 1 to 5) a polypeptide having an amino acid sequence in which amino acid of which amino acid is deleted, substituted and Z or added, and which has dehydrogenase activity; or
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, Particularly preferably has a homology of 97% or more, A polypeptide having dehydrogenase activity;
  • the homology search of the above polypeptide can be performed, for example, using the FASTA program or the BLAST program for the DNA Databank of JAPAN (DDBJ).
  • dehydrogenase activity is a general term for activities that catalyze dehydrogenation reactions.
  • dehydrogenase activity involves alkylamination of carbonyl compounds with coenzymes and alkylamines relating to redox reactions such as NADH and NADPH.
  • Examples of the method for obtaining the dehydrogenase of the present invention include a method of isolating and purifying from a culture of a microorganism having dehydrogenase activity as described above, and a method of obtaining a part or all of the amino acid sequence of the present invention as described below.
  • the dehydrogenase of the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • Kuwawa Trading US Advanced Chem Tech
  • Perkin Elmer Japan US Perkin Elmer
  • Amersham Pharmacia Bioag Amersham Pharmacia Biotech
  • Aroka US Protein Technology Instrument Kurabo Industries
  • Kurabo Industries Synthecell-Vega, USA
  • Nippon Perceptive Limited US PerSeptive
  • Shimadzu Corporation etc.
  • the DNA encoding the above dehydrogenase is, for example, represented by SEQ ID NO: 2. And those containing a base sequence to be used.
  • homologue of the DNA encoding the dehydrogenase of the present invention one to a plurality (preferably 1 to 60, more preferably 1 to 30, and A polypeptide having a base sequence in which 1 to 20, more preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to 5 bases have been deleted, substituted and / or added, and having dehydrogenase activity DNA encoding; or
  • DNAJ that hybridizes under stringent conditions refers to a DNA hybridization using DNA as a probe, a colony hybridization method, a plaque hybridization method, or a Southern blot hybridization method. Means the DNA base sequence obtained by using the Yong method or the like.For example, using a filter immobilized with colonies or plaque-derived DNA or a fragment of the DNA, 0.7 to 1.0 M After hybridization at 65 ° C in the presence of NaC1, 0.1 to 2 XSSC solution (1 XSSC composition is 150 mM chloride Sodium, 15 mM sodium citrate), 65. Examples of such DNA include DNA that can be identified by washing the filter under the C condition.
  • Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition and the like.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more. Those having the above homology are mentioned.
  • DNA encoding the dehydrogenase of the present invention can be isolated, for example, by the following method.
  • the N-terminal amino acid sequence is analyzed.Furthermore, the desired dehydrogenase is obtained by using a conventional genetic engineering analysis technique such as cloning using PCR from chromosomal DNA.
  • the gene to be encoded can be isolated and its nucleotide sequence analyzed.
  • a primer can be set based on the nucleotide sequence to clone a target gene, or can be synthesized by a DNA synthesizer. .
  • the DNA encoding the dehydrogenase of the present invention obtained in the above (II) can be introduced into a known expression vector to provide a dehydrogenase expression vector. By culturing a transformant transformed with this expression vector, dehydrogenase can be obtained from the transformant.
  • microorganism to be transformed for expressing the dehydrogenase of the present invention is not particularly limited as long as the host itself does not adversely affect the reaction. Can be mentioned.
  • Genus Escherichia genus Bacillus, genus Pseudomonas, genus Serratia, Brevibacterium A bacterium which has been developed in a host vector system such as a genus, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus;
  • Streptomyces whose host vector system has been developed, such as genus Rhodococcus and Streptomyces;
  • Genus Saccharomyces Genus Kluyveromyces, Genus Schizosaccharomyces, Genus Zygosaccharomyces M, Genus Yarrowia, Genus Trichosporon Yeast being developed as a host vector system such as genus Rhodosporidium, genus / Hansenula, genus Pichia, genus Candida;
  • the host is preferably a genus Escherichia, a genus Bacillus, a genus Brevibacterium, a genus Corynebacterium, and particularly preferably a genus Escherichia.
  • the genus Corynebacterium is preferably a genus Escherichia, a genus Bacillus, a genus Brevibacterium, a genus Corynebacterium, and particularly preferably a genus Escherichia.
  • the genus Corynebacterium is preferably a genus Escherichia, a genus Bacillus, a genus Brevibacterium, a genus Corynebacterium, and particularly preferably a genus Escherichia.
  • the genus Corynebacterium is particularly preferably a genus Escherichia.
  • the procedure for producing a transformant and the construction of a recombinant vector suitable for a host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, molecular claw).
  • the DNA of the present invention is introduced into a plasmid vector or a phage vector which is stably present in a microorganism, or the DNA of the present invention is directly introduced into a host genome, and the genetic information is obtained. It needs to be transcribed and translated.
  • a promoter at 5, 5 upstream of the DNA chain of the present invention and more preferably, a terminator at 3, 3 downstream of the DNA chain.
  • the promoter and terminator that can be used in the present invention are used as hosts. No particular limitation is imposed on the promoter and terminator that are known to function in the microorganisms to be used.
  • promoters and terminators that can be used in these various microorganisms see, for example, “Basic Course in Microbiology 8”. Genetic Engineering. Kyoritsu Shuppan ", especially yeast, is described in detail in Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990), Yeast 8, 423-488 (1992).
  • Eshie Li HERE genus especially in E. coli Eshieri HERE co Li (Escherichia coli)
  • P BR as a plasmid vector, P BR, include pUC series plasmid, l ac (0 - galactosidase), trp (Tryptophan operon), tac, trc (fusion of lac and tr), phage PL, promoter derived from PR, and the like.
  • the terminator include a terminator derived from trpA, phage, and rrnB ribosomal RNA.
  • vectors include pUBllO-based plasmids, pC194-based plasmids, and the like, and can also be integrated into chromosomes.
  • promoter and terminator promoters and terminators of enzyme genes such as alkaline protease, neutral protease and ⁇ -amylase can be used.
  • the vector may be, for example, Pseudomonas putida s.
  • PKT240 A broad host range vector based on the T0L plasmid (including genes required for autonomous replication derived from RSF1010 and the like) PKT240 can be mentioned.
  • examples of the vector include a plasmid vector such as pAJ43 (Gene 39, 281 (1985)).
  • pAJ43 Gene 39, 281 (1985)
  • various promoters and terminators used in Escherichia coli can be used.
  • Corynebacterium especially Corynebacterium d'Arta micum (Corynebacterium glutamicum), pCSll (Japanese
  • plasmid vectors such as pCBlOl (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)), etc.
  • the genus Saccharomyces especially Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae).
  • Examples of vectors include YRp, YEp, YCp, and Yip plasmids, alcohol dehydrogenase, darisel aldehyde-13-phosphate dehydrogenase, acid phosphatase, and ⁇ -galactosidase.
  • the promoters and terminators of various enzyme genes such as phosphoglycerate kinase and enolase can be used.
  • examples of the vector include a plasmid vector derived from Schizosaccharomyces bomb described in Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986).
  • pAUR224 is commercially available from Takara Shuzo and can be easily used.
  • Aspergillus In the genus Aspergillus, Aspergillus niger and Aspergillus oryzae have been most studied among molds, and their integration into plasmids and chromosomes has been studied. It can be used, and a promoter derived from extracellular protease ⁇ amylase can be used (Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)).
  • host vector systems corresponding to various microorganisms have been developed, and these can be used as appropriate.
  • a transformant having the DNA of the present invention is cultured, and the dehydrogenase of the present invention can be isolated and purified from the culture by a known method.
  • the method for culturing the transformant having the DNA of the present invention can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the culture medium for culturing these microorganisms contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be utilized by the microorganism.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the transformant.
  • the cultivation is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is usually 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted by using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like. If necessary, an antibiotic such as ampicillin-tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as host cells commonly used RPM11640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science , 122, 501 (1952)], Fraction M medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], or fetal bovine serum etc. A medium or the like to which is added. Culture is carried out usually p H 6 ⁇ 8, 3 0 ⁇ 4 0 ° C, 5% C 0 2 present 1 to 7 days under conditions such as lower. If necessary, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • a conventional protein isolation and purification method may be used.
  • the dehydrogenase of the present invention when expressed in a lysed state in a cell, after completion of the culture, the cell is recovered by centrifugation and suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic frame breaker, a French press, a mantongaulin. Break the cells with a homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Jetyl Aminoethyl (DEAE) Cephal Anion exchange chromatography using a resin such as DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia), Methods such as hydrophobic chromatography using resins such as norecepharose and pheninoresepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, and electrophoresis such as isoelectric focusing By using these alone or in combination, a purified sample can be obtained.
  • DIAION HPA-75 manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation
  • cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia
  • the dehydrogenase of the present invention When the dehydrogenase of the present invention is expressed by forming an insoluble substance in cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain a precipitate fraction obtained by a conventional method. After recovering, the insoluble form of the dehydrogenase is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the lysate into a solution containing no protein denaturing agent or a solution in which the concentration of the protein denaturing agent is so low that the dehydrogenase is not denatured, and then the dehydrogenase is formed into a normal three-dimensional structure. A purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • R 1 represents a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group
  • R 2 represents an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group
  • An amino carboxylic acid and an amino carboxylic acid represented by the general formula (II) are represented by a general formula (I):
  • R 1 and R 2 have the same meanings as defined in the general formula (II)
  • an enzyme capable of converting to a compound represented by the formula: R 3 (R 4 ) NH 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group, provided that R 3 and R 4 are not both hydrogen atoms.
  • a method for producing an N-alkyl monoamino acid derivative comprising reacting an alkyl-substituted amine with an alkyl-substituted amine of the present invention in the presence of the dehydrogenase, polypeptide or transformant of the present invention.
  • the alkyl group of R 1 in the general formula (I) is a linear, branched or cyclic alkyl group which may be substituted with a group which is inert to a reaction such as a halogen atom or an aryl group.
  • a group which is inert to a reaction such as a halogen atom or an aryl group.
  • Specific examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a trifluoromethyl group, a benzyl group and the like.
  • this house Preferably, it has 1 to carbon atoms: L 0, and more preferably 1 to 4.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom or a linear alkyl group, particularly preferably a hydrogen atom.
  • the alkyl group of R 2 is a linear, branched or cyclic alkyl group which may be substituted with a group which is inert to the reaction such as a halogen atom, a hydroxyl group, an aryl group, and the like.
  • a group which is inert to the reaction such as a halogen atom, a hydroxyl group, an aryl group, and the like. Examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propynole group, an isopropyl group, a fluoromethyl group, a trifluoromethyl group, a hydroxymethyl group, a benzyl group and the like.
  • the aryl group represented by R 2 is an aryl group which may be substituted with a group which is inert to the reaction, such as a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group, or an aryl group. Specific examples thereof include a phenyl group and a tolyl group. Groups, a phenololenophenyl group, a hydroxyphenyl group, and the like.
  • the above-mentioned optionally substituted alkyl group and aryl group preferably have 1 to 10 carbon atoms.
  • R 2 is preferably an alkyl group, a haloalkyl group, or an aralkyl group, and among them, a linear group is particularly preferable.
  • Preferred specific examples of the compound represented by the general formula (I) include pyruvic acid, hydroxypyruvic acid, phenylpyruvic acid, ⁇ -fluoropyruvic acid, 2-ketohexanoic acid, and 2-ketoisohexanoic acid. , 2-oxobutyric acid, 2-ketooctanoic acid or 2-keto ⁇ -valeric acid, and particularly preferred are pyruvic acid, fenirubiric acid, 3-fluoropyruvic acid, 2-oxobutyric acid, 2-ketohexanoic acid or 2-keto n—valeric acid.
  • Preferred specific examples of the compound represented by the general formula (II) include fenylalanine and methionine.
  • R 3 (R 4 ) NH The amines used in this reaction are represented by R 3 (R 4 ) NH.
  • R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group which may be substituted, wherein the alkyl group which may be substituted Is a linear, branched or cyclic alkyl group which may be substituted with a group which is inert to the reaction such as a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group or an aryl group.
  • alkyl group which may be substituted include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a fluoromethyl group, a trifluoromethyl group, a hydroxymethyl group, an aminomethyl group, a benzyl group and the like. Of these, a linear alkyl group or an aminoalkyl group is preferable.
  • the alkyl group which may be substituted preferably has 1 to 6 carbon atoms, and more preferably has 1 to 4 carbon atoms.
  • amines Mechiruamin, Echiruamin, n _ Puropiruamin, isopropyl ⁇ Min, Jiaminometan, Jimechiruamin, Kisan'amin the like to consequent opening, more preferably primary amines, especially good Mashiku Is methylamine.
  • the dicarbonyl group-containing compound serving as a reaction substrate is generally used at a substrate concentration of 0.1 to 90% w / v, preferably 0.1 to 30% wZv. . These may be added all at once at the start of the reaction, but they may be added continuously or intermittently from the viewpoint of reducing the effects of enzyme substrate inhibition and improving the product accumulation concentration. It is desirable to add them.
  • the amino carboxylic acid as a reaction substrate is generally used at a substrate concentration of 0.01 to 90% wZv, preferably 0.1 to 30% wZv.
  • the amines are used in an equimolar amount or more, preferably 1.5 times or more, based on the dicarbonyl group-containing compound and the aminocarboxylic acids. If it is within the above range, it may be used arbitrarily in consideration of the pH and cost in the system, etc., but is usually 50 times or less, preferably 20 times or less.
