WO2003046161A2 - Verfahren zur ex vivo-expansion und -differenzierung von multipotenten stammzellen - Google Patents

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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the invention relates to a method for expanding multipotent stem cells ex vivo.
  • the invention further relates to a two-stage process for the expansion and differentiation of multipotent stem cells ex vivo, in which the stem cells can be gene transfected at the first stage, ie during the expansion phase.
  • the multipotent stem cells are differentiated into cells from the hematopoietic, endothelial or mesenchymal cell series.
  • Stem and progenitor cells obtained in this way, as well as mature cells from the hematopoietic, endothelial and mesenchymal cell series can be used, among other things, for the prophylaxis, diagnosis and therapy of human diseases, and for tissue engineering.
  • vasculogenesis involves the in situ differentiation of hemangioblasts into endothelial cells and their subsequent organization into a primary capillary plexus.
  • vasculogenesis involves the in situ differentiation of hemangioblasts into endothelial cells and their subsequent organization into a primary capillary plexus.
  • angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting existing blood vessels.
  • Hemangioblast as a common stem cell for hematopoietic cells and endothelial cells has recently been identified as a transient cell stage that is only detectable for a short time during early embryonic development. Thereafter, the hemangioblast appears to differentiate without renewing itself (Choi et al., Development 125, 725-732, 1998). However, it must be pointed out that these results are based on animal studies and are not necessarily transferable to the human system.
  • Kalka et al. Circul. Res. 86, 1198-1202, 2000; Kalka et al., Ann. Thorac. Surg. 70, 829-834, 2000; Bhattacharya et al., Blood 95, 581-585, 2000; Crosby et al. , Circul. Res.
  • EPC endothelial progenitor cells
  • Endothelial progenitor cells show only a slight growth tendency in conventional cell culture media. Cell numbers, as would be required for many clinical applications, cannot be achieved in this way. Culture conditions that allow ex vivo expansion of endothelial progenitor cells and endothelial cells have not yet been developed. Even with the culture conditions selected in the study cited above (Gehling et al., Loc. Cit.), No proliferation of the endothelial progenitor cells in the sense of an expansion could be induced. It was only possible to multiply these progenitor cells by a maximum of 8 times. In order to gain the number of cells of endothelial progenitor cells necessary for clinical use, however, an expansion of 100 times must be aimed for.
  • EPC endothelial progenitor cells
  • EC endothelial cells
  • diagnosis, prophylaxis and therapy of cardiovascular and malignant (such as neoplastic) diseases, as well as tissue engineering are to be mentioned.
  • An example in the field of cardiology is the direct introduction of EPC into poorly perfused areas of the heart to induce the formation of new blood vessels. This procedure can be applied to circulatory disorders in other organs and parts of the body.
  • tissue engineering the EPC can be used to produce new blood vessels for clinical purposes in vitro.
  • the EPC can also be used to: To enable vascular supply of skin grafts and artificially produced (tissue engineered) organs, such as the liver and pancreas. Another area of application is the use of gene-transfected EPC as a vehicle for certain gene products. These genetically modified EPCs can be introduced into the vessels of diseased organs and tumors for both diagnostic and therapeutic purposes.
  • a patient's stem cell reserve may not be sufficient to obtain the amount of progenitor cells required for transplantation from the bone marrow or peripheral blood.
  • numerous working groups have been involved in the development of Culture conditions that allow ex vivo expansion of hematopoietic progenitor cells (Berenson et al., Blood 77, 1717-1722, 1991; Brandt et al., Blood 79, 634-641, 1992; Haylock et al., Blood 80, 1405 - 1412, 1992; Brugger et al., Blood 81, 2579-2584, 1993; Sato et al., Blood 82, 3600-3609, 1993; Rice et al., Exp. Hematol.
  • Another object of the present invention is therefore to develop a method, the culture conditions enable ex vivo expansion of transplantable hematopoietic stem cells.
  • Bone marrow cells can be cultured in the presence of EGF and PDGF-BB.
  • a disadvantage of this method is - as was already the case with the Quirici et al. (see above) for the methods described for the endothelial cell series - in that the mononuclear bone marrow cells used only make up a proportion of 0.1 to 0.5% of the bone marrow cells. Additional purification and enrichment levels are associated with this.
  • the CD45 " / GlyA " cells only have a very low proliferation rate. The line doubling rate is 46-60 hours.
  • the present invention is a first invention.
  • the object of the present invention is to avoid the disadvantages known from the prior art and to provide an expansion method which can be used to achieve significantly higher cell numbers during expansion than has been the case in the prior art.
  • a method is to be made available with which progenitor cells and mature cells can be differentiated Allow cell lines (hematopoietic, endothelial and mesenchymal cell lines) to grow equally at different levels of differentiation.
  • the method should be able to be carried out without great technical or time expenditure and should preferably start from multipotent stem cells which are accessible by simple blood sampling.
  • the object is achieved according to the invention by methods for expanding multipotent stem cells, in which multipotent stem cells are cultivated in the presence of Flt3 ligand and at least one growth factor from the group consisting of SCF, SCGF, VEGF, bFGF, insulin, NGF and TGF-ß.
  • Flt3 ligand at least one growth factor from the group consisting of SCF, SCGF, VEGF, bFGF, insulin, NGF and TGF-ß.
  • additional IGF-1 and / or EGF can be used.
  • one of the following combinations is selected:
  • Flt3 ligand and VEGF a) Flt3 ligand and VEGF, b) Flt3 ligand, SCGF and VEGF, c) Flt3 ligand and EGF, d) Flt3 ligand, EGF and bFGF, e) the growth factors mentioned under a) to d) in combination with IGF-1 and / or EGF.
  • the number of cells used can be increased by more than a hundredfold, for example starting from only 50 ml of leukapheresis product after 14 days of culture, 1 x 10 9 to 1 x 10 10 multipotent stem cells are obtained.
  • the expansion can thus be carried out to a significantly greater extent than in the prior art.
  • sources of stem cells, such as blood are readily available.
  • Flt3 ligand which is a hamatopoetic growth factor, in combination with the growth factors mentioned, does not lead to premature differentiation of the stem cells, not even in the direction of the hamatopoetic cell series.
  • the multipotent stem cells can be matured after expansion in a subsequent differentiation phase.
  • the separation of expansion and differentiation according to the invention advantageously enables the still multipotent stem cells to be genetically modified. That is, it is possible to transfect the stem cells while they are proliferating strongly with vectors which preferably contain nucleic acid sequences coding for proteins or polypeptides which are not naturally expressed in these cells.
  • the differentiation of the expanded multipotent stem cells can, according to the invention, rather take place in the subsequent second step, with which a differentiation into one of the three cell rows (endothelial, hematopoietic and mesenchymal) can be carried out in a targeted manner.
  • the invention thus also relates to a two-phase process (two-phase culture system) in which multipotent stem cells are expanded and developed to produce human progenitor cells and mature cells of the hamatopoietic, endothelial and mesenchymal cell series.
  • the previously mentioned expansion process according to the invention corresponds to phase I of the two-phase process.
  • phase I for simplification, whereby the explanations apply equally to the expansion process (ie without a subsequent differentiation phase).
  • the invention thus further relates to a method for in vitro (ex vivo) expansion and differentiation of multipotent stem cells, in which one
  • Flt3 ligand i.e. in the presence of Flt3 ligand and at least one growth factor from the group consisting of SCF, SCGF, VEGF, bFGF, insulin, NGF and TGF-ß (in each case optionally in combination with IGF-1 and / or EGF) and one
  • ECGS AP-1, AP-2, NGF, CEACAM, pleiotrophin, angiogenin, P1GF, and HGF cultivated, optionally in combination with at least one growth factor from the group consisting of LIF, EGF, IGF-1, PDGF, PDECGF, TGF ⁇ , TGFß, TNF ⁇ , Estrogen, proliferin, IL-3, G-CSF, GM-CSF, EPO
  • cultivated for (induction of) hepatocytic differentiation in the presence of HGF optionally in combination with at least one growth factor from the group consisting of EGF, IGF-1, insulin, HCG, KGF, TNF, Flt3 ligand, SCF and SCGF.
  • Flt3 ligand in the following combinations is preferred:
  • Flt3 ligand and VEGF a) Flt3 ligand and VEGF, b) Flt3 ligand, SCGF and VEGF, c) Flt3 ligand and EGF, d) Flt3 ligand, EGF and bFGF, e) the growth factors mentioned under a) to d) in combination with IGF-1 and / or EGF.
  • the method can also be used in a particularly simple manner for gene transfection of the stem cells without the cell expansion being impeded.
  • the gene-transfected stem cells can differentiate into the hematopoietic, endothelial and mesenchymal cell series analogously to the genetically unmodified stem cells.
  • a nucleic acid sequence (hereinafter referred to as "foreign gene") coding for a protein or polypeptide that is not naturally expressed in the cells is introduced.
  • the multipotent stem cells can be obtained from mobilized or unmobilized autologous peripheral blood or bone marrow of the patient or from umbilical cord blood.
  • Mobilization therapy can consist of a subcutaneous or intravenous injection of growth factors such as G-CSF, GM-CSF or SCF and / or an intravenous or oral application of cytostatics.
  • the extraction of the multipotent stem cells from G-CSF mobilized peripheral blood represents a special embodiment of the invention.
  • the multipotent stem cells can be obtained in the mononuclear cell fraction.
  • the multipotent stem cells can be isolated by using antibodies which recognize special antigens on multipotent stem cells.
  • the following antibodies can be used: Anti-CD7 MoAb, Anti-CD31 MoAb (PECAM-1), Anti-CD34
  • CD114 G-CSF-R
  • anti-CD116 GM-CSF-R
  • EGF-R MoAb Anti-FGF-R MoAb, Anti-P1H12 MoAb, Anti-KDR MoAb,
  • Anti-EN4 MoAb Anti-BENE MoAb.
  • lectins such as Ulex europaeus agglutinin-1 can also be used for the selection of the multipotent stem cells.
  • the multipotent stem cells can be obtained by depletion.
  • the MoAb CD45 can be used for this.
  • the multipotent stem cells can basically be obtained in the following cell populations: AC133 + CD34 + , AC133 + CD34 " , AC133 " CD34 " Selection of the total population of AC133-positive stem and progenitor cells.
  • the multipotent stem cells After the multipotent stem cells have been obtained, these cells are expanded ex vivo in suspension cultures.
  • IMDM, MEM, DMEM, X-VivolO, RPMI, M-199 medium, EGM-2 can be used as the basal medium.
  • the basal medium can be supplemented with fetal calf serum, horse serum or human serum.
  • the multipotent stem cells can be expanded serum-free.
  • the above-mentioned (preferably recombinant) human growth factors can be used for the expansion phase.
  • the medium can also be supplemented with hydrocortisone.
  • the genetic material that is transferred to the multipotent stem cells expanded ex vivo can be genes that code for a large number of proteins. These genes include those that code for fluorescent proteins such as GFP. Furthermore, these genes also include those which code for various hormones, growth factors, enzymes, cytokines, receptors and anti-tumor substances. The genes can also code for a product that regulates the expression of another gene product, or genes that one or block several steps of a biological reaction sequence. In addition, the genes can code for a toxin which is associated with a polypeptide, e.g. B. a receptor ligand, fused, or with an antibody that binds the toxin to the target cell. Accordingly, the gene can code for a therapeutic protein which fuses with a "targeting" polypeptide, in order in this way to transmit a therapeutic effect to a diseased organ or tissue.
  • a polypeptide e.g. B. a receptor ligand
  • the nucleic acids are introduced into the multipotent stem cells that have been expanded ex vivo, which ensures their uptake and expression in the stem cells.
  • These methods can include vectors, liposomes, naked DNA, electroporation, etc. include.
  • the multipotent stem cells can be differentiated into the hematopoietic, endothelial or mesenchymal cell line directly after isolation or after prior ex vivo expansion, genetically native or modified.
  • the following media can be used as the basal medium: IMDM, MEM, RPMI, M-199, X-VivolO, EGM-2, Williams Medium E, SATO Medium, DMEM or DMEM-F12.
  • the basal medium can be supplemented with fetal calf serum, horse serum or human serum. Alternatively, serum-free culture conditions can be used.
  • the following (preferably recombinant) human growth factors are added: G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, TPO and / or EPO.
  • one or more of the following (preferably recombinant) human growth factors can be used: IL-1, SCF and SCGF.
  • SCF, IL-3, IL-6, G-CSF and TPO in combination with EPO represents a particularly preferred embodiment of the invention.
  • the induction of the differentiation of the multipotent stem cells into the endothelial cell row is achieved by using the following (preferably recombinant) human growth factors: VEGF, bFGF and / or ECGS.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • bFGF vascular endothelial progenitor cells
  • ECGS endothelial progenitor cells
  • one or more of the following (preferably recombinant) human growth factors can be used: AP-1, AP-2, LIF, EGF, IGF-1, NGF, CEACAM, HGF, SCF and SCGF.
  • SCF SCF
  • VEGF, bFGF, IGF-1, EGF, LIF plus AP-1 represents a preferred embodiment according to the invention.
  • PDGF-BB To induce mesenchymal differentiation, the following (preferably recombinant) human growth factors are added: PDGF-BB, TGF-ß and / or BMP-4.
  • one or more of the following (preferably recombinant) human growth factors can be used: EGF, aFGF, bFGF, IGF-1, SCF and SCGF.
  • EGF, PDGF-BB, IGF-1 and bFGF in combination with BMP-4 represents a particularly preferred embodiment of the invention.
  • the induction of the differentiation of the multipotent stem cells into the neuronal cell row is achieved by using the following (preferably recombinant) human growth factors: NGF, CNTF, GDNF and / or BDNF.
  • NGF preferably recombinant human growth factors
  • BDNF preferably recombinant human growth factors
  • IGF-1 IL-Ib
  • 11-6 11-11
  • LIF Flt3 ligand
  • SCF and BMP-4.
  • BDNF, GDNF, EGF plus bFGF represents a preferred embodiment according to the invention.
  • HGF human growth factor
  • human growth factors can be used: EGF, IGF-1, insulin, HCG, KGF, TNF-, Flt3
  • the differentiation phase which lasts about 10 to 14 days, at regular intervals.
  • functional testing of the cells in the culture is useful, for example in the form of a colony assay.
  • the EPCs lose e.g. with increasing differentiation the ability to form blood cell colonies.
  • cell samples in phase II it can be checked at regular intervals of, for example, 1 to 3 days whether and to what extent the ability of the cells to form colonies of the respectively undesired cell row changes.
  • the differentiation phase has reached the stage in which only progenitor cells of this cell row are present.
  • the cells can either be removed or isolated for further applications or differentiate into mature cells of the desired cell row.
  • the cells in phase II can be checked by immunocytochemistry in order to check the formation of certain surface structures on the cells during the differentiation phase.
  • the results of the functional assay can be advantageously compared with those of the immunocytochemical Adjust analyzes to find out which surface structures have to be formed when progenitor cells of the desired cell row are present, ie the cells are not yet mature but have already lost the ability to form the other cell rows.
  • progenitor cells isolated in the manner described above must either be used immediately in the desired manner, i.e. for being used in the planned application or being frozen.
  • a medium consisting of DMSO, IMDM and HSA preferably 40% IMDM + 50% HSA + 10% DMSO has proven to be advantageous for endothelial progenitor cells.
  • the present invention enables the use of ex vivo expanded multipotent stem cells as well as of hematopoietic, endothelial and mesenchymal progenitor cells and mature cells for the diagnosis, prophylaxis and therapy of cardiovascular and malignant diseases. Furthermore, the ex vivo expanded multipotent stem cells, endothelial progenitor cells and mature endothelial cells can be used for the coating of surfaces. The ex vivo expanded multipotent stem cells as well as the endothelial and mesenchymal progenitor cells and mature cells can also be used in tissue engineering of organs and tissues.
  • the ex vivo expanded multipotent stem cells can be used for allogeneic or autologous transplantation in patients who are being treated with myeloablative chemotherapy for a malignant disease in order to regenerate the hematopoiesis.
  • the patient is first given the growth factor G-CSF in order to mobilize the bone marrow stem cells into the peripheral blood. Instead of leukapheresis, patients can have their blood drawn normally.
  • the stem cells are then isolated from the peripheral blood and the amount of stem cells required for a transplant is generated by ex vivo expansion. The burden and risks associated with performing leukapheresis can thus be avoided for the patient.
  • the graft can consist exclusively of multipotent stem cells expanded ex vivo.
  • a graft consisting of expanded stem cells and endothelial progenitor cells can be used. The additional use of the endothelial progenitor cells can accelerate the reconstitution of the patient's bone marrow function.
  • phase I of the two-stage method is a phase in which the multipotent stem cells proliferate
  • a simultaneous gene transfection can advantageously also be carried out.
  • Appropriate methods for gene transfection using vectors, liposomes, naked DNA or electroporation is well known to the person skilled in the art (see “References”).
  • the ex vivo expanded stem cells and the endothelial progenitor cells can thus be genetically modified before the transplantation and used for diagnostic and therapeutic applications in malignant tumors and leukaemias.
