WO2003044195A1 - Procede d'amplification de fragment d'acide nucleique monocatenaire cible - Google Patents

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WO2003044195A1
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Akio Yamane
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Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the two primers work in much the same way, producing double-stranded DNA as an amplification.
  • the reaction conditions are changed to conditions suitable for the higher Tm. From this stage, the primer with the lower Tm stops working, and only the extension reaction from the primer with the higher Tm proceeds. This can result in excessive generation of extension products from the primer with the higher Tm.
  • FIG. 5 shows the results of analysis by 12% polyacrylamide gel electrophoresis in Example 2.
  • the asymmetric PCR (asymmetric PCR) method is an excellent method in terms of simplification of genetic testing.
  • the method of changing the amount of primer or the method of inhibiting one of the primer reactions is to make sure that the amount of each strand of the product double-stranded DNA is not equivalent. Is possible, but the resulting strands serve as templates for the next reaction, and as described above, the amount of genes in the sample may directly affect amplification efficiency. It is. Therefore, it is considered that such a problem can be overcome by a system in which the excessively formed chain does not serve as a template for the next reaction.
  • some of the DNA polymerases used in amplification reactions have the property of strand displacement (e.g., Hamilton et. Al. Biotechniq). ues 31, 370-383 (2001)).
  • strand displacement e.g., Hamilton et. Al. Biotechniq. ues 31, 370-383 (2001)
  • the extension reaction according to the template can proceed while unwinding the strand. Therefore, if two primers are set adjacent to each other on one strand of the gene fragment to be amplified, the extension product from the downstream primer is released by the extension reaction from the upstream primer, and the excess It can be produced as strand DNA.
  • both the extension product from the upstream primer and the extension product from the downstream can serve as a template for the other primer. Therefore, if the operation of amplifying the strand is continued as it is, the quantitative difference between the complementary strands will be resolved.
  • one strand of a complementary strand generated by a nucleic acid amplification reaction forms a loop structure (or sometimes referred to as a stem-loop structure), whereby this strand is subjected to a subsequent elongation reaction. 'So that it does not become a template. Therefore, by performing this method in accordance with the gene amplification method, those that do not serve as a template for the subsequent extension reaction are accumulated, and it is possible to overamplify only one of the complementary strands. The amount of excess strand thus generated is linked to the degree of nucleic acid amplification, and the excess strand obtained does not affect the nucleic acid amplification reaction itself.
  • the amplification product is denatured. It is possible to perform the hybridization without the need. Furthermore, when the probe is immobilized on a carrier, it is often difficult to make the probe overwhelmingly excessively present in the sample. It is conceivable that the efficiency of the zone decreases. However, when the single-stranded DNA produced according to the present invention is used as a sample, it is difficult to achieve an efficient hybridization because there is almost no competition for hybridization with the probe. it can.
  • the pyrosequencing method (Ahmadian et.al. Anal. Biochem. 280 3 103-110 (2000)), in which sequencing is performed by extending several bases, or SBE, which detects SNPs by extending only one base
  • SBE sequencing is performed by extending several bases
  • SBE which detects SNPs by extending only one base
  • the method according to the present invention can be effectively applied to the template of the method (Chen et. Al. Genome Research 9, 492-498 (1999)).
  • a nucleic acid fragment that is used as a target for nucleic acid amplification may be either DNA or RNA, and may be single-stranded or double-stranded.
  • the nucleic acid is RNA
  • complementary DNA may be synthesized from RNA using reverse transcriptase activity of reverse transcriptase or reverse transcriptase of DNA polymerase.
  • the nucleic acid containing the target nucleic acid fragment may be single-stranded or double-stranded at the beginning of the amplification reaction.
  • the single-stranded target nucleic acid can be synthesized according to the gene amplification method.
  • gene amplification methods include various conventional methods for performing exponential amplification reactions, such as the PCR, SDA, LAMP, ICAN, RCA, NASBA, and TMA methods. Methods selected from the group are mentioned.
  • the NASBA method or the TMA method can obtain double-stranded DNA and single-stranded RNA as an amplified product, but when single-stranded DNA is required, the method according to the present invention can be applied.
  • a plurality of types of primers are used, but it is preferable that three or more types of primers are used.
  • at least one of the primers used is such that the single-stranded nucleic acid fragment synthesized thereby forms a loop structure in the molecule of the nucleic acid fragment, and the nucleic acid fragment becomes type II. This prevents the progress of the extension reaction by other primers.
  • it is more preferable to use at least three types of primers such as the following (i) to (iii):
  • the amplification reaction may be carried out by preparing the primers 1 and 3 in excess in the primer 2 in advance.
  • the two or more types of primers for the same strand described above may be ones that bind to different template molecules to promote the extension reaction, or may be ones that bind to the same molecule.
  • the primers large excess (1 0 9-1 0 1 2 times) there is likely to be the latter situation with respect template in the initial stage of the reaction in a nucleic acid amplification reaction .
  • the use of a DNA polymerase that has the property of unfolding double-stranded DNA existing downstream in the direction of extension (strand displacement activity) as the DNA polymerase that performs the primer-elongation reaction will improve the efficiency of the reaction. It is thought that it can be advanced.
  • E. coli DNA polymerase III holoen zyme is known to exhibit strand displacement activity in the presence of SSB protein.
  • the extension reaction of the primer can be performed using DNA polymerase, but when RNA is used as a template, an RNA polymerase (Rodriguez-Wells et al.) That performs an extension reaction from an RNA primer is used. al. Nucleic Acids Res. 29, 2715-Z724 (2001)) can also be used.
  • DNA polymerase Even if a known DNA polymerase whose activity is not clear, it is considered that there is a known DNA polymerase having the above activity due to structural similarity. Such a DNA polymerase can also be used in the present invention. Such DNA polymerases include those used as appropriate for various gene amplification reactions.
  • PCR method when the PCR method is used as a gene amplification method to which the method of the present invention is applied, heat-denaturation at a high temperature is required, so that highly heat-resistant Thermococcus litoral is DNA polymerase, PCR The most commonly used method, Thennus thermophilus DNA polymerase or helicase, can be used in the presence of the appropriate protein.
  • an isothermal amplification method such as the LAMP method or the ICAN method
  • moderately heat-resistant Bacillus Stearothemophilus polymerase I or the like can be suitably used.
  • Bacteriophage phi 29 DNA polymerase can be suitably used. That is, in the present invention, the DNA polymerase to be used is appropriately selected depending on the gene amplification method to be applied. You can choose any.
  • the buffer and the substrate used in the reaction can be directly used in the reaction depending on the gene amplification method to be applied.
  • At least one of the primers used in the present invention is such that a single-stranded nucleic acid fragment synthesized thereby forms a loop structure, and the loop structure forms the nucleic acid fragment. It suppresses the extension reaction caused by other primers used as templates. That is, the extension product of the primer in the present invention forms a loop structure in the molecule, whereby the extension product does not substantially become a template in the next step. .
  • a primer for synthesizing an extension product capable of forming such a loop structure in the present invention can be set, for example, as follows.
  • a portion forming the stem structure of the stem 'loop structure is inserted into the 5th side of the primer while the 3rd side of the extension product generated from the primer is inserted into the other side.
  • the primer in the present invention is designed to form a triple strand between the portion complementary to the primer and the stem portion.
  • This extension product is composed of a single-stranded loop and a triple-stranded stem, and the primer binding portion is expected to inhibit the primer-elongation reaction due to the triple-stranded portion (Hacia et. al. Biochemistry 24, 6192-6200 (1994)). This can prevent the extension product obtained by this primer from becoming a template in the next step.
  • a protein that specifically binds to the base sequence on the 3 ′ side of the extension product generated from the primer is introduced into the 5 ′ side of the primer.
  • the resulting extension product has a 5′-end and a 3′-end molecularly linked to form a loop structure, so that the extension reaction of another primer acts on this extension product. Can be prevented.
