WO2003020962A2 - Procede d'identification de composes liant une glycosyl transferase - Google Patents

Procede d'identification de composes liant une glycosyl transferase Download PDF

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WO2003020962A2
WO2003020962A2 PCT/FR2002/002989 FR0202989W WO03020962A2 WO 2003020962 A2 WO2003020962 A2 WO 2003020962A2 FR 0202989 W FR0202989 W FR 0202989W WO 03020962 A2 WO03020962 A2 WO 03020962A2
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moenomycin
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glycosyl transferase
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Jacques Biton
François MICHOUX
Jean-Noël VELTZ
Jacques Dumas
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Aventis Pharma S.A.
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    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying compounds capable of binding to a bacterial glycosyltransferase at the transglycosylation site.
  • the invention also relates to the compounds obtained by such a process, and to their uses.
  • Peptidoglycan is a polymer synthesized by the bacteria and essential for its survival.
  • PBP Bacillus Binding Proteins
  • class A PBPs which are modular proteins with two enzymatic activities: transpeptidase activity (represented by a sequence of approximately 340 amino acids) and glycosyltransferase activity (approximately 300 amino acids in the N region -terminal).
  • the present invention therefore relates to a new method for the identification, detection and / or screening of compounds which bind to the transglycosylation site of a glycosyl transferase, this method being simple to implement, and said glycosyl transferase being either a PBP protein of class A, i.e. a protein of the MgtA type
  • the method according to the invention also makes it possible to practice high-throughput screening, that is to say to be able to easily test several compounds at the same time. This process therefore saves time and substantial savings for the detection of new glycosyl transferase binding partners, and an embodiment is shown diagrammatically in FIG. 1.
  • the invention relates to a method for identifying and / or screening and / or selecting a compound which binds to the transglycosylation site of a recombinant glycosyl transferase, comprising the steps consisting in: a) bringing said compound into contact with said recombinant protein, before, after, or concomitantly with bringing said recombinant protein into contact with an inhibitor of transglycosylation activity, said inhibitor being marked by a marker generating a direct signal or indirect, b) studying said signal linked to said recombinant protein, the binding of said compound to the transglycosylation site being deduced from the difference in signal obtained in step b) relative to the signal obtained in the absence of said compound.
  • said recombinant glycosyl transferase is a class A PBP, more preferably the PBPlb from Escherichia coll.
  • This protein is the main responsible for the glycosyltransferase activity essential for the synthesis of the bacterial wall in vitro. Furthermore, it has an important homology with class A PBPs observed in other bacteria.
  • use is preferably made of the PBPlb corresponding to SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 1 representing a fusion protein constructed for the production of a recombinant PBPlb.
  • the method can however be adapted using any class A PBP, originating from a microorganism having a peptidoglycan, whether it is Gram + or Gram -.
  • class A PBPs originating from micro-organisms pathogenic to humans, for example S. aureus, S. pneumoniae, M. leprae, L. pnewnophilia, M. catarrhalis, C. jeikeium, H. influenzae, P. aeruginosa ...
  • binding to the transglycosylation site is detected by competition with the inhibitor employed.
  • This process makes it possible to obtain compounds specific for transglycosylation activity, which also have a high probability of inhibiting this activity.
  • the advantage of using a recombinant protein also makes it possible to reduce the risks of binding of the various compounds tested which may occur if a protein prepared directly from the bacterial membrane is used, the preparation thus obtained then being able to contain contaminating proteins.
  • said inhibitor is moenomycin. It is important to note, however, that analogues could also be used of moenomycin, such as those described in application WO 99/26956, or any other compound inhibiting the transglycosylation activity.
  • said recombinant protein is attached to a solid support.
  • This support can in particular be a column or a flat surface.
  • the solid support according to the invention consists of beads, carrying a group capable of fixing the recombinant protein, such as copper ions or a Glutathione residue.
  • the use of beads allows the protein to be brought into contact with the inhibitors and the compounds to be tested, which generally makes it possible to improve the binding capacities, compared to a flat (two-dimensional) surface.
  • said recombinant protein has been modified by genetic engineering, in order to present a modification allowing its binding to said support.
  • modifications are known to those skilled in the art, and include in particular the addition of Histidine residues to the N- or C-terminus of the protein, which allows a bond with a metal chelate (Copper, for example) .
  • Glutathione-based systems can also be used.
  • said marker is a radioactive or fluorescent marker.
  • any type of radioactive labeling can be used, in particular by incorporating radioactive compounds (preferably 3 H) into the structure of the inhibitor.
  • the use of tritium is in fact preferred, when the labeled inhibitor used in the process according to the invention is an organic molecule.
