WO2003027268A2 - Souches de lactococcus lactis et leur application a la conservation de produits alimentaires - Google Patents

Souches de lactococcus lactis et leur application a la conservation de produits alimentaires Download PDF

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    • A23V2400/21—Streptococcus, lactococcus
    • A23V2400/231—Lactis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention relates to a new strain of lactic acid bacteria, Lactococcus lactis species.
  • This invention further relates to cultures, biomasses, extracts derived from this strain and their use in the preservation of food products.
  • This invention also relates to compositions incorporating such a strain, to food products treated with such a strain and to methods of preserving such food products.
  • the present invention is the result of studies carried out in the field of the preservation of food products, in particular seafood products packaged under vacuum or in a controlled atmosphere.
  • Fresh fish is a particularly perishable food making its conservation difficult and limiting its distribution.
  • the spoilage of fresh chilled fish is caused by the development of non-pathogenic microorganisms producing ammonia, amines, hydrogen sulphide ...
  • Vacuum or modified atmosphere packaging does not completely inhibit this weathering flora, part of which is able to adapt to anaerobic conditions. This results in the development of unpleasant odors, which concentrate quickly, even before the taste of the fish is affected.
  • the "sous-vide" and the modified atmosphere are however more and more appreciated modes of packaging because they combine the organoleptic and nutritional qualities of the fresh and a long shelf life.
  • Boudreaux et al. in 1989 use living Lactobacillus cells having the particularity of not fermenting and capable of producing hydrogen peroxide to inhibit the spoilage flora and the pathogenic flora of packaged refrigerated foods (U.S. No. 4,874,704).
  • hydroxygen peroxide is not very effective for fish and poses regulatory problems.
  • Matrozza et al. (1989) add a mixture of Streptococcus lactis and Pediococcus based on non-viable cells to inhibit the psychrotrophic flora of refrigerated milk without obtaining a phenomenon of fermentation or growth of the lactic flora (US No. 4,880,743). This inhibition process is therefore based on the production of active molecules.
  • Dr. Hall's team at Loughborough University tested different strains of lactic acid bacteria isolated from marine products to preserve minced whiting flesh. The addition of ferment (strains of Lactococcus or Carnobacterium) had no effect on the organoleptic qualities of the products nor on the inhibition of the spoilage flora.
  • Lactic acid bacteria isolated from fish, exhibiting inhibitory activities vis-à-vis the spoilage flora of fish or monocytogenic strains of Listeria have been the subject of various studies (Stoffels et al., 1992; Pilet et al. , 1995; Leroi et al., 1996). The strains studied are all related to the genus Carnobacterium. A strain of Leuconostoc isolated from fish has also shown the ability to inhibit monocytogenic strains of Listeria (Jeppensen and Huss, 1993). However, these strains grow at 30 ° C. It is therefore impossible to separate the alteration flora from the strain during routine microbiological analyzes.
  • An object of the present invention is to propose a new strain of lactic acid bacteria capable of delaying the development of bad odors on refrigerated food products preferably packaged in a controlled atmosphere or under vacuum and in inhibiting close germs as well as pathogenic germs for extend the shelf life of food products, particularly packaged seafood.
  • Another object of the invention is to propose a new strain of lactic acid bacteria incapable of developing at 30 ° C. so as to allow the enumeration of the spoilage flora of food products within the framework of routine microbiological analyzes.
  • the present invention provides a new strain of lactic acid bacteria, namely Lactococcus lactis suitable for use in the field of preserving food products, in particular seafood.
  • strain Lactococcus lactis LLO A sample of the culture of the microorganism, in accordance with the invention, called strain Lactococcus lactis LLO, was deposited on September 11, 2001 under the Budapest Treaty in the national collection of culture of French microorganisms (CNCM), Institut Pasteur - 28 rue du Dondel Roux - 75724 PARIS CEDEX 15. The sample received the N ° CNCM I- 2716.
  • CNCM French microorganisms
  • cultures, biomasses and extracts obtained from the strain as mentioned above are also provided.
  • this invention includes the strains of Lactococcus lactis obtained from mutation, variation, recombination of the strain Lactococcus lactis LLO.
  • Another subject of the invention relates to the use of cultured strains, biomasses, extracts of Lactococcus lactis LLO for the preservation of food products as an agent delaying the appearance of bad odors or slowing down the development of spoilage flora. refrigerated food products, preferably packaged in a reduced oxygen atmosphere.
  • Another subject of the invention relates to a food composition for the conservation in a refrigerated state of food products, in particular seafood products, preferably packaged under an atmosphere reduced in oxygen, characterized in that it comprises at least Lactococcus lactis LLO or a variant or mutant thereof.
  • Another object of the invention relates to a food product stored in a refrigerated state and preferably packaged under an atmosphere reduced in oxygen, characterized in that said product has on its surface a biological barrier consisting at least of Lactococcus lactis LLO or d 'a variant or mutant thereof.
  • Another object of the invention relates to a process for preserving in a refrigerated state food products, in particular seafood products, preferably packaged in an atmosphere reduced in oxygen before consumption, characterized in that it consists in putting in contact with the food product to be stored and Lactococcus lactis prior to packaging said product so as to form a biological barrier on the surface of said product which slows down the development of bad odors and the growth of the spoilage flora of said product.
  • Lactococcus lactis LLO strain was isolated from refrigerated whiting fillets preserved in the presence of reduced oxygen content.
