WO2003042241A2 - Verfahren zur induktion der produktion von stressproteinen in pflanzlichem material - Google Patents

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Ralf Goldmann
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Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing the intracellular production of stress proteins in plant material, high-quality feed and / or pure stress proteins being obtained.
  • Heat stress proteins also known as HSPs
  • HSPs Heat stress proteins
  • the main stress proteins are divided into four families, namely HSP 90, HSP 70, HSP 60 and a low-molecular HSP family.
  • the most important members of the low-molecular HSP family are HSP 45, HSP 20 and HSP 17.
  • WO 00/70931 describes a method for producing stress proteins from plant material, the plants being harvested and heated immediately before and / or during and / or after harvesting in order to increase the production of stress proteins in the plant material induce.
  • the heating can take place by introducing the vegetable material into closed containers, as a result of which the vegetable material changes the endobiochemical processes are heated, or can be carried out using a radiator or blower.
  • the solution to the problem is a method comprising the steps of a) providing plant material, b) introducing the plant material into a liquid medium at a temperature suitable for inducing stress proteins, and if necessary c) separating the plant material.
  • vegetable material includes both plants and seeds as well as harvested vegetable material of all kinds.
  • the vegetable material is harvested in step a) to provide the vegetable material, preferably before flowering.
  • Aquatic plants, algae, soybeans, grass, cereals and / or alfalfa are preferably used as the vegetable material.
  • the vegetable material is preferably grown within 10 to 120 minutes, most preferably between 30 and 60 minutes. introduced into the liquid medium in an uncrushed form according to step b).
  • the liquid medium is preferably water, which can be mixed with other stressors.
  • the temperature of the liquid medium and possibly the additional stressors are suitable for inducing the production of stress proteins in the plant material.
  • the temperature of the liquid medium should preferably be about 30 to about 55 ° C.
  • the duration of the induction is preferably between about 10 minutes. and about 300 minutes, preferably between 30 and 120 minutes.
  • the temperature can either be preset, or it can be increased or decreased at variable time intervals. This results in different induction times and thus different heat stress reactions in the plants or parts of plants, which in turn lead to different HSP synthesis profiles.
  • the temperature of the induction bath can be increased uniformly from 25 ° C up to 55 ° C over the induction period. For example, this temperature increase can take place over a period of 30 to 60 minutes. during the entire induction period.
  • Induction with an alternating bath has also proven to be advantageous, the first induction bath having a temperature of up to 55 °, preferably around 40 ° C. and a second induction bath having a temperature of between 25 ° and 30 ° C. and the plants or plant constituents first for about 10 min. exposed to the first induction bath, then about 15 min. the second induction bath and then again up to 180, preferably 90 to 120 min. the first induction bath.
  • the vegetable material is heated uniformly, in contrast to the previously known method, whereby the uniform heating can be supported by a circulation system in the induction bath with a vertical flow direction.
  • the plant material can be exposed to additional chemical and / or physical stressors before, during and / or after, preferably during, step b). Lack of light, electromagnetic fields and UV radiation can be used as additional physical stressors.
  • High salt concentrations, alcohols or heavy metal ions, preferably copper ions, aluminum ions, zinc ions, can be used as additional chemical stressors.
  • the stress on the living plant cell is increased, the production of the stress proteins is additionally induced and the heating time in the induction bath is shortened after the change in protein synthesis in the cell, which takes about 10 minutes.
  • the plant material can be exposed to activators which stimulate the plant metabolism before, during and / or after, preferably during step b).
  • nutrients such as CO 2 and trace elements as well as fertilizer can be added to the induction bath to supply the living plant material or the plant material is additionally exposed to a low-energy ultrasound load.
  • the activators stimulate the metabolism of the cells, which in turn increases the production of the stress proteins during the influence of stressors inducing the production of the stress proteins.
  • the plant material is advantageously introduced into the liquid medium in a dip tank.
  • the vegetable material can also be introduced into several plunge pools in succession at different temperatures.