  • a primer for synthesizing a single-stranded nucleic acid fragment capable of forming a loop structure is complementary to the primer on the 5 ′ end side in a strand that hybridizes with the primer. Sequence at the end of the chain 5 from a region A nucleic acid portion selected from the above, and the sequence of the nucleic acid portion is entirely or partially identical to the sequence of a bramer that hybridizes with the other strand.
  • Another primer 12 complementary to the extension product and a nucleic acid part partially or wholly complementary are added (see FIG. 2).
  • the extension product of the primer 3 has a stem-repe structure formed between the single-stranded loop portion, the sequence added to the primer, and the third side (see FIG. 2 (C)).
  • the part where the primers are complementary is protected by the stem structure, preventing the binding of other primers.
  • the method of blocking the binding of primers using such a stem structure is used for another purpose and is known to function (Siebert et.al. Nucleic Acids Res. 23, 1087-1088 ( 1995)).
  • the sequence added to the 5 ′ side of the primer 3 competes with the original amplification reaction in the binding reaction between the primer 12 and the template.
  • the extension product generated from primer 3 can be stabilized using a different moiety than the one to which primer 12 is complementary. It is generally known that the intramolecular double-stranded structure of the extension product is more stable than the intermolecular double-stranded structure (Tyagi et.al. Nature Biotechnology 14, 303-308 (1996) )). For this reason, the sequence portion added to the 5 side of the primer 13 does not have to be complementary to all of the portion complementary to the primer 12 of the extension product from the primer 13.
  • the extension reaction of the primer 12 can be prevented if the portion where the 3 ′ side of the primer 12 is bonded is protected by the stem structure. For this reason, it is sufficient that the sequence on the 5 side added to the primer 13 contains only a part of the primer 2, and the competitive reaction to the template is given priority to the primer 12 .
  • the sequence to be added to the primer 13 may be DNA or RNA, and may be a nucleic acid represented by PNA (peptide nucleic acid) in which nucleobases are connected by peptide bonds. It may be other than a nucleic acid that forms a complementary strand with the nucleic acid. Furthermore, the sequences of such nucleic acids and PNAs are May be continuously linked to the 5 'end of the sequence complementary to the template, or may be linked via a spacer molecule or the like. Further, the sequence may be introduced in a structure that is branched from a sequence complementary to the template of the primer-13.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the primer 11 and the primer 13 may be arranged continuously with respect to the template, or may be separated from each other.
  • the interval between these primers should be within a range that includes the sequence of the target nucleic acid fragment to be detected by the extension product from primer 3 and that does not reduce the efficiency of the amplification reaction between primer 1 and primer 2.
  • the extension product generated by the primer 3 it is desirable that the extension product is not too long.
  • the length of the sequence capable of forming the stem 'loop structure is about 30 bases to 500 bases, and more preferably about 60 bases to 300 bases.
  • the single-stranded nucleic acid fragment capable of forming a loop structure has a higher level than the sequence complementary to the primer in a strand that hybridizes with the primer for synthesizing the single-stranded nucleic acid fragment. it is caused by 35 the end of the side sequence and hybridizes Zusuru primer one by strand displacement extension reaction chain. That is, the single-stranded nucleic acid fragment is formed by unwinding the double strand generated by the extension of the downstream primer by the strand displacement extension reaction of the upstream primer.
  • a primer used for amplifying a single-stranded target nucleic acid fragment which is capable of hybridizing with one of the type III strands to form a loop structure.
  • the elongation reaction for synthesizing a target nucleic acid fragment of the present strand and converting the nucleic acid fragment into a ⁇ -shaped nucleic acid fragment by the loop structure, and inhibiting the elongation reaction by a primer that hybridizes with the other strand complementary to the strand is suppressed.
  • a primer is also provided, characterized in that
  • the method for amplifying a single-stranded nucleic acid fragment of interest according to the present invention can typically be said to comprise the following steps:
  • (II) at least one kind of the bimer hybridizes with one of the type I strands and synthesizes a single-stranded target nucleic acid fragment by the elongation reaction;
  • the method for amplifying a target nucleic acid fragment according to the present invention is as described above.
  • One preferred embodiment of the method of the present invention is as follows.
  • the method for amplifying a single-stranded target nucleic acid fragment comprises:
  • a method comprising:
  • the operations such as double-strand denaturation, annealing, and primer extension reaction can be appropriately performed by the operations and conditions employed in the conventional nucleic acid amplification method. It can be appropriately selected according to the amplification reaction, the target nucleic acid, the primer, and the like.
  • Oligonucleotides used in this example were purchased from Japan Bioservices and purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a plasmid containing the PstI fragment of the /?-Globin gene (pBR322-? A , Ikuta et.al. Nucleic Acids Res. 15, 797-811) was used as a template for amplification.
  • Smart Probe was synthesized according to the method of Nucleic Acids Symposium Series NO.44, 297-298. Further, Vent (exo-) DNA polymerase (obtained from New England Biolabs, Inc.) was used for the amplification reaction.
  • Thermal Cycler 9600 (Roche Diagnostics) was used for the gene amplification reaction, and Light Cycler (Roche Diagnostics) was used for fluorescence measurement corresponding to temperature changes.
  • SYBR Gold obtained from Molecular Probes Inc.
  • the primers 1, 2 and 3 used in the reaction were as follows.
  • the underlined portion of the primer 3 is a portion complementary to the 3 'side of the extension product. You.
  • Figure 3 shows the layout for the template.
  • PG3 5 'TGTCTTGTAACCTTGATACC (SEQ ID NO: 1)
  • HPG4 5 'GCAACCTCAAACAGACACCACAACTTCATCCACGTTCACC (SEQ ID NO: 3)
  • HPG5 5 TAGCAACCTCAAACAGACACCACAACTTCATCCAG6TTCACC (SEQ ID NO: 4)
  • HPG7 5 'GTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCACAACTTCATCCACGTTCACC' (SEQ ID NO: 6)
  • SEQ ID NO: 6 5 'GTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCACAACTTCATCCACGTTCACC'
  • the primer PG2 has only a sequence complementary to the target portion of the primer 13 (PG2: 5, CAACTTCATCCACGTTCACC) (SEQ ID NO: 7).
  • No. 1 and No. 2 were ordinary PCR reactions, and the desired double-stranded amplification product was obtained.
  • NO.3 to NO.6 were reacted by the method of the present invention, and in each case, products similar to No.2 were obtained. Further, in NO.3 to NO.6, a remarkable band having a higher mobility was detected in addition to the double-stranded DNA. These are presumed to be the desired single-stranded DNA.
  • Example 3 In each case, the band of the target amplified product was confirmed, but the efficiency of amplification was reduced in all cases. This is thought to be because the extension product formed a stem structure. From the comparison with Example 1, it is considered that the amplification efficiency can be increased by further adding the primer 11 here.