  • the Lactococcus lactis LLO strain corresponds to the definition of a lactic acid bacteria. It is related to the genus Lactococcus species Lactis. Its metabolism in milk or fish stock does not produce any alteration phenomenon. It inhibits the alteration flora of whiting, salmon and crustaceans.
  • the cells of the Lactococcus lactis LLO strain are ovoid, immobile. They appear in pairs or in chains.
  • these cells are Gram positive, catalase negative, oxidase negative. They do not form spores. They are facultative anaerobic and have a fermentative metabolism.
  • the fermentation of glucose is accompanied by a slight production of gas.
  • the strain is however homofermentative. It belongs to the genus Lactococcus.
  • the strain does not hydrolyze arginine, urea or starch does not produce indole or hydrogen sulfide and does not acidify milk. It does not reduce nitrates, it is hemolytic. It produces acetoin.
  • the strain is psychrotrophic and develops between 2 and 25 ° C with a growth optimum close to 20 ° C. It is cultivated in the following culture media: MRS pH 6.5, Elliker, M17, Trypticase Soy agar with blood. It does not grow on the agar medium of ROGOSA, nor at 30 ° C. It develops on the flesh of refrigerated fish or crustaceans without adding an odor or an altered taste.
  • the test is carried out on Mueller Hinton medium containing 1.7% agar and 5% horse blood, the pH is 7.3.
  • the thickness of the agar in the petri dishes is constant, it is 4 mm. It is a standardized medium according to O.M.S.
  • the LLO strain is cultivated in an MRS pH 6.5 broth for 48 to 36 hours at 15 ° C. until the stationary phase is obtained.
  • the culture is diluted to 1/10 in a Mueller Hinton broth.
  • the approximate concentration of the suspension is 10 6 bacteria / ml.
  • the agar media are completely flooded with 2 ml of suspension. The excess liquid is removed and the dishes are left to dry for 10 minutes at room temperature. The antibiotic discs are deposited using forceps (4 maximum). The dishes are incubated at room temperature for 48 hours.
  • a genetic identification was carried out by pulsed field electrophoresis after digestion of the genome with a restriction enzyme at rare sites.
  • the bacterial biomass from 10 ml of culture (48 hours in MRS medium, 18 ° C) is recovered by centrifugation (10 min at 4000 g).
  • the cell pellet is taken up in 10 ml of TE buffer (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) then homogenized with a vortex.
  • the DO600 is then taken.
  • Centrifuge (10 min at 4000 g) and the pellet is taken up in DO600 / 0.7 ml of T100E buffer (10 mM Tris, 100 mM EDTA, pH 7.5).
  • the cell suspension is mixed V / V with an LMP (low melting point) agar (2% in TE). Leave to cool to 4 ° C and cut the plugs 1 mm thick.
  • the plug is washed in 10 ml of TE buffer (20 min) and then the migration gel is loaded.
  • the device used is a GeneLine (Beckman).
  • the enzyme used is Apa I.
  • the first column corresponds to 10 s of draw for 16 hours to identify large fragments.
  • the second column corresponds to 7 s of draw for 16 hours to identify the intermediate fragments.
  • the third column corresponds to 2 s of draw for 7 hours then 4 s of draw for 4 hours to identify small fragments.
  • the migration buffer is 0.25 X TBE and the temperature is 12 ° C.
  • the indicator strains were cultivated for 24 to 48 hours at 30 ° C. in M17 or MRS broth for lactic acid bacteria and in nutritive broth for non-lactic acid, before being sown in the same medium containing 1% agar.
  • the final concentration in indicator strain is of the order of 10 7 CFU / ml.
  • This agar maintained under supercooling at 46 ° C. is poured into a Petri dish onto an identical agar containing 1.2% of agar previously cooled. After gelation of the second layer, a drop of pellet of the strain "O" cultivated in M17 broth at 20 ° C for 3 days and washed in physiological water is placed on each agar. The dishes are incubated at 30 ° C.
  • the sensitivity scale of the indicative strains vis-à-vis the LLO strain is established as follows:
  • Halo of 1 mm around the deposit + Halo of 2 to 3 mm around the deposit: ++
  • the LLO strain is inhibited by the nisin-producing strain Lactococcus lactis ATCC 11454.
  • Whiting fillets were purchased from a fishmonger. Control fillets are stored in a bag and stored in the refrigerator at 5 ° C. The test nets are seeded with the LLO strain by spraying the LLO strain in suspension in physiological water before being stored in a second bag and stored at 5 ° C. On these two types of nets are carried out sensory analyzes and microbiological analyzes. Sensory analyzes are carried out using a control and test sample. The odor and taste after cooking of each sample are scored according to a scale of scores as follows:
  • Microbiological analyzes are carried out in particular by counting aerobic mesophilic germs. The counts are made from a sample of 10 g of flesh suspended in 90 ml of sterile physiological water and homogenized for 3 minutes. This suspension is considered to be the parent suspension.
  • the counts of aerobic mesophilic germs growing at 30 ° C in 3 days are made from dilutions to one tenth of the mother suspension using the deep counting technique.
  • the culture medium is PCA agar, ordinary agar for enumeration in food microbiology.
  • the LLO strain is counted on MRS agar pH 6.5 using the deep counting technique, the dishes are incubated for 5 days at 15 ° C.
  • a composition comprising the Lactococcus lactis LLO strain or a variant or mutant thereof as a food composition for the preservation in a refrigerated state of food products.
