WO2003068978A2 - Combinaisons de vecteurs et leurs hotes pour propager et exprimer des genes recombinants sans recourir a des antibiotiques - Google Patents

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WO2003068978A2
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Philippe Marliere
Volker Doring
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Evologic Sa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers

Definitions

  • the invention relates to novel eubacterial protein expression systems which make it possible not to use antibiotics, as well as to their use for the production of recombinant proteins.
  • the production of recombinant proteins in eubacterial hosts is currently carried out using plasmids carrying antibiotic resistance genes as positive selection markers.
  • the microorganisms are transformed with these plasmids carrying the gene coding for the protein of interest, under the control of an appropriate promoter (constitutive or inducible depending on the desired objective), and the transformants are selected, by their ability to proliferate in a medium. containing the antibiotic selection marker.
  • Ampicillin, tetracycline, kanamycin or chloramphenicol are generally used for selection.
  • those whose activity is bactericidal are generally preferred to those whose activity is bacteriostatic.
  • the stability of a plasmid in its host can be defined as the property of maintaining an expression of the protein (s) of interest, while maintaining the detectable activity of the protein, after propagation of the host during a generation number greater than 40 generations, preferably greater than 50 generations, more preferably greater than 60 generations.
  • a method of propagation of the host consists in inoculating a culture medium to the thousandth with an aliquot coming from a stationary culture (generally after 24 hours of culture under normal conditions (37 ° C for
  • the invention relates to a vector for expression of a protein in a eubacterium, characterized in that it comprises, as the only positive selection factor, a gene complementing an auxotrophy with meso-diaminopimelic acid (DAP), chosen in particular from the DAP synthesis genes.
  • DAP meso-diaminopimelic acid
  • the positive selection factor is not the dapD2 gene, but is the asd gene (coding for aspartate semialdehyde dehydrogenase, Haziza et al.,
  • the dapA gene chosen is preferably derived from E. coli, such as the gene described in
  • GenBank (M12844), and whose coding sequence is represented by SEQ ID No. 1.
  • This dapA gene codes for dihydropicolinate synthase, an enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of meso-diaminopimelic acid (DAP), a precursor of the peptidoglycan in the wall and of lysine in proteins.
  • DAP meso-diaminopimelic acid
  • the asd gene codes for aspartate semialdehyde dehydrogenase, an enzyme involved not only in the synthesis of DAP but also in that of lysine, methionine, and threonine proteins.
  • DAP auxotrophy One advantage of using a DAP auxotrophy is that, unlike most of the other auxotrophies described, conventional rich media can be used to propagate the bacteria. Indeed, these do not contain DAP, whereas they generally contain the complementation factors for the other auxotrophies (amino acids ...), and it is therefore necessary, for these other auxotrophies, to use minimal environments.
  • DAP deficiency in this element is bactericidal (and not bacteriostatic).
  • hosts are then used for which the dapA gene has been inactivated, preferably in a non-reversible manner, that is to say that a natural mutation during the growth of the host does not cannot restore the endogenous activity of the dapA gene.
  • the gene is inactivated, bacteria cannot grow on a medium that does not contain DAP.
  • the presence of DAP is no longer required for the growth of microorganisms.
  • the bacteria are obtained by conventional techniques of site-directed mutagenesis or gene silencing by homologous recombination. All of these techniques are well known to those skilled in the art. It is particularly preferred to replace the dapA gene by homologous recombination, to ensure that the inactivation is irreversible. To do this, one can use a homologous recombination vector, in which a gene for resistance to an antibiotic (for example resistance to chloramphenicol or to erythromycin) is flanked by sequences homologous to the sequences flanking the gene dapA. AdapA bacteria are selected based on their resistance to the antibiotic and their inability to grow in the absence of DAP.
  • an antibiotic for example resistance to chloramphenicol or to erythromycin
  • the use of an antibiotic to obtain the mutant bacterium is less troublesome, since the gene for resistance to the antibiotic is introduced into the bacterial genome. The risks of dissemination of said gene to other organisms are then reduced.
  • the gene is present in only one copy in the bacterium (whereas it is present in a large number of copies when carried by a plasmid). Furthermore, there is no need to maintain a selection pressure by using the antibiotic on the bacterium after having selected the desired mutant bacterium.
  • said vector is stable in its prokaryotic host, which is preferably E. coli.
  • said vector is derived from the vector pQE-60 or pQE-70 (the plasmid pQE-60 corresponds to SEQ ID No. 3, the plasmid pQE-70 differing from this only by a site multiple of cloning, these two plasmids being marketed by Qiagen (www.qiagen.com)).
  • said vector is derived from a pUC vector, in particular from the pUC 18 vector.
  • the modifications made to the base vector are restricted and do not modify the vector replication host, nor its fundamental properties (number of copies, size of the insert, stability, etc.).
  • the bla gene coding for the resistance to ampicillin of the vector pQE-60 or pQE-70 is replaced by the dapA gene.
  • the vector also comprises a gene allowing the regulation or the induction of the expression of said protein.
  • the gene coding for the protein of interest is then under the control of the T5 promoter, and of two lacO operators. It may therefore be advantageous to introduce, into the skeleton of the vector according to the invention, the lad gene, coding for a protein interacting with the lacO operators, and restricting the expression of the protein of interest.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactosidase
  • the vector according to the invention is a vector pSP102, pSPl 14, pSP150, pSP139, pSPl 17, pSP136, as described in the examples, and in particular the vector pSP114 or pSP139 deposited at the CNC under the numbers 1-2796 and 1-2793, February 08, 2002.
  • said vector does not contain specific sequences allowing a simplified purification of said protein.
  • nucleic sequences located in phase with said protein, 5 ′ or 3 ′ of the coding sequence of said protein, said specific sequences coding for a series of amino acids capable of '' interact with compounds located on polymerization supports (purification by affinity chromatography, and recovery of the native protein by specific cleavage).
  • Many elements can be envisaged, and are notably summarized in Ford et al. ("Fusion tails for the recovery and purification of recombinant proteins", Protein Expr Purif 1991 Apr-Jun; 2 (2-3): 95-107).
  • polyhistidine tail purification by metal ion affinity chromatography
  • the tails of charged amino acids arginine, aspartate, glutamate, with ion exchange chromatography
  • domains which bind to biotin enzymes ( ⁇ -galactosidase, glutathione-S-transferase, chloramphenicol acetyl transferase, with the respective ligands APTG, glutathione, chloramphenicol), proteins which bind to polypeptides (Staphylococcus protein A - IgG, streptococcal protein G - Albumin) , antigenic epitopes (Flag, recA, ⁇ -galactosidase), carbohydrate-binding domains (malE - cross-linked maltose or starch, starch-binding domains, cellulose or galactose).
  • the invention relates to a protein expression system, characterized in that it comprises:
  • said expression system further comprises a second vector carrying an element allowing the regulation or the induction of the expression of said protein.
  • Said element has been described above. It may thus be a gene coding for a protein which binds to the promoter or to an operator of the expression system on the first vector, which binding can be reduced by the addition of a competitor compound.
  • said element can be a transcription factor, under the control of an inducible promoter, in particular by IPTG, or lactose.
  • said second vector does not contain an antibiotic resistance gene, and includes the thyA gene, as the sole positive selection factor.
  • the thyA gene codes for thymidylate synthase, and bacteria with inactivation in the thyA gene require the presence of thymidine if they have the tdk allele, or of thymine if they also have the deoA allele for their growth.
  • a preferred thyA gene is that of E. coli, represented by SEQ ID N ° 2.
  • the eubacterial host also has inactivation in the thyA gene.
  • said second vector is the vector pREP4 (SEQ ID No. 4, marketed by Qiagen), in which the neo gene coding for kanamycin resistance has been replaced by the gene coding for thyA.
  • said expression system comprises at least one of the vectors chosen from pSP1 14, pSP139 and pVDM62 and at least one strain chosen from +552, +838, +849, +1005, +1010 deposited at the CNCM under order numbers 1-2792 to 1-2796 on February 08, 2002.