  • the ex vivo expanded multipotent stem cells and endothelial progenitor cells can be genetically engineered to inhibit angiogenesis.
  • This can e.g. B. can be achieved by introducing a gene which codes for an angiogenic inhibitory substance.
  • the angiogenic inhibitory substances include, for example, endostatin or angiostatin, and antibodies or antisense nucleic acids against angiogenic cytokines, such as. B. VEGF.
  • Another possible application is gene therapy for congenital diseases, such as, for example, hemophilia A and B (cf. Mannuci PM, Tuddenham EG. N. Engl. J. Med. 344, 1773-1779, 2000; Emilien et al., Clin Lab. Haematol. 22, 313-322, 2000), Gaucher disease (cf. Barranger et al., Baillieres Clin. Haematol. 10, 765-768, 1997), glycogen storage diseases (types I - III) ( see Elpeleg ON. J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 12, 363 - 379, 1999), mucopolysaccharide storage diseases (type I - VII) (see.
  • the ex vivo expanded multipotent stem cells and / or the endothelial progenitor cells can be radioactively labeled with 18F-fluorodeoxyglucose ( 18 F-FDG) or with n- indium and administered intravenously to patients in order to represent metastases.
  • the administered cells are enriched in the tumor tissue (see de Bont et al., Cancer Research 61, 7654-7659, 2001), which means that the metastases can be diagnosed using routine diagnostic methods such as positron emission tomography (PET) for the detection of 18 F-FDG labeled cells) or simple scintigraphy (for the detection 1: L1 indium-labeled cells).
  • PET positron emission tomography
  • simple scintigraphy for the detection 1: L1 indium-labeled cells.
  • the radioactive labeling of ex vivo expanded multipotent stem cells and / or the endothelial progenitor cells with 18F-fluorodeoxyglucose ( 18 F-FDG) or with 1: L1 indium can also be used for the diagnosis of ischemic diseases.
  • 18 F-FDG 18F-fluorodeoxyglucose
  • 1: L1 indium 1: L1 indium
  • the marked cells migrate via circulation to ischemic areas of the orgasm in order to participate in the formation of new blood vessels (see overview by Masuda et al., Hum. Cell 13, 153-160, 2000). In this way, clinically asymptomatic reduced blood flow can also be recorded.
  • the marked cells are displayed analogously to the above-mentioned method using PET or scintigraphy.
  • the ex vivo expanded multipotent stem cells as well as the endothelial progenitor cells and mature endothelial cells can also be used for the therapy of diseases which involve a reduced vascular supply.
  • the ex vivo expanded multipotent stem cells, the endothelial progenitor cells or the mature endothelial cells can be introduced directly into an organ or vascular system in order to induce the formation of new blood vessels there.
  • the reduced vascular supply can be due to an ischemic disease or an autoimmune disease.
  • Affected tissues can include muscle, brain, kidneys, lungs.
  • the ischemic tissues can specifically be myocardial ischemia, ischemic cardiomypopathy, renal ischemia, pulmonary ischemia or ischemia of the extremities.
  • the ex vivo expanded stem cells and the endothelial progenitor cells can be genetically modified before being introduced into the diseased organ or vessel in order to increase therapeutic effect.
  • the stem cells and endothelial progenitor cells expanded ex vivo can be transfected with a gene encoding a vasodilator substance.
  • the ex vivo expanded stem cells as well as the endothelial progenitor cells and the mature endothelial cells can be used for the treatment of diseases and injuries of the coronary arteries.
  • the multipotent stem cells or the endothelial progenitor cells can be administered directly intracoronarily in order to accelerate reendothelialization of the injured coronary sections and thereby prevent restenosis.
  • This application can also be applied to the treatment of diseases and injuries to arteries of other locations, such as extremity vessels, by injecting the expanded stem cells, the endothelial progenitor cells or the mature endothelial cells directly into the affected vessel.
  • the endothelial progenitor cells and mature endothelial cells obtained by differentiation of the multipotent stem cells can be used for the coating of coronary stents which are implanted following angioplasty or rotablation, in order to prevent restenosis.
  • the endothelial progenitor cells or the mature endothelial cells can be applied either directly to the stent surface or to matrix-coated stents. Different stent surfaces can be used: ceramics, PTFE, gold, titanium, etc.
  • the matrix can consist, for example, of fibronectin, collagen, heparin, gelatin, fibrin, silicone, phosphorylcholine or Matrigel.
  • the matrix can additionally be coupled with antibodies that bind endothelial cell-specific or progenitor cell-specific surface antigens.
  • the following antibodies can be used: Anti-CD7 MoAb, Anti-CD31-MoAb, Anti-CD34 MoAb, Anti-CD54 (ICAM-1) MoAb, Anti-CD62e MoAb (E-Selectin), Anti-CD90 (Thy-1 ) MoAb, Anti-CD106 MoAb (VCAM-1), Anti-CD114 (G-CSF-R) MoAb, Anti-CD116 (GM-CSF-R) MoAb, Anti-CD117 (c-kit) MoAb, Anti-CDwl23 (IL-3R ⁇ Chain) MoAb, Anti-CD127 (IL-7R) MoAb, Anti-AC133 MoAb, Anti-CD135 (Flk3 / Flk2) MoAb, Anti-CD140b (PDGF-Rß) MoAb, Anti-CD144 (VE- Cadherin) MoAb, Anti-CD164 MoAb, Anti-CD172a MoAb
  • CD228 MoAb Anti-CD243 (MDR-1) MoAb, Anti-EGF-R MoAb, Anti-FGF-R MoAb, Anti-P1H12 MoAb, Anti-KDR MoAb, Anti-BENE MoAb and antibodies against lectins.
  • the endothelial progenitor cells can be used for the coating in a genetically unchanged or gene-transfected manner. Genes which code for a vasodilatory substance, such as, for example, NO synthase, or genes which code for an antithrombotic substance, such as, for example, antithrombin III, can be used for the transfection.
  • a further use of the endothelial progenitor cells and mature endothelial cells obtained in culture is the coating of biomechanical vascular valves of the heart in order to prevent thrombosis of implanted vascular valves.
  • the invention further relates to methods for coating implantable materials, in particular coronary stents and vascular valves, in which the two-stage expansion / differentiation method according to the invention is carried out and endothelial differentiation is carried out during phase II and / or at the end of phase II (Depending on whether a coating with EPCs and / or mature ECs is desired) the material to be implanted, which is preferably coated with fibronectin, is transferred into the culture medium in which the cells are differentiated.
  • the stem cells can be gene transfected in phase I, so that the coating is carried out with gene transfected EPCs and / or ECs.
  • Tissue engineering is a possible application for the ex vivo expanded multipotent stem cells as well as for the endothelial and mesenchymal progenitor cells.
  • the ex vivo expanded multipotent stem cells can be used to generate in vitro organ-specific tissue, such as
  • the stem cells are cultivated in special basal media.
  • the media SATO Medium or DMEM-F12 can be used to generate neuronal cells.
  • Media such as Williams Medium E can be used in liver cells.
  • the cultures can contain serum additives.
  • serum-free culture systems can be used.
  • the multipotent stem cells in the presence of at least one growth factor from the group consisting of NGF, ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), GDNF and BDNF and optionally in combination with at least one growth factor from the group consisting of EGF, bFGF, IGF-1, IL-Ib, IL-6, IL-11, LIF, Flt3 ligand, SCF and SCGF be cultivated.
  • NGF ciliary Neurotrophic Factor
  • the multipotent stem cells can be used in the presence of HGF and optionally in combination with at least one growth factor from the group consisting of EGF, IGF-1, insulin, HCC, keratinocyte growth factor, TNF- ⁇ , TGF-ß, Flt3 Ligand, SCF and SCGF are cultivated.
  • liver cf. Torok et al., Dig. Surg. 18, 196 - 203, 2001
  • a matrix for the production of artificial tissue, in particular brain, liver, kidney, heart, bone, retina, muscle or connective tissue or skin, a matrix can be provided which can be expanded with the multipotent stem cells, progenitor cells and / or differentiated cells in contact. This means that this matrix is transferred to a suitable vessel and covered with the cell-containing culture medium (before or during the differentiation of the expanded multipotent stem cells).
  • matrix is understood to mean any suitable carrier material to which the cells can attach or attach in order to form the corresponding cell network, ie the artificial tissue.
  • the matrix or the carrier material is preferably already in one for According to a particular embodiment of the invention, bovine pericardial tissue is used as the matrix, which is cross-linked, decellularized and photofixed with collagen (CardioFix TM, Sulzer Medica, Zurich, Switzerland).
  • the ex vivo expanded multipotent stem cells as well as the endothelial progenitor cells and mature endothelial cells can also be used for the in vitro production of blood vessels.
  • the in vitro generated blood vessels can be implanted as vascular grafts in patients with coronary artery disease or peripheral arterial occlusions and represent an alternative to bypass surgery and implantation of artificial vascular prostheses.
  • the matrix is preferably already preformed in a cylindrical shape.
  • the ex vivo expanded multipotent stem cells and the endothelial progenitor cells can also be used to improve or ensure the vascular supply of skin transplantation.
  • the skin grafts can include mesh grafts or skin grafts made by tissue engineering.
  • ex vivo expanded multipotent stem cells and the endothelial progenitor cells can be used to ensure vascular supply to organs or tissues produced by tissue engineering.
  • the organs or tissues can e.g. Include liver, kidney, or cartilage.
  • vascular systems can be made individually for the patient to possibly prevent a host-against-graft reaction (graft rejection).
  • the present invention thus furthermore relates to a process for the preparation of a pharmaceutical composition, in which the process according to the invention for the expansion of multipotent stem cells is carried out.
  • the differentiation phase can also follow according to the invention that one carries out the two-stage expansion / differentiation process for the preparation of the pharmaceutical composition, the cells being isolated during and / or at the end of phase II depending on the desired degree of differentiation.
  • the cells obtained in each case can be used directly for therapy, preferably by taking up in 0.9% saline, or, if necessary, otherwise prepared for the respective administration. This may also include radioactive labeling of the cells.
  • the pharmaceutical composition can contain a mixture of expanded multipotent stem cells and endothelial progenitor cells.
  • the process for the preparation of the pharmaceutical composition therefore optionally includes carrying out the expansion / differentiation process according to the invention
  • phases I and II whereby cells obtained in phase I are combined with EPCs isolated in phase II.
  • the method for producing a pharmaceutical composition can further include gene transfection, that is to say the introduction of foreign genes into the multipotent stem cells, the gene transfection taking place as part of the expansion process (or in the two-stage process during the expansion phase, phase I ).
  • a pharmaceutical composition can also be provided which contains both gene-transfected stem cells and gene-transfected progenitor cells.
  • pharmaceutical composition includes both preparations for therapeutic use and agents for diagnostic purposes.
  • the invention further relates to the use of the cells obtained by the expansion method according to the invention and by the two-stage expansion / differentiation method according to the invention (ie the multipotent stem cells, progenitor cells and mature cells) for the production of artificial organs and tissues, in particular of brain, liver and kidneys -, heart, cartilage, bone, retina, muscle or connective tissue or skin.
  • the cells obtained by the expansion method according to the invention and by the two-stage expansion / differentiation method according to the invention ie the multipotent stem cells, progenitor cells and mature cells
  • the invention further relates to the pharmaceutical compositions, implantable materials and artificial organs and tissues, in particular including the blood vessels, produced using the expanded multipotent stem cells, progenitor cells and / or mature cells produced using the invention (or using the method according to the invention) ,
  • the present invention describes a culture system that enables ex vivo expansion of multipotent human stem cells. Compared to the culture systems described so far, the present invention has the advantage that there is no or no significant differentiation of the stem cells during the expansion phase. As a result, the stem cells retain their regenerative capacity and can be used for autologous or allogeneic transplants in patients with malignant diseases. They can also be used for tissue engineering.
  • the invention is also characterized in that the multipotent stem cells can be gene transfected under the developed culture conditions. This leads to new approaches for diagnosis and therapy of cardiovascular and malignant diseases.
  • the invention enables endothelial progenitor cells to be multiplied by a factor of one hundred in the culture system and cell numbers to be achieved as are necessary for clinical applications.
  • the culture system has the advantage that both the multipotent stem cells and the endothelial progenitor cells can be produced without great expenditure on equipment.
  • a patient's cryopreserved leukapheresis product was used, which was intended for high-dose chemotherapy with autologous stem cell transplantation due to a malignant disease.
  • Fresh leukapheresis products or G-CSF mobilized, unpheresized blood can also be processed.
  • the cryopreserved sample was thawed in a water bath at 37 ° C. and transferred to a buffer consisting of PBS, 0.5% HSA and 0.6% ACD-A. The sample was then centrifuged for 15 minutes at 900 rpm and 4 ° C. The cell pellet obtained was resuspended in PBS + 5% HSA. Then DNAse (100 U / ml) was added to this PBS solution and the sample was incubated for 30 minutes on an automatic mixer.
  • the mononuclear cell fraction (MNC) of the leukapheresis product was obtained by density gradient centrifugation via Fikoll-Hypaque. For this, the sample was centrifuged for 20 minutes at 2000 rpm and 4 ° C. The sample was then washed twice for 10 minutes at 1200 rpm in PBS + 0.5% HSA + DNAse (100 U / ml). The MNC were then resuspended in PBS + 0.5% HSA, incubated with AC133-conjugated microbeads (AC133 Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) for 30 minutes at 4 ° C and in PBS + 0.5% HSA for 10 Minutes at 1200 rpm. The AC133 selection was then carried out on the autoMACS (Miltenyi Biotec; software program Posseldx). After each selection, the degree of purity was determined by means of FACS analysis.
  • AC133 Isolation Kit AC133 Isolation Kit, Milten
  • the freshly isolated AC133 + cells were cultivated in fibronectin-coated 24 perforated plates at a cell density of 2 ⁇ 10 6 cells / ml in IMDM + 10% FCS + 10% horse serum + 10 "6 mol / 1 hydrocortisone.
  • the following recombinant human growth factors were added to cells: SCGF (100 ng / ml; TEBU, Frankfurt), Flt3 ligand (50 ng / ml; TEBU) and VEGF (50 ng / ml; TEBU) and the cells for 14 days at 37 ° C incubated in 5% CO 2.
  • the medium was supplemented with SCGF (100 ng / ml) and VEGF (50 ng / ml) and the cells were cultivated for 14 days Proliferation of the cells was carried out, the supernatant was carefully pipetted off and replaced with fresh medium, proliferating cells contained in the supernatant were counted, adjusted to a cell density of 2 ⁇ 10 6 cells / ml and introduced into fresh wells of the perforated plate.
  • Freshly isolated AC133 + cells and cultured cells were centrifuged on slides in a cytocentrifuge at 500 rpm for 5 minutes. The cytospins were air dried for at least 24 hours and then stained using immunofluorescence.
  • the following primary unconjugated and conjugated antibodies were used: Anti-KDR-MoAb (Sigma), Anti-Ulex Europaeus Agglutinin-1 MoAb, Anti-EN4 (Cell Systems), Anti-CD31-PE (Pharmingen, Hamburg), VE-Cadherin PE (Pharmingen) and Anti-vWF-FITC.
  • Anti-mouse FITC-conjugated immunoglobulins were used as the secondary antibody.
  • the cytospins were first washed in 10% FCS / PBS to block nonspecific binding sites. Then the cytospins were incubated with the primary antibody for 60 minutes at room temperature. The cytospins that were incubated with an unconjugated primary antibody were then incubated for 30 minutes at room temperature.
  • cytospins were then kept at -20 ° C for 5 minutes at 5%
  • the freshly isolated AC133 + cells were first incubated with a hemolytic buffer (0.155 mol / L NH 4 C1, 0.012 mol / L NaHC0 3 , 0.1 mmol / L EDTA, pH 7.2) in order to lyse erythrocytes. Cells that have already been cultured were fed directly to the antibody incubation.
  • a hemolytic buffer (0.155 mol / L NH 4 C1, 0.012 mol / L NaHC0 3 , 0.1 mmol / L EDTA, pH 7.2
  • the measurements were carried out as single-color and two-color analyzes on the FACS SCAN flow cytometer (Becton Dickinson) and the software program Cell Quest. Each analysis included at least 5000 counts. An isotype control ( ⁇ l ⁇ 2a, Purngen) was carried out with each measurement.
  • AMV Avian Myeloblastosis virus
  • the specific primers for KDR, Tie-2 / Tek, VE-Cadherin, vWF and actin recognize coding sequences.
  • the size of the PCR products was as follows: for the outer KDR primer pair 591 bp, for the inner KDR primer pair 213 bp, for the outer Tie-2 / Tek primer pair 624 bp, for the inner Tie-2 / Tek primer pair 323 bp, for the outer VE-Cadherin primer pair 462 bp, for the inner VE-Cadherin primer pair 340 bp, for the outer vWF primer pair 312 bp, for the inner vWF primer pair 128 bp.
  • the individual steps of the PCR reaction and gel electrophoresis were carried out in different rooms using different pipettes. Correspondingly, control reactions carried along were always negative.
  • the AC133 + cells were first expanded for 14 days under the influence of Flt3 ligand, SCGF and VEGF.