  • the plant material can be introduced into a cooled liquid medium, preferably water, in order to slow down or even completely prevent the absorption and auto-degradation of the induced HSP before further processing.
  • step c) the vegetable material is separated from the liquid medium.
  • the separation can preferably be carried out by introducing the vegetable material into a centrifuge.
  • the plant material can be placed in a vacuum drying chamber.
  • the temperature in the vacuum drying chamber is preferably about 4 ° C., which is preferably achieved by additional heating of the material to be dried by infrared radiation. Since the plant material is preferably not comminuted and therefore living cells are contained in the plant material, a final induction of the production of stress proteins by cold, lack of oxygen and / or ice formation on the plant material is brought about when introduced into the vacuum drying chamber.
  • the vegetable material can additionally be crushed and pressed, the pressing being carried out in particular in such a way that "loose" press cakes are obtained, and the temperature during the pressing process is clearly below 95 ° C., preferably below 45 ° C is held.
  • the feed according to the invention is preferably packed in airtight bags under nitrogen or vacuum, so that preservation with chemical preservatives is avoided.
  • the feed according to the invention has a residual moisture content of ⁇ 10% and contains about 0.5 to about 50 g of stress proteins per ton of feed. It is therefore ideally suited as an additional feed for animals, since HSPs given orally also stabilize the immune system in animals.
  • a plant according to the invention for producing feed containing HSP will preferably enable a throughput of one to four tons per hour.
  • seeds, duckweed or algae are used as the plant material.
  • the seeds are preferably germinated without light prior to use in the method of the invention. This has the advantage that no chlorophyll and practically no Rubisco are formed, which would have to be separated off later when high-purity HSP was obtained.
  • the algae or duckweed can preferably be propagated with optimal nutrient supply and slight temperature stress at temperatures between about 25 to about 35 ° C. and optionally with low-energy ultrasound treatment before being exposed to the induction bath or baths.
  • steps b) and c) are carried out in accordance with the embodiment described above, the vegetable before the material after step c) is preferably not introduced into a vacuum drying chamber.
  • the vegetable material separated in step c) is then further processed by cutting and grinding.
  • the millbase obtained is then subjected to microfiltration, such as pressing using a membrane with 150 kDalton or a ceramic or polymeric hollow fiber of the same pore size.
  • the juice thus obtained is subjected to ultrafiltration against an ultrafiltration cascade with 80, 60, 30 and 10 kDaltons.
  • the vegetable material is preferably processed further at a temperature of about 2 ° C. in order to avoid the protease, the degradation of the HSP by enzymes.
  • the retenates obtained after ultrafiltration are subjected to a chromatography sequence from an ion exchanger and affinity chromatography to isolate the stress proteins contained in the retenates.
  • the HSP can also be deposited with a suitable antibody, preferably with a magnetically labeled antibody and separated in a magnetic field or with a suitable surface which binds the antibodies.
  • a suitable antibody preferably with a magnetically labeled antibody and separated in a magnetic field or with a suitable surface which binds the antibodies.
  • the juice after microfiltration can be used in conjunction with different antibodies to obtain different HSPs, or the residues obtained after the respective ultrafiltration steps can be used.
  • High-purity stress proteins are thereby obtained, and the plant for obtaining high-purity HSP can be designed for processing up to 100 kg of plant material, from which, for example, up to 5 g of HSP 70 can be obtained.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion der innerzellulären Produktion von Stressproteinen in pflanzlichem Material, wobei hochwertige Futtermittel und/oder reine Stressproteine erhalten werden.

Description

Verfahren zur Induktion der Produktion von Stressproteinen in pflanzlichem Material
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion der innerzellulären Produktion von Stressproteinen in pflanzlichem Material, wobei hochwertige Futtermittel und/oder reine Stressproteine erhalten werden.
