WO2003072604A1

WO2003072604A1 - Peptide inhibiteur du nfat transmembranaire

Info

Publication number: WO2003072604A1
Application number: PCT/JP2003/002106
Authority: WO
Inventors: Hideki Matsui; Masayuki Matsushita
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2003-09-04
Also published as: EP1486507A4; CN1303103C; JP3761476B2; KR20040099290A; US20050096267A1; DE60334194D1; US7659249B2; US7160863B2; JP2003252898A; EP1486507B1; AU2003211322A1; EP1486507A1; KR100863626B1; US20070093427A1; CN1639190A

Description

明糸田書膜透過型 N F A T阻害べプチド技術分野

本発明は、生体膜通過シグナル配列を含有する新規べプチド化合物に関する。さらに本発明は、数残基のアルギニンと V I V I Tからなる N F A T活性化の阻害剤、免疫抑制剤および心肥大抑制剤に関する。背景技術

従来より、移植手術後の拒絶反応ゃァトピー性皮膚炎などの免疫疾患に対して、様々な化合物が免疫抑制剤として使用されている。たとえば、シクロスポリン A (C y s A) および F K 5 0 6は周知の免疫抑制剤であるが、それらを動物に投与した場合には腎機能低下、高血圧、インスリン分泌量の低下または神経毒性などの副作用が生じることも知られている。また、 C y s Aや F K 5 0 6以外の免疫抑制剤についても、様々な副作用が生じることが調べられており、副作用のより少ない免疫抑制剤が切に望まれてきた。

現在では、前記合成化合物による治療のほか、外来遺伝子を含有するべクタ一を人間に投与するという遺伝子治療が注目を集めており、様々な疾患に関して臨床段階での検討が行われている。しかしながら、遺伝子治療に用いられるベクターには、たとえば、ベクタ一を人間に投与した場合の細胞内への導入効率、投与からタンパク質発現までに必要な期間および副作用など、解決されるべき問題が多く残されている。また、種々のべプチド製剤なども検討されているが、現時点では臨床で使用されているものはない。心肥大は、遺伝的背景または圧負荷などによって心臓が通常より大きくなった状態であり、心不全につながる可能性がある。しかしながら、心肥犬に対し、その進行を防ぐまたはその退縮を促進するといつた心肥大抑制剤は、現在のところ市販されていない。これは、現在知られる心肥大抑制剤が強い副作用を有するため、実際にヒトに適用することができないからである。したがって、心肥大を抑制または改善し、かつ副作用などの問題のない薬剤が切望されている。

発明の開示

本発明の課題は前記のような従来の問題点を解消することであり、投与してから実際に効果を発揮するまでの期間が短く、副作用や抗原性のないペプチド化合物を提供することである。本発明はとくに、免疫疾患および心肥大に対する治療剤を提供することを目的とする。また本発明は、 N F AT活性化の阻害剤をも提供する。

アルギニン 9残基〜 1 3残基、とくにアルギニン 1 1残基からなるぺプチドが、生体膜通過シグナル配列として非常に有効であることを特願 2 0 0 0 - 3 5 8 4 4 2に開示した。そして、さらに検討を重ねた結果、アルギニン 9残基〜 1 3残基と核内 T細胞活性化因子（Nuc lear Factor Act iv ated T cel l) N F A Tの活性阻害ペプチドとを融合したペプチド化合物をインビポ系で用いた場合に、優れた免疫抑制効果が得られることを初めて見出した。そのうえ、該ペプチドを心肥大のラットに投与した場合には、心肥大の症状が極めて良好に改善されることも見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、アルギニン 9残基〜 1 3残基および配列番号 1のァミノ酸配列を含有するべプチド化合物に関する。

本発明は、アルギニン 9残基〜 1 3残基および配列番号 1のアミノ酸配列を含有するぺプチド化合物からなる N F A T活性化の阻害剤に関する。また、本発明は、アルギニン 9残基〜 13残基および配列番号 1のアミノ酸配列を含有するぺプチド化合物を有効成分とする免疫抑制剤に関する。さらに、本発明は、アルギニン 9残基〜 13残基および配列番号 1のァミノ酸配列を含有するべプチド化合物を有効成分とする心肥大抑制剤に関する。図面の簡単な説明

図 1は、 11R— V IVI T、 FK506および 11 R— VEETを各濃度で添加して培養した細胞における I L一 2遺伝子の転写量を示すダラフである。縦軸は、 GAPDHに対する I L一 2遺伝子の相対 RNA量を表す。