  • Example 3

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Description

明 細 書 一本鎖目的核酸断片の増幅方法 [発 明 の 背景]
発明の分野
本発明は目的核酸断片の増幅方法に関する。 詳しくは、 核酸の増幅反応におい て生成する二本鎖核酸のいずれか一方の一本鎖のみを過剰に増幅することができ る、 目的核酸断片の増幅方法に関する。
技術背景
近時、 ヒトゲノム配列のほぼ全容が明らかとなり、 また SNP解析も巨大プロ ジェクトで進められている。 このため、 単一遺伝子疾患のみならず多因子疾患に ついても遺伝子診断の意義が急速に高まりつつある。 また、 外来因子である病原 細菌やウィルスの遺伝子診断も臨床の現場で定着しつつあり、 今後、 検査対象が 増加すると考えられる。 さらに、 DN Aチップテクノロジ一などの進展により、 ガンなどの病態と遺伝子発現との関連が次第に明らかにされつつある。 このよう な状況において、 遺伝子検出もしくは SNP検出の簡易化および低コスト化は、 高度医療を実現するために重要であると考えられる。
一般的に、 遺伝子検出を行うにあたっては、 検出しょうとする微量の遺伝子を 何らかの方法で増幅する必要がある。 増幅の方法としては、 検出のためのシグナ ルを増幅する方法と、 遺伝子そのものを増幅する方法とある。 現在のところ後者 の方に実用的なものが多い。
一般的に、 このような増幅の対象となるものとしては、 DNAと RNAが挙げ られる。 このうち、 DNAは、 例えば、 PCI 去 （Polfs et.al. PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer-Verlag (1992)ヽ SDA法 (Walker et. al. ucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)) 、 LAMP法 (Notomi et.al. Nucleic Acids Res. 28, e63(2000)) 、 または I CAN法 (Mukai et.al. 国際 出願 WOOO/56877号） などにより合成し増幅することができる。 RNAは、 例えば、 NASBA法 (Gabrielle et.al. J. General Microbiol. 139, 2423-2429(199 3)) 、 または T MA法 (Kacian et. al. 米国特許第 5, 399, 491号） などにより合成 し増幅することができる。
増幅物が D N Aである場合には、 D NAは二本鎖であるため、 増幅物の配列倩 報に基づく検査を行うにあたって、 何らかの方法で二本鎖 D N Aを一本鎖にする 必要がある。
増幅物が R N Aである場合には、 R N Aは一本鎖であるので D N Aの場合のよ うに一本鎖にする必要はない。 しかしながら、 R NAは分解し易く、 また 3次構 造を形成し易いことなどから、 その操作は必ずしも容易ではない。
一般的に、 二本鎖 D N Aを一本鎖にする方法には種々の方法がある。 例えば次 のような方法挙げられる。
第一の方法としては、 二本鎖 D N Aを熱的または化学的処理により変性して一 本鎖にする方法が挙げられる。 この方法は操作が簡便であるが、 次の配列を検査 する段階で二本鎖に戻る可能性があり、 それが原因で検査の感度の低下を招くこ とがある (Gillespie et.al, 米国特許第.5, 627, 05.4号) 。
第二の方法としては、 二本鎖 D N Aを変性した後に、 検査に不必要な鎖を除く 方法が挙げられる。 この方法の具体例としては次のような方法が挙げられる。 P C R法において一方の鎖のみをビォチンで標識するために、 一方のプライマ一に のみピオチン標識しておき増幅反応を行う。 得られた増幅混合物をァビジンなど を結合した不溶性の担体と接触させ、 ピオチンが結合した D N Aを担体上に捕獲 する。 それらを洗浄後、 二本鎖 D N Aが変性する条件に付し、 ピオチンの結合し ていない方の鎖を担体から遊離させる。 これにより、 遊離した一本鎖 D NAを得 ることができ、 これを用いて配列情報に基づく検査を行うことができる （Nyren et.al. Anal.Biochem. 208, 171-175 (1993)) 。 この方法では検出の対象とする 鎖の相補鎖が存在しないため、 効率的な検出が可能である。 しかしながら、 この 方法は操作が煩雑であるため、 ルーチン検査を行う上では望ましくない。
そこで第≡の方法として、 増幅反応において一方の鎖を他方より過剰に合成す る方法が考案されている。 この方法は主に P C R法と組み合わせて行われており 総称して非対称 P C R (asymmetric PCR) と呼ばれることがある。 具体例として は、 P C R法による増幅反応において二つのプライマーのうちの一方を他方より 過剰に加えることにより、 過剩に加えたほうの伸長生成物をもう一方のプライマ' 一からの伸長生成物より過剰に合成する方法が挙げられる （Gfyllensten et.al. Pro Natl. Acad. Sci. 85， 7652-7656) 。 またこれに類似する方法として、 一 方のプライマ一の活性のみを阻害する物質を増幅反応の系中に共存させて、 もう 一方のプライマ一による伸長生成物のみを過剰生産させる方法が挙げられる （Bu chardt et.al. 米国特許第 5, 972, 610号） 。
しかしながら、 これらの方法では、 一方のプライマ一による伸長反応を抑制す るために増幅効率そのものに影響を与えてしまう可能性がある。 また試料中の増 幅させようとする遺伝子の量が常に一定であればそれに最適なそれそれのプライ マ一量を設定することは可能であるが、 実際には、 試料中の遺伝子の量が異なる ことが多い。 このような場合には、 遺伝子の増幅効率は大きく変化するため、 目 的とする遺伝子の増幅および過剰の伸長生成物を得ることは困難である。
さらに別の方法として、 二つのプライマーの熱安定性の差を利用する方法が挙 げられる (Mazars et. al. Nucleic Acids Res. 19， 4783 (1991 )) 。 ここでいう 熱安定性とは、 夕一ゲットとする遺伝子と相補鎖を形成するときの安定性を意味 し、 一般的に T mという指標で表される。 通常、 P C R法では増幅の効率や特異 性の観点から二つのプライマーの T mは同じに設定されるが、 この方法では意図 的に異なるように設定される。 具体的には、 増幅反応の初期段階では、 T mの低 い方のプライマーに適した条件で増幅反応を行う。 この段階では二つのプライマ —がほぼ同じように働き、 増幅物として二本鎖 D N Aが生成する。 次に、 ある程 度増幅反応が進んだ段階で、 T mが高い方に適した条件に反応条件を変更する。 この段階から T mの低い方のプライマ一は働かなくなり、 T mの高い方のプライ マーからの伸長反応だけが進行することになる。 これによつて、 T mの高い方の プライマーからの伸長生成物を過剰に生成することができる。
しかしながら、 この方法では後半の増幅反応は所謂 P C Rの指数関数的な反応 とは異なって直線的な増幅反応であるため、 反応条件の変更のタイミングを、 増 幅反応がかなり進んだ時点に変更する必要がある。 このため、 反応条件を変更す る時点で、 試料中の夕一ゲットとする遺伝子が大量に存在する場合は増幅反応が 飽和に達してしまうことがある。 また試料中の夕一ゲットとする遺伝子が少量の 場合は遺伝子増幅が不十分となる可能性がある。 前者の場合には、 伸長反応に必 要な試薬が枯渴しているか、 または反応により生じたピロリン酸により反応が阻 害されることになる。 このため、 T mが高い方のプライマ一による伸長反応を効 率的に行うことが困難となる。 後者の場合には、 前半の指数関数的な増幅反応が 不十分となるため、 その後に直線的な伸長反応を行っても、 検出に十分な量の生 成物を得ることは困難となる。 したがって、 この方法の場合にも、 最適な条件を 設定するためには試料中の夕一ゲットとする遺伝子の量が一定であることが重要 となる。 このことは、 遺伝子検査の方法へ適用するには望ましいとは言えない。 したがって、 遺伝子検査をより簡易かつ効率的に行うことができるようにする ための核酸断片の増幅方法が依然として望まれている。