Hitzestressproteine, die auch als HSPs bezeichnet werden, werden in einer Zelle gebildet, wenn diese einer Stresssituation, wie Wärme, ausgesetzt wird. Es ist eine große Anzahl an Genen bekannt, die Stressproteine kodieren. Die wichtigsten Stressproteine werden in vier Familien eingeteilt, nämlich HSP 90, HSP 70, HSP 60 und eine niedermolekulare HSP-Familie. Die niedermolekulare HSP-Familie hat als wichtigste Mitglieder HSP 45, HSP 20 und HSP 17.
Auch wenn die genaue Wirkungsweise und Funktion von Stressproteinen, auch als Chaperone bekannt, noch nicht vollständig erforscht ist, wird angenommen, dass diese die korrekte Faltung von Proteinen überwachen, falsch gefaltete Proteine restrukturieren, die Zelle und insbesondere die DNA und auch die mRNA vor schädigenden Umwelteinflüssen schützen sowie eine wesentliche Rolle in der Stimulierung des Immunsystems spielen. Daher finden Stressproteine Verwendung auf den Gebieten der Medizin, Veterinärmedizin, Molekularbiologie, Pharmazie, Kosmetik und dem Pflanzenschutz.
Verfahren zur Induktion der Produktion von Stressproteinen in pflanzlichem Material sind bekannt. So ist beispielsweise in der WO 00/70931 ein Verfahren zum Herstellen von Stressproteinen aus pflanzlichem Material beschrieben, wobei die Pflanzen geerntet und unmittelbar vor und/oder während und/oder nach dem Ernten erwärmt werden, um die Produktion von Stressproteinen in dem pflanzlichen Material zu induzieren.
Das Erwärmen kann dabei durch Einbringen des pflanzlichen Materials in verschlossene Behälter erfolgen, wodurch sich das pflanzliche Material aufgrund der endobiochemischen Vorgänge erwärmt, oder durch Verwendung eines Strahlers oder Gebläses durchgeführt werden.
Allerdings sind diese Verfahren zum Erwärmen des pflanzlichen Materials auf- wendig und ermöglichen keine gleichmäßige Erwärmung des geschnittenen Pflanzenmaterials. Daher liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
Die Lösung der Aufgabe ist ein Verfahren umfassend die Schritte, a) Bereitstel- len von pflanzlichem Material, b) Einbringen des pflanzlichen Materials in ein flüssiges Medium mit einer für die Induktion von Stressproteinen geeigneten Temperatur, und gegebenfalls c) Abtrennen des pflanzlichen Materials.
Im Sinne dieser Erfindung umfasst der Begriff "pflanzliches Material" sowohl Pflanzen und Samen als auch geerntetes pflanzliches Material jeder Art.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zum Bereitstellen des pflanzlichen Materials in Schritt a) das pflanzliche Material geerntet, vorzugsweise vor der Blüte. Als pflanzliches Material werden vorzugsweise Wasserpflanzen, Algen, Sojabohnen, Gras, Getreide und/oder Luzerne verwendet.