図 2は、 10%ゥシ胎仔血清含有 RPMI培地のみで 60時間培養したジャーカット細胞、 11R— V I V I T添加後 13時間、 18時間、 24 時間、 36時間および 60時間培養したジャーカツト細胞および FK 50 6添加後 60時間培養したジャーカツト細胞における I L一 2遺伝子の転写量を示すグラフである。縦軸は、 GAPDHに対する I L— 2遺伝子の相対 RN A量を表す。

図 3は、リンパ球混合試験において、細胞に取り込まれた [³H] Td Rの放射活性を示すグラフである。

図 4は、 11 R— VIV I T、 FK506および 11 R— VEETを投与したマウスから得られた細胞を用いたリンパ球混合試験において、細胞に取り込まれた [³H] TdRの放射活性を示すグラフである。

図 5は、移植したベータ細胞の生存率を力プランマイヤ一で評価したグラフである。

図 6は、移植したベ一夕細胞を免疫染色した結果を示す顕微鏡像である。 1は BALBZcマウスのベータ細胞を示す。 2は糖尿病モデルマウスの腎臓を示す。

図 7は、各処理を行った細胞によるインスリン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図 7 (a) は、各濃度の 11 R— V I V I Tで処理された細胞によるィンスリン分泌量を、コントロ一ルに対する相対値で示したグラフである。図 7 (b) は、各濃度の FK506 で処理された細胞によるィンスリン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図 7 (c) は、各濃度の 11 R— VEETで処理された細胞によるィンスリン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。

図 8は、各処理を行った細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図 8 (a) は、 11 R— V I V I Tで処理された細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図 8 ( b) は、 FK 506で処理された細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図 8 (c) は、 11 R— VEETで処理された細胞の増殖を、コントロールに対する相対値で示したグラフである。図 9は、ラッ卜の心室中隔および左室全壁の厚さを超音波エコーにより解析した結果を示すグラフである。図 9 (a) は、コントロール、 AoB、 Cy s A投与 AoBおよび 11 R— V I V I T投与 A o Bの心室中隔壁厚を示すグラフである。図 9 (b) は、コントロール、 AoB、 Cy sA投与 AoBおよび 11 R— V I V I T投与 AoBの左室全壁厚を示すグラフである。

図 10は、ラット心臓の組織標本の顕微鏡像である。図 10 (a) は、正常なラットの心臓切片を示す顕微鏡像である。図 10 (b) は、 AoB の心臓切片を示す顕微鏡像である。図 10 (c) は、 Cy sAを投与した AoBの心臓切片を示す顕微鏡像である。図 10 (d) は、 11R— V I VI Tを投与した AoBの心臓切片を示す顕微鏡像である。 3は左心室を示し、 4は右心室を示す。

図 11は、ラットの血液検査結果を示すグラフである。図 11 (a) は、コントロール、 AoB、 Cy s A投与 AoBおよび 11 R— V I V I T投与 AoBの ANPを示すグラフである。図 11 (b) は、コントロール、 AoB、 Cy s A投与 AoBおよび 1 1 R_V I V I T投与 AoBの BN Pを示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明のぺプチド化合物およびその用途について詳細に説明する。本願発明のペプチド化合物は、数個のアルギニンが連続するアミノ酸配列および配列番号 1のアミノ酸配列を含有する。

連続するアルギニンの残基数としては、 9〜13残基が好ましく、 1 1 残基が最も好ましい。連続したアルギニンが 8残基以下または 14残基以上である場合、本願発明のぺプチド化合物の細胞への導入効率が悪くなる傾向がある。

本願発明のペプチド化合物はまた、 NFATの活性阻害ペプチド V I V I Tを含有する。 NFATとは、カルシニューリンに脱リン酸化されることによって活性化する転写調節因子であり、 NFAT1、 NFAT2、 N FAT 3および NFAT4などを含むファミリーを形成する。 V I V I T は、 MAGPHP V I V I TGPHEE (配列番号 1 ) で示されるァミノ酸配列からなるペプチドである。 VI V I Tは、カルシニューリンのホスファターゼ活性に影響することなく、 NFATファミリーに属するタンパク質とカルシニューリンとの相互作用を選択的に阻害する（ァラムブル J . (Aramburu, J.) ら、サイエンス（Science) 、第 285巻、 212 9〜 2133頁、 1999年）。配列番号 1に示すアミノ酸配列において、各アミノ酸残基は、 NFATを阻害するものであれば生物学的に同等のァミノ酸配列に置換してもよく、 V I V I Tと同等の生物学的活性を有するものであれば、数個のアミノ酸残基が付加、欠失されていてもよい。また、本発明のペプチド化合物は、同等の生物学的活性を有する限り、前記の数個のアルギニンが連続するァミノ酸配列および配列番号 1のアミノ酸配列に加え、数個のアミノ酸残基が付加、欠失または置換されていてもよい。