  • both the inhibitor and the protein can be labeled with fluorescent compounds, the link between the two entities then being determined by “quenching”, or by other methods (for example SPA (Scintillation Proximity Assay) or FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer).
  • SPA Scintillation Proximity Assay
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • the PBPlb is fixed on SPA beads (Amersham) which contain a scintillant. These PBP beads are brought into contact with the potential inhibitor and the labeled moenomycin. If the PBP fixes the inhibitor, no signal is seen. If the PBP fixes the marked Moenomycin, the proximity of the radioelement and the ball triggers the emission of a signal (emission of photons by the scintillant contained in the SPA ball).
  • the signal linked to said recombinant protein can be deduced by measuring the signal not linked to the protein, as a function of the total starting signal. Indeed, knowing the amount of inhibitor added in the method according to the invention, we know the amount of initial signal. It is then possible, after the inhibitor has passed over the protein, and the various washes, to determine the amount of unbound inhibitor, and thus to deduce therefrom the amount of inhibitor bound to the protein. This is an indirect method.
  • the invention also relates to a method for identifying a product having antibacterial activity, comprising the steps of: a) implementing a method according to the invention, b) modification of the product selected in step a) in particular by grafting residues onto the chemical skeleton, c) testing of the product modified in step b) in in vitro and / or in vivo methods, on relevant models for measuring antibiotic activity, d) identification of the product making it possible to obtain an antibiotic activity greater than the activity obtained for the product selected in step a).
  • animal models are often used in particular, generally in rodents (mice, rats, etc.) or in dogs, or even primates.
  • the invention also relates to a compound capable of binding to the transglycolsylation site of a glycosyl transferase and preferably having an antibiotic activity, which can be obtained by a method according to the invention, or directly obtained by one of said methods.
  • Such a compound according to the invention can be a compound having a chemical structure (of the small organic molecule type), a lipid, a sugar, a protein, a peptide, a hybrid protein-lipid, protein-sugar, peptide-lipid compound, or peptide-sugar, a protein or peptide to which chemical branches have been added.
  • a chemical structure of the small organic molecule type
  • lipid a sugar, a protein, a peptide, a hybrid protein-lipid, protein-sugar, peptide-lipid compound, or peptide-sugar, a protein or peptide to which chemical branches have been added.
  • the organic compounds envisaged they may contain one or more rings, aromatic or not, as well as several residues of all kinds (in particular lower alkyl, that is to say having between 1 to 6 carbon atoms) .
  • the compound according to the invention is not moenomycin, nor the compounds of WO 99/26956.
  • the invention also relates to a compound
  • the invention thus relates in particular to the use of compounds which can be or are obtained by the method according to the invention and which have capacities for binding to the transglycosylation site of a glycosyl transferase and / or for inhibiting this activity.
  • the preferred compound for the preparation of a medicament intended to treat bacterial infections.
  • the preferred compound also has an antibiotic activity, which can easily be tested on animal models or in vitro, on culture media. Said compound is not moenomycin and behaves like a competitor of this product in the process according to the present invention.
  • An interesting inhibitor of the glycosyltransferase site is moenomycin, and in a preferred embodiment of the invention, this compound is used after tritiation, this allowing a favored implementation of the invention, insofar as this modification does not modify not radically the properties of moenomycin, and allows easy detection, in particular by SPA.
  • the number of saturated bonds has an effect on the more or less lipophilic nature of the molecule and therefore probably on the signal / background noise ratio observed during the test (increased bonding with lipophilicity), it may be worth trying to limit the number of saturated links. Hydrogenation in the presence of Wilkinson's catalyst achieves this goal with hydrogen but gives disappointing results with tritium.
  • an alternative method consisting of tritiation in a heterogeneous medium, preferably by measuring the quantity of tritium absorbed and by stopping the reaction to approximately two moles of tritium per mole of moenomycin.
  • a controlled tritiation of the moenomycin is carried out.
  • the invention also relates to a process for the preparation of tritiated moenomycin, comprising a step of fixing tritium on one or more double bonds of the side chain of moenomycin (FIG. 2).
  • This process is preferably carried out in a heterogeneous medium, in the presence of a catalyst, in particular palladium.
  • said catalyst is palladium on carbon, preferably about 12-25% palladium on carbon, more preferably about 18% on carbon.
  • the moenomycin is dissolved in an organic solvent, and preferably in ethanol or methanol.
  • an organic solvent preferably in ethanol or methanol.
  • suitable solvent for moenomycin is within the reach of those skilled in the art.