[発 明 の 概要]
本発明者は、 今般、 前記したような核酸の増幅反応において、 相補鎖の一方の 鎖に基づくテンプレ一トに対するプライマーの伸長生成物が、 ループ構造を形成 するように該プライマ一を設定することにより、 相補鎖の一方の鎖のみを過剰に 増幅させることができることを見出した。 また、 このことは、 相補鎖の一方の鎖 に基づくテンプレートに対して、 他方のテンプレートに対するより過剰の数のプ ライマーを設定するような核酸増幅法において有効であることも見出した。 本発 明はこのような知見に基づくものである。
したがって、 本発明は、 核酸の増幅反応において生成する二本酸核酸のいずれ か一方の鎖を、 簡便かつ効率的に過剰に増幅させることができる方法の提供をそ の目的としている。
そして、 本発明による一本鎖目的核酸断片の増幅方法は、 複数種のプライマー を用いる一本鎖目的核酸断片の増幅方法であって、 少なくとも 1種のプライマー が、 鎵型である一方の鎖とハイブリダィズして、 ループ構造を形成し得る一本鎖 目的核酸断片を合成し、 該ループ構造によって、 その核酸断片を錡型とする伸長 反応であって、 かつ前記鎖に相補的なもう一方の鎖とハイブリダィズするプライ マーによる伸長反応が抑制されることを特徴とする方法である。
また換言すると、 本発明による核酸断片の増幅方法は、 複数種のプライマ一を 用いる核酸断片の増幅方法であって、 一方の鎖とハイブリダィズする少なくとも 1種のプライマ一により合成される一本鎖目的核酸断片が、 その分子内でループ 構造を形成して、 それを鎢型とする、 もう一方の鎖とハイプリダイズするプライ マーによる伸長反応が抑制され、 それにより一本鎖目的核酸断片が増幅されるこ とを特徴とする方法である。
[図面の簡単な説明]
図 1は、 本発明による方法の一つの態様を示した図である。
図 2は、 本発明による方法の別の一つの態様を示した図である。 図中、 （A) および （B ) の鎖は次の反応のテンプレ一トとなるものであり、 （C ) の鎖は次 の反応のテンプレートとはならなるものである。
図 3は、 実施例におけるプライマーのテンプレートに対する配置を示す。
図 4は、 例 1における 1 2 %ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動による分析結果 を示す。
図 5は、 例 2における 1 2 %ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動による分析結果 を示す。
図 6は、 例 3の結果を示す図である。
[発明の具体的説明]
前記したように非対称 P C R (asymmetric PCR) 法は遺伝子検査の簡易化とい う点では優れた方法であるといえる。 この方法のうち、 前記したプライマ一量を 変える方法または一方のプライマー反応を阻害する方法は、 確かに生成物である 二本鎖 D N Aのそれそれの鎖の量を等量的でないようにすることは可能であるが、 それから得られるそれそれの鎖は次の反応のテンプレートとなるため、 試料中の 遺伝子の量が増幅効率に直接的に影響を与えてしまうことがある点は前記したと おりである。 したがって、 過剰に生成した鎖が次の反応のテンプレートにならな いような系であればそのような問題を克服できると考えられる。
一方で、 増幅反応で利用される D NAポリメラーゼの中には鎖置換 （strand d isplacement) 伸長反応の性質を持つものがある （Hamilton et. al. Biotechniq ues 31， 370-383 (2001)) 。 これは、 伸長反応の途中でテンプレートに相補的な 鎖が存在する場合に、 その鎖をほどきながらテンプレートにしたがつた伸長反応 を進めることができるものである。 したがって、 増幅しょうとする遺伝子断片の 一方の鎖について隣接する位置に二つのプライマーを設定すれば、 下流のプライ マーからの伸長生成物は上流のプライマーからの伸長反応により遊離され、 過剰 の一本鎖 D N Aとして生成することができる。
しかしながら、 このままでは次の反応において、 上流のプライマーからの伸長 生成物も下流からの伸長生成物もいずれも、 他方のプライマ一のテンプレートと なり得る。 このため、 このまま鎖の増幅操作を続けると、 相補鎖間の量的な違い は解消されてしまう。
そこで、 該下流のプライマ一から生成した D N Aが他方のプライマーのテンプ レートにならないようにすれば、 相補鎖間の量的な不均衡を維持できると考えら れる。
本発明による方法によれば、 核酸増幅反応により生成される相補鎖の一方の鎖 において、 ループ構造 （または、 ステム 'ループ構造ということがある） を形成 させることにより、 この鎖が次の伸長反応のテンプレートとならないようにする 'ことができる。 したがつてこの方法を遺伝子増幅法にしたがって行うことにより、 次の伸長反応のテンプレートにならないものが蓄積されて、 相補鎖の一方の鎖の みを過剰に増幅させることが可能となる。 このように生成される過剰の鎖の量は 核酸増幅の程度に連動しており、 しかもその得られる過剰の鎖は核酸増幅反応そ れ自身には影響を与えないものである。
このため、 本発明によれば、 一本鎖核酸断片を、 簡便かつ効率的に増幅させる ことができる。 また、 本発明による方法は、 指数的な増幅を伴う各種の遺伝子増 幅方法において容易に適用することが可能である。
本発明により生成される過剰の一本鎖核酸、 すなわち一本鎖 D NA (場合によ り部分的なステム構造をもってもよい） は、 塩基配列に基づく各種の遺伝子検出 法に利用できる。
例えば、 担体に固定化したプローブを用いるハイブリダィゼ一シヨン法 （Kawa i et.al. Anal . Biochem. 209, 63-69 (1993)) において、 増幅生成物を変性させ ることなくハイプリダイゼーシヨンを行うことができる。 さらに、 担体にプロ一 ブを固定する場合には、 サンプルに対してプローブを圧倒的大過剩存在させるこ とが困難な場合が多く、 二本鎖を変性させて一本鎖としたものではハイプリダイ ゼ一シヨンの効率が低下することが考えられる。 しかしながら、 本発明により生 成される一本鎖 D N Aをサンプルとする場合には、 プロ一ブとのハイブリダィゼ —シヨンに競合するものがほとんどないことから、 効率のよいハイブリダィゼ一 シヨンを達成することができる。
さらに、 最近、 均一系で検出できるプローブを利用し、 増幅反応中のプロ一ブ と増幅物との間でのハイプリダイゼ一シヨンを検出し、 これによつて増幅反応を 連続的にモニタ一する方法が考案されている (Tyagi et. al. Nature Biotechnol ogy 14, 303-308 (1996)、 Wittwer et. al. Biotechniques 22, 130-138 (1997) 、 Yamane, Nucleic Acids Symposium Ser. 44, 297-298(2000)) 。 この方法にお いて、 プローブが、 共存するターゲットに相補的な鎖と競合して、 ハイプリダイ ゼ一シヨンの効率は低下することがある。 このとき、 大過剰のプローブを用いる と、 検出のバックグランドを上昇させたり、 または増幅反応を妨害したりする可 能性が高いため、 夕一ゲットに対して圧倒的大過剰のプロ一プを使用することは できない。 本発明により得られる一本鎖 D N Aを夕ーゲヅトとするプローブを利 用すれば、 効率的なハイブリダィゼーシヨンを達成することができる。
また、 P C R増幅物をそのままテンプレートとするサイクルシークェンシング 法 (Taylor et.al. D NA Seq. 5, 9-15 (1994)) が考案されている。 本発明に よる方法で調製した増幅物を利用すれば、 そのような方法を用いずに、 短時間で 効率的なシ一クェンシング反応を行うことができる。