  • the cells became adherent just a few hours after the start of the culture.
  • the cells formed a monolayer from small, round cells.
  • the cell density increased significantly from day to day.
  • a non-adherent cell layer of small round cells was found, which had formed above the adherent cell layer.
  • the non-adherent cell layer was carefully pipetted off, counted and fresh holes in the perforated plate were introduced. This process could now be repeated, the cells proliferated continuously.
  • the cells multiplied 100 times. The morphology changed little during the entire period.
  • the cells had a larger diameter on day 14 and had a “cobble-stone” morphology. From day 14, the cells were transferred to a medium which contained the growth factors SCGF and VEGF. The proliferation decreased significantly within three to four days The cells showed the first morphological differentiation characteristics, which is typical for endothelial cells. Small elongated cells that grew very flat were initially found. After 14 days of culture in the differentiation medium, the cell population consisted predominantly of large spindle-shaped cells with typical endothelial cells. Morphology.
  • the freshly isolated AC133 + cells and cells that were expanded for 14 days were placed in semisolide medium containing either hematopoietic growth factors to stimulate hematopoietic colonies or the cytokines SCGF and VEGF to induce endothelial colonies.
  • Table 1 shows, the cells which had already been expanded in suspension cultures for 14 days still had clonogenic potential. Compared to freshly isolated AC133 + cells, these cells were no longer able to form BFU-E and CFU-E, but they had a higher capacity to form endothelial colonies.
  • BFU-E burst-forming unit erythrocyte
  • CFU-E colony-forming unit erythrocyte
  • CFU-GEMM colony-forming unit granulocyte-erythrocyte-macrophage-megakaryocyte
  • CFU-GM colony-forming unit granulocyte-macrophage
  • CFU-G colony-forming unit granulocyte
  • CFU-M colony-forming unit macrophage
  • CFU-EC colony-forming unit endothelial cell.
  • Table 2 Percentages of positive cells for CD31, vWF, VE-Cadherin and Ulex europaeus agglutinin-1 using immunofluorescence staining.
  • Table 3 Gene expression analysis of the freshly isolated AC133 + cells and the cultured cells using RT-PCR.
  • the AC133 + cells were initially for 4 days at a cell density of 2 ⁇ 10 6 cells / ml in IMDM + 10% FCS + 10% horse serum + 10 ⁇ 6 mol / 1 hydrocortisone + Flt3 ligand (50 ng / ml) + SCGF (100ng / ml) + VEGF (50ng / ml) cultivated.
  • the AC133 + cells were transfected with the retroviral vector SFll ⁇ EGFPrev, which codes for the enhanced green fluorescence protein.
  • 6-well plates were first coated with the recombinant fibronectin fragment CH296 (RN, see, for example, R.
  • a fresh 6-well plate was coated with RN and loaded with retroviral particles by means of 5 centrifugation steps, as described above, and the transfection was carried out overnight. In this way, a transduction efficiency of 70% was achieved.
  • the transfected cells were then cultured in fresh 6-well plates coated with fibronectin that were not loaded with viral particles for a further 48 hours in the above-mentioned medium under the influence of Flt3 ligand, SCGF and VEGF.
  • the cells were trypsinized, washed, resuspended in 100 ⁇ l PBS / 1 ⁇ 10 6 cells and SCID mice were injected subcutaneously. Three different experimental groups, each with ten mice, were formed.
  • group I a suspension of 1 x 10 6 gene transfected cells plus 1 x 10 6 cells of the lung carcinoma cell line A549 was injected per mouse.
  • the experimental animals in group II received only 1 x 10 6 gene-transfected cells, whereas in group III only 1 x 10 6 A549 cells were administered subcutaneously.
  • the tumor size and structure of all test animals were analyzed.
  • Subcutaneous tumors were found in all group I and group III mice, while none of the animals in group II had developed a subcutaneous tumor.
  • the largest tumors were found in the group I mice.
  • the tumor diameter was on average 30% larger than that of group III tumors.
  • the tumors of group I also had a higher vascular density than that of group III.
  • the content of the tumors in EGFP-expressing cells was examined using a fluorescence microscope. In the group I tumors, green fluorescent cells could be detected in the vessels.
  • DAKO hepatocyte marker OCH1E5
  • CK-19 DAKO
  • GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein
  • MAP-2 Microtubule-Associated Protein-2
  • PTFE stents were coated with fibronectin for 2 hours. Then the coated stents were transferred into a centrifuge tube and covered with 3 ml of the cell-containing culture medium. The tubes thus prepared were then left at 12 for 2 hours xg and centrifuged at 37 ° C. Subsequently, the coated stents were carefully transferred into a 25 cm 2 culture bottle with 10 ml of the above-mentioned culture medium and after defined times on the inverse ion fluorescence microscope analyzed. A confluent coating with fluorescent cells on the stent was still detectable after 1 week.
  • the AC133 + cells were initially for 4 days at a cell density of 2 x 10 6 cells / ml in IMDM + 10% FCS + 10% horse serum + 10 "6 mol / 1 hydrocortisone + Flt3 ligand (50 ng / ml) + SCGF (100 ng / ml) + VEGF (50 ng / ml) and then transfected with retroviral vector SFll ⁇ EGFPrev as described above, after which the cells were again in IMDM, Flt3 ligand, SCGF and VEGF and from day 15 of Culture period cultured in IMDM, SCGF and VEGF.
  • vascular valves were coated with fibronectin for 2 hours and then placed in a 75 cm 2 culture bottle 250 ml of the cell-containing culture medium were then pipetted into the culture bottle so that the vessel flaps were completely surrounded by the medium, and the culture bottles were then placed on an automatic machine for 24 hours Mixer slowly swiveled.
  • the automatic mixer was placed in an incubator and the culture bottles were incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the culture bottles were then removed from the mixer, half of the culture medium was pipetted off and replaced by fresh medium.
  • the coating of the vessel valves was analyzed at defined times using an inversion fluorescence microscope. In this example, too, a confluent layer of fluorescent cells was still detectable on the vascular valves after 1 week.
  • Bovine pericardial tissue that is cross-linked, decellularized and photofixed with collagen (CardioFix TM, Sulzer
  • Medica, Zurich, Switzerland prepared and shaped into a cylinder. These cylinders were then transferred to a centrifuge tube and covered with 3 ml of the cell-containing culture medium. BFGF (10 ng / ml) was also added to the culture medium which already contained SCGF and VEGF. The tubes thus prepared were then centrifuged for 6 hours at 12 g and 37 ° C.
  • the coated CardioFix cylinders were then carefully placed in a 25 cm 2 culture bottle with 10 ml IMDM + 10% FCS + 10% horse serum + 10 "6 mol / 1 hydrocortisone + VEGF (50 ng / ml) + bFGF (10 ng / ml) + IGF-1 (10 ng / ml) transferred and cultured for 8 weeks, then the cylinders were immunohistochemically analyzed to find a confluent monolayer of cells with endothelial cell morphology that were immunohistochemically positive for vWF and VE-Cadherin.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor the use of the isoforms A, B, C and / or D is included according to the invention.
  • IL-1, -3, -6, -11 interleukin-1, -3, -6, -11
  • HGF Hepatocyte Growth Factor

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expansion multipotenter Stammzellen ex vivo. Ferner betrifft die Erfindung ein zweistufiges Verfahren zur Expansion und Differenzierung von multipotenten Stammzellen ex vivo, bei dem die Stammzellen auf der ersten Stufe, d.h. während der Expansionsphase, gentransfiziert werden können. In der Phase erfolgt die Differenzierung der multipotenten Stammzellen wahlweise in Zellen der hämatopoetischen, endothelialen oder mesenchymalen Zellreihe. Auf diese Weise gewonnene Stamm- und Progenitorzellen sowie reife Zellen der hämatopoetischen, endothelialen und mesenchymalen Zellreihe lassen sich unter anderem für die Prophylaxe, Diagnostik und Therapie humaner Erkrankungen sowie zum Tissue Engineering einsetzen.

Description

Verfahren zur ex vivo-Expansion und -Differenzierung von multipotenten Stammzellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expansion multipotenter Stammzellen ex vivo. Ferner betrifft die Erfindung ein zweistufiges Verfahren zur Expansion und Differenzierung von multipotenten Stammzellen ex vivo, bei dem die Stammzellen auf der ersten Stufe, d.h. während der Expansionsphase, gentransfiziert werden können. In der zweiten Phase erfolgt die Differenzierung der multipotenten Stammzellen wahlweise in Zellen der hamatopoetischen, endothelialen oder mesenchymalen Zellreihe. Auf diese Weise gewonnene Stamm- und Progenitorzellen sowie reife Zellen der hamatopoetischen, endothelialen und mesenchymalen Zellreihe lassen sich unter anderem für die Prophylaxe, Diagnostik und Therapie humaner Erkrankungen sowie zum Tissue Engineering einsetzen.
Hintergrund und Stand der Technik:
a) Endotheliale Zellreihe
Der Aufbau und die Aufrechterhaltung einer Gefäßversorgung sind eine absolute Voraussetzung für das Wachstum von normalem und malignem Gewebe. Für die Gefäßneubildung sind grundsätzlich zwei Prozesse verantwortlich. Der erste Prozeß, die Vasculogenese, beinhaltet die in situ Differenzierung von Hämangioblasten zu Endothelzellen und deren nachfolgende Organisation in einen primären Kapillarplexus . (Risau et al . , Development 102, 471-478, 1988; Risau et al . , Annu . Rev. Cell Dev. Biol.ll, 73-91, 1995). Der zweite Prozeß, die sogenannte Angiogenese, ist definiert als die Formation neuer Blutgefäße durch Aussprossung bereits vorhandener Blutgefäße. Bisher wird angenommen, daß der Prozeß der Vasculogenese nur während der frühen Embryonalphase stattfindet, während die Angiogenese sowohl prä- wie postnatal vorkommt. Der Hämangioblast als gemeinsame Stammzelle für hämatopoetische Zellen und Endothelzellen wurde kürzlich identifiziert als ein transientes Zellstadium, das während der frühen Embryonalentwicklung nur für kurze Zeit nachweisbar ist. Danach scheint der Hämangioblast auszudifferenzieren, ohne sich selbst zu erneuern (Choi et al . , Development 125, 725- 732, 1998) . Allerdings muß darauf hingewiesen werden, daß diese Ergebnisse auf tierexperimentellen Studien beruhen und nicht notwendigerweise auf das humane System übertragbar sind. Es wäre denkbar, daß beim Menschen Hämangioblasten oder andere Subpopulationen von Endothelprogenitorzellen über die Embryonalphase hinaus persistieren und im adulten Organismus zirkulieren, differenzieren und an der Blutgefäßneubildung teilhaben können. Diese Hypothese wird inzwischen durch zahlreiche Studien unterstützt (Asahara et al . , Science 275, 964 - 967, 1997; Yin et al . , Blood 90, 5002 - 5012, 1997; Shi et al., Blood 92, 362 - 367, 1998; Takahashi et al., Nature Med. 5, 434 - 438, 1999; Asahara et al . , Circul . Res . 85, 221
- 228, 1999; Lin et al . , J. Clin. Invest. 105, 71 - 77, 2000;
Kalka et al . , Circul. Res. 86, 1198 - 1202, 2000; Kalka et al., Ann. Thorac. Surg. 70, 829 - 834, 2000; Bhattacharya et al., Blood 95, 581 - 585, 2000; Crosby et al . , Circul. Res.
87, 728 - 730, 2000; Murohara et al . , J. Clin. Invest. 105,
1527 - 1536, 2000; Peichev et al . , Blood 95, 952 - 958, 2000).
Es konnte gezeigt werden, daß die Population adulter humaner AC133-positiver Stamm- und Progenitorzellen Endothel- progenitorzellen (EPC) enthält, die in Gegenwart von SCGF, einem hamatopoetischen Stammzellwachstumsfaktor, und VEGF, einem angiogenen Zytokin, zu funktionell intakten Endothelzellen differenzieren, die in vivo Blutgefäße bilden können (Gehling et al., Blood 95, 3106 - 3112, 2000).
In vitro ist die Proliferationsrate von reifen Endothelzellen normalerweise sehr niedrig. Auch Endothelprogenitorzellen weisen in konventionellen Zellkulturmedien nur eine geringe Wachstumstendenz auf. Zellzahlen, wie sie für viele klinische Anwendungen benötigt würden, können auf diesem Wege nicht erreicht werden. Kulturbedingungen, die eine ex vivo Expansion von Endothelprogenitorzellen und Endothelzellen ermöglichen, wurden bisher noch nicht entwickelt. Auch mit den in der oben zitierten Studie (Gehling et al., loc. cit.) gewählten Kulturbedingungen konnte keine Proliferation der Endothelprogenitorzellen im Sinne einer Expansion induziert werden. Es konnte lediglich eine Vermehrung dieser Progenitorzellen um das maximal 8-fache erreicht werden. Um die für klinische Einsätze notwendigen Zellzahlen an Endothelprogenitorzellen zu gewinnen, muß jedoch eine Expansion um das hundert-fache angestrebt werden.
Von Quirici et al . (Br. J. Heamatol . 115, 186-194, 2001) wurde ein Verfahren zur Expansion von Endothelzellen beschrieben, bei dem CD133-positiver Knochenmarkzellen zunächst für 3-4 Wochen in Gegenwart von VEGF, bFGF und IGF-1 kultiviert werden. Nach Aufreinigung unter Verwendung von Ulex europaeus agglutinin-1 (UEA-1) schließt sich eine weitere Kultivierungsphase (3-4 Wochen) mit VEGF, bFGF und IGF-1 an. Es wird zwar eine Expansion um das etwa 2300-fache beschrieben, doch ist zu bedenken, daß die durch UEA-1 aufgereinigten Zellen nur etwa 0,5 % der ursprünglichen Zellen ausmachen, wodurch das Verfahren, insbesondere auch wegen der mit insgesamt 6-8 Wochen sehr langen Kultivierungsphasen nur in sehr begrenzten Fällen praktikabel ist.
Vor diesem Hintergrund besteht nach wie vor der Bedarf für ein Expansionsverfahren, das - vorzugsweise ausgehend von durch Blutentnahme erhaltenen multipotenten Stammzellen - eine ausreichend Expansionsrate liefert und ohne großen technischen oder zeitlichen Aufwand durchführbar ist. Mit Bereitstellen eines solchen Verfahrens würden sich zahlreiche neue Anwendungen erschließen, die bislang nicht durchführbar sind, weil das dafür erforderliche Zellmaterial nicht oder nicht in ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden kann.
So sind die möglichen Einsatzgebiete von ex vivo expandierten Endothelprogenitorzellen (EPC) und Endothelzellen (EC) vielfältig. Hier sind zum einen die Diagnostik, Prophylaxe und Therapie von kardiovaskulären und bösartigen (wie z.B. neoplastischen) Erkrankungen, sowie das Tissue Engeneering zu nennen. Ein Beispiel im Bereich der Kardiologie ist das direkte Einbringen von EPC in minderdurchblutete Gefäßbezirke des Herzens sein, um die Bildung neuer Blutgefäßgefäße zu induzieren. Dieses Verfahren ließe sich auf Durchblutungsstörungen anderer Organe und Körperbereiche übertragen. Im Bereich des Tissue Engeneering können die EPC genutzt werden, um in vitro neue Blutgefäße für klinische Zwecke herzustellen. Weiterhin können die EPC dazu dienen, die Gefäßversorgung von Hauttransplantaten und von künstlich hergestellten (tissue-engineerten) Organen, wie Leber und Pankreas, zu ermöglichen. Ein weiteres Einsatzgebiet stellt die Verwendung von gentransfizierten EPC als Vehikel für bestimmte Genprodukte dar. Diese genetisch veränderten EPC können dabei sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Zwecke in die Gefäße von erkrankten Organen und von Tumoren eingebracht werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Expansionsverfahren zur Verfügung zu stellen, das vorzugsweise ausgehend von durch Blutentnahme erhaltenen multipotenten Stammzellen - eine ausreichend Expansionsrate liefert und ohne großen technischen oder zeitlichen Aufwand durchführbar ist.
b) Hämatopoetische Zellreihe
Seit Beginn der neunziger Jahre werden Patienten, die an einem bösartigen Tumor erkrankt sind, in zunehmendem Maße mit einer Hochdosischemotherapie behandelt. Da die wesentliche Nebenwirkung in einer langanhaltenden Knochenmarkaplasie besteht, wird diese Therapie in Verbindung mit einer autologen Transplantation von hamatopoetischen Progenitorzellen durchgeführt. Für die Gewinnung einer ausreichenden Anzahl an hamatopoetischen Progenitorzellen ist entweder die Durchführung einer großvolumigen Knochenmarkentnahme in Vollnarkose oder die Durchführung von ein bis drei Leukapheresen notwendig.