さらに、本願発明のペプチド化合物は、細胞内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有してもよい。マ一力一はとくに限定されるものではなく、たとえばフルォレセィンィソチオシァネー卜 (以下、 F I T C と略称する）、 G F Pおよびローダミンなどを使用することができる。本発明のペプチド化合物は、通常の人工合成法によって、または一般に市販されている人工合成機によって製造することができる。あるいは、本発明のぺプチド化合物は、遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。たとえば、数個のアルギニンが連続する配列および V I V I Tからなる配列を含むぺプチド配列をコ一ドする D N Aを揷入した組換えべク夕― を作製し、適当な宿主細胞に組換えベクターを導入後、その宿主細胞を培養する。ついで、培養物を回収することにより、本発明のペプチド化合物を得ることができる。本発明のペプチド化合物を製造後、得られたぺプチド化合物は公知の方法で精製することもできる。これらのペプチド化合物の製造法および精製法は、本分野において一般的な手法であり、当業者により容易に実施されるものである。

本発明のぺプチド化合物は、 N F AT活性化の抑制剤として使用することができる。 N F AT活性化の抑制剤は、 N F ATの活性化に起因する疾患の治療剤として用いることができる。 N F ATの活性化に起因する疾患としては、たとえば、アレルギー疾患および心肥大などを挙げることができる。本発明のペプチド化合物は、免疫抑制を誘導する作用を有しており、移植の際の免疫抑制剤として用いることができる。また、本発明の免疫抑制剤は、免疫疾患などの治療剤として利用することもできる。具体的な免疫疾患としては、移植手術後の拒絶反応、アトピー性皮膚炎などが挙げられる。

本発明の免疫抑制剤は、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、直腸内等の非経口的に投与することができる。とくに、ペプチド化合物を直接血流に導入することによってべプチド化合物の分解を防ぐことができるため、静脈内投与または皮下投与が好ましい。

本発明の免疫抑制剤の剤型は投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、水溶液および乳液などの液剤および軟膏を例示することができる。

本発明の免疫抑制剤の有効量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などを考慮して適宜設定することができ、有効成分に換算して通常は

；!〜 1 O m g Z k gである。しかしながら、有効成分である本発明のぺプチド化合物の量は変更可能であり、これらの範囲に限定されるものではない。

本発明の免疫抑制剤は、本発明のぺプチド化合物を有効成分として含有するものであればとくに限定されず、適当な薬学的賦形剤、適当な担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、担体、 p H安定剤など本技術分野で通常用いられるほかの成分を添加してもよい。これらの添加剤ほ、通常当業者により適宜選択され得る。

本発明のぺプチド化合物は心肥大抑制剤として有効である。本発明の心肥大抑制剤は、静脈内、皮下、経皮、直腸内等の非経口的に投与することができる。とくに、ペプチド化合物を直接血流に導入することが、ぺプチド化合物の分解を防ぐうえで重要であることから、静脈内投与が好ましい。本発明の心肥大抑制剤の剤型は投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、水溶液および乳液などの液剤および軟膏を例示することができる。

本発明の心肥大抑制剤の投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜設定することができ、有効成分に換算して通常は 0. l〜2mg/kgである。しかしながら、有効成分である本発明のペプチド化合物の量は変更可能であり、これらの範囲に限定されるものではない。

本発明の心肥大抑制剤は、本発明のぺプチド化合物を有効成分として含有するものであればとくに限定されず、適当な薬学的賦形剤、適当な担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、担体、 PH安定剤など本技術分野で通常用いられるほかの成分を添加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択され得る。

以下、実施例によって、本発明のペプチド化合物をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。

実施例 1

連続したアルギニン 11残基、 V I V I Tおよび F I TCを含有するべプチド化合物を人工合成し (シダマジエノシスジャパン社 (S i gma Ge nosis Japan, Inc.) に製造依頼）、分取逆相 HP L Cにより該ペプチドを精製した。以下、連続したアルギニン 11残基およびグリシン 3残基を付加した V I V I Tからなるペプチドを、 11 R— V I V I Tと略称する。 11 R-V I V I Tのペプチド配列を配列番号 2に示す。なお、 F I TC は、 11 R— V I V I Tのァミノ末端側に付加されている。