  • the catalyst In the presence of the catalyst, it is pressurized with tritium, and it is brought back to a temperature lower than approximately 45-50 ° C, preferably lower than approximately 30 ° C, more preferably at room temperature, ie approximately 20 ° C.
  • the mixture is stirred at ambient temperature to reduce the pressure, then the reaction medium is filtered, which is concentrated under vacuum, before taking up the residue.
  • the time necessary for the integration of one to two moles of tritium per mole of moenomycin is thus agitated. This time depends on the temperature and can be determined by a person skilled in the art, but it is indicated that the time required is approximately 15 minutes when working at 20 ° C.
  • the filtration of the medium is carried out after removal of the excess tritium.
  • the mixture can then be analyzed, for example by HPLC, and purified on a preparative column, according to protocols known to those skilled in the art.
  • the method according to the invention makes it possible to reproduce batches of tritiated moenomycin in a reproducible manner, and to control the quantity of tritium incorporated, as a function of the quantity of tritium provided,
  • the method according to the invention makes it possible to obtain a trenium-labeled moenomycin, so that the tritium only saturates a limited number (one or two) of double bonds, which makes it possible to preserve the characteristics and properties of moenomycin.
  • the invention also relates to tritiated moenomycin, which can optionally be or directly obtained by the tritiation method according to the invention, the tritium being preferably incorporated by saturation of a double bond in its side chain, and / or being synthesized by fermentation in the presence of radioactive precursors.
  • the invention also uses a recombinant glycosyl transferase.
  • This membrane protein is preferably prepared so that it can be solubilized, so as to be produced with a certain purity, with the aim of bringing greater specificity to the process which is the subject of the present invention.
  • the invention relates to a process for the preparation of a recombinant glycosyl transferase from a vector comprising the gene for said glycosyl transferase, comprising the steps of: a) fermentation of a cell into which said vector is introduced, under conditions allowing the production of recombinant glycosyl transferase b) purification of said recombinant glycosyl transferase, in the presence of a detergent, preferably nonionic.
  • this process is applied for the preparation of a class A PBP, and in particular the PBPlb of E. coli, which is mainly responsible for the glycosyltransferase activity essential for the synthesis of the bacterial wall in vitro.
  • the vector introduced into the bacterial cell contains the PBP gene, at the end of which a polyhistidine tail has been inserted, by known methods of molecular biology. This allows the binding of the recombinant protein with the SPA type beads when the method according to the invention is implemented.
  • a protein is thus obtained having a sequence close to SEQ ID No. 1, which is shown in illustration, amino acids 1-23 corresponding to the polyhistidine tail, amino acids 24-822 corresponding to the PBP of E. coli (S ⁇ Q ID N ° 2).
  • Fermentation is carried out according to the usual methods. Depending on whether a particular promoter is used, the production (or even overproduction) of protein can be induced, which can also be done by varying the fermentation temperature. All this is well known to those skilled in the art.
  • the PBP protein is a hydrophobic membrane protein. It is therefore necessary to purify it in the presence of detergent.
  • the purification methods used are well known to those skilled in the art. It is preferably carried out in the presence of a nonionic detergent, the preferred detergent being NOG (N-Octyl Glucopyranoside). You can also choose another non-ionic detergent, such as PHecameg, Triton X-100, tetraethylene glycol mono-octyl ether or Nonidet P-40. Note that the detergent is used in all stages of purification.
  • the implementation of the process according to the invention is also preferably carried out in the presence of a nonionic detergent, and more particularly of the detergent used during the purification, that is to say NOG.
  • FIGURES Figure 1 schematic representation of the method according to the invention.
  • the SPA beads carrying copper groups are represented by ovals, with the site of attachment of the poly-histidine (His) end of the PBP1b protein of E. coli.
  • labeled moenomycin [3H] -Menomycin
  • the connection is made and a signal is emitted.
  • Figure 2 representation of the tritiation of moenomycin by saturation of a double bond on the side chain.
  • T tritium
  • Ca catalyst.
  • AMERSHAM PVT Copper His-Tag beads 200 ⁇ g / 100 ⁇ l / well
  • Moenomycin: PM 1580 Da; 200 pmoles / 1 O ⁇ l / well to monitor the non-specific level.
  • Inhibitor Dilution in DMSO; 10 ⁇ Well.
  • NOG SIGMA n-octyl ⁇ -D glucopyranoside
  • Buffer 1 Tris, 10 mM maleate; 10 mM MgCl 2 ; 0.2 M NaCl; NOG 1%; pH 7.2 PBS lOx GTBCO BRL
  • Buffer 2 PBS 1x; Tween 20 0.5% BSA CALBIOCHEM
  • Buffer 3 PBS2x; BSA 2%
  • Dilutions are made in DMSO.