さらに、 数塩基の伸長でシークェンシングを行うピロシークェンシング法 （Ah madian et.al. Anal. Biochem. 2803 103-110 (2000))、 または 1塩基だけ伸長 させて S N Pを検出する S B E法 （Chen et.al. Genome Research 9， 492-498 ( 1999)) のテンプレートしても、 本発明による方法は有効に適用することができ る。
本明細書において、 目的核酸断片の増幅方法とは、 典型的には、 目的核酸断片 を含む核酸断片に対しプライマ一をハイプリダイズさせ、 このプライマ一を複製 起点としてプライマ一伸長反応を行うことにより前記断片と相補的な核酸断片を 形成させることを含んでなるものである。
本明細書において、 核酸増幅の夕一ゲットとなる核酸断片は、 DNAまたは R N Aのいずれでもあってよく、 また一本鎖でもあっても二本鎖であってもよい。 該核酸が RNAである場合には、 リバ一ストランスクリプターゼ、 または DNA ポリメラ一ゼのリバーストランスクリプ夕一ゼ活性を利用して R N Aから相補的 な DNAを合成してもよい。 本発明においては、 目的核酸断片を含む核酸は、 増 幅反応の最初において、 一本鎖であっても二本鎖であってよい。
また本発明において目的核酸断片は、 その由来によって特に制限されるもので はなく、 従って本発明は、 真核生物、 原核生物、 ウィルス由来の核酸、 さらには 合成されたものに対しても適用可能である。
本発明による増幅方法において、 一本鎖目的核酸の合成は、 遺伝子増幅法にし たがって行うことができる。 このような遺伝子増幅法としては、 指数関数的な増 幅反応を行う慣用の各種の方法、 例えば、 PCR法、 SDA法、 LAMP法、 I CAN法、 RCA法、 NASBA法、 および TMA法からなる群より選択される 方法が挙げられる。 このうち、 NASBA法または TMA法は、 二本鎖 DNAと 一本鎖 R N Aが増幅物として得られるが、 一本鎖 D N Aが必要である場合は本発 明による方法を適用することができる。
指数関数的な増幅を行う遺伝子増幅法においては、 通常、 増幅反応の過程で二 本鎖 DNAの両方の鎖が必ず反応に関与する。 例えば、 PCR法においては、 二 本鎖の内の一方の鎖をテンプレートとして伸長した核酸鎖は、 次の段階で元の鎖 を合成するテンプレートとして働く。 ここで本発明の方法を、 PCR法適用の場 合を例にとって説明する。
まず一方の鎖 （鎖（1)) に対するプライマ一 2種類と、 もう一方の鎖 （鎖 (2)) に対するプライマー 1種類とを用意する （図 1参照） 。 なお、 図 1は PCR法を 例として示したものであるが、 前記したような他の増幅法においても鎖（1)に対す るプライマー、 および鎖 (2)に対するプライマ一という観点で同様に本発明の方法 を適用することができる。 また本発明においては、 相補鎖関係にある二本鎖核酸 のいずれか一方の鎖が、 前記鎖（1)であっても前記鎖（2)であってもよく、 したが つて、 例えば前記の場合を、 鎖 (2)に対して 2種類、 鎖 (1)に対して 1種類のブラ イマ一を用意すると表現しても本発明においては同じことを意味する。
図 1に示した状態で、 鎖 (1)および鎖 (2)を鎵型としてプライマーの伸長反応を 行うと、 それそれのプライマ一に対する 3種類の伸長生成物が得られる。 このと き、 2種類設定したプライマ一の下流側のプライマーの生成物を、 次の伸長反応 の段階でもう一方の鎖のプライマ一 （鎖 (2)に対するプライマ一 （図 1ではプライ マ一 Bに相当する） ） のテンプレートにならないように設計しておく。 このよう にすると、 次の伸長反応段階で鎖（1)に対するプライマーのうち上流のプライマー による生成物 （図 1ではプライマ一 Aを含むものに相当する） に対してのみ、 鎖 (2)に対するプライマーが働くことになる。 一方、 前の段階で生成した鎖 (2)に対 するプライマーからの伸長生成物は当然ながら鎖（1 )に対する 2種類のプライマー のテンプレートになる。 このように、 鎖（1 )に対する上流のプライマーと鎖 (2)に 対するプライマーで増幅反応が進行する一方で、 鎖（1)に対する下流のプライマー から生じた生成物は増幅反応に影響を及ぼさず増幅反応に連動して一本鎖 D N A として蓄積されることとなる。 以上の操作を、 P C R反応において繰り返し行う と、 前記一本鎖 D NAを過剰に増幅することができる。
したがって、 本発明の好ましい態様によれば、 ループ構造を形成する一本鎖核 酸断片を合成するプライマー （ここではプライマー 3またはプライマー Cという ことがある） に加えて、 このプライマ一とハイプリダイズする鎖においてこのプ ライマ一と相補的である領域よりも 3， 側の配列から選択される配列とハイプリ ダイズするプライマ一 （ここではプライマー 1またはプライマ一 Aということが ある） をさらに用いる （図 1、 または図 2上段の図を参照） 。 またこのとき、 も う一方の鎖に対して相補的な相補的なプライマ一 （ここではプライマ一 2または プライマ一 Bということがある） も用いられる。
したがって、 本発明の方法においては、 複数種のプライマーが用いられるが、 3種以上のプライマ一が使用されることが好ましい。 このとき、 使用されるブラ イマ一の内の少なくとも 1種は、 それにより合成される一本鎖核酸断片が、 その 核酸断片の分子内でループ構造を形成して、 その核酸断片を錶型とする他のブラ イマ一による伸長反応を進行させなくするものである。 本発明においては、 下記（i)〜（iii)のような 3種のプライマ一を少なくとも使 用することがより好ましい：
( i ) 錡型である一方の鎖とハイブリダィズして、 ループ構造を形成し得る一本 鎖目的核酸断片を合成するプライマ一であって、 ここで該ループ構造によって、 その核酸断片を銪型とする伸長反応であって、 かつ前記鎖に相補的なもう一方の 鎖とハイプリダイズするプライマ一による伸長反応が抑制されるもの、
(ii) 前記（i )のプライマーよりも上流に位置するプライマ一、 すなわち、 前記 プライマ一とハイプリダイズする鎖において、 このプライマーと相補的である領 域よりもその鎖の 3 ' 側の配列から選択される配列とハイプリダイズするプライ マ一、 および
(iii) もう一方の鎖に対して相補的な相補的なプライマー。
また本発明においては、 予め前記プライマー 1およびプライマー 3を、 プライ マー 2に対して過剰量用意して増幅反応を行ってもよい。
上記した同一の—鎖に対する 2種類以上のプライマーは、 異なるテンプレート分 子に結合して伸長反応が進行するものであってもよく、 また、 同一分子に結合す るものであってもよい。 通常、 核酸増幅反応においては反応の初期段階ではテン プレートに対して大過剰 （1 0 9〜1 0 1 2倍程度） のプライマーが存在するため、 後者の状況になる可能性が高いと考えられる。 そのような場合、 プライマ一伸長 反応を行う D N Aポリメラーゼとして、 伸長方向の下流に存在する二本鎖 D N A をほどく性質 （鎖置換 （strand displacement) 活性） のあるものを使用すると、 反応を効率的に進行させることができると考えられる。 また、 二本鎖 D NAをほ どく性質のあるへリカーゼ （Delagoutte et.al. Biochemistry 40， 4459-4477 (2001)) や、 ほどける一本鎖 D NAに結合して一本鎖 D N Aを安^に維持する一 本鎖 D N Aタンパク (single strand binding (SSB) protein) をさらに添加して もおい。 これらによっても、 D N Aポリメラ一ゼがニ本鎖 D N Aをほどきながら 伸長反応を進めることを助けることができる （Canceill et. al. J. Biol. Chem.