  • the transformant when the above transformant is allowed to act on the dicarbonyl group-containing compound and the amino carboxylic acid, the transformant is used as it is, and the transformant is treated with an organic solvent such as acetone, DMSO, toluene, or a surfactant. , Freeze-dried, physically or enzymatically crushed cells, etc.
  • the enzyme fraction of the present invention in the transformant may be extracted as a crude product or a purified product, or may be immobilized on a carrier such as polyacrylamide gel or carrageenan gel. it can.
  • NAD (P) + coenzyme NAD + or NAD P +
  • NAD (P) H coenzyme NAD + or NAD P +
  • NAD (P) H NADH or NADPH
  • NAD (P) + generated from NAD (P) H into NAD (P) H for improving production efficiency.
  • An enzyme (regenerating enzyme) that can be used to regenerate NAD (P) H such as an enzyme, alcohol dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, or organic acid dehydrogenase (malate dehydrogenase), is included in the reaction system.
  • microorganisms containing the regenerated enzymes such as those obtained by treating the microorganisms with acetone, freeze-drying, physically or enzymatically crushing,
  • a product obtained by extracting the enzyme fraction as a crude product or a purified product, or a product obtained by immobilizing these on a carrier represented by polyacrylamide gel, carrageenan gel or the like may be used. May be used.
  • the amount of the regenerating enzyme used is, specifically, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times the enzyme activity as compared with the dehydrogenase of the present invention. I do.
  • the method of 3 the method of integrating the DNA of the present invention and the DNA of the above-mentioned regenerating enzymes into a chromosome, the method of introducing both DNAs into a single vector and transforming a host, and the like
  • a method of transforming a host after introducing both DNAs separately into a vector can be used.However, in a method of transforming a host after introducing both DNAs separately into a vector, an imbalance between the two vectors is required. It is necessary to select a vector in consideration of compatibility.
  • This reaction is carried out in an aqueous medium containing the reaction substrate, the transformant of the present invention, various coenzymes added as required, and a regeneration system thereof, or in a mixture of the aqueous medium and an organic solvent. .
  • Examples of the above-mentioned aqueous medium include water or a buffer, and examples of the organic solvent include water-soluble organic solvents such as ethanol, propanol, tetrahydrofuran, and dimethinoresnorreoxide, ethyl acetate, butyl acetate, toluene, and chloroform. From water-insoluble organic solvents such as oral form and n- hexane, those having high solubility of the reaction substrate can be used as appropriate.
  • This reaction is generally carried out at a reaction temperature of 4 to 50 ° C, preferably 10 to 40 ° C, and usually at pH 6 to l1, preferably at pH 7 to: L1.
  • the carboxylic acid ester of the compound represented by the general formula (I) When steles are used as a reaction raw material, a commercially available hydrolase may be allowed to coexist in the system, and may be converted into carboxylic acids in which R 1 is a hydrogen atom in the system, followed by N-alkylamination.
  • an amino carboxylic acid corresponding to the above general formula (I), that is, a compound (R 2 CH (NH 2 ) COOR 1 ) represented by the general formula (II) is used as a reaction raw material,
  • an enzyme which acts on the compound represented by the formula (II) and can be converted into the compound represented by the formula (I) the compound represented by the above formula (I) is produced in the system.
  • N-alkylamination may be performed with the present dehydrogenase.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can act on the compound represented by the general formula (II) and can be converted into the compound represented by the general formula (I).
  • Specific examples include amino acid oxidase and amino acid Dehydrogenase ⁇ amino acid transferase.
  • an enzyme having a wide substrate specificity is preferred.
  • Specific examples include L-amino acid oxidase described in Enzyme and Microbial Technology vol. 31 (2002) p77-87, and D-amino acid oxidase manufactured by Sigmane.
  • amino acid oxidase and amino acid dehydrogenase ⁇ amino acid transferase used are those that react only with the amino acid, and that can be used corresponding to the capture enzyme used in this reaction are preferable as an alternative to the capture enzyme regeneration system. . That is, when NAD (P) H is used as a coenzyme in the N-alkylamination of this reaction, NAD (P) H becomes NADP + by N-alkylamination of this reaction, while In producing the compound represented by the above general formula (I) from an amino carboxylic acid, the compound is converted to NAD (P) H using this NAD P +.
  • an enzyme that acts on the compound represented by the general formula (II) and can be converted into the compound represented by the general formula (I) acts only on an amino acid having no substituent in the carboxylic acid group
  • An enzyme that hydrolyzes the aminocarboxylic acid into an amino acid may be further coexisted, and the reaction may be performed after the amino acid is generated.
  • the N-alkyl monoamino acid derivative After completion of the reaction, the N-alkyl monoamino acid derivative After separating the bacterial cells and proteins in the solution by centrifugation, membrane treatment, etc., extraction by an organic solvent such as ethyl acetate or toluene, distillation, column chromatography, crystallization, etc. are performed as appropriate. it can.
  • the enzyme activity in this example was measured by the following method.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • UV detector (210 nm)
  • a reagent from Sigma was used as a standard sample.
  • Enzyme activity unit lunit is defined as the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of N-methylphenylalanine per minute.
  • Example 1 Purification of enzyme (1-1)
  • 50 ml of the culture solution obtained by the pre-preculture was inoculated into 50 ml ⁇ 4 sterile liquid culture media (2 L Sakaguchi flasks) of the same composition, 50 ml each in 2 L Sakaguchi flasks.
  • the cells were cultured with shaking under aerobic conditions at 28 ° C for 8 hours (preculture).
  • 1% polypeptone (Nacalai Testa) 0.5% yeast extract
  • LB medium medium
  • the culture solution obtained after the culture was centrifuged to obtain 2.5 kg of wet cells.
  • the cells were suspended in 5 L of 2 OmM Tris-monohydrochloride buffer (pH 7.0) and sonicated to obtain 5.9 L of a crude enzyme solution.
  • Ammonium sulfate fractionation of the crude enzyme revealed that the fraction with an ammonium sulfate concentration of 20-60% was active. This fraction was collected and dialyzed 5 times against 15 L of 20 mM Tris-monohydrochloride buffer (pH 7.0). The amount of the enzyme solution became 3100 ml.
  • the fraction eluted with the above-mentioned 2 OmM Tris-HCl buffer containing 0.2 M sodium chloride was collected, and the amount of protein and enzyme activity were measured.
  • 3 900 mL of the active solution 3 was dialyzed three times against 12 L of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 20% saturated ammonium sulfate.
  • the enzyme solution after dialysis was 3000 mL.
  • the protein was eluted by applying a gradient so that the sodium chloride concentration was 0.1 to 0.3M.
  • a fraction having enzyme activity was recovered, 1700 mL of an enzyme solution was obtained.
  • 0.760 g of ammonium sulfate was added to the enzyme solution, stirred, and concentrated.
  • the enzyme solution became 6 OmL. This was dialyzed twice with 8 L of 2 OmM Tris' monohydrochloride buffer (pH 7.0). After dialysis, the enzyme solution was reduced to 10 OmL.
  • the precipitate was suspended in 2 Omm Tris monohydrochloride buffer (pH 7.0) 3 m L, and 8 hours dialyzed with 20% ammonium sulfate containing 20 mM Tris-monohydrochloride buffer saturated (P H 7.0) 9 L. After dialysis, a precipitate was found in the tube, and 8.5 mL of the same buffer as in dialysis was added to suspend the tube. Since the precipitate did not dissolve in this operation, centrifugation was performed to separate the precipitate from the supernatant. Since almost all activity was observed in the supernatant, 13 mL of the supernatant was purified using RESOURCE PHE (Amersham Bioscience). 20 mL of 20 0 /. The protein was eluted with a gradient of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing saturated ammonium sulfate and 20 mL of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0).
  • the collected enzyme solution (19 mL) was concentrated to 5 mL by ultrafiltration, and then dialyzed against 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.0). As a result, the enzyme solution was 6.5 mL.
  • the active fraction was eluted with 50 mL of a 1 M aqueous sodium chloride solution and 50 mL of a 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.0) such that the sodium chloride salt concentration became 0 to 1 M.
  • Table 1 summarizes the specific activities and the like of the enzyme fraction in each of the purification steps (1-1-1) to (1-1-7).
  • Chromosomal DNA was prepared from the cells obtained by culturing Pseudomonas putida, ATC C12633 strain in LB medium, using a DNeasy Tissue Kit (Qiagen). Primers were synthesized based on the N-terminal amino acid sequence determined in Example 2 and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence found in the BLAST search. The respective base sequences are shown in SEQ ID NOs: 4 (NMPDHf) and 5 (MPDHrl) in the sequence listing.
  • the chromosomal DNA of Pseudomonas putida ATCC 12633 was type III, and NMPDHf and NMPDHrl were used as primers for 30 cycles of PCR (98 ° C, 20 seconds, 68 ° C, 3 minutes) to obtain a specific amplified sample.
  • PCR 98 ° C, 20 seconds, 68 ° C, 3 minutes
  • the DNA fragment obtained above was introduced into a clawing vector pET21a (Takara Shuzo) according to a conventional method. (This plasmid is called pENMadh)
  • Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) was transformed.
  • the transformant was grown at 37 ° C. on an LB medium plate (LB medium + 2% agar) containing ampicillin (100 / g / mL). Some white colonies that appeared were cultured and plasmid extraction was performed under normal conditions.
  • the resulting plasmid was digested with restriction enzymes NdeI and Hindill (at 37 ° C. for 3 hours), and it was confirmed by agarose electrophoresis whether the target DNA fragment was inserted into the plasmid.
  • a colony in which the DNA fragment of interest is assumed to be inserted is cultured in a liquid LB medium containing ampicillin.At 14 hours of the culture, IPTG is added to a concentration of 0.1 mM, and the culture is further continued for 3 hours. The cells were collected. The cells were sonicated to obtain a crude enzyme.
  • the activity of the obtained crude enzyme was measured to confirm the expression of the target protein.
  • Example 3 The obtained colonies of the Escherichia coli clone were aseptically inoculated with a platinum loop and cultured with shaking at 37 ° C for 24 hours (preculture). Next, 50 OmL of the LB medium was placed in a 2 L Sakaguchi flask for sterilization. After the temperature was brought to room temperature, 50 O ⁇ L of a 10 Omg / m1 ampicillin aqueous solution was added.
  • Green sepharose CL-4B (100 ml resin) was equilibrated with Tris-HCl buffer (pH 7.0), and the cell-free extract was poured.
  • the enzyme solution obtained by the above dialysis was supplied to DEAE-TOYOPEARL (manufactured by TOSOH) (resin 6 OmL) equilibrated with 20 mM Tris-monohydrochloride buffer (pH 7.0). Thereafter, washing was performed with 50 OmL of 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.0). Next, the protein was eluted by applying a gradient so that the sodium chloride concentration became 0 to 0.35 M. Fractions with enzyme activity were collected, concentrated by Centriprep (Amersham Bio Sa Iensu Inc.), it was dialyzed against 2 Omm tris monohydrochloride buffer (P H 7.0). After dialysis, the enzyme solution was 6 drops. Table 2 summarizes the specific activity ratio of the enzyme fraction in each of the above purification steps.
  • Purified enzyme was obtained from the E. coli clone in the same manner as in Example 5.
  • Purified enzyme was obtained from the E. coli clone in the same manner as in Example 5.
  • Example 9 pH stability
  • Example 5 The purified enzyme obtained in Example 5 was incubated at 30 ° C. for 30 minutes using a buffer solution and changing the H, and the residual activity was measured.
  • the reaction conditions were the same as in Example 7, using methylamine-sulfuric acid (pH 10) at 37 ° C.
  • the results are shown in FIG. 3 in terms of the residual activity when the untreated activity is set to 100.
  • the enzyme according to the invention was most stable at pH 6-9.
  • Example 10 Temperature stability of enzyme
  • Example 11 Substrate specificity of the present enzyme when NADH was used as a coenzyme Purified present enzyme was obtained from a cloned E. coli strain in the same manner as in Example 5.
  • Each of the various keto acids shown in Table 4 was added to a final concentration of 40 mM (however, 30 mM for j3-phenylpyruvic acid), NADH to a final concentration of 0.3 mM, bis-Tris propane buffer ( ⁇ . ⁇ ) to a final concentration of 100 mM, methylamine was added to a final concentration of 180 mM, and the enzyme activity was measured by examining the change in absorbance at 340 nm of the reaction solution. The reaction temperature during measurement was 37 ° C. Table 4 shows the results of the relative activities, using pyruvate as the substrate, as 100%. Table 4
  • Example 12 Measurement of optimal ⁇ when NADH is used as a coenzyme
  • Purified enzyme was obtained from the E. coli clone in the same manner as in Example 5.
  • the enzyme activity was determined by examining the change in the absorbance at 340 ⁇ m of the reaction mixture containing pyruvate at a final concentration of 80 mM, NADH at a final concentration of 0.3 mM, and methylamine adjusted to each pH with sulfuric acid to a final concentration of 180 mM.
  • the reaction temperature during the measurement was 37 ° C.
  • the amount of enzyme that reacts with 1 micromol of pyruvate per minute is defined as 1 unit, and the results of the relationship between the number of units (uZmg) per protein and pH are shown in FIG. The optimum pH for the reaction was 9.5.
  • Example 13 Examination of reverse reaction when NAD is used as a coenzyme
  • Purified enzyme was obtained from the E. coli clone in the same manner as in Example 5.
  • N-methyl-L-alanine at a final concentration of 50 mM, NAD at a final concentration of 10 mM, bis-Tris Enzyme activity was measured by examining the change in absorbance at 330 nm of the reaction mixture to which a propane buffer ( ⁇ .0) was added to a final concentration of 100 mM.
  • the reaction temperature during measurement was 37 ° C.