Nach dem Ernten wird das pflanzliche Material vorzugsweise innerhalb von 10 bis 120 min., am besten zwischen 30 und 60 min. in unzerkleinerter Form ge- maß Schritt b) in das flüssige Medium eingebracht. Das flüssige Medium ist vorzugsweise Wasser, das mit weiteren Stressoren versetzt werden kann . Die Temperatur des flüssigen Mediums sowie gegebenenfalls die zusätzlichen Stressoren sind geeignet, um die Produktion von Stessproteinen im pflanzlichen Material zu induzieren. Hierbei sollte die Temperatur des flüssigen Mediums vorzugsweise etwa 30 bis etwa 55 °C betragen. Die Dauer der Induktion liegt vorzugsweise zwischen etwa 10 min. und etwa 300 min., am besten zwischen 30 und 120 min.. Hierbei kann die Temperatur entweder voreingestellt sein, oder aber in variablen zeitlichen Abständen erhöht oder erniedrigt werden. Es ergeben sich so unterschiedliche Induktionszeiten und damit unterschiedliche Hitzestressreaktionen der Pflanzen bzw. Pflanzenteile, die wiederum zu unterschiedlichen HSP-Syntheseprofilen führen. Beispielsweise kann die Temperatur des Induktionsbades über der Induktionsdauer gleichmäßig von 25° C auf bis zu 55° C erhöht werden. Beispielsweise kann diese Temperaturerhöhung während eines Zeitabschnittes von 30 bis 60 min. während der Gesamtinduktionsdauer erfolgen. Als vorteilhaft erweist sich auch die Induktion mit einem Wechselbad, wo- bei das erste Induktionsbad eine Temperatur bis 55°, vorzugsweise um 40° C aufweist und ein zweites Induktionsbad eine Temperatur zwischen 25° und 30° C aufweist und die Pflanzen bzw. Pflanzenbestandteile zuerst für etwa 10 min. dem ersten Induktionsbad ausgesetzt werden, anschließend etwa 15 min. dem zweiten Induktionsbad und dann wieder bis zu 180, vorzugsweise 90 bis 120 min. dem ersten Induktionsbad.
Durch das Einbringen in ein flüssiges Medium bei einer geeigneten Temperatur wird das pflanzliche Material im Unterschied zu dem vorbekannten Verfahren gleichmäßig erwärmt, wobei die gleichmäßige Erwärmung durch eine in dem Induktionsbad vorhandene Umwälzanlage mit einer senkrechten Strömungsrichtung unterstützt werden kann.
Zusätzlich zum Erwärmen kann das pflanzliche Material vor, während und/oder nach, vorzugsweise während, Schritt b) zusätzlichen chemischen und/oder phy- sikalischen Stressoren ausgesetzt werden. Als zusätzliche physikalische Stressoren können Lichtmangel, elektromagnetische Felder sowie eine UV-Strahlung eingesetzt werden.
Als zusätzliche chemische Stressoren können hohe Salzkonzentrationen, Alko- hole oder Schwermetallionen, vorzugsweise Kupferionen, Aluminiumionen, Zinkionen verwendet werden. Dadurch wird der Stress auf die lebende Pflanzenzelle erhöht, die Produktion der Stressproteine zusätzlich induziert und die Erwärmungsdauer im Induktionsbad nach der etwa 10 Minuten dauernden Umstellung der Proteinsynthese in der Zelle verkürzt. Außerdem kann das pflanzliche Material vor, während und/oder nach, vorzugsweise während Schritt b), Aktivatoren ausgesetzt werden, die den pflanzlichen Stoffwechsel anregen. Als Aktivatoren können dem Induktionsbad zur Versor- gung des lebenden pflanzlichen Materials Nährstoffe, wie CO2 und Spurenelemente sowie Dünger zusetzt werden oder das pflanzliche Material wird zusätzlich einer niedrigenergetischen Ultraschallbelastung ausgesetzt. Durch die Aktivatoren wird der Stoffwechsel der Zellen angeregt, wodurch wiederum die Produktion der Stressproteine während des Einflusses von die Produktion der Stressproteine induzierenden Stressoren erhöht wird.
Vorteilhafterweise wird das pflanzliche Material in Schritt b) in einem Tauchbek- ken in das flüssige Medium eingebracht. Das pflanzliche Material kann auch in mehrere Tauchbecken nacheinander mit unterschiedlichen Temperaturen ein- gebracht werden. Außerdem kann das pflanzliche Material nach der Induktion in ein gekühltes flüssiges Medium, vorzugsweise Wasser, eingebracht werden, um die Resorption und den Autoabbau der induzierten HSP vor der Weiterverarbeitung zu verlangsamen oder sogar ganz zu unterbinden.
In Schritt c) wird das pflanzliche Material vom flüssigen Medium abgetrennt.
Das Abtrennen kann vorzugsweise mittels Einbringen des pflanzlichen Materials in eine Schleuder erfolgen.