  • refrigeration is meant food products stored in a temperature range between about 0 ° C and 12 ° C.
  • this strain does not develop at a temperature of 30 ° C. This allows a count of the flora of food products as part of routine microbiological analyzes. It is also noted that the effect of this strain is increased when it is applied to food products stored in an atmosphere reduced in oxygen.
  • a control fresh salmon fillet is sliced into eight portions of 100 to 200 g, then wrapped in individual bags and put under vacuum before being stored in a cold room between 2 and 4 ° C.
  • test sample is prepared in the same way except that it comprises between the slicing step and the packaging step a step of seeding by spraying with the LLO strain in suspension in water. physiological.
  • sensory analyzes are carried out on the one hand, and microbiological examinations on the other.
  • Sensory analyzes are carried out using a control and test sample. The color of the flesh is visually controlled. After opening the sachets, the smell is noted on a note scale. If necessary, the sample is cooked in simmering water for a few minutes before being scored again.
  • the pH is measured at different points in the samples.
  • the value retained is an average of 3 measurements.
  • the counts are made from a sample of 10 g of flesh suspended in 90 ml of sterile physiological water and homogenized for 3 minutes. This suspension is considered to be the parent suspension.
  • the counts of aerobic mesophilic germs growing at 30 ° C in 3 days are made from dilutions to one tenth of the mother suspension using the deep counting technique.
  • the culture medium is PCA agar, ordinary agar for enumeration in food microbiology.
  • the LLO strain is counted on MRS agar pH 6.5 using the deep counting technique, the dishes are incubated for 5 days at 15 ° C.
  • control shrimps are packed in packs of ten in trays under modified atmosphere.
  • the "test” shrimps are previously seeded with the LLO strain by spraying the LLO strain in suspension in physiological water. They are then packaged in sets of ten in trays under modified atmosphere and stored at 4 ° C.
  • Sensory analyzes are carried out from a "control” and "test” sample.
  • the color of the flesh is visually controlled.
  • the taste is noted according to a scale of notes identical to that provided for the example of the salmon above.
  • Counts are taken from a sample of 10 g of shrimp suspended in 90 ml of sterile physiological water and homogenized for 3 minutes. This suspension is considered to be the parent suspension.
  • the counts of mesophilic germs, aerobic growing at 30 ° C in 3 days, are made from dilutions to one tenth of the mother suspension using the technique of deep counting.
  • the culture medium is PCA agar, ordinary agar for enumeration in food microbiology.
  • the LLO strain is counted on MRS agar pH 6.5 using the deep counting technique, the dishes are incubated for 5 days at 15 ° C.
  • Lactococcus lactis LLO strain can be under
  • This Lactococcus lactis LLO strain can still come in the form of a suspension.
  • the food can be seeded also by spraying a powder incorporating the Lactococcus lactis LLO strain, or by spraying a cell suspension incorporating the above-mentioned strain, or by soaking the food in a bath containing the strain.
  • the strain can be used alone or mixed with a support.

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Abstract

L'invention concerne une nouvelle souche de Lactococcus lactis appelée souche Lactococcus lactis LLO et déposée à la CNCM sous le numéro d'accession CNCM I-2716. Application: conservateur de produits de la mer.

Description

Nouvelles bactéries lactiques du genre Lactococcus lactis et leur application à la conservation de produits alimentaires
La présente invention concerne une nouvelle souche de bactéries lactiques espèce Lactococcus lactis.
Cette invention se rapporte en outre à des cultures, biomasses, extraits dérivés de cette souche et leur utilisation dans la conservation de produits alimentaires.
Cette invention se rapporte encore à des compositions incorporant une telle souche, à des produits alimentaires traités au moyen d'une telle souche et à des procédés de conservation de tels produits alimentaires.
La présente invention est le résultat d'études menées dans le domaine de la conservation de produits alimentaires, en particulier de produits de la mer conditionnés sous vide ou dans une atmosphère contrôlée.
Le poisson frais est un aliment particulièrement périssable rendant sa conservation difficile et limitant sa distribution. L'altération du poisson frais réfrigéré est provoquée par le développement de micro-organismes non pathogènes produisant de l'ammoniac, des aminés, de l'hydrogène sulfuré... L'emballage sous vide ou sous atmosphère modifiée n'inhibe pas totalement cette flore d'altération dont une partie est capable de s'adapter à des conditions d ' anaérobiose . Il en résulte le développement d'odeurs désagréables qui se concentrent rapidement, avant même que le goût du poisson ne soit altéré. Le "sous-vide" et l'atmosphère modifiée sont cependant des modes de conditionnement de plus en plus appréciés car ils allient les qualités organoleptiques et nutritionnelles du frais et une durée de conservation élevée.
L'utilisation de bactéries lactiques pour préserver les aliments réfrigérés a fait l'objet de différents brevets ou publications .
Ainsi, Boudreaux et al. en 1989 utilisent des cellules vivantes de Lactobacillus ayant la particularité de ne pas fermenter et capables de produire du peroxyde d'hydrogène pour inhiber la flore d'altération et la flore pathogène des aliments réfrigérés emballés (U.S. N° 4.874.704). Toutefois, le Peroxyde d ' hydroxygène s'avère peu efficace pour les poissons et pose des problèmes en termes de réglementation .