  • the activity was 7.8X10-3 (uZmg protein).
  • Example 14 Substrate specificity of this enzyme when NAD PH is used as a coenzyme
  • Purified enzyme was obtained from the E. coli clone in the same manner as in Example 5.
  • GDH Bacillus subtilis-derived glucose dehydrogenase
  • subtilis chromosomal DNA prepared in Example 17 as type I, 30 cycles of PCR (94 ° (30 seconds, 54 ° C, 30 seconds, 72 ° C 1 minute)) were performed for 30 cycles to obtain specific amplified DNA.
  • the resulting DNA fragment was digested with EcoRI and Hindlll, and the plasmid vector pKK223-3 (Amersham Pharmacia) was digested with EcoRI and Hindlll, and the PCR amplified DNA fragment was digested with T4 DNA ligase.
  • the nucleotide sequence of the inserted fragment was completely analyzed and found to be identical to the nucleotide sequence contained in the database (DDBJ Accession No. M12276). The sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • Example 17 Construction of a GDH plasmid pSTV28-GDH that can be co-expressed with pE Madh [a plasmid obtained by inserting the DNA fragment of the present dehydrogenase into pET21a]
  • the pKK223-3GDH constructed in Example 16 was digested with two types of restriction enzymes, RI and Pstl, to prepare a fragment containing the Bacillus subtilis GDH gene.
  • Plasmid vector pSTV28 (TAKARA) was digested with oRI and Pstl, and the above GDH-containing fragment was ligated with T4 DNA ligase to obtain PSTV28-GDH.
  • TAKARA Plasmid vector pSTV28
  • Example 18 Coexpression of Bacillus subtilis-derived GDH and the present dehydrogenase in Escherichia coli An Escherichia coli BL21 (DE3) clone strain carrying pENMadh was transformed with pSTV28-GDH. The recombinant E.
  • coli was inoculated into a liquid LB medium containing 100 ⁇ g / raL of ampicillin and 25 ⁇ g / mL of chloramphenicol, cultured for 17 hours, supplemented with ImM IPTG, and further cultured for 3 hours. After harvesting, the cells were suspended in 20 mM Tris-HCL (pH 7.0), and the enzyme activity of the crude cell extract obtained by sonication was measured.
  • This dehydrogenase activity was measured at 30 ° C using a reaction solution containing lOOmM bis-trispropane buffer (pH 10.0), 0.2mM NADPH, 30mM methylamine, lOmM sodium pyruvate. I went in. 1 U was the amount of enzyme that oxidizes 1 / xmol of NADPH per minute under the above reaction conditions. The result was 6.6 U / mg protein.
  • the Escherichia coli obtained in Example 18 was cultured in the same manner as in Example 17 to obtain a culture solution of 100 ml. After the culture, the cells were collected by centrifugation, and the cells were washed twice with 40 ml of 20 mM Tris-hydrochloride buffer (H 7.0) containing 0.85% saline to obtain cells.
  • H 7.0 Tris-hydrochloride buffer
  • a reaction solution containing a final concentration of lOOmM sodium phenylviruvate, a final concentration of 0.2mM NADP, a final concentration of lOOmM glucose, and a final concentration of 700mM methylamine monohydrochloride (pH 9) was added to the obtained resting cells.
  • the turbidity of the cells was adjusted to 20 (absorbance at 660 nm).
  • the reaction was performed while stirring at 30 ° C.
  • the reaction was carried out with stirring while adjusting the pH to 8 to 9 with a 10 N aqueous sodium hydroxide solution.
  • the amount of N-methylphenylalanine produced after 24 hours of reaction was 13.4 g / L (reaction yield: 75%).
  • Example 20 Co-reaction with D-amino acid oxidase (1)
  • D-phenylalanine, NADPH at a final concentration of 10 mM, and methylamine with H adjusted to 10 with sulfuric acid to a final concentration of 50 mM, and a final concentration of 6 OmM were added.
  • 0.052 units of D-amino acid oxidase (derived from porcine kidney manufactured by Sigma) was added to the reaction solution 100 1 to which a final concentration of lOOmM was added to a hydrochloric acid buffer solution (pH 9).
  • the amount of protein of the present enzyme in the reaction solution was adjusted to 26.
  • the reaction temperature during the measurement was 30.
  • reaction was terminated by adding 25 ⁇ l of acetic acid to the reaction solution at a final concentration of 2%.
  • the reaction solution was analyzed by HPLC under the following conditions.
  • Example 20 was carried out in the same manner as in Example 20, except that D-methionine was used instead of phenylalanine.
  • the HPLC chromatogram is shown in FIG.
  • the retention time of HPLC was 10.6 minutes for methionine, but a peak was generated together with the reaction at 14.1 minutes, suggesting N-methylmethionine. Therefore, LC-mass under the following conditions was applied using the same analytical column.
  • Figure 7 shows the results of the mass spectrum.
  • the molecular weight of the peak estimated to be N-methylmethionine was 163, which was consistent with the molecular weight of N-methylmethionine.
  • Ionization method Electrospray ionization method (ESI) Positive ion detection Mass scanning condition: m / z60-500 lsec
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 20, except that L-phenylalanine dehydrogenase (manufactured by Sigma) was used instead of D-amino acid oxidase, and L-phenylalanine was used instead of D-phenylalanine.
  • L-phenylalanine dehydrogenase manufactured by Sigma
  • a novel dehydrogenase having properties different from those of known dehydrogenases is provided.
  • the dehydrogenase of the present invention it is possible to produce an N-alkylamino acid useful as an intermediate for pharmaceuticals or agricultural chemicals.

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Description

新規デヒドロゲナーゼ及ぴそれをコードする遺伝子 技術分野
本発明は、 新規デヒドロゲナーゼ、 それをコードする D NA、 及びそれを用い た N—アルキルアミノ酸の製造方法に関するものである。 N—アルキルアミノ酸 の中でも、 特に N—メチルアミノ酸は、 ジデムニン （Didemnin) あるいはドラス タチン （dolastatin) といった天然の生理活性物質の構造の一部で存在すること が知られ（J. Am. Chem. So 1981， 103 号， pl857- 1859 ; Tetrahedron 1993， 49 号 p9151 - 917Q)、近年は医薬あるいは農薬の中間原料として注目されている有用な物 質である。 背景技術
N—置換アミノ酸類の製造方法としては、 アジドの還元的アルキルィヒによる方 法（J. Org. Chem. 1995, 60号， p4986- 4987)、 ォキザゾリジン誘導体からの還元 的開環反応による製法（Tetrahedron Letter 39 (1998) 1985-1986)といった化学 的反応などが知られていた。
また、 微生物を用いた方法としては、 デヒドロゲナーゼ又はアミノトランスフ エラーゼを用いた 2—ォキソカルボン酸誘導体からのアミノ酸類の製造方法が知 られているものの、 これらは主として、 単なるアミノ化のみが行われているだけ であり、置換アミノ基を用いたものとしては、 シユードモナス （Pseudomonas)属 の微生物を用いてピルビン酸から N—メチルァラニンを製造する方法 （J. Biol. Chem. , 250号， ρ3746- 3751 (1975) )、 及ぴロ ドコッカス属、 ァルスロパクター属 の微生物を用いたメチルァミノ化方法 （特開 2 0 0 1 - 1 9 0 2 9 8号公報） の ように単なるメチルァミノ化のみが知られているのみであった。
また、 上記反応に関与する酵素と しては、 J. Biol. Chem. , 250 号， 3746-3751 (1975)に、 シユードモナス M S A T C C 2 5 2 6 2由来の N—メチ ルァラニンデヒドロゲナーゼが精製されたことが報告されている。
発明の開示
しかしながら、 上述のように、 公知のアミノ酸デヒドロゲナーゼおよび N—メ チルァミノ酸デヒドロゲナーゼは、 ァミン類又はジカルボニル基含有化合物とい つた基質特異性が限定されており、 適用できる応用の範囲が狭い。 また、 上記し た公知の酵素を用いて N—メチルアミノ化を行った場合、 N—メチルーアミノ酸 だけではなくァミノ基の置換基のない通常のアミノ酸も同時に製造されるため、 工業的に有利な方法とは言えない。 このため、 新規なデヒドロゲナーゼの取得が 望まれていた。 即ち、 本発明は、 公知のデヒドロゲナーゼとは異なる性質を有す る新規なデヒドロゲナーゼを提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 シユードモナス プチダ ATCC 12633株より新規デヒドロゲナーゼを単離することに成功し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明によれば、 以下の理化学的性質を有するデヒドロゲナーゼが提供 される。
(1) 作用： NAD PHおよび Z又は NADHを補酵素としてピルビン酸とァ ルキルァミン又はジアルキルアミンから N—アルキル一 Lーァラニンを生成す る ；
(2) 基質特異性：アルキルァミン又はジアルキルァミンに対して活性を示す がアンモニアには活性を示さない；
(3) フエ二ルビルビン酸とメチルァミンとを基質とした場合の至適 pHが 1 0付近；及ぴ、
(4) 30°Cで 30分処理したときの酵素が安定である pHが 5〜10. 5付 近：
本発明の別の側面によれば、 下記の何れかのポリべプチドが提供される。
(1) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド； ( 2 ) 配列番号 1で表されるァミノ酸配列において 1から複数個のァミノ酸が欠 失、 置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を有し、 デヒドロゲナーゼ活性を有 するポリぺプチド；又は