実施例 2

6週齢の C 3HZHeNマウス H— 2 k (クレアジャパン社 (CLEA Jap an, Inc.) 製）に対し、実施例 1で製造した 1 1 R— V I V I Tと F I T Cとからなるペプチド化合物 1 Omg/kg量を溶解した 0. 5m 1のリンガー液を注射剤とする腹腔内注射を実施した。注射から 6時間後、各マウスから脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓を摘出し、それぞれを 3 m 1のヒス卜プレップ（フィッシャ一サイエンティフィック社（Fish er Scientific) 製）中で、 — 80°Cで凍結させた。次に、クリオスタツト上で 10〜50 mの切片を作製し、ツァイス顕微鏡（ツァイス社 (Ze iss) 製）で分析した。なお、コントロールとして、未処理の C3HZH e Nマウスの切片を用いた。

分析の結果、複合ペプチドを投与したマウスに由来する脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓の切片では、いずれも F I TCの蛍光が観察された。一方、コントロールの切片においては、 F I TCの蛍光は観察されなかつた。これは、腹腔内投与により、少なくとも脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および心臓の細胞に 11 R— V I V I Tが導入されることを示すものである。

実施例 3

I L一 2遺伝子の転写に対する 11 R— V I V I Tの容量依存的効果を検討した。

l nM、 10nM、 100 nMまたは 1 Mの 11 R— V I V I Tを含む lm 1の 10%ゥシ胎仔血清含有 RPM I (インビトロゲン社 (Invito rogen) 製）を用いて、 1 X 10⁵細胞個のジャーカット細胞 Gurkat ce lis) を、 37 C、 5%炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置（山洋電気株式会社製）において 1時間培養した。ついで、 2 Mのホルポール 12—ミリステート 13—アセテート（PMA) (シグマ社 (Sigma) 製 ) および 40 Mのィオノマイシン（シグマ社製）を含む 100 1の R PMIを添加し、さらに 12時間培養を続けた。ついで細胞を回収し、得られた細胞を用いて、下記のリアルタイム定量 RT— PCR (real-time quantitative RT-PCR) により I L— 2遺伝子の転写量を測定した。リアルタイム定量 RT— PC Rでは、ハウスキーピング遺伝子として知られる GAPDHを内部標準物質として使用した。なお、 1 1尺ー¥ 1¥ 1丁を含まない培地で培養したジャ一カツト細胞をコントロール細胞として用レ、同様のリアルタイム定量 R T -PCRを実施した。

RNe a s y M i n i K i t (キアゲン社（QIAGEN) 製）をプロトコルにしたがって使用し、細胞から全 RNAを抽出した。得られた全 RN Aを用い、逆転写反応を 22°Cで 10分間、ついで 42°Cで 20分間インキュベ一シヨンすることにより実施した。

つぎに、ライトサイクラ一一ファーストスタ一ト DNAマスタ一 S YB Rグリーン Iキット (LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I Kit (ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社 (Rhoche Molecular Bioc eiicals) 製）を用い、 20 1の反応混液（転写産物の 10分の 1 量、 4mM MgC l ₂、 4種のプライマー各 0. 5 M、の 1

0 Xライトサイクラ一ファーストスタート DNAマスタ一 S YBRグリーン I) を増幅反応用に調製した。ヒト I L— 2に対するプライマーとしては、競合定量 RT— PC Rキット（Co即 etitive Quantitative RT-PCR Ki t) (フナコシ株式会社製）内に含まれるプライマーを用いた。 GAPD Hに対するプライマ一としては、 5 ' -CTGACCAGGGTCCTA TTCCA- 3 ' (配列番号 5) および 5' -TGGTTATCCCAA GCAAGAGG- 3 ' (配列番号 6) を用いた（ともに、ジーンセット社製）。増幅反応は、 95°Cで 10分間インキュベーションしたのち、 9 A°C 15秒間、 57 X 5秒間および 72 10秒間のィンキュベーシヨンを 1サイクルとし、これを 60サイクル実施した。ついで、 0. 2°C/秒で 95^まで温度を上昇させた。解離カーブ解析には、ライトサイクラ一ソフトウェア（ロッシュモレキユラ一バイオケミカルズ社製）を使用した。解析の結果得られた GAPDHに対する相対 RNA量を図 1に示す (n=3) 。

11 R— V I V I Tは、 I L一 2遺伝子の転写を未処理の場合の 12% に抑制した。 I L一 2遺伝子は、アレルギーや拒絶反応により T細胞が活性ィ匕される場合に、転写が促進される遺伝子である。したがってこの結果は、 11 R_V I V I Tが T細胞活性化を抑制し得ることを示す。

比較例 1

実施例 1と同様にして、連続したアルギニン 11残基およびグリシン 3 残基を付加した VEETからなるペプチド化合物（以下、 11R— VEE Tと略称する）を人工合成し、精製した。 VEETは、 MAGPPH I V EETGPHV I (配列番号 3) で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドである。 11 R— VEETのペプチド配列を配列番号 4に示す。以下、 11 R - VEETを 11 R-V I V I Tのネガティブコントロールとして用いる。