  • the initial concentrations are such that the inhibitor is at the correct final concentration by depositing 10 ⁇ l / well.
  • 10 ⁇ l of Moinero radio in the non-specific binding level wells 10 ⁇ l of Moinero radio in the non-specific binding level wells. 10 ⁇ l of inhibitor in the test wells 100 ⁇ l 1 of 3 H-Moeno in all the wells. 10 ⁇ l of DMSO in protein-free wells, maximum binding level, non-specific binding level.
  • the use of the method according to the invention has made it possible to test approximately 500,000 compounds in 5 days, and to select approximately 1000.
  • the method is rapid, at high speed, and relatively discriminative.
  • Example 6 Tritiation of moenomycin In a tritiation flask of 1 cm 3 is introduced: 6 mg of moenomycin or -10 ⁇ mol. 300 ⁇ l of methanol. 2 mg of 18% Palladium catalyst on carbon (Degussa type E10N / D).
  • reaction medium After recovering the excess of tritium, the reaction medium is filtered, concentrated under vacuum and the residue is taken up in 100 cm 3 of ethanol and counted.
  • composition of the mixture is as follows: unchanged product: 24% (in UN), mono saturated: 29%, di saturated: 28% (complement to 100% in radioactivity: polysaturated products).
  • Lot A Total activity: 6.56GBq (177mCi) Specific Activity l, 9TBq / mmol ( ⁇ 2T / mole)
  • volume activity 37MBq / cm 3 (Ethanol at 5% water). Storage: -80 ° C under inert gas.
  • ot B Total activity: 8,28GBq (223mCi). Specific Activity 4.92TBq / mmol ( ⁇ 4.5T / mole).

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'identification, de criblage ou de sélection d'un composé se liant au site de transglycosylation d'une glycosyl transférase recombinante, comprenant les étapes consistant: a) mettre ledit composé en contact avec ladite protéine recombinante, avant, après, ou de façon concomitante à la mise en contact de ladite protéine recombinante avec un inhibiteur de l'activité de transglycosylation, ledit inhibiteur étant marqué par un marqueur générant un signal direct ou indirect, b) étudier ledit signal lié; ladite protéine recombinante,la liaison dudit composé au site de transglycosylation étant déduite de la différence de signal obtenu dans l'étape b) par rapport au signal obtenu en l'absence dudit composé.

Description

PROCEDE D'IDENTIFICATION DE COMPOSES LIANT UNE GLYCOSYL
TRANSFERASE
La présente invention se rapporte à un procédé d'identification de composés pouvant se lier à une glycosyltransférase bactérienne, au site de transglycosylation. L'invention se rapporte aussi aux composés obtenus par un tel procédé, et à leurs utilisations.
Le peptidoglycane est un polymère synthétisé par la bactérie et indispensable à sa survie. Les enzymes impliquées dans la synthèse et l'organisation de ce peptidoglycane bactérien, propre au monde procaryote, constituent ainsi des cibles potentielles très intéressantes pour la recherche de nouveaux antibiotiques.
Parmi celles-ci les PBP (Penicillin Binding Proteins, protéines liant la pénicilline), qui font partie des étapes membranaires, font l'objet de nombreux travaux. Cet intérêt est lié principalement à la présence d'une activité transpeptidase qui est inhibée par les pénicillines (van Heijenoort, J. 1996, p. 1025-1034. In Neidhardt et al. (éd.), Escherichia coli and Salmonella, 2nd éd.: cellular and molecular biology, ASM Press, Washington, D.C.).
Les plus étudiées sont les PBP de classe A qui sont des protéines modulaires possédant deux activités enzymatiques: l'activité transpeptidase (représentée par une séquence d'environ 340 amino-acides) et une activité glycosyltransférase (environ 300 amino-acides dans la région N-terminale).
Cette activité glycosyltransférase est encore peu connue, tant par la difficulté à suivre la réaction enzymatique que par l'absence totale de données cristallographiques. On connaît cependant un inhibiteur de cette activité, la moénomycine dont le mécanisme exact d'action reste à élucider (Wasielewski et al,
1965, Antimicrob. Agents and Chem., 743-748).
Il est important de noter qu'à ce jour, aucune PBP de classe A n'a été entièrement cristallisée.