( 3 ) 配列番号 1で表されるァミノ酸配列と 50 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列を有し、 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明のポリペプチドをコードす る DNAが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 下記の何れかの DN Aが提供される。
(1) 配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA；
(2) 配列番号 2で表される塩基配列において 1から複数個の塩基が欠失、 置換 及び Z又は付加された塩基配列を有し、 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプ チドをコ一ドする DNA；又は
(3) 配列番号 2で表される塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件 下でハイブリダイズし、 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドす る DNA：
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の DN Aを有する組み換え ベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の DN Aまたは組換えべク ターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 下記一般式 （I)
Figure imgf000004_0001
(式中、 R1は、 水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、 R2は置 換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいァリール基を示す） で 表されるジカルボ-ル基含有化合物と R3 (R4) NH (式中、 1 3及ぴ1 4は、 そ れぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、 R3と R4は共に水素原子であることはない。） で表されるアルキル置換アミン類 とを、 本発明のデヒドロゲナーゼ、 ポリペプチド又は形質転換体の存在下で反応 させることを含む、 N—アルキル一アミノ酸誘導体の製造方法が提供される。 好ましくは、 R1は水素原子である。
好ましくは、 R 3はァミノ基で置換されていてもよい C 1〜C 6の直鎖、 分岐 鎖若しくは環状のアルキル基であり、 R 4が水素原子である。
好ましくは、式（I)で表される化合物は、 ピルビン酸、 フエ二ルビルビン酸、 j3—フルォロピルビン酸、 2—ォキソ酪酸、 2—ケトへキサン酸又は 2—ケト n 一吉草酸である。
本発明のさらに別の側面によれば、 下記一般式 （I I) :
Figure imgf000005_0001
(式中、 R1は、 水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、 R2は置 換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいァリ一ル基を示す） で 表されるアミノカルボン酸類と、 一般式 （I I) で表されるアミノカルボン酸類 を一般式 （ I ) ：
Figure imgf000005_0002
(式中、 R1及ぴ R2は、 一般式 （I I) における定義と同義である） で表される 化合物に変換することのできる酵素と、 R3 (R4) NH (式中、 R3及び R4は、 そ れぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、 R 3と R 4は共に水素原子であることはない。） で表されるアルキル置換ァミン類 とを、 本発明のデヒドロゲナーゼ、 ポリペプチド又は形質転換体の存在下で反応 させることを含む、 N—アルキル一アミノ酸誘導体の製造方法が提供される。 好ましくは、 R3はァミノ基で置換されていてもよい C 1〜C 6の直鎖、分岐鎖 若しくは環状のアルキル基であり、 R4が水素原子である。
好ましくは、 一般式 （I I ) で表されるアミノカルボン酸類は、 フエ二ルァラ ニンま はメチォニンである。
好ましくは、 式 （I I ) で表されるァミノカルボン酸類を式 （I ) で表される アルキル置換ァミン類に変換することのできる酵素は、 D—アミノ酸ォキシダ一 ゼ、 L—アミノ酸ォキシダーゼ、 D—アミノ酸デヒドロゲナーゼ、 L一アミノ酸 デヒドロゲ^ "一ゼ、 アミノ酸トランスフェラーゼである。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明の N -メチル- L -フエ二ルァラニンデヒドロゲナーゼの至適 pHを 示すグラフである。
図 2は、 本発明の N -メチル- L-フェニルァラ二ンデヒドロゲナーゼの至適温度 を示すグラフである。
図 3は、本発明の N-メチル- L-フヱニルァラ二ンデヒドロゲナーゼの PH安定性 を示すグラフである。
図 4は、 本発明の N -メチル -L-フエ二ルァラニンデヒドロゲナーゼの熱安定性 を示すグラフである。
図 5は、 本発明の N -メチル -L -フエ二ルァラニンデヒドロゲナーゼに対する pH の影響を示すグラフである。
図 6は、 D—ァミノ酸ォキシダーゼとの共反応産物を H P L C分析した結果を 示す。 図 7は、図 6の peak- 1と peak- 2についてマススぺクトル解析した結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
( I ) 本発明のデヒドロゲナーゼ及びポリぺプチド
本発明のデヒドロゲナーゼは以下の理化学的性質を有するものである。
(1) 作用： NADPHおよび Z又は NADHを補酵素としてピルビン酸とァ ルキルァミン又はジアルキルァミンから N—アルキル一 L—ァラニンを生成す る；
( 2 ) 基質特異性：アルキルァミン又はジアルキルァミンに対して活性を示す がアンモニアには活性を示さない；
(3) フエニルピルビン酸とメチルァミンとを基質とした場合の至適 p Hが 1 0付近；及び、
(4) 30°Cで 30分処理したときの酵素が安定である pHが 5〜10. 5付 近：
本発明のデヒ ドロゲナーゼは、 例えば、 フエ二ルビルビン酸のようなジカルボ ニル基含有化合物と、 NAD PHおよび Z又は NADHの存在下で、アンモニア、 アルキルアミン及ぴジアルキルアミンを用いたスクリ一二ングを行うことにより、 取得することができる。
スクリーニングに当たっては、 デヒドロゲナーゼ活性を有する微生物の培養物 から増殖菌体、 該菌体破碎物、 又はこれから通常の操作により単離した粗酵素又 は精製酵素を用いることができる。
加えて、 酵素の安定な pHが 5〜10. 5付近である上で、 至適 pHが 10付 近となるといつた特性を有することが本発明のデヒドロゲナーゼの特性である。 上記デヒドロゲナーゼは、 例えば、 シユードモナス ·プチダに属する微生物、 特に好ましくは、 シユードモナス ·プチダ ATCC 12633株より単離するこ とができる。 上記デヒドロゲナーゼの具体例としては、 配列番号 1に記載のァミノ酸配列で 表されるポリペプチド、 並びにそのホモログであってデヒドロゲナーゼ活性を有 するものが挙げられる。
配列番号 1に記載のァミノ酸配列で示されるデヒドロゲナーゼの性質としては、 上記 （1) 〜 （4) で示される性質の他に以下のような特性も示す。
(5) Superose 12HR10/30 (アマシャムバイオサイエンス社製） を用いたゲル 濾過法分析により測定される分子量が約 80〜 93キロダルトンであり、 S D S 一ポリアクリルアミ ド電気泳動において、 少なくとも約 36キロダルトンと推定 されるポリペプチドのバンドを示す。
(6) フエ二ルビルビン酸とメチルアミンを基質とした場合の活性測定による 至適温度は 35 °C付近である。
(7) 至適 pH (フエ二ルビルビン酸とメチルァミンとを基質とした場合 =p HI 0) において 30分処理したときの熱安定性は、 約 30°C未満である。
(8) ピルビン酸だけでなく、 少なくとも 2—ケトへキサン酸、 フエニルピル ビン酸、 2—ォキソ酪酸、 _フルォロピルビン酸、 2—ケト η—吉草酸にも活 性を示す。
(9) 0. O lmMの塩化水銀 （HgC l 2) 及び 0. 01 mMの塩化銅 （C uC 12) といった 2価の重金属によって活性が阻害される。
本発明のデヒドロゲナーゼのホモログとしては、
配列番号 1で表されるァミノ酸配列において 1から複数個 （好ましくは 1〜 2 0個、 より好ましくは 1〜15個、 さらに好ましくは 1〜10個、 さらに好まし くは 1〜 7個、 特に好ましくは 1〜 5個程度） のァミノ酸が欠失、 置換及び Z又 は付加されたアミノ酸配列を有し、 デヒ ドロゲナーゼ活性を有するポリべプチ ド；又は
配列番号 1で表されるァミノ酸配列と 50 %以上、 好ましくは 60 %以上、 よ り好ましくは 70 %以上、 より好ましくは 80 %以上、 さらに好ましくは 90 % 以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 97%以上の相同性を有し、 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチド；
が挙げられる。
尚、 上記ポリペプチドのホモロジ一検索は、 例えば、 DNA Databank of JAPAN (DDBJ)を対象に、 FASTA programや BLAST programなどを用いて行うこと ができる。
' また、 デヒドロゲナーゼ活性とは、 一般に脱水素反応を触媒する活性の総称で あるが、 本発明では NAD Hや NAD P H等の酸化還元反応に関する補酵素とァ ルキルアミン類によりカルボニル化合物をアルキルアミノ化させる活性をいう。 本発明のデヒドロゲナーゼの取得方法としては、 上述したようにデヒドロゲナ ーゼ活性を有する微生物の培養物から単離 ·精製する方法のほか、 後述するよう に本発明のァミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を元にして作成し たプローブを用いることにより、 デヒドロゲナーゼ活性を有する任意の微生物か ら該還元酵素をコードする D N Aを単離した後、 それを元に遺伝子工学的手法を 用いて得ることができる。
あるいは、 本発明のデヒドロゲナーゼは、 Fmoc法（フルォレニルメチルォキシ カルボニル法）、 tBoc法（t一ブチルォキシカルボ二ル法）等の化学合成法によって も製造することができる。 また、 桑和貿易（米国 Advanced Chem Tech社製）、 パー キンェルマ一ジャパン（米国 Perkin Elmer社製）、 アマシャムファルマシァバイオ ァグ (Amersham Pharmacia Biotech 社製)、 ァロカ 米国 Protein Technology Instrument社製）、クラボウ（米国 Synthecell- Vega社製）、 日本パーセプティプ . リミテッド (米国 PerSeptive社製)、島津製作所等のぺプチド合成機を利用して化 学合成することもできる。
(II) 本発明の D NA
本発明によれば、 上記デヒドロゲナーゼをコードする D NAまたはそのホモ口 グが提供される。
上記デヒドロゲナーゼをコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号 2で表 される塩基配列を含むものが挙げられる。
本発明のデヒドロゲ^ "一ゼをコ一ドする DNAのホモログとしては、 配列番号 2で表される塩基配列において 1から複数個 (好ましくは 1〜 60個、 より好ましくは 1〜30個、 さらに好ましくは 1〜20個、 さらに好ましくは 1 〜10個、 特に好ましくは 1〜5個程度） の塩基が欠失、 置換及び/又は付加さ れた塩基配列を有し、 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA ;又は
配列番号 2で表される塩基配列を有する D N Aとストリンジユントな条件下で ハイプリダイズし、 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチドをコードする D NA：
が挙げられる。
当業者であれば、 配列番号 2に記載の DN Aに部位特異的変異導入法 （Nu c 1 e i c Ac i d Re s. 10， p p. 6487 (1 982)、 Me t h o d s i n En z ymo l . 100, p p. 448 (1983), Mo 1 e c u 1 a r C l o n i n g 2 n d E d t . , C o l d S p r i n g Ha r b o r La b o r a t o r y P r e s s (1989) (以下、 〃モレキュラークロー二 ング第 2版〃と略す）、 P CR A P r a c t i c a l Ap p r o a c h I RL P r e s s p p. 200 (1 991)) 等を用いて適宜置換、 欠失、 挿入 及び zまたは付加変異を導入することにより所望のホモログを得ることが可能で ある。
本明細書において 「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAJ とは、 DN Aをプローブとして使用し、 コロニーハイブリダィゼーシヨン法、 プ ラークハイブリダィゼーシヨン法、 あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシ ヨン法等を用いることにより得られる DNAの塩基配列を意味し、 例えば、 コロ ニーあるいはプラーク由来の DN Aまたは該 DN Aの断片を固定化したフィルタ 一を用いて、 0. 7〜1. 0Mの N a C 1存在下 65°Cでハイブリダィゼーショ ンを行った後、 0. 1〜2 X S S C溶液 （1 X S S Cの組成は、 150mM塩化 ナトリウム、 1 5 mMクェン酸ナトリウム） を用い、 6 5。C条件下でフィルター を洗浄することにより同定できる D N A等を挙げることができる。
ハイブリダィゼーションは、 モレキュラークローニング第 2版等に記載されて いる方法に準じて行うことができる。
上記した D NAのホモログとしては、 配列番号 2に記載の塩基配列を有する D NAと 6 0 %以上、 好ましくは 7 0 %以上、 より好ましくは 8 0 %以上、 特に好 ましくは 9 0 %以上の相同性を有するものが挙げられる。
本発明のデヒ ドロゲナーゼをコードする D NAは、 例えば、 以下のような方法 によって単離することができる。
まず、 本発明のデヒドロゲナーゼを精製後、 N末端アミノ酸配列を解析し、 さ らに、 染色体 D NAから P C R法を用いたクローニング等の通常の遺伝子工学的 解析手法を用いて、 目的とするデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離し、 その塩基配列を解析することができる。 また、 本発明により、 その塩基配列が明 らかになつたため、 当該塩基配列を元にプライマーを設定し、 目的とする遺伝子 をクローユングすることもできるし、 D N A合成装置により合成することもでき る。
(III) 本発明の組み換えベクター及ぴ形質転換体
上記の （II) で取得された本発明のデヒドロゲナーゼをコードする D NAは、 公知の発現ベクターに揷入することにより、 デヒドロゲナーゼ発現ベクターを提 供することができる。 また、 この発現べクタ一で形質転換した形質転換体を培養 することにより、 デヒドロゲナーゼを該形質転換体から得ることができる。
本発明のデヒドロゲナーゼを発現させるための形質転換の対象となる微生物と しては、 宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、 具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
ェシエリ ヒア（Escherichia)属、 バチルス（Bacillus)属、 シユー ドモナス (Pseudomonas)属、セラチア（Serratia)属、ブレビノ クテリゥム（Brevibacterium) 属、 コ リネパクテリ ゥム（Corynebacterium)属、 ス ト レプト コ ッカ ス (Streptococcus)属、 ラタトバチルス（Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開 発されている細菌；