274, 27481-27490 (1999)) 。 例えば、 E. coli D NA polymerase III holoen zyme (HE)は、 SSBタンパク共存下で鎖置換活性を発揮することが知られている
(Hamilton et. al. Biotechniques 31, 370-383 (2001)) 。 本発明において、 こ れを用いてもよい。
また、 プライマーの濃度や反応条件を最適化することによって、 二本鎖をほど く作用がなくても 2種類のブライマ一からの伸長生成物を得ることも可能であり、 結果として遺伝子増幅に連動した一本鎖 DN Aを合成することができる。 本発明 においては、 これらの操作をさらに適用してもよい。
本発明においては前記したように、 プライマーの伸長反応は D N Aポリメラー ゼを用いて行うことができるが、 RNAをテンプレートとする場合、 RNAブラ イマ一からの伸長反応を行う RNAポリメラーゼ （Rodriguez- Wells et. al. Nu cleic Acids Res. 29， 2715-Z724 (2001)) を用いることも可能である。
また本発明において使用可能な DN Aポリメラ一ゼであって、 鎖置換活性をも つことが明らかになっているものとしては、 例えば、 Bacillus Stearothemophil us ポリメラ一ゼ I、 E. coli ポリメラ一ゼ I、 Thermoanaerobacter thermophil us ポリメラ一ゼ I、 Bacteriophage phi 29 DNA ポリメラ一ゼ、 および Therm ococcus litoral is DNA ポリメラ一ゼなどが挙げられる （Hamilton et. al. Biotechniques 31, 370-383 (2001))。
また、 既知の D N Aポリメラ一ゼでその活性が明らかになつていないものでも 構造の類似性から上記活性のあるものが存在すると考えられる。 このような DN Aポリメラーゼも本発明おいて使用することができる。 このような D N Aポリメ ラ一ゼとしては、 各種の遺伝子増幅反応に適切なものとして使用されているもの が挙げられる。
例えば、 本発明の方法を適用する遺伝子増幅法として P CR法が採用される場 合には、 高温での熱変性を必要とするために高度耐熱性の Thermococcus litoral is DNA ポリメラ一ゼ、 P CR法で最もよく使われている Thennus thermophil us DNA ポリメラ一ゼまたはへリカ一ゼなどを適切なタンパク共存下で使用す ることができる。 また、 LAMP法や I CAN法などの等温温増幅法が採用され る場合には、 中度耐熱性の Bacillus Stearothemophilus ポリメラ一ゼ Iなどが好 適に使用できる。 さらに、 室温付近で行う RCA法が採用される場合には、 Bact eriophage phi 29 DNA ポリメラ一ゼが好適に使用できる。 すなわち、 本発明 においては、 適用する遺伝子増幅法に応じて、 使用する DN Aポリメラーゼを適 宜選択することができる。
本発明においては、 反応に使用するバッファ一や基質も、 適用する遺伝子増幅 法に応じて、 その反応おいて通常使用されるものをそのまま使用することができ る。
前記したように、 本発明において使用されるプライマーの内、 少なくとも 1種 は、 それにより合成される一本鎖核酸断片が、 ル一プ構造を形成し、 該ループ構 造がその核酸断片を錶型とする他のプライマーによる伸長反応を抑制するもので ある。 すなわち、 本発明における該プライマーの伸長生成物は、 その分子内でル —プ構造を形成して、 これによりこの伸長生成物は実質的に次の段階でテンプレ 一トにならないものとなっている。
このようなループ構造を形成し得る伸長生成物を合成する本発明におけるブラ イマ一は、 例えば、 下記のようにして設定することができる。
( 1 ) 一つの態様としては、 プライマ一の 5， 側に、 ステム 'ループ構造のステ ム構造を形成する部分を挿入する一方で、 そのプライマーから生じる伸長生成物 の 3， 側であって別のプライマーと相補的になる部分に対して、 該ステム部分との 間で 3本鎖を形成するように、 本発明におけるブラィマ一を設計することが挙げ られる。 この伸長生成物は一本鎖のループ部分と 3本鎖のステム部分からなり、 プライマーが結合する部分が 3本鎖になっていることによりプライマ一伸長反応 を阻害することが期待される (Hacia et. al. Biochemistry 24, 6192-6200 ( 199 4)) 。 これにより、 このプライマ一により得られる伸長生成物が次の段階でテン プレートとなるのを防く、ことができる。
( 2 ) 別の態様としては、 プライマーの 5， 側に、 そのプライマ一から生成する 伸長生成物の 3' 側の塩基配列に特異的に結合するタンパクを導入しておくことが 挙げられる。 これにより、 得られる伸長生成物は、 その 5 ' 端側と 3 ' 端側が分 子的に結合してループ構造をとるため、 別のプライマーの伸長反応がこの伸長生 成物に作用することを防止することができる。
( 3 ) さらに別の態様としては、 ループ構造を形成し得る一本鎖核酸断片を合 成するプライマーが、 その 5 ' 端側に、 このプライマ一とハイブリダィズする鎖 において、 このプライマーと相補的である領域よりもその鎖の 5， 端側の配列か ら選択される核酸部分を有し、 かつ、 この核酸部分の配列が、 もう一方の鎖とハ ィブリダイズするブラィマーの配列と全部または一部が同一である場合が挙げら れる。 換言すると、 図 2示されるように、 プライマ一 3の 5， 端側に、 そのプライ マ一 3から生成する伸長生成物の 3' 側の一定部分の配列と相補的な核酸部分であ つて、 該伸長生成物と相補的な他のプライマ一 2と、 一部または全部が相補的で ある核酸部分を付加しておくことが挙げられる （図 2参照） 。 これにより、 この プライマー 3の伸長生成物は、 一本鎖のループ部分とブラィマーに付加した配列 と 3， 側との間で形成されるステム レープ構造となる （図 2 ( C )参照） 。 このた め、 プライマ一が相補的になる部分はステム構造で守られており他のプライマ一 の結合を阻止することになる。 なお、 このようなステム構造を利用したプライマ 一の結合を阻止する方法は別の目的で利用され、 機能することが知られている (Siebert et. al . Nucleic Acids Res. 23, 1087-1088 ( 1995 )) 。
ただし、 本発明の方法においては、 前記プライマー 3の 5' 側に付加した配列は 本来の増幅反応であるプライマ一 2とテンプレートとの結合反応において競合す ることになる。 しかしながら、 プライマー 3から生じた伸長生成物は、 プライマ 一 2が相補的となる部分とは別の部分を使って安定化させることができる。 また、 一般的に伸長生成物の分子内における二本鎖構造は、 分子間における二本鎖構造 より安定であることが知られている （Tyagi et.al. Nature Biotechnology 14, 303-308 ( 1996 )) 。 このため、 プライマ一 3の 5， 側に付加する配列部分は、 ブラ イマ一 3からの伸長生成物のプライマ一 2と相補的になる部分の全部と相補的で なくともよい。 プライマ一 2の 3' 側が結合する部分が、 ステム構造で保護されて いれば、 プライマ一 2の伸長反応を防く、ことができると考えられる。 このため、 プライマ一 3に付加された 5， 側の配列は、 プライマ一 2の一部のみを含んでいれ ば十分であり、 テンプレートに対する競合反応はブライマ一 2の方が優先するこ ととなる。
本発明において、 前記プライマ一 3に付加する配列としては、 D N Aでもあつ ても R N Aであってもよく、 また、 核酸塩基をペプチド結合でつなぎ合わせた P N A (ペプチド核酸） に代表されるような核酸と相補鎖を形成する核酸以外のも のであってもよい。 さらには、 それら核酸や P N Aなどの配列は、 プライマ一 3 のテンプレートと相補的な配列の 5' 末端と連続的に結合していてもよいが、 また はスぺ一サ一分子などを介して結合しているものであってもよい。 また、 該配列 は、 プライマ一 3のテンプレートと相補的な配列から枝別れしたような構造で導 入されていてもよい。
