WO2003062418A1 - Procede et systeme de detection de donnees relatives a un acide nucleique - Google Patents

Procede et systeme de detection de donnees relatives a un acide nucleique Download PDF

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WO2003062418A1
WO2003062418A1 PCT/JP2003/000668 JP0300668W WO03062418A1 WO 2003062418 A1 WO2003062418 A1 WO 2003062418A1 JP 0300668 W JP0300668 W JP 0300668W WO 03062418 A1 WO03062418 A1 WO 03062418A1
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probe
target nucleic
temperature
reaction
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Hisashi Koike
Tomonori Nagaoka
Takatomo Satoh
Yoshioki Kaneko
Midori Hatanaka
Morinao Fukuoka
Hiroko Sakamoto
Hiroyuki Yonekawa
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Olympus Corporation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a method and an apparatus for detecting nucleic acid information forcefully.
  • a DNA probe complementary to each of a nucleic acid having a normal gene sequence or a nucleic acid having a known mutation in the gene sequence is prepared in advance.
  • a certain sample DNA is hybridized separately to each probe, and the amount of these hybrids is detected and compared, and it is determined that the probe with more hybridization has higher complementarity with the sample DNA. Is being done. That is, if the amount of hybridization to the probe complementary to the normal DNA is large, the sample DNA is normal, and if the amount of hybridization to the probe complementary to the mutant DNA is large, the sample DNA suddenly It can be assumed that the mutation has occurred.
  • a detectable label is applied to the sample DNA and the amount of DNA is indirectly detected by detecting the label.
  • fluorescence, RI (radioactive isotope), chemiluminescence and the like are used for such a label.
  • DNA microarrays which collectively detect information on multiple genes, has begun to spread.
  • DNA microarrays makes it possible to analyze information about multiple genes at the same time, and is often used for mRNA expression analysis.
  • Base mutation polymorphism Base mutation polymorphism
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-50931 proposes a method for detecting a single base mutation at high speed and with high sensitivity by using an electrochemical reaction in a DNA microarray.
  • the reaction is accelerated by applying electrodes to each element and applying a voltage.
  • a method for performing hybridization at high speed and with high accuracy a method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-51525 is cited. In this method, a metal oxide having a porous structure is used as a reaction carrier, and the solution is driven from one surface to the other surface, thereby increasing the diffusion speed of the sample solution and speeding up the reaction. is there.
  • a probe corresponding to a base mutation is prepared, and the mutation is identified using its specificity.However, in order to reliably detect a single base mutation difference, a probe containing a mismatched nucleotide is used. I use. This is due to the difference in Tm between the hybrid between the hybrid with the perfect match and the probe with a single base mutation and the difference between the hybrid with the probe with a single base mutation and the hybrid with the probe with a single base mutation. This is to take advantage of the fact that is larger.
  • the absolute hybridization intensity is reduced, there are problems in that much time is required for the reaction, and in terms of sensitivity.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above-described various problems with the conventional technology. As a result of performing signal data acquisition in a powerful manner, more and more accurate We found that it would be possible to obtain more reliable information.
  • the target nucleic acid is brought into contact with a probe having a sequence complementary to at least a part of the target nucleic acid sequence.
  • the signal data acquisition is performed while changing reaction measurement conditions or detection conditions. More specifically, the reaction temperature, or the composition of the reaction solution, It is preferable that the change is performed while changing at least one of the capacity and the type, and it is particularly preferable that the change is a change in the reaction temperature.
  • the method for detecting nucleic acid information of the present invention also includes a perfect match probe that is completely complementary to at least a part of the sequence of the target nucleic acid, and one or more types of imperfections in which at least a part of the perfect match probe is mutated.
  • the match probe is brought into contact with the target nucleic acid, a hybrid is formed between the target nucleic acid and the complete match probe or the incomplete match probe, and the hybrid of the target nucleic acid is determined based on a difference in binding strength of the hybrid.
  • the method for detecting nucleic acid information is characterized in that the method includes force-inductively acquiring data of the signal while continuously or stepwise changing conditions for measuring or detecting a signal generated by the hybrid. I do.
  • the acquisition of the signal data is a change in at least one of a reaction temperature, or a composition, a volume, or a type of a reaction solution. It is a change of Is preferred.
  • the reaction temperature in the nucleic acid information detection method described above may be changed one or more times from a temperature lower than the Tm value of the hybrid to be detected to a temperature increase between temperatures exceeding the Tm value, or such a temperature increase and a temperature decrease. It is preferred that the temperature cycle be the same.
  • the maximum value of the signal intensity and / or the amount of change in the signal intensity may be measured during that time.
  • the temperature at which the signal emitted by the hybrid is measured is continuously or stepwise increased, and the intensity of the signal emitted from the hybrid between the respective temperatures is increased.
  • the temperature can be maintained when the amount of change turns negative.
  • the method for detecting nucleic acid information of the present invention further comprises, in any of the above-described embodiments, using a plurality of types of probes in the same system to which the same reaction conditions can be applied, and obtaining information on a plurality of types of nucleic acids. It is characterized by simultaneous detection, and more specifically, a DNA microarray can be used.
  • the method for detecting mutation of a nucleic acid sequence of the present invention is characterized in that the probe is a plurality of types of probes having a plurality of types of sequences, and the probes have sequences overlapping each other.
  • the method for detecting a mutation in a nucleic acid sequence of the present invention also includes the method for detecting a mutation in a nucleic acid sequence described above, wherein the plurality of types of probes are completely complementary to at least a part of the sequence of the target nucleic acid.
  • the determination can be made by comparing the results of the analysis with the probe group having a lower Tm value and the results of the analysis with the probe group having a higher Tm value among the overlapping probes.
  • Probes of SEQ ID NOs: 56 to 69 characterized in that the probe having the above sequence has a 20-mer nucleotide sequence for analyzing K_i'as codonl2 can be used.
  • probes having SEQ ID NOs: 70 to 83 characterized in that the probe having the above sequence has an r7mer base sequence for analyzing K-ras codonl2, can be used.
  • the above-mentioned probe has a 17-mer nucleotide sequence for the purpose of analyzing K_ms codonl2.
  • Probes having SEQ ID NOs: 70 to 83, which have a 20-mer nucleotide sequence for the purpose of analyzing lobe and Ks codonl2, can be used.
  • the hybrid formation may be performed by bringing a liquid sample containing a target nucleic acid into contact with a probe fixed to a porous body. It is characterized by.
  • the method for detecting nucleic acid information preferably includes a step of reciprocating the liquid sample once or a plurality of times in the porous body.
  • the detection of a signal can be performed based on the detection of a fluorescent label.
  • the target nucleic acid may be any of an oncogene, an intracellular drug resistance gene, a cell cycle control gene, or an apoptosis-related gene, or a combination thereof.
  • the nucleic acid information detection device of the present invention includes a sample storage container for containing a sample containing a target nucleic acid, a nucleic acid-reactive carrier including a porous structure capable of immobilizing nucleic acid and connected to the container, Driving means for controlling and flowing without leakage between the nucleic acid reaction carrier, temperature control means for controlling the reaction temperature on the reaction carrier, and a target formed in the porous structure It is characterized by including means for detecting a signal emitted from a hybrid between the nucleic acid and the probe.
  • nucleic acid information detection device of the present invention there are provided one or more solution storage containers connected to the nucleic acid reaction carrier and for storing a solution of a different type from the sample containing the target nucleic acid, and the solution storage device as appropriate.
  • a means for mixing various solutions contained in the container and sending the mixed solution to the nucleic acid reaction carrier may be further included.
  • the target nucleic acid can be any of an oncogene, an intracellular drug resistance gene, a cell cycle control gene, or an apoptosis-related gene, or a combination thereof.
  • FIG. 1 This is a diagram schematically showing the nucleic acid information analyzer of the present invention.
  • Figure 2 This figure shows the results of force-intensity measurement of the hybridization between a target nucleic acid and a perfect match probe or an incomplete match probe while changing the hybridization temperature.
  • the signal measurement temperature was set at 25 ° C
  • the region (B) at 40 ° C
  • the region (C) at 60 ° C.
  • the sample solution was reciprocated five times to the nucleic acid reaction carrier.
  • FIG. 3 This figure shows the result of detecting the p53 gene derived from a cell line by the method of the present invention.
  • FIG. 4 This figure is a probe arrangement diagram of the DNA microarray used in Example 3.
  • FIG. 5 This figure shows the results of the experiment of Example 3 for detecting a mutation in the K-RAS gene.
  • the lower panel shows the results of measuring the fluorescence at 1 minute, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, and 40 minutes after the start of hybridization.
  • FIG. 6 This figure is a probe arrangement diagram of the DNA microarray used in Example 4.
  • FIG. 7 is a view showing experimental results of Example 4 in which the p53 gene and the K-RAS gene are simultaneously detected.
  • the lower panel shows the results of measuring the fluorescence at 1 minute, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, and 40 minutes after the start of hybridization.
  • Fig. 8 shows the difference in signal from the hybrid at temperature ⁇ ( ⁇ ') in the system using probes A-D.
  • the fluorescence intensity in this figure, the fluorescence intensity for nucleic acids B, C, and D is the strongest, followed by nucleic acid A and probe A complete match, and nucleic acid A and probe A — The fluorescence intensity decreases in the order of base mismatch.
  • Figure 9 shows the difference in signal from the hybrid at the temperature ⁇ ( ⁇ ') in the system using probes A-D.
  • the method of expressing the difference in fluorescence intensity is in accordance with the expression method in FIG. 8, and a spot without hatching indicates the weakest fluorescence intensity.
  • Figure 10 shows the difference in signal from eight hybrids at a temperature T (C) in a system using probe A-D.
  • the method of expressing the difference in the fluorescence intensity is in accordance with the expression method in FIG. 8, and the spot without any hatching indicates the weakest fluorescence intensity.
  • Fig. 12 shows the profile of temperature change during force-inductive acquisition of data.
  • FIG. 13 is a spot arrangement diagram of probes in the DNA microarray used in Example 6.
  • Fig. 14 When hybridized at room temperature (25 ° C) in Example 6 5 compares the signal intensity of each spot.
  • Fig. 15 Comparison of the signal intensity of each spot when hybridizing at 55 ° C in Example 6.
  • FIG. 16 A comparison of the signal intensity of each spot when hybridizing at ⁇ 2 ° C. in Example 6. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Nucleic acid refers to DNA or RNA, including DNA, RNA, and artificial nucleotides.
  • RN A means any of them.
  • the “probe” means a nucleic acid fragment for testing a nucleic acid in a sample using a hybridization reaction based on complementation of nucleic acids.
  • Probe types of probes means, when the target gene is a single gene, a probe obtained by substituting, inserting, or deleting a part of the base sequence of the probe with another base sequence; and It means a plurality of probes using different base parts as gene capture sites. When there are a plurality of target genes, it means a plurality of complementary nucleic acid sequence probes for each gene.
  • Hybrid refers to a homologous or heterologous duplex formed between any of the above nucleic acids, and includes DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA and the like. '
  • nucleic acid information refers to the nucleic acid sequence itself, the presence or absence of a mutation in the nucleic acid sequence, physical properties (eg, Tm) that changes depending on the nucleic acid sequence, and the amount of the nucleic acid (eg, mRNA copy number).
  • the “signal” is a signal that can be appropriately detected and measured by an appropriate means, and includes fluorescence, radioactivity, chemiluminescence, and the like.
  • “Perform force-inductively” means that the data is acquired not only at a fixed point in time, but also at successive or intermittent points in time.
  • the method for detecting nucleic acid information of the present invention comprises: contacting a target nucleic acid with a probe having a sequence complementary to at least a part of the target nucleic acid sequence; In a method for detecting information of the target nucleic acid by measuring a signal emitted in an amount dependent on the amount of the hybrid, a data acquisition of the signal In the operation.
  • the target nucleic acid can be of various types, such as DNA from the genome, mRNA extracted from cells, DNA amplified by PC, and plasmid DNA, and can be used for hybridization with a probe. This is not particularly limited as long as it does not contain any adverse substances. However, in order to perform a highly accurate experiment, it is preferable to use a sample whose purity has been further increased by various purification techniques known in the art. Further, in the target nucleic acid, it is preferable that at least a part of the sequence of a portion to be hybridized is known in order to synthesize a probe. The introduction of the label into the target nucleic acid can be performed by reverse transcription of PCR of mRNA.
  • Contact between the target nucleic acid and the probe is performed by contacting the probe with the target immobilized on a carrier capable of immobilizing the nucleic acid without disturbing duplex formation with other nucleic acids. It can be performed by contacting a solution containing a nucleic acid or the like.
  • the formation of eight hybrids between the target nucleic acid and the probe can be performed under conditions determined based on the difference in binding strength depending on the sequence information of the hybridizing portion. If it is a change, it can be done at a temperature determined based on the difference in Tm. At a temperature lower than Tm, but near Tm, specific duplex formation between the target nucleic acid and probe is likely to occur, and non-specific duplex formation is unlikely to occur. It takes time to form. On the other hand, at a temperature lower than the temperature at which specific duplex formation is likely to occur, the reaction time for duplex formation is reduced, but non-specificity between the target nucleic acid and the probe is reduced. The amount of binding increases. Therefore, the setting of the temperature of the reaction is determined by the required experimental accuracy and the required reaction time. In addition, other reaction conditions are similarly determined in consideration of this.
  • the measurement of the signal emitted in an amount dependent on the amount of the hybrid is usually performed using a label that has been previously introduced into the sample nucleic acid, but includes, for example, a fluorescently labeled sample nucleic acid and a radioisotope.
  • a label that has been previously introduced into the sample nucleic acid, but includes, for example, a fluorescently labeled sample nucleic acid and a radioisotope.
  • a sample nucleic acid synthesized from NTP can be used.
  • various nucleic acid labeling techniques regardless of existing ones and newly developed ones
  • it is also possible to detect the hybrid by adding a reagent that binds to the hybrid double heavy chain after the formation of the hybrid and detecting it.
  • Examples of the case where hybrids are detected by fluorescence include the method of using a primer that has a fluorescent label introduced in advance when synthesizing the sample nucleic acid by PCR, and the method of chemical reaction with the sample nucleic acid. And a method of introducing a fluorescent label using an enzyme. Regarding the introduction of fluorescent labels, commonly used labels A method is available. '
  • the time required for acquiring force-intensity data varies depending on the reaction conditions of the hybridization reaction, but generally ranges from several minutes to several hours after the start of the hybridization reaction. However, depending on the reaction conditions, it is possible to acquire data only for the total time outside this range.
  • data acquisition is performed force-inductively. . Therefore, in the present invention, it is possible to track the temporal change of the hybridization between the target nucleic acid and the probe, and by tracking the temporal change, more and more accurate information on the target nucleic acid can be obtained. Thus, information with less variation can be obtained. That is, when performing kinetic data acquisition, the progress of the reaction state can be monitored, and the progress of the reaction can be strictly detected. Then, more accurate nucleic acid information can be obtained from the entire course of the reaction.
  • the data acquisition of the signal is performed while changing the measurement condition or the detection condition of the reaction, more specifically, at least one of the reaction temperature, or the composition, volume, or type of the reaction solution. It is also possible to carry out one, more preferably, changing the reaction temperature. For example, when signal data acquisition is performed in conjunction with a change in reaction temperature, information such as the amount of change in the hybridization reaction, the start of the reaction, and the response of the reaction system to changes in the reaction conditions, etc., can also be acquired. Enabled and more profitable.
  • change of the reaction temperature means to change the temperature in the system in which the hybridization reaction between the target nucleic acid and the probe is performed
  • change of the composition of the reaction solution includes Changes in the composition and pH of the salts and additives to be added
  • changes in the volume of the reaction solution means changes in the volume due to removal and insertion of the reaction solution from the reaction system.
  • Change of type means to change the type of aqueous solution or alcohol solution.
  • Hybridization between a target nucleic acid and a probe is performed under optimal conditions for estimation based on sequence information, and it is therefore generally not known whether these conditions are truly optimal. For this reason, conventional nucleic acid information detection methods that perform static measurements do not have sufficient data reliability or data variability if data acquisition is performed under non-optimal conditions. There existed problems such as the presence or absence.
  • Examples of the above-mentioned embodiments of the present invention include comparison of the transcription amount and copy number of a specific gene in a sample, detection of a specific sequence (normal or mutant) in a nucleic acid sequence, and SNP. Gene polymorphism detection, virus and bacterial typing, and the like.
  • the method for detecting nucleic acid information of the present invention comprises: a perfect match probe completely complementary to at least a part of the sequence of a target nucleic acid; and one or more types in which at least a part of the perfect match probe is mutated.