Matrozza et al. (1989) rajoutent un mélange de Streptococcus lactis et de Pediococcus à base de cellules non viables pour inhiber la flore psychrotrophe du lait réfrigéré sans obtenir de phénomène de fermentation ou de croissance de la flore lactique (U.S. N° 4.880.743). Ce processus d'inhibition repose donc sur la production de molécules actives. Dans le cadre d'un programme FAR en 2000, l'équipe du Dr Hall de l'Université de Loughborough a testé différentes souches de bactéries lactiques isolées de produits marins pour préserver de la chair hachée de merlan. L'apport de ferment (souches de Lactococcus ou de Carnobacterium) n'avait pas d'incidence sur les qualités organoleptiques des produits ni sur l'inhibition de la flore d'altération.
Hutkins et al. (1993) introduisent dans les aliments réfrigérés conservés en anaérobiose des cellules vivantes de Pediococcus productrices de bactériocines . Les bactéries lactiques rajoutées ne se développent pas dans l'aliment, ne le fermentent pas et ne modifient pas ses qualités organoleptiques (U.S. N° 5.186.962). Ces bactéries productrices de bactériocines s'avèrent non viables à long terme. En outre, les bactériocines sont considérées comme des additifs de type antibiotique provoquant l'apparition de germes résistants et pouvant perdre ainsi leur efficacité.
Des essais de préservation de saumon fumé à l'aide d'une souche de Lactococcus lactis productrice de nisine ont été réalisés par essels et Huss en 1996. Il s'avère que la population de Lactococcus lactis décroît sur le saumon fumé conservé à 10°C, la souche n'étant pas psychrotrophe, ni adaptée à ce type de substrat. L'action combinée du sel et du taux de C02 permet d'augmenter les effets bactéricides de la nisine contre des souches de Listeria monocytogènes (Nilsson et al. 1997).
Parallèlement, le même type de souche a été étudié par Chen
Mei-Hui et Al. Des filets de maquereau ont été ensemencés par trempage dans une solution acide et salée contenant une forte concentration en cellules de Lactococcus lactis productrice de nisine. Après séchage, les filets sont conservés à 4°C dans des sacs. Les auteurs n'ont pas pu comparer l'évolution de la flore d'altération entre filets ensemencés et non ensemencés car les techniques de dénombrements classiques ne permettent pas de séparer la flore d'altération du ferment rajouté en très grande quantité (Chen Mei-Hui et Al . : "Processing of low-slated mackerel fillets using biopreservative" . Journal of the
Fisheries Society of Taiwan, vol. 24, no. 4, 1997 (1997- 12) , pages 327-336.
Des bactéries lactiques isolées de poisson, présentant des activités inhibitrices vis-à-vis de la flore d'altération du poisson ou de souches de Listeria monocytogènes ont fait l'objet de différentes études (Stoffels et al., 1992 ; Pilet et al., 1995 ; Leroi et al., 1996). Les souches étudiées sont toutes apparentées au genre Carnobactérium. Une souche de Leuconostoc isolée de poisson a également montré des aptitudes à inhiber des souches de Listeria monocytogènes (Jeppensen et Huss, 1993) . Toutefois, ces souches poussent à 30°C. Il est donc impossible de séparer la flore d'altération de la souche au cours d'analyses microbiologiques de routine.
La demande internationale WO 00/60947 décrit de nouvelles souches de bactéries productrices d'acide lactique. Ces bactéries lactiques sont toutes isolées de produits laitiers et croissent à 30°C. Aucune des bactéries impliquées n'altère les aliments à des températures inférieures à 7°C parce qu'elles ne se développent pas à ces températures. La population bactérienne est divisée par 100 après une à deux semaines de conservation. Les inhibitions des germes pathogènes n'ont lieu qu'à des températures supérieures à 8°C. Elles sont dues à la présence d'acides, de dioxide de carbone et de bactériocines ou autres. En conséquence, ces bactéries lactiques présentent divers inconvénients puisqu'elles sont incapables d'inhiber des germes indésirables à des températures inférieures à 8°C sans produire de bactériocine et qu'elles se développent à 30°C.
Un but de la présente invention est de proposer une nouvelle souche de bactérie lactique apte à retarder le développement de mauvaises odeurs sur des produits alimentaires réfrigérés de préférence conditionnés dans une atmosphère contrôlée ou sous vide et à inhiber des germes proches ainsi que des germes pathogènes pour prolonger la durée de conservation (DLC) des produits alimentaires, en particulier les produits de la mer conditionnés.
Un autre but de l'invention est de proposer une nouvelle souche de bactérie lactique incapable de se développer à 30 °C de manière à permettre le dénombrement de la flore d'altération de produits alimentaires dans le cadre d'analyses microbiologiques de routine.
A cet effet, la présente invention fournit une nouvelle souche de bactéries lactiques, à savoir Lactococcus lactis approprié pour une exploitation dans le domaine de la conservation des produits alimentaires, en particulier de produits de la mer.
Un échantillon de la culture du micro-organisme, conforme à l'invention, appelé souche Lactococcus lactis LLO, a été déposé le 11 septembre 2001 sous le Traité de Budapest dans la collection nationale de culture de micro-organismes française (CNCM) , Institut Pasteur - 28 rue du Docteur Roux - 75724 PARIS CEDEX 15. L'échantillon a reçu le N° CNCM I- 2716. Conformément à cette invention, les cultures, biomasses et extraits obtenus à partir de la souche comme mentionnée ci- dessus sont également prévus. Bien évidemment, cette invention inclut les souches de Lactococcus lactis obtenues à partir de mutation, variation, recombinaison de la souche Lactococcus lactis LLO.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de souches cultures, biomasses, extraits de Lactococcus lactis LLO pour la conservation de produits alimentaires en tant qu'agent retardant l'apparition de mauvaises odeurs ou ralentissant le développement de la flore d'altération de produits alimentaires réfrigérés et de préférence conditionnés dans une atmosphère réduite en oxygène.