Es kann vorkommen, daß die Stammzellreserve eines Patienten nicht ausreicht, um eine für die Transplantation benötigte Menge an Progenitorzellen aus dem Knochenmark oder dem peripherem Blut zu erhalten. In den vergangenen zehn Jahren haben sich zahlreiche Arbeitsgruppen mit der Entwicklung von Kulturbedingungen beschäftigt, die eine ex vivo Expansion von hamatopoetischen Progenitorzellen ermöglichen (Berenson et al., Blood 77, 1717 - 1722, 1991; Brandt et al . , Blood 79, 634 - 641, 1992; Haylock et al . , Blood 80, 1405 - 1412, 1992; Brugger et al . , Blood 81, 2579 - 2584, 1993; Sato et al . , Blood 82, 3600 - 3609, 1993; Rice et al., Exp. Hematol. 23, 303 - 308, 1995; Alcorn et al . , J. Clin. Oncol . 14, 1839 - 1847, 1996; Peters et al . , Blood 87, 30 - 37; 1996, Yonemura et al., Blood 89, 1915 - 1921, 1997; Reiffers et al-, Lancet 354, 1092 - 1093, 1999, McNiece et al . , Blood 96, 3001 - 3007; 2000) . Durch eine der Transplantation vorgeschalteten Expansionskultur der Progenitorzellen könnte die Menge des Knochenmarkaspirates oder des Leukapheresates auf ein Minimum reduziert werden. Für Patienten mit eingeschränkter Stammzellreserve könnte ein ausreichendes Progenitorzeil- Transplantat hergestellt werden. Ferner erhofft man sich von der Transplantation ex vivo expandierter Progenitorzellen eine schnellere Rekonstitution der Hämatopoese .
Bis heute konnte jedoch keine der oben genannten Arbeitsgruppen Kulturbedingungen vorstellen, die eine ex vivo Expansion der „wirklichen" hamatopoetischen Stammzelle bewirken. Vielmehr führen die bisher entwickelten Kulturbedingungen zu einer frühzeitigen Differenzierung der Stammzellen und somit zu einer ex vivo Expansion von determinierten Progenitorzellen, die ihre Stammzelleigenschaften verloren haben. Diese Zellen sind für eine Transplantation nicht geeignet, da sie im Anschluß an eine myeloablative Chemotherapie keine dauerhafte Hämatopoese regenerieren können (Shih et al . , J. Hematother. Stem Cell Res. 9, 621 - 628, 2000, McNiece et al . , Exp. Hematol. 29, 3 - 11, 2001) .
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zu entwickeln, dessen Kulturbedingungen eine ex vivo Expansion von transplantablen hamatopoetischen Stammzellen ermöglichen.
c) Mesenchymale Zellreihe
Im Bereich der mesenchymalen Zellreihe wurde von Reyes et al .
(Blood 96, 2615-2625, 2001) ein ex vivo-Expansionsverfahren beschrieben, bei dem CD45/Glycophorin-A-negative mononukleäre
Knochenmarkzellen in Gegenwart von EGF und PDGF-BB kultiviert werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch - wie bereits bei dem von Quirici et al. (s.o.) für die endotheliale Zellreihe beschriebenen Verfahren - darin, daß die eingesetzten mononukleären Knochenmarkzellen nur einen Anteil von 0,1 bis 0,5 % der Knochenmarkzellen ausmachen. Damit verbunden sind somit zusätzliche Aufreinigungs- und Anreicherungsstufen. Ferner ist zu bedenken, daß die CD45" /GlyA" Zellen nur eine sehr geringe Proliferationsrate aufweisen. So beträgt die Zeilverdopplungsrate 46-60 Stunden. Wenn man von einer Entnahme von 100 ml Knochenmark ausgeht, erhält man 1 x 108 mononukleäre Blutzellen, davon sind 0,1-0,5% CD45"/GlyA", d.h. 1-5 x 105 CD45"/GlyA~Zellen. Nach 14 Tagen in Kultur erhält man somit nur 6,4 x 106 bis 3,2 x 107 Stammzellen. Aus diesen Gründen ist das Expansionsverfahren nach Reyes et al., insbesondere für den klinischen Einsatz, nur von geringer praktischer Bedeutung.
Die vorliegende Erfindung:
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile zu vermeiden und ein Expansionsverfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem sich bei der Expansion deutlich höhere Zellzahlen erreichen lassen, als es bislang im Stand der Technik der Fall ist. Insbesondere soll ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, mit dem sich gezielt Progenitorzellen und reife Zellen verschiedener Zellreihen (hämatopoetische, endotheliale und mesenchymale Zellreihen) auf verschiedenen Differenzierungsstufen gleichermaßen vermehren lassen. Das Verfahren soll ohne großen technischen oder zeitlichen Aufwand durchführbar sein und vorzugsweise von multipotenten Stammzellen ausgehen, die durch einfache Blutentnahme zugänglich sind.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Verfahren zur Expansion multipotenter Stammzellen gelöst, bei dem man multipotente Stammzellen in Gegenwart von Flt3-Ligand und mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus SCF, SCGF, VEGF, bFGF, Insulin, NGF und TGF-ß kultiviert. In jedem Fall kann wahlweise zusätzlich IGF-1 und/oder EGF verwendet werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird eine der folgenden Kombinationen gewählt:
a) Flt3-Ligand und VEGF, b) Flt3-Ligand, SCGF und VEGF, c) Flt3-Ligand und EGF, d) Flt3-Ligand, EGF und bFGF, e) die unter a) bis d) genannten Wachstumsfaktoren in Kombination mit IGF-1 und/oder EGF.
Überraschenderweise läßt sich durch Verwendung der vorgenannten Wachstumsfaktoren eine Vermehrung der eingesetzten Zellzahlen um mehr als das Hundertfache erreichen, wobei zum Beispiel ausgehend von nur 50 ml Leukaphereseprodukt nach 14-tägiger Kultur bereits 1 x 109 bis 1 x 1010 multipotente Stammzellen erhalten werden. Die Expansion läßt sich somit in deutlich größerem Ausmaß durchführen als im Stand der Technik. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß auf Quellen für Stammzellen zurückgeriffen werden kann, die, wie z.B. Blut, auf einfache Weise erhältlich sind. Unerwarteterweise führt die Verwendung von Flt3-Ligand, bei dem es sich um einen hamatopoetischen Wachstumsfaktor handelt, in Kombination mit den genannten Wachstumsfaktoren zu keiner vorzeitigen Ausdifferenzierung der Stammzellen, auch nicht in Richtung der hamatopoetischen Zellreihe. Dies hat den besonderen Vorteil, daß man die multipotenten Stammzellen nach der Expansion in einer sich anschließenden Differenzierungsphase ausreifen lassen kann. Gleichzeitig ermöglicht die erfindungsgemäße Trennung von Expansion und Differenzierung in vorteilhafter Weise, daß man die noch multipotenten Stammzellen gentechnisch verändern kann. Das heißt, es ist möglich, die Stammzellen, während sie stark proliferieren, mit Vektoren zu transfizieren, die bevorzugt für natürlicherweise in diesen Zellen nicht exprimierte Proteine oder Polypeptide kodierende Nukleinsäuresequenzen enthalten.
Da es sich gezeigt hat, daß die Verwendung von Flt3-Ligand in Gegenwart von VEGF und bFGF die Ausdifferenzierung begünstigt, sollte diese Kombination vermieden werden, wenn ausschließlich eine Expansion multipotenter Stammzellen verfolgt wird, d.h. ohne oder ohne wesentliche Ausdifferenzierung. Die Ausdifferenzierung der expandierten multipotenten Stammzellen kann erfindungsgemäß vielmehr in dem sich anschließenden zweiten Schritt erfolgen, mit dem gezielt eine Ausdifferenzierung in eine der drei Zellreihen (endothelial, hämatopoetisch und mesenchymal) vorgenommen werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist somit ferner ein zweiphasiges Verfahren (Zwei-Phasen-Kultursystem) , bei dem man multipotente Stammzellen expandiert und zur Erzeugung von humanen Progenitorzellen und reifen Zellen der hamatopoetischen, endothelialen und mesenchymalen Zellreihe entwickelt. Das bereits zuvor genannte erfindungsgemäße Expansionsverfahren entspricht Phase I des zweiphasigen Verfahrens. Im folgenden wird daher zur Vereinfachung auf Phase I verwiesen, wobei die Ausführungen gleichermaßen für das Expansionsverfahren (d.h. ohne nachfolgende Differenzierungsphase) gelten.
Die Erfindung betrifft somit ferner ein Verfahren zur in vitro (ex vivo) Expansion und Differenzierung multipotenter Stammzellen, bei dem man
a) in einer ersten Phase zur Expansion multipotenter Stammzellen das erfindungsgemäße Expansionsverfahren
(d.h. in Gegenwart von Flt3-Ligand und mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus SCF, SCGF, VEGF, bFGF, Insulin, NGF und TGF-ß (jeweils gegebenenfalls in Kombination mit IGF-1 und/oder EGF) durchführt und man
b) die expandierten Zellen in einer zweiten Phase differenziert, wobei man die Zellen
(i) zur (Induktion der) hamatopoetischen
Differenzierung in Gegenwart mindestens eines Wachstumsfaktors aus der Gruppe bestehend aus G- CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, TPO und EPO kultiviert, wahlweise in Kombination mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus IL-1, SCF und SCGF,
(ii) zur (Induktion der) endothelialen Differenzierung in Gegenwart mindestens eines Wachstumsfaktors aus der Gruppe bestehend aus VEGF, aFGF, bFGF,
ECGS, AP-1, AP-2, NGF, CEACAM, Pleiotrophin, Angiogenin, P1GF, und HGF kultiviert, wahlweise in Kombination mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus LIF, EGF, IGF-1, PDGF, PDECGF, TGFα, TGFß, TNFα, Oestrogen, Proliferin, IL-3, G-CSF, GM-CSF, EPO
SCF und SCGF,
(iii) zur (Induktion der) mesenchymalen Differenzierung in Gegenwart mindestens eines Wachstumsfaktors aus der Gruppe bestehend aus PDGF-BB, TGF-ß und BMP-4 kultiviert, wahlweise in Kombination mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus EGF, aFGF, bFGF, IGF-1, SCF und SCGF,
(iv) zur (Induktion der) neuronalen Differenzierung in
Gegenwart mindestens eines Wachstumsfaktors aus der Gruppe bestehend aus NGF, CNTF, GDNF und BDNF kultiviert, wahlweise in Kombination mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus EGF, bFGF, IGF-1, IL-lb, 11-6, II- 11, LIF, Flt3 Ligand, SCF und BMP-4, oder
(v) zur (Induktion der) hepatozytären Differenzierung in Gegenwart von HGF kultiviert, wahlweise in Kombination mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus EGF, IGF-1, Insulin, HCG, KGF, TNF- , Flt3 Ligand, SCF und SCGF.
Zur Durchführung der Expansion (entsprechend der ersten Phase des zweistufigen Verfahrens) ist die Verwendung von Flt3- Ligand in folgenden Kombinationen bevorzugt:
a) Flt3-Ligand und VEGF, b) Flt3-Ligand, SCGF und VEGF, c) Flt3-Ligand und EGF, d) Flt3-Ligand, EGF und bFGF, e) die unter a) bis d) genannten Wachstumsfaktoren in Kombination mit IGF-1 und/oder EGF.
In der zweiten Phase wird gemäß einer besonderen Ausführungsform
(i) zur hamatopoetischen Differenzierung eine Kombination aus SCF, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF und EPO verwendet oder
(ii) zur endothelialen Differenzierung eine Kombination aus SCGF und VEGF verwendet,
(iii) zur mesenchymalen Differenzierung eine Kombination aus EGF, PDGF-BB, IGF-1, bFGF und BMP-4 verwendet,
(iv) zur neuronalen Differenzierung eine Kombination aus BDNF, GDNF, EGF und bFGF verwendet oder man
(v) zur hepatozytären Differenzierung eine Kombination aus Flt3 Ligand, SCF, HGF und TGF-ß verwendet.
Das Verfahren kann auf besonders einfache Weise zusätzlich für eine Gentransfektion der Stammzellen genutzt werden, ohne daß es zu einer Behinderung der Zellexpansion kommt. Die gentransfizierten Stammzellen können analog den genetisch nicht veränderten Stammzellen in die hämatopoetische, endotheliale und mesenchymale Zellreihe differenzieren.
Bei der Gentransfektion wird eine für ein in den Zellen natürlicherweise nicht exprimiertes Protein oder Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz (nachfolgend als „Fremdgen" bezeichnet) eingeführt. Die multipotenten Stammzellen können aus mobilisiertem oder unmobilisiertem autologem peripherem Blut oder Knochenmark des Patienten oder aus Nabelschnurvenenblut gewonnen werden. Die Mobilisierungstherapie kann aus einer subkutan oder intravenösen Injektion von Wachstumsfaktoren wie G-CSF, GM-CSF oder SCF und/oder aus einer intravenösen oder oralen Applikation von Zytostatika bestehen. Die Gewinnung der multipotenten Stammzellen aus G-CSF mobilisierten peripherem Blut (frisch gewonnenes oder gefrorenes Leukaphereseprodukte) stellt eine besondere Ausführungsform der Erfindung dar. Die multipotenten Stammzellen können in der mononukleären Zellfraktion gewonnen werden. Durch Verwendung von Antikörpern, die spezielle Antigene auf multipotenten Stammzellen erkennen, können die multipotenten Stammzellen isoliert werden. Folgende Antikörper können zum Einsatz kommen: Anti-CD7 MoAb, Anti-CD31 MoAb (PECAM-1), Anti-CD34
MoAb, Anti-CD54 (ICAM-1) MoAb, Anti-CD90 (Thy-1) MoAb, Anti-
CD114 (G-CSF-R) MoAb, Anti-CD116 (GM-CSF-R) MoAb, Anti-CD117
(c-kit) MoAb, Anti-CDwl23 (IL-3R α Chain) MoAb, Anti-CD127 (IL-7R) MoAb, Anti-AC133 MoAb, Anti-CD135 (Flk3/Flk2) MoAb, Anti-CD140b (PDGF-Rß) MoAb, Anti-CD144 (VE-Cadherin) MoAb, Anti-CD164 MoAb, Anti-CD172a MoAb, Anti-CD173 MoAb, Anti-CD174 MoAb, Anti-CD175 MoAb, Anti-CD176 MoAb, Anti-CD184 (CXCR4) MoAb, Anti-CD201 (Endothelial cell Protein C receptor) MoAb, Anti-CD202b (Tie-2/Tek) MoAb, Anti-CD224 MoAb, Anti-CD227
(MUC-1) MoAb, Anti-CD228 MoAb, Anti-CD243 (MDR-1) MoAb, Anti-
EGF-R MoAb, Anti-FGF-R MoAb, Anti-P1H12 MoAb, Anti-KDR MoAb,
Anti-EN4 MoAb, Anti-BENE MoAb. Alternativ zu Antikörpern können auch Lektine, wie zum Beispiel Ulex europaeus agglutinin-1 für die Selektion der multipotenten Stammzellen verwendet werden. Ferner können die multipotenten Stammzellen mittels Depletion erhalten werden. Hierfür kann der MoAb CD45 verwendet werden. Die multipotenten Stammzellen können grundsätzlich in folgenden Zellpopulationen gewonnen werden: AC133+ CD34+, AC133+ CD34", AC133" CD34". Empfohlen wird die Selektion der Gesamtpopulation AC133-positiver Stamm- und Progenitorzellen .
Die einzelnen Phasen des erfindungsgemäßen Kultursystems werden nachfolgend näher erläutert:
Phase I des Kultursystems: Expansionsphase
Im Anschluß an die Gewinnung der multipotenten Stammzellen werden diese Zellen in Suspensionskulturen ex vivo expandiert. Als Basalmedium kann IMDM, MEM, DMEM, X-VivolO, RPMI, M-199 Medium, EGM-2 verwendet werden. Das Basalmedium kann mit fötalem Kälberserum, Pferdeserum oder humanem Serum supplementiert werden. Alternativ können die multipotenten Stammzellen serumfrei expandiert werden. Für die Expansionsphase können die oben genannten (vorzugsweise rekombinanten) humanen Wachstumsfaktoren verwendet werden. Das Medium kann ferner mit Hydrocortison supplementiert werden. Die ex vivo Expansion der multipotenten Stammzellen in IMDM + 10% FBS + 10% Pferdeserum + 10"6 mol/1 Hydrocortison + SCGF + Flt3-Ligand + VEGF stellt eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform dar. SCGF kann problemlos gegen SCF ausgetauscht werden.
Während der Expansionsphase kann den multipotenten Stammzellen genetisches Material übertragen werden. Bei dem genetischen Material, welches den ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen übertragen wird, kann es sich um Gene handeln, die für eine Vielzahl von Proteinen kodieren. Diese Gene umfassen solche, die für fluoreszierende Proteine, wie zum Beispiel GFP, kodieren. Ferner umfassen diese Gene auch solche, die für verschiedene Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Zytokine, Rezeptoren und Anti-Tumor-Substanzen kodieren. Die Gene können außerdem für ein Produkt kodieren, welches die Expression eines anderen Genproduktes reguliert, oder Gene, die einen oder mehrere Schritte eines biologischen Reaktionsablaufes blockieren. Zusätzlich können die Gene für ein Toxin kodieren, welches mit einem Polypeptid, z. B. einem Rezeptor-Liganden, fusioniert ist, oder mit einem Antikörper, der das Toxin an die Zielzelle bindet. Entsprechend kann das Gen für ein therapeutisches Protein kodieren, welches mit einem „targeting"-Polypeptid fusioniert, um auf diese Weise einen therapeutischen Effekt auf ein erkranktes Organ oder Gewebe zu übertragen.