  • a perfect match probe completely complementary to at least a part of the sequence of a target nucleic acid
  • one or more types in which at least a part of the perfect match probe is mutated mutated.
  • the progress of the hybridization reaction can be performed very precisely. For example, if signal acquisition is performed in a dynamic manner while changing the reaction temperature continuously or stepwise, it becomes possible to detect mutations in a nucleic acid sequence that differs only by one base.
  • a target nucleic acid such as a PCR product is prepared, and a probe completely complementary to at least a part of its natural sequence and the same one base of the known sequence are mutated.
  • hybridization with the target nucleic acid Measure while changing the reaction temperature. At a temperature near the Tm for a hybrid with a probe that perfectly matches the target nucleic acid, the hybrid between the target nucleic acid and the probe that does not perfectly match it is more unstable, and the It is considered that the equilibrium is inclined toward the side where the probe has dissociated.
  • the hybrid between the target nucleic acid and the perfectly matched probe should give the strongest signal, while the target nucleic acid and the Hybrids between probes that do not perfectly match, if any, are of very low abundance and, therefore, have low signal intensity. Based on such differences in signal intensity or the presence or absence of a signal, it is possible to identify whether the base considered to be mutated in the target nucleic acid is A, T, G, or C based on the signal intensity It is possible to do. In the conventional method, since the reaction temperature for performing hybridization is a fixed point, if the reaction temperature is not optimal for the formation of the hybrid, hybridization with an incomplete match probe may give a stronger signal. it was thought.
  • mutations of not only one base but also a plurality of bases can be detected simultaneously by appropriately preparing and using a probe containing mutations at a plurality of bases.
  • the reaction conditions other than the reaction temperature for example, the composition, volume
  • a similar effect can be obtained by changing the type. More specifically, it is also possible to change the type and concentration of the salt in the reaction solution for the hybridization reaction, and to change the conditions of the high pre-sidication reaction through the formation of a ⁇ ⁇ gradient using different buffers. It is possible.
  • Such a change in the composition of the reaction solution and the like affects the hybridization as well as a change in the reaction temperature.
  • the change in the reaction temperature is preferably an increase in temperature.
  • the temperature it is preferable to increase the temperature from a temperature lower than the Tm value to a temperature exceeding the Tm value.
  • a profile of the hybridization reaction can be obtained. This makes it possible to acquire more reliable data.
  • the Tm value of the hybrid can be qualitatively or quantitatively determined by measuring the maximum value of the signal intensity during the increase. If the temperature is increased stepwise, an approximate Tm value can be determined, and if the temperature increase is made more finely in steps (for example, at intervals of 1 ° C or less) or continuously, a more accurate Tm value will be determined. It is also possible to determine This difference in Tm value reflects the presence or absence of a mutation in the sequence of each nucleic acid, and therefore, according to this embodiment of the present invention, the mutation can be detected more strictly.
  • the measurement accuracy can be further increased by measuring the amount of change in the signal.
  • the method for detecting nucleic acid information of the present invention comprises continuously or stepwise increasing a temperature at which a signal emitted by a hybrid is measured, and measuring a change in the intensity of a signal emitted from the hybrid. Maintaining the temperature when the amount of change turns negative.
  • the reaction temperature is maintained when the change in the signal intensity turns negative, the Tm of the temperature higher than that temperature is maintained.
  • Signals from hybrid species with higher values maintain or increase their intensity, whereas signals from hybrid species with Tm values below the maintained temperature gradually decrease. it is conceivable that. Therefore, by utilizing the difference in Tm value, it is possible to more accurately distinguish between hybrid species that are perfectly matched and hybrid species that are not perfectly matched, based on the sequence of the perfectly matched probe. And unknown Mutations can be identified.
  • the method for detecting nucleic acid information of the present invention uses a plurality of types of probes and simultaneously detects information on a plurality of types of nucleic acids in the same system to which the same reaction conditions can be applied. It is characterized by doing. More specifically, a DNA microarray is used.
  • hybridization between the target nucleic acid and the probe can be performed near conditions that depend on the sequence of the hybridizing portion in the target nucleic acid.
  • a change in the condition for measuring a signal is caused by a change in temperature.
  • force kinetic can be performed in a temperature range determined based on the Tm of the sequence of the hybrid-forming portion of the target nucleic acid. That is, from a temperature lower than the Tm value of the probe having the lowest Tm value of the plural types of probes to a temperature higher than the Tm value of the probe having the highest Tm value among the plural types of probes.
  • the signal can be measured force-inductively within the temperature range.
  • Figure 8 shows the state of the hybrid at the temperature ⁇ ( ⁇ ') near Tm (A), which is the lowest temperature in Figures 8 to 11, and shows the target nucleic acid ⁇ and its perfect match.
  • the signal intensity of the hybrid of the probe is higher than the signal intensity of the hybrid of the target nucleic acid A and its monobasic mismatch probe, but is derived from the hybrid containing the target nucleic acids B, C, and D having a higher Tm value. It is weaker than the signal strength.
  • FIG. 9 shows a state in which the temperature is further increased from ⁇ ( ⁇ ′) to ⁇ ( ⁇ ′) near Tm (B).
  • the signal intensity of the hybrid between the target nucleic acid ⁇ and its perfect match probe is stronger than the signal intensity of the hybrid of the target nucleic acid ⁇ and its single-base mismatch probe, but has a higher Tm value.
  • the signal intensity is lower than the signal intensity derived from a hybrid containing target nucleic acids C and D.
  • a hybrid signal between the target nucleic acid A and its perfect match probe is detected, but the target nucleic acid A and its single-base mismatch are detected.
  • the signal of the hybrid with the Tuchi probe was hardly detected.
  • FIG. 10 shows a state in which the temperature is further increased from ⁇ ( ⁇ ′) to T (C) near Tm (C).
  • the signal intensity of the hybrid of the target nucleic acid C and its perfect match probe is stronger than the signal intensity of the hybrid of the target nucleic acid C and its single base mismatch probe.
  • the hybrid signals of the target nucleic acids A and B and the respective perfect match probes are detected respectively, but in particular, the target nucleic acid A is weakened as compared with FIG. Almost no signal was detected for hybrids between nucleic acids A and B and each single-nucleotide mismatch probe.
  • FIG. 11 shows a state in which the temperature is further increased from T (C) to T (D ′) near Tm (D).
  • the signal intensity of the hybrid between the target nucleic acid D and its perfect match probe is stronger than the signal intensity of the hybrid of the target nucleic acid D and its single base mismatch probe.
  • the hybrid signals of the target nucleic acids B and C and the respective perfect match probes were detected, particularly for the target nucleic acid B, the signal was weakened as compared with FIG. Hybrids containing nucleic acid A, and hybrids of target nucleic acids B and C with each single-base mismatch probe were hardly detected.
  • Obtaining the signal overnight is not a fixed point with respect to time, but is performed force-inductively, as shown in Fig. 12 for an example. More specifically, the time required for obtaining the force overnight is different depending on the reaction conditions of the hybridization reaction.Power is generally several minutes to several hours after the start of the hybridization reaction. Luck. However, depending on the reaction conditions, it is possible to acquire data overnight only for the total time outside this range. In the example shown in FIG. 12, the temperature is raised stepwise and intermittently, but it is also possible to raise the temperature continuously or to lower the temperature.
  • Hybridization between a target nucleic acid and a probe is usually performed under optimal conditions for estimation based on sequence information. Therefore, it is usually not known whether the conditions are really optimal. For this reason, conventional nucleic acid information detection methods that perform static (non-force-induced) or fixed-point measurements require data reliability under conditions that are not optimal. However, there were problems such as not being sufficient, and data variations.
  • data acquisition is performed force-inductively, and a plurality of probes are used. For this reason, multiple sequences having different Tm values can be detected accurately and at high speed in the same system.
  • the probe is a plurality of types of probes having a plurality of types of sequences, and the probes have a sequence overlapping each other. .
  • the same sequence in the target nucleic acid is detected with a plurality of types of probes. All of these multiple types of probes share the recognition sequence in the target nucleic acid, that is, the recognition sequence is overlapped and hybridizes with at least one base different from the other probes. Has become.
  • a probe may not be able to hybridize with the target nucleic acid due to its higher-order structure, and the target nucleic acid is detected using only such a probe. For example, false positive and false negative problems may occur.
  • multiple types of probes it is expected that the probability that at least one of the types of probes normally hybridizes to the target nucleic acid is higher, thereby improving the reliability of the detection result. Become.
  • the difference in Tm value between the shorter length probe and the longer length probe is set to 5 to 10 ° C.
  • These probes are used in the same system and force-inductively measured. This is because when the difference in Tm value between the probes is 5 to 1 Ot, even at a temperature near the Tm value of a longer probe, a signal from the spot of a perfect match of a short probe can be expected.
  • the DNA microarray that can be used in the method for detecting nucleic acid information of the present invention is not particularly limited, and ordinary microarrays can be used. it can.
  • An example of a usable microarray is a microarray in which a plurality of microarrays are provided on a slide chip, and a plurality of probe spots are present in each microarray.
  • the probe spot is the minimum unit for fixing the probe.
  • the size of the slide tip is usually in the range of 0.5-20.0 cm X 0.5-20.0 cm X 0.01-1.0 cm.
  • the size of the microarray is usually in the range of 3.0 mm2 to 16 cm2.
  • the probe spot can be substantially circular, substantially rectangular, or polygonal, and its diameter or length of one side is usually on the order of several hundreds / xm.
  • the number of probe spots in one microarray is usually in the range of 100-10000. Depending on the experimental conditions, it is of course possible to use a DNA microarray of a standard other than the range defined here.
  • the same conditions can be imposed on all probe spots, and when a plurality of probes are used, information on a plurality of nucleic acids can be detected at once.
  • the conventional static measurement that does not perform the measurement over time due to the acquisition of the kinetic shidanal de night, which is one of the features of the present invention. It is possible to solve the problem that the reaction time for forming the hybrid is long, which was a problem in the case of (1). That is, as described above, by starting hybridization at a temperature lower than its Tm and sequentially increasing the reaction temperature, the hybridization reaction can be shortened.
  • hybridization between a target nucleic acid and a probe is carried out by bringing a liquid sample containing the target nucleic acid into contact with a probe immobilized on a porous body. It is characterized by being performed.
  • the immobilization of the probe is performed on a carrier having a porous structure, so that the surface area for immobilizing the nucleic acid is dramatically increased.
  • the speed and sensitivity of detecting information is increased.
  • the porous material used herein means any porous material suitable for immobilizing nucleic acids, and is not particularly limited. Examples thereof include an aluminum oxide film formed by anodic oxidation, for example, Whatman. The company name Anodisc can be mentioned.
  • the step of reciprocating the liquid sample containing the target nucleic acid once or a plurality of times in the porous body under each of the changed signal measurement conditions is performed. It is preferred to include.
  • the frequency of contact between the probe immobilized in the porous material and the target nucleic acid increases, which further increases the reaction. It will contribute to the progress and further increase in sensitivity.
  • the sample is reciprocated one or more times in the porous body.
  • the temperature of the reaction system can be controlled more accurately, and the detection accuracy can be increased and more detailed data can be acquired. This has the advantage that
  • the detection of a hybrid can be performed based on a fluorescent label.
  • fluorescent label examples include FITC, rhodamine, Cy3, Cy5, Texas Red, and the like, but other than these can be used.
  • Target nucleic acids that can be detected by the nucleic acid information detection method of the present invention are not particularly limited, but non-limiting examples include oncogenes, intracellular drug resistance genes, cell cycle control genes, and apoptosis-related genes. And the like.
  • the present invention provides a nucleic acid information analyzer which can be used particularly in the above-described method for detecting nucleic acid information, which comprises a sample storage container for containing a sample containing a target nucleic acid, and a porous material capable of immobilizing a nucleic acid.
  • a nucleic acid reaction carrier including a structure and connected to the container, a driving means for flowing the sample between the container and the nucleic acid reaction carrier in a controlled and leak-free manner, and a reaction temperature on the reaction carrier And a means for detecting a signal emitted from a hybrid between the probe and a target nucleic acid formed in the porous structure.
  • the outline of one embodiment of this apparatus is as shown in FIG.
  • the device shown in FIG. 1 is a detection device based on a fluorescence microscope, and the operation of each component is controlled by a PC.
  • the sample storage container (not shown in FIG. 1) is not particularly limited as long as it is suitable for storing the sample nucleic acid.
  • the nucleic acid reaction carrier containing a porous structure capable of immobilizing nucleic acids is not particularly limited as long as it is suitable for immobilizing nucleic acids and does not inhibit the formation of hybrids.
  • the above-mentioned DNA microarray can be mentioned.
  • a DNA microarray in which a desired nucleic acid probe is immobilized on a carrier having a porous structure is preferable.
  • the structure between the sample storage container and the nucleic acid-reactive carrier the structure must be sealed in order to allow the sample nucleic acid to flow back and forth once or multiple times into the porous structure without leakage. It is preferable to have a capacity sufficient to hold the entire amount of the sample nucleic acid.
  • a solution drive for flowing the sample solution between the sample storage container and the nucleic acid reaction carrier As means, pumps suitable for transporting one unit of solution can be used.
  • the temperature control means for controlling the reaction temperature on the nucleic acid reaction carrier a means capable of setting the temperature in units of about 0.1 ° C is preferable. This means not only the nucleic acid reaction carrier but also a sample storage container and a sample storage container.
  • the environmental temperature of the flow path between the carrier and the nucleic acid reaction carrier can be set to the same temperature.
  • a CCD camera image detection unit
  • It can be a microscope equipped with the like. It is desirable that all of the microscope, the image detection unit, the solution driving unit, and the temperature control unit are appropriately controlled by a PC.
  • the obtained image is converted into signal information for each probe by the processing of the PC, and its absolute value, relative value, and amount of change are calculated by processing with parameters such as the reaction temperature, the number of drives, and the time. It is designed to display the final gene mutation information.
  • the device is connected to the nucleic acid reaction carrier and stores at least one solution for storing a different type of solution from the sample containing the target nucleic acid. It is preferable to further include a container, and a means for appropriately sending various solutions contained in the solution storage container to the nucleic acid reaction carrier.
  • reaction conditions other than the reaction temperature for example, the reaction solution
  • the hybridization reaction can proceed while changing the composition and pH.
  • nucleic acid information analyzer of the present invention examples include oncogenes, intracellular drug resistance genes, cell cycle control genes, or Apoptosis-related genes.
  • oligo DNAs represented by SEQ ID NOS: 1 to 4 were synthesized and immobilized on an aluminum oxide substrate prepared by anodization.
  • a hybridization reaction was performed using the oligo DNA shown in SEQ ID NO: 5 as a sample.
  • This oligo DNA was labeled on its 3 ′ side with FITC.
  • the sequence of the oligo DNA of SEQ ID NO: 5 is complementary to the probe of SEQ ID NO: 1.
  • the probes of SEQ ID NOS: 2 to 4 are obtained by mutating the base at the center of the complementary strand of the oligo DNA of SEQ ID NO: 5 by one base.
  • This oligo DNA sample was diluted with 1 XSSPE buffer, and the concentration of ⁇ was used to perform an eight-hybridization reaction with each probe on the substrate.
  • the temperature of the nucleic acid reaction carrier was controlled in conjunction with the flow of the solution to the substrate serving as the nucleic acid reaction carrier. The specific conditions are as follows.
  • Each cycle was performed for one minute for reciprocating the solution between the sample storage container and the nucleic acid reaction carrier.
  • Results Figure 2 shows the results.
  • the figure shows detection signals for the probes of SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the region (A) in FIG. 2 shows the result of hybridization at 25 ° C.
  • the signal intensity increases as the number of flow cycles of the solution increases.
  • the non-specific reaction since a non-specific reaction between the target nucleic acid and the probe also occurs, it has an effect of promoting hybridization.
  • the signal difference between the perfect match probe (probe SEQ ID NO: 1) and the incomplete match probe (SEQ ID NO: 2) is small.
  • the region (B) shows the results when the reaction temperature was 40 ° C.
  • FIG. 3 shows the results of signal information derived from hybrids formed by SEQ ID NOS: 10 and 11. This is the relative intensity when the signal intensity derived from the hybrid formed by the probes of SEQ ID NOS: 10 and 11 is 100, and the signal intensity derived from the hybrid formed by the probe of SEQ ID NO: 10 is 100. It is shown as a ratio.
  • the method for determining the presence or absence of a mutation near Codonl2 of the K-Ras oncogene performed based on the present invention is shown.