A côté de ces PBP bi-fonctionnelles cohabitent deux systèmes ono- fonctionnels:
- d'une part, les PBP mono-fonctionnelles, qui possèdent uniquement une activité transpeptidase : Une de ces PBP a été récemment cristallisée (Gordon et al, 2000, J. Mol. Biol, 299, 477-485). - d'autre part, des enzymes possédant la seule activité glycosyltransférase, dénommées MgtA (également appelées MtgA) (Di Berardino et al, 1996, FEBSLett., 392, 184-188)
II est important de pouvoir disposer de nouveaux inhibiteurs de l'activité glycosyltransférase, qui pourraient ainsi être utilisés en tant que nouveaux agents antibiotiques.
La présente invention concerne donc un nouveau procédé d'identification, détection et/ou criblage de composés se liant au site de transglycosylation d'une glycosyl transferase, ce procédé étant simple à mettre en oeuvre, et ladite glycosyl transferase étant soit une protéine PBP de classe A, soit une protéine de type MgtA
(également appelées MtgA), sensible à la moénomycine (par exemple une MgtA de staphylocoque et de streptocoque, tel S. aureus ou S. pneumoniaé). Le procédé selon l'invention permet également de pratiquer un criblage à haut débit, c'est-à- dire de pouvoir tester aisément plusieurs composés en même temps. Ce procédé permet donc un gain de temps et une économie substantielle pour la détection de nouveaux partenaires de liaison de la glycosyl transferase, et un mode de réalisation est schématisé en figure 1.
Un certain nombre de procédé de détection de composés pouvant, entre autres, se lier au site de transglycosylation d'une glycosyltransférase ont été publiés (Branstrom A., Midha S., Goldman R. FEMS Microbiool. Lett, 2000., 191, 187-190 ; Barbosa M., Yang G., Fang G., Kurilla M., Pompliano D, Antimicrob Agents. Chemother., 2002, 46, 4, 943-946 ; Nollmer W, Holtje, JN, Antimicrob Agents. Chemother., 2000, 44, 5, 1181-1185). Ces méthodes présentent toutes un certain nombre de désavantages par rapport au procédé objet de la présente demande. Ainsi, ces techniques ne ciblent pas spécifiquement l'activité transglycosylase de la sytnhèse du peptidoglycane bactérien et ne sont pas du tout adaptées aux méthodes de criblage à haut débit de découverte de molécules d'intérêt pharmaceutique.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un procédé d'identification et/ou de criblage et/ou de sélection d'un composé se liant au site de transglycosylation d'une glycosyl transferase recombinante, comprenant les étapes consistant à : a) mettre ledit composé en contact avec ladite protéine recombinante, avant, après, ou de façon concomitante à la mise en contact de ladite protéine recombinante avec un inhibiteur de l'activité de transglycosylation, ledit inhibiteur étant marqué par un marqueur générant un signal direct ou indirect, b) étudier ledit signal lié à ladite protéine recombinante, la liaison dudit composé au site de transglycosylation étant déduite de la différence de signal obtenu dans l'étape b) par rapport au signal obtenu en l'absence dudit composé. Dans un mode de réalisation préférée, ladite glycosyl transferase recombinante est une PBP de classe A, de façon plus préférée la PBPlb de Escherichia coll. Cette protéine est la principale responsable de l'activité glycosyltransférase indispensable à la synthèse de la paroi bactérienne in vitro. Par ailleurs, elle possède une importante homologie avec les PBP de classe A observées chez les autres bactéries. Ainsi, on utilise preferentiellement la PBPlb correspondant à SEQ ID N°2, SEQ ID N° 1 représentant une protéine de fusion construite pour la production d'une PBPlb recombinante. La méthode peut toutefois être adaptée en utilisant toute PBP de classe A, provenant d'un microorganisme possédant un peptidoglycane, qu'il soit Gram + ou Gram -. On utilise de préférence des PBP de classe A provenant de micro-organismes pathogènes pour l'homme, par exemple S. aureus, S. pneumoniae, M. leprae, L. pnewnophilia, M. catarrhalis, C.jeikeium, H. influenzae, P. aeruginosa...
Ainsi, on détecte la liaison au site de transglycosylation par compétition avec Pinhibiteur employé. Ce procédé permet d'obtenir des composés spécifiques de l'activité de transglycosylation, qui présentent aussi une probabilité élevée d'inhiber cette activité. L'intérêt de l'utilisation d'une protéine recombinante permet également de diminuer les risques de liaison des différents composés testés pouvant arriver si l'on utilise une protéine préparée directement à partir de la membrane bactérienne, la préparation ainsi obtenue pouvant contenir alors des protéines contaminantes.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit inhibiteur est la moénomycine. Il est toutefois important de noter que l'on pourrait également utiliser des analogues de la moénomycine, comme ceux décrits dans la demande WO 99/26956, ou tout autre composé inhibant l'activité de transglycosylation.