  • the invention also relates to a kit for the production of proteins, comprising an expression system according to the invention, as well as to the use of a vector according to the invention, an expression system according to the invention, or a kit according to the invention for the production of recombinant proteins.
  • the recombinant protein is the pipA * protein, encoded in particular by the pipA * gene (SEQ ID No. 19). Deposit of biological material
  • the deposited strains have the following genotypes:
  • the plasmids included in the strains can easily be isolated by techniques known to those skilled in the art, in particular using commercial kits.
  • Figure 1 pSP102. Description of the plasmid: MCS (396-455); LacZ (N-Term fragment of ⁇ -Galactosidase) (469-146); Origin of replication (replicon pMB1) (866): DapA gene (coding sequence for dihydropicolinate synthetase) (2504-1626)
  • Figure 2 pQE 60.
  • Figure 6 plasmid pSPl 17. Description of the plasmid: Start of numbering / Xhol site (1); T5 promoter / lake operator (7-87); Transcription start site + 1 (61); 6xHis-tag (1203-1220); Lambda t 0 (termination of transcription) (1243-1333); rrnB Tl (termination of transcription) (2103-2201); ColEl origin of replication (2684); DapA gene (4303-3425)
  • Cloned gene Synthetic gene pipA * (1068 bp; 355 AA) (115-1182)
  • Figure 7 pSP136. Description of the plasmid: Start of numbering / Xhol site (1); T5 promoter / lake operator (7-87); Transcription start site + 1 (61); 6xHis-tag (1203-1220); Lambda t 0 (termination of transcription) (1243-1343); rrnB Tl (termination of transcription) (2103-2201); ColEl origin of replication (3882); Lac operon regulatory gene (lad) (2278-3369); DapA gene (5507-4629); Gene clone.
  • Figure 9 pVDM62. Description of the plasmid: Start of numbering / HindIII site (1); ThyA gene (527-1321); 3 'end of the neo gene (1471-1702); Regulator gene of the lac operon (lad) (3171-2080).
  • Figure 10 pEVL225. Description of the plasmid: Start of numbering / Xhol site (1); T5 promoter / lake operator (7-87); Transcription start site + 1 (61); MCS (113-134); Lambda tO (transcription termination) (155-249); rrnB Tl (transcription termination) (1015-1113); ColEl origin of replication (2794); Gene regulator of the lac operon (lad) (1201-2292); DapA gene (4430-3552) Figure 11: pEVL227.
  • This construction is carried out from the commercial plasmid pUC18 (BioLabs) which carries an origin of replication of the ColEI compatibility group and the bla gene for resistance to penicillins specifying ⁇ -lactamase.
  • the sequence of the plasmid pUC18 was modified by mutagenesis directed to nucleotides 1615 (change T to C), 1617 (change G to A) and 1618 (change T to G) by a method described (Ansaldi et al., 1996 Anal. Biochem., 234: 110-1 1 1) using the oligonucleotides PUC1 and PUC2 (SEQ ID N ° 5 and SEQ ID N ° 6) .
  • the plasmid pSP98 thus obtained has a unique Xhol site. Digestion of the plasmid pSP98 with the restriction enzymes Sspl and Xhol makes it possible to eliminate the bla gene.
  • the dapA gene of E. coli specifies dihydropicolinate synthase, an enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of meso-diaminopimelic acid (DAP), a precursor of peptidoglycan.
  • DAP meso-diaminopimelic acid
  • This gene was amplified by PCR on the chromosomal DNA of E. coli. 2 ⁇ l of total DNA were placed in the presence of the 4 dNTPs (250 ⁇ M), of each of the oligodeoxynucleotides PUC3 and PUC4 (500 nM) (SEQ ID No. 7 and SEQ ID No.
  • the fragment thus amplified was digested with Sspl and XhoI and introduced by ligation into the plasmid pSP98 which was also previously digested with Sspl and Xhol.
  • the ligation products were introduced into strains of E. coli carrying a deletion at the dapA locus and which therefore require, in order to grow, the presence in the culture medium of meso-diaminopimelic acid (DAP), and more precisely in the strains +849, ( ⁇ dapA:: cat, constructed according to Richaud et al ., 1993 J. Biol.
  • This construction uses the commercial plasmid pQE60 (Qiagen, shown schematically in Figure 2).
  • This plasmid (origin of replication ColEl, bla gene) contains the promoter of phage T5, two elements of the lac operator, the synthetic ribosomal binding site RBSII in 5 ′ of the polylinker and a coding sequence for a 6 x His tag in 3 'of the polylinker.
  • the sequence of the plasmid pQE60 was modified by site-directed mutagenesis (method according to Ansaldi et al., 1996, op.
  • nucleotide 838 (change T to A, oligonucleotides PQE60 / 1 and PQE60 / 2, SEQ ID N ° 9 and SEQ ID N ° 10), leading to the destruction of an Sspl restriction site and to nucleotides 2358-2360 (change TCT to GTC, oligonucleotides PQE60 / 3 and PQE60 / 4, SEQ ID N ° 11 and SEQ ID N ° 12) leading to the creation of a Sali restriction site.
  • the plasmid obtained, pSPHO was then digested with Sspl and Sali in order to eliminate the bla gene.
  • the dapA gene of E. coli was amplified by PCR on E. chromosomal DNA. coli as described above in Example 1.1 using the oligonucleotides PQE60 / 5 and PQE60 / 6 (SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 14).
  • the fragment thus amplified was digested with the restriction enzymes Xhol and EcoRV and introduced by ligation into the plasmid pSP1 10 digested with Sspl and SalI.
  • the ligation products were introduced into the strain +552 (ddapA :: erm) and the transforming strain +644 selected on LB medium without adding DAP.
  • the presence of the dapA gene on the plasmid extracted from this strain was confirmed by sequencing.
  • This plasmid, shown schematically in Figure 3 was named pSP114.
  • coli carrying the repressor gene la of the lactose operon was produced from the plasmid pSP1 14 and the lad gene from the plasmid pREP4 (Qiagen) amplified by PCR.
  • the amplification was carried out according to the protocol described above in 1.1. in the presence of plasmid DNA 10 nM and oligodeoxynucleotides PQE60 / 7 and PQE60 / 8 (SEQ ID No. 15 and SEQ ID No. 16).
  • the fragment thus amplified was digested with Nhel and introduced by ligation into the plasmid pSP1 14 previously digested with Xbal (cleavage site unique to nucleotide 1134).
  • the ligation products were introduced into the +552 strain and the transformants selected on LB medium without adding DAP.
  • the plasmid DNAs of the transformants were extracted and analyzed.
  • the presence of the lad gene on the plasmid pSP139 (FIG. 4) of the transforming strain +838 and its orientation with respect to the other elements of the plasmid were verified by analytical cleavages with appropriate restriction enzymes and by sequencing.
  • the +838 strain was deposited at the CNCM under the number 1-2793.
  • the same construction scheme was applied to the commercial vector pQE70 (QIAGEN) which has a cloning site (MCS: multiple cloning site) different from that of pQE60.
  • the resulting vector (pSP150) is shown diagrammatically in FIG. 5.
  • the plasmids pSP114, pSP139 (derived from pQE60) and pSP150 (derived from pQE70) therefore offer a wide range of cloning possibilities.
  • Example 2 Overexpression in E. coli of the heterologous pipA * gene cloned in the dapA + plasmids.
  • the pipA gene with a size of 1066 bp coding for the lysine cyclodesaminase from Streptomyces pristinaespiralis and whose sequence is described in patent WO 9601901 -Al, is composed of a G + C proportion of 69.6%.
  • This gene has been rewritten according to the genetic code optimized for expression in Escherichia coli (pipA *, SEQ ID No. 19) and is now composed of a G + C proportion of 38%. This gene was constructed by PCR.
  • the threonine 97 residue was coded by ACC instead of ACT.
  • a TAA translation termination codon was also added at position 1080 (1st nucleotide of the codon) of the sequence SEQ ID No. 19, and unique restriction sites EcoRI and Ncol on the one hand, HindIII on the other hand, were introduced respectively 5 ′ and 3 ′ of the gene thus allowing its insertion into a cloning vector.