口ドコッカス（Rhodococcus)属、ストレプトマイセス（Streptomyces)属など宿主 ベクター系の開発されている放線菌；
サッカロマイセス (Saccharomyces)属、クライべロマイセス (Kluyveromyces)属、 シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces)属、 チゴサッカロマイセス (Zygosaccharomyces) M、 ャロ ウィ ァ (Yarrowia)属、 ト リ コ スポロ ン (Trichosporon)属、 ロ ドスポジ ジゥム (Rhodosporidium)属、 /ヽンゼヌラ (Hansenula)属、 ピキア（Pichia)属、 キャンディダ（Candida)属などの宿主べクタ 一系の開発されている酵母；
ノイロスポラ（Neurospora)属、ァスぺノレギノレス (Aspergillus)属、セファロスポ リゥム（Cephalosporium)属、トリコデルマ（Trichoderma)属などの宿主ベクター系 の開発されているカビ。
上記微生物の中で宿主として好ましくは、ェシェリヒア（Escherichia)属、バチ ルス（Bacillus)属ブレビバタテリゥム（Brevibacterium)属、 コリネパクテリゥム (Corynebacterium)属であり、 特に好ましくは、 ェシェリヒア（Escherichia)属、 コリネバクテリゥム（Corynebacterium)属である。
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築 は、 分子生物学、 生物工学、 遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準 じて行うことができる （例えば、 モレキュラークローユング第 2版などを参照)。 具体的には、 微生物中において安定に存在するプラスミ ドベクターやファージ ベクター中に本発明の D NAを導入するか、 もしくは、 直接宿主ゲノム中に本発 明の D N Aを導入し、 その遺伝情報を転写 ·翻訳させる必要がある。
このとき、 プロモーターを本発明の D NA鎖の 5， 一側上流に、 より好ましく はターミネータ一を 3， 一側下流にそれぞれ組み込むことが好ましい。 本発明で 用いることができるプロモーター及びターミネータ一としては、 宿主として利用 する微生物中において機能することが知られているプロモーター及ぴターミネ一 ターであれば特に限定されず、 これら各種微生物において利用可能なベクター、 プロモーター及びターミネータ一などに関しては、 例えば 「微生物学基礎講座 8 遺伝子工学.共立出版」、 特に酵母に関しては、 Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、 Yeast 8, 423-488 (1992)、 などに詳細に記述されている。
具体的には、 例えばェシエ リ ヒア属、 特に大腸菌ェシエリ ヒア · コ リ (Escherichia coli)においては、 プラスミドベクターとしては、 PBR、 pUC系プラ スミドが挙げられ、 lac ( 0 -ガラクトシダーゼ）、 trp (トリプトファンオペロン）、 tac、 trc (lac, tr の融合）、 ファージ P L、 PRなどに由来するプロモータ 一などが挙げられる。また、ターミネータ一としては、 trpA由来、ファージ由来、 rrnBリボソーマル R NA由来のターミネータ一などが挙げられる。
バチルス属においては、 ベクターとしては、 pUBllO系プラスミド、 pC194系プ ラスミ ドなどを挙げることができ、 また、 染色体にインテグレートすることもで きる。 プロモーター及びターミネータ一としては、 アルカリプロテアーゼ、 中性 プロテアーゼ、 α—アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネータな どが利用できる。
シユードモナス属においては、 ベクターとしては、 シユードモナス 'プチダ (Pseudomonas putida) s シユードモナス ·セ /ヽンァ Pseudomonas cepacia)なと ? 開発されている一般的な宿主ベクター系や、 トルエン化合物の分解に関与するプ ラスミド T0Lプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010などに由来する 自律的複製に必要な遺伝子を含む) PKT240を挙げることができる。
プレビパクテリゥム属、 特にブレビパクテリゥム · ラタ トフアーメンタム (Brevibacterium lactofermentum)においては、ベクターとしては、 pAJ43 (Gene 39， 281 (1985) )などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及ぴ ターミネータ一としては、 大腸菌で使用されている各種プロモーター及ぴタ ミ ネーターが利用可能である。
コ リネバタテリ ゥム属、 特にコ リネパクテリ ゥム · ダルタ ミカム (Corynebacterium glutamicum)においては、 ベクターとしては、 pCSll (特開昭
57-183799号公報）、 pCBlOl (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミ ドベクターが挙げられる。 サッカロマイセス（Saccharomyces)属、 特にサッカロマイセス .セレビジァェ (Saccharomyces cerevisiae) 【こおレヽて ίま、 ベクターとして fま、 YRp系、 YEp系、 YCp系、 Yip系プラスミドが挙げられる。 また、 アルコール脱水素酵素、 ダリセル アルデヒド一 3—リン酸脱水素酵素、 酸性フォスファターゼ、 β—ガラク トシダ ーゼ、 ホスホグリセレートキナーゼ、 エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロ モーター、 ターミネータ一が利用可能である。
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces)属においては、ベクターとしては、 Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス ·ボンべ由来のプ ラスミ ドベクターを挙げることができる。 特に、 pAUR224 は、 宝酒造から市販さ れており容易に利用できる。
ァスペルギルス（Aspergillus)属においては、 ァスペルギルス · 二ガー (Aspergillus niger) 、 ァスヘル = ルス *ォリシ一 (Aspergillus oryzae) など がカビの中で最もよく研究されており、 プラスミドゃ染色体へのインテグレーシ ョンが利用可能であり、 菌体外プロテアーゼゃアミラーゼ由来のプロモーターが 利用可能である （Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989) )。
また、 上記以外でも、 各種微生物に応じた宿主ベクター系が開発されており、 それらを適宜使用することができる。
また、 微生物以外でも、 植物、 動物において様々な宿主 ·ベクター系が開発さ れており、 特に蚕を用いた昆虫 （Nature 315, 592-594 (1985) ) や菜種、 トウモ 口コシ、 ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系及ぴ大 腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が開発さ れており、 好適に利用できる。
本発明の D N Aを有する形質転換体を培養し、 培養物から公知の方法で本発明 のデヒドロゲナーゼを単離精製することができる。 本発明の D N Aを有する形質転換体を培養する方法は、 宿主の培養に用いられ る通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、 酵母菌等の真核生物である場合、 これら微生物を培養する培地は、 該微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩 類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成 培地のレ、ずれでもよい。 培養は、 振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的 条件下で行うことが好ましく、 培養温度は通常 15〜40°Cであり、 培養時間は、 通 常 1 6時間〜 7日間である。 培養中 p Hは、 3 . 0〜9 . 0に保持する。 p Hの 調整は、 無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモ ユアなどを用いて行う。 また培養中必要に応じて、 アンピシリンゃテトラサイク リン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている RPM11640 培地 〔The Journal of the American Medical Association, 199， 519 (1967)〕、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)〕、 画 M培地 [Virology, 8， 396 (1959)〕、 199培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73， 1 (1950) ] またはこれら培地に牛胎児血清等を添 加した培地等が用いられる。 培養は、 通常 p H 6〜8、 3 0〜4 0 °C、 5 % C 02 存在下等の条件下で 1〜7日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、 ぺニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
形質転換体の培養物から、 本発明のデヒドロゲナーゼを単離精製するには、 通 常のタンパク質の単離、 精製法を用いればよい。
例えば、本発明のデヒドロゲナーゼが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、 超音波破枠機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を 破枠し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られ た上清から、 通常のタンパク質の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による 塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルァミノェチル (DEAE)セファロ ース、 DIAION HPA- 75 (三菱化学社製)等レジ を用いた陰イオン交換クロマトグラ ブイ一法、 S- Sepharose FF (フアルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換 クロマトグラフィー法、 ブチノレセファロース、 フエニノレセファロース等のレジン を用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィュテ ィークロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電 気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができ る。
また、本発明のデヒドロゲナーゼが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞を回収後破碎し、 遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、 通常の方法により該デヒドロゲナーゼを回収後、 該デヒドロゲナーゼの不溶体を タンパク質変性剤で可溶化する。 該可溶化液を、 タンパク質変性剤を含まないあ るいはタンパク質変性剤の濃度がデヒドロゲナーゼが変性しない程度に希薄な溶 液に希釈、 あるいは透析し、 該デヒドロゲナーゼを正常な立体構造に構成させた 後、 上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
(IV) 本発明のデヒドロゲナーゼを用いた N—アルキル一アミノ酸誘導体の製造 さらに本発明は、 下記一般式 （I )
Figure imgf000016_0001
(式中、 R 1は、 水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、 R 2は置 換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいァリール基を示す） で 表されるジカルポニル基含有化合物と R 3 (R 4) ΝΗ (式中、 1 3及ぴ1 4は、 そ れぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもょレ、アルキル基を示す。ただし、 R 3と R 4は共に水素原子であることはない。） で表されるアルキル置換アミン類 とを、 上記した本発明のデヒドロゲナーゼまたは形質転換体の存在下で反応させ ることを含む、 N—アルキルーァミノ酸誘導体の製造方法；及ぴ、
下記一般式 （I I) :
Figure imgf000017_0001
(式中、 R1は、 水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、 R2は置 換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいァリール基を示す） で 表されるァミノカルボン酸類と、 一般式 （I I) で表されるァミノカルボン酸類 を一般式 （ I ) ：
Figure imgf000017_0002
(式中、 R1及ぴ R2は、 一般式 （I I) における定義と同義である） で表される 化合物に変換することのできる酵素と、 R3 (R4) NH (式中、 R3及ぴ R4は、 そ れぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、 R3と R4は共に水素原子であることはない。） で表されるアルキル置換アミン類 とを、 本発明のデヒドロゲナーゼ、 ポリペプチド又は形質転換体の存在下で反応 させることを含む、 N—アルキル一ァミノ酸誘導体の製造方法に関する。
上記一般式 （I) 中の R1のアルキル基としては、 ハロゲン原子、 ァリール基 等の反応に不活性な基で置換されていていてもよい直鎖、 分岐鎖若しくは環状の アルキル基であり、 具体例としては、 メチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 ィ ソプロピル基、 トリフルォロメチル基、 ベンジル基等が挙げられる。 このうち、 好ましくは炭素数 1〜： L 0、 より好ましくは 1〜4のものである。
上記 R 1として好ましくは、 水素原子又は直鎖のアルキル基であり、 特に好ま しくは水素原子である。
上記 R 2のアルキル基としては、 ハロゲン原子、 水酸基、 ァリール基等の反応 に不活性な基で置換されていていてもよい直鎖、 分岐鎖若しくは環状のアルキル 基であり、 具体例としては、 メチル基、 ェチル基、 n—プロピノレ基、 イソプロピ ル基、 フルォロメチル基、 トリフルォロメチル基、 ヒ ドロキシメチル基、 ベンジ ル基等が挙げられる。
上記 R 2のァリール基としては、 ハロゲン原子、 水酸基、 アルキル基、 ァリー ル基等の反応に不活性な基で置換されていていてもよいァリール基であり、 具体 例としては、 フエニル基、 トリル基、 フノレオロフェニル基、 ヒドロキシフエ二ノレ 基等が挙げられる。
上記置換されていてもよいアルキル基及ぴァリール基として好ましくは炭素数 1〜 1 0のものである。
上記 R 2として好ましくは、 アルキル基、 ハロアルキル基、 ァラルキル基であ り、 このうち、 直鎖状のものが特に好ましい。