11 R-V I V I Tの代わりに 100 nMの FK506 (藤沢薬品工業株式会社製）または 1 Mの 11 R— VEETを含む培地を使用したほかは実施例 3と同様にして、ジャーカット細胞を培養し、得られた細胞を用いて RT_ PC Rを実施した。結果を図 1に示す。

11R— VEETは、 I L一 2遺伝子の転写レベルに影響を与えなかつた。

実施例 4

T細胞における 11R— V I V I Tの半減期を、 I L— 2転写に対する阻害活性に基づき検討した。

I Mの 11R— V I V I Tを含む lmlの 10%ゥシ胎仔血清含有 R PM Iを用いて、 1 X 10⁵細胞個のジャ一カット細胞を、 37°C、 5% 炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において 1時間培養した。ついで、 2 ιι PMAおよび 40 Mのィオノマイシンを含む 100 1の RPMIを添加し、さらに 12時間、 17時間、 23時間、 35時間または 59時間培養を続けた。なお、コントロール細胞としては、 1 1R— V I V I Tを含まない 10 %ゥシ胎仔血清含有 R PM Iで前記同様に 1時間培養し、 2 M PMAおよび 40 Mのィオノマイシンを含む 100 1の RPM Iを添加したのち、さらに 12時間、 17時間、 23時間、 3 5時間または 59時間培養したジャーカツト細胞を用いた。

ついで、得られた各細胞を試料として用いたほかは実施例 3と同様にして、 RT— PC Rおよびリアルタイム定量 RT— PC Rを実施して解析することにより、 GAPDHに対する相対 RNA量を測定した。結果を図 2 に示す（n=3) 。図 2に示す時間は、培養全体の時間を意味する。

1 1 R-V I V I Tの半減期は、約 30時間であった。 1 1 R— V I V I Tを添加してから 60時間後には、その I L— 2転写阻害活性はみられなかった。

比較例 2

1 Mの FK506を含む lmlの 10 %ゥシ胎仔血清含有 R PM Iを用いて、 1 X 10⁵細胞個のジャーカット細胞を、 37T、 5%炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において 1時間培養した。ついで、 2 H M PMAおよび 40 Mのィオノマイシンを含む 100 1の RPM I を添加したのち、さらに 12時間、 17時間、 23時間、 35時間または 59時間培養した。つぎに、得られた培養細胞を用いたほかは実施例 3と同様の方法で、 R T— PC Rおよびリアルタイム定量 RT— PC Rを実施した。 FK506の添加から 60時間後の相対 I L— 2 mRNAレベルを、図 2に示す。

FK506は 60時間後においても代謝されず、 I L一 2の転写を強く抑制した。

実施例 5

T細胞の活性化および増殖に対する 11 R— V I V I Τの効果を、リンパ球混合試験により検討した。

6〜8週齢の0311 116 マゥスぉょび6〜8週齢の8八し87じマウス H_2 d (清水実験材料株式会社製）から脾臓細胞を取り出した。 B ALB/c脾臓細胞はマイトマイシン C (協和醱酵工業株式会社製）で処理し、刺激細胞として用いた。

1 ρΜ、 I nMもしくは I Mの 1 1R— V IV I Tを含む RPM Iを、平底 96穴プレート（イワキ株式会社製）に添加した。ついで、前記刺激細胞と C3HZHeNマウス由来の脾臓細胞とを 1 ： 5で混合した混合細胞を、各ゥエルに 5 X 10⁵個添加し、 37°C、 5%炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において 90時間培養した。なお、コントロールとして、培地のみのゥエルに混合細胞を添加し、同様に培養した。

つぎに、 0. 5 C i Z穴の³ Hメチルチミジン (以下、 [³H] Td Rとする。アマシャムフアルマシアバイオテク株式会社製) を添加し、 6時間培養した。ついで、細胞を直径 1 cmのフィルタ一紙上に置き、細胞に取り込まれた [³H] TdRの放射活性を、ベータカウンター（べックマン社製）により測定した。結果を図 3に示す。

1 Mの 11 R— V I V I Tは、コントロールに対し、リンパ球の増殖を 43%抑制した。図 3において、 *はコントロールと比較して P<0. 05であることを意味し、 **はいずれも P<0. 001であることを意味する。

比較例 3

11 R-V I V I Tの代わりに 1 ρΜ、 I nMもしくは 1 xMの FK5 06または 1 Mの 11 R— VEETを含む RPM Iを用いたほかは実施例 5と同様の方法により、混合細胞を培養し、 [³H] TdRを添加して、細胞に取り込まれた [³H] TdRの放射活性を、ベ一夕カウン夕一により測定した。結果を図 3に示す。