  • Translation begins at ATG at position 15.
  • the synthetic pipA * gene was previously cloned into the vector pQE60 to give the plasmid pSP47.
  • the plasmid pSP47 was cut by the restriction enzymes Ncol and BglII; the 1076 bp digestion fragment was ligated into plasmids pSP114 and pSP139 digested with Ncol and BglII.
  • the ligation products were introduced into the +552 strain (described in Example 1.1) and the transformants selected in LB medium without DAP.
  • the plasmids pSP117 ( Figure 6) and pSP136 ( Figure 7) resulting respectively from the ligations with the vectors pSP114 and pSP139 were characterized and reintroduced into the strain +552.
  • the +626 and +823 strains were thus isolated, hosting the plasmids pSP117 and pSP136 respectively.
  • the expression of the pipA * gene was studied in the three strains +75, +626 and +823.
  • the +75 strain is a derivative of the E. strain. coli K12 MG1655 (Vidal et al. (1998) J. Bacteriol., 180: 2442-2449) containing the plasmid pSP47 (pQE60 :: pipA *) and the helper plasmid pREP4 carrying the lad gene.
  • the +626 and +823 strains and the +75 control strain were cultured in LB medium at 37 ° C. until reaching the optical density (600 nm) of 0.8.
  • the total proteins of the cells thus cultured were separated by polyacrylamide / SDS gel electrophoresis and stained with Coomassie blue. A protein with a molecular weight of 36 kDa was detected and its expression level was estimated at approximately 5% of the total proteins in the three strains. Control cultures of strains +75 and +823 without adding IPTG made it possible to control the absence of expression of the pipA * gene and therefore the activity of the lad repressor carried, in trans on the auxiliary plasmid pREP4 (strain +75 ), in cis on the plasmid pSP136 (strain +823).
  • Example 3 Stability of the L-lysine cyclodesaminase activity propagated by a plasmid dapA + lacl + without marker of resistance to an antibiotic.
  • strains +75 and +823 make it possible to lock the expression of the pipA * gene by expression of the repressor la, to induce the expression of the toxic gene in the presence of IPTG and offer, in the case of the strain
  • the strains +75, +626 and +823 (described in Example 2) were each cultured in 100 ml of LB medium at 37 ° C until reaching the stationary phase (24h). These cultures were then diluted by inoculating 100 ml of fresh LB with 100 ml of the stationary culture. This thousandth dilution operation was carried out seven times consecutively on each culture, thus carrying out approximately 70 generations.
  • the L-lysine-cyclodesaminase activity of the protein PipA * expressed in the strains +75, +626 and +823 was tested according to a protocol described below on aliquots preserved by freezing the cultures corresponding to 0, 20, 40 , 60 and 70 generations.
  • the cultures are centrifuged at 13000 g and the cell pellets are taken up in MS mineral medium so as to concentrate the cells 100 times.
  • the cells are then permeabilized by two stages of freezing / thawing at -20 ° C promoting access of the substrate to the enzyme.
  • the enzymatic reaction is carried out at 37 ° C. with stirring. After 20 hours, a 300 ⁇ l sample of each culture is taken which is centrifuged at 13000 g so as to recover the supernatant. A diluted solution of the supernatants is then deposited on a thin layer of silica.
  • Example 4 Construction of a strain allowing the stable propagation of two plasmids without genes for resistance to antibiotics.
  • the transducing strain +1005 ( ⁇ dapA :: cat ⁇ thyA :: erm) was selected in the presence of chloramphenicol on LB medium supplemented with thymidine (dT, 0.3 mM) and DAP (0.1 mM). The auxotrophies for thymidine and for DAP were confirmed on the appropriate media.
  • the +1005 strain was deposited at the CNCM under the number 1-2795.
  • the thyA gene was amplified by PCR from the plasmid pTSO (Lemeignan et al., 1993) constructed by insertion of the wild thyA gene of E. coli in the commercial plasmid pTZ18R (BioRad).
  • the PCR amplification was carried out with the oligonucleotides PREP1 and PREP2 (SEQ ID No. 17 and SEQ ID No. 18) using Vent Polymerase (Biolabs) according to the protocol described in Example 1.1.
  • the amplified fragment was cut with the restriction enzymes Ncol and BglII and introduced by ligation into the vector pREP4 (Qiagen, shown diagrammatically in FIG.
  • Plasmid pVDM62 ( Figure 9) was isolated. Replacement of the neo cassette by the thyA gene was verified by cleavage of the plasmid pVDM62 with appropriate restriction enzymes and sequencing of the lad gene.
  • the plasmid pVDM62 constructed in Example 4.2 was introduced into the +1005 strain described in Example 4.1; the transformants were selected in the middle LB in the presence of DAP and in the absence of thymidine. One of these transformants (strain +1007) was then isolated and then transformed with the plasmid pSPl 17 resulting from the ligation between the pSP114 cut with Ncol and BglII and the insert carrying the pipA * gene of the plasmid pSP47 cut with the same enzymes. The transformants were selected on LB medium in the absence of DAP.
  • the strain (+ 1008) thus obtained harbors the plasmids pVDM62 and pSP117.
  • This strain was cultured in the presence or absence of IPTG and the activities of the lysine cyclodesaminase produced were measured as described in Example 3 and compared with each other. It was thus verified that the expression of the enzyme is well locked by the lad repressor present in trans on the plasmid pVDM62.
  • the strain (+1010) was constructed by introducing the plasmid pSP114 into the strain +1007.
  • Example 5 Construction and use of expression plasmids devoid of label sequence useful for the purification of proteins and propagated stably in E. coli without marker of resistance to an antibiotic.
  • the sequence of the plasmid pSP139 described in Example 1.2. was modified by site-directed mutagenesis according to the method described by Ansaldi et al. (1996) using oligonucleotides 817 and 818 (SEQ ID No 21 and SEQ ID No 22).
  • the plasmid pEVL225 thus obtained and shown diagrammatically in FIG. 10, no longer comprises the sequence of 18 base pairs present on the plasmid pQE60 and coding for the hexa-histidyl label for protein purification.
  • the plasmid pSP47 was cut by the restriction enzymes Ncol and BglII; the 1076 bp digestion fragment thus obtained was ligated into the plasmid pEVL225 digested with Ncol and BglII.
  • the ligation product was introduced into the +552 strain (described in Example 1.1., Deposited at the CNCM, under the number 1-2792) and the transformants selected in LB medium without DAP.
  • the plasmid pEVL254 was extracted from a culture of these transformants and then characterized.
  • the plasmid pEVL254 is shown schematically in Figure 12.
  • the respective plasmids pEVL225, pEVL227, and pEVL254 were introduced into the strain +552 ( ⁇ dapA:: erm) and the respective transforming strains +2140, +2142 and +2294 were selected on LB medium without addition of DAP as described in l 'example 1.1.
  • the effective expression of the pipA * gene in the +2294 strain by induction at 1TPTG was verified by visualization of a band of 36 kDa after electrophoresis on polyacrylamide gel under denaturing conditions as described in Example 2. Furthermore, the stability of such expression of the pipA * gene after propagation of the strain +2294 in LB medium for more than 70 generations and the maintenance of the high level of activity of the lysine cyclodesaminase encoded by the pipA * gene were confirmed using the method described in Example 3.

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Abstract

L'invention se rapporte à de nouveaux systèmes eubactériens d'expression de protéines, utilisant le gène dapA comme marqueur de sélection, ainsi qu'à leur utilisation pour la production de protéines recombinantes.

Description

COMBINAISONS DE VECTEURS ET LEURS HOTES
POUR PROPAGER ET EXPRIMER DES GENES RECOMBINANTS
SANS RECOURIR A DES ANTIBIOTIQUES
L'invention se rapporte à de nouveaux systèmes eubactériens d'expression de protéines, permettant de ne pas utiliser d'antibiotiques, ainsi qu'à leur utilisation pour la production de protéines recombinantes.