  • seven types of K-Ras oncogene probes SEQ ID NOS: 15-21
  • the Tm between the microarray and the sample a fluorescently labeled K-Ras gene (amplified by PCR using primers of SEQ ID NOs: 12 and 13) was measured.
  • the experimental steps used at this time are described.
  • the experimental steps consist of four steps: 1) preparation of fluorescently labeled samples, 2) preparation of microarray, 3) hybridization of sample to microarray, and 4) data analysis.
  • Preparation of fluorescently labeled sample Amplify target gene set and perform fluorescent labeling.
  • the sample used at this time is not particularly limited as long as it is a part of the human body, but is mainly a tissue section collected from a cancerous tissue, a cell piece obtained by a microdissection method, or a cultured cell. Is used.
  • a human K-Ras gene template set (Cat # 7242) marketed by Takara Shuzo was used.
  • K-Ras gene for 7 templates Amplify the gene using a PCR kit (Cat # 7112) that can amplify Codonl2.
  • an antisense primer having a fluorescent label of FITC inserted at the 5 ′ end was used.
  • agarose electrophoresis prepared with 3% NuSieve (FMC) was performed to confirm the amplified product.
  • FMC NuSieve
  • the obtained amplified sample was again processed by Asymetrix PCR.
  • the Asymetrix PCR method uses a composition and temperature cycle in which the sense strand primer is removed from the initial PCR method. 3M ammonium acetate (Wako) was added to the PCR product to 10% (VV), and ethanol (Wako) was further added to a 70% concentration.
  • the PCR product was allowed to stand at -20 ° C overnight and centrifuged at 12.000 rpm ⁇ 2 min to precipitate the PCR product. The precipitate was washed twice with 70% ethanol, and then dried with SpeedVac (Savant).
  • spots A2-A4 the probe corresponding to the K-RAS-Va1 mutant of SEQ ID NO: 15, and in spots B2-B4, the probe corresponds to the K-RAS-AsP mutant of SEQ ID NO: 16.
  • spots C2-C4 the probe corresponding to the K-RAS-A1a mutant of SEQ ID NO: 17 was found, and in spot D2-D4, the probe corresponding to the K-RAS-S The probe corresponding to the er mutant was spot E2-E4, and the probe corresponding to the K-RAS-Cyc mutant of SEQ ID NO: 19 was found in spot F2-F4.
  • a probe corresponding to the K-RAS-Arg mutant of SEQ ID NO: 21 and a probe corresponding to the K-RAS-N natural sequence of SEQ ID NO: 21 are arranged in spot G2-G4.
  • FIG. 5 shows the time change of the fluorescent spot of the microarray obtained when the temperature was changed during the hybridization.
  • FIG. 5 is a fluorescence image from the bottom for 1 minute, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, and 40 minutes after the reaction, which was programmed to drive the solution and to give a change in the temperature of the solution.
  • the temperature of the reaction chamber which was initially at room temperature, is set to 72 ° C.
  • the fluorescence intensity of most spots increased immediately after the reaction, and as the temperature was further increased, the Cys spot (codonl2) spotted at the portions corresponding to E2, E3, and E4 in the figure TGT) shows the highest level of fluorescence (after 20-30 minutes).
  • the probes with seven different base sequences immobilized not a probe whose sequence is perfectly matched to the sample, but rather a probe with a low calculated Tm It can be seen that the sample is more strongly bound.
  • Example 4 The following describes an experimental step for simultaneously testing the P53 cancer suppressor gene and the K-Ras oncogene performed based on the present invention.
  • the experimental steps consist of four steps: 1) preparation of fluorescently labeled samples, 2) preparation of microarray, 3) hybridization to DNA chip, and 4) data analysis.
  • the sample used at this time is not particularly limited as long as it is a part of the human body, but is mainly a tissue section collected from a cancerous tissue, a cell piece obtained by a microdissection method, or a cultured cell. Is used. As an example, squamous epithelial cells collected from the mouth of a normal person were used. After gargle several times with a saline solution containing 1 M NaCl, the gargle was again gargleed with PBS and used as a suspension of cell debris.
  • the cell suspension is precipitated by centrifugation at 2000 rpm x 10 min and suspended in a cell lysis solution consisting of 0.2 / ig / mL Protease K (Wako) and PBS adjusted to 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate). I do. After incubating the cell lysate containing the sample at 37 ° C for 30 minutes, heat-treat at 95 ° C for 30 minutes to inactivate Protease K activity. Transfer the reacted sample to a 1.5 mL eppendorf tube and centrifuge at 12.000 x 2 min to precipitate undissolved cell debris. The centrifuged supernatant was used as a nucleic acid extract.
  • a cell lysis solution consisting of 0.2 / ig / mL Protease K (Wako) and PBS adjusted to 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate). I do. After incubating the cell lysate containing the
  • the obtained nucleic acid extract was suspended in one PCR master mix, and a PCR reaction of 50 cycles was performed.
  • a master mix is prepared using Takara Shuzo's PCH Core kit 1 and the primer pairs shown in SEQ ID NOs: 22 to 23 and SEQ ID NOs: 24 to 25 according to the kit instructions.
  • agarose electrophoresis prepared with 3% NuSieve (FMC) was performed to confirm the amplified product.
  • FMC NuSieve
  • the Asymetrix PCR method comprises a composition and a temperature cycle in which the primer of the sense strand is deleted from the first PCR method.
  • spots B 1 -B 4 have the probes of SEQ ID NOs: 30-33, respectively, and the spots C 1 -B 4 ⁇ Probes of SEQ ID NOS: 34-36 are placed on C3, no probe is placed on spot C4, and SEQ ID NOs: 37-40 are placed on spots D1-D4, respectively.
  • Probes, spots E1-E4 have probes of SEQ ID Nos. 41-44, respectively, spots F1-F4 have probes of SEQ ID Nos. 45-48, spot G1- Probes of SEQ ID NOs: 49-51 are assigned to G3, no probe is assigned to spot G4, and probes of SEQ ID NO: 29 are assigned to spots HI and H4, respectively.
  • Probes of SEQ ID NOs: 52 and 53 were placed on spots H2 and H3, respectively. In rows A to D, probes for K-ras were used except for spots for primary use. In rows E to H, probes for P53 were used except for spots for markers. Are located.
  • Hybridization The dried ethanol precipitate was dissolved well by adding 501 pure water to obtain a fluorescently labeled sample.
  • 3x SSPE sodium phosphate buffer, technical data: DNA microarray and latest PCR method, cell engineering special edition Genome Science Series 1 Shujunsha
  • 3x SSPE sodium phosphate buffer, technical data: DNA microarray and latest PCR method, cell engineering special edition Genome Science Series 1 Shujunsha
  • the cells were suspended in 10% (V / V) ExpressHyb (Clontech) so as to have a 10% solution.
  • the analysis of the high predication was performed by an experimental system in which a cooled CCD camera was connected to BX-51TFR manufactured by Olympus Optical.
  • the experimental system is designed to automatically drive the solution around the reaction filter, control the temperature, and image the fluorescent spot.
  • FIG. 7 shows the time change of the fluorescence spot of the DNA chip obtained by the experimental apparatus. From the bottom of Fig. 7, fluorescence images at 1, 10, 20, 30, and 40 minutes after the reaction were completed. It is set to be a degree. As is clear from the figure, the fluorescence intensity of most spots increased immediately after the reaction, and as the temperature was further increased, the level at which only one spot of P53 spotted in the upper part of the figure could be detected Fluorescence. (30 minutes later) In this state, the intensity of the fluorescent spot brightness of most K_Ras is not clear because the Tm value of the K-Ras gene of the immobilized probe is high. Therefore, by raising the temperature of the reaction chamber further, it became possible to clearly measure the intensity of the spot luminance of the K-Ras gene (after 40 minutes). A series of images was stored on the hard disk along with information such as temperature conditions.
  • the obtained images were analyzed using analysis software programmed specifically for mutation detection.
  • the analysis software can automatically determine the base sequence of the sample based on the base sequence of the probe spotted on the microarray used and the image information obtained as a result of the experiment.
  • 3) Analyze the image obtained as a result of When the base sequence of samples of P53e X on7, it has been found that certain passing Ride shown in SEQ ID NO: 5 4.
  • the nucleotide sequence containing K-RasCodonl2 was found to be as shown in SEQ ID NO: 55. From this, it was found that the nucleotide sequence of the sample was normal for both P53 and K-Ras. In this way, it was shown that the sequence of two genes can be rapidly analyzed by one reaction array.
  • Fluorescent labels were incorporated by reverse transcription into mRNAs extracted from normal tissues and diseased tissues to synthesize single-stranded cDNA.
  • the microarray was set in the device shown in Fig. 1 that can obtain a kinetic data of this sample, and a hybridizing reaction was performed on cDNA expressed from each tissue.
  • a CCD camera was used to acquire the image data. It is necessary to set an appropriate exposure time for the brightness of the subject in the CCD camera, but the gene obtained depends on the degree of fluorescent labeling of the sample, the quantum efficiency of the fluorescent substance itself, the reaction efficiency of hybridization, etc. May cause a difference in brightness in the hybridized image.
  • the light emission image of the spot In order to perform detection with high accuracy, the light emission image of the spot must be within an appropriate range of the dynamic range of the CCD. If this is not appropriate, a dark image or an image over the imaging range will not be obtained, and accurate detection cannot be performed. Without acquiring such undetermined imaging conditions in advance, the data was obtained by force exposure, the images were confirmed, and the reaction proceeded while setting the optimal imaging conditions. The obtained hybrid image is adjusted so that the maximum luminance is about 80% of the dynamic range of the CCD, and by analyzing the obtained image, it is possible to detect the hybrid image with high accuracy. Was.
  • the sense strands SEQ ID NOS: 56-62 and the antisense strands of the seven 20-mer K-ras oncogene probes with mutations introduced in the K-ras codon 12 sequence) Nos. 63-69 and the sense strands of seventeen 17-mer K-ras oncogene probes (SEQ ID NOs: 70-76) with one or two bases removed from both ends of these probes.
  • the antisense strand SEQ ID NOs: 77-83 were spotted in the arrangement shown in FIG.
  • the Tm value of the 20-mer probe group is 56-58 ° C
  • the Tm value of the 17-mer probe group is 47-49 ° C, Lower than that of the monomer.
  • the source of the target gene can be, for example, a part of the human body, and more specifically, a tissue section collected from a cancerous tissue or the like, or obtained by a microdissection method or the like. Cell debris, cultured cells and the like can be mentioned.
  • a human K-ras oncogene template set (Takara Shuzo Co., Ltd., Cat # 7242) was used. Gene amplification was performed on the seven types of templates using a PCR kit (Takara Shuzo, Cat # 7112) that can also amplify the codon 12 portion of the K-ras gene. For amplification, primers with FITC fluorescent label at the 5 'end were used. After completion of the PCR, agarose electrophoresis prepared with 3% NuSieve (FMC) was performed to confirm the amplified product.
  • FMC NuSieve
  • a 20-mer sense strand probe corresponding to the K-rasArg mutant of SEQ ID NO: 57 is arranged, and in spot 3, 20 corresponding to the K-rasCys mutant of SEQ ID NO: 58
  • the probe of the sense strand of the dimer is arranged.
  • a 20-mer antisense strand probe corresponding to K-rasWt in SEQ ID NO: 63 is arranged, and in spot 15 a 1-mer corresponding to K-rasWt in SEQ ID NO: 70 A 7-mer sense strand probe is located.
  • a 17-mer antisense strand probe corresponding to K-rasWt in SEQ ID NO: 77 is arranged.
  • Hybridization Sample 4 Add 10 ⁇ 1.25'.SSPE (sodium phosphate buffer, reference material: DNA microarray and latest PCR method, Cell Engineering Supplement Genome Science Series 1, Shujunsha) as a solution for chilling.
  • SSPE sodium phosphate buffer, reference material: DNA microarray and latest PCR method, Cell Engineering Supplement Genome Science Series 1, Shujunsha
  • a hybridization sample was prepared.
  • the analysis of the hybridization was performed by an experimental system in which a cooled CCD camera was connected to BX-52 TRF manufactured by Olympus Optical. This experimental system is designed to automatically drive the solution around the reaction filter, control the temperature, and record the image of the fluorescent spot.
  • a reaction solution of 501 was added to a reaction portion of a dedicated chamber in which a microarray having a diameter of 6 mm was installed, and a solution was driven and a temperature change was applied to obtain a fluorescence image.
  • the experimental results obtained using the template-derived fluorescently labeled sample are shown below.
  • a control sample a PCR product having a normal Ki- as oncogene sequence was used.
  • the time change of the fluorescence spot of the microarray obtained when the temperature was given during the hybridization is shown in FIGS.
  • the experimental system was programmed to accompany the solution drive and to provide a change in solution temperature.
  • the temperature of the reaction chamber which was initially room temperature (25 ° C), is set to 55 ° C, and finally to 72 ° C.
  • the fluorescence intensity of most spots increased immediately after the reaction.
  • both the 17-mer group and the 20-mer group immobilized on the solid-phased probe had the same sequence as the sample among the probes with seven different base sequences. Strong fluorescence intensity can be seen in spots other than (Fig. 14). By further raising the temperature of the reaction chamber to 55 ° C, the fluorescence intensity of the mismatched spots (spots 16-21 and 23-28) gradually decreased in the 17-mer probe. However, only fluorescent spots (15 and 22) of Gly (codon 12 sequence GGT), which is actually a perfect match for the target nucleic acid, are observed (FIG. 15). However, each probe in the 20-mer group is still below the Tm value of the probe, and the signal strength and perfect match do not match.