Dans un mode préféré de réalisation, ladite protéine recombinante est fixée à un support solide. Ce support peut notamment être une colonne ou une surface plane. De préférence, le support solide selon l'invention consiste en des billes, portant un groupement capable de fixer la protéine recombinante, tel que des ions Cuivre ou un résidu Glutathion. En effet, l'utilisation de billes permet la mise en contact en solution de la protéine avec les inhibiteurs et les composés à tester, ce qui permet en général d'améliorer les capacités de liaison, par rapport à une surface plane (bidimensionnel).
Dans un mode de réalisation particulier, ladite protéine recombinante a été modifiée par génie génétique, afin de présenter une modification permettant sa liaison audit support. De telles modifications sont connues de l'homme du métier, et comprennent notamment l'ajout de résidus Histidine à l'extrémité N- ou C- terminale de la protéine, ce qui permet une liaison avec un chélate métallique (Cuivre, par exemple). On peut aussi utiliser les systèmes basés sur le glutathion.
Dans un mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention, ledit marqueur est un marqueur radioactif ou fluorescent. Ainsi, on peut utiliser tout type de marquage radioactif, notamment par incorporation de composés radioactifs (de façon préférée 3H) dans la structure de Pinhibiteur. L'utilisation de tritium est en effet préférée, lorsque l'inhibiteur marqué utilisé dans le procédé selon l'invention est une molécule organique. Toutefois, on peut aussi envisager l'incorporation de 13C ou 14C dans le squelette dudit inhibiteur. Ainsi, on peut utiliser un précurseur marqué au 14C (glucose, propionate...), lors de la synthèse de l'inhibiteur, lorsque celui-ci est préparé par fermentation. Lorsqu'il est préparé par synthèse chimique, on utilise de éléments déjà marqués.
On peut aussi marquer ledit inhibiteur avec un marqueur fluorescent ou d'une autre nature, soit que le signal émis soit détecté directement, soit qu'il ne le soit qu'en cas de contact (ou proximité) entre la protéine et l'inhibiteur (détection indirecte). Ainsi, on peut marquer à la fois l'inhibiteur et la protéine par des composés fluorescent, la liaison entre les deux entités étant alors déterminée par « quenching », ou par d'autres méthodes (par exemple SPA (Scintillation Proximity Assay) ou FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer). Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la PBPlb est fixée sur des billes SPA (Amersham) qui renferment un scintillant. On met en contact ces billes-PBP avec l'inhibiteur potentiel et la moénomycine marquée. Si la PBP fixe l'inhibiteur on ne voit pas de signal. Si la PBP fixe la Moénomycine marquée la proximité du radioélément et de la bille déclenche l'émission d'un signal (émission de photons par le scintillant contenu dans la bille SPA).
Dans un mode de réalisation, on peut déduire le signal lié à ladite protéine recombinante par mesure du signal non lié à la protéine, en fonction du signal total de départ. En effet, connaissant la quantité d'inhibiteur ajouté dans le procédé selon l'invention, on connaît la quantité de signal initial. H est alors possible, après passage de l'inhibiteur sur la protéine, et les différents lavages, de déterminer la quantité d'inhibiteur non lié, et d'en déduire ainsi la quantité d'inhibiteur lié à la protéine. H s'agit ici d'une méthode indirecte.
Toutefois, le mode de réalisation dans lequel on mesure directement la quantité d'inhibiteur lié à la protéine est préféré.
L'invention se rapporte également à un procédé d'identification d'un produit ayant une activité antibactérienne, comportant les étapes de : a) mise en œuvre d'un procédé selon l'invention, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de mesure d'activité antibiotique, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité antibiotique supérieure à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a).
En effet, le développement d'un médicament est souvent effectué sur le principe suivant : ' - criblage de composés ayant une activité voulue par une méthode appropriée, - sélection des composés répondant au « cahier des charges » (ici, liaison au site d'activité de transglycosylation de la glycosyl transferase),
- détermination de la structure (notamment la séquence (éventuellement tertiaire) s'il s'agit de peptides, formule et squelette s'il s'agit de composés chimiques) des composés sélectionnés,
- optimisation des composés sélectionnés, par modification de la structure (par exemple par le changement de la conformation stéroéochimique (par exemple passage de L en D des acides aminés dans un peptide), ajout de substituants sur les squelettes peptidiques ou chimiques, notamment par greffage de résidus sur le squelette, modification des peptides (voir notamment Gante "Peptidomimetics", dans Ange andte Chemie-International Edition Engl. 1994, 33. 1699-1720),
- passage et criblage des composés ainsi obtenus sur des modèles appropriés qui sont souvent des modèles plus proches de la pathologie étudiée. A ce stade, on utilise notamment souvent des modèles animaux, en général chez les rongeurs (souris, rats...) ou chez des chiens, voire des primates.