11R— VEETは、 1 Mでは、リンパ球の増殖に影響を与えなかつた。

比較例 4

11 R-V I V I Tを含まない RPM Iを培地として用い、混合細胞の代わりに C 3 H/H e Nマウス由来の脾臓細胞のみを用いたほかは実施例 5と同様の方法により、細胞を培養し、 [³H] TdRを添加して、細胞に取り込まれた [³H] TdRの放射活性を、ベータカウンタ一により測定した。結果を図 3に示す。

実施例 6

1 Omg/kg量の 11 R— V I V I Tを溶解した 0. 5mlのリンガ —液を注射剤として用い、ィンビポにおける T細胞の活性化および増殖に対する 11 R— V I V I Tの効果を検討した。

6週齢の C 3H/He nマウスに、前記注射剤を、 1日 1回 2日間、腹腔内に注射した。

2回目の注射から 6時間後に、脾臓を外科的に摘出した。得られた脾臓細胞（1 X 1 0⁴個）を、マイトマイシン Cで処理された BALBZcマウスの脾臓細胞（1 X 1 0⁵個）とともに平底 96穴プレートに添加し、 37 ：、 5%炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において 90時間培養した。培地は、 RPMIを使用した。なお、コントロールとして、培地のみのゥエルに混合細胞を添加し、同様に培養した。

つぎに、 0. 5 C iZ穴の [³H] TdRを添加し、 6時間培養した。ついで、細胞を直径 1 cmのフィルタ一紙上に置き、細胞に取り込まれた

[³H] TdRの放射活性を、ベ一夕カウン夕一により測定した。結果を図 4に示す。図 4において、 * *はいずれもコントロールと比較して P< 0. 00 1であることを意味する。

インビポにおいて、 1 OmgZk gの 1 1 R_V I V I Tは、コント口ールに対して 30%の抑制効果を示した。

比較例 5

1 1 R-V I V I Tの代わりに lmgZk gの FK506または 1 Om g/k gの 1 1 R— VEETを用いたほかは実施例 6と同様の方法により、 C 3HZHe nマウスに対して腹腔内注射を実施し、脾臓細胞を取り出して培養し、 [³H] TdRを添加して、細胞に取り込まれた [³H] Td Rの放射活性をベータカウンタ一により測定した。結果を図 4に示す。

1 1R— VEET^¾、 1 Mでは、リンパ球の増殖に影響を与えなかつた。

比較例 6

1 1 R-V I V I Tを含まない RPM Iを培地として用い、混合細胞の代わりに C 3 H/H e Nマウス由来の脾臓細胞のみを用いたほかは実施例 6と同様の方法により、細胞を培養し、 [³H] TdRを添加して、細胞に取り込まれた [³H] TdRの放射活性を、ベータカウンタ一により測定した。結果を図 4に示す

実施例 7

1 OmgZkg量の 1 1 R— V I V I Tを溶解した 0. 5mlのリンガ一液を注射剤として用い、ベ一タ細胞の移植における 1 1 R— V I V I T の効果を検討した。移植の際、ドナーとして 6週齢の BALBZcマウスを、レシピエントとして 6週齢の C 3H/HeNマウスを用いた。

C 3HZHeNマウスに対して 22 OmgZk gのストレプトゾシン（シグマ—アルドリッチジャパン株式会社）を 1回腹腔内注射することにより、糖尿病モデルマウスを作製した。また、ストレブ卜ゾシン注射から 6日後、グルコース値が 35 Omg/d 1を超えたマウスを高血糖症であると判断した。

一方、 BALBZcマウスの塍臓を取り出し、不連続フイコール密度勾配遠心を実施したのち、通常のコラゲナーゼ消化によりベータ細胞を単離した。

単離した約 500個のベータ細胞を、前記糖尿病モデルマウスの左腎の被膜下に移植した。移植後、毎日 1回、マウスに 1 OmgZkgの 1 1R 一 V I V I Tを腹腔内注射した（n=6) 。コントロールとして、 11R -V I V I Tを含まない生理食塩水を、ベータ細胞を移植したマウスに注射した（n = 4) 。血糖を測定し、その値が 2日間連続 20 OmgZd 1 を超えた場合に移植組織拒絶とした。図 5に、力プランマイヤーで評価した結果を示す。