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Description

核酸情報の検出方法及び装置 技術分野 、
本発明は、 力イネティックに核酸情報を検出する方法及び装置に関する。 背景技術
遺伝子の突然変異情報の解析、 疾病の予知や診断、 ウィルスのタイピング等 を行う遺伝子診断に関する技術が近年大幅に進歩している。 例えば、 正常な遺 伝子配列を有する核酸、 又は当該遺伝子配列中に既知の突然変異を含む核酸の それぞれに相補的な D N Aプローブを予め用意しておき、 ここに、 '変異の有無 が不明である試料 D N Aを各種プロ一ブにそれぞれ別個にハイブリダィズさせ、 これらのハイブリダィズの量を検出■比較し、 より多くハイブリダィズが行わ れるプロ一ブの方がサンプル D N Aとの相補性が高いことを判断することが行 われている。 即ち、 正常 D N Aに相補的なプローブへのハイブリダィズ量が多 ければ、 サンプル D N Aは正常であり、 逆に突然変異 D N Aに相補的なプロ一 ブへのハイブリダイズ量が多ければ、 サンプル D N Aは突然変異を起こしてい ると推定できる。
ハイプリダイズの検出には、 例えばサンプル D N Aに検出可能な標識を施し、 その標識を検出することで間接的に D N A量を検出する方法がとられている。 一般にこのような標識には、 蛍光や R I (放射性同位体)、 化学発光等が用いら れている。
また、 このような D NAの持つ相補性を利用したハイブリダイズ反応をべ一 スとし、 数百個乃至数万個の D N Aプローブを、 格子状に配列させ、 核酸試料 を含む溶液をこのアレイ上でハイブリダィズさせることで、 複数の遺伝子の情 報を一括して検出する D N Aマイクロアレイと呼ばれるシステムが普及し始め ている。
D N Aマイクロアレイを利用すると、 複数の遺伝子についての情報を同時に 解析することが可能であり、 通常は mR N Aの発現解析に用いられることが多 いが、 一方でこれを遺伝子の突然変異や S N P (—塩基変異多型） に応用した 例も見受けられる。
一塩基の変異を高速かつ感度よく検出することは、 一般に非常に困難である。 そのため、 例えば特開 2 0 0 1 - 5 0 9 3 1号公報においては、 D NAマイクロ ァレイにおいて電気化学反応を併用し、 一塩基の変異を高速かつ感度よく検出 する方法が提案されている。 この文献では、 D NAマイクロアレイの各アレイ 要素ごとに電極を付与し、 電圧を印加することで反応が高速化されている。 また、 ハイブリダィズを高速かつ、 精度よく行う方法としては、 特表 2 0 0 0 - 5 1 5 2 5 1号公報に記載の方法が挙げられる。 この方法は、 多孔質構造を 有する金属酸化物を反応担体として利用し、 一方の面から他方の面へと溶液を 駆動させることにより、 サンプル溶液の拡散速度を高めて反応を高速化したも のである。
しかしながら従来の方法においては、ハイブリダィズの反応が非常に遅く （通 常は数時間乃至十数時間）、 高速の検出を行うには、 複雑な構成のチップを用い る必要があった。 そのために装置や核酸の検出を行うチップが大型化したり、 コスト高につながつていた。 また、 特異性を上げるために反応温度を上昇させ る必要があり、 これに起因して反応時間の遅延、 そしてひいてはハイブリッド の検出時間の長時間化が生じていた。 特に一塩基のみの変異の有無を精度よく 検出しょうとする場合においては、 このような問題が顕著であった。 . 一塩基の変異検出の具体例としては、 特表 2 0 0 0 - 5 1 1 4 3 4号公報が挙 げられる。 この方法は、 塩基の変異に対応したプローブを用意し、 その特異性 を利用して変異を特定するものであるが、 一塩基変異の差を確実に検出するた めに、 ミスマッチヌクレオチドを含むプローブを利用している。 これはパーフ ェクトマツチしたハイブリッドと一塩基が変異したプローブとのハイブリッド についての Tmの差よりも、 一塩基が変異したプロ一ブとのハイブリツドとニ 塩基が変異したプローブとのハイプリッドについての Tmの差の方が大きくな ることを利用したものでる。 しかしこの方法においては、 絶対的なハイブリダ ィズ強度が低下するために、 反応により多くの時間がかかることや、 感度の点 でも問題があった。
一塩基変異を検出する場合のように、 D N A全体の長さに対して一塩基のみ しか変異していない場合には、 プロ一ブと標的 D N Aの相補性に関しての程度 の差が大きくなく、 ハイブリダィズの度合いについての差が実質的に生じてい ないために、 突然変異を検出することができなかった。 つまり、 一塩基の変異 を検出するには、 塩基長に対する変異の割合を高めるために、 塩基長が短い方 が好ましいが、 一方で、 配列が短か過ぎるプローブの場合には、 反応温度を下 げる必要性から、 標的 D N Aに非特異的にハイプリダイズする量が増えてしま う。 そのために、 精度の高い検出が行えないという問題が生じる。 このように 従来の方法では、 一塩基の変異を精度よく且つ高速に検出することができなか つた。
また、 一塩基の変異を精度よく且つ高速に検出しょうとする系においては、 反応条件を、 検出される配列に適したものへと限定する方向性 （系の最適化） がでてくることに起因して、 多数の種類の標的配列を検出しょうとする場合に は、 標的配列の数だけ測定を繰り返す必要が生じてしまい、 結果として実験全 体にかかる時間が長時間化するという問題が生じる。 従って、 個々の配列の検 出時間が短縮されても、 複数の配列を検出しょうとする実験系の場合には、 全 体にかかる時間が長くなるという問題が存在する。
従って、 標的核酸の複数種類の配列についての変異を、 たとえそれが一塩基 における変異であっても、 精度よく且つ高速に検出できる検出方法であって、 一度により多くの種類の変異を検出できる方法が提供されれば望ましい。 発明の開示
本発明者らは、 上記の従来技術についての種々の問題点に鑑み、 鋭意研究を 進めたところ、 シグナルのデータ取得を力イネティックに行うことにより、 核 酸についての、 より多くの、 より正確な、 より信頼性のある情報を得ることが 可能になることを見いだした。
即ち、 本発明の核酸情報検出方法は、 標的核酸と、 当該標的核酸配列の少な くとも一部に対して相補的な配列を有するプローブとを接触させ、 当該標的核 酸と当該プローブとの間にハイプリッドを形成させ、 当該ハイプリッドの量に 依存した量で発せられるシグナルを測定することにより、 当該標的核酸の情報 を検出する方法において、 当該シグナルのデータ取得を力イネティックに行う ことを含むことを特徴とする。
そして本発明の核酸情報検出方法においては、 前記のシグナルのデータ取得 が、 反応の測定条件または検出条件を変更しながら行われることが好ましく、 より具体的には反応温度、 又は反応溶液の組成、 容量、 若しくは種類のうちの 少なくとも 1つを変更しながら行われることが好ましく、特に、前記の変更が、 反応温度についての変更であることが好ましい。
本発明の核酸情報検出方法はまた、 標的核酸の配列の少なくとも一部に対し て完全に相補的な完全マツチプローブ、 及び当該完全マッチプローブの少なく とも一部が変異した 1以上の種類の不完全マッチプローブを、 当該標的核酸と 接触させ、 当該標的核酸と当該完全マツチプロ一ブ又は当該不完全マツチプロ ーブとの間にハイプリッドを形成させ、 当該ハイプリッドの結合強度の違いに 基づいて当該標的核酸の核酸情報を検出する方法において、 当該ハイブリツド が発するシグナルを測定または検出する条件を連続的または段階的に変更しな がら、 当該シグナルのデータ取得を力イネティックに行うことを含むことを特 徴とする。
そして上記の核酸情報検出方法においては、 前記のシグナルのデータ取得が、 反応温度、 又は反応溶液の組成、 容量、 若しくは種類のうちの少なくとも 1つ についての変更であることが好ましく、 特に反応温度についての変更であるこ とが好ましい。
上記の核酸情報検出方法における反応温度の変更は、 検出するハイプリッド の Tm値未満の温度から、 Tm値を越える温度間の温度上昇、 又はそのような 温度上昇及び温度下降からなる 1回又は複数回の温度サイクルであることが好 ましい。
反応条件の変更が、 温度上昇である場合には、 その間にシグナル強度の極大 値及び 又はシグナル強度の変化量を測定してもよい。
更に、 本願発明の核酸情報検出方法は、 上記の何れの態様において、 前記の ハイプリッドが発するシグナルを測定する温度を連続的又は段階的に上昇させ、 それぞれの温度間における当該ハイプリッドから発せられるシグナル強度の変 化を測定し、 その変化量が負に転じた時にその温度を維持することができる。 本発明の核酸情報検出方法は更に、 上記の何れの態様において、 同一の反応 条件を適用することが可能な同一の系内において、 複数種類のプローブを使用 し、 複数種類の核酸についての情報を同時に検出することを特徴とし、 より具 体的には、 D N Aマイクロアレイを利用することができる。
更に本発明の核酸配列の変異検出方法は、 上記プローブが複数種類の配列を 有する複数種類のプローブであって、 当該プローブ同士が、 互いに重なり合う 配列を有することを特徴とするものである。
本発明の核酸配列の変異検出方法はまた、 上記の核酸配列の変異検出方法に おいて、 前記の複数種類のプローブが、 標的核酸の配列の少なくとも一部に対 して完全に相補的な完全マツチプロ一ブ、 及び当該完全マツチプロ一ブの少な くとも一部が変異した 1種類以上の不完全マツチプローブと、 当該完全マッチ プローブ及び当該不完全マッチプローブの両端あるいは片端において塩基配列 を伸張するか、 又は短縮したオーバ一ラッピングプロ一ブとからなることを特 徴とするものである。
オーバ一ラッピングプロ一ブのうち、 より低い Tm値を有するプローブ群で 解析した結果と、 より高い Tm値を有するプロ一ブ群で解析した結果を比較す ることによって判定することができる。
そして上記の配列のプローブが K_i'as codonl2 を解析することを目的とし た 20merの塩基配列を持つことを特徴とする配列番号 5 6番から 6 9番までの プローブを用いることができる。
そして上記の配列のプローブが K一 ras codonl2 を解析することを目的とし た r7merの塩基配列を持つことを特徴とする配列番号 7 0番から 8 3番までの プローブを用いることができる。
そして上記のプローブが K_ ms codonl2 を解析することを目的とした 17mer の塩基配列を持つことを特徴とする配列番号 5 6番から 6 9番までのプ ローブと K一 s codonl2を解析することを目的とした 20merの塩基配列を持 つことを特徴とする配列番号 7 0番から 8 3番までのプロ一ブを用いることが できる。
本発明の核酸情報検出方法はまた、 上記の何れの態様において、 前記のハ イブリツド形成が、 標的核酸を含む液体試料を、 多孔質体に固定されたプロ一 ブに接触させることにより行われることを特徴とする。
そしてこの核酸情報検出方法においては、 前記の液体試料を、 前記の多孔質 体内を 1回又は複数回往復させる工程を行うことを含むことが好ましい。
本発明の核酸情報検出方法においては、 シグナルの検出を、 蛍光標識の検出 に基づいて行うことができる。
本発明の核酸情報検出方法においては、 標的核酸が、 癌遺伝子、 細胞内薬剤 耐性遺伝子、細胞周期制御遺伝子、若しくはアポトーシス関連遺伝子の何れか、 又はこれらの組合せとすることができる。
本発明の核酸情報検出装置は、 標的核酸を含む試料を入れるための試料貯蔵 容器、 核酸を固定できる多孔質構造体を含み且つ当該容器と接続された核酸反 応担体、 当該試料が当該容器と当該核酸反応担体との間で、 制御されながら漏 れなく流動するための駆動手段、 当該反応担体上での反応温度を制御するため の温度制御手段、 及び当該多孔質構造体において形成される標的核酸とプロ一 ブとの間のハイプリッドから発せられるシグナルを検出するための手段を含む ことを特徴とする。
本発明の核酸情報検出装置においては、 前記の核酸反応担体へと接続され且 つ標的核酸を含む試料とは異なる種類の溶液を貯蔵するための 1以上の溶液貯 蔵容器、 及び適宜当該溶液貯蔵容器に含まれる各種の溶液を混合して前記核酸 反応担体へと送る手段を更に含んでいてもよい。
本発明の核酸情報検出装置においては、 標的核酸が、 癌遺伝子、 細胞内薬剤 耐性遺伝子、細胞周期制御遺伝子、若しくはアポトーシス関連遺伝子の何れか、 又はこれらの組合せとすることができる。 図面の簡単'な説明 図 1 この図は、 本発明の核酸情報解析装置の概略を示す図である。
図 2 この図は、 標的核酸と、 完全マッチプローブまたは不完全マッチプロ —ブとのハイブリダィズを、 ハイブリダィズ温度を変化させながら力イネティ ックに測定した結果を示す図である。 図中の （A) の領域ではシグナルの測定 温度を 2 5 °Cに、 （B ) の領域では 4 0 °Cに、 そして （C ) の領域では 6 0 °Cに した。 各温度においては、 試料溶液を核酸反応担体へ各 5回往復させた。 図 3 この図は、 細胞株由来の p 5 3遺伝子を、 本発明の方法により検出し た結果を示す図である。
図 4 この図は、 実施例 3において使用した D N Aマイクロアレイのプロ一 ブ配置図である。
図 5 この図は、 K- R A S遺伝子の変異を検出する、 実施例 3の実験結果を 示す図である。 図中、 下のパネルからそれぞれ、 ハイブリダィズ開始後、 1分、 1 0分、 2 0分、 3 0分、 及び 4 0分の時の蛍光を測定した結果が示されてい る。
図 6 この図は、 実施例 4において使用した D N Aマイクロアレイのプロ一 ブ配置図である。
図 7 p 5 3遺伝子及び K- R A S遺伝子を同時に検出する実施例 4の実験結 果を示す図である。 図中、 下のパネルからそれぞれ、 ハイブリダィズ開始後、 1分、 1 0分、 2 0分、 3 0分、 及び 4 0分の時の蛍光を測定した結果が示さ れている。
図 8 プローブ A-Dを使用した系において、 温度 Τ (Α ' ) でのハイブリッド からのシグナルの差を示したものである。 蛍光強度に閼しては、 この図では核 酸 B、 C、 Dについての蛍光強度が最も強く、 次に核酸 Aとプロ一ブ A完全マ ツチの場合が強く、 そして、 核酸 Aとプローブ A—塩基ミスマッチの順に蛍光 強度が弱くなつている。
図 9 プローブ A-Dを使用した系において、 温度 Τ ( Β ' ) でのハイブリツド からのシグナルの差を示したものである。 蛍光強度の差の表し方は、 図 8にお ける表現方法に準じており、 更にハッチングのないスポットが、 最も弱い蛍光 強度を表している。
図 1 0 プロ一ブ A-Dを使用した系において、 温度 T ( C ) での八イブリッ ドからのシグナルの差を示したものである。 蛍光強度の差の表し方は、 図 8に おける表現方法に準じており、 更にハッチングのない、 スポットが、 最も弱い 蛍光強度を表している。
図 1 1 プローブ A-Dを使用した系において、 温度 T (D ' ) でのハイブリツ ドからのシグナルの差を示したものである。 蛍光強度の差の表し方は、 図 8に おける表現方法に準じており、 更にハッチングのないスポットが、 最も弱い蛍 光強度を表している。
図 1 2 データの力イネティックな取得の際の温度変化のプロファイルを示 すものである。 '
図 1 3 実施例 6 において使用した D NAマイクロアレイにおけるプローブ のスポット配置図である。
図 1 4 実施例 6 において、 室温 （2 5 °C) でハイブリッド形成させたとき の、 各スポットのシグナル強度を比較したものである。
図 1 5 実施例 6において、 55°Cでハイブリッド形成させたときの、 各ス ポッ卜のシグナル強度を比較したものである。
図 1 6 実施例 6において、 Ί 2°Cでハイブリッド形成させたときの、 各ス ポッ卜のシグナル強度を比較したものである。 発明を実施するための最良の形態
(定義）
本願明細書においては、 以下の用語を以下に定義した意味において用いる。 「核酸」 とは、 DNA、 RNA、 及び人工的ヌクレオチドを含む DNA又は
RN Aの何れをも意味する。
「プローブ」 とは、 核酸の相補性に基づくハイブリダィズ反応を利用して、 検体中の核酸を検査するための核酸断片を意味する。
「複数種類のプロ一ブ」 とは、 対象とする遺伝子が 1つである場合には、 そ のプローブの一部の塩基配列を他の塩基配列に置換、 挿入、 欠損させたもの、 及び、 遺伝子の捕捉部位として異なる塩基部分を用いた複数のプローブを意味 する。 また、 対象とする遺伝子が複数である場合には、 それぞれの遺伝子に対 する複数の相補核酸配列プロ一ブを意味する。
「ハイブリッド」 とは、 上記の核酸の何れかの間に形成される同種間及び異 種間の二重鎖を意味し、 DNA-DNA、 DNA-RNA、 RNA-RNA等が含 まれる。 '
また 「核酸の情報」、 又は 「核酸情報」 とは、 核酸の配列自体、 核酸配列中の 変異の有無、 核酸の配列に依存して変化する物性镒 （例えば Tm)、 及び核酸の 量 （例えば mRNAのコピー数） を含む。