Les modèles in vitro sont facilement mis en œuvre par l'homme du métier. On ajoute, à un milieu de culture pour les bactéries cibles, les composés sélectionnés par les procédés selon l'invention (avec éventuellement les modifications de structure apportées), à des concentrations variables, et on étudie la survie des bactéries par toute méthode appropriée, notamment en les étalant sur des milieux solides et en comptant les colonies formées.
Les modèles animaux qui peuvent être utilisés sont bien connus de l'homme du métier. On utilise par exemple, des modèles basés sur des souris i munodéprimées (par exemple scid/scid), que l'on infecte avec des bactéries, ce qui mène au développement d'une infection. On étudie l'efficacité des composés sélectionnés par la méthode selon l'invention par la résolution de l'infection. L'invention se rapporte également à un composé pouvant se lier au site de transglycolsylation d'une glycosyl transferase et possédant de préférence une activité antibiotique, pouvant être obtenu par un procédé selon l'invention, ou directement obtenu par l'un desdits procédés. Un tel composé selon l'invention peut être un composé ayant une structure chimique (du type petite molécule organique), un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre, peptide-lipide, ou peptide-sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications chimiques. • Parmi les composés organiques envisagés, ils peuvent contenir un ou plusieurs cycles, aromatique(s) ou non, ainsi que plusieurs résidus de toute sorte (notamment alkyle inférieur, c'est-à-dire présentant entre 1 à 6 atomes de carbones). Toutefois, le composé selon l'invention n'est pas la moénomycine, ni les composés de WO 99/26956. L'invention se rapporte également à un composé selon l'invention, à titre de médicament, en tant que tel ou avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, ainsi qu'à l'utilisation desdits composés pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les infections bactériennes.
L'invention se rapporte ainsi en particulier à l'utilisation de composés pouvant être ou étant obtenus par le procédé selon l'invention et possédant des capacités de liaison au site de transglycosylation d'une glycosyl transferase et/ou d'inhibition de cette activité, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des infections bactériennes. De préférence, le composé préféré possède de plus une activité antibiotique, pouvant facilement être testée sur modèles animaux ou in vitro, sur milieux de cultures. Ledit composé n'est pas la moénomycine et se comporte comme un compétiteur de ce produit dans le procédé selon la présente invention.
Un inhibiteur intéressant du site de glycosyltransférase est la moénomycine, et dans un mode de réalisation préférée de l'invention, on utilise ce composé après tritiation, ceci permettant une mise en œuvre favorisée de l'invention, dans la mesure où cette modification ne modifie pas radicalement les propriétés de la moénomycine, et permet une détection aisée, notammment par SPA. Le nombre de liaisons saturées ayant un effet sur le caractère plus ou moins lipophile de la molécule et donc probablement sur le rapport signal / bruit de fond observé lors du test (augmentation du collage avec la lipophilie), il peut être intéressant de chercher à limiter le nombre de liaisons saturées. Une hydrogénation en présence de catalyseur de Wilkinson permet d'atteindre ce but avec de l'hydrogène mais donne des résultats décevants avec du tritium.
Ainsi, un procédé alternatif a été développé, consistant en une tritiation en milieu hétérogène, de préférence en mesurant la quantité de tritium absorbé et en arrêtant la réaction à environ deux moles de tritium par mole de moénomycine. Ainsi, on effectue une tritiation contrôlée de la moénomycine.
Le mélange obtenu est ensuite avantageusement séparé par chromatographie de façon à grouper les produits d'activité spécifique identique (donc selon le nombre de doubles liaisons saturées au tritium). Ainsi, l'invention se rapporte également à un procédé de préparation de moénomycine tritiée, comprenant une étape de fixation de tritium sur une ou plusieurs doubles liaisons de la chaîne latérale de la moénomycine (figure 2). Ce procédé est réalisé de préférence en milieu hétérogène, en présence d'un catalyseur, notamment le palladium. De préférence, ledit catalyseur est du palladium sur charbon, de préférence le palladium à environ 12-25 % sur charbon, de façon plus préférée à environ 18 % sur charbon.
De façon préférée, on dissout la moénomycine dans un solvant organique, et de préférence dans Péthanol ou le méthanol. Le choix du solvant adapté pour la moénomycine est à la portée de l'homme du métier.
En présence du catalyseur, on pressurise avec du tritium, et on ramène à une température inférieure à environ 45-50 °C, de préférence inférieure à environ 30 °C, de façon plus préférée à température ambiante, soit environ 20 °C.