Un autre objet de l'invention concerne une composition caractérisée en ce qu'elle contient au moins la souche Lactococcus lactis LLO ou un variant ou un mutant de celle- ci .
Un autre objet de l'invention concerne une composition alimentaire pour la conservation à l'état réfrigéré de produits alimentaires, en particulier de produits de la mer, conditionnés de préférence sous atmosphère réduite en oxygène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins Lactococcus lactis LLO ou un variant ou un mutant de celle- ci .
Un autre objet de l'invention concerne un produit alimentaire conservé à l'état réfrigéré et de préférence conditionné sous une atmosphère réduite en oxygène, caractérisé en ce que ledit produit présente à sa surface une barrière biologique constituée au moins de Lactococcus lactis LLO ou d'un variant ou d'un mutant de celui-ci. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de conservation à l'état réfrigéré de produits alimentaires, en particulier de produits de la mer, de préférence conditionnés dans une atmosphère réduite en oxygène avant consommation, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact le produit alimentaire à conserver et Lactococcus lactis préalablement au conditionnement dudit produit de manière à former une barrière biologique en surface dudit produit qui ralentit le développement de mauvaises odeurs et la croissance de la flore d'altération dudit produit.
L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence à la figure unique annexée qui représente, sous forme de trois colonnes, les migrations de différents fragments de restriction de 1 'ADN chromosomique de la souche LLO .
La souche Lactococcus lactis LLO a été isolée à partir de filets de merlan réfrigérés conservés en présence de teneur réduite en oxygène.
La souche Lactococcus lactis LLO correspond à la définition d'une bactérie lactique. Elle s'apparente au genre Lactococcus espèce Lactis. Son métabolisme dans le lait ou le fumet de poisson ne produit aucun phénomène d'altération. Elle inhibe la flore d'altération du merlan, du saumon et des crustacés .
Sur le plan morphologique, les cellules de la souche Lactococcus lactis LLO sont ovoïdes, immobiles. Elles apparaissent par paires ou en chaînes.
En ce qui concerne leurs caractéristiques de culture, ces cellules sont Gram positif, catalase négative, oxydase négative. Elles ne forment pas de spores. Elles sont anaérobies facultatives et ont un métabolisme fermentatif.
La fermentation du glucose s'accompagne d'une légère production de gaz. La souche est cependant homofermentaire . Elle appartient au genre Lactococcus.
La souche n' hydrolyse pas l'arginine, l'urée ou l'amidon ne produit pas d'indole, ni d'hydrogène sulfuré et n'acidifie pas le lait. Elle ne réduit pas les nitrates, elle est α hémolytique. Elle produit de l'acétoïne.
La souche est psychrotrophe et se développe entre 2 et 25°C avec un optimum de croissance proche de 20°C. Elle se cultive dans les milieux de cultures suivants : MRS pH 6,5, Elliker, M17, gélose Trypticase Soja au sang. Elle ne pousse pas sur le milieu gélose de ROGOSA, ni à 30°C. Elle se développe sur la chair de poissons ou de crustacés réfrigérée sans y apporter d'odeur, ni un goût altéré.
Un antibiogramme a été réalisé avec la souche LLO pour étudier sa résistance vis-à-vis de quelques antibiotiques.
Le test est réalisé sur milieu de Mueller Hinton contenant 1,7 % d'agar et 5 % de sang de cheval, le pH est de 7,3. L'épaisseur de la gélose dans les boîtes de Pétri est constante, elle est de 4 mm. Il s'agit d'un milieu standardisé selon les normes O.M.S.
La souche LLO est cultivée dans un bouillon MRS pH 6,5 pendant 48 à 36 heures à 15°C jusqu'à obtention de la phase stationnaire . La culture est diluée au l/10e e dans un bouillon Mueller Hinton. La concentration approximative de la suspension est de 106 bactéries/ml.
Les milieux géloses sont inondés entièrement avec 2 ml de la suspension. L'excès de liquide est retiré et les boîtes sont mises à sécher 10 minutes à température ambiante. Les disques antibiotiques sont déposés à l'aide d'une pince (4 maximum) . Les boîtes sont incubées à température ambiante pendant 48 heures.
Les résultats sont tels que suit :
Figure imgf000010_0001
Une identification génétique a été réalisée par électrophorèse en champ puisé après digestion du génome par une enzyme de restriction à sites rares.
Le mode opératoire est le suivant :
La biomasse bactérienne provenant de 10 ml de culture (48 heures en milieu MRS, 18°C) est récupérée par centrifugation (10 mn à 4000 g) . Le culot cellulaire est repris dans 10 ml de tampon TE (tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) puis homogénéisé au vortex. La DO600 est ensuite prise. On centrifuge (10 mn à 4000 g) et on reprend le culot dans DO600/0,7 ml de tampon T100E (Tris 10 mM, EDTA 100 mM, pH 7,5). On mélange V/V la suspension cellulaire avec une gélose LMP (à bas point de fusion) en fusion (2 % dans TE) . On laisse refroidir à 4°C et on découpe les plugs de 1 mm d'épaisseur. On incube 4 heures à 37°C dans 3 ml de tampon T100E contenant 2 mg/ml de lysozyme . On retire ensuite le mélange réactionnel . On incube 16 heures à 37°C dans 3 ml de tampon TESP (tris 10 mM ; EDTA 0,5 M ; Sarkosyl 10 % pH 7,5) contenant 3 mg de pronase . Après incubation, on lave 6 fois les plugs avec 10 ml de tampon TE (30 mn chaque lavage) puis on laisse digérer 4 heures par l'enzyme de restriction dans les conditions suivantes : volume total 120 μl, 30U d'enzyme, 1,2 μl de BSA et 1/10 du tampon préconisé par le fabricant OZYME .