さらに前記プライマ一 1とプライマ一 3とは、 テンプレートに対して連続して 並んでいてもよく、 または互いに離れていてもよい。 これらのプライマ一の間隔 は、 プライマー 3からの伸長生成物が検出しょうとする目的核酸断片の配列を含 み、 かつ、 プライマ一 1とプライマー 2とによる増幅反応の効率が低下しない範 囲であれば、 特に限定されない。 ただし、 プライマー 3により生じる伸長生成物 が効率よくステムを形成するためには、 その伸長生成物があまり長くないことが 望ましい。 好ましくは、 前記ステム 'ループ構造をとり得る配列の長さは、 3 0 塩基〜 5 0 0 0塩基程度であり、 より好ましくは 6 0塩基〜 3 0 0塩基程度であ る ο
本発明の一つの好ましい態様によれば、 前記ループ構造は、 前記一本鎖核酸断 片を合成する前記プライマーと、 前記プライマ一による伸長反応により形成され る伸長生成物上の塩基との結合により生ずる。
より好ましい態様によれば、 ループ構造を形成し得る一本鎖核酸断片が、 この 一本鎖核酸断片を合成する前記プライマーとハイブリダィズする鎖において、 こ のプライマ一と相補的である配列よりもその鎖の 3 5 端側の配列とハイブリダイ ズするプライマ一による鎖置換伸長反応によって生じたものである。 すなわち、 該一本鎖核酸断片は、 上流ブラィマ一の鎖置換伸長反応により下流ブラィマーの 伸長により生じている二本鎖がほどかれて生じたものである。
本発明の別の態様によれば、 一本鎖目的核酸断片の増幅のために用いられるプ ライマ一であって、 錶型である一方の鎖とハイブリダィズして、 ループ構造を形 成し得る一本鎖目的核酸断片を合成し、 該ループ構造によって、 その核酸断片を 錡型とする伸長反応であって、 かつ前記鎖に相補的なもう一方の鎖とハイブリダ ィズするプライマーによる伸長反応が抑制されるものであることを特徴とするプ ライマーも提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、 一本鎖目的核酸断片の増幅のために用いら れる複数種のプライマ一を含んでなるプライマーセヅトであって、 少なくとも 1 種のプライマーが、 鎵型である一方の鎖とハイブリダィズして、 ループ構造を形 成し得る一本鎖目的核酸断片を合成し、 該ループ構造によって、 その核酸断片を 錡型とする伸長反応であって、 かつ前記鎖に相補的なもう一方の鎖とハイブリダ ィズするプライマーによる伸長反応が抑制されるものであることを特徴とするプ ライマ一セヅトが提供される。
本発明による一本鎖目的核酸断片の増幅方法は、 典型的には下記のような工程 からなるということもできる ：
( I ) 複数種のプライマ一を用意し、
( I I ) 少なくとも 1種のブラィマーが、 錶型である一方の鎖とハイブリダイズし て、 その伸長反応によって一本鎖目的核酸断片を合成し、
( I I I ) 得られた該目的核酸断片がループ構造を形成し、 そのループ構造によって、 その核酸断片を錡型とする伸長反応であって、 かつ前記鎖に相補的なもう一方の 鎖とハイプリダイズするプライマーによる伸長反応が抑制され、
( IV) 前記（I I )および（I I I )を繰り返すことにより、 相補鎖に比べて過剰量に増 幅された一本鎖目的核酸断片を得る。
本発明による目的核酸断片の増幅方法は、 以上に説明したとおりであるが、 本 発明の方法の一つの好ましい態様をさらに示せば、 下記の通りである。
すなわち、 本発明の一つの好ましい態様によれば、 一本鎖目的核酸断片の増幅 方法は、
( a ) 複数種、 好ましくは 3種以上、 のプライマーを用意し、 ここで、 前記 プライマーの内の少なくとも 1種は、 ループ構造を形成し得る一本鎖核酸断片を 合成し、 前記ループ構造によって、 その核酸断片を錡型とする他のプライマーに よる伸長反応が抑制されるものであり、 より好ましくは、 前記プライマーに加え てさらに、 前記プライマーとハイブリダィズする鎖において、 このプライマ一と 相補的である領域よりもその鎖の 3 5 側の配列から選択される配列とハイプリダ ィズするプライマーと、 もう一方の鎖に対して相補的な相補的なプライマ一とを 使用し、
( b ) 目的核酸断片を含む核酸断片を用意し、 ( c ) 前記核酸断片が二本鎖である場合には必要に応じてこれを変性させ、 得られた一本鎖断片と （a ) で用意したプライマーとをアニーリングさせ、
( d ) プライマー伸長反応を行い、
( Θ ) 前記 （c ) と （d ) とを必要に応じて繰り返し、
( f ) 目的核酸断片を含む一本鎖核酸断片を、 それと相補的な鎖に対して過 剰量得る
ことを含んでなる方法である。
なおここで、 二本鎖変性、 アニーリング、 およびプライマ一伸長反応等の操作 は、 慣用の核酸増幅法において採用さている操作、 条件等を適宜採用することが でき、 したがって、 P C R法等の採用する増幅反応、 目的核酸、 プライマー等に 応じて適宜選択することができる。
[実 施 例]
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 これらは本発明を限定する ものではない。
■ 本実施例において用いられるオリゴヌクレオチドは、 日本バイオサービス社よ り購入して、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製したものを使用した。 また、 増幅のテンプレートしては/?—グロビン遺伝子の Pst I断片を含むプラス ミド (pBR322- ? A ， Ikuta et.al. Nucleic Acids Res. 15, 797-811) を使用し た。 Smart Probeは、 Nucleic Acids Symposium Series NO.44, 297-298の方法に したがって合成した。 さらに増幅反応には Vent(exo—) D NAポリメラ一ゼ （New England Biolabs, Inc.より入手） を使用した。
遺伝子増幅反応には Thermal Cycler 9600 (Roche Diagnostics社製） を使用し、 温度変化に対応した蛍光測定は Light Cycler (Roche Diagnostics社製） を使用し た。 また、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の D N Aの染色は一本鎖 D N Aで も染色されやすいとされている SYBR Gold (Molecular Probes Inc.より入手）を使 用し 7こ。
反応に使用したブライマ一 1、 プライマ一 2およびブライマ一 3は以下の通り であった。 プライマ一 3の下線の部分は、 伸長生成物の 3' 側と相補的な部分であ る。 またそのテンプレートに対する配置を図 3に示した。
プライマ-ー 1
PG3: 5 ' TGTCTTGTAACCTTGATACC (配列番号 1 )
プライマ' —2
PG1 : 53 ACACAACTGTGTTCACTAG (配列番号 2 )
プライマ- —3
HPG4: 5' GCAACCTCAAACAGACACCACAACTTCATCCACGTTCACC (配列番号 3 )
HPG5 : 5, TAGCAACCTCAAACAGACACCACAACTTCATCCAG6TTCACC (配列番号 4 )
HPG6 : 5， CACTAGCAACCTCAAACAGACACCACAACTTCATCCACGTTCACC (配列番号 5 )
HPG7: 5' GTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCACAACTTCATCCACGTTCACC '(配列番号 6 ) 実施例 1
下表に示したプライマ一の組み合わせ （各 0.5〃M) を用いて、 プラスミド pBR3 22 - ? A (300pg) をテンプレートとして増幅反応を行った。 反応液には 4種のデォ キシヌクレオチド三リン酸 （各 200〃M) および反応バッファ一 （New England Bi olabs, Inc. ) を加え、 Vent ( exo— ) D N Aポリメラーゼ ( 2ユニット） を加えて総 量 5 0 z Lで行った。 温度条件は 9 4 °C ( 1 5秒） 、 5 5 °C ( 1 5秒） 、 および 7 2 °C ( 3 0秒） で、 これを 3 5サイクル行った。
なお、 プライマ一 PG2は、 上記プライマ一 3のターゲット部分に相補的な配列の みを持つものである （PG2: 5， CAACTTCATCCACGTTCACC ) (配列番号 7 ) 。
No. プライマー 予想される生成物： 予想される生成物：
：本鎖 DNA (鎖長） 一本鎖 DNA (鎖長）
1 PG1, PG2 110塩基対 なし
2 PG13PG3 152塩基対 なし
3 PG1, PG3, HPG4 152塩基対 130塩基
4 PG1, PG3, HPG5 152塩基対
5 PG1, PG3, HPG6 152塩基対
6 PG1, PG3, HPG7 152塩基対 138塩基 得られた反応液を 1 2 %ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により分析した。 結果は図 4に示されるとおりであった。