11 R-V I V I Tの投与により、コントロールと比較して、生存率が有意に上がった（P<0. 005) 。

比較例 7

11 R— V I V I Tの代わりに 10018ノ1?：8の11R— VEETを用いたほかは実施例 7と同様にして、ベータ細胞の移植に対する 11R— V EETの効果を検討した。結果を図 5に示す。

11R— VEETは、コントロールと同様に、移植組織の生存には何の影響も与えなかった。

実施例 8

実施例 1において 11 R— V I V I Tを投与したマウスを用い、移植したべ一夕細胞の機能を検討した。

ベー夕細胞の移植から 50日後の腎臓を外科的に摘出した。ついで、凍結ミトクローム（カールツァイス社製）を用い、 30 mの腎臓の切片を作製した。つぎに、得られた切片について、インスリンに対するポリクローナル抗体 (サンタクルーズ社製) およびアビジン、ピオチンペルォキシダーゼ法（ベクタ一社製）を用いて免疫染色を実施した。

免疫染色の結果を図 6に示す。図 6において、 1は移植されたベータ細胞であり、 2はレシピエントの腎臓である。移植したベ一夕細胞がインスリン抗体により染色されたことから、移植細胞がィンスリンを産生していることを確認した。

実施例 9

3TC 6細胞によるィンスリン分泌に対する 1 1 R— V I V I Tの効果を検討した。 jSTC6細胞は、グルコース応答性でインスリンを分泌するランゲルハンス島の細胞系である。

]3TC 6細胞 (アメリカンタイプカルチャーコレクション (Amer ican Type Culture collection) 、 CRL— 11506) を 96穴プレ一卜に播種し（5 X 10⁴細胞個ノ穴）、 10、 100、 1000または 1 0000 nMの 11 R— V I V I Tを含む lm 1の 10 %ゥシ胎仔血清含有 RPMIを用いて 37V, 5%炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において 96時間培養した。培地は 24時間毎に、 11 R— V I V I T を含む新鮮な培地と交換した。 96時間後、新鮮な培地に交換してさらに 1時間培養し、培養上清を回収した。コントロールとして、 11R— VI V I Tを含まない培地を用いたほかは同様にして、 /3TC 6細胞の培養を実施した。

つぎに、回収した培養上清を用いて、マウスインスリン EL I SA (T MB) キット（シバヤギ製）をプロトコルにしたがって使用し、分泌されたインスリンを分析した。図 7 (a) は、 11 R— V I V I Tで処理された細胞によるィンスリン分泌量を、コントロールに対する相対値で示したものである。

j8 T C 6細胞のインスリン分泌量は、 1 1 R— V I V I Tが 0〜1 の範囲でコントロールとほぼ同じであつたが、 10 Mではコントロールの 71 %であった（P = 0. 042) 。

比較例 8

11 R— V I V I Tの代わりに 1、 10、 100もしくは 1000 nM の FK 506または 10、 100、 1000もしくは 1000 OnMの 1 1 R— VEETを含む完全培地を用いたほかは実施例 9と同様の方法により、 ]STC6細胞を培養し、）3 TC 6細胞によるインスリン分泌に対する効果を検討した。その結果を図 7 (b) および図 7 (c) に示す。

i3TC 6細胞のインスリン分泌量は、 FK506により著しく減少され、一方、 11 R— VEETにより影響されなかった。

実施例 10

/3 TC 6細胞の増殖に対する 11 R— V I V I Tの効果を検討した。 iSTC 6細胞を 96穴プレートに播種し（5 X I 0⁴細胞個 Z穴）、 1 0、 100、 1000または 10000 nMの 1 1 R— V I V I Tを含む完全培地を用いて 37°C、 5%炭酸ガス濃度に設定した炭酸ガス培養装置において 88時間培養した。培地は 24時間毎に、 11 R— VIV I Tを含む新鮮な培地と交換した。つぎに、穴の [³H] TdRを添加し、さらに 8時間培養した。コント口一ルとして、 1 1R— V IV I T を含まない培地を用いたほかは同様にして、 iSTC 6細胞の培養を実施した。ついで、細胞を直径 1 cmのフィルタ一紙上に置き、細胞に取り込まれた [³H] TdRの放射活性を、ベータカウンタ一により測定した。図 8 (a) は、 1 1 R— V I V I Tで処理された細胞の増殖を、コント口一ルに対する相対値で示したものである。

j3TC 6細胞の増殖に関しては、 11 R— V I V I Tが 0〜1 Mの範囲ではコントロールとほぼ同じであつたが、 10 Mではコントロールの 73%であった（P=0. 075) 。比較例 9

11 R— V I V I Tの代わりに 1、 10、 100もしくは 1000 ηΜ の FK506または 10、 100、 1000もしくは 10000 ηΜの 1 1 R— VEETを含む完全培地を用いたほかは実施例 10と同様の方法により、 j8TC6細胞を培養し、 i3TC 6細胞の増殖に対する効果を検討した。その結果を図 8 (b) および図 8 (c) に示す。