Après digestion, on lave le plug dans 10 ml de tampon TE (20 mn) puis on charge le gel de migration.
L'appareil utilisé est un GeneLine (Beckman) .
L'enzyme utilisée est Apa I.
Trois conditions de migration sont appliquées afin de séparer dans les meilleures conditions les différents fragments de restriction obtenus. Les résultats sont fournis à la figure unique.
La première colonne correspond à 10 s de puise pendant 16 heures pour identifier les gros fragments.
La deuxième colonne correspond à 7 s de puise pendant 16 heures pour identifier les fragments intermédiaires. La troisième colonne correspond à 2 s de puise pendant 7 heures puis 4 s de puise pendant 4 heures pour identifier les petits fragments.
Le tampon de migration est TBE 0,25 X et la température est de 12°C.
Les résultats sont représentés à la figure unique.
Les effets inhibiteurs de la souche LLO ont été recherchés en boîte de Pétri par la technique de double couches.
Les souches indicatrices ont été cultivées pendant 24 à 48 heures à 30°C en bouillon M17 ou MRS pour les bactéries lactiques et en bouillon nutritif pour les non lactiques, avant d'être ensemencées dans le même milieu contenant 1 % d'agar. La concentration finale en souche indicatrice est de l'ordre de 107 CFU/ml . Cette gélose maintenue en surfusion à 46 °C est versée en boîte de Pétri sur une gélose identique contenant 1,2 % d'agar préalablement refroidie. Après gélification de la deuxième couche, une goutte de culot de la souche "O" cultivée en bouillon M17 à 20°C pendant 3 jours et lavée dans l'eau physiologique est déposée sur chaque gélose. Les boîtes sont incubées à 30°C.
L'échelle de sensibilité des souches indicatives vis-à-vis de la souche LLO est établie telle que suit :
Absence de halo : -
Halo de 1 mm autour du dépôt : + Halo de 2 à 3 mm autour du dépôt : ++
les résultats obtenus sont fournis dans le tableau ci- après :
Souches indicatrices Inhibition par la souche "0'
Figure imgf000013_0001
La souche LLO est inhibée par la souche Lactococcus lactis ATCC 11454 productrice de nisine.
Des expériences d'ensemencement de filets de merlan conservés en aérobie ont été réalisées avec la souche Lactococcus lactis LLO. Ces expériences sont décrites ci- dessous :
Des filets de merlan ont été achetés chez un poissonnier. Les filets témoins sont rangés dans un sac et conservés au réfrigérateur à 5°C. Les filets essais sont ensemencés avec la souche LLO par pulvérisation de la souche LLO en suspension dans l'eau physiologique avant d'être rangés dans un deuxième sac et conservés à 5°C. Sur ces deux types de filets sont effectuées des analyses sensorielles et des analyses microbiologiques. Les analyses sensorielles sont réalisées à partir d'un échantillon témoin et essai. L'odeur et le goût après cuisson de chaque échantillon sont notés selon une échelle de notes telle que suit :
0 putride
1 - 2 très mauvais
3 - 4 mauvais
5 - 6 acceptable
7 - 8 satisfaisant
9 - 10 très satisfaisant
Les analyses microbiologiques sont effectuées notamment par dénombrements des germes mésophiles aérobies. Les dénombrements sont réalisés à partir d'un prélèvement de 10 g de chair mis en suspension dans 90 ml d'eau physiologique stérile et homogénéisés pendant 3 minutes. Cette suspension est considérée comme la suspension mère.
Les dénombrements des germes mésophiles aérobies cultivant à 30°C en 3 jours sont réalisés à partir de dilutions au dixième de la suspension mère en utilisant la technique de dénombrement en profondeur. Le milieu de culture est la gélose PCA, gélose ordinaire pour le dénombrement en microbiologie alimentaire.
La souche LLO est dénombrée sur gélose MRS pH 6,5 en utilisant la technique de dénombrement en profondeur, les boîtes sont incubées 5 jours à 15°C.
Les résultats obtenus sont tels que suit :
En ce qui concerne les tests organoleptiques, le tableau ci-dessous fournit les résultats :
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
En ce qui concerne les dénombrements, le tableau ci -dessous reproduit les résultats obtenus :
Figure imgf000015_0002
Les expériences menées permettent de constater que les produits alimentaires ensemencés avec la souche Lactococcus lactis LLO sont toujours de meilleure qualité organoleptique que les témoins. On constate en particulier une forte diminution des odeurs d'ammoniac ou de H2S permettant une augmentation de la durée de conservation de produits alimentaires traités. La consommation régulière de produits alimentaires ensemencés n'engendre aucun désordre digestif, ni phénomène d'allergie. On constate également que le développement de la flore banale est retardé .