No. lおよび No.2は通常の P C R反応であり、 目的とする二本鎖の増幅物が得ら れた。 NO.3から NO.6は本発明の方法による反応でそれそれにおいて No.2と同様な 生成物が得られた。 さらに NO.3から NO .6においては二本鎖 D N Aのほかにそれよ り移動度の速い顕著なバンドが検出された。 これらは目的とする一本鎖 D NAで あると推定される。 実施例 2
実施例 1と比較する目的でプライマ一 2とブライマ一 3のみでの P C R反応を 行った。 プライマ一をプライマ一 2とプライマ一 3のみ用いて行った以外は、 反 応条件は実施例 1と同じであった。 プライマ一の組み合わせは以下に示す通りで めった。
No. プライマ- 予想される生成物
二本鎖 DNA (—鎖長）
7 PG13 HPG4 130塩基対
8 PG1, HPG5 132塩基対
9 PG1, HPG6 135塩基対
10 PG1, HPG7 138塩基対一 反応液を 1 2 %ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で分析した。 それそれ実施例 1の反応液と隣り合わせに泳動させた。
結果は図 5に示されるとおりであった。
いずれの場合においても目的とする増幅物のバンドが確認されたが、 増幅の効 率はすべてにおいて低下していた。 これは伸長生成物がステム構造を形成するた めであると考えられる。 例 1との比較から、 ここでプライマ一 1をさらに加える ことにより増幅効率を高めることができると考えられる。 実施例 3
実施例 1で得られた反応液には一本鎖 D N Aが含まれていると考えられるが、 これがハイプリダイゼ一シヨン効率を高める効果があるかどうかを調べた。 ハイ ブリダィゼーシヨンには Smart Probeを使用しだ。 なお Smart Probeは夕一ゲヅト と二本鎖を形成すると蛍光を発するプロ一プである。
本実験では各プライマー 3の伸長生成物と相補的な Smart Probe (Py-BNF3: 5' ACCTGACTCCTGA(Py ) (F ) GGAGAAGTCTGCG( P )： Pyおよび Fはォリゴヌクレオチドに導入 したピレンおょぴフルォレセインを示したもので、 Pはプロ一ブの 3， 末端に導入 したリン酸を示す） （配列番号 8 ) を混合し、 温度変化に対応する蛍光を測定し てハイプリダイゼ一ションの効率を比較した。
実施例 1で得られた反応液 （6 /L)、 20mM リン酸バヅファー pH 7.0 (10 L) 、 1.5M NaCl (2〃L) 、 および、 0.5 zM Py-BNF3 (2〃L) を混合し、 Light Cyclerを 用いて 3 5 °Cから 8 0 °Cの間での温度変化 （0. C/秒） に対する蛍光を測定した。 結果は図 6に示したとおりであった。 実施例 4
本発明により一本鎖 D N Aが効率よく得られるているかどうかをマイクロプレ —トハイプリダイゼ一シヨンにより調べた。
センス鎖に相当するオリゴヌクレオチド配列 （5， GACACCATGGTGCACCTGACTCCTG AGGAGAAGTCTGCGGTTACTGCCCTGT) (配列番号 9 ) を固定したマイクロプレートを文 献 (Kawai et. al. Anal. Biochem. 209， 63-69 ( 1993)) に記載の方法に従って調 製した。 また、 実施例 1で使用した PG3， HG4, HG5, HG6, HG7とまったく同じ塩基 配列で 5' 末端にピオチンを導入したプライマーを調製した。 これらのビォチン標 識プライマ一からの伸長生成物はマイクロプレートに固定した塩基配列と相補的 である。
これらプライマ一を用いて、 実施例 1とまったく同じ条件で増幅反応を行った。 得られた反応液を 1 2 %電気泳動で調べたところ、 実施例 1と同様のパターンを 示す結果が得られた。 反応の番号とプライマーの組み合わせを以下の表に示した。 PCR NO. プライマ一
Pi PGl,Bio-PG3
P2 PG1， PG3, Bio-麵
P3 PG13 PG3， Bio - HPG5
P4 PG1, PG35 B 10-HPG6
_£5. PG1,_ PG3 Bio-HPG7 これらの反応液を用い先に調製しておいたマイク口プレートを用いてハイプリ ダイゼ一シヨンを行った。 各ゥエルに 0 · 5 X S S C (50uL)を添加した。 これ に、 調製しておいた P C R反応液 （4 uL) を添加した。 ただし、 PCR NO. 1につい ては熱変性処理を行ったものもサンプルとして使用した。 3 7 °Cで 1時間ハイブ リダィゼ一シヨンを行った後、 ハイブリダィゼ一シヨン溶液を除き、 洗浄液 （0. 1M Nacl, 0.1M Tris-HCl， 2mM MgCL, 0.05% Triton X-100) で 3回洗浄した。 こ れに、 洗浄液で希釈したホースラデヅシュペルォキシダ一ゼを結合したアビジン (Vector社） を加え、 3 7 °Cで 1 5分間反応させた。 次に反応液を除き、 洗浄液 で 3回洗浄した。 これに 3 %過酸化水素水を A B T S溶液 （1.5mM ABTS, 200mM 酒石酸 (pH 4.4)) により 2 0 0倍希釈した溶液を加えて発色反応を行った。 室温 で 1 0分反応を行ったのち停止液 （2 %シユウ酸） を加え、 4 1 5 n mで吸光度 を測定した。
結果は下記表に示されるとおりであった。
なお、 各反応は 2ゥエルを用いて行い下記表では平均値を示した。 サンプル NO. サンプゾレ 吸光度
未変性 PCR N0. pl 0.73
2 熱変性 PCR N0.pl 1.64
3 未変性 PCR N0. p2 1.22
4 未変性 PGR N0. p3 2.13
5 未変性 PCR N0.p4 1.84
6 未変性 PCR N0j35 1.84 上記表から、 本発明による方法 （サンプル 3~6) によれば、 通常の PCR (サンプル 1 ) に比べて変性操作をしなくても十分なハイプリダイゼ一シヨンシ グナルが得られることがわかった。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 複数種のプライマーを用いる一本鎖目的核酸断片の増幅方法であって、 少なくとも 1種のプライマーが、 錶型である一方の鎖とハイブリダィズして、 ループ構造を形成し得る一本鎖目的核酸断片を合成し、 該ループ構造によって、 その核酸断片を錶型とする伸長反応であって、 かつ前記鎖に相補的なもう一方の 鎖とハイプリダイズするブライマ一による伸長反応が抑制されることを特徴とす る、 一本鎖目的核酸断片の増幅方法。
2 . 前記ループ構造が、 一本鎖核酸断片を合成する前記プライマーと、 前記 プライマ一による伸長反応により形成される伸長生成物上の塩基との結合により 生ずる、 請求項 1に記載の方法。
3 . ループ構造を形成し得る一本鎖核酸断片を合成する前記プライマ一が、 その 5， 端側に、 このプライマ一とハイブリダィズする鎖において、 このプライ マ一と相補的である領域よりもその鎖の 5 5 端側の配列から選択される核酸部分 を有し、 かつ、 この核酸部分の配列が、 もう一方の鎖とハイブリダィズするブラ イマ一の配列と全部または一部が同一である、 請求項 1または 2に記載の方法。
4 . ループ構造を形成し得る一本鎖核酸断片が、 この一本鎖核酸断片を合成 する前記プライマーとハイプリダイズする鎖において、 このプライマ一と相補的 である配列よりもその鎖の 3， 端側の配列とハイブリダイズするブラィマーによ る鎖置換伸長反応によって生じたものである、 請求項 1〜 3のいずれか一項に記 載の方、法。
5 . 一本鎖目的核酸断片の合成が、 遺伝子増幅法にしたがって行われる、 請 求項 1〜 4のいずれか一項に記載の方法。
6 . 遺伝子増幅法が、 P C R法、 S D A法、 L AMP法、 I C A N法、 R C A法、 N A S B A法、 および T MA法からなる群より選択される、 請求項 5に記 載のの方法。
7 . 一本鎖目的核酸断片の増幅のために用いられる複数種のプライマーを含 んでなるプライマーセヅトであって、
少なくとも 1種のプライマーが、 錶型である一方の鎖とハイブリダィズして、 ループ構造を形成し得る一本鎖目的核酸断片を合成し、 該ループ構造によって、 その核酸断片を錡型とする伸長反応であって、 かつ前記鎖に相補的なもう一方の 鎖とハイプリダイズするブラィマ一による伸長反応が抑制されるものであること を特徴とする、 プライマーセヅト。
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