Die Nukleinsäuren werden mit einer Methode in die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen eingebracht, die deren Aufnahme und Expression in den Stammzellen gewährleistet. Diese Methoden können Vektoren, Liposomen, nackte DNA, Elektroporation, u.s.w. umfassen.
Phase II des Kultursystems: Differenzierungsphase
In Suspensionskulturen können die multipotenten Stammzellen direkt nach Isolation oder nach vorheriger ex vivo Expansion, genetisch nativ oder verändert, in die hämatopoetische, endotheliale oder mesenchymale Zellreihe differenziert werden. Als Basalmedium können folgende Medien verwendet werden: IMDM, MEM, RPMI, M-199, X-VivolO, EGM-2, Williams Medium E, SATO Medium, DMEM oder DMEM-F12. Das Basalmedium kann mit fötalem Kälberserum, Pferdeserum oder humanen Serum supplementiert werden. Alternativ können serumfreie Kulturbedingungen verwendet werden .
Um eine hämatopoetische Differenzierung zu induzieren, werden folgende (vorzugsweise rekombinante) humane Wachstumsfaktoren zugesetzt: G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, TPO und/oder EPO. Zusätzlich können ein oder mehrere der folgenden (vorzugsweise rekombinanten) humanen Wachstumsfaktoren verwendet werden: IL-1, SCF und SCGF. Die Verwendung von SCF, IL-3, IL-6, G-CSF und TPO in Kombination mit EPO stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Die Induktion der Differenzierung der multipotenten Stammzellen in die endotheliale Zellreihe, das heißt in Endothelprogenitorzellen und in reife Endothelzellen, wird durch Verwendung folgender (vorzugsweise rekombinanter) humaner Wachstumsfaktoren erreicht: VEGF, bFGF und/oder ECGS . Zusätzlich können ein oder mehrere der folgenden (vorzugsweise rekombinanten) humanen Wachstumsfaktoren verwendet werden: AP- 1, AP-2, LIF, EGF, IGF-1, NGF, CEACAM, HGF, SCF und SCGF. Die Verwendung von SCF, VEGF, bFGF, IGF-1, EGF, LIF plus AP-1 stellt eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform dar.
Um eine mesenchymale Differenzierung zu induzieren, werden folgende (vorzugsweise rekombinante) humane Wachstumsfaktoren zugesetzt: PDGF-BB, TGF-ß und/oder BMP-4. Zusätzlich können ein oder mehrere der folgenden (vorzugsweise rekombinanten) humanen Wachstumsfaktoren verwendet werden: EGF, aFGF, bFGF, IGF-1, SCF und SCGF. Die Verwendung von EGF, PDGF-BB, IGF-1 und bFGF in Kombination mit BMP-4 stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Die Induktion der Differenzierung der multipotenten Stammzellen in die neuronale Zellreihe, das heißt in neuronale Progenitorzellen und in reife neuronale Zellen, wird durch Verwendung folgender (vorzugsweise rekombinanter) humaner Wachstumsfaktoren erreicht: NGF, CNTF, GDNF und/oder BDNF. Zusätzlich können ein oder mehrere der folgenden (vorzugsweise rekombinanten) humanen Wachstumsfaktoren verwendet werden: EGF, bFGF, IGF-1, IL-lb, 11-6, 11-11, LIF, Flt3 Ligand, SCF und BMP-4. Die Verwendung von BDNF, GDNF, EGF plus bFGF stellt eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform dar. Um eine hepatozytäre Differenzierung zu induzieren, wird der
(vorzugsweise rekombinante) humane Wachstumsfaktor HGF zugesetzt. Zusätzlich können ein oder mehrere der folgenden
(vorzugsweise rekombinanten) humanen Wachstumsfaktoren verwendet werden: EGF, IGF-1, Insulin, HCG, KGF, TNF- , Flt3
Ligand, SCF und SCGF. Die Verwendung von Flt3 Ligand, SCF, HGF plus TGF-ß stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Um das Entwicklungsstadium der Zellen in Kultur zu charakterisieren, ist es erforderlich, die Differenzierungsphase, die etwa 10 bis 14 Tage dauert, in regelmäßigen Abständen zu überprüfen. Es bietet sich beispielsweise eine funktioneile Prüfung der Zellen in der Kultur an, beispielsweise in Form eines Kolonie-Assays. Bei Differenzierung der multipotenten Stanmmzellen in die endotheliale Zellreihe verlieren die EPCs z.B. mit zunehmender Differenzierung die Fähigkeit, Blutzeil-Kolonien zu bilden. Durch Entnahme von Zellproben in Phase II kann so in regelmäßigen Abständen von beispielsweise 1 bis 3 Tagen überprüft werden, ob und in wieweit sich die Fähigkeit der Zellen zur Bildung von Kolonien der jeweils nicht gewünschten Zellreihe verändert. Sobald die Zellen nur noch Kolonien der gewünschten Zellreihe bilden, hat die Differenzierungsphase das Stadium erreicht, in dem nur Progenitorzellen dieser Zellreihe vorliegen. Die Zellen können entweder für weitere Anwendungen entnommen bzw. isoliert werden oder zu reifen Zellen der gewünschten Zellreihe ausdifferenzieren.
Zusätzlich oder anstelle des Kolonie-Assays können die Zellen in Phase II mittels Immunzytochemie geprüft werden, um die Ausbildung bestimmter Oberflächenstrukturen auf den Zellen während der Differenzierungsphase zu überprüfen. Die Ergebnisse des funktionellen Assays lassen sich in vorteilhafter Weise mit denjenigen der immunzytochemischen Analysen abgleichen, um herauszufinden, welche Oberflächenstrukturen ausgebildet sein müssen, wenn Progenitorzellen der gewünschten Zellreihe vorliegen, d.h. die Zellen noch nicht ausgereift sind aber dennoch bereits die Eigenschaft zur Kolonie-Bildung der jeweils anderen Zellreihen verloren haben.
Die auf die oben beschriebene Weise isolierten Progenitorzellen müssen entweder sofort in der gewünschten Weise verwendet, d.h. für in der geplanten Anwendung eingesetzt werden oder eingefroren werden. Für Endothelprogenitorzellen hat sich ein aus DMSO, IMDM und HSA bestehendes Medium (vorzugsweise 40% IMDM + 50% HSA + 10% DMSO) als vorteilhaft erwiesen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht den Einsatz von ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen sowie von hamatopoetischen, endothelialen und mesenchymalen Progenitorzellen und reifen Zellen für die Diagnostik, Prophylaxe und Therapie kardiovaskulärer und bösartiger Erkrankungen. Ferner können die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen, Endothelprogenitorzellen und reifen Endothelzellen für die Beschichtung von Oberflächen verwendet werden. Die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen sowie die endothelialen und mesenchymalen Progenitorzellen und reifen Zellen können auch beim Tissue Engineering von Organen und Geweben eingesetzt werden.
Nachfolgend werden exemplarisch einige Anwendungsbeispiele für die in vitro expandierten und differenzierten Zellen angegeben, wobei die genannten Verwendungen nur die Verwendungsmöglichkeiten der bei der Expansion und/oder Differenzierung multipotenter Stammzellen gemäß der vorliegenden Erfindung verdeutlichen sollen, ohne die Erfindung darauf zu beschränken. Anwendung I: Transplantation von multipotenten Stammzellen für hämatopoetische Differenzierung in vivo
Die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen können für die allogene oder autologe Transplantation bei Patienten, die wegen einer bösartigen Erkrankung mit einer myeloablativen Chemotherapie behandelt werden, eingesetzt werden, um die Hämatopoese zu regenerieren. Dabei wird den Patienten zunächst der Wachstumsfaktor G-CSF verabreicht, um eine Mobilisierung der Knochenmarkstammzellen in das periphere Blut zu bewirken. Anstelle von Leukapheresen kann bei den Patienten eine normale Blutentnahme erfolgen. Aus dem peripheren Blut werden dann die Stammzellen isoliert und durch eine ex vivo Expansion die für eine Transplantation benötigte Menge an Stammzellen generiert. Für die Patienten können somit Belastungen und Risiken, die mit der Durchführung von Leukapheresen verbunden sind, vermieden werden. Das Transplantat kann zum einen ausschließlich aus ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen bestehen. Alternativ kann ein Transplantat verwendet werden, das aus expandierten Stammzellen und Endothelprogenitorzellen besteht. Durch den zusätzlichen Einsatz der Endothelprogenitorzellen kann die Rekonstition der Knochenmarkfunktion der Patienten beschleunigt werden.
Anwendung II: Transplantation von genetisch veränderten Stamm- und Progenitorzellen
Da es sich beim erfindungsgemäßen Expansionsverfahren bzw. bei Phase I des zweistufigen Verfahrens um eine Phase handelt, in der die multipotenten Stammzellen stark proliferieren, kann in vorteilhafter Weise auch eine gleichzeitige Gentransfektion vorgenommen werden. Entsprechende Verfahren zur Gentransfektion mittels Vektoren, Liposomen, nackter DNA oder durch Elektroporation sind dem Fachmann gut bekannt (siehe „Referenzen"). In diesem Zusammenhang kann es von Vorteil sein, zur Gentransfektion einen Vektor zu verwenden, der eine von außen induzierbare Expression des Fremdgens, d.h. des natürlicherweise in den Zellen nicht exprimierten Gens, erlaubt, wie z.B. das sogenannte „Tet-on-System", bestehend aus einem Transactivator Construct und einem Responder Construct (vgl. Gossen M., Bujard H. Proc. Natl. Acad. Sei. 89, 5547-5551, 1992; Gossen et al . , Science 268, 1766-1769, 1995; Puttin et al . , Am. J. Physiol. Renal Physiol. 281, F1164-72, 2001) .
Die ex vivo expandierten Stammzellen und die Endothelprogenitorzellen können somit vor der Transplantation genetisch verändert und für diagnostische und therapeutische Anwendungen bei malignen Tumoren und Leukämien verwendet werden. Zum Beispiel können die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen und Endothelprogenitorzellen derart genetisch verändert werden, daß sie Angiogenese inhibieren. Dies kann z. B. durch Einbringen eines Gens, welches für eine angiogeneseinhibitorische Substanz kodiert, erreicht werden. Die angiogeneseinhibitorischen Substanzen umfassen z.B. Endostatin oder Angiostatin, sowie Antikörper oder Antisense- Nukleinsäuren gegen angiogene Zytokine, wie z. B. VEGF. Eine weitere mögliche Anwendung ist die Gentherapie von angeborenen Erkrankungen, wie zum Beispiel die Hämophilie A und B (vgl. Mannuci PM, Tuddenham EG. N. Engl . J. Med. 344, 1773 - 1779,2001; Emilien et al . , Clin. Lab. Haematol . 22, 313 - 322, 2000), die Gaucher-Krankheit (vgl. Barranger et al., Baillieres Clin. Haematol. 10, 765 - 768, 1997), Glykogen- Speicherkrankheiten (Typ I - III) (vgl. Elpeleg ON. J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 12, 363 - 379, 1999), Mukopolysaccharid-Speicherkrankheiten (Typ I - VII) (vgl. Caillaud C, Poenaru L. Biomed. Pharmacother . 54, 505 - 512, 2000), Niemann-Pick-Krankheit (vgl. Millat et al . , Am. J. Hum. Genet. 69, 1013 - 1021, 2001; Miranda et al . , Gene Ther. 7, 1768 - 1776, 2001), Morbus Hirschsprung (vgl. Amiel et al., J. Med. Genet. 38, 729 - 739, 2001), Fanconi Anämie (vgl. Yamashita T. Int. J. Hematol. 74, 33 - 41, 2001), Chediak- Higashi-Syndrom (vgl. Ward et al . , Traffic 1, 816 - 822, 2000), Thalassämie (vgl. Weatherhall DJ. Nat. Rev. Genet. 2, 245 - 255, 2001), Sichelzellanämie (vgl. Chui DH, Dover GJ. Curr. Opin. Pediatr. 13, 22 - 27, 2001) u.s.w..
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methoden zur Gentransfektion sind in den im Abschnitt „Referenzen" zitierten Publikationen beschrieben, wobei diese Verfahren nur beispielhaft genannt, jedoch nicht auf diese Methoden beschränkt sind.
Anwendung III: Diagnostik von Metastasen und ischämischen Erkrankungen
III a.) Diagnostik von Metastasen
Als eine spezielle Anwendung in der Onkologie können die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen und/oder die Endothelprogenitorzellen mit 18F-Fluorodeoxyglukose (18F-FDG) oder mit nιIndium radioaktiv markiert und Patienten intravenös verabreicht werden, um Metastasen darzustellen. Die verabreichten Zellen werden im Tumorgewebe angereichert (vgl. de Bont et al . , Cancer Research 61, 7654 - 7659, 2001), wodurch sich die Metastasen mit diagnostischen Routineverfahren, wie der Positronen Emissions Tomographie (PET, für die Detektion 18F-FDG markierter Zellen) beziehungsweise der einfachen Szintigraphie (für die Detektion 1:L1Indium-markierter Zellen) darstellen lassen. III b.) Diagnostik von ischämischen Läsionen
Die radioaktive Markierung von ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen und/oder die Endothelprogenitorzellen mit 18F-Fluorodeoxyglukose (18F-FDG) oder mit 1:L1Indium kann ebenfalls für die Diagnostik von ischämischen Erkrankungen verwendet werden. Nach intravenöser Verabreichung wandern die markierten Zellen via Zirkulation in ischämische Gebiete des Orgasmus, um dort an der Blutgefäßneubildung teilzunehmen (vgl. Übersicht von Masuda et al., Hum. Cell 13, 153 - 160, 2000). Auf diese Weise lassen sich auch klinisch symptomlose Minderdurchblutungen erfassen. Die Darstellung der markierten Zellen erfolgt analog zum oben genannten Verfahren mittels PET bzw. einer Szintigraphie.
Anwendung IV: Blutgefäßneubildung in vivo
Die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen sowie die Endothelprogenitorzellen und reifen Endothelzellen können ferner für die Therapie von Erkrankungen, die eine verminderte Gefäßversorgung beinhalten, verwendet werden. Zum Beispiel können die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen, die Endothelprogenitorzellen oder die reifen Endothelzellen direkt in ein Organ- bzw. Gefäßsystem eingebracht werden, um dort die Bildung neuer Blutgefäße zu induzieren. Die verminderte Gefäßversorgung kann auf einer ischämischen Erkrankung oder einer Autoimmun-Erkrankung beruhen. Betroffene Gewebe können Muskel, Gehirn, Nieren, Lunge umfassen. Bei den ischämischen Geweben kann es sich speziell um eine Myokardischämie, ischämische Kardiomypopathie, renale Ischämie, pulmonale Ischämie oder um eine Ischämie der Extremitäten handeln. Die ex vivo expandierten Stammzellen sowie die Endothelprogenitorzellen können vor dem Einbringen in das erkrankte Organ bzw. Gefäß genetisch verändert werden, um den therapeutischen Effekt zu erhöhen. Zum Beispiel können die ex vivo expandierten Stammzellen und Endothelprogenitorzellen mit einem Gen transfiziert werden, das für eine vasodilatatorische Substanz kodiert.
Anwendung V: Reendothelialisierung von Gefäßen
Als spezielle Anwendung in der Kardiologie können sowohl die ex vivo expandierten Stammzellen als auch die Endothelprogenitorzellen und die reifen Endothelzellen für die Behandlung von Erkrankungen und Verletzungen der Koronararterien verwendet werden. Zum Beispiel können die multipotenten Stammzellen oder die Endothelprogenitorzellen im Anschluß an eine Angioplastie oder Rotablation direkt intrakoronar appliziert werden, um eine Reendothelialisierung der verletzten Koronarabschnitte zu beschleunigen und dadurch einer Restenose vorzubeugen. Diese Anwendung kann auch auf die Behandlung von Erkrankungen und Verletzungen von Arterien anderer Lokalisationen, wie zum Beispiel Gefäße der Extremitäten, übertragen werden, in dem die expandierten Stammzellen, die Endothelprogenitorzellen oder die reifen Endothelzellen direkt in das betroffene Gefäß injiziert werden .