Les résultats obtenus permettent donc de conclure à la possibilité d'utiliser une composition comprenant la souche Lactococcus lactis LLO ou un variant ou un mutant de celle- ci en tant que composition alimentaire pour la conservation à l'état réfrigéré de produits alimentaires. Par réfrigération, on entend des produits alimentaires conservés dans une plage de température comprise entre environ 0°C et 12 °C. A l'inverse, on constate que cette souche ne se développe pas à une température de 30°C. Ceci permet un dénombrement de la flore des produits alimentaires dans le cadre d'analyses microbiologiques de routine . On constate également que l'effet de cette souche est augmenté quand elle est appliquée sur des produits alimentaires conservés dans une atmosphère réduite en oxygène .
Des expériences ont ainsi été menées sur du saumon frais écossais (salmo salar) , provenant d'une ferme d'élevage des îles Shetland, éviscéré et mis en glace pendant 4 jours avant traitement. Ce saumon est fileté avec la peau. Un des filets sert de témoin, l'autre d'essai.
En ce qui concerne la préparation d'un témoin, un filet de saumon frais témoin est tranché en huit portions de 100 à 200 g puis emballé dans des sacs individuels et mis sous vide avant d'être stocké dans une chambre froide entre 2 et 4°C.
L'échantillon essai est préparé de la même manière à l'exception du fait qu'il comporte entre l'étape de tranchage et l'étape d'emballage une étape d'ensemencement par pulvérisation avec la souche LLO en suspension dans l'eau physiologique.
Sur la base de ces deux échantillons sont effectués d'une part des analyses sensorielles, d'autre part des examens microbiologiques. Les analyses sensorielles sont réalisées à partir d'un échantillon témoin et essai. La couleur de la chair est contrôlée visuellement. Après ouverture des sachets, l'odeur est notée selon une échelle de notes. Si nécessaire, l'échantillon est cuit dans l'eau frémissante pendant quelques minutes avant d'être à nouveau noté.
L'échelle de notes s'établit telle que suit 0 putride
1 - 2 très mauvais
3 - 4 mauvais
5 - 6 acceptable 7 - 8 satisfaisant
9 - 10 très satisfaisant
En ce qui concerne les examens microbiologiques, le pH est mesuré en différents points des échantillons. La valeur retenue est une moyenne de 3 mesures. Les dénombrements sont réalisés à partir d'un prélèvement de 10 g de chair mis en suspension dans 90 ml d'eau physiologique stérile et homogénéisés pendant 3 minutes. Cette suspension est considérée comme la suspension mère.
Les dénombrements des germes mésophiles aérobies cultivant à 30°C en 3 jours sont réalisés à partir de dilutions au dixième de la suspension mère en utilisant la technique de dénombrement en profondeur. Le milieu de culture est la gélose PCA, gélose ordinaire pour le dénombrement en microbiologie alimentaire.
La souche LLO est dénombrée sur gélose MRS pH 6,5 en utilisant la technique de dénombrement en profondeur, les boîtes sont incubées 5 jours à 15°C.
Les résultats obtenus sont tels que suit :
En ce qui concerne les tests organoleptiques, le tableau ci-dessous fournit les résultats :
Figure imgf000018_0001
En ce qui concerne les variations du pH, le tableau ci- dessous reproduit les résultats obtenus :
Figure imgf000018_0002
En ce qui concerne les dénombrements, le tableau ci-dessous fournit les résultats obtenus :
Figure imgf000018_0003
Les résultats montrent clairement qu'il n'existe aucune différence significative entre le pH des témoins et des produits traités. A l'inverse, les qualités organoleptiques des produits ainsi que le développement de la flore banale présentent des résultats positifs comparés aux échantillons témoins .
D'autres essais ont été menés sur des crevettes d'élevage étêtées et surgelées. Ces crevettes sont mises à décongeler dans l'eau tiède pendant 5 minutes, avant d'être cuites dans l'eau bouillante salée à 20 g/1 pendant 1 minute. Après un rapide refroidissement sous l'eau courante, les crevettes sont plongées dans un bain glacé d'eau salée à 20 g/1.
Les crevettes "témoin" sont emballées par lot de dix dans des barquettes sous atmosphère modifiée. Les crevettes "essai" sont préalablement ensemencées avec la souche LLO par pulvérisation de la souche LLO en suspension dans l'eau physiologique. Elles sont ensuite emballées par lot de dix dans des barquettes sous atmosphère modifiée et conservées à 4°C.
Des analyses sensorielles sont réalisées à partir d'un échantillon "témoin" et "essai". La couleur de la chair est contrôlée visuellement. Après ouverture des sachets, le goût est noté selon une échelle de notes identique à celle fournie pour l'exemple du saumon ci -dessus.
Des dénombrements sont réalisés à partir d'un prélèvement de 10 g de crevettes mis en suspension dans 90 ml d'eau physiologique stérile et homogénéisés pendant 3 minutes. Cette suspension est considérée comme la suspension mère.
Les dénombrements des germes mésophiles, aérobies cultivant à 30°C en 3 jours, sont réalisés à partir de dilutions au dixième de la suspension mère en utilisant la technique de dénombrement en profondeur. Le milieu de culture est la gélose PCA, gélose ordinaire pour le dénombrement en microbiologie alimentaire.
La souche LLO est dénombrée sur gélose MRS pH 6,5 en utilisant la technique de dénombrement en profondeur, les boîtes sont incubées 5 jours à 15°C.