La production de protéines recombinantes dans des hôtes eubactériens s'effectue actuellement en utilisant des plasmides portant des gènes de résistance aux antibiotiques en tant que marqueurs de sélection positive. On transforme les microorganismes avec ces plasmides portant le gène codant pour la protéine d'intérêt, sous le contrôle d'un promoteur approprié (constitutif ou inductible selon le but recherché), et on sélectionne les transformants, par leur aptitude à proliférer dans un milieu contenant l'antibiotique marqueur de sélection. On utilise en général l'ampicilline, la tétracycline, la kanamycine ou le chloramphénicol pour la sélection. Parmi ces antibiotiques utilisés pour la sélection, ceux dont l'activité est bactéricide sont généralement préférés à ceux dont l'activité est bactériostatique.
Toutefois, de tels systèmes d'expression, s'ils peuvent éventuellement être adaptés à la production de protéines dans les laboratoires scientifiques, ne sont pas souhaitable pour la production de protéines à grande échelle. En particulier, les plasmides portant les gènes de résistance à un antibiotique peuvent être échangés entre des microorganismes, ce qui peut donner lieu à une dissémination du gène de résistance dans des organismes sauvages. Par ailleurs, il peut rester des traces d'antibiotiques dans les préparations de protéines, ce qui est rédhibitoire lorsque la protéine recombinante doit obtenir un agrément de la part d'autorités réglementaires.
Il convient donc de mettre au point de nouveaux systèmes d'expression de protéines, dont la propagation ne requiert pas l'emploi d'antibiotiques pour produire la protéine d'intérêt.
On peut définir la stabilité d'un plasmide dans son hôte comme étant la propriété de maintenir une expression de la (ou des) protéine(s) d'intérêt, tout en maintenant l'activité détectable de la protéine, après propagation de l'hôte, pendant un nombre de génération supérieur à 40 générations, de préférence, supérieur à 50 générations, de façon plus préférée supérieur à 60 générations.
Une méthode de propagation de l'hôte consiste à ensemencer au millième un milieu de culture avec un aliquote provenant d'une culture stationnaire (généralement après 24 heures de culture dans les conditions normales (37 °C pour
Escherichia coli)), et à répéter cette opération. Chaque opération de nouvel ensemencement correspond à la réalisation d'environ 10 générations.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention se rapporte à un vecteur d'expression d'une protéine dans ue eubactérie, caractérisé en ce qu'il comprend, en tant qu'unique facteur de sélection positive, un gène complémentant une auxotrophie à l'acide meso-diaminopimélique (DAP), choisi notamment dans les gènes de synthèse de DAP.
De préférence, le facteur de sélection positive n'est pas le gène dapD2, mais est le gène asd (codant pour l'aspartate semialdéhyde déhydrogénase, Haziza et al.,
EMBO J., 1982, 1(3), 379-84, GenBank V00262, SEQ ID N° 20), ou le gène dapA.
Le gène dapA choisi est de préférence issu de E. coli, tel le gène décrit dans
GenBank (M12844), et dont la séquence codante est représentée par SEQ ID N° 1.
Ce gène dapA code pour la dihydropicolinate synthase, enzyme qui catalyse la première étape de la synthèse de l'acide meso-diaminopimélique (DAP) précurseur du peptidoglycanne de la paroi et de la lysine des protéines.
Le gène asd code pour l'aspartate semialdéhyde déhydrogénase, enzyme impliquée non seulement dans la synthèse du DAP mais aussi dans celle de la lysine, la méthionine, et la thréonine des protéines. Un intérêt d'utiliser une auxotrophie au DAP est que, contrairement à la plupart des autres auxotrophies décrites, on peut utiliser des milieux riches classiques pour propager les bactéries. En effet, ceux-ci ne contiennent pas de DAP, alors qu'ils contiennent généralement les facteurs de complémentation pour les autres auxotrophies (acides aminés...), et qu'il est donc nécessaire, pour ces autres auxotrophies, d'utiliser des milieux minimaux.
Un autre intérêt du choix de DAP comme marqueur d' auxotrophie est que le déficit en cet élément est bactéricide (et non bactériostatique). Afin de réaliser la sélection des transformants, on utilise alors des hôtes pour lesquels le gène dapA a été inactivé, de préférence de façon non réversible, c'est-à- dire qu'une mutation naturelle lors de la croissance de l'hôte ne peut pas restaurer l'activité endogène du gène dapA. Lorsque le gène est inactivé, les bactéries ne peuvent pas se développer sur un milieu ne contenant pas de DAP. En revanche, après transformation par le vecteur selon l'invention et complémentation en trans, la présence de DAP n'est plus requise pour la croissance des microorganismes.
On obtient les bactéries modifiées par des techniques classiques de mutagenèse dirigée ou d'inactivation du gène par recombinaison homologue. Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. On préfère notamment le remplacement du gène dapA par recombinaison homologue, pour assurer que l'inactivation est irréversible. Pour ce faire, on peut utiliser un vecteur de recombinaison homologue, dans lequel un gène de résistance à un antibiotique (par exemple de résistance au chloramphénicol ou à l'érythromycine) est flanqué de séquences homologues aux séquences flanquant le gène dapA. On sélectionne les bactéries AdapA, en fonction de leur résistance à l'antibiotique et de leur incapacité à pousser en absence de DAP.
Il convient de noter que l'utilisation d'un antibiotique pour obtenir la bactérie mutante est moins gênante, dans la mesure où le gène de résistance à l'antibiotique est introduite dans le génome bactérien. Les risques de dissémination dudit gène à d'autres organismes sont alors réduits. De plus, le gène n'est présent qu'en une seule copie dans la bactérie (alors qu'il est présent à un grand nombre de copies lorsqu'il est porté par un plasmide). Par ailleurs, il n'est nul besoin de maintenir une pression de sélection en utilisant l'antibiotique sur la bactérie après avoir sélectionné la bactérie mutante désirée.
En conséquence, la technique classique d'obtention d'une bactérie knock- out pour le gène dapA peut être utilisée. De plus, si la présence d'un gène codant pour la résistance à l'antibiotique est réellement non désirable, certains systèmes de sélection négative peuvent permettre de supprimer ce gène, après inactivation du gène dapA.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit vecteur est stable dans son hôte procaryote, qui est préférentiellement E. coli. Dans un mode de réalisation préféré, ledit vecteur est dérivé du vecteur pQE-60 ou pQE-70 (le plasmide pQE-60 correspond à SEQ ID N° 3, le plasmide pQE-70 ne différant de celui ci que par un site multiple de clonage, ces deux plasmides étant commercialisés par Qiagen (www.qiagen.com)). Dans un mode de réalisation, ledit vecteur est dérivé d'un vecteur pUC, notamment du vecteur pUC 18.
L'homme du métier comprend le terme « dérivé », qui signifie notamment que le vecteur final possède globalement le même squelette (notamment les origines de réplication, et éléments stabilisateurs...) que le vecteur de départ dont il est dérivé. Il est important de noter que ceci signifie également que, de préférence, les éléments intergéniques sont conservés.
Dans le cas présent, les modifications apportées au vecteur de base sont restreintes et ne modifient pas l'hôte de réplication du vecteur, ni ses propriétés fondamentales (nombre de copies, taille de l'insert, stabilité...). Dans le cas présent, on considère surtout qu'un vecteur est dérivé d'un autre, après substitution du gène marqueur de sélection positive.
Dans le cas présent, le gène bla codant pour la résistance à l'ampicilline du vecteur pQE-60 ou pQE-70 est remplacé par le gène dapA.
Dans un cas particulier de l'invention, le vecteur comporte en outre un gène permettant la régulation ou l'induction de l'expression de ladite protéine.
En effet, lorsque le vecteur selon l'invention est dérivé de pQE-60 ou pQE- 70, le gène codant pour la protéine d'intérêt est alors sous le contrôle du promoteur T5, et de deux opérateurs lacO. Il peut donc être intéressant d'introduire, dans le squelette du vecteur selon l'invention, le gène lad, codant pour une protéine interagissant avec les opérateurs lacO, et restreignant l'expression de la protéine d'intérêt. Lorsque l'on ajoute de l'IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosidase) au milieu de culture, celui-ci fixe la protéine Lad, menant donc à l'expression induite de la protéine d'intérêt.