Sollte es erwünscht sein, das pflanzliche Material noch weiter vom flüssigen Medium zu befreien, kann dieses in eine Vakuumtrockenkammer eingebracht werden. Bevorzugt ist die Temperatur in der Vakuumtrockenkammer etwa 4 °C, was vorzugsweise durch zusätzliches Erwärmen des Trocknungsgutes durch Infrarotstrahlung erreicht wird. Da vorzugsweise das pflanzliche Material nicht zerkleinert ist und daher lebende Zellen in dem pflanzlichen Material enthalten sind, wird beim Einbringen in die Vakuumtrockenkammer eine abschließende Induktion der Produktion von Stressproteinen durch Kälte, Sauerstoffmangel und/oder Eisbildung auf dem pflanzlichen Material bewirkt. Nach Schritt c) kann das pflanzliche Material zusätzlich zerkleinert und ver- presst werden, wobei das Verpressen insbesondere so durchgeführt wird, dass "lose" press cakes erhalten werden, und während des Pressvorganges die Temperatur deutlich unter 95° C, vorzugsweise unterhalb von 45° C gehalten wird. Dieses ist notwendig, da den vorbekannten Presstechniken mit sehr hohem Druck ein hochverdichteter press cake erzeugt wird und die dabei entstehenden Presstemperaturen zum Abbau oder zur Denaturierung der induzierten HSP führen. Mit den niedrigen Presstemperaturen wird ein erfindungsgemäßes, einen hohen HSP-Anteil aufweisendes Futtermittel erhalten.
Das erfindungsgemäße Futtermittel wird bevorzugt in luftdichte Beutel unter Stickstoff oder Vakuum verpackt, damit wird eine Konservierung mit chemischen Konservierungsmitteln vermieden.
Das erfindungsgemäße Futtermittel hat eine Restfeuchte von < 10% und enthält etwa 0,5 bis etwa 50 g Stressproteine pro Tonne Futtermittel. Daher ist es ausgezeichnet geeignet als Zusatzfuttermittel für Tiere, da auch bei Tieren oral gegebene HSP das Immunsystem stabilisieren. Eine erfindungsgemäße Anlage zur Erzeugung HSP-haltiger Futtermittel wird vorzugsweise einen Durchsatz von einer bis vier Tonnen pro Stunde ermöglichen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden als pflanzliches Material Samen, Wasserlinsen oder Algen verwendet. Die Samen werden vorzugsweise vor der Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren ohne Licht zum Keimen gebracht. Das hat den Vorteil, dass sich kein Chlorophyll und so gut wie kein Rubisco bildet, die bei der Gewinnung hochreiner HSP später abgetrennt werden müßte. Die Algen bzw. Wasserlinsen können vorzugsweise bei optimaler Nährstoffzufuhr umd leichtem Temperaturstreß bei Temperaturen zwischen etwa 25 bis etwa 35 °C und gegebenenfalls unter niedrigenergeti- scher Ultraschallbehandlung vermehrt werden bevor sie dem oder den Induktionsbädern ausgesetzt werden.
Für die Gewinnung hochreiner HSP werden die Schritte b) und c) gemäß der vorstehend beschriebenen Ausführungsform durchgeführt, wobei das pflanzli- ehe Material nach Schritt c) vorzugsweise nicht in eine Vakuumtrockenkammer eingebracht wird.
Sodann wird das in Schritt c) abgetrennte pflanzliche Material durch Schneiden und Aufmahlen weiter verarbeitet. Das erhaltene Mahlgut wird daraufhin einer Mikrofiltration, wie Abpressen mittels einer Membran mit 150 kDalton oder einer keramischen oder polymeren Hohlfaser gleicher Porengröße, unterworfen. Der so erhaltene Saft wird einer Ultrafiltration gegen eine Ultrafiltrationskaskade mit 80, 60, 30 und 10 kDalton unterworfen. Vorzugsweise wird das pflanzliche Ma- terial nach Schritt c) bei einer Temperatur von etwa 2 °C weiterverarbeitet, um die Protease, den Abbau der HSP durch Enzyme zu vermeiden.