「シグナル」 とは、 適当な手段により適宜検出 ·測定可能な信号であって、 蛍光、 放射能、 化学発光等が含まれる。
「力イネティックに行う」 とは、 データの取得を、 ある定められた時点にお いてのみではなく、 時間的に連続した又は断続した各時点で測定を行うことを 意味する。
以下においては、 本発明の実施態様についての、 構成、 実施方法、 効果等に ついて説明する。
一の態様において本発明の核酸情報の検出方法は、 標的核酸と、 当該標的核 酸配列の少なくとも一部に対して相補的な配列を有するプローブとを接触させ、 当該標的核酸と当該プローブとの間にハイブリツドを形成させ、 当該ハイプリ ッドの量に依存した量で発せられるシグナルを測定することにより、 当該標的 核酸の情報を検出する方法において、 当該シグナルのデータ取得をカイネティ ックに行うことを含むことを特徴とする。
標的核酸は、 ゲノムからの D NA、 細胞から抽出された mR N A、 P C に より増幅された D NAや、 プラスミド D NA等、 種々のものとすることが可能 であり、 プローブとのハイプリダイズに悪影響を及ぼす夾雑物等が含まれてい ない限り、 これは特に限定されるものではない。 しかし、 精度の高い実験を行 うためには、 当該技術分野において既知の種々の精製技術により純度をより高 めておいた試料を用いることが好ましい。 また、 標的核酸は、 プローブを合成 するために、 ハイブリダィズを行う部分についての少なくとも一部の配列が既 知であることが好ましい。 標的核酸への標識の導入は、 mR N Aの逆転写ゃP C Rにより行うことができる。
標的核酸とプローブとの接触は、 核酸を、 他の核酸との間の二重鎖形成を阻 害しないようにして固定することが可能な担体上に固定化されたプローブに対 して、 標的核酸を含む溶液等を接触することにより行うことができる。
標的核酸-プローブ間の八イブリツド形成は、 ハイブリダィズする部分の配列 情報に依存した結合強度の違いに基づいて決定された条件において行うことが できるが、 例えばシグナルを測定する条件の変更が、 温度の変更である場合に は Tmの違いに基づいて決定された温度において行うことができる。 Tmより も低いが、 Tm近傍にある温度においては、 標的核酸-プローブ間での特異的な 二重鎖形成が生じやすく、 非特異的な二重鎖の形成は生じにくいが、 ハイプリ ッドの形成には時間がかかる。 一方、 このように特異的な二重鎖形成が生じや すい温度よりも更に低い温度においては、 二重鎖形成の反応時間は短縮される が、 標的核酸-プロ一ブ間の非特異的な結合量が増大してしまう。 従って八イブ リダイズ反応の温度の設定は、 要求される実験精度と必要な反応時間とのかね あいで決定される。 また、 その他の反応条件についても同様にこれを考慮して 決定される。
ハイブリッドの量に依存した量で発せられるシグナルの測定は、 通常、 試料 となる核酸に予め導入しておいた標識を用いて行われるが、 例えば蛍光標識し た試料核酸や、 放射性同位元素を含む d N T Pから合成した試料核酸等を使用 することができる。標識の導入については、種々の核酸標識技術（既存のもの、 新規に開発されるものを問わない） を使用することが可能である。.更に、 ハイ プリッドニ重鎖に結合する試薬をハイプリッド形成後に添加し、 それを検出す ることによりハイプリッドを検出することも可能である。
ハイプリッドの検出を蛍光により行う場合の例としては、 P C Rにより試料 核酸を合成する際に、 予めプライマに蛍光標識を導入しておいたものを利用す る方法や、 試料核酸に対して、 化学反応や酵素を利用して蛍光標識を導入する 方法が挙げられる。 蛍光標識の導入に関しては、 一般的に用いられている標識 方法を利用することができる。 '
シグナルデータの取得は、 時間に関して定点ではなく、 力イネティックに行 う。 より具体的には、 力イネティックにデータ取得する時間は、 ハイブリッド 形成反応の反応条件に応じて異なるものであるが、 概して、 ハイブリッド形成 反応開始後、 合計で数分間から数時間程度にわたる。 もっとも、 反応条件いか んによっては、 この範囲外の合計時間だけデータ取得を行うことも可能である。 上記したように、 本願発明のこの態様においては、 従来の時間に関しての定 点観測に基づく静的なデ一夕取得とは異なり、 デ一夕取得が力イネティックに 行われることを特徴としている。 従って本願発明においては、 標的核酸-プロ一 ブ間のハイブリツド形成の時間的変化を追跡することが可能になり、 そしてこ の時間的変化の追跡により、 標的核酸についてのより多くの、 より正確な、 そ してよりばらつきの少ない情報を得ることが可能になる。 即ち、 カイネテイツ クなデータ取得を行う場合には、 反応状態の経過をモニタリングすることが可 能になり、 反応の進行状況を厳密に検出することが可能になる。 そして、 反応 の経過全体から、 より正確な核酸情報を入手できるようになる。
上記の実施態様においては、 前記のシグナルのデータ取得が、 反応の測定条 件または検出条件を変更しながら、 より具体的には反応温度、 又は反応溶液の 組成、 容量、 若しくは種類のうちの少なくとも 1つ、 より好ましくは反応温度 を変更しながら行うことも可能である。 例えばシグナルのデータ取得を反応温 度の変更と連動させながら行う場合、 ハイブリダィズ反応の反応変化量、 反応 の立ち上がり、 反応条件の変化に対する反応系の応答具合等の情報についても 併せて取得することが可能となり、 より有益である。
ここで 「反応温度の変更」 とは、 標的核酸とプローブ間でのハイブリダィズ 反応が行われる系内の温度を変更することを意味し、 「反応溶液の組成の変更」 とは、 反応溶液に含まれる塩や添加物等の組成や p Hを変更することを意味し、 「反応溶液の容量の変更」 とは、 反応系からの反応溶液の抜き差しによる容量 の変化を意味し、 そして 「反応溶液の種類の変更」 とは、 水溶液やアルコール 溶液といった種類を変更することを意味する。
標的核酸-プローブ間のハイプリッ.ド形成は、 配列情報に基づいた推定の最適 条件において行われるものであり、 従ってその条件が本当に最適条件であるか はわからないのが普通である。 そのために、 静的に測定を行う従来の核酸情報 検出方法においては、 最適ではない条件下でのデータ取得を行っている場合に は、 デ一夕の信頼性が十分ではなかったり、 データのばらつきが存在したりす るなどの問題が存在していた。
しかし、 本願発明の上記態様におけるように、 力イネティックなデータ取得 と連動して反応条件を変更することにより、 複数の反応条件でハイプリダイズ 反応を進行させ、 それを経時的に測定することが可能となる。 そのためこの実 施態様においては、 データの信頼性等についての上記した従来の問題が解決さ れることとなる。
ある条件下においてハイプリッド形成が進行している場合には、 力イネティ ックなデータ取得によって、 ハイプリッド反応のモニタリングが行われること になる。 そのため、 ハイブリッド反応の進行をより厳密に検出することが可能 となる。 従って、 シグナルのデータ取得をこのように力イネティックに行う本 願発明においては、 反応の初期段階における反応変化率を測定し、 それによつ て反応の終了時点を予測することも可能となる。 これは、 核酸検出のための反 応時間を短くすることに役立つものである。 更にこれを発展的に利用する場合、 ハイプリッド形成の最適反応条件を力イネティックなデータ取得で決定し、 反 応条件を最適なものへと移行することや、 広範な反応条件にわたるハイプリッ ド形成反応を追跡することに役立てることも可能である。
上記した本願発明の実施態様に属するものとしては、 試料中の特定遺伝子の 転写量やコピー数の比較、 核酸配列中における特定配列 （正常型又は変異型） の検出、 S N Pに代表されるような遺伝子多型検出、 ウィルスや細菌のタイピ ング等が挙げられる。
別の態様において本願発明の核酸情報検出方法は、 標的核酸の配列の少なく とも一部に対して完全に相補的な完全マツチプローブ、 及び当該完全マッチプ ローブの少なくとも一部が変異した 1以上の種類の不完全マッチプローブを、 当該標的核酸と接触させ、 当該標的核酸と当該完全マッチプローブ又は当該不 完全マツチプローブとの間にハイブリッドを形成させ、 当該ハイブリッドの結 合強度の違いに基づいて当該標的核酸の核酸情報を検出する方法において、 当 該ハイプリッドが発するシグナルを測定する条件を連続的又は段階的に変更し ながら、 当該シグナルのデータ取得を力イネティックに行うことを含むことを 特徴とする。
この実施態様においては、 ハイブリダィズ反応の進行を非常に精密に行うこ とを可能とするものとなっている。 例えば反応温度を連続的又は段階的に変更 しながらシグナルのデ一夕取得を力イネティックに行うと、 1塩基のみにおい てしか異なっていない核酸配列の変異の検出を行うことも可能になる。
より具体的には、 例えば P C R産物等の標的核酸を準備し、 その天然の配列 の少なくとも一部に完全に相補的なプローブと、 その既知の配列のうちの、 同 一の 1塩基が変異した 3つの異なるプローブを準備する。 これら 4種類のプロ —ブは、 その同一の 1の塩基部分において、 それぞれ A、 T、 G、 Cの何れか のヌクレオチドを有していて、 その他の部分においては完全に同一となってい る。 これら 4種類のプローブを使用して、 標的核酸とのハイプリダイズを、 反 応温度を変更しながら測定する。 標的核酸に完全マッチするプローブとのハイ ブリツドについての Tm近傍の温度においては、 標的核酸と、 これに完全にマ ツチしないプローブとの間のハイブリッドは、 より不安定であるために、 標的 核酸とプローブとが解離した状態側に平衡が傾いていると考えられる。 そのた め、 この Tm近傍の温度においては、 標的核酸と、 これに完全にマッチするプ ローブとの間のハイブリツドが最も強くシグナルを発しているはずであり、 一 方、 標的核酸と、 これに完全にはマッチしないプロ一ブとの間のハイブリッド は、 存在していたとしてもその量は非常に少なく、 よって、 シグナル強度は強 くない。 このようなシグナル強度の違い、 又はシグナルの有無から、 標的核酸 中において変異していると考えられる塩基が、 シグナル強度を基にして、 A、 T、 G、 Cの何れかであるかを同定することが可能となる。 従来の方法におい ては、 ハイブリダィズを行う反応温度は定点であったために、 その反応温度が 当該ハイプリッド形成に最適ではない場合、 不完全マツチプローブとのハイブ リダィズの方がより強いシグナルを与えることも考えられた。 しかし、 本願発 明のこの態様においては、 柔軟に反応温度等の反応条件を変更できるために、 このような誤つた結果がでることを効果的に防ぐことが可能となっている。 従来の方法において、 このように 1塩基のみが変異している標的核酸を検 出 '区別するには、 反応温度を Tm近傍の温度にまで上昇させる必要性から、 長い反応時間を要していた。 しかし、 本願発明のこの実施態様の方法において は、 より柔軟な温度制御が可能であることから、 例えば、 Tmよりも低い温度 からハイブリッド形成を開始し、 一定量のハイブリッド量を確保した後に、 T m近傍にまで反応温度を連続的又は段階的に上昇させることにより、 ハイプリ ッド反応時間を短縮することが可能となる。 更には Tm近傍の温度範囲での細 かな温度制御により、 非特異的なハイブリッド形成を除外して、 より精度の高 い測定を行うことが可能となる。
本願発明のこの態様においては、 複数の塩基において変異を含むプローブを 適宜用意して用いれば、 1塩基のみならず、 複数の塩基の変異を同時に検出す ることも可能である。
このように、 反応温度の変更を、 シグナルデ一夕の取得と連動して変更する ことにより、 上記のような効果が得られるが、 反応温度以外の反応条件、 例え ば反応溶液の組成、 容量、 又は種類の変更によっても同様の効果が得られる。 より具体的には、 ハイブリツド形成反応の反応溶液の塩の種類や濃度を変更す ることや、 異なる緩衝液を使用することによる ρ Η勾配の形成を通じて、 ハイ プリダイズ反応の条件を変更することも可能である。 このような反応溶液の組 成等の変更は、 反応温度の変更と同様に、 ハイブリッド形成へ影響を与える。 上記した本願発明の実施態様においては、 反応時間の短縮化等の観点より、 反応温度の変更は、 温度上昇であることが好ましい。 温度を上昇する場合、 特 にハイプリッドの推定 Tmよりも低い温度から開始する場合には、 非特異的な 結合が生じるものの、 標的核酸とプローブ間のハイプリッド形成が促進され、 また、 非特異的な結合は、 その後の温度上昇により除去できることから、 より 好ましいと考えられる。 従って、 温度上昇の場合には反応時間が短縮されるの みならず、 ハイブリツド反応の精度も上昇するという効果を得ることが可能と なる。
反応温度の変更については、 Tm値未満の温度から、 Tm値を越える温度間 の温度上昇が好ましいが、 これを更に発展させて、 Tm値未満の温度から、 T m値を越える温度間の温度上昇と温度下降からなる 1回又は複数回の温度サイ クルとすることにより、 ハイブリダィズ反応のプロファイルを取得することが 可能となる。 これにより、 更に信頼性の高いデータを取得することが可能とな る。
反応温度の上昇を行う場合には、 上昇中のシグナル強度の極大値を測定する ことにより、 ハイプリッドの Tm値を定性的又は定量的に求めることが可能と なる。 温度上昇を段階的に行う場合は、 おおよその Tm値が決定でき、 温度上 昇をより細かく段階的に （たとえば 1 °C以下の間隔で）、 又は連続的に行えば、 より正確な Tm値を決定することも可能である。 この Tm値の違いは、 各核酸 の配列における変異の有無や違いを反映しているものであるので、 本発明のこ の態様により、 変異の検出をより厳密に行うことが可能となる。
また、 この実施態様においては、 ハイブリッドからのシグナルを検出するの みならず、 シグナルの変化量を計測すれば、 測定の精度を更に高めることも可 能となる。
更に別の好ましい態様において、 本発明の核酸情報検出方法は、 ハイブリツ ドが発するシグナルを測定する温度を連続的又は段階的に上昇させ、 当該ハイ ブリツドから発せられるシグナル強度の変化を測定し、 その変化量が負に転じ た時にその温度を維持することを含むことを特徴とする。
この実施態様によれば、 未知の変異についての検出をより精度良く行うこと が可能となる。 即ち、 反応温度を連続的又は段階的に変化させる間のシグナル 強度の変化を検出し、 そのシグナル強度の変化量が負に転じたところで反応温 度を維持すると、 その温度よりも高い温度の Tm値を有するハイブリツド種か らの信号は、 その強度が保たれるか又は更に上昇するが、 一方、 維持された温 度以下の Tm値を有するハイプリッド種からの信号は、 徐々に減少していくと 考えられる。 従って、 Tm値の違いを利用して、 完全にマッチしたハイブリツ ド種と、 完全にはマッチしていないハイプリッド種とをより精度良く区別する ことが可能となり、 完全にマッチしたプローブの配列に基づいて、 未知であつ た変異を同定できる。
他の実施態様において本願発明の核酸情報検出方法は、 同一の反応条件を適 用することが可能な同一の系内において、 複数種類のプローブを使用し、 複数 種類の核酸についての情報を同時に検出することを特徴としている。 より具体 的には、 D N Aマイクロアレイを利用する。
このとき、 標的核酸-プローブ間のハイブリッド形成は、 標的核酸中のハイブ リダイズする部分の配列に依存する条件近辺において行うことができるが、 例 えばシグナルを測定する条件の変更が、 温度の変更である場合には標的核酸の ハイプリッド形成部分の配列の Tmに基づいて決定された温度範囲において力 イネティック行うことができる。 即ち、 複数種類のプローブのうちもっとも低 レ Tm値を有するプローブの T m値よりも低い温度から、複数種類のプローブの うちでもっとも高い Tm値を有するプローブの T m値よりも高い温度の間の温 度範囲内で力イネティックにシグナルの測定を行うことができる。 温度をカイ ネティックに変化したときの、 標的核酸とプローブとの間のハイプリッド状態 の変化を図を参照しながら以下に説明する。
図 8乃至図 1 1は、 4種類の配列を検出するための実験系における、 ハイブ リツド状態の変化を模式的に示したものである。 これらの図においては、 標的 核酸 A、 B、 C、 及び Dの配列を検出する試みが行われており、 標的核酸 A、 B、 C、 及び Dのそれぞれの Tm値 （/°C) (Tm (A)、 Tm (B )、 Tm ( C )、 及び Tm (D) ) の間には、 Tm (A) <Tm (B ) く Tm ( C ) く Tm (D) の関係が存在している。 この実験系においては、 測定温度を、 図 1 2に示され るようなスキームにより、 力イネティックに変化させて、 各温度において標的 核酸の検出を行っている。