Dans un cas préféré, le vecteur selon l'invention est un vecteur pSP102, pSPl 14, pSP150, pSP139, pSPl 17, pSP136, tel que décrits dans les exemples, et en particulier le vecteur pSP114 ou pSP139 déposés à la CNC sous les numéros d'ordre respectifs 1-2796 et 1-2793, le 08 février 2002. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit vecteur ne contient pas de séquences spécifiques permettant une purification simplifiée de ladite protéine.
Par séquences spécifiques permettant une purification simplifiée de ladite protéine, on entend des séquences nucléiques situées en phase avec ladite protéine, en 5' ou 3' de la séquence codante de ladite protéine, lesdites séquences spécifiques codant pour une série d'acides aminés capables d'interagir avec des composés situés sur des supports de polymérisation (purification par chromatographie d'affinité, et récupération de la protéine native par clivage spécifique). De nombreux éléments peuvent être envisagés, et sont notamment résumés dans Ford et al. ("Fusion tails for the recovery and purification of recombinant proteins", Protein Expr Purif 1991 Apr-Jun;2(2-3):95-107).
On peut citer la queue polyhistidine (purification par chromatographie d'affinité à ions métalliques), les queues à acides aminés chargés (arginine, aspartate, glutamate, avec une chromatographie d'échange d'ions), les domaines se liant à la biotine, les enzymes (β-galactosidase, glutathion-S-transférase, chloramphénicol acétyl transférase, avec les ligands respectifs APTG, glutathion, chloramphénicol), les protéines se liant à des polypeptides (protéine A du Staphylocoques - IgG, protéine G du streptocoques - Albumine), les épitopes antigéniques (Flag, recA, β-galactosidase), les domaines se liant à des glucides (malE - maltose ou amidon réticulé, domaines de liaison à l'amidon, la cellulose ou le galactose).
Dans un autre mode de réalisation, l'invention se rapporte à un système d'expression d'une protéine, caractérisé en ce qu'il comporte :
- un premier vecteur selon l'invention, tel que décrit ci-dessus, et
- un hôte eubactérien, présentant une inactivation dans le gène dapA.
On a vu plus haut comment obtenir un hôte eubactérien (en particulier E. coli) présentant une inactivation, de préférence par une mutation (insertion, substitution, délétion) non réversible du gène codant pour ledit marqueur métabolique. Dans un autre mode de réalisation, ledit système d'expression comporte en outre un second vecteur portant un élément permettant la régulation ou l'induction de l'expression de ladite protéine. Ledit élément a été décrit plus haut. Il peut ainsi s'agir d'un gène codant pour une protéine se fixant au promoteur ou à un opérateur du système d'expression sur le premier vecteur, fixation pouvant être diminuée par l'addition d'un composé compétiteur.
Alternativement, ledit élément peut être un facteur de transcription, sous le contrôle d'un promoteur inductible, notamment par l'IPTG, ou le lactose.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit second vecteur ne contient pas de gène de résistance à un antibiotique, et comprend le gène thyA, en tant qu'unique facteur de sélection positive.
Le gène thyA code pour la thymidylate synthase, et les bactéries présentant une inactivation dans le gène thyA nécessitent la présence de thymidine si elles possèdent l'allèle tdk, ou de thymine si elles possèdent aussi l'allèle deoA pour leur croissance. Un gène thyA préféré est celui d'E. coli, représenté par SEQ ID N° 2.
Dans ce cas, et pour permettre la sélection, l'hôte eubactérien présente aussi une inactivation dans le gène thyA.
Dans un cas particulier, ledit second vecteur est le vecteur pREP4 (SEQ ID N° 4, commercialisé par Qiagen), dans lequel le gène neo codant pour la résistance la kanamycine a été remplacé par le gène codant pour thyA.
Dans un cas préféré, ledit système d'expression comporte au moins l'un des vecteurs choisis parmi pSPl 14, pSP139 et pVDM62 et au moins une souche choisie parmi +552, +838, +849, +1005, +1010 déposés à la CNCM sous les numéros d'ordre 1-2792 à 1-2796 le 08 février 2002. L'invention se rapporte également à un kit pour la production de protéines, comprenant un système d'expression selon l'invention, ainsi qu'à l'utilisation d'un vecteur selon l'invention, d'un système d'expression selon l'invention, ou d'un kit selon l'invention pour la production de protéines recombinantes. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine recombinante est la protéine pipA*, codée en particulier par le gène pipA* (SEQ ID N° 19). Dépôt de matériel biologique
Les organismes suivants ont été déposés le 08 février 2002 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.
- Souche +552 Numéro d'ordre 1-2792
- Souche +838 Numéro d'ordre 1-2793
- Souche +849 Numéro d'ordre 1-2794
- Souche +1005 Numéro d'ordre 1-2795
- Souche +1010 Numéro d'ordre 1-2796
Les souches déposées ont les génotypes suivants :
- Souche +552 ΔdapA :: erm - Souche +838 ΔdapA :: erm pSP 139
- Souche +849 ΔdapA :: cm - Souche +1005 ΔdapA :: cm ΔthyA :: erm
- Souche +1010 ΔdapA :: cm ΔthyA :: erm pSPl 14 pVDM62
Les plasmides inclus dans les souches peuvent aisément être isolés par des techniques connues de l'homme du métier, notamment en utilisant des kits commerciaux.
Les exemples ci-après sont destinés à illustrer certains modes de mise en oeuvre de l'invention, et ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES Les figures représentent les plasmides décrits dans les exemples.
Figure 1 : pSP102. Description du plasmide : MCS (396-455) ; LacZ (fragment N- Term de la β-Galactosidase) (469-146) ; Origine de réplication (réplicon pMBl) (866) : Gène dapA (séquence codante de la dihydropicolinate synthetase) (2504- 1626) Figure 2 : pQE 60. Description du plasmide : Début de numérotation / site Xhol (1) ; Promoteur T5 / opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; MCS (113-132) ; 6xHis-tag (133-150) ; Lambda tO (terminaison de la transcription) (173-267) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (1033-1131) ; ColEl origine de réplication (1608) ; Gène bla (séquence codante de la b-lactamase) (3226-2366). Figure 3 : pSP1 14. Description du plasmide : Début de numérotation / site Xhol (1) ; Promoteur T5 / opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; MCS (113-132) ; 6xHis-tag (133-150) ; Lambda t0 (terminaison de la transcription) (173-267) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (1033-1131) ; ColEl origine de réplication (1608) ; Gène dapA (séquence codante de la dihydropicolinate synthetase) (3244-2366) Figure 4 : pSP 139. Description du plasmide : Début de numérotation / site Xhol (1) ; Promoteur T5 / opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; MCS (113-132) ; 6xHis-tag (133-150) ; Lambda t0 (terminaison de la transcription) (173-267) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (1033-1131) ; ColEl origine de réplication (2812) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lad) (1219-2310) ; Gène dapA (4448-3570) Figure 5 : pSP150. Description du plasmide :Début de numérotation / site Xhol (1) ; Promoteur T5 / opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; MCS (113-132) ; 6xHis-tag (133-150) ; Lambda t0 (terminaison de la transcription) (173-267) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (1033-1131) ; ColEl origine de réplication (2812) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lad) (1218-2309) ; Gène dapA (4447-3569)
Figure 6 : plasmide pSPl 17. Description du plasmide : Début de numérotation / site Xhol (1) ; Promoteur T5 / opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; 6xHis-tag (1203-1220) ; Lambda t0 (terminaison de la transcription) (1243- 1343) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (2103-2201) ; ColEl origine de réplication ( 2684) ; Gène dapA (4303-3425)
Gène clone :Gène synthétique pipA* (1068 pb ; 355 AA) (115-1182) Figure 7 : pSP136. Description du plasmide : Début de numérotation / site Xhol (1) ; Promoteur T5 / opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; 6xHis-tag (1203-1220) ; Lambda t0 (terminaison de la transcription) (1243-1343) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (2103-2201) ; ColEl origine de réplication (3882) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lad) (2278-3369) ; Gène dapA (5507- 4629) ; Gène clone . Gène synthétique pipA* (1068 pb ; 355 AA) (115-1182) Figure 8 : pREP4. Description du plasmide : Début de numérotation / site HindIII (1) ; Gène neo(codant 1 'aminoglycoside 3'-phosphotransférase) (357-1151) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lad) (2620-1529)
Figure 9 : pVDM62. Description du plasmide : Début de numérotation / site HindIII (1) ; Gène thyA (527-1321) ; Extrémité 3' du gène neo (1471-1702) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lad) (3171-2080).