Die nach der Ultrafiltration erhaltenen Retenate werden zur Isolierung der jeweilig in den Retenaten enthaltenen Stressproteine einer Chromatographiefolge aus einer Ionenaustauscher- und Affinitätschromatographie unterzogen.
Ebenfalls kann die Abscheidung der HSP mit einem geeigneten Antikörper, vorzugsweise mit einem magnetisch markierten Antikörper und einer Abtrennung in einem Magnetfeld oder einer geeigneten, die Antikörper bindenden Oberfläche, erfolgen. Hierbei kann der Saft nach der Mikrofiltration in Verbindung mit unterschiedlichen Antikörpern zur Gewinnung unterschiedlicher HSP genutzt werden oder es werden die nach den jeweiligen Ultrafiltrationsschritten gewonnen Re- tentate genutzt. Dadurch werden hochreine Stressproteine erhalten, wobei die Anlage zur Gewinnung hochreiner HSP auf die Verarbeitung bis zu 100 kg Pflanzenmaterial ausgelegt sein kann, aus dem zum Beispiel bis zu 5g HSP 70 gewonnen werden können.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Induktion der Produktion von Stressproteinen in pflanzlichem Material, umfassend die Schritte, a) Bereitstellen von pflanzlichem Material, und b) Einbringen des pflanzlichen Materials in ein flüssiges Medium mit einer für die Induktion der Produktion von Stressproteinen geeigneten Temperatur.
Verfahren nach Anspruch 1, zusätzlich den Schritt umfassend,
c) Abtrennen des pflanzlichen Materials vom flüssigen Medium.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das pflanzliche Material ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserpflanzen, Algen, Sojabohnen, Gras, Getreide, Luzerne, und deren Samen.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das in Schritt b) verwendete flüssige Medium Wasser ist.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Temperatur des flüssigen Mediums in Schritt b) 30 bis 55 °C beträgt.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt b) etwa 10 bis etwa 300 min. durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das in Schritt b) in ein flüssiges Medium eingebrachte pflanzliche Material zusätzlich chemischen und/oder physikalischen Stressoren ausgesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das in Schritt b) in ein flüssiges Medium eingebrachte pflanzliche Material zusätzlich Aktivatoren für den Pflanzenstoffwechsel ausgesetzt werden.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das pflanzliche Material in Schritt b) in einem Tauchbecken in das flüssige Medium eingebracht wird.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das flüssige Medium mit Durchströmung des Induktionsgutes in Schritt b) umgewälzt wird.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt b) 1 bis 3-mal wiederholt wird, wobei die Temperatur in einem ersten Induktionsbad bis zu 55° C und in einem zweiten Induktionsbad bis zu 35° C beträgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11 , wobei das pflanzliche Material in Schritt c) von dem flüssigen Medium mittels einer Schleuder abgetrennt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das pflanzliche Material zusätzlich durch Einbringen in eine Vakuumtrockenkammer vom flüssigen Medium abgetrennt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Druck in der Vakuumkammer kontinuierlich abgesenkt wird und die Temperatur in der Vakuumkammer etwa 2 bis etwa 6 °C beträgt.
15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das pflanzliche Material nach Schritt c) zerkleinert wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 15, wobei das pflanzliche Material nach Schritt c) vorzugsweise bei einer Presstemperatur unter 45° C verpresst wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, wobei das pflanzliche Material nach Schritt c) ausgemahlen und der Pflanzensaft abgepreßt bzw. abzentrifugiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das gemahlenen pflanzliche Material einer Mikrofiltration, Ultrafiltration, Chromatograpie und/oder Trennung mit geeigneten Antikörpern einmal oder mehrmals unterworfen wird, wodurch einzelne reine Stressproteine wie HSP 70 oder mehrere HSP- Arten in einem Arbeitsgang erhalten werden.
19. Futtermittel, erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18.
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