図 8は、 図 8乃至図 1 1の中でもっとも低い温度である、 Tm (A) 近傍の 温度 Τ (Α ' ) でのハイブリッドの状態を示したものであり、 標的核酸 Αとその 完全マッチプローブのハイブリツドのシグナル強度は、 標的核酸 Aとその一塩 基ミスマッチプローブとのハイブリッドとのシグナルの強度よりも強いが、 よ り高い Tm値を有する標的核酸 B、 C、 及び Dを含むハイブリッド由来のシグ ナル強度よりも弱くなつている。
図 9は、 Τ (Α ' ) から更に温度を、 Tm ( B ) 近傍の Τ (Β ' ) にまで上げ た状態を示す。 この温度においては、 標的核酸 Βとその完全マッチプローブと のハイプリッドのシグナル強度は、 標的核酸 Βとその一塩基ミスマッチプロ一 ブとのハイブリッドのシグナルの強度よりも強いが、 より高い Tm値を有する 標的核酸 C、 及び Dを含むハイブリツド由来のシグナル強度よりも弱くなつて いる。 更にこの温度においては、 標的核酸 Aとその完全マッチプローブとのハ イブリツドのシグナルは、 検出されているが、 標的核酸 Aとその一塩基ミスマ ツチプローブとのハイブリツドのシグナルは、 ほぼ検出されていない。
次に図 1 0は、 Τ (Β ' ) から更に温度を、 Tm ( C) 近傍の T ( C ) にま で上げた状態を示す。 この温度においては、 標的核酸 Cとその完全マッチプロ ーブとのハイブリツドのシグナル強度は、 標的核酸 Cとその一塩基ミスマッチ プローブとのハイブリッドのシグナルの強度よりも強くなつている。 更にこの 温度においては、 標的核酸 A、 Bとそれぞれの完全マッチプローブとのハイブ リッドのシグナルは、それぞれ検出されているが、特に標的核酸 Aについては、 図 8と比較して弱まっており、 標的核酸 A及び Bと、 それぞれの一塩基ミスマ ツチプローブとのハイブリッドのシグナルは、 ほぼ検出されていない。
次に図 1 1は、 T ( C ) から更に温度を、 Tm (D) 近傍の T (D ' ) にま で上げた状態を示す。 この温度においては、 標的核酸 Dとその完全マッチプロ ーブとのハイプリッドのシグナル強度は、 標的核酸 Dとその一塩基ミスマッチ プローブとのハイブリッドのシグナルの強度よりも強くなつている。 更にこの 温度においては、 標的核酸 B、 及び Cとそれぞれの完全マッチプローブとのハ イブリッドのシグナルは、検出されているものの、特に標的核酸 Bについては、 図 9と比較して弱まっており、 標的核酸 Aを含むハイブリッド、 並びに標的核 酸 B及び Cとそれぞれの一塩基ミスマッチプローブとのハイブリッドは、 ほぼ 検出されていない。
シグナルのデ一夕取得は、 時間に関して定点ではなく、 一例が図 1 2に示さ れるように力イネティックに行う。 より具体的には、 力イネティックにデ一夕 取得する時間は、 ハイブリツド形成反応の反応条件に応じて異なるものである 力 概して、 ハイブリッド形成反応開始後、 合計で数分間から数時間程度にわ たる。 もっとも、 反応条件いかんによっては、 この範囲外の合計時間だけデ一 夕取得を行うことも可能である。 図 1 2に示される例では、 温度上昇は、 階段 状に、 断続的に行われているが、 連続的に上昇させたり、 逆に下降させるるこ とも可能である。
標的核酸-プローブ間のハイプリッド形成は通常、 配列情報に基づいた推定の 最適条件において行われるものである。 従ってその条件が本当に最適条件であ るかはわからないのが普通である。そのために、 静的 (非力イネティック) に、 又は定点的に測定を行う従来の核酸情報検出方法においては、 最適ではない条 件下でのデータ取得を行っている場合には、 データの信頼性が十分ではなかつ たり、 データのばらつきが存在したりするなどの問題が存在していた。
しかし、 本発明においては、 力イネティックなデータ取得と連動して反応条 件を変更することにより、 複数の反応条件でハイプリダイズ反応を進行させ、 それを経時的に測定することが可能となる。 従って、 例えば Tm値など、 配列 固有の特性値が異なる複数種類のプローブを使用する場合であっても、 力イネ ティックなデータ取得を行う際に、 その特性値の範囲を考慮して実験を行えば、 同一系内において、 同一核酸中の複数の配列の検出や、 複数種類の標的核酸の 検出をほぼ同時に行うことが可能となる。
このように、 本発明の一態様においては、 従来の時間に関しての定点観測に 基づく静的なデータ取得とは異なり、 データ取得が力イネティックに行われ、 尚且つ複数のプローブを使用していることに起因して、 Tm値の異なる複数の 配列を同一系内において、 精度よく尚且つ高速に検出することが可能となって いる。
本発明の核酸配列の変異検出方法一の態様においては、 前記プローブが、 複 数種類の配列を有する複数種類のプローブであって、 当該プローブ同士が、 互 いに重なり合う配列を有することを特徴とする。
この態様の方法においては、 標的核酸中の同一の配列を複数種類のプローブ で検出する。 これらの複数種類のプローブは何れも、 標的核酸中の認識配列を 共有し、即ち認識配列に重なりが生じていて、尚且つ少なくとも 1塩基分だけ、 他のプローブとは異なる塩基とハイブリダィズするものとなっている。
同一の標的核酸に対し、 このような複数種類のプローブを使用することによ り、 変異をより正確に検出することが可能となる。 プローブは、 その配列及び 長さ、 そして使用条件によっては高次構造をとるなどして、 標的核酸とのハイ ブリダイズがうまくいかないことがあり、 そのようなプローブのみを使用して 標的核酸の検出を行えば、 偽陽性 ·偽陰性の問題が生じることがある。 しかし ながら、 複数種類のプローブを利用すれば、 少なくともその 1種類のプローブ が正常に標的核酸とハイブリダィズしている確率がより高いことが期待され、 よつて検出結果の信頼性を高めることが可能となる。
より具体的には、 前記の複数種類の配列のプローブに、 標的核酸の配列の少 なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ、 及び当該完全マツ チプローブの少なくとも一部が変異した 1種類以上の不完全マッチプローブと、 当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブの両端あるいは片端に おいて塩基配列を伸張するか、 又は短縮したオーバーラッピングプローブとか らなるものを利用すると、 より正確な測定 （変異の判定） が可能となる。
好ましくは、 長さの短いプローブと、 長さのより長いプローブとの間の Tm 値の差を、 5乃至 1 0 °C設ける。 そしてこれらのプローブを同一系内で使用し て力イネティックに測定を行う。 プローブ間の Tm値の差異が 5乃至 1 O tで ある場合には、 より長いプローブの Tm値近傍の温度においても、 短いプロ一 ブの完全マツチのスポットからのシグナルが期待できるためである。
本願発明の核酸情報検出方法において使用できる D N Aマイクロアレイにつ いては特に限定されるものではなく、 通常のマイクロアレイを利用することが できる。 使用可能なマイクロアレイの一例としては、 複数のマイクロアレイが スライドチップ上に設けられたものであって、 各マイクロアレイ中に、 複数の プローブスポットが存在するものを挙げることができる。 ここで、 プロ一ブス ポットとは、 プローブを固定するための最小単位のことである。
スライドチップの大きさは、 通常は 0 . 5 - 2 0 . 0 c m X 0 . 5 - 2 0 . 0 c m X 0 . 0 1 - 1 . 0 c mの範囲である。 また、 マイクロアレイの大き さは、通常は 3 . 0 mm2- 1 6 c m2の範囲にある。更に、プローブスポットは、 略円形、 略矩形、 又は多角形とすることができ、 その直径又は一辺の長さは、 通常、 数百/ x m程度である。 また、 1マイクロアレイ中のプロ一ブスポットの 数は、 1 0 - 1 0 0 0の範囲にあることが通常である。 実験条件に応じて、 ここ に定義した範囲以外の規格の D N Aマイクロアレイを使用することも勿論可能 である。
D N Aマイクロアレイを利用する場合、 同一の条件を全プロ一ブスポッ卜に 課することが可能であり、 複数のプローブを利用すれば、 複数の核酸について の情報を一度に検出することが可能である。
D N Aマイクロアレイを用いるこの実施態様においても勿論のこと、 本願発 明の一の特徴であるカイネテイツクなシダナルデ一夕の取得が行われることに 起因して、 経時的な測定を行わない従来の静的測定の場合に問題となっていた、 ハイプリッド形成の反応時間が長いという問題を解決することも可能である。 即ち、 上記したように、 ハイブリッド形成をその Tmよりも低い温度から開始 し、 順次反応温度を上昇させることにより、 ハイブリッド形成反応を短縮化す ることが可能となる。
好ましい一の態様において本発明の核酸情報検出方法は、 標的核酸とプロ一 ブとの間のハイブリッド形成が、 標的核酸を含む液体試料を、 多孔質体に固定 されたプローブに接触させることにより行われることを特徴とする。
この態様においては、 プローブの固定が、 従来の基板表面とは異なり、 多孔 質構造を有する担体に対して行われるため、 核酸を固定化する表面積が飛躍的 に増大し、 これに起因して核酸情報の検出の速度及び感度が上昇する。 ここで 用いられる多孔質体としては、 核酸の固定に適する何れの多孔質体をも意味し、 特に限定されるものではないが、 例としては、 陽極酸化により作製された酸化 アルミニウム膜、例えば Whatman社の商品名 Anodiscを挙げることができる。 本願発明の他の好ましい態様においては、 変更するシグナル測定条件のそれ ぞれの条件において、 標的核酸を含む液体試料を、 前記の多孔質体内を 1回又 は複数回往復させる工程を行うことを含むことが好ましい。 このように多孔質 体内を、 標的核酸を含む試料を往復させることにより、 多孔質内に固定化され たプローブと標的核酸との接触頻度が増えることになり、 これは反応の更なる 進行及び更なる感度の上昇に寄与することとなる。 ここで、 反応温度等の反応 条件の変更は、 試料の多孔質体内での往復工程と連動して行うことが好ましレ^ このように、 多孔質内を 1回又は複数回、 試料を往復させるためには、 ハイ プリッド形成反応を行う反応担体中の多孔質部分の内外において試料の流動を 強制的に制御するための手段を設ける必要がある。 しかし、 この手段を用いて 試料の往復を一定の時間制御下にて行うと、 反応系の温度制御をより正確に行 うことが可能となり、 検出精度の上昇や、 より細かなデータ取得を可能にする という利点が生じる。
本願発明の核酸情報検出方法についての何れの実施態様においても、 ハイブ リツドの検出は、 蛍光標識に基づいて行うことが可能である。 使用する蛍光標 識の種類としては、 F I T C、 ローダミン、 C y 3、 C y 5、 テキサスレッド 等を挙げることができるが、 これら以外のものを利用することができる。
本願発明の核酸情報検出方法により検出可能な標的核酸は、 特に限定される ものではないが、 非限定的な例としては、 癌遺伝子、 細胞内薬剤耐性遺伝子、 細胞周期制御遺伝子、 及びアポトーシス関連遺伝子等を挙げることができる。 本願発明は、 上記の核酸情報検出方法に特に使用できる、 核酸情報解析装置 を提供するものであるが、 これは、 標的核酸を含む試料を入れるための試料貯 蔵容器、 核酸を固定できる多孔質構造体を含み且つ当該容器と接続された核酸 反応担体、 当該試料が当該容器と当該核酸反応担体との間で、 制御されながら 漏れなく流動するための駆動手段、 当該反応担体上での反応温度を制御する手 段、 及び当該多孔質構造体において形成される標的核酸とプローブとの間のハ イブリッドから発せられるシグナルを検出するための手段を含むことを特徴と する。 この装置の一実施例についての概略は、 図 1に示される通りである。 図 1に示される装置は、 蛍光顕微鏡をべ一スとした検出装置であり、 各コンポ一 ネントが、 P Cによりその動作を制御されているものである。
ここで試料貯蔵容器 （図 1では図示せず） としては、 試料核酸の貯蔵に適す るものであれば特に限定されるものではない。 また、 核酸を固定できる多孔質 構造体を含む核酸反応担体についても、 核酸の固定に適し、 ハイブリッドの形 成を阻害するような材質でなければ特に限定されるものではないが、 核酸反応 担体の具体的な例としては、 上述の D N Aマイクロアレイを挙げることができ、 特に多孔質構造を有する担体に所望の核酸プローブを固相化させたものが取り 付けられるようになっているものが好ましい。 ここで試料貯蔵容器と、 核酸反 応担体との間の構造については、 試料核酸を多孔質構造体へ 1回または複数回 ,漏れなく往復流動させるために、 その構造体は密閉されていることが望ましく、 更に、 試料核酸の全量を保持できるだけの容量を有することが好ましい。 そし て試料溶液を試料貯蔵容器と核酸反応担体との間で流動させるための溶液駆動 手段としては、 1単位の溶液の輸送に適したポンプ類を使用することができ る。 核酸反応担体上での反応温度を制御する温度制御手段としては、 0 . 1 °C 程度の単位で温度設定できるものが好ましく、 これは核酸反応担体のみならず、 試料貯蔵容器、 並びに試料貯蔵容器及び核酸反応担体の間の流路の環境温度を 同一の温度に設定できるものであることが好ましい。 ハイブリツドから発せら れるシグナルを検出するための手段としては、 例えばハイブリツドの標識が、 蛍光体である場合には、 核酸反応担体からの光学的信号を撮像するための C C Dカメラ （画像検出部） を備えた顕微鏡等とすることができる。 これらの顕微 鏡、 画像検出部、 溶液駆動手段、 及び温度制御手段は、 いずれも適宜 P Cによ り制御されていることが望ましい。 そして得られた画像は P Cの演算処理によ り各プローブ毎の信号情報に変換され、 その絶対値、 相対値、 変化量を反応温 度や駆動回数、 時間等のパラメータとの演算処理により、 最終的な遺伝子の変 異情報を表示できるような構成となっている。
本願発明の核酸情報解析装置の一の態様においては、 当該装置は、 前記の核 酸反応担体へと接続され且つ標的核酸を含む試料とは異なる種類の溶液を貯蔵 するための 1以上の溶液貯蔵容器、 及び適宜当該溶液貯蔵容器に含まれる各種 の溶液を渥合して前記核酸反応担体へと送る手段を更に含むことが好ましい。 当該装置において、 核酸反応担体へと接続され且つ標的核酸を含む試料とは 異なる種類の溶液を貯蔵するための 1以上の溶液貯蔵容器を設けることにより、 反応温度以外の反応条件、 例えば反応溶液の組成や p Hを変更させながらハイ ブリダィズ反応を進行させることが可能となる。 また、 溶液貯蔵容器に含まれ る複数の溶液を混合して核酸反応担体へと送る手段を有する場合には、 塩濃度 や p Hについての勾配を設けて反応条件を変更することが可能となる。
本発明の核酸情報解析装置において解析できる核酸の種類は特に限定される ものではないが、 非限定的な標的核酸の例としては、 癌遺伝子、 細胞内薬剤耐 性遺伝子、細胞周期制御遺伝子、またはアポトーシス関連遺伝子が挙げられる。
(実施例 1 )
実験方法
プロ一ブとして、 配列番号 1 - 4に示される 4種のオリゴ D NAを合成し、 陽 極酸化で作製した酸化アルミニウム基板に固相化した。 反応の検証のために、 配列番号 5に示されるオリゴ D N Aをサンプルとして、 ハイブリダイズ反応を 行った。 このオリゴ D NAは、 その 3 ' 側を F I T Cで標識した。 配列番号 5 のオリゴ D NAの配列は、 配列番号 1のプローブと相補的なものとなっている。 また配列番号 2 - 4のプローブは、 配列番号 5のオリゴ D N Aの相補鎖に対し、 その中央の塩基を一塩基変異させたものとなっている。 このオリゴ D NAサンプルを 1 X S S P E緩衝液で希釈し、 ΙΟηΜの濃度とし て、 各プロープとの八イブリダィズ反応を基板上で行った。 核酸反応担体であ る基板への溶液の流動と連動して、 核酸反応担体の温度を制御した。 具体的な 条件は以下の通りである。
サイクル数 温度
I- 5 25°C
6-10 40°C
II- 15 60°C
各サイクルは、 試料貯蔵容器と核酸反応担体との間の溶液の往復に 1分間か けて行った。
結果 図 2に結果の図を示す。 図中には配列番号 1及び 2のプローブに対す る検出シグナルを示してある。 図 2の (A)の領域は、 25°Cでハイブリダィズを行 つた結果を示すものであり、 溶液の流動サイクル数の増大とともに、 シグナル 強度は上昇している。 ここでは、 標的核酸とプローブ間の非特異的な反応も生 じていることから、 ハイブリッド形成を促進する効果がある。 しかし、 非特異 的な反応のため、 完全マッチプローブ （配列番号 1のプロ一ブ） と、 不完全マ ツチプロ一ブ （配列番号 2 ) の間のシグナルの差は小さい。 （B)の領域は、 反応 温度を 40°Cとした場合の結果を示すものである。 配列番号 1のプローブが形成 しているハイブリツドに由来するシグナルは上昇しつづけ、 配列番号 2のプロ ーブが形成しているハイプリッドに由来するシグナルの強度はやや減少してい る。 このように、 完全マッチプローブと不完全マッチプローブとの間にシグナ ル強度についての差異が生じている段階で検出を行うことにより、 輝度差が大 きいために、 より精度よく核酸配列の検出を行うことが 能となる。 ここでは 配列番号 1のプローブが形成するハイプリッドに由来する信号強度が最も強く 現れた。 図中には示さなかったが、 配列番号 3及び 4のプローブが形成するハ イブリッドに由来する信号についても、 配列番号 2のプローブの場合と同様の 結果であった。 したがって、 温度制御を行うハイブリダィズ反応により、 一塩 基の変異を精度よく検出できることが検証できた。