FK506および 11 R— VEETは、 3 T C 6細胞の増殖に対して阻害効果を示さなかった。

実施例 11

心肥大に対する 11 R— V I V I Tの効果を検討した。

心肥大モデルラットに対し、 1. 5mg/kg量の 11 R— V I V I T を溶解した 0. 5m 1のリンガー液を隔日で皮下注射した（n=6) 。なお、心肥大モデルラットは、体重 200〜 250 gの 7週齢の雄ウイス夕一ラット（清水実験材料株式会社製）の大動脈を結紮し心臓に圧負荷をかけることにより作製した。本明細書において、心肥大モデルラットは Ao Bと略称する。

ついで、 0、 1、 2、 3、 4および 5週後にラットの心臓を以下の方法で評価した。なお、コントロールとして 11 R— V I V I Tを投与されなかった正常なラットを用いた。

コントロールおよび 11 R— V I V I Tを投与した AoBに対し、超音波エコー検査（ULC) 、組織標本の作製および血液検査を、以下のようにして実施した。

ULCは、ラットの心室中隔および左室全壁の厚さを超音波エコー（日立株式会社製）により、小児用プローブを用いて解析した。結果を図 9 ( a) および図 9 (b) に示す。その結果、 11 R— V I V I T投与により、 AoBにおける心室中隔壁厚および左室全壁厚はともに改善されることを確認した。

組織標本は、ラットの心臓を外科的に摘出し、凍結ミクロトームにより厚さ 5 mの切片を作製し、ついで得られた切片をへマトキシリンェォジン染色法で染色することにより作製した。得られた組織標本は、顕微鏡で観察した（図 10 (d) ) 。図 10において、 3は左心室を示し、 4は右心室を示す。その結果、 11 R_V I V I T投与により、正常に近い形態にまで症状が改善されることを確認した。

心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP) および B型ナトリウム利尿べプチド（BNP) の測定は、日本エスァ一ルエル株式会社に依頼した。結果を図 11 (a) および図 11 (b) に示す。その結果、 1 1R— V IV I T投与により、 AoBにおける ANPおよび BNPの値はともに改善されることを確認した。

比較例 10

11 -V I V I Tを投与しない AoBを用いたほかは実施例 11と同様にして ULCの測定、組織標本の作製および血液検査を実施した。結果を図 9 (a) 、図 9 (b) 、図 10 (b) 、図 11 (a) および図 11 ( b) に示す。

比較例 11

11 R-V I V I Tの代わりに 5mgZk gの Cy s Aを用いたほかは実施例 11と同様にして、心肥大に対する Cy s Aの効果を検討した。結果を図 9 (a) 、図 9 (b) 、図 10 (c) 、図 11 (a) および図 11

(b) に示す。

試験例 1

肝機能および腎臓機能に対する 11 R— V I V I Tの毒性を、 11 R— V I V I Tを投与した AoBを用いて検討した。

1. 5mg/k g量の 11 R_V I V I Tを溶解した 0. 5mlのリンガ一液を隔日で 4週間、 AoBに皮下注射した（n=6) 。得られた A o Bについて、以下の測定を日本エスアールエル株式会社に依頼した。肝機能検査としてグルタミン酸ォキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GO T) およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ一ゼ（GPT) を測定し、腎臓機能検査としてクレアチニン（C r) および尿素窒素（BUN) を測定した。なお、 1 1 R_V I V I Tを投与しない正常ラットおよび A oBをコントロールとして使用した。結果を表 1に示す。

測定の結果、本発明のぺプチド化合物は肝臓および腎臓の機能に影響を与えないことが示唆された。産業上の利用可能性

本発明のペプチド化合物は、副作用が極めて少ない N FATの活性ィ匕に起因する疾患の治療剤として使用することができる。具体的には、たとえば免疫抑制剤および心肥大抑制剤として使用し得るため、非常に有用である。配列表フリーテキスト配列番号 2 ：融合ペプチド配列

配列番号 4：融合ペプチド配列

Claims

請求の範囲

1. アルギニン 9残基〜 1 3残基および配列番号 1のアミノ酸配列を含有するペプチド化合物。

2. アルギニンが 1 1残基である請求の範囲第 1項記載のペプチド化合物。

3. 請求の範囲第 1項または第 2項記載のぺプチド化合物からなる N F A T活性化の阻害剤。

4. 請求の範囲第 1項または第 2項記載のペプチド化合物を有効成分とする免疫抑制剤。

5. 請求の範囲第 1項または第 2項記載のぺプチド化合物を有効成分とする心肥大抑制剤。