Anwendung VI: Beschichtung von koronaren Stents
Ferner können die durch Differenzierung der multipotenten Stammzellen gewonnenen Endothelprogenitorzellen und reifen Endothelzellen für die Beschichtung von Koronarstents, die im Anschluß an eine Angioplastie oder Rotablation implantiert werden, verwendet werden, um einer Restenose vorzubeugen. Hierbei können die Endothelprogenitorzellen oder die reifen Endothelzellen entweder direkt auf die Stentoberflache oder auf Matrix-beschichtete Stents aufgebracht werden. Verschiedene Stentoberflachen können verwendet werden: Keramik, PTFE, Gold, Titan, u.s.w.. Die Matrix kann zum Beipiel aus Fibronectin, Collagen, Heparin, Gelatin, Fibrin, Silikon, Phosphorylcholin oder Matrigel bestehen. Die Matrix kann zusätzlich mit Antikörpern, die endothelzellspezifische oder progenitorzellspezifische Oberflächenantigene binden, gekoppelt sein. Folgende Antikörper können zum Einsatz kommen: Anti-CD7 MoAb, Anti-CD31-MoAb, Anti-CD34 MoAb, Anti-CD54 (ICAM-1) MoAb, Anti-CD62e MoAb (E-Selectin) , Anti-CD90 (Thy-1) MoAb, Anti-CD106 MoAb (VCAM-1) , Anti-CD114 (G-CSF-R) MoAb, Anti-CD116 (GM-CSF-R) MoAb, Anti-CD117 (c-kit) MoAb, Anti- CDwl23 (IL-3R α Chain) MoAb, Anti-CD127 (IL-7R) MoAb, Anti- AC133 MoAb, Anti-CD135 (Flk3/Flk2) MoAb, Anti-CD140b (PDGF-Rß) MoAb, Anti-CD144 (VE-Cadherin) MoAb, Anti-CD164 MoAb, Anti- CD172a MoAb, Anti-CD173 MoAb, Anti-CD174 MoAb, Anti-CD175
MoAb, Anti-CD176 MoAb, Anti-CD184 (CXCR4) MoAb, Anti-CD201
(Endothelial cell Protein C receptor) MoAb, Anti-CD202b (Tie-
2/Tek) MoAb, Anti-CD224 MoAb, Anti-CD227 (MUC-1) MoAb, Anti-
CD228 MoAb, Anti-CD243 (MDR-1) MoAb, Anti-EGF-R MoAb, Anti- FGF-R MoAb, Anti-P1H12 MoAb, Anti-KDR MoAb, Anti-BENE MoAb sowie Antikörper gegen Lektine. Die Endothelprogenitorzellen können für die Beschichtung genetisch unverändert oder gentransfiziert eingesetzt werden. Für die Transfektion können Gene, die für eine vasodilatatorische Substanz, wie zum Beispiel die NO-Synthase, kodieren oder Gene, die für eine antithrombotische Substanz, wie zum Beipiel Antithrombin III, kodieren, verwendet werden.
Anwendung VII: Beschichtung von Gefäßklappen
Eine weitere Verwendung der in Kultur gewonnenen Endothelprogenitorzellen und reifen Endothelzellen stellt die Beschichtung von biomechanischen Gefäßklappen des Herzens dar, um einer Thrombosierung von implantierten Gefäßklappen vorzubeugen. Gemäß den beiden vorgenannten Anwendungsbeispielen betrifft die Erfindung ferner Verfahren zur Beschichtung von implantierbarer Materialien, insbesondere koronarer Stents und Gefäßklappen, bei denen man das erfindungsgemäße zweistufige Expansions-/Differenzierungsverfahren durchführt und man bei endothelialer Differenzierung während der Phase II und/oder am Ende der Phase II (je nachdem, ob eine Beschichtung mit EPCs und/oder reifen ECs gewünscht ist) das zu implantierende Material, das vorzugsweise mit Fibronectin beschichtet ist, in das Kulturmedium überführt, in dem die Differenzierung der Zellen erfolgt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Stammzellen in Phase I gentransfiziert werden, so daß die Beschichtung mit gentransfizierten EPCs und/oder ECs erfolgt.
Anwendung VIII: Tissue Engineering von Organen
Ein mögliches Einsatzgebiet für die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen sowie für die endothelialen und mesenchymalen Progenitorzellen ist das Tissue Engineering. Die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen können genutzt werden, um in vitro organspezifisches Gewebe, wie zum Beispiel
Gehirn-, Leber-, Herz-, Knorpel-, Knochen-, Retina-, Muskel- oder Bindegewebe, herzustellen. Hierzu werden die Stammzellen in speziellen Basalmedien kultiviert. Für die Generierung neuronaler Zellen können zum Beispiel die Medien SATO Medium oder DMEM-F12 verwendet werden. Für die Herstellung von
Leberzellen können Medien wie zum Beispiel Williams Medium E verwendet werden. Die Kulturen können Serumzusätze enthalten.
Alternativ können serumfreie Kultursysteme verwendet werden.
Für die Induktion der neuronalen Differenzierung können die multipotenten Stammzellen in Gegenwart mindestens eines Wachstumsfaktors aus der Gruppe bestehend aus NGF, Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) , GDNF und BDNF sowie wahlweise in Kombination mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus EGF, bFGF, IGF-1, IL-lb, IL-6, IL-11, LIF, Flt3 Ligand, SCF und SCGF kultiviert werden.
Für das Tissue Engineering von Leberzellen können die multipotenten Stammzellen in Gegenwart von HGF sowie wahlweise in Kombination mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus EGF, IGF-1, Insulin, HCC, Keratinocyte Growth Factor, TNF-α, TGF-ß, Flt3 Ligand, SCF und SCGF kultiviert werden.
In Zusammenhang mit dem Tissue Engineering von Organen und Geweben können die folgenden Methoden zum Einsatz kommen: Leber (vgl. Torok et al., Dig. Surg. 18, 196 - 203, 2001),
Gehirn (vgl. Woerly S. Neurosurg. Rev. 23, 59 - 77, 2000;
Tresco PA. Prog. Brain Res. 128, 349 - 363, 2001), Herz (vgl.
Mann BK, West JL. Anat . Rec. 263, 367 - 371, 2001), Knorpel
(vgl. Laurencin et al . , Ann . Rev. Biomed. Eng. 1, 19 - 46, 1999; Lu et al . , Clin. Orthop. 391, S251 - 270; Gao et al . , Tissue Eng. 7, 363 - 371, 2001), Knochen (vgl. Doll et al . , Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 11, 173 - 198, 2001; Gao et al., Tissue Eng. 7, 363 - 371, 2001), Retina (vgl. Lu et al . , Biomaterials 22, 3345 - 55, 2001), Muskelgewebe (vgl. Polinkovic et al . , Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 11, 121 - 129, 2001), Bindegewebe (vgl. Pieper et al . , Biomaterials 21, 1689 - 1699, 2001), Haut (Houzelstein et al . , Development 127, 2155 - 64, 2000; Ng et al., Tissue Eng. 7, 441 - 455, 2001), Niere (vgl. Amiel et al . , World J. Urol . 18, 71 - 79, 2000; Poulson et al . , J. Pathol . 195, 229 -235, 2001). Bei der Etablierund der Gefäßversorgung in durch Tissue Engineering hergestellten Organen kann die Methode von Kaihara et al . (Tissue Eng. 6, 105 - 117, 2000) zum Einsatz kommen. Zur Erzeugung künstlicher Gewebe, insbesondere von Gehirn-, Leber-, Nieren-, Herz-, Knochen-, Retina-, Muskel- oder Bindegewebe oder Haut, kann man eine Matrix bereitstellen, die man mit den erfindungsgemäß expandierten multipotenten Stammzellen, Progenitorzellen und/oder ausdifferenzierten Zellen in Kontakt bringt. Das heißt, daß man diese Matrix in ein geeignetes Gefäß überführt und mit dem zellhaltigen Kulturmedium (vor oder während der Differenzierung der expandierten multipotenten Stammzellen) überschichtet. Unter dem Begriff „Matrix" wird in diesem Zusammenhang jedes geeignete Trägermaterial verstanden, an das sich die Zellen anlagern oder anheften können, um den entsprechenden Zellverbund, d.h. das künstliche Gewebe, zu bilden. Die Matrix bzw. das Trägermaterial liegt vorzugsweise bereits in einer für die spätere Anwendung gewünschten dreidimensionalen Form vor. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird als Matrix Rinderperikardgewebe verwendet, das mit Collagen vernetzt, dezellularisiert und photofixiert ist (CardioFix™, Sulzer Medica, Zürich, Schweiz) .
Anwendung IX: Tissue Engineering von Blutgefäßen
Die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen sowie die Endothelprogenitorzellen und reifen Endothelzellen können außerdem für die in vitro Herstellung von Blutgefäßen verwendet werden. Die in vitro generierten Blutgefäße können als vaskuläre Transplantate bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit oder peripheren arteriellen Gefäßverschlüssen implantiert werden und stellen eine Alternative zur Bypass- Operation und zur Implantation von künstlichen Gefäßprothesen dar.
Hinsichtlich des Verfahrens zur Erzeugung künstlicher Blutgefäße wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf die Ausführungen zur Erzeugung künstlicher Gewebe, insbesondere bezüglich der eingesetzten „Matrix", verwiesen. Die Matrix ist vorzugsweise bereits zylinderförmig vorgeformt.
Anwendung X: Blutgefäßneubildung in Organ- und Gewebetransplantaten
Die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen sowie die Endothelprogenitorzellen können ferner verwendet werden, um die Gefäßversorgung von Hauttranspantaten zu verbessern bzw. zu gewährleisten. Die Hauttransplantate können Mesh-grafts oder durch Tissue-Engineering hergestellte Hauttransplantate umfassen.
Außerdem können die ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen und die Endothelprogenitorzellen verwendet werden, um eine Gefäßversorgung von Organen oder Geweben, die durch Tissue Engineering herstellt wurden, zu gewährleisten. Die Organe oder Gewebe können z.B. Leber, Niere oder Knorpel umfassen. Durch Verwendung autologer multipotenter Stammzellen oder autologer Endothelprogenitorzellen können Gefäßsysteme individuell für den Patienten hergestellt werden, um möglicherweise einer Wirt-gegen-Transplantat-Reaktion (Transplantatabstoßung) vorzubeugen.
Im Hinblick auf die vorgenannten Verwendungen ist somit ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, bei dem man das erfindungsgemäße Verfahren zur Expansion multipotenter Stammzellen durchführt. Sofern zusätzlich oder anstelle der Stammzellen Progenitorzellen (z.B. Endothelprogenitorzellen) und/oder ausgereifte Zellen (z.B. reife Endothelzellen) verwendet werden sollen, kann sich erfindungsgemäß noch die Differenzierungsphase anschließen, so daß man zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung das zweistufige Expansions-/Differenzierungsverfahren durchführt, wobei man die Zellen je nach dem gewünschten Differenzierungsgrad während und/oder am Ende der Phase II isoliert. Die jeweils erhaltenen Zellen können direkt zur Therapie eingesetzt werden, vorzugsweise durch Aufnahme in 0,9 %iger Kochsalzlösung, oder, soweit erforderlich, anderweitig für die jeweilige Verabreichung aufbereitet. Dies schließt gegebenenfalls auch die radioaktive Markierung der Zellen ein.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann die pharmazeutische Zusammensetzung eine Mischung aus expandierten multipotenten Stammzellen und Endothelprogenitorzellen enthalten. Das Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung schließt daher gegebenenfalls die Durchführung des erfindungsgemäßen Expansions-/Differenzierungsverfahrens
(also Phase I und II) ein, wobei Zellen, die in Phase I erhalten werden, mit in Phase II isolierten EPCs kombiniert werden .
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung ferner eine Gentransfektion, d.h. das Einbringen von Fremdgenen in die multipotenten Stammzellen, einschließen, wobei die Gentransfektion im Rahmen des Expansionsverfahrens erfolgt (bzw. beim zweistufigen Verfahren während der Expansionsphase, Phase I) . Sofern man die genetisch veränderten multipotenten Stammzellen weiter ausdifferenziert, kann auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt werden, die sowohl gentransfizierte Stammzellen als auch gentransfizierte Progenitorzellen enthält. Erfindungsgemäß schließt der Begriff „pharmazeutische Zusammensetzung" sowohl Präparate für die therapeutische Anwendung als auch Mittel für diagnostische Zwecke ein.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der durch das erfindungsgemäße Expansionsverfahren und der durch das erfindungsgemäße zweistufige Expansions-/Differenzierungsverfahren erhaltenen Zellen (d.h. der multipotenten Stammzellen, Progenitorzellen und ausgereiften Zellen) zur Erzeugung künstlicher Organge und Gewebe, insbesondere von Gehirn-, Leber-, Nieren-, Herz-, Knorpel-, Knochen-, Retina-, Muskel- oder Bindegewebe oder Haut.
Gegenstand der Erfindung sind ferner die unter Verwendung der erfindungsgemäß erzeugten (bzw. die unter Verwendung der durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlichen) expandierten multipotenten Stammzellen, Progenitorzellen und/oder reifen Zellen hergestellten pharmazeutischen Zusammensetzungen, implantierbaren Materialien sowie künstlichen Organe und Gewebe, insbesondere einschließlich der Blutgefäße.
Vorteile der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Kultursystem, daß eine ex vivo Expansion von multipotenten humanen Stammzellen ermöglicht. Im Vergleich zu bisher beschriebenen Kultursystemen hat die vorliegende Erfindung den Vorteil, daß es während der Expansionsphase zu keiner bzw. zu keiner wesentlichen Differenzierung der Stammzellen kommt. Dadurch behalten die Stammzellen ihre regeneratorische Kapazität und können für autologe oder allogene Transplantationen bei Patienten bösartigen Erkrankungen zum Einsatz kommen. Ferner können sie für das Tissue Engineering verwendet werden. Die Erfindung zeichnet sich außerdem dadurch aus, dass die multipotenten Stammzellen unter den entwickelten Kulturbedingungen gentransfiziert werden können. Hierdurch ergeben sich neue Ansätze für Diagnostik und Therapie kardiovaskulärer und bösartiger Erkrankungen. Schließlich ermöglicht die Erfindung, dass in dem Kultursystem Endothelprogenitorzellen um das Hundertfache vermehrt werden können und damit Zellzahlen erreicht werden, wie sie für klinische Anwendungen notwendig sind. Dabei hat das Kultursystem den Vorteil, dass sowohl die multipotenten Stammzellen als auch die Endothelprogenitorzellen ohne großen apparativen Aufwand hergestellt werden können.
Wichtige Anwendungen der erfindungsgemäß expandierten und/oder differenzierten Stammzellen werden nachfolgend beispielhaft zusammengefaßt :
• Transplantation mit ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen • Transplantation mit ex vivo expandierten multipotenten Stammzellen + Endothelprogenitorzellen • Transplantation mit genetisch veränderten multipotenten Stammzellen mit folgendem Transgen:
Angiogenes inhibierendes Gen Blutgefäßneubildung förderndes Gen • Transplantation mit genetisch veränderten multipotenten Stammzellen zur Therapie von angeborenen Erkrankungen
• Diagnostik von Metastasen
• Diagnostik von Ischämien
• Blutgefäßneubildung in vivo • Reendothelialisierung von Gefäßen in vivo
• Tissue Engineering von Gehirn-, Leber-, Niere, Herz-, Knorpel-, Knochen-, Retina-, Muskel- oder Bindegewebe oder von Haut
• Erzeugung künstlicher Blutgefäße • Gefäßversorgung von Hauttransplantaten
• Gefäßversorgung von künstlich (durch Tissue Engineering) hergestellten Organen und Geweben.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben.
Beispiele
Die oben und in den nachfolgenden Beispielen genannten Substanzen, Wachstumsfaktoren und Antikörper sind entweder kommerziell erhältlich, oder sie können nach bekannten Methoden hergestellt bzw. erhalten werden. Eine Übersicht über die relevanten Publikationen ist im Anhang unter „Referenzen" angegeben.
Beispiel 1
Probenvorbereitung:
Für dieses Beispiel wurde ein kryokonserviertes Leukaphereseprodukt eines Patienten verwendet, der aufgrund einer bösartigen Erkrankung für eine Hochdosischemotherapie mit autologer Stammzelltransplantation vorgesehen war. Es können aber auch frische Leukaphereseprodukte oder G-CSF mobilisiertes, unpheresiertes Blut verarbeitet werden. Die kryokonservierte Probe wurde in einem ersten Schritt bei 37°C im Wasserbad aufgetaut und in einen Puffer, bestehend aus PBS, 0,5% HSA und 0,6% ACD-A überführt. Die Probe wurde dann für 15 Minuten bei 900 rpm und 4°C zentrifugiert . Das erhaltene Zellpellet wurde in PBS + 5% HSA resuspendiert. Anschließend wurde dieser PBS-Lösung DNAse (lOOU/ml) zugegeben und die Probe für 30 Minuten auf einem automatischen Mischer inkubiert.
Frische Leukaphereseprodukte und peripheres, unpheresiertes Blut können direkt der Dichte-Gradient-Zentrifugation zugeführt werden. Immunmagnetische AC133-Selektion:
Mittels Dichte-Gradient-Zentrifugation über Fikoll-Hypaque wurde die mononukleäre Zellfraktion (MNC) des Leukaphereseproduktes gewonnen. Dafür wurde die Probe für 20 Minuten bei 2000 rpm und 4°C zentrifugiert. Anschließend wurde die Probe zweimal für 10 Minuten bei 1200 rpm in PBS + 0,5% HSA + DNAse (100 U/ml) gewaschen. Die MNC wurden dann in PBS + 0,5 %HSA resuspendiert, mit AC133-konjugierten Microbeads (AC133 Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert und in PBS + 0,5% HSA für 10 Minuten bei 1200 rpm gewaschen. Die AC133-Selektion wurde dann am autoMACS (Miltenyi Biotec; Software-Programm Posseldx) durchgeführt. Im Anschluß an jede Selektion wurde der Reinheitsgrad mittels FACS-Analyse ermittelt.