一般式 （I ) で表される化合物の好ましい具体例としては、 ピルビン酸、 ヒド ロキシピルビン酸、 フエニルピルビン酸、 β _フルォ口ピルビン酸、 2—ケトへ キサン酸、 2—ケトイソへキサン酸、 2—ォキソ酪酸、 2—ケトオクタン酸又は 2—ケト η—吉草酸が挙げられ、 特に好ましくはピルビン酸、 フエ二ルビルビン 酸、 3—フルォロピルビン酸、 2—ォキソ酪酸、 2—ケトへキサン酸又は 2—ケ ト n—吉草酸である。
一般式 （I I ) で表される化合物の好ましい具体例としては、 フエ二ルァラ二 ン、 メチォニンである。
本反応に用いられるアミン類は、 R 3 (R 4) NHで表されるものである。 ここで、 上記 R 3及び R 4として、 それぞれ独立して、 水素原子又は置換されて いてもよいアルキル基であり、 ここで、 置換されていてもよいアルキル基として は、 ハロゲン原子、 水酸基、 アミノ基、 ァリール基等の反応に不活性な基で置換 されていていてもよい直鎖、 分岐鎖若しくは環状のアルキル基である。
上記置換されていてもよいアルキル基の具体例としては、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 イソプロピル基、 フルォロメチル基、 トリフルォロメチル基、 ヒドロキシメチル基、 アミノメチル基、 ベンジル基等が挙げられ、 このうち好ま しくは直鎖状のアルキル基又はァミノアルキル基である。
また、 上記置換されていてもよいアルキル基としては、 炭素数 1〜6のものが 好ましく、 より好ましくは炭素数 1〜4のものである。
上記アミン類の好ましい具体例としては、 メチルァミン、 ェチルァミン、 n _ プロピルァミン、 イソプロピルァミン、 ジァミノメタン、 ジメチルァミン、 シク 口へキサンアミン等が挙げられ、 より好ましくは 1級のアミン類であり、 特に好 ましくはメチルァミンである。
本反応において、 反応基質であるジカルボニル基含有化合物は、 通常、 基質濃 度が 0 . 0 1〜9 0 %w/ v、 好ましくは 0 . 1〜3 0 %wZ vの範囲で用いら れる。 これらは、 反応開始時に一括して添加してもよいが、 酵素の基質阻害があ つた場合の影響を減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点か らすると、 連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
本反応において、反応基質であるァミノカルボン酸類は、通常、基質濃度が 0 . 0 1〜9 0 %wZ v、 好ましくは 0 . 1〜3 0 %wZ vの範囲で用いられる。 また、 アミン類は、 ジカルボニル基含有化合物及びアミノカルボン酸類に対し て等モル量以上、 好ましくは 1 . 5モル倍以上用いられる。 上記範囲であれば、 通常、 系内の p H及ぴコス ト等を勘案して任意に用いればよいが、 通常、 5 0モ ノレ倍量以下、 好ましくは 2 0モノレ倍以下である。
本反応において、 ジカルボニル基含有化合物及びァミノカルボン酸類に上記形 質転換体を作用させるに当たっては、 該形質転換体をそのまま、 該形質転換体を アセトン、 DM S O、 トルェン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、 凍結乾燥処理したもの、 物理的または酵素的に破碎したもの等の菌体処理物、 該 形質転換体中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、 さらには、 これらをポリアクリルアミ ドゲル、 カラギーナンゲル等に代表される 担体に固定ィヒしたものを用いることができる。
また、本反応においては、補酵素 NAD +あるいは NAD P+ (以下 NAD (P) +と略） もしくは NADHあるいは NADPH (以下 NAD (P) Hと略） を添 加するのが好ましく、 通常、 0. 00 ImM〜： L 0 OmM、 好ましくは 0. 01〜1 OmM添加する。
上記捕酵素を添加する場合には、 NAD (P) Hから生成する NAD (P) + を NAD (P) Hへの再生させることが生産効率向上のため好ましく、 上記再生 方法としては、 1) 宿主微生物自体の NAD (P) +還元能を利用する方法、 2) NAD (P) +から NAD (P) Hを生成する能力を有する微生物やその処理物、 あるいは、 グルコース脱水素酵素、 ギ酸脱水素酵素、 アルコール脱水素酵素、 ァ ミノ酸脱水素酵素、 有機酸脱水素酵素 （リンゴ酸脱水素酵素など） などの NAD (P) Hの再生に利用可能な酵素 （再生酵素） を反応系内に添加する方法、 3) 形質転換体を製造するに当たり、 NAD (P) Hの再生に利用可能な酵素である 上記再生酵素類の遺伝子を本発明の DNAと同時に宿主に導入する方法が挙げら れる。
このうち、 上記 1) の方法においては、 反応系にグルコースやエタノール、 ギ 酸などを添加する方が好ましい。
また、 上記 2) の方法においては、 上記再生酵素類を含む微生物、 該微生物菌 体をアセトン処理したもの、 凍結乾燥処理したもの、 物理的または酵素的に破砕 したもの等の菌体処理物、 該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出した もの、 さらには、 これらをポリアクリルアミ ドゲル、 カラギーナンゲル等に代表 される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。 この場合、 上記再生酵素の使用量としては、 具体的には、 本発明のデヒドロゲ ナーゼに比較して、 酵素活性で 0. 01〜100倍、 好ましくは 0. 5〜20倍 程度となるよう添加する。 また、 上記再生酵素の基質となる化合物、 例えば、 グルコース脱水素酵素を利 用する場合のグルコース、 ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、 アルコール脱 水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはィソプロパノールなど、 の添加も 必要となるが、 その添加量としては、 反応原料であるジカルボニル基含有化合物 に対して、 0 . 1〜2 0モル倍量、 好ましくは 1〜5モル倍量添加する。
また、 上記 3 ) の方法においては、 本発明の D NAと上記再生酵素類の D NA を染色体に組み込む方法、 単一のベクター中に両 D N Aを導入し、 宿主を形質転 換する方法及ぴ両 D N Aをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転 換する方法を用いることができるが、 両 D N Aをそれぞれ別個にベクターに導入 した後に宿主を形質転換する方法の場合、 両ベクター同士の不和合性を考慮して ベクターを選択する必要がある。
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、 プロモーター及びター ミネ一ターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラタ トースォペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させること' も可能である。
本反応は、 反応基質及び本発明の形質転換体並びに必要に応じて添加された各 種補酵素及ぴその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機 溶媒との混合物中で行われる。
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、 エタノーノレ、 プロパノール、 テトラヒドロフラン、 ジメチノレスノレホキシド等の水 溶性有機溶媒や酢酸ェチル、 酢酸ブチル、 トルエン、 クロ口ホルム、 n—へキサ ン等の非水溶性有機溶媒などから適宜反応基質の溶解度が高い物を使用すること ができる。
本反応は、 通常、 4〜5 0 °C、 好ましくは 1 0〜4 0 °Cの反応温度で、 通常 p H 6〜l l、 好ましくは p H 7〜： L 1で行われる。
また、 膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
さらに、 本反応において、 一般式 （I ) で表される化合物のうちカルボン酸ェ ステル類を反応原料として用いる場合には、 市販の加水分解酵素を系内に共存さ せ、系内で R1が水素原子であるカルボン酸類に変換させ引き続き、 N—アルキル ァミノ化してもよい。
また、 本反応においては、 上記一般式 （I) に対応するァミノカルボン酸類、 すなわち一般式 （I I) で表される化合物 （R2CH (NH2) COOR1) を反応 原料として用い、 一般式 （I I) で表される化合物に作用し一般式 （I) で表さ れる化合物に変換する事の出来る酵素を共存させることにより、 系内で上記一般 式 （I) で表される化合物を生成させ、 引き続き、 本デヒドロゲナーゼにより N 一アルキルアミノ化してもよレ、。
一般式 （I I) で表される化合物に作用し一般式 （I) で表される化合物に変 換する事の出来る酵素であれば特に限られないが、 具体的にはアミノ酸ォキシダ ーゼ、 アミノ酸デヒドロゲナーゼゃアミノ酸トランスフェラーゼがあげられる。 好ましくは基質特異性の広い酵素が好ましい。 具体的には Enzyme and Microbial Technology vol.31(2002) p77 - 87 に記載されている L一アミノ酸ォキシダーゼ、 シグマネ土製の D—ァミノ酸ォキシダーゼなどがあげられる。 用いられるアミノ酸 ォキシダーゼ、 アミノ酸デヒドロゲナーゼゃアミノ酸トランスフェラーゼは、 ァ ミノ酸にのみ反応するものであり、 かつ本反応で用いられる捕酵素に対応するも のを使用できると捕酵素の再生システムの代替ともなり好ましい。 すなわち、 本 反応の N—アルキルアミノ化において、 補酵素として NAD (P) Hを用いた場 合、 NAD (P) Hは本反応の N—アルキルアミノ化により NAD P +となるが、 一方で、 ァミノカルボン酸類から上記一般式 （I) で表される化合物を製造する に当たり、 この NAD P +を利用して NAD (P) Hへ変換することとなる。 ま た一般式 （I I ) で表される化合物に作用し一般式 （I) で表される化合物に変 換する事の出来る酵素がカルボン酸基に置換基のないアミノ酸のみに作用する場 合、 該ァミノカルボン酸をアミノ酸に加水分解する酵素をさらに共存させ、 該ァ ミノ酸を生成せしめた後に反応を行わせても良い。
本反応により生成する N—アルキル一アミノ酸誘導体は、 反応終了後、 反応液 中の菌体ゃタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸ェチル、 トルエンなどの有機溶媒による抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラフィー、 晶析等 のなどを適宜 aみ合わせることにより行うことができる。
以下、 実施例により本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれに限定され るものではない。 実施例
本実施例における酵素活性は下記のような方法で測定した。
測定対象となる粗酵素液にフエニルピルビン酸ナトリウム（最終濃度 15 mM)、 メチルァミン一硫酸緩衝液 ( Hl 0) (最終濃度 400mM)、 NADPH (最 終濃度 10 mM) を加え全量 50 μ Lとした。 37 °Cで 1時間反応させた。 反応 終了後、 5 μ Lの 10%トリクロ口酢酸液を加え 13000 r pm、 5分間遠心 を行つた。 遠心上清 1' 0 Lを 40 の高速液体ク口マトグラフィー （以下、 H P L Cと略記する） 溶離液で希釈し 0. 45 //mのフィルタ一で濾過後高速液 体クロマトグラフィー （以下、 HP LCと略記する） にて分析した。
HP LCの条件は
カラム： U l t r o n E S P h-CD (信和化工株式会社）
温度： 40 °C
溶離液： 20%ァセトニトリル、 80% 20mMKH2PO4、 H3P04 0. 4 m 1 /L (pH3)
流速： 0. 85 ml/min.
検出器： UV検出器 ( 210 n m)
標準サンプルとして S i gma社の試薬を用いた。
酵素の活性単位 l un i tを一分間に 1 μモルの N—メチルフエ二ルァラニンを 生成する酵素量と規定する。 実施例 1 ：酵素精製 (1- 1)
滅菌した液体培地 100ml (メチルァミン塩酸塩 5 g/L, グルコース 1 g/L, 酵母エキス 5g/L， リン酸水素二カリウム 7g/L, リン酸二水素カリウム 3g/L, 硫酸マグネシウム七水和物 0. lg/Lを含む） X 2本（50 Om 1坂口フラスコ） に、 シユードモナス プチダ ATCC 1 2633株を接種し、 28°Cで 18時 間、好気的に振とう培養した （前々培養)。 次に、 同じ組成の滅菌した液体培地 5 00ml X 4本 （2 L坂口フラスコ） に、 前々培養で得られた培養液を各 2 L坂 口フラスコに 50mlずつ接種した。 28 °Cで 8時間、 好気的条件で振とう培養 した （前培養)。 1%ポリペプトン （ナカライテスタ社製）、 0. 5%酵母エキス
(ナカライテスタ社製）、 1%塩化ナトリウム （ナカライテスタ社製） を添力 Πした 培地 （以下、 LB培地と略す） 200 Lを滅菌して、 前培養で得られた培養液 2 200m lをすベて接種し、 28 °Cで好気的に 16時間培養した（本培養）。培養 後得られた培養液を遠心分離し、 2. 5 k gの湿菌体を得た。 この菌体を、 5 L の 2 OmMトリス一塩酸バッファー （pH7. 0) に懸濁し、 超音波破砕によつ て 5. 9 Lの粗酵素液を得た。
粗酵素に対し硫安分画を行ったところ、 硫安濃度 20〜60%画分に活性があ つた。 この画分を集めて 15 Lの 20 mMトリス一塩酸バッファー（pH7. 0) で 5回透析した。 酵素液の量は 3100m lになった。
(1 -2) SuperQ-TOYOPEARL (TOSO H社製） による精製
20 mMトリス—塩酸パッファー （pH 7.0)で平衡化した SuperQ-TOYOPEARL ( T OS OH社製） 70 OmLに、硫安分画 20〜60%飽和の画分 310 OmLを供し た。 その後 20 mMトリス一塩酸バッファー （pH 7.0) 4900 m Lで洗浄を行 つた。 洗浄画分には活性が検出されなかった。
上記洗浄後、 0. 2 M塩化ナトリウムを含有する 2 OmMトリスー塩酸バッフ ァー 350 OmLで溶出した。この条件で、活性を持つタンパク質が溶出された。 さらに、 0. 5M塩化ナトリゥムを含有する 2 OmMトリス一塩酸バッファー 3 50 OmLで溶出したが、 この画分では活性が検出されなかった。
上記 0.2M塩化ナトリゥムを含有する 2 OmMトリスー塩酸バッファーで溶 出した画分を回収し、 タンパク量及び酵素活性を測定した。 活性を示した溶液 3 900mLを、 20 %飽和の硫安含有 20 mMトリス—塩酸パッファー（pH 7.0) に 12 Lで 3回透析した。 透析後の酵素液は 3000 m Lであった。
(1-3) Butyl-TOYOPEARL (T OS OH社製） による精製
上記 （ 1— 2 ) で得た酵素液 3000mLを、 20 %飽和の硫安含有 20 mM トリス一塩酸パッファー（pH 7.0)で平衡化した Butyl- T0YOPEARL (TOSO H社 製） 500 m Lに流した。 その 20 %飽和の硫安含有 20 mMトリス一塩酸バッ ファー (pH 7.0) 280 OmLで洗浄を行った。 洗浄画分のタンパク量及び酵素活 性を測定したところ、 この画分に活性が検出された。 洗浄で得た酵素液に直接硫 安を加えて、 硫安濃度が 5〜 20 %飽和の画分を取得し再び Butyl- T0Y0PEARLに 流すことにした。
(1-4) Butyl-TOYOPEARL (TOSO H社製） による 2回目の精製
得られた硫安画分の酵素液 5700mLを、 30 %飽和の硫安含有 20 mMト リス一塩酸バッファー（pH 7.0)で平衡化した Butyl- T0Y0PEARL (TOSO H社製） 50 OmLに流した。 その後、 30%飽和の硫安含有 2 OmMトリス一塩酸パッ ファー (pH 7.0) 230 OmLで洗浄を行った。 洗浄画分のタンパク量及ぴ酵素活 性を測定したところ、この画分に活性が検出された。続いて、このカラムを 15% 飽和の硫安含有 20 mMトリス一塩酸パッファー (pH 7.0)で溶出した。その結果、 溶出液にも活性が検出された。 活性を示した上記両方の画分を回収し、 60%飽和 濃度になるように 3070 gの硫安を加えて撹拌し、 濃縮した。 その結果、 酵素 液は 600 m Lとなった。 これを 20 mMトリス一塩酸バッファー（pH 7.0) 14 Lで 3回透析を行い、 得られた酵素液は 1.00 OmLになった。 (1-5) DEAE-TOYOPEARL (TOSO H社製） による精製