(実施例 2 )
実験方法
細胞株由来の p53遺伝子の変異を検出する実験を行った。 試料として、 ヒト リンパ芽球腫 WTK1の細胞株を利用した。 この細胞株では、 p53遺伝子のェク ソン第 7コドンの 273部分が ATGから ATAへ変異していることが確認されて いる。 この変異部分を含む 98bpを PCRにより増幅処理した。 PCRの際のブラ イマの 5'側には F I T Cを使い、 蛍光標識を行うことで、 増幅産物への蛍光標 識を行った。 得られた増幅 D N Aを水に溶解し、 95°Cで熱変性させた。 10分後 に急冷し、 ハイブリダィズ用の緩衝液に溶解することで、 一本鎖の D N Aサン プルとした。 増幅した配列は、 配列番号 6に、 そして検出した配列部分は、 配 列番号 7に示した。
一方変異検出のために、 変異が想定される部分を中央においたプローブを複 数個合成し、 多孔質の構造を有する基板上に固相化した。 固相化したこれらの プローブは配列番号 8 - 1 1に示したとおりである。 ここで、 配列番号 7に相補 的なプローブは配列番号 1 0のプローブである。 これらの試料を用いた八イブ リツド形成反応は、 温度変化と連動させて行い、 更に試料溶液を、 多孔質構造 を有する核酸反応担体への出し入れ （駆動制御） を行った。 これらの反応のう ち、 配列番号 1 0及び 1 1が形成するハイブリッドに由来するシグナル情報の 結果を図 3に示す。 これは、 配列番号 1 0及び 1 1のプローブが形成するハイ ブリツドに由来するシグナルの強度を、 配列番号 1 0のプローブが形成するハ イブリツドに由来するシグナル強度を 100とした場合の相対的強度比で示した ものである。
結果 温度の上昇とともに、 完全マッチと一塩基のミスマッチを含む不完全 マッチとの間のシグナルの強度比の差が大きくなり、 室温では検出できなかつ た一塩基の識別が、 温度の制御により可能であることが確認された。
(実施例 3 ) ' 実験方法
本願発明に基づいて行つた、 K-Rasガン遺伝子の Codonl2近傍の変異の有無 を決定する方法を示す。 マイクロアレイ上に、 Codonl2の部分に突然変異を導 入した 7種類の K-Rasガン遺伝子プローブ （配列番号 1 5 - 2 1 ) を、 図 4に示 される配置でスポットする。 このマイクロアレイとサンプルである蛍光標識さ れた K-Ras遺伝子 （配列番号 1 2及び 1 3のプライマを利用して P C Rにより 増幅済） との間の Tm を測定した。 この時に用いる実験ステップについて記載 する。 実験ステップは、 1 ) 蛍光標識サンプルの作成、 2 ) マイクロアレイの 作製、 3 ) サンプルのマイクロアレイに対するハイブリダィゼ一シヨン、 4 ) データ解析、 の 4つのステップから構成される。
1 ) 蛍光標識サンプルの作製：対象遺伝子セットの増幅、 および蛍光標識を行 う。 この時に用いるサンプルとしては、人体の一部であれば特に制限はないが、 主にガン化した組織などから採取した組織切片や、 マイクロダイセクション法 などによって得られた細胞片、 あるいは培養細胞などが用いられる。 本実施例 においては、 宝酒造から発売されているヒト K-Ras遺伝子テンプレートセット (Cat#7242) を用いた。 7種類のテンプレートに対して、 同じく K-Ras遺伝子 Codonl2の部分を増幅できる PCRキット (Cat#7112)を用いて遺伝子増幅する。 この時、 配列番号 12及び 13に示されるような、 5'末端に FITCの蛍光標識が 入れられたアンチセンスプライマーを使用した。 PCR の終了後に 3%NuSieve(FMC)で作成したァガロース電気泳動を行なって、 増幅産物を確認 した。 さらに蛍光標識を増強するために、 得られた増幅サンプルを再度 Asymetrix PCR法で処理した。 Asymetrix PCR法は、 最初の PCR法からセン ス鎖のプライマを除いた組成、温度サイクルを使用する。 PCR産物に 10%(VV) となるように 3M酢酸アンモニゥム (Wako)を加え、 さらに 70%濃度となるよう にエタノール （Wako) を加えた。 -20度で一昼夜静置し、 12.000rpm X 2 min の遠心によって PCR産物を沈殿させた。 2回 70%エタノールによつて沈殿を洗 浄したあと、 SpeedVac(Savant社)によって乾燥させた。
2) マイク□アレイの作製： K-Ras遺伝子の塩基配列は、 GenBankなどのデ一 夕ベースを参照し、 配列番号 15-21のプローブをマイクロアレイに固相化し た。 合成したプローブをマイクロアレイに図 4のレイアウトとなるようにピエ ゾ素子を利用した微量分注システムを利用して分注した。 図 4において、 スポ ット Al、 A5、 C 5、 Gl、 G 5においては、 配列番号 14のネガティブ対 照プローブに蛍光標識したもの （スポット位置参照用） が配置されている。 ス ポット A2-A4においては、 配列番号 15の K-RAS-Va 1変異体に対応す るプローブが、 スポット B 2-B 4においては、 配列番号 16の K-RAS-As P変異体に対応するプローブが、 スポット C 2-C 4においては、 配列番号 17 の K-RAS-A 1 a変異体に対応するプローブが、 スポット D 2 -D 4において は、 配列番号 18の K-RAS-S e r変異体に対応するプローブが、 スポット E 2 -E 4においては、 配列番号 19の K-RAS-C y c変異体に対応するプロ一 ブが、 スポット F 2 -F 4においては、 配列番号 20の K-RAS-A r g変異体 に対応するプローブが、 そしてスポット G2-G4においては、 配列番号 21の K-RAS- N天然配列に対応するプロ一ブが、 それぞれ配置されている。
3) リアルタイムハイブリダィゼーションモニタリング：乾燥させたエタノー ル沈殿に、 50 1の純水を加えてよく溶解し、 蛍光標識サンプルとした。 ハイブ リダイゼ―ション用溶液として、 3 xSSPE (リン酸ナトリゥム緩衝液、 技術資 料： D N Aマイクロアレイと最新 PCR法、 細胞工学別冊ゲノムサイエンスシリ —ズ 1秀潤社参照)、 10 %(V/V)ExpressHyb(Clontech社)にサンプルを 10%溶 液となるように懸濁した。 ハイブリダイゼーションの分析は、 ォリンパス光学 社製の BX-51TFRに冷却 CCDカメラを接続した実験システムによって行なつ た。 この実験システムは、 反応フィルターの周りの溶液駆動と温度制御、 およ び蛍光スボットの画像の記録を自動的に行なうことが出来るように設計されて いる。 直径 6mmのマイクロアレイが設置された専用チャンバ一の反応部分に、 50 Lの反応溶液を加え、 溶液駆動と温度変化を与え、 蛍光画像を撮像した。 テンプレート由来の蛍光標識サンプルを用いて得られた実験結果を示す。 対 照試料として、 正常な K-Ras遺伝子配列を持つ； PCR産物を使用した。 ハイブ リダイゼ一シヨン時に、 温度変化を与えた場合に得られたマイクロアレイの蛍 光スポッ卜の時間変化を図 5において示した。図 5は、下側から、反応後 1分、 10分， 2 0分、 3 0分、 4 0分の蛍光画像であり、 溶液駆動を伴い、 且つ溶液の 温度変化を与えるようにプログラムした。 温度に関しては、 最初に室温であつ た反応チャンバ一が、 最終的には 72°Cとなるように設定してある。 図からも明 らかなように、 反応後すぐにほとんどのスポットの蛍光輝度が上昇し、 さらに 温度を上げるに従って、 図の E 2、 E 3、 E 4に相当する部分にスポットした Cysスポット（codonl2の配列 TGT)が最も高いレベルの蛍光を示している（2 0 - 3 0分後)。 この温度環境では、 固相化された 7種類の異なる塩基配列を持つ プローブの中で、 サンプルに対して完全に配列の一致したプロ一ブではなく、 むしろ Tmの計算値の低いプローブに対して、 サンプルがより強く結合してい ることがわかる。 さらに反応チャンバ一の温度を上げることにより、 次第にこ の Cysスポット （E 2 - E 4スポット） の蛍光強度は減少し、 7 2度の温度とな つた段階で、 実際に標的核酸に対してパーフェクトマッチである Gly(Codonl2 の配列 GGT)の蛍光スポット （G 2 - G 4 ) のみが観察されるようになる （4 0 分後）。 この一連の画像を温度条件などの情報と共にハードディスクに保存した。
4 ) 解析：得られた画像を変異検出用にプログラムした解析ソフトウェアを利 用して解析した。 実験の結果得られた蛍光画像情報を元にして標的核酸とプロ —ブの間の Tm値とァフィ二ティの程度を決定することが出来る。 この結果、 3 ) の実験から、 サンプルの K-RasCodonl2部分のプローブと標的核酸とのハ ィブリダイゼ一シヨンの程度が環境要因によつて変化し、 ある温度条件におい てはミスマッチプローブの方がマッチしたプローブよりもより高いァフィニテ ィを持つことが分かった。 またプローブとサンプルの間のァフィ二ティは、 ミ スマツチの塩基配列によって異なることが画像から直感的にも理解出来る。 こ のようにして、 一つの反応アレイによってサンプルと複数のプ口一ブ間のリア ルタイムなァフィ二ティの解析とハイブリダイゼーシヨンのモニタリングが行 なえることが示された。 この実験システムを使用して実際の Tmの値を求める ことが出来ると共に、 D N Aの二重らせんの安定性についての新しい知見が得 られることが期待出来た。 実際にさまざまな突然変異を持つプローブへの親和 性を解析したり、 プロモーター部分の転写効率を測定することによって、 より 正確なハイプリダイゼーションの機構の解析に利用できる。
(実施例 4 ) この発明に基づいて行つた P53ガン抑制遺伝子と K-Rasガン遺伝子を同時に 検査する実験ステップについて記載する。 実験ステップは 1 ) 蛍光標識サンプ ルの作製、 2 ) マイクロアレイの作製、 3 ) D NAチップに対するハイブリダ ィゼーシヨン、 4 ) データ解析、 の 4つのステップから構成される。
1 ) 蛍光標識サンプルの作製：対象遺伝子セットの増幅、 および蛍光標識を行 う。 この時に用いるサンプルとしては、人体の一部であれば特に制限はないが、 主にガン化した組織などから採取した組織切片や、 マイクロダイセクション法 などによって得られた細胞片、 あるいは培養細胞などが用いられる。 実施例と して、 正常な人の口腔内から採取した扁平上皮細胞を用いた。 lMNaCl を溶解 した食塩水で数回うがいをしたあと、 PBS によってもう一度よくうがいをした ものを細胞片の浮遊液とした。 この細胞浮遊液を 2000 rpm x 10 minの遠心に よって沈殿させ、 0.2 /i g/mLの Protease K(Wako)と、 0.1%SDS (ドデシル硫酸 ナトリゥム)に調整した PBSからなる細胞溶解液に懸濁する。サンプルの入った 細胞溶解液を 3 7度で 3 0分反応させたあと、 9 5でで 3 0分熱処理を行ない、 ProteaseKの活性を失活させる。 反応後のサンプルを 1.5mLのエツペンドルフ のチューブに移し、 12.000 X 2 minの遠心分離を行なって、 溶解しなかった細 胞片を沈殿させる。 この遠心上清を核酸の抽出液として用いた。 得られた核酸 抽出液を PCRマスタ一ミックスに懸濁し、 5 0サイクルの PCR反応を行なつ た。 マスタ一ミックスは宝酒造の PCH Core kit 1と、 配列番号 2 2 - 2 3、 及び 配列番号 2 4 - 2 5に示されたプライマーペアを用いて、 キットの説明書に従つ て作成する。 PCRの終了後に 3%NuSieve(FMC)で作成したァガロース電気泳動 を行なって、 増幅産物を確認した。 さらに核酸の蛍光標識を増強するために、 得られた増幅サンプルを再度 AsymetrixPCR法で処理した。 Asymetrix PCR法 は、 第一の PCR法からセンス鎖のプライマを削除した組成、 温度サイクルから 構成されている。 Asymetrix PCRを行なったサンプルに 10%の 3M酢酸アンモ 二ゥムを加え、 さらに 70%濃度となるようにエタノール（Wako) を加えた。 -20 度で一昼夜静置し、 12.000 rpm x 2minの遠心によって： PCR産物を沈殿させた。 沈殿を 2回、 70%エタノールによって沈殿を洗浄したあと、 SpeedVac(Savant 社)によって乾燥させた。
2 ) マイクロアレイの作製： P53と K-Ras遺伝子の検出用チップに使用したプ 口一ブの塩基配列は、 GenBankなどのデータべ一スを参照とした。 合成したプ ローブ （配列番号 2 6 - 5 3 ) を、 図 6のレイアウトとなるようにピエゾ素子を 利用した微量分注システムを利用して分注した。 図 6においては、 スポット A 1 -A 3にはそれぞれ配列番号 2 6 - 2 8のプロ一ブを、スポット A 4には配列番 号 2 9のネガティブプローブに蛍光標識したもの （スポット位置参照用） を、 スポット B 1 - B 4にはそれぞれ配列番号 3 0 - 3 3のプローブを、スポット C 1 ■C 3にはそれぞれ配列番号 3 4 - 3 6のプローブを配置し、スポット C 4にはプ 口一ブを配置せず、スポット D 1 -D 4にはそれぞれ配列番号 3 7 - 4 0のプロ一 ブを、 スポット E 1 - E 4にはそれぞれ配列番号 4 1 - 4 4のプローブを、 スポッ ト F 1 - F 4にはそれぞれ配列番号 4 5 - 4 8のプローブを、 スポット G 1 - G 3 にはそれぞれ配列番号 4 9 - 5 1のプローブを配置し、 スポット G 4にはプロ一 ブを配置せず、 スポット H I及び H 4には共に配列番号 2 9のプローブを、 そ してスポット H 2及び H 3にはそれぞれ配列番号 5 2及び 5 3のプローブを配 置した。 Aから Dの列においては、 マ一力用のスポットを除き、 K- r a s用の プローブを ·、 Eから Hの列においては、 マーカ用のスポットを除き、 P 5 3用 のプロ一ブが配置されている。
3 )ハイブリダィゼーシヨン：乾燥させたエタノール沈殿に 50 1の純水を加え てよく溶解し、 蛍光標識サンプルとした。 ハイブリダィゼーシヨンのサンプル 溶液として、 3x SSPE (リン酸ナトリウム緩衝液、 技術資料： D N Aマイクロ ァレイと最新 PCR法、細胞工学別冊ゲノムサイエンスシリーズ 1秀潤社参照)、
1 0 %(V/V)ExpressHyb(Clontech社)に 10%溶液となるように懸濁した。 ハイ プリダイゼーションの分析は、オリンパス光学社製の BX-51TFRに、冷却 CCD カメラを接続した実験システムによって行なった。 この実験システムは、 反応 フィルターの周りの溶液駆動と温度制御、 および蛍光スポットの画像を自動的 に行なうことが出来るように設計されている。
解析結果： ヒト正常人から得られたサンプルを用いて得られた実験結果の一 部を示す。 実験装置によって得られた D N Aチップの蛍光スポッ卜の時間変化 が図 7において示されている。 図 7の下側から、 反応後 1分、 1 0分、 2 0分、 3 0分、 4 0分の蛍光画像であり、 最初に室温であった反応チャンバ一が、 最 終的には 72度となるように設定してある。 図からも明らかなように、 反応後す ぐにほとんどのスポットの蛍光輝度が上昇し、 さらに温度を上げるに従って、 図の上部に位置する部分にスポッ卜した P53の 1スポットのみが検出可能なレ ベルの蛍光を示すようになった。 （3 0分後） この状態では固相化されたプロ一 ブに对する K-Ras遺伝子の Tmの値が高いために、ほとんどの K_Rasの蛍光ス ボット輝度の強弱は明瞭ではない。 そこでさらに反応チャンバ一の温度を上げ ることにより、 K-Ras遺伝子のスポット輝度の濃淡が明瞭に測定することが出 来るようになった （4 0分後)。 一連の画像を温度条件などの情報と共にハード ディスクに保存した。
4 ) 解析：得られた画像を変異検出専用にプログラムした解析ソフトウェアを 利用して解析した。 解析ソフトウェアは、 使用したマイクロアレイにスポット したプロ一ブの塩基配列と、 実験の結果得られた画像情報を元にしてサンプル の塩基配列を自動的に決定することが出来る。 3 ) の結果得られた画像を解析 したところ、 サンプルの P53eXon7 の塩基配列は、 配列番号 5 4に示される通 りであることが判明した。 また、 K-RasCodonl2 を含む塩基配列は、 配列番号 5 5に示さる通りであることが分かった。 これからサンプルの塩基配列は P53,K-Ras共に正常であることが分かった。 このようにして、 一つの反応ァレ ィによって二つの遺伝子の配列を迅速に解析することが可能であることが示さ れた。