Suspensionskulturen :
Die frisch isolierten AC133+ Zellen wurden in Fibronektin- beschichteten 24 Lochplatten bei einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml in IMDM + 10% FKS + 10% Pferdeserum + 10"6 mol/1 Hydrocortison kultiviert. Für die Expansion der AC133+ Zellen wurden dem Medium folgende rekombinante humaneWachstumsfaktoren zugegeben: SCGF (100 ng/ml; TEBU, Frankfurt), Flt3 Ligand (50 ng/ml; TEBU) und VEGF (50 ng/ml; TEBU) und die Zellen für 14 Tage bei 37°C in 5% C02 inkubiert. Für die Differenzierung der Stammzellen wurde das Medium mit SCGF (100 ng/ml) und VEGF (50 ng/ml) supplementiert und die Zellen für 14 Tage kultiviert. Zusätzliches Füttern der Kulturen wurde in Abhängigkeit von der Proliferation der Zellen durchgeführt. Dabei wurde der Überstand vorsichtig abpipettiert und durch frisches Medium ersetzt. Im Überstand enthaltene proliferierende Zellen wurden gezählt, auf eine Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml eingestellt und in frische Wells der Lochplatte eingebracht. Colony Assays
Frisch isolierte AC133+ Zellen sowie Zellen, die für 8 und 14 Tage expandiert wurden, wurden mit einer Zelldichte von 1 x 103 bis 5 x 104 in semisolides Medium eingebracht, das aus 0,9%
Methylcellulose in IMDM, 30% FKS, 1% Kälberserumalbumin, 10"4 mol/L Mercaptoethanol und 2 mmol/L L-Glutamin bestand
(komplettes Medium von Cell Systems, St. Katharinen) . In parallelen Ansätzen wurden die Kulturen entweder mit einer Kombination von hamatopoetischen Wachstumsfaktoren, bestehend aus SCF (50 ng/ml), IL-3 (20 ng/ml), IL-6 (20 ng/ml), G-CSF (20 ng/ml) , GM-CSF (20 ng/ml) und Erythropoetin (3 U/ml; komplettes Medium von Cell Systems) , oder mit der Kombination von SCGF (100 ng/ml, TEBU) und VEGF (50 ng/ml, TEBU) stimuliert. Alle Kulturen wurden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt, bei 37°C in 5% C02 inkubiert und nach 14 Tagen am Inversionsmikroskop ausgewertet.
Immunfärbung:
Frisch isolierte AC133+ Zellen und kultivierte Zellen wurden in einer Zytozentrifuge bei 500 rpm für 5 Minuten auf Objektträger zentrifugiert. Die Zytospins wurden für mindestens 24 Stunden luftgetrocknet und dann mittels Immunfluoreszenz gefärbt. Folgende primäre unkonjugierte und konjugierte Antikörper wurden verwendet: Anti-KDR-MoAb (Sigma) , Anti-Ulex Europaeus Agglutinin-1 MoAb, Anti-EN4 (Cell Systems), Anti-CD31-PE (Pharmingen, Hamburg), VE-Cadherin-PE (Pharmingen) und Anti-vWF-FITC . Als sekundärer Antikörper wurden Anti-Maus FITC-konjugierte Immunglobuline verwendet. Die Zytospins wurden zunächst in 10% FKS/PBS gewaschen, um unspezifische Bindungsstellen zu blocken. Dann wurden die Zytospins für 60 Minuten bei Raumtemperatur mit dem primären Antikörper inkubiert. Die Zytospins, die mit einem unkonjugierten Primärantikörper inkubiert wurden, wurden anschließend für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wurden die Zytospins für 15 Minuten bei -20°C mit 5%
Eisessig/Ethanol fixiert.
Durchflußzytometrie :
Die frisch isolierten AC133+ Zellen wurden zunächst mit einem hämolytischen Puffer (0,155 mol/L NH4C1, 0,012 mol/L NaHC03, 0,1 mmol/L EDTA, pH 7,2) inkubiert, um Erythrozyten zu lysieren. Zellen, die bereits kultiviert wurden, wurden direkt der Antikörper-Inkubation zugeführt. Jeweils 5 x 105 Zellen wurden mit den folgenden Antikörpern inkubiert: PE-anti-AC133 MoAb, FITC-anti-CD34 MoAb, PE-anti-CD33 MoAb, FITC-anti-CD105 MoAb, PE-anti-CDl4 MoAb, FITC-anti-CD45 MoAb, PE-anti-VE- Cadherin MoAb, FITC-anti-vWF MoAb, PE-anti-CD31 MoAb, PE-anti- c-kit MoAb, FITC-anti-CD90 MoAb und PE-anti-CD7 MoAb. Alle Inkubationen wurden für 15 Minuten bei 4°C durchgeführt. Dann wurden die Zellen in 0,1% BSA/PBS gewaschen. Die Messungen wurden als Einfarben- und Zweifarben-Analysen am FACS SCAN Durchflußzytometer (Becton Dickinson) und dem Software- Programm Cell Quest durchgeführt. Jede Analyse schloß mindestens 5000 Zählereignisse ein. Bei jeder Messung wurde eine Isotypen-Kontrolle (γlγ2a, Parmingen) mitgeführt.
Synthese der cDNA und Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) :
Frisch isolierte AC133+ Zellen sowie kultivierte Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und für 5 Minuten bei 1200 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Die Isolierung der RNA wurde mittels einer Mini-Säule (Rneasy Kit, Quiagen, Hilden) entsprechend der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Ein Mikrogramm der isolierten RNA wurde für die cDNA-Synthese eingesetzt. Die cDNA-Synthese erfolgte unter Verwendung von Avian Myeloblastosis virus (AMV) Reverse Transcriptase und Oligo dT als Primer.
Verschiedene Aliquots der cDNA wurden mittels spezifischer Primer für KDR, Tie-2/Tek, VE-Cadherin und vWF sowie für Aktin als Positivkontrolle amplifiziert . Für KDR, Tie-2/Tek, Ve- Cadherin und vWF wurden zwei Durchgänge und für Aktin wird ein Durchgang mit 35 Zyklen der PCR in einem programmierbaren Thermoblock bei 94°C für 1,5 Minuten, bei 60°C für 3 Minuten und bei 72°C für 4 Minuten durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf 1%-igem Agarose-Gel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und im UV-Licht dargestellt. Die Primer-Sequenzen waren wie folgt: äußerer KDR Sense Primer 5Λ- GTCAAGGGAAAGACTACGTTGG-3 \ äußerer KDR Antisense Primer 5λ- AGCAGTCCAGCATGGTCTG-3,, innerer KDR Sense Primer 5λ- CAGCTTCCAAGTGGCTAAGG-3λ, innerer KDR Antisense Primer 5λ- TCAAAAATTGTTTCTGGGGC-3 \ äußerer Tie-2/Tek Sense Primer 5λ- TGGACCTGTGAGACGTTC-3 äußerer Tie-2/Tek Antisense Primer 5 - CTCTAAATTTGACCTGGCAACC-3\ innerer Tie-2/Tek Sense Primer 5X- AGGCCAACAGCACAGTCAG-3 innerer Tie-2/Tek Antisense Primer 5Λ- GAATGTCACTAAGGGTCCAAGG-3Λ, äußerer VE-Cadherin Sense Primer 5,-TAGCATTGGATACTCCATCCG-3λ, äußerer VE-Cadherin Antisense Primer 5 λ-ATGACCACGGGTAGGAAGTG-3 λ , innerer VE-Cadherin Sense Primer 5 Λ-TTCCGAGTCACAAAAAAGGG-3 , innerer VE-Cadherin Antisense Primer 5 Λ-TATCGTGATTATCCGTGAGGG-3 , äußerer vWF Sense Primer 5 Λ-CTGCAAGGTCAATGAGAGAGAGG-3 λ , äußerer vWF Antisense Primer 5 λ-GAGAGCAGCAGGAGCACTG-3 Λ , innerer vWF Sense Primer 5 λ-TGAGGAGCCTGAGTGCAAC-3 Λ , innerer vWF Antisense Primer 5 ,-TGGAGTACATGGCTTTGCTGλ . Die spezifischen Primer für KDR, Tie-2/Tek, VE-Cadherin, vWF und Aktin erkennen kodierende Sequenzen. Die Größe der PCR-Produkte war wie folgt: für das äußere KDR Primerpaar 591 bp, für das innere KDR Primerpaar 213 bp, für das äußere Tie-2/Tek Primerpaar 624 bp, für das innere Tie-2/Tek Primerpaar 323 bp, für das äußere VE-Cadherin Primerpaar 462 bp, für das innere VE-Cadherin Primerpaar 340 bp, für das äußere vWF Primerpaar 312 bp, für das innere vWF Primerpaar 128 bp. Um Kreuzkontamination zu vermeiden, wurden die einzelnen Arbeitsschritte der PCR-Reaktion und Gel- Elektrophorese in verschiedenen Räumen unter Verwendung von verschiedenen Pipetten durchgeführt. Entsprechend waren mitgeführte Kontrollreaktionen stets negativ.
Ergebnisse von Beispiel 1:
Charakterisierung der frisch isolierten AC133+ Zellpopulation Die durchflußzytometrischen Analysen ergaben einen Reinheitsgrad von 99,94%. Die Gesamtpopulation der AC133+ Zellen coexprimierte die Oberflächenantigene CD34, CD45, CD33 und CD31. 42,3% der AC133+ Zellen coexprimierten CD90 (thy-1) , einen Oberflächenmarker, der nur auf sehr unreifen Stammzellen exprimiert wird. CD7 und c-kit, ebenfalls Marker für unreife Stammzellen, wurden von 15,23% und 6,86% der AC133+ Zellen exprimiert. Die Endothelzellmarker vWF und VE-Cadherin waren nur auf 1,43% und 0,36% der Zellen nachweisbar.
Proliferation und Differenzierung der AC133+ Zellen in Suspensionskultur :
Die AC133+ Zellen wurden zunächst für 14 Tage unter dem Einfluß von Flt3 Ligand, SCGF und VEGF expandiert. Bereits wenige Stunden nach Beginn der Kultur wurden die Zellen adhärent . Während der ersten vier Kulturtage formten die Zellen einen Monolayer aus kleinen runden Zellen. Dabei nahm die Zelldichte von Tag zu Tag deutlich zu. Am Tag 5 der Kulturperiode fand sich dann eine nicht-adhärente Zellschicht von kleinen runden Zellen, die sich oberhalb der adhärenten Zellschicht gebildet hatte. Die nicht-adhärente Zellschicht wurde vorsichtig abpipettiert, gezählt und frische Löcher der Lochplatte eingebracht. Dieser Vorgang konnte nun wiederholt werden, die Zellen proliferierten kontinuierlich. Am Tag 14 der Kulturperiode wurde eine Vermehrung der Zellen um das 100- fache erreicht. Die Morphologie änderte sich während der gesamten Zeit nur wenig. Am Tag 14 hatten die Zellen einen größeren Durchmesser und wiesen eine „cobble-stone" Morphologie auf. Ab Tag 14 wurden die Zellen in ein Medium überführt, das die Wachstumsfaktoren SCGF und VEGF enthielt. Innerhalb von drei bis vier Tagen ließ die Proliferation deutlich nach, und die Zellen wiesen erste morphologische Differenzierungsmerkmale auf, wie sie für Endothelzellen typisch ist. Es fanden sich zunächst kleine längliche Zellen, die sehr flach wuchsen. Nach 14-tägiger Kultur in dem Differenzierungsmedium bestand die Zellpopulation überwiegend aus großen spindelförmigen Zellen mit typischer Endothelzell- Morphologie.
Clonogenes Potential der frisch isolierten AC133+ Zellen und der Zellen in Kultur:
Die frisch isolierten AC133+ Zellen und Zellen, die für 14 Tage expandiert wurden, wurden in semisolides Medium eingebracht, das entweder hämatopoetische Wachstumsfaktoren zwecks Stimulation von hamatopoetischen Kolonien oder die Zytokine SCGF und VEGF zwecks Induktion von endothelialen Kolonien enthielt. Wie die Tabelle 1 zeigt, wiesen die Zellen, die bereits für 14 Tage in Suspensionskulturen expandiert worden waren, immer noch clonogenes Potential auf. Im Vergleich zu frisch isolierten AC133+ Zellen waren diese Zellen zwar nicht mehr in der Lage, BFU-E und CFU-E zu bilden, dafür hatten sie eine höhere Kapazität, endotheliale Kolonien zu bilden.
Figure imgf000041_0001
Tabelle 1: Clonogenes Potential der frisch isolierten AC133+ Zellen und der kultivierten Zellen. Abkürzungen: BFU-E = burst-forming unit erythrocyte; CFU-E = colony-forming unit erythrocyte; CFU-GEMM = colony-forming unit granulocyte- erythrocyte-macrophage-megakaryocyte; CFU-GM = colony-forming unit granulocyte-macrophage; CFU-G = colony-forming unit granulocyte; CFU-M = colony-forming unit macrophage; CFU-EC = colony-forming unit endothelial cell.
Identifizierung der Endothelzellen:
Um Zellen der endothelialen Zellreihe zu identifizieren, wurde die Expression der Endothelzellmarker CD31, vWF, VE-Cadherin, Ulex europaeus agglutinin-1, Tie-2/Tek und KDR mittels Immunfärbung und RT-PCR untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und Tabelle 3 dargestellt.
Figure imgf000041_0002
Tabelle 2 : Prozentzahlen positiver Zellen für CD31, vWF, VE- Cadherin und Ulex europaeus agglutinin-1 mittels Immunfluoreszenzfärbung.
Figure imgf000042_0001
Tabelle 3: Genexpressionsanalyse der frisch isolierten AC133+ Zellen und der kultivierten Zellen mittels RT-PCR.
Beispiel 2
In vivo Studien mit gentransfizierten AC133+ Zellen
In diesem Beispiel wurden die AC133+ Zellen zunächst für 4 Tage bei einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml in IMDM + 10% FKS + 10% Pferdeserum + 10~6 mol/1 Hydrocortison + Flt3 Ligand (50 ng/ml) + SCGF (100 ng/ml) + VEGF (50 ng/ml) kultiviert. Am Tag 5, 6 und 7 der Kulturperiode wurden die AC133 + Zellen mit dem retroviralen Vector SFllαEGFPrev, der für das enhanced Green Fluorescence Protein kodiert, transfiziert . Dazu wurden zunächst 6-Lochplatten mit dem rekombinanten Fibronectin- Fragment CH296 (RN, vgl. z.B. R. Kapur et al . , Blood 97 (2001) 1975-81; Takara, Otsu, Japan) beschichtet. Anschließend wurden 2,5 ml/Loch des retroviralen Überstandes, der zuvor in Kulturen der Zellreihe PG13 gewonnen wurde, für 30 Minuten bei 1000g und 4°C auf die RN-beschichteten Lochplatten zentrifugiert. Um die Lochplatten maximal mit retroviralen Partikeln zu beladen, wurde der Zentrifugationsvorgang viermal wiederholt. Dann wurden die AC133+ Zellen in die RN- beschichteten und mit Viruspartikeln beladenen Lochplatten eingebracht und bei einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml in dem oben beschriebenen Kulturmedium über Nacht inkubiert. Der Transfektionsvorgang in den nächsten 4 aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt. Dabei wurde jeweils zu Beginn der Transfektion eine frische 6-Lochplatte mit RN beschichtet und mittels 5 Zentrifugationsschritten, wie oben beschrieben, mit retroviralen Partikeln beladen, und die Transfektion über Nacht durchgeführt. Auf diese Weise wurde eine Transduktionseffizienz von 70 % erreicht. Die transfizierten Zellen wurden dann in frischen Fibronectin-beschichteten 6- Lochplatten, die nicht mit viralen Partikeln beladen waren, für weitere 48 Stunden in dem oben genannten Medium unter dem Einfluß von Flt3 Ligand, SCGF und VEGF kultiviert. Am Tag 9 der Kulturperiode wurden die Zellen trypsiniert, gewaschen, in 100 μl PBS/1 x 106 Zellen resuspendiert und SCID Mäusen subkutan injiziert. Dabei wurden drei verschiedene Versuchsgruppen mit jeweils zehn Mäusen gebildet. In der Gruppe I wurde pro Maus eine Suspension von 1 x 106 gentransfizierten Zellen plus 1 x 106 Zellen der Lungenkarzinomzelllinie A549 injiziert. Die Versuchstiere der Gruppe II erhielten ausschließlich 1 x 106 gentransfizierte Zellen, während in der Gruppe III ausschließlich 1 x 106 A549- Zellen subkutan appliziert wurden. Vier Wochen nach der Injektion wurden Tumorgröße und -aufbau aller Versuchstiere analysiert.