上記 （1—4) において透析して得た酵素液 100 OmLを、 20 mMトリス —塩酸バッファー（pH 7.0) で平衡化した DEAE- T0Y0PEA L (TO SO H社製） 6 0 OmLに供した。 その後、 2 OmMトリス一塩酸バッファー（pH 7.0) 4000 mLで洗浄を行った。 洗浄画分には活性がみられなかった。 続いて 0. 1Mの塩 化ナトリゥムを含有する 2 OmMトリスー塩酸バッファー（pH 7.0) 250 OmL で溶出した。 その結果、 この画分にほとんど活性が検出されなかった。 次に、 塩 化ナトリウム濃度が 0. 1〜0. 3Mとなるようにグラジェントをかけてタンパ クを溶出した。 酵素活性を有する画分を回収したところ、 1 700mLの酵素液 が得られた。この酵素液に.760 gの硫安を加えて撹拌し、濃縮した。その結果、 酵素液は 6 OmLになった。 これを 2 OmMトリス'一塩酸バッファー（pH 7.0) 8 Lで 2回透析を行った。 透析後、 酵素液は 10 OmLになった。
(1-6) Green-sepharose CL- 4Bによる精製
市販の膨潤 SepharoseCL-4Bゲル 150mlをガラスフィルタ一上にとり、 1 Lの蒸 留水を用いて吸引洗浄した。 これを 2 L坂口フラスコに移した。 これに、 150mL の水に溶かした Reactive Green 19 (Sigma社製） 0.75 g (7.5mg色素 ZmLゲル の割合）を加えた。 さらに 22 %塩化ナトリゥム水溶液 15mL (最終濃度：約 2%) を加え、 ゲルと色素がよく混ざり合う程度で、約 30分間振とう撹拌した。 1. 5 gの結晶炭酸ナトリゥムを加えて、 50°Cで一晩振とう撹拌した。 反応終了後、 ゲル懸濁液をガラスフィルターに移し、水 （約 1. 5 L)、 1M塩化ナトリウム水 溶液 （約 1. 5 L)、 水 （約 3 L) の順序で、 ろ液の着色が見られなくなるまで色 素ゲルを洗浄し、 Green- sepharose CL- 4Bを調製した。
上記方法で調製した Green sepharose CL-4B 450mLを 20 mMトリスー 塩酸パッファー（pH 7.0)で平衡化した後に上記 （ 1— 5 ) で得た酵素液 100m Lを流した。
その後、 2 OmMトリス一塩酸バッファー（pH 7.0) 300 OmLで洗浄を行つ た。 洗浄画分には、 上記 （1— 5) で得られた酵素液のトータル活性の 1 5%ほ どの活性が検出された。 次に、 塩ィ匕ナトリウム濃度が 0〜3Mになるようにダラ ジェントをかけてタンパクを溶出した。酵素活性を有する画分を回収したところ、 23 lmLの酵素液が得られた。 これに、 70%飽和濃度になるように硫安を 10 9 g加えてタンパクを沈殿させた。 沈殿を 2 OmMトリス一塩酸バッファー（pH 7.0) 3 m Lに懸濁し、 20 %飽和の硫安含有 20 mMトリス一塩酸バッファー（PH 7.0) 9 Lで 8時間透析した。 透析後、 チューブ内に沈殿物が見られたため、 透析 と同じバッファー 8. 5 mLを加えて懸濁した。 この操作でも沈殿物が溶解しな かったため、 遠心して沈殿物と上清を分離した。 活性がほとんど上清の方にみら れたため、 上清 13 m Lを RESOURCE PHE (アマシャムバイオサイエンス社製） で 精製した。 20 mLの 200 /。飽和の硫安含有 20 mMトリス—塩酸バッファー（pH 7.0)と 20 mLの 20 mMトリス一塩酸バッファー（pH 7.0)でグラジェントをかけ てタンパクを溶出した。
回収した酵素液 1 9 mLを限外濾過で 5m Lまで濃縮した後に、 20 mMトリ ス一塩酸バッファー（pH 7.0)で透析したところ、 酵素液は 6. 5 m Lになった。
(1 -7) Blue-sepharose 4B (アマシャムバイオサイエンス社製） による精製 Blue— sepharose 4B (アマシャムバイオサイエンス社製） 5mLを 20mMト リス一塩酸バッファー (pH 7.0)で平衡化した後に上記 （1— 6) で得られた酵素 液 6. 5mLを流した。 その後、 2 OmMトリス一塩酸バッファー（pH 7.0) 50 mLで洗浄を行った。さらに、 50 mLの 1M塩化ナトリゥム水溶液と 50mLの 20mM トリス一塩酸バッファー（pH 7.0)で、 塩ィヒナトリウム濃度が 0〜1Mとなるよう にグラジェントをかけ活性画分を溶出させた。
上記 （1一 1) 〜 （1一 7) の各精製ステップにおける酵素画分の比活性等を 表 1にまとめる。 表 1
Figure imgf000028_0001
実施例 2 ： SDS— PAGEおよび部分アミノ酸配列の解析
各酵素精製ステップのサンプルをすベて SDS—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動した。
精製と共に量の増加が見られる約 35〜40 kD aを通常の方法で切り出し、 プロテインシーケンサ一により、 ェドマン法によるアミノ酸配列の解析を行い、 N末端のァミノ酸配列を決定した。 該配列を配列表の配列番号 3で示す。
BLASTサーチにより、 リンゴ酸デヒドロゲナーゼと相同性が高い蛋白であ ることが示唆された。 実施例 3 ：酵素遺伝子のクローニング
シュ一ドモナス ·プチダ （Pseudomonas put i da) ATC C 12633株を LB 培地で培養し得られた菌体より DNeasy Tissue Kit (Qiagen社製）を用いて、 染色 体 DNAを調製した。 実施例 2で決定された N末端アミノ酸配列及ぴ B LASTサーチで見出された アミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を元にプライマーを合成した。 それぞれの塩 基配列を、 配列表の配列番号 4 (NMPDHf)及ぴ 5 ( MPDHrl) に示す。
シユードモナス.プチダ ATCC 1 2633株の染色体 DNAを铸型とし、 NMPDHf、 NMPDHrlをプライマーとして、 PCR(98°C， 20秒、 68°C， 3分）を 30サイクル行い、 特異的な増幅サンプルを得た。
上記で得られた DNA断片を常法に従い、 クローユングベクター p ET 21 a (宝酒造社製） ) に導入した。 （このプラスミドを pENMadhとする）
次に大腸菌 （Escherichia coli) BL21 (DE3) (Novagen社） を形質転換した。 形質転換株をアンピシリン （100 / g/mL) を含む LB培地プレート （LB培地 + 2%寒天） 上で 37°Cで生育させた。 出現したいくつかの白いコロニーを培養 しプラスミドの抽出を通常の条件で行った。 とれたプラスミドを制限酵素 Nd e Iおよび H i n dillで切断後 (37°Cで 3時間）、 目的 DNA断片がプラスミド に挿入されているかァガロース電気泳動で確認した。
目的とする DN A断片が挿入されていると考えられるコロニーをアンピシリン を含む液体 L B培地で培養し、 培養 14時間目に I P T Gを 0. 1 mMとなるよ うに添加しさらに培養を 3時間続けて、 集菌した。 菌体を超音波破碎し粗酵素を 得た。
得られた粗酵素の活性測定を行つて目的蛋白の発現を確認した。
目的断片が入ったコ口ニーから得られた粗酵素を用いると N—メチル一フエ二 ルァラニンの生成が確認され、 プラスミドのみで形質転換した菌体破碎物では N ーメチルーフエ二ルァラニン生成が見られなかった。
活性確認されたプラスミド中の挿入断片の塩基配列を解析した。 該遺伝子の塩 基配列を配列表の配列番号 2に、 該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配 列を配列表の配列番号 1に示す。 実施例 4 ：形質転換体の無細胞抽出液を用いた N—メチルーフヱ二ルァラニンの 合成
LB培地 5 mLを試験管に入れて 121°Cで 20分間蒸気殺菌し、 室温になつ てから 10 Omg/m 1 アンピシリン水溶液を 5 μ L加えた。 これに実施例 3で 得られた大腸菌クロ一ン株のコロニーを無菌的に白金耳で接種して、 37°Cで 2 4時間振とう培養した（前培養)。次に LB培地 5 OmLを 50 OmLの坂ロフラ スコに入れて殺菌し、室温になつてから 10 Omg/m 1アンピシリン水溶液を 5 O L力！]えた。 これに前培養で得られた大腸菌クローン株の培養液 0. 5mLを 接種して、 37でで 10時間振とう培養した。 この段階で 1 Mの I P T G水溶液 を 50 μ Ι^加え、 さらに 37°Cで 3時間振とう培養した。 培養後、 遠心分離によ り菌体を集め、 2 OmMトリス一塩酸緩衝液 (pH 7. 0) で 2回洗浄した。 得 られた菌体 0. 37 gを 20mM トリスー塩酸緩衝液 （pH 7. 0) 8. 0 m Lに懸濁し、 超音波で菌体を破碎した。 遠心分離により菌体断片を除き、 8. 0 m Lの無細胞抽出液を得た。
5 OmLのビーカーに、 フエ二ノレピノレビン酸ナトリウム 6 Omg、 NAD PH 2. 3m g、 グルコース脱水素酵素 35 U、 グルコース 1 gを含有する 40 mM トリスー塩酸緩衝液 (pH 8. 0) 5. 88m lに、 硫酸で pH 8. 0に調整 した 240 mMメチルァミンを 5 · 88 m L、 上記無細胞抽出液 3. 25mLを 入れ、 30°Cで反応を行った。 反応は 1規定の水酸化ナトリゥム水溶液で p Hを 8. 0に調整しながら、 撹拌しつつ行った。 反応液の一部を定期的に HP で 分析し、 基質のフ 二ルビルビン酸ナトリウムが枯渴している場合には、 さらに 3 Omgを追加して反応を継続させた。 この操作を 8回繰り返しつつ、 24時間 反応した。 反応終了後の N—メチルフエ二ルァラニンの生成量は 146mgであ つに o 実施例 5 ：形質転換体からの酵素精製
LB培地 5m Lを試験管に入れて 121°Cで 20分間蒸気殺菌し、 室温になつ てから l O Omg/ra l アンピシリン水溶液を 5 L加えた。 これに実施例 3で 得られた大腸菌クローン株のコロニーを無菌的に白金耳で接種して、 37°Cで 2 4時間振とう培養した（前培養）。次に LB培地 50 OmLを 2 Lの坂口フラスコ に入れて殺菌し、 室温になつてから 10 Omg/m 1 アンピシリン水溶液を 50 O ^ L加えた。 これらに前培養で得られた大腸菌クローン株の培養液 0. 5mL を接種して、 37 °Cで 14時間振とう培養した。 この段階で 1 Mの I P T G水溶 液を 500 μ L加え、 さらに 37 °Cで 3時間振とう培養した。 培養後、 遠心分離 により菌体を集め、 20 mMトリス一塩酸緩衝液 (pH 7. 0 )で 2回洗浄した。 得られた菌体 3. 3 gを 20mM トリスー塩酸緩衝液 (pH 7. 0) 28mL に懸濁し（全量 30m l)、超音波で菌体を破砕した。遠心分離により菌体断片を 除き、 29 m Lの無細胞抽出液を得た。 次に実施例 1で用いた Green sepharose CL-4Bを用いて精製を行った。
Green sepharose CL-4B (樹脂 100m l量） をトリス塩酸バッファー（pH 7.0) で平衡化した後に上記無細胞抽出液を流した。
その後、 2 OmMトリス一塩酸バッファー（pH 7.0) 80 OmLで洗浄を行った。 洗浄画分には、 次に、 塩化ナトリウム濃度が 0〜1Mになるようにグラジェント をかけてタンパクを溶出した。 酵素活性を有する画分を回収し、 これを Centriprep (アマシャムバイオサイエンス社製） で濃縮した。 これを 2 OmMト リス一塩酸バッファー (pH 7.0)で 8時間透析した。 透析後、 酵素液量は 59m l となった。
次に DEAE-TOYOPEARL (TOSOH社製） による精製を行った。
上記の透析して得た酵素液を、 20 mMトリス一塩酸バッファー (pH 7.0)で平 衡化した DEAE- TOYOPEARL (TO S OH社製） （樹脂 6 OmL)に供した。その後、 2 OmMトリスー塩酸バッファー（pH 7.0) 50 OmLで洗浄を行った。 次に、 塩 化ナトリゥム濃度が 0〜0. 35 Mとなるようにグラジェントをかけてタンパク を溶出した。 酵素活性を有する画分を回収し、 Centriprep (アマシャムバイオサ ィエンス社製） で濃縮した後、 2 OmMトリス一塩酸バッファー (PH 7.0)に対し て透析を行った。 透析後、 酵素液は 6た になった。 上記の各精製ステップにおける酵素画分の比活性比を表 2にまとめる 表 2
Figure imgf000032_0001
実施例 6 ：本酵素の基質特異性
実施例 5と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これに表 3に示す各種ケト酸を最終濃度 10mM、 NADPHを最終濃度 0.2mM、 硫酸で p HI 0に調整したメチルァミンを最終濃度 6 OmM となるように加えた反 応液の 340 n mの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。 測定 時の反応温度は 3 7°Cにした。 —フエ二ルビルビン酸を基質としたときを 100%として相対活性の結果を表 3に示した。 表 3
相対活性
フエ二ノレピノレビン酸 100%
ピゾレビン酸 334 %
2—ケトへキサン酸 174 %
2—ケト酪酸 98%
β—フルォロピルビン酸 90%
2—ケト— η—吉草酸 53%
ケトロイシン 30%
2— ketooctanoic acid .25% 実施例 7 ：至適 pHの測定
実施例 5と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これに /3—フエニルピルビン酸を最終濃度 10mM、 NADPHを最終濃度 0.2mM、 硫酸で各 p Hに調整したメチルァミンを最終濃度 6 OmM となるように加えた反応 液の 340 nmの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。 測定時 の反応温度は 37°Cにした。 一分間に 1マイクロモルの /3—フエ二ルビルビン酸 と反応する酵素量を 1 u n i tととして蛋白量あたりの u n i t数 （uZmg) と p Hの関係の結果を図 1に示した。 反応の至適 pHは 10.0であった。 実施例 8 ：酵素の作用至適温度
実施例 6と同様な反応条件のうちメチルァミン一硫酸 （pHI O) にして、 温 度だけを変化させて活性を測定した。結果を図 2に示す。至適温度は 30〜40°C であった。 実施例 9 ： pH安定性
実施例 5で得られた精製酵素を、 緩衝液を用いて： Hを変化させて 30°Cで 30 分間インキュベートし、 残存活性を測定した。 反応条件は実施例 7と同様にメチ ルァミン—硫酸（pH 10)、 37°Cで行った。 結果は、未処理の活性を 100と した残存活性で表し、 図 3に示した。 本発明による酵素は、 pH6〜9において 最も安定であった。 実施例 10 ：酵素の温度安定性
実施例 5で得られた精製酵素を 25 °C、 30°C、 35°C、 40°C、 ^45°Cおよ ぴ 50°Cの温度で 30分間放置した後、 実施例 7と同様に活性を測定した。 結果 は、 未処理 （氷中放置） の活性を 100とした残存活性で表し、 図 4に示した。 本発明による酵素は、 30 °Cまで 100 %の残存活性を示した。 実施例 11 ： NADHを補酵素とした場合の本酵素の基質特異性 実施例 5と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これに表 4に示す各種ケト酸を最終濃度 40mM (但し j3—フエ二ルビルビン酸は 30mM)、 NADHを最終濃度 0.3mM、 bis- Tr is propane緩衝液 （ρΗΙΟ.Ο) を最終 濃度 100mM、 メチルァミンを最終濃度 180mMとなるように加えた反応液の 340 nmの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。 測定時の反応温度 は 37 °Cにした。 ピルビン酸を基質としたときを 100%として相対活性の結果を 表 4に示した。 表 4
Figure imgf000034_0001
実施例 12 ： NADHを補酵素とした場合の至適 ρΗの測定