(実施例 5 )
次に本発明の方法を遺伝子の発現解析に応用した場合について例示する。 正 常組織及び、 病変組織のそれぞれより抽出した mRNAに対して、 逆転写反応に より蛍光標識を取り込み、 一本鎖 cD NAを合成した。 このサンプルをカイネテ イクなデ一夕取得が可能な図 1に示される装置にマイクロアレイをセットし、 それぞれの組織から発現した cD N Aに対してハイプリダイズ反応を行つた。画 像データの取得には CCDカメラを利用した。 CCDカメラには被写体の明るさ に対して適切な露光時間を設定する必要があるが、 サンプルの蛍光標識の程度 や、 蛍光物質の自体の量子効率、 ハイブリダィズの反応効率等により、 得られ る遺伝子のハイブリダイズ像に明るさの差が生じることがある。 検出を精度よ く行うためにはスポットの発光像を、 CCDのダイナミックレンジの中の適当な 範囲内に収める必要がある。 これが適当でないと暗い画像や、 撮像レンジをォ 一バーした画像となり、 精度の良い検出を行うことができない。 このような未 確定の撮像条件をあらかじめ設定することなく力イネテツイクにてデータを取 得しながら、 その画像を確認し、 最適な撮像条件を設定しながら反応を進行さ せた。 得られたハイブリダィズ画像はその最大輝度が、 CCDのダイナミックレ ンジの 8割程度となるように調整し、 得られた画像を解析することで精度よく ハイブリダイズ画像の検出を行うことが可能となつた。
(実施例 6 )
本発明の系を実証するために、 配列の長さを変化させて Tm値を異ならせた 複数種類のプローブを用いて、 K-ras ガン遺伝子のコドン 1 2における変異の 有無の決定を行う方法の概略を以下に示す。
マイクロアレイ上に、 K-rasコドン 1 2の配列に突然変異を導入した 7種類の 2 0量体の K-rasガン遺伝子プローブのセンス鎖 （配列番号 5 6 - 6 2と、 アン チセンス鎖（配列番号 6 3 - 6 9 )、及びこれらのプローブの両端から 1又は 2塩 基を削除した、 同じく 7種類の 1 7量体の K-rasガン遺伝子プローブのセンス 鎖 （配列番号 7 0 - 7 6 )、 及びアンチセンス鎖 （配列番号 7 7 - 8 3 ) を図 1 3 に示される配置でスポットした。 2 0量体のプロ一ブ群の Tm値は、 5 6乃至 5 8 °Cであり、一方、 1 7量体の プローブ群の Tm値は、 4 7乃至 4 9 °Cであり、 2 0量体のものに比べて低い。 このマイクロアレイの各プローブと、 標的核酸である、 蛍光標識済 K-rasガン 遺伝子 （K-rasコドン 1 2を増幅するプライマ一を利用して PCRによって増幅 しておいたもの） との間で、 ハイブリダィゼーシヨンさせ、 ハイブリッドから 発せられる蛍光の強度をオリンパス光学社製 BX- 5 2 TRFに冷却 CCDカメラ を接続した実験システムで測定した。
上記に概略が示された実験は、 1 ) 蛍光標識試料の調製 2 ) マイクロアレイ の作製 3 ) 試料のマイクロアレイに対するハイブリダィゼーシヨン 4 ) データ の解析の主として 4つのステップから構成されるものであるが、 以下には、 各 ステツプの詳細を説明する。
1 ) 識試料の調製について 対象となる遺伝子セットの増幅と、 蛍光標識を 行う。 対象遺伝子の採取源としては、 例えば人体の一部などを挙げることがで きるが、 より具体的にはがん化した組織などから採取した組織切片や、 マイク ロダイセクション法等によって得られた細胞片ゃ、 培養細胞などが挙げられる。 本実施例においては、ヒト K-rasガン遺伝子テンプレ一トセット（宝酒造社製、 Cat# 7 2 4 2 ) を使用した。 7種類のテンプレートに対して、 同じく K-rasガ ン遺伝子のコドン 1 2の部分を増幅できる PCRキット （宝酒造社製、 Cat# 7 1 1 2 ) を用いて遺伝子増幅した。 増幅時には、 5 ' 末端に FITC の蛍光標識 が入れられたプライマ一を使用した。 PCR終了後、 3 %NuSieve (FMC) で作 製したァガロース電気泳動を行い、 増幅産物を確認した。
2 ) マイクロアレイの作製 K-rasガン遺伝子の塩基配列は、 GenBank等の データべ—スを参照し、 配列番号 5 6 - 6 2、 6 3 - 6 9、 7 0 - 7 6、 7 7 - 8 3 のプローブをマイクロアレイに固相化した。 合成したプローブをマイクロアレ ィに対し、 図 1 3のレイアウトとなるようにピエゾ素子を利用した微量分注シ ステムを利用してスポットした。 図 1 3のスポット 1においては、 配列番号 5 6の K-ras天然配列 （Wt) に対応する 2 0量体のセンス鎖プローブが配置され ている。 スポット 2においては、配列番号 5 7の K-rasArg変異体に対応する 2 0量体のセンス鎖プローブが配置され、 スポット 3においては、 配列番号 5 8 の K-rasCys 変異体に対応する 2 0量体のセンス鎖のプローブが配置されてい る。 また、 スポット 8においては、 配列番号 6 3の K-rasW tに対応する 2 0量 体のアンチセンス鎖プローブが配置され、 スポット 1 5においては、 配列番号 7 0の K-rasWtに対応する 1 7量体のセンス鎖プローブが配置されている。 ま た、 スポット 2 2においては、 配列番号 7 7の K-rasWtに対応する 1 7量体の アンチセンス鎖プロ一ブが配置されている。
3 ) ハイプリダイゼーシヨン PCR後の試料 4 0 1に、 ハイプリダイゼー シヨン用溶液として、 1 0 ^ 1の 1 . 2 5 '. SSPE (リン酸ナトリウム緩衝液、 参考資料： DNAマイクロアレイと最新 PCR法、 細胞工学別冊ゲノムサイェン スシリ一ズ 1、秀潤社) を添加して、ハイプリダイゼーション試料を作成した。 ハイプリダイゼーションの分析は、 オリンパス光学社製の BX- 5 2 T R Fに冷 却 CCDカメラを接続した実験システムによって行った。 この実験システムは、 反応フィルタの周りの溶液駆動と、 温度制御、 及び蛍光スポットの画像の記録 を自動的に行うことが出来るように設計されている。 直径 6 mmのマイクロア レイが設置された専用チャンバ一の反応部分に、 5 0 1の反応溶液を加え、 溶液駆動と温度変化を与えて、 蛍光画像を撮像した。
テンプレート由来の蛍光標識試料を用いて得られた実験結果を以下に示す。 対照試料としては、 正常な K-i'asガン遺伝子配列を持つ PCR産物を使用した。 ハイブリダィゼ一ション時に、 温度変化を与えて場合に得られたマイクロアレ ィの蛍光スポットの時間変化を図 1 4から 1 6において示した。 この実験シス テムは、溶液駆動を伴い、且つ溶液の温度変化を与えるようにプログラムした。 温度に関しては、 最初に室温 （2 5 °C) であった反応チャンバ一が 5 5 °Cにな り、 更に最終的には 7 2 °Cとなるように設定してある。 図からも明らかなよう に、 反応後すぐにほとんどのスポットの蛍光強度が上昇した。 この温度環境で は、 固相化された 1 7量体群、 及び 2 0量体群ともに、 7種類の異なる塩基配 列を持つプローブの中で、 試料に対して完全に配列の一致したプローブ以外の スポットでも強い蛍光強度が見える （図 1 4 )。 更に反応チャンバ一の温度を 5 5度に上げることにより、 1 7量体群のプロ一ブにおいて、 次第にミスマッチ のスポット （スポット 1 6 - 2 1、 及び 2 3 - 2 8 ) の蛍光強度は減少し、 実際に 標的核酸に対して完全マッチである Gly (コドン 1 2の配列 GGT) の蛍光スポ ット （1 5及び 2 2 ) のみが観察されるようになる （図 1 5 )。 しかし、 2 0量 体群の各プローブはまだ、 プローブの持つ Tm値以下であり、 シグナルの強さと 完全マッチは一致していない。 更に温度を 7 2 °Cに上げることにより、 2 0量 体群でもミスマッチ個所のスポットの蛍光強度が減少し、完全マッチである Gly (コドン 12の配列 GGT) の蛍光スポット （スポット 1と 8 ) のみが観察され るようになる （図 1 6 )。 この一連の画像を温度条件などの情報とともにハード ディスクに保存した。
4 ) データの解析 得られた画像を変異検出用にプログラムした解析ソフト ウェアを利用して解析した。 実験の結果得られた蛍光画像情報を元にして、 標 的核酸とプローブとの間の Tm値とァフィ二ティの程度を決定することができ る。 この結果、 3 ) の実験から、 試料の K-ras コドン 1 2部分のプローブと標 的核酸とのハイブリダィゼ一シヨンの程度が、 環境要因によって変化し、 ある 温度条件下では、 ミスマッチプローブのほうが完全にマッチしたプローブより も高いァフィ二ティを持つことがわかったまたプローブと試料との間のァフィ 二ティは、 ミスマツチの塩基配列によって異なることが画像からも直感的に理 解することもできる。 このようにして一つの反応アレイによって試料と複数の プローブとの間のリアルタイムなァフィ二ティ解析とハイブリダィゼーシヨン のモニタリングが行えることが示された。 この実験システムを使用して実際の Tm値を求めることが出来るとともに、 DNAの二重らせんの安定性についての 新しい知見が得られることが期待された。 実際にさまざまな突然変異を有する プローブへの親和性を解析したり、 プロモ一夕部分の転写効率を測定すること によって、 より正確なハイブリダィゼーションの機構の解析に利用することが できる。
産業上の利用性
本発明の方法及び装置を用いれば、核酸についてのより多くの、より正確な、 より信頼性のある情報を得ることが可能になる。 更に、 複数の異なる配列を同 一系内において、 制度良く尚且つ高速に検出することが可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 標的核酸と、 当該標的核酸配列の少なくとも一部に対して相補的な配列 を有するプローブとを接触させ、 当該標的核酸と当該プローブとの間にハイブ リッドを形成させ、 当該ハイプリッドの量に依存した量で発せられるシグナル を測定することにより、 当該標的核酸の情報を検出する方法において、
当該シグナルのデータ取得を力イネティックに行うことを含む、 核酸情報の 検出方法。
2 . 前記のシグナルのデータ取得が、 反応の測定条件または検出条件を変更 しながら行われる、 請求項 1に記載の方法。
3 . 前記のシグナルのデータ取得が、反応温度、又は反応溶液の組成、容量、 若しくは種類のうちの少なくとも 1つを変更しながら行われる、 請求項 2に記 載の方法。
4. 前記の変更が、反応温度についての変更である、請求項 3に記載の方法。
5 . 標的核酸の配列の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプ ローブ、 及び当該完全マッチプローブの少なくとも一部が変異した 1以上の種 類の不完全マッチプローブを、 当該標的核酸と接触させ、 当該標的核酸と当該 完全マッチプローブ又は当該不完全マッチプローブとの間にハイプリッドを形 成させ、 当該ハイプリッドの結合強度の違いに基づいて当該標的核酸の核酸情 報を検出する方法において、
当該ハイプリッドが発するシグナルを測定または検出する条件を連続的また は段階的に変更しながら、 当該シグナルのデータ取得を力イネティックに行う ことを含む、 核酸の核酸情報を検出する方法。
6 . 前記のシグナルのデータ取得が、反応温度、又は反応溶液の組成、容量、 若しくは種類のうちの少なくとも 1つを変更しながら行われる、 請求項 5に記 載の方法。
7 . 前記の変更が、反応温度についての変更である、請求項 6に記載の方法。
8 . 前記の反応温度についての変更が、 検出するハイブリッドの Tm値未満 の温度から、 Tm値を越える温度間の温度上昇である、請求項 7に記載の方法。
9 . 前記の反応温度についての変更が、 検出するハイブリッドの Tm値未満 の温度から、 Tm値を越える温度間の温度上昇及び温度下降からなる 1回また は複数回の温度サイクルである、 請求項 7に記載の方法。
1 0 . 前記の温度上昇の間にシグナル強度の極大値を測定することを含む、 請求項 8又は 9に記載の方法。
1 1 . 前記の温度上昇の間にシグナル強度の変化量を測定することを含む、 請求項 8又は 9に記載の方法。
1 2 . 前記のハイプリッドが発するシグナルを測定する温度を連続的又は段 階的に上昇させ、 当該ハイブリツドから発せられるシグナル強度の変化量を測 定し、 その変化量が負に転じた時にその温度を維持することを含む、 請求項 5 乃至 1 1の何れか一項に記載の方法。
1 3 . 同一の反応条件を適用することが可能な同一の系内において、 複数種 類のプローブを使用し、 複数種類の核酸についての情報を同時に検出すること を特徴とする請求項 1乃至 1 2の何れか一項に記載の方法。
1 4 . 前記プローブが複数種類の配列を有する複数種類のプローブであって、 当該プローブ同士が、 互いに重なり合う配列を有することを特徴とする、 請求 項 1乃至 1 3のいずれか一項に記載の方法。
1 5 . 前記の複数種類の配列を有するプローブが、 標的核酸の配列の少なく とも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ、 及び当該完全マッチプ ローブの少なくとも一部が変異した 1種類以上の不完全マッチプローブと、 当 該完全マツチプロ一ブ及び当該不完全マツチプロ一ブの両端あるいは片端にお いて塩基配列を伸縮するか、 または短縮したオーバーラッビングプローブとか らなることを特長とする、 請求項 1乃至 1 4のいずれか一項に記載の方法。
1 6 . オーバーラッピングプローブのうち、 より低い Tm値を有するプロ一 ブ群で解析した結果と、 より高い Tm値を有するプローブ群で解析した結果を 比較することによつて判定することを含む請求項 1乃至 1 5のいずれか一項目 に記載の方法。
1 7 . 前記の配列のプロ一ブが K— s codonl2を解析することを目的とし た 20merの塩基配列を持つことを特徴とする配列番号 5 6番から 6 9番までの プローブを有することを特徴とする請求項 1乃至 1 6のいずれか一項目に記載 の方法。
1 8 . 前記の配列のプローブが K— ras codonl2を解析することを目的とし た 17merの塩基配列を持つことを特徴とする配列番号 7 0番から 8 3番までの プローブを有することを特徴とする請求項 1乃至 1 7のいずれか一項目に記載 の方法。
1 9 . 前記の配列のプロ一ブが K一 ras codonl2を解析することを目的とし た 17merの塩基配列を持つことを特徴とする配列番号 5 6番から 8 3番までの プローブと K— ras codonl2を解析することを目的とした 20merの塩基配列を 持つことを特徴とする配列番号 7 0番から 8 3番までのプロ一ブを有すること を特徴とする請求項 1乃至 1 8のいずれか一項目に記載の方法。
2 0 . 前記のハイブリッド形成が、 標的核酸を含む液体試料を、 多孔質体に 固定されたプローブに接触させることにより行われる、 請求項 1乃至 1 9の何 れか一項に記載の方法。
2 1 . 前記の液体試料を、 前記の多孔質体内を 1回又は複数回往復させるェ 程を行うことを含む、 請求項 2 0に記載の方法。
2 2 . 前記のシグナルの検出を、 蛍光標識の検出に基づいて行う、 請求項 1 乃至 2 1の何れか一項に記載の方法。
2 3 . 標的核酸が、 癌遺伝子、 細胞内薬剤耐性遺伝子、 細胞周期制御遺伝 子、 若しくはアポ卜一シス関連遺伝子の何れか、 又はこれらの組合せである、 請求項 1乃至 2 2の何れか一項に記載の方法。
2 4. 標的核酸を含む試料を入れるための試料貯蔵容器、 核酸を固定できる 多孔質構造体を含み且つ当該容器と接続された核酸反応担体、 当該試料が当該 容器と当該核酸反応担体との間で、 制御されながら漏れなく流動するための駆 動手段、 当該反応担体上での反応温度を制御するための温度制御手段、 及び当 該多孔質構造体において形成される標的核酸とプローブとの間のハイプリッド から発せられるシグナルを検出するための手段を含む核酸情報解析装置。
2 5 . 前記の核酸反応担体へと接続され且つ標的核酸を含む試料とは異なる 種類の溶液を貯蔵するための 1以上の溶液貯蔵容器、 及び適宜当該溶液貯蔵容 器に含まれる各種の溶液を混合して前記核酸反応担体へと送る手段を更に含む、 請求項 2 4に記載の核酸情報解析装置。
2 6 . 標的核酸が、癌遺伝子、細胞内薬剤耐性遺伝子、細胞周期制御遺伝子、 若しくはアポ! ^一シス関連遺伝子の何れか、 又はこれらの組合せである、 請求 項 2 4又は 2 5に記載の核酸情報解析装置。
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