Subkutane Tumoren fanden sich bei allen Mäusen der Gruppe I und der Gruppe III, während keines der Tiere in Gruppe II einen subkutanen Tumor ausgebildet hatte. Die größten Tumoren waren bei den Mäusen der Gruppe I nachweisbar. Hier lag der Tumordurchmesser durchschnittlich 30% über dem der Tumoren in Gruppe III. In Gefrierschnittpräparaten wiesen ferner die Tumoren der Gruppe I eine höhere Gefäßdichte als die der Gruppe III auf. Mittels Fluoreszenzmikroskop wurde der Gehalt der Tumoren an EGFP-exprimierenden Zellen untersucht. In den Tumoren der Gruppe I konnten dabei grünfluoresziierende Zellen in den Gefäßen nachgewiesen werden. Beispiel 3
In vitro Differenzierung von Leberzellen aus AC133+ Zellen
In diesem Beispiel wurden die AC133+ Zellen bei einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml in Williams Medium E + 10% FKS + 10% Pferdeserum + 5 x 10"6 mol/L Hydrocortison + Flt3 Ligand (50 ng/ml) + SCF (100 ng/ml) + HGF (50 ng/ml) + TGF-ß (10 ng/ml) in Collagen-beschichteten Lochplatten kultiviert. Nach 14 Tagen wurden die Zellen trypsiniert und immunzytochemisch analysiert. Hierbei waren 70% der Zellen positiv für den Hepatozytenmarker OCH1E5 (DAKO) . 20 % exprimierten den biliären Zellmarker Zytokeratin-19 (CK-19 (DAKO) .
Beispiel 4
In vitro Differenzierung von neuronalen Zellen aus AC133+ Zellen
In diesem Beispiel wurden die AC133+ Zellen bei einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml in DMEM/F-12 (1:1) + 5 x 10"3 mol/L Hepes Puffer + 0,6% Glukose + 3 x 10-3 mol/L
Natriumbikarbonat + 2 x 10"3 mol/L Glutamin + 25 μg/ml Insulin
+ 100 μg/ml Transferrin + 50 ng/ml BDNF + 50 ng/ml GDNF + EGF
(20 ng/ml) + bFGF (20 ng/ml) in unbeschichteten Lochplatten kultiviert. Nach 14 Tagen wurden die Zellen immunzytochemisch analysiert. Hierbei waren 62% der Zellen positiv für den Marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP; Incstar, Stillwater, MN, USA) , 7% der Zellen exprimierte das Microtubule-Associated Protein-2 (MAP-2; Boehringer Mannheim) , und 3% der Zellen waren positiv für den Oligidendrozytenmarker
04 (Boehringer Mannheim) .
Beispiel 5
Stentbeschichtung mit gentransfizierten Endothelprogenitorzellen
In diesem Beispiel wurden die AC133+ Zellen für 4 Tage bei einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml in IMDM + 10% FKS + 10% Pferdeserum + 10"6 mol/1 Hydrocortison + Flt3 Ligand (50 ng/ml) + SCGF (100 ng/ml) + VEGF (50 ng/ml) kultiviert und anschließend wie oben beschrieben mit retroviralen Vector SFllαEGFPrev gentransfiziert. Nach erneuter Kultur in IMDM, Flt3 Ligand, SCGF und VEGF wurden die Zellen am Tag 9 der Kulturperiode trypsiniert, in PBS gewaschen und erneut in Kulturmedium aufgenommen. Parallel dazu wurden PTFE-Stents für 2 Stunden mit Fibronectin beschichtet. Dann wurden die beschichteten Stents in ein Zentrifugenröhrchen transferriert und mit 3 ml des Zellhaltigen Kulturmediums überschichtet. Die so präparierten Röhrchen wurden danach für 2 Stunden bei 12 x g und 37°C zentrifugiert. Anschließlich wurden die beschichteten Stents vorsichtig in eine 25 cm2 Kulturflasche mit 10 ml des oben genannten Kulturmediums überführt und nach definierten Zeitpunkten am Inversionsfluoreszezmikroskop analysiert. Noch nach 1 Woche war eine konfluente Beschichtung mit fluoreszierenden Zellen auf dem Stent nachweisbar.
Beispiel 6
Beschichtung von biomechanischen Gefäßklappen des Herzens mit gentransfizierten Endothelprogenitorzellen Analog zu dem oben genannten Beispiel wurden die AC133+ Zellen zunächst für 4 Tage bei einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml in IMDM + 10% FKS + 10% Pferdeserum + 10"6 mol/1 Hydrocortison + Flt3 Ligand (50 ng/ml) + SCGF (100 ng/ml) + VEGF (50 ng/ml) kultiviert und anschließend wie oben beschrieben mit retroviralen Vector SFllαEGFPrev gentransfiziert. Anschließend wurden die Zellen erneut in IMDM, Flt3 Ligand, SCGF und VEGF und ab Tag 15 der Kulturperiode in IMDM , SCGF und VEGF kultiviert. Am Tag 28 der Kulturperiode wurden die Zellen trypsiniert, in PBS gewaschen und erneut in Kulturmedium aufgenommen. Parallel dazu wurden Gefäßklappen für 2 Stunden mit Fibronectin beschichtet und danach in eine 75 cm2 Kulturflasche eingebracht. In horizontaler Position wurden dann 250 ml des zellhaltigen Kulturmediums in die Kulturflasche pipettiert, so daß die Gefäßklappen vollständig vom Medium umgeben waren. Die Kulturflaschen wurden danach für 24 Stunden auf einem automatischen Mischer langsam geschwenkt. Der automatische Mischer wurde dabei in einen Inkubator plaziert und die Kulturflaschen bei 37°C und 5 % C02 inkubiert. Danach wurden die Kulturflaschen vom Mischer entfernt, das Kulturmedium zur Hälfte abpipettiert und durch frisches Medium ersetzt. Die Beschichtung der Gefäßklappen wurde an definierten Zeitpunkten am Inversionsfluoreszenzmikroskop analysiert. Auch in diesem Beispiel war noch nach 1 Woche eine konfluente Schicht fluoreszierender Zellen auf den Gefäßklappen nachweisbar.
Beispiel 7
Herstellung von Blutgefäßen aus Endothelprogenitorzellen in vitro
In diesem Beispiel wurden die AC133+ Zellen für 14 Tage bei einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml in IMDM + 10% FKS + 10% Pferdeserum + 10"6 mol/1 Hydrocortison + Flt3 Ligand (50 ng/ml)
+ SCGF (100 ng/ml) + VEGF (50 ng/ml) und anschließend für weitere 4 Tage kultiviert unter dem Einfluß von SCGF und VEGF kultiviert. Dann wurden die Zellen trypsiniert, in PBS gewaschen und erneut in Kulturmedium aufgenommen. Parallel dazu wurde ein 2 x 1 cm langes Stück eines speziellen
Rinderperikardgewebes, das mit Collagen vernetzt, dezellularisiert und photofixiert ist (CardioFix™, Sulzer
Medica, Zürich, Schweiz) , vorbereitet und zu einem Zylinder geformt. Diese Zylinder wurden dann in ein Zentrifugenröhrchen transferriert und mit 3 ml des zellhaltigen Kulturmediums überschichtet. Dem Kulturmedium, das bereits SCGF und VEGF enthielt, wurde außerdem bFGF (10 ng/ml) zugesetzt. Die so präparierten Röhrchen wurden danach für 6 Stunden bei 12g und 37°C zentrifugiert. Anschließlich wurden die beschichteten CardioFix-Zylinder vorsichtig in eine 25 cm2 Kulturflasche mit 10 ml IMDM + 10% FKS + 10% Pferdeserum + 10"6 mol/1 Hydrocortison + VEGF (50 ng/ml) + bFGF (10 ng/ml) + IGF-1 (10 ng/ml) überführt und für 8 Wochen kultiviert. Dann wurden die Zylinder immunhistochemisch analysiert. Dabei fand sich ein konfluenter Monolayer von Zellen mit Endothelzellmorphologie, die immunhistochemisch positiv für vWF und VE-Cadherin waren.
Beispiel 8
Diagnostik von Metastasen mittels radioaktiv markierten Endothelprogenitorzellen
In diesem Beispiel wurden die AC133+ Zellen für 14 Tage bei einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen/ml in IMDM + 10% FKS + 10% Pferdeserum + 10"6 mol/1 Hydrocortison + Flt3 Ligand (50 ng/ml) + SCGF (100 ng/ml) + VEGF (50 ng/ml) und anschließend für weitere 4 Tage kultiviert unter dem Einfluß von SCGF und VEGF kultiviert. Dann wurden die Zellen trypsiniert, in PBS gewaschen und erneut in Kulturmedium aufgenommen. Dabei wurde das Medium mit 20 U/ml Heparin supplementiert und die Zellen für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde dem Medium 50 MBq 18F-Fluorodeoxyglukose zugegeben und Zellen für weitere 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Markierungsreaktion durch Zugabe von PBS gestoppt. Die Zellen wurden für 10 Minuten bei 450g zentrifugiert, zweimal in PBS gewaschen und in 100 μl/2 x 108 Zellen 0,9 %-ige NaCl-Lösung resuspendiert. Anschließend wurden die radioaktiv markierten Zellen tumortragenden Nacktratten in die Schwanzvene injiziert. Dabei erhielt jedes Tier 2 x 108 markierte Zellen. Die Messung der Tiere erfolgte 30, 60, 90 und 120 Minuten mittels Positron Emissions Tomographie. Dabei zeigte sich eine maximale Anreicherung der markierten Zellen im Tumorgewebe nach 90 Minuten.
Verwendete Abkürzungen:
SCGF Stem Cell Growth Factor
SCF Stem Cell Factor
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor; erfindungsgemäß ist die Verwendung der Isoformen A, B, C und/oder D eingeschlossen.
EGF Epidermal Growth Factor
aFGF acidic Fibroblast Growth Factor
bFGF basic Fibroblast Growth Factor
IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1
NGF Nerve Growth Factor
TGF-ßl Transforming Growth Factor-ßl
Flt3 Ligand Fetal liver Tyrosine Kinase 3 Ligand
G-CSF Granulocyte Colony-Stimulating Factor
GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor
M-CSF Macrophage Colony-Stimulating Factor
CTNF Ciliary Neurotrophic Factor
KGF Keratinocyte Growth Factor
IL-1, -3, -6, -11 Interleukin-1, -3, -6, -11
P1GF Placenta-like Growth Factor
TNFα Tumor Necrosis Factor α
PD-ECGF Platelet-Derived Endothelial-Cell Growth Factor
TPO Thrombopoietin
EPO Erythropoietin
AP-1, -2 Angiopoietin-1, -2
LIF Leukemia Inhibitoring Factor
ECGS Endothelial Cell Growth Supplement CEACAM CEA-related Cell Adhesion Molecule
HGF Hepatocyte Growth Factor
GDNF Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor
BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor
PDGF-BB Platelet-Derived Growth Factor-BB
BMP-4 Bone Morphogenetic Protein-4
IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
MEM Minimum Essential Medium
RPMI RPMI 1640 Medium
EGM-2 Endothelial Growth Medium-2
GFP Green Fluorescent Protein
DMSO Dirnethylsulfoxid
HSA Humanes Serumalbumin
FBS Fötales Kälberserum
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Elektroporation

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur in vitro Expansion multipotenter Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man multipotente Stammzellen in Gegenwart von Flt3-Ligand und mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend aus SCF, SCGF, VEGF, bFGF, Insulin, NGF und TGF-ß kultiviert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Wachstumsfaktoren verwendet:
a) Flt3-Ligand und VEGF, b) Flt3-Ligand, SCGF und VEGF, c) Flt3-Ligand und EGF, d) Flt3-Ligand, EGF und bFGF.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich IGF-1 und/oder EGF verwendet.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die multipotenten Stammzellen während der Expansion gentransfiziert.
5. Verfahren zur in vitro Expansion und Differenzierung multipotenter Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) in einer ersten Phase zur Expansion multipotenter Stammzellen ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4 durchführt und man
b) die expandierten Zellen in einer zweiten Phase differenziert, wobei man die Zellen (i) zur hamatopoetischen Differenzierung in Gegenwart von G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, TPO und/oder EPO kultiviert,
(ii) zur endothelialen Differenzierung in Gegenwart von VEGF, aFGF, bFGF, ECGS, AP-1, AP-2, NGF, CEACAM, Pleiotrophin, Angiogenin, P1GF, und/oder HGF kultiviert,
(iii) zur mesenchymalen Differenzierung in Gegenwart von PDGF-BB, TGF-ß und/oder BMP-4 kultiviert,
(iv) zur neuronalen Differenzierung in Gegenwart von NGF, CNTF, GDNF und/oder BDNF kultiviert, oder
(v) zur hepatozytären Differenzierung in Gegenwart von HGF kultiviert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man
(i) zur hamatopoetischen Differenzierung ferner IL-1, SCF und/oder SCGF zusetzt,
(ii) zur endothelialen Differenzierung ferner LIF,
EGF, IGF-1, PDGF, PDECGF, TGFα, TGFß, TNFα,
Oestrogen, Proliferin, IL-3, G-CSF, GM-CSF, EPO SCF und/oder SCGF zusetzt,
(iii) zur mesenchymalen Differenzierung ferner EGF, aFGF, bFGF, IGF-1, SCF und/oder SCGF zusetzt,
(iv) zur neuronalen Differenzierung ferner EGF, bFGF, IGF-1, IL-lb, 11-6, 11-11, LIF, Flt3 Ligand, SCF und/oder BMP-4 zusetzt, oder (v) zur hepatozytären Differenzierung ferner EGF, IGF-1, Insulin, HCG, KGF, TNF-α, Flt3 Ligand, SCF und/oder SCGF zusetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in der zweiten Phase
(i) zur hamatopoetischen Differenzierung eine Kombination von SCF, IL-3, IL-6, G-SCF, GM-CSF und EPO verwendet, man
(ii) zur endothelialen Differenzierung eine Kombination von SCGF und VEGF verwendet,
(iii) zur mesenchymalen Differenzierung eine Kombination aus EGF, PDGF-BB, IGF-1, bFGF und BMP-4 verwendet,
(iv) zur neuronalen Differenzierung eine Kombination aus BDNF, GDNF, EGF und bFGF verwendet oder man
(v) zur hepatozytären Differenzierung eine Kombination aus Flt3 Ligand, SCF, HGF und TGF-ß verwendet .
8. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4 durchführt und man die erhaltenen multipotenten Stammzellen zur Verabreichung aufbereitet .
9. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7 durchführt, wobei man Progenitorzellen und/oder ausgereifte Zellen isoliert und man die erhaltenen Zellen zur Verabreichung aufbereitet.
10. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4 durchführt und man
b) ein Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7 durchführt, bei dem man entweder Progenitorzellen und/oder ausgereifte Zellen isoliert,
wobei man die in a) und b) erhaltenen Zellen mischt und zur Verabreichung aufbereitet.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen radioaktiv markiert.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen in 0,9 %iger Kochsalzlösung aufnimmt.
13. Verfahren zur Beschichtung implantierbarer Materialien, bei dem man ein Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7 unter endothelialer Differenzierung der Zellen durchführt, wobei man das zu implantierende Material während und/oder am Ende der Differenzierungsphase in das zellhaltige Kulturmedium, in dem die Differenzierung der Zellen erfolgt, einbringt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das implantierbaren Materialien mit Fibronectin beschichtet sind.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die implantierbaren Materialien koronare Stents oder Gefäßklappen sind.
16. Verwendung der nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 7 erhaltenen Zellen zur Erzeugung künstlicher Gewebe.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe Gehirn-, Leber-, Nieren-, Herz-, Knorpel-, Knochen-, Retina-, Muskel- oder Bindegewebe oder Haut ist.
18. Verfahren zur Erzeugung künstlicher Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7 durchführt und man die expandierten Zellen vor oder während der Differenzierung mit einer Matrix in Kontakt bringt, an das sich die Zellen anlagern können.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren unter endothelialer oder mesenchymaler Differenzierung durchführt und man die Matrix während der Differenzierungsphase mit endothelialen oder mesenchymalen Progenitorzellen in Kontakt bringt.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe Gehirn-, Leber-, Nieren-, Herz-, Knorpel-, Knochen-, Retina-, Muskel- oder Bindegewebe oder Haut ist.
21. Verfahren zur Erzeugung künstlicher Blutgefäße, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Verfahren nach Anspruch 18 unter endothelialer Differenzierung durchführt und man die Zellen mit einer zylinderförmigen Matrix in Kontakt bringt.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, die durch ein Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 12 erhalten ist.
23. Implantierbares Material, das durch ein Verfahren nach Anspruch 13 oder 14 erhalten ist.
24. Implantierbares Material nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es ein koronarer Stent oder eine Gefäßklappe ist.
25. Künstliches Gewebe, das durch Verwendung der nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 7 erhaltenen Zellen hergestellt ist.
26. Künstliches Gewebe, das durch ein Verfahren nach Anspruch 18 oder 19 erhalten ist.
27. Künstliches Gewebe nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß es Gehirn-, Leber-, Nieren-, Herz-, Knorpel-, Retina-, Muskel- oder Bindegewebe oder Haut ist.
28. Künstliches Blutgefäß, das durch das Verfahren nach Anspruch 21 erhalten ist.
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