実施例 5と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これにピルビン酸を最終濃度 80mM、 NADHを最終濃度 0.3mM、 硫酸で各 pH に調整したメチルァミンを最終濃度 180mMとなるように加えた反応液の 340 η mの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。 測定時の反応温度は 37°Cにした。 一分間に 1マイクロモルのピルビン酸と反応する酵素量を 1 un i tととして蛋白量あたりの u n i t数 （uZmg) と pHの関係の結果を図 5 に示した。 反応の至適 pHは 9.5であった。 実施例 13 ： NADを補酵素とした場合の逆反応の検討
実施例 5と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
N—メチル -L-ァラニンを最終濃度 50mM、 NADを最終濃度 10mM、 bis- Tris propane緩衝液 ( ΗΙΟ.0) を最終濃度 lOOmMとなるように加えた反応液の 34 0 nmの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。 測定時の反応温 度は 37°Cにした。 活性は 7.8X10-3 (uZmg蛋白） であった。 実施例 14 ： NAD PHを補酵素とした場合の本酵素の基質特異性
実施例 5と同様な方法で大腸菌クローン株より精製本酵素を得た。
これに表 5に示す各種ァミン類を最終濃度 60mM、 N AD P Hを最終濃度 0.2mM、 ]3—フエ二ルビルビン酸を最終濃度 10mM となるように加えた反応液の 340 η mの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。 測定時の反応温度は 37でにした。 メチルァミンを基質としたときを 100%として相対活性の結果を 表 5に示した。 表 5
Figure imgf000035_0001
実施例 15 ：枯草菌からの DNAの精製
枯草菌 （Bacillus subtilis株） を LB培地上で培養し、 菌体を調製した。 菌体 から染色体 DNAの調製は Qiagen kit (Qiagen社製）を用い、 付属マニュアル記載 の方法により行った。 実施例 16 ：枯草菌からのグルコース脱水素酵素遺伝子のクローニング
NADPHの再生を行わせるために、 文献 （J.Bacteriol.166,238- 243(1986)) 記載 の枯草菌由来グルコース脱水素酵素 （以下 GDHと略す） 遺伝子のクローニングを 行った。 文献記載の塩基配列を元に、 GDH遺伝子のオープンリーディングフレー ム部分ののみを PCRクローニングするため構造遺伝子の 5-末、 3' -末の配列を元 にプライマー BsuG_S (配列番号 6 )、 BsuG— A (配列番号 7 )を合成した。 実施例 1 7により調製した枯草菌染色体 DNAを铸型として PCR (94° (、 30秒、 54°C、 30秒、 72°C1分）を 30サイクル行レヽ、特異的な増幅 DNAを得た。得られた DNA断片を EcoRI と Hindlllの 2種類の制限酵素で消化した。プラスミドベクター pKK223- 3 (アマシ ャムーファルマシァ社製）を EcoRIと Hindlllで消化し、上記 PCR増幅 DNA断片を T4DNAリガーゼで連結し、 KK223-3GDHを得た。挿入断片の塩基配列解析を行った 結果、 データベース（DDBJ AccessionNo. M12276)に収録されている塩基配列と全 て一致した。 得られた GDH遺伝子の塩基配列を配列番号 8に示す。 実施例 1 7 ： pE Madh [pET21aに本デヒドロゲナーゼの DNA断片を挿入したプラ スミド]と共発現できる G D Hプラスミド pSTV28- GDHの構築
実施例 1 6で構築した pKK223- 3GDHを り RI、 Pstlの 2種類の制限酵素で消化 し、枯草菌 GDH遺伝子を含む断片を調製した。プラスミドベクター pSTV28 (TAKARA 社製）を oRI、 Pstlで消化し、 上記 GDHを含む断片を T4DNAリガーゼで連結し、 PSTV28-GDHを得た。 実施例 1 8 ：枯草菌由来 GDHと本デヒドロゲナーゼの大腸菌における共発現 pENMadh を保持する大腸菌 BL21 (DE3) クローン株を pSTV28- GDHで形質転換し た。組み換え大腸菌を lOOug/raLのアンピシリン、 25ug/mLのクロラムフエニコー ルを含む液体 LB培地に植菌し 1 7時間培養した後、 ImM IPTGを添カ卩し、 さらに 3時間培養した。 集菌後、 20mM Tris- HCL (pH7. 0) にて懸濁し、 超音波破碎によ つて得られた細胞粗抽出液の酵素活性を測定した。
( 1 ) 本デヒドロゲナーゼ活性の測定
本デヒ ドロゲナーゼ活性の測定は lOOmMbis- trispropaneバッファー（pH10. 0)、 0. 2mM NADPH, 30mM methylamine, lOmMピルビン酸ナ小リゥムを含む反応液で 30°C で行った。 1Uは上記反応条件で 1分間に 1/xmolの NADPHを酸化する酵素量とし た。 結果、 6.6U/mg蛋白であった。
(2) グルコース脱水素酵素活性の測定
粗酵素 10 μ 1にグルコースを最終濃度 100mM、 NADPを最終濃度 2mM、 ト リス塩酸緩衝液 ( H9.0) を最終濃度 100raM、 となるように加えた反応液 1 m 1 の 340 n mの吸光度の変化を調べることにより酵素活性を測定した。 測定時の 反応温度は 30°Cにした。 一分間に 1マイクロモルのグルコースと反応する酵素 量を 1 u n i tととして蛋白量あたりの u n i t数（u/mg)を求めた。結果、 lmg蛋白あたり 3.4Uであった。 実施例 19 ： グルコース脱水素酵素共発現形質転換体を用いた N—メチルーフエ 二ルァラニンの合成
実施例 18で得られた大腸菌を実施例 17と同様に培養し培養液 100 m 1を 得た。培養後、遠心分離により菌体を集め、 0.85%の食塩を含む 20 mMトリス— 塩酸緩衝液 ( H 7. 0) 40m 1で 2回洗浄休止菌体を得た。
得られた休止菌体に最終濃度 lOOmMのフエ二ルビルビン酸ナトリゥム、 最終濃 度 0.2mMの NADP最終濃度 lOOmMのグルコース、 およぴ最終濃度 700mMのメ チルァミン一塩酸（pH 9)を含む反応液を加え菌体の濁度を 20 (660 nm の吸光 度） となるようにした。 30°Cで攪拌しながら反応を行った。 反応は 10規定の 水酸化ナトリウム水溶液で pHを 8〜9に調整しながら、 撹拌しつつ行った。 2 4時間反応後の N—メチルフェニルァラニンの生成量は 13.4g/Lであった （反応 収率 75%)。 実施例 20 ： D—アミノ酸ォキシダーゼとの共反応 （1)
実施例 10と同様な方法で大腸菌クローン株の精製本酵素を得た。
これに最終濃度 50mMとなるように D—フエ二ルァラニン、また NADPHを最 終濃度 10mM、 硫酸で Hを 10にあわせたメチルァミンを最終濃度 6 OmM、 トリ ス塩酸緩衝液 (pH9) を最終濃度 lOOmM となるように加えた反応液 100 1 に D—アミノ酸ォキシダーゼ （シグマ社製 porcine kidney由来） を 0.052unit 加えた。 このとき反応液中の本酵素の蛋白量は 26. となるようにした。 測定時の反応温度は 30でにした。
900分後反応液にトリクロ口酢酸を最終濃度 2 %となるように 25 μ 1 添カロ し反応を終了させた。 反応液を下記条件の HPLCで分析した。
カラム： ODSカラム UK- C18 250 x 4.6mm (imtakt社製）
溶離液：水 100 %
流速： 0.5ml/min
温度： 40°C
検出： UV 21 Onm
測定の結果 N—メチルフエニルァラ二ンが 0.46g/L生成されていた。 残存するフ ェニルァラニンは 1.06g/Lであった。
実施例 21 ： D—アミノ酸ォキシダーゼとの共反応 （2)
フエ二ルァラニンを用いる代わりに D—メチォニンを用いた以外は実施例 20 と同様に行った。 HPLCのクロマトグラムを図 6に示す。 HPLCのリテンシ ヨンタイムはメチォニンが 10. 6分であるが 14. 1分にピークが反応と共に 生成されており N—メチルメチォニンと推測された。 そこで同分析カラムを用い て下記の条件の LC— ma s sにかけた。 マススペクトルの結果を図 7に示す。 N—メチルメチォニンと推定されたピークの分子量は 163となり、 N—メチル メチォニンの分子量と一致した。
L C— m a s s条件
装置： Waters 2690型セパレーシヨンモジュール および micromass ZM D型質量分析計
カラム： ODSカラム UK- C18 250 x 4.6mm (imtakt社製）
溶離液：水 100 % 流速： 0.5ml/min
温度： 40。C
検出： UV2 1 Onm
イオン化法：エレクトロスプレ一^ Γオン化法 (E S I ) 正イオン検出 質量走査条件： m/z60- 500 lsec
印可電圧： 3. 6 k V
コーン電圧： 1 0V 実施例 22 ： L—フエ二ルァラニンデヒドロゲナーゼとの共反応
D—アミノ酸ォキシダーゼの代わりに L一フエ二ルァラニンデヒドロゲナーゼ (シグマ社製）、および D—フエニルァラ二ンの代わりに L—フエニルァラニンを 用いる以外は実施例 20と同様に反応を行った。
結果 N -メチルフェニルァラニンが 0.21g/L生成されていた。 また残存する L
—フエ二ルァラニンは 2.75g/Lであった。 実施例 23 ：
実施例 1 0と同様な方法で大腸菌クローン株の精製本酵素を得た。
本酵素の蛋白量 1 4 μβに最終濃度 30mMとなるようにメチルピルビン酸、また NAD PHを最終濃度 10mM、硫酸で pHを 1 0にあわせたメチルァミンを最終濃 度 60mM、 リン緩衝液 (pH7) を最終濃度 lOOmMとなるように加えた反応液 1 0 0 μ 1 を反応温度 30。Cで 4時間反応させた。 反応終了後下記の条件の H P L C で分析を行った。
カラム： CH I RALPAK WH 250 x 4.6mm (ダイセル社製）
溶離液： 2mM CuS04
Vi ： 0.5ml/min
温度： 50 °C
検出： UV 254nm 結果 N—メチルァラニンが 0 . lg/L生成されていた。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 公知のデヒドロゲナーゼとは異なる性質を有する新規なデヒ ドロゲナーゼが提供される。 本発明のデヒドロゲナーゼを用いることにより、 医 薬あるいは農薬の中間原料として有用な N—アルキルアミノ酸を製造することが できる。

Claims

請求の範囲
1. 以下の理化学的性質を有するデヒドロゲナーゼ。
(1) 作用： NAD PHおよび Z又は NADHを補酵素としてピルビン酸とァ ルキルアミン又はジアルキルアミンから N—アルキル一 L—ァラニンを生成す る；
( 2 ) 基質特異性：アルキルァミン又はジアルキルァミンに対して活性を示す がアンモニアには活性を示さない；
(3) フエ二ルビルビン酸とメチルァミンとを基質とした場合の至適 pHが 1 0付近；及ぴ、
(4) 30°Cで 30分処理したときの酵素が安定である pHが 5〜10. 5付 近：
2. 下記の何れかのポリぺプチド。
(1) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
( 2 ) 配列番号 1で表されるァミノ酸配列において 1から複数個のァミノ酸が欠 失、 置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を有し、 デヒドロゲナーゼ活性を有 するポリべプチド；又は
(3) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 50%以上の相同性を有するァミノ 酸配列を有し、 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
3. 請求項 2に記載のポリぺプチドをコードする D N A。
4. 下記の何れかの DNA。
( 1 ) 配列番号 2で表される塩基配列を有する D N A；
(2) 配列番号 2で表される塩基配列において 1から複数個の塩基が欠失、 置換 及び/又は付加された塩基配列を有し、 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプ チドをコ一ドする DNA；又は
( 3 ) 配列番号 2で表される塩基配列を有する D N Aとストリンジュントな条件 下 ハイプリダイズし、 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードす る DNA：
5. 請求項 3又は 4に記載の. DN Aを有する組み換えべクター。
6. 請求項 3又は 4に記載の D N Aあるいは請求項 5記載の組換えべクタ ' を有する形質転換体。
7. 下記一般式 （I)
Figure imgf000042_0001
(式中、 R1は、 水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、 R2は置 換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいァリ一ル基を示す） で 表されるジカルボニル基含有化合物と R3 (R4) ΝΗ (式中、 1 3及ぴ1 4は、 そ れぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ただし、 R3と R4は共に水素原子であることはない。） で表されるアルキル置換アミン類 とを、 請求項 1に記載のデヒドロゲナーゼ、 請求項 2に記載のポリペプチド又は 請求項 6に記載の形質転換体の存在下で反応させることを含む、 Ν—アルキル一 アミノ酸誘導体の製造方法。
8. R1が水素原子である、 請求項 7に記載の製造方法。
9. R3がァミノ基で置換されていてもよい C 1〜C 6の直鎖、 分岐鎖若し くは環状のアルキル基であり、 R 4が水素原子である、 請求項 7又は 8に記載の 製造方法。
10. 式 （I) で表されるジカルボニル基含有化合物が、 ピルビン酸、 フエ 二ルビルビン酸、 /3—フルォロピルビン酸、 2—ォキソ酪酸、 2—ケトへキサン 酸又は 2—ケト n—吉草酸である、請求項 7から 9のいずれかに記載の製造方法。
1 1. 下記一般式 （I I) :
Figure imgf000043_0001
(式中、 R1は、 水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示し、 R2は置 換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいァリ一ル基を示す） で 表されるァミノカルボン酸類と、 一般式 （I I) で表されるァミノカルボン酸類 を一般式 （ I ) ：
Figure imgf000043_0002
(式中、 R1及ぴ R2は、 一般式 （I I) における定義と同義である） で表される 化合物に変換することのできる酵素と、 R3 (R4) NH (式中、 R3及ぴ R4は、 そ れぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよいァルキル基を示す。ただし、 R3と R4は共に水素原子であることはない。） で表されるアルキル置換アミン類 とを、 請求項 1に記載のデヒドロゲナーゼ、 請求項 2に記載のポリぺプチド又は 請求項 6に記載の形質転換体の存在下で反応させることを含む、 N—アルキル一 アミノ酸誘導体の製造方法。
12. R3がァミノ基で置換されていてもよい C 1〜C 6の直鎖、分岐鎖若し くは環状のアルキル基であり、 R4が水素原子である、請求項 1 1に記載の製造方 法。
13. —般式 （I I) で表されるアミノカルボン酸類が、 フエ二ルァラニン またはメチォニンである、 請求項 1 1又は 12に記載の製造方法。
14. 式 （I I) で表されるアミノカルボン酸類を式 （I) で表されるアル キル置換アミン類に変換することのできる酵素が、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、 L—アミノ酸ォキシダーゼ、 D—アミノ酸デヒドロゲナーゼ、 L一アミノ酸デヒ ドロゲ^ "一ゼ、 アミノ酸トランスフェラーゼである、 請求項 1 1から 1 3のいず れかに記載の製造方法。
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