Figure 10 : pEVL225. Description du plasmide : Début de numérotation / site Xhol (1) ; Promoteur T5 / opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; MCS (113-134) ; Lambda tO (terminaison de la transcription) (155-249) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (1015-1113) ; ColEl origine de réplication (2794) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lad) (1201-2292) ; Gène dapA (4430-3552) Figure 11 : pEVL227. Description du plasmide : Début de numérotation / site Xhol (1) ; Promoteur T5 / opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; MCS (113-134) ; Lambda tO (terminaison de la transcription) (155-249) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (1015-1 1 13) ; ColEl origine de réplication (2794) ; Gène régulateur de l'opéron lac (lad) (1200-2291) ; Gène dapA (4429-3551) Figure 12 : pEVL254. Description du plasmide : Début de numérotation / site Xhol (1) ; Promoteur T5 / opérateur lac (7-87) ; Site + 1 de début de transcription (61) ; Lambda tO (terminaison de la transcription) (1225-1319) ; rrnB Tl (terminaison de la transcription) (2085-2183) ; ColEl origine de réplication (3864) ; Gène régulateur de l'opéron lac (la ) (2260-3351) ; Gène dapA (5489-4611) ; Gène clone : Gène synthétique pipA* (1068 pb ; 355 AA) (1 15-1182)
EXEMPLES Exemple 1: Construction de plasmides propagés de façon stable dans E. coli sans marqueur de résistance à un antibiotique.
1.1. Construction d'un plasmide de clonage sans marqueur de résistance à un antibiotique.
Cette construction est réalisée à partir du plasmide commercial pUC18 (BioLabs) qui porte une origine de réplication du groupe de compatibilité ColEI et le gène bla de résistance aux pénicillines spécifiant la β-lactamase.
La séquence du plasmide pUC18 a été modifiée par mutagénèse dirigée aux nucléotides 1615 (changement T vers C), 1617 (changement G vers A) et 1618 (changement T vers G) par une méthode décrite (Ansaldi et al., 1996 Anal. Biochem., 234: 110-1 1 1) en utilisant les oligonucléotides PUC1 et PUC2 (SEQ ID N° 5 et SEQ ID N° 6). Le plasmide pSP98 ainsi obtenu possède un site unique Xhol. La digestion du plasmide pSP98 par les enzymes de restriction Sspl et Xhol permet d'éliminer le gène bla.
Le gène dapA d'E. coli spécifie la dihydropicolinate synthase, enzyme qui catalyse la première étape de la synthèse de l'acide meso-diaminopimélique (DAP), un précurseur du peptidoglycanne. Ce gène a été amplifié par PCR sur l'ADN chromosomique d'E. coli. 2 μl d'ADN total ont été mis en présence des 4 dNTP (250 μM), de chacun des oligodésoxynucléotides PUC3 et PUC4 (500 nM) (SEQ ID N° 7 et SEQ ID N° 8) et d'une unité de Vent DNA Polymérase (BioLabs) dans un volume final de réaction de 50 ml dans le tampon 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM Tris-HCl pH 8.8, 2 mM MgSO4, 0.1 % Triton X-100. Après une période de dénaturation à 95°C pendant 5 min, l'amplification de l'ADN a été réalisée durant 30 cycles de dénaturation 30 sec à 95°C - hybridation 30 sec à 52°C - élongation 1 min à 72°C, et terminée par 5 min d'élongation à 72°C.
Le fragment ainsi amplifié a été digéré par Sspl et Xhol et introduit par ligation dans le plasmide pSP98 lui aussi préalablement digéré par Sspl et Xhol. Les produits de ligation ont été introduits dans des souches d'E. coli portant une délétion au locus dapA et qui nécessitent donc pour croître la présence dans le milieu de culture d'acide méso-diaminopimélique (DAP), et plus précisément dans les souches +849, (ΔdapA: :cat, construite selon Richaud et al., 1993 J. Biol. Chem., 268:26827-26835), déposée à la CNCM sous le numéro 1-2794, ou +552 (ΔdapA: :erm, construite selon une méthode analogue à celle utilisée pour la souche +849), et déposée à la CNCM sous le numéro 1-2792. Les transformants ont été sélectionnés sur le milieu riche de Luria-Bertani (LB, DIFCO) sans DAP.
Douze transformants ont été analysés pour essayer de déceler la présence de plasmides portant le gène dapA+ conformes à la construction espérée. Les ADN plasmidiques de ces 12 transformants ont été extraits (Kit Qiaprep, Qiagen) et soumis à des coupures analytiques par des enzymes de restriction appropriées. Un plasmide conforme a été isolé et nommé pSP102. Une représentation schématique de ce plasmide est donnée en Figure 1. La souche +541 contenant le plasmide pSP102 (ΔdapA: :erm pSP102) a été restriée cinq fois consécutivement sur LB-agar sans DAP et le maintien du plasmide de clonage pSP102 en l'absence d'antibiotique a été établi.
1.2. Construction d'un plasmide d'expression sans marqueur de résistance à un antibiotique.
Cette construction utilise le plasmide commercial pQE60 (Qiagen, représenté schématique en Figure 2). Ce plasmide (origine de réplication ColEl, gène bla) contient le promoteur du phage T5, deux éléments de l'opérateur lac, le site synthétique de liaison ribosomique RBSII en 5' du polylinker et une séquence de codage pour un tag 6 x His en 3' du polylinker.
Afin de remplacer le gène bla par le gène dapA d'E. coli, la séquence du plasmide pQE60 a été modifiée par mutagénèse dirigée (méthode selon Ansaldi et al., 1996, op. cit.) au nucléotide 838 (changement T vers A, oligonucléotides PQE60/1 et PQE60/2, SEQ ID N° 9 et SEQ ID N° 10), entraînant la destruction d'un site de restriction Sspl et aux nucléotides 2358-2360 (changement TCT vers GTC, oligonucléotides PQE60/3 et PQE60/4, SEQ ID N° 11 et SEQ ID N° 12) entraînant la création d'un site de restriction Sali. Le plasmide obtenu, pSPHO, a été digéré ensuite par Sspl et Sali afin d'éliminer le gène bla. Le gène dapA d'E. coli a été amplifié par PCR sur ADN chromosomique d'E. coli comme décrit ci-dessus dans l'exemple 1.1 à l'aide des oligonucléotides PQE60/5 et PQE60/6 (SEQ ID N° 13 et SEQ ID N° 14) .
Le fragment ainsi amplifié a été digéré par les enzymes de restriction Xhol et EcoRV et introduit par ligation dans le plasmide pSPl 10 digéré par Sspl et Sali. Les produits de ligation ont été introduits dans la souche +552 (ddapA::erm ) et la souche transformante +644 sélectionnée sur milieu LB sans ajout de DAP. La présence du gène dapA sur le plasmide extrait de cette souche a été confirmée par séquençage. Ce plasmide, représenté schématiquement en Figure 3 a été nommé pSP114. La construction d'un vecteur d'expression dapA+ d'E. coli portant le gène répresseur la de l'opéron lactose a été réalisée à partir du plasmide pSPl 14 et le gène lad du plasmide pREP4 (Qiagen) amplifié par PCR. L'amplification a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus en 1.1. en présence d'ADN plasmidique 10 nM et des oligodésoxynucléotides PQE60/7 et PQE60/8 (SEQ ID N° 15 et SEQ ID N° 16). Le fragment ainsi amplifié a été digéré par Nhel et introduit par ligation dans le plasmide pSPl 14 préalablement digéré par Xbal (site de coupure unique au nucléotide 1 134). Les produits de ligation ont été introduits dans la souche +552 et les transformants sélectionnés sur milieu LB sans ajout de DAP.