En ce qui concerne les tests organoleptiques, le tableau ci-dessous fournit les résultats :
Figure imgf000020_0001
En ce qui concerne les dénombrements, le tableau ci -dessous fournit les résultats obtenus :
Figure imgf000020_0002
Il est donc possible d'envisager une application industrielle de cette souche dans le cadre de procédé de conservation de produits alimentaires réfrigérés. Le
10 procédé consistera alors à mettre en contact le produit alimentaire à conserver et la souche Lactococcus lactis LLO préalablement au conditionnement du produit de manière à former une barrière biologique en surface du produit qui ralentit le développement de mauvaises odeurs et la
15 croissance de la flore d'altération du produit. Bien évidemment, cette mise en contact devra s'effectuer après tout traitement du produit, en particulier si ce dernier doit subir un traitement thermique. La mise en contact pourra s'effectuer par inoculation du produit alimentaire à
20 conserver avec environ 105 - 107 cellules restant viables de Lactococcus lactis LLO par gramme de produit à conserver. Diverses méthodes d'inoculation peuvent être envisagées selon la forme de présentation de la souche. Ainsi, la souche Lactococcus lactis LLO peut être sous
25 forme lyophilisée. Cette souche Lactococcus lactis LLO peut encore se présenter sous forme d'une suspension.
L'ensemencement de l'aliment peut s'effectuer aussi par pulvérisation d'une poudre incorporant la souche Lactococcus lactis LLO, ou par pulvérisation d'une suspension cellulaire incorporant la souche précitée, ou par trempage de l'aliment dans un bain contenant la souche. La souche pourra être utilisée seule ou mélangée à un support .
Cette souche possède donc les propriétés :
- de se développer sur les produits de la mer, tels que poissons, crustacés ou autres, aux températures de réfrigéra ion,
- de ne pas altérer l'aliment, - de permettre, dans certaines conditions, de ralentir le développement de la flore banale d'altération de l'aliment et d'inhiber certains pathogènes,
- de retarder l'apparition d'odeurs indésirables, telles que des odeurs d'ammoniac ou de H2S.
Son efficacité est accrue quand l'aliment est emballé sous vide, sous atmosphère modifiée ou tout autre conditionnement réduisant la présence d'oxygène.
Elle ne se développe pas à 30°C et peut être dénombrée dans une analyse microbiologique alimentaire courante.

Claims

REVENDICATIONS
1. Nouvelle souche de Lactococcus lactis appelée souche Lactococcus lactis LLO et déposée à la CNCM sous le numéro d'accession CNCM 1-2716.
2. Toute souche de Lactococcus lactis obtenue par mutation, variation, recombinaison de la souche conforme à la revendication 1.
3. Nouvelle souche de Lactococcus lactis LLO conformément à l'une des revendications 1 et 2 , caractérisée en ce qu'elle présente une température de croissance comprise entre 2°C et 25 °C avec une température optimale de croissance proche de 20°C.
4. Cultures, biomasses et extraits obtenus à partir de souches conformes à l'une des revendications 1 et 2.
5. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la souche Lactococcus lactis LLO ou un variant ou un mutant de celle- ci conformément aux revendications 1 à 3.
6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que la souche Lactococcus lactis LLO est sous forme lyophyllisée .
7. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que la souche Lactococcus lactis LLO est sous forme d'une suspension.
8. Composition alimentaire pour la conservation à l'état réfrigéré de produits alimentaires, en particulier de produits de la mer, conditionnés de préférence sous atmosphère réduite en oxygène, caractérisée en ce qu'elle comprend la souche Lactococcus lactis LLO selon l'une des revendications 1 à 3 ou un variant ou un mutant de celle-ci notamment en tant qu'agent actif retardant l'apparition de mauvaises odeurs et/ou le développement de bactéries pathogènes ou non.
9. Produit alimentaire conservé à l'état réfrigéré et conditionné de préférence sous une atmosphère réduite en oxygène, caractérisé en ce que ledit produit présente à sa surface une barrière biologique constituée au moins de Lactococcus lactis LLO ou d'un variant ou d'un mutant de celui-ci conformément à l'une des revendications 1 à 3.
10. Utilisation de souches, cultures, biomasses, extraits de Lactococcus lactis LLO conformes à l'une des revendications 1 à 4 comme agent retardant l'apparition de mauvaises odeurs sur des produits alimentaires conservés à l'état réfrigéré et conditionnés de préférence sous une atmosphère réduite en oxygène.
11. Utilisation de souches, cultures, biomasses, extraits de Lactococcus lactis LLO conformes à l'une des revendications 1 à 4 comme agent ralentissant le développement de la flore d'altération des produits alimentaires réfrigérés et conditionnés de préférence sous une atmosphère réduite en oxygène.
12. Procédé de conservation à l'état réfrigéré de produits alimentaires, en particulier de produits de la mer, conditionnés dans une atmosphère réduite en oxygène avant consommation, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact le produit alimentaire à conserver et Lactococcus lactis LLO conforme à l'une des revendications 1 à 3 préalablement au conditionnement dudit produit de manière à former au moins une barrière biologique en surface dudit produit qui ralentit le développement de mauvaises odeurs et la croissance de la flore d'altération dudit produit.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on met en contact le produit alimentaire à conserver et Lactococcus lactis LLO par inoculation du produit à conserver avec environ 105 - 107 cellules restant viables de Lactococcus lactis LLO par gramme de produit à conserver.
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