Les ADN plasmidiques des transformants ont été extraits et analysés. Ainsi, la présence du gène lad sur le plasmide pSP139 (fig. 4) de la souche transformante +838 et son orientation par rapport aux autres éléments du plasmide ont été vérifiées par coupures analytiques avec des enzymes de restriction appropriées et par séquençage. La souche +838 a été déposée à la CNCM sous le numéro 1-2793. Le même schéma de construction a été appliqué au vecteur commercial pQE70 (QIAGEN) qui possède un site de clonage (MCS : multiple cloning site) différent de celui du pQE60. Le vecteur résultant (pSP150) est représenté schématiquement en Figure 5. Les plasmides pSP114, pSP139 (dérivés de pQE60) et pSP150 (dérivé de pQE70) offrent donc un large éventail de possibilités de clonage.
Exemple 2: Surexpression dans E. coli du gène hétérologue pipA* clone dans les plasmides dapA+. Le gène pipA d'une taille de 1066 pb codant pour la lysine cyclodésaminase de Streptomyces pristinaespiralis et dont la séquence est décrite dans le brevet WO 9601901 -Al, est composé d'une proportion en G + C de 69,6 %. Ce gène a été réécrit suivant le code génétique optimisé pour l'expression dans Escherichia coli (pipA*, SEQ ID n° 19) et est désormais composé d'une proportion en G + C de 38 %. Ce gène a été construit par PCR.
Afin d'introduire un site de restriction unique Kpnl, le résidu thréonine 97 a été codé par ACC au lieu de ACT. Un codon de terminaison de la traduction TAA a été également ajouté en position 1080 (1er nucléotide du codon) de la séquence SEQ ID n° 19, et des sites de restriction uniques EcoRI et Ncol d'une part, HindIII d'autre part, ont été introduits respectivement en 5' et en 3' du gène permettant ainsi son insertion dans un vecteur de clonage. La traduction commence à l' ATG en position 15. Le gène synthétique pipA* a été préalablement clone dans le vecteur pQE60 pour donner le plasmide pSP47. Il a ensuite été inséré dans les vecteurs dapA+ pSP114 et pSP139 (décrits ci-dessus en 1.2.). Le plasmide pSP47 a été coupé par les enzymes de restriction Ncol et BglII ; le fragment de digestion de 1076 bp a été introduit par ligation dans les plasmides pSP114 et pSP139 digérés par Ncol et BglII. Les produits de ligation ont été introduits dans la souche +552 (décrite à l'exemple 1.1) et les transformants sélectionnés en milieu LB sans DAP. Les plasmides pSP117 (Figure 6) et pSP136 (Figure 7) résultant respectivement des ligations avec les vecteurs pSP114 et pSP139 ont été caractérisés et réintroduits dans la souche +552. Les souches +626 et +823 ont été ainsi isolées, hébergeant respectivement les plasmides pSP117 et pSP136.
L'expression du gène pipA* a été étudiée dans les trois souches +75, +626 et +823. La souche +75 est un dérivé de la souche d'E. coli K12 MG1655 (Vidal et al. (1998) J. Bacteriol., 180 :2442-2449) contenant le plasmide pSP47 (pQE60::pipA*) et le plasmide auxiliaire pREP4 portant le gène lad. Les souches +626 et +823 et la souche contrôle +75 ont été cultivées en milieu LB à 37°C jusqu'à atteindre la densité optique (600 nm) de 0,8.
Dans le cas des souches +75 et +823, 1TPTG a été ajouté au milieu de culture suivant le protocole du fournisseur (Kit Qiaexpressionist, Qiagen) pour induire l'expression du gène pipA*.
Les protéines totales des cellules ainsi cultivées ont été séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide/SDS et colorées par le bleu de Coomassie. Une protéine d'un poids moléculaire de 36 kDa a été détectée et son taux d'expression a été estimé à environ 5 % des protéines totales dans les trois souches. Des cultures témoins des souches +75 et +823 sans ajout d'IPTG ont permis de contrôler l'absence d'expression du gène pipA* et donc l'activité du répresseur lad porté, en trans sur le plasmide auxiliaire pREP4 (souche +75), en cis sur le plasmide pSP136 (souche +823).
Exemple 3: Stabilité de l'activité L-lysine cyclodésaminase propagée par un plasmide dapA+ lacl+ sans marqueur de résistance à un antibiotique.
Il est apparu que l'expression de l'activité de la L-lysine cyclodésaminase n'était pas stable dans la souche +626, bien que le plasmide se maintienne et assure la croissance en absence de DAP dans le milieu de culture. Ceci laisse suggérer que l'enzyme PipA* est toxique pour les cellules. Cet effet n'a pas été décrit auparavant.
Les constructions décrites ci-dessus (souches +75 et +823) permettent de verrouiller l'expression du gène pipA* par expression du répresseur la , d'induire l'expression du gène toxique en présence d'IPTG et offrent, dans le cas de la souche
+823, un vecteur d'expression inductible dépourvu de gène de résistance à un antibiotique.
Les souches +75, +626 et +823 (décrites dans l'exemple 2) ont été cultivées chacune dans 100 ml de milieu LB à 37°C jusqu'à atteindre la phase stationnaire (24h). Ces cultures ont été ensuite diluées en inoculant 100 mL de LB neuf avec 100 mL de la culture stationnaire. Cette opération de dilution au millième a été réalisée sept fois consécutivement sur chaque culture, réalisant ainsi approximativement 70 générations. L'activité L-lysine-cyclodésaminase de la protéine PipA* exprimée dans les souches +75, +626 et +823 a été testée suivant un protocole décrit ci-dessous sur des aliquots conservés par congélation des cultures correspondant à 0, 20, 40, 60 et 70 générations.
Après induction, les cultures sont centrifugées à 13000g et les culots cellulaires sont repris dans du milieu minéral MS de façon à concentrer les cellules 100 fois. Les cellules sont alors perméabilisées par deux étapes de congélation/décongélation à -20°C favorisant l'accès du substrat à l'enzyme. La L- lysine monohydrochloride (pH = 7) est alors ajoutée à une concentration finale de 1 M dans les suspensions cellulaires (volume final = 2 mL). La réaction enzymatique se fait à 37°C sous agitation. Au bout de 20 heures on prélève un échantillon de 300 μl de chaque culture que l'on centrifuge à 13000g de façon à récupérer le surnageant. Une solution diluée des surnageants est ensuite déposée sur couche mince de silice.
L'activité de la lysine-cyclodésaminase est mesurée par la conversion de la L-lysine en acide-L-pipécolique dans des suspensions cellulaires et par la révélation de l'acide-L-pipécolique par coloration avec la ninhydrine après migration chromatographique en couche mince (Rf = 0.22 ; butanol / acide acétique / eau
4/1/1). Dans le cas de la souche +626 on a constaté une perte totale d'activité au bout de 20 générations. En revanche, dans le cas des souches +75 et +823, l'activité de la L-lysine-cyclodésaminase est stable au-delà de 70 générations.
Exemple 4: Construction d'une souche permettant la propagation stable de deux plasmides sans gènes de résistance à des antibiotiques.
4.1. Construction d'une souche d'E. coli portant deux délétions : au locus thyA spécifiant la thymidylate synthase et au locus dapA spécifiant la dihydropicolinate svnthase. Un lysat du phage PI récolté sur la souche d'E. coli +849 (ΔdapA::cat, exemple 1.1) a été employé pour transduire le caractère ΔdapA::cat dans la souche βl308 (ΔthyA::erm, Lemeignan et al., 1993 J. Mol. Biol., 231 :161-166). La souche transductante +1005 (ΔdapA::cat ΔthyA::erm) a été sélectionnée en présence de chloramphénicol sur milieu LB supplémenté avec de la thymidine (dT, 0.3 mM) et du DAP (0.1 mM). Les auxotrophies pour la thymidine et pour le DAP ont été confirmées sur les milieux appropriés. La souche +1005 a été déposée à la CNCM sous le numéro 1-2795.
4.2. Construction d'un plasmide thyA+ sans marqueur de résistance à un antibiotique
Le gène thyA a été amplifié par PCR à partir du plasmide pTSO (Lemeignan et al., 1993) construit par insertion du gène thyA sauvage d'E. coli dans le plasmide commercial pTZ18R (BioRad). L'amplification PCR a été réalisée avec les oligonucléotides PREP1 et PREP2 (SEQ ID N° 17 et SEQ ID N° 18) en utilisant la Vent Polymerase (Biolabs) selon le protocole décrit à l'exemple 1.1. Le fragment amplifié a été coupé avec les enzymes de restriction Ncol et BglII et introduit par ligation dans le vecteur pREP4 (Qiagen, représenté schématiquement en Figure 8) dont la cassette de résistance à la kanamycine (neo) a été éliminée par digestion avec Ncol et BglII. Les produits de ligation ont été introduits dans la souche βl308 et des transformants sélectionnés sur milieu LB sans ajout de thymidine. Le plasmide pVDM62 (Figure 9) a été isolé. Le remplacement de la cassette neo par le gène thyA a été vérifié par coupure du plasmide pVDM62 avec des enzymes de restriction appropriées et séquençage du gène lad.
4.3. Expression inductible et stable du gène hétérologue pipA* dans la souche +1005 (ΔdapA::cat ΔthyA::erm)
Le plasmide pVDM62 construit à l'exemple 4.2 a été introduit dans la souche +1005 décrite à l'exemple 4.1 ; les transformants ont été sélectionnés en milieur LB en présence de DAP et en absence de thymidine. Un de ces transformants (souche +1007) a été ensuite isolé puis transformé avec le plasmide pSPl 17 résultant de la ligation entre le pSP114 coupé par Ncol et BglII et l'insert portant le gène pipA* du plasmide pSP47 coupé par les mêmes enzymes. Les transformants ont été sélectionnés sur milieu LB en absence de DAP.
La souche (+ 1008) ainsi obtenue héberge les plasmides pVDM62 et pSP117. Cette souche a été cultivée en présence ou en absence d'IPTG et les activités de la lysine-cyclodésaminase produite ont été mesurées comme décrit à l'exemple 3 et comparées entre elles. Il a ainsi été vérifié que l'expression de l'enzyme est bien verrouillée par le répresseur lad présent en trans sur le plasmide pVDM62.
Parallèlement la souche (+1010) a été construite en introduisant le plasmide pSP114 dans la souche +1007. Cette souche, hébergeant les plasmides pSP114 et pVMD62 a été déposée à la CNCM sous le numéro 1-2796.
Ces exemples démontrent que les marqueurs de sélection métaboliques dapA et thyA peuvent être utilisés dans des vecteurs d'expression de protéines, dans des hôtes appropriés. Ils démontrent aussi l'utilité du répresseur lad, et son activité en cis ou en trans.
Exemple 5: Construction et utilisation de plasmides d'expression dépourvus de séquence étiquette utile pour la purification des protéines et propagés de façon stable dans E. coli sans marqueur de résistance à un antibiotique.
La séquence du plasmide pSP139 décrit à l'exemple 1.2. a été modifiée par mutagénèse dirigée selon la méthode décrite par Ansaldi et al. (1996) en utilisant les oligonucléotides 817 et 818 (SEQ ID N°21 et SEQ ID N°22). Le plasmide pEVL225 ainsi obtenu et représenté schématiquement en Figure 10, ne comporte plus la séquence de 18 paires de bases présente sur le plasmide pQE60 et codant pour l'étiquette hexa-histidyl de purification des protéines.
Le même protocole de délétion par mutagénèse dirigée a été appliqué au plasmide pSP150 décrit à l'exemple 1.2. pour construire le plasmide pEVL227 représenté schématiquement en Figure 1 1.
Le gène synthétique pipA* spécifiant la lysine cyclodésaminase de Streptomyces pristinaespiralis préalablement clone dans le vecteur pQE60 (pSP47, FR 2 825 717 Al) a été inséré dans le vecteur dapA+ pEVL225 décrit ci-dessus. Le plasmide pSP47 a été coupé par les enzymes de restriction Ncol et BglII ; le fragment de digestion de 1076 bp ainsi obtenu a été introduit par ligation dans le plasmide pEVL225 digéré par Ncol et BglII. Le produit de la ligation a été introduit dans la souche +552 (décrite à l'exemple 1.1., déposée à la CNCM, sous le numéro 1-2792) et les transformants sélectionnés en milieu LB sans DAP. Le plasmide pEVL254 a été extrait à partir d'une culture de ces transformants puis caractérisé. Le plasmide pEVL254 est représenté schématiquement en Figure 12.
Les plasmides respectifs pEVL225, pEVL227, et pEVL254 ont été introduits dans la souche +552 (ΔdapA: :erm) et les souches transformantes respectives +2140, +2142 et +2294 ont été sélectionnée sur milieu LB sans ajout de DAP comme décrit à l'exemple 1.1.
L'expression efficace du gène pipA* dans la souche +2294 par induction à 1TPTG a été vérifiée par visualisation d'une bande de 36 kDa après électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes comme décrit à l'exemple 2. Par ailleurs, la stabilité d'une telle expression du gène pipA* après propagation de la souche +2294 en milieu LB pendant plus de 70 générations et le maintien du niveau élevé d'activité de la lysine cyclodésaminase codée par le gène pipA* ont été confirmés en utilisant la méthode décrite à l'exemple 3.

Claims

Revendications
I. Vecteur d'expression d'une protéine dans une eubactérie, caractérisé en ce qu'il comprend le gène dapA, en tant qu'unique facteur de sélection positive. 2. Vecteur de clonage selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est stable dans son hôte eubactérien.
3. Vecteur de clonage selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il est dérivé d'un vecteur choisi parmi pQE60, pQE70 et pUC18.
4. Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gène bla codant pour la résistance à l'ampicilline est remplacé par le gène dapA.
5. Vecteur selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un gène permettant la régulation/l'induction de l'expression de ladite protéine.
6. Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit gène est le gène la , et que l'induction est réalisée par 1TPTG ou le lactose. 7. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il ne contient pas de séquences spécifiques permettant une purification simplifiée de ladite protéine.
8. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pSP114 ou du vecteur pSP139 déposés à la CNCM sous les numéros d'ordre respectifs 1-2796 et 1-2793, le 08 février 2002.
9. Système d'expression d'une protéine, caractérisé en ce qu'il comporte :
- un premier vecteur selon l'une des revendications 1 à 8
- un hôte eubactérien, présentant une inactivation irréversible dans le gène dapA. 10. Système d'expression selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un second vecteur portant un élément permettant la régulation ou l'induction de l'expression de ladite protéine.
I I. Système d'expression selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit second vecteur comprend le gène thyA, en tant qu'unique facteur de sélection positive.
12. Système d'expression selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit second vecteur est le vecteur pREP4, dans lequel le gène neo codant pour la résistance à la kanamycine a été remplacé par le gène codant pour ledit marqueur métabolique.
13. Système d'expression selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'un des vecteurs choisis parmi pSP114, pSP139 et pVDM62 et/ou au moins une souche choisie parmi +552, +838, +849, +1005,
+1010 déposées à la CNCM sous les numéros d'ordre 1-2792 à 1-2796 le 08 février 2002.
14. Kit pour la production de protéines, comprenant un système d'expression selon l'une des revendications 9 à 13. 15. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 8, d'un système d'expression selon l'une des revendications 9 à 13, ou d'un kit selon la revendication 14 pour la production de protéines recombinantes. 16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite protéine recombinante est la protéine pipA*.
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