On agite à température ambiante, pour faire baisser la pression, puis on filtre le milieu réactionnel, que l'on concentre sous vide, avant de reprendre le résidu. On agite ainsi le temps nécessaire à l'intégration d'une à deux moles de tritium par mole de moénomycine. Ce temps dépend de la température et peut être déterminé par l'homme du métier, mais on indique que le temps nécessaire est d'environ 15 minutes lorsque l'on travaille à 20 °C.
La filtration du milieu est effectuée après élimination de l'excès de tritium.
On peut ensuite analyser le mélange, par exemple par HPLC, et le purifier sur une colonne préparative, selon des protocoles connus de l'homme du métier.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir de façon reproductible des lots de moénomycine tritiée, et de contrôler la quantité de tritium incorporée, en fonction de la quantité de tritium apportée,
Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une moénomycine marquée au tritium, de telle sorte que le tritium ne sature qu'un nombre limité (une ou deux) de doubles liaisons, ce qui permet de conserver les caractéristiques et propriétés de la moénomycine.
De plus, la séparation par chromatographie (HPLC) des produits mono et di saturés permet de travailler avec des lots d'activité spécifique reproductible. Ce point peut s'avérer important pour juger de la qualité de l'effet compétiteur des produits que l'on teste dans le procédé selon l'invention, il convient en effet de disposer de lots parfaitement identifiés et aux propriétés bien définies. Notons que l'on peut mettre en œuvre toute autre méthode de séparation des produits.
L'invention se rapporte également à de la moénomycine tritiée, pouvant éventuellement être ou directement obtenue par le procédé de tritiation selon l'invention, le tritium étant incorporé de préférence par saturation d'une double liaison dans sa chaîne latérale, et/ou étant synthétisée par fermentation en présence de précurseurs radioactifs.
L'invention utilise également une glycosyl transferase recombinante. Cette protéine membranaire est préparée de préférence de telle sorte qu'elle puisse être solubilisée, de façon à être produite avec une certaine pureté, dans le but d'apporter une plus grande spécificité au procédé objet de la présente invention. Ainsi, l'invention se rapporte à un procédé de préparation d'une glycosyl transferase recombinante à partir d'un vecteur comprenant le gène de ladite glycosyl transferase, comprenant les étapes de : a) fermentation d'une cellule dans laquelle est introduit ledit vecteur, dans des conditions permettant la production de la glycosyl transferase recombinante b) purification de ladite glycosyl transferase recombinante, en présence d'un détergent de préférence non ionique.
De préférence, ce procédé est appliqué pour la préparation d'une PBP de classe A, et notamment la PBPlb de E.coli, principale responsable de l'activité glycosyltransférase indispensable à la synthèse de la paroi bactérienne in vitro. De préférence, le vecteur introduit dans la cellule bactérienne contient le gène de la PBP, à l'extrémité duquel on a inséré, par des méthodes connues de biologie moléculaire, une queue polyhistidine. Ceci permet la liaison de la protéine recombinante avec les billes de type SPA lorsque l'on met en œuvre le procédé selon l'invention. On obtient ainsi une protéine présentant une séquence proche de SEQ ID N° 1, qui est indiquée en illustration, les acides aminés 1-23 correspondant à la queue polyhistidine, les acides aminés 24-822 correspondant à la PBP d'E. coli (SΕQ ID N° 2).
La fermentation est effectuée selon les méthodes habituelles. Selon que l'on utilise un promoteur particulier, on peut induire la production (voire la surproduction) de protéine, ce qui peut également être effectué en variant la température de fermentation. Tout ceci est bien connu de l'homme du métier.
La protéine PBP est une protéine membranaire hydrophobe. Il est donc nécessaire de la purifier en présence de détergent. Les méthodes de purification utilisées sont quant à elles bien connues de l'homme du métier. On travaille de préférence en présence d'un détergent non ionique, le détergent préféré étant le NOG (N-Octyl Glucopyranoside). On peut également choisir un autre détergent non ionique, comme PHecameg, le Triton X-100, le tétraéthylène glycol mono-octyl éther ou le Nonidet P-40. Notons que le détergent est utilisé dans toutes les étapes de la purification. La mise en œuvre du procédé selon l'invention s'effectue aussi de préférence en présence d'un détergent non ionique, et plus particulièrement du détergent utilisé lors de la purification, c'est-à-dire le NOG. Ceci permet d'observer une bonne activité enzymatique. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : représentation schématique du procédé selon l'invention. Les billes SPA portant des groupements cuivre sont représentées par des ovales, avec le site de fixation de l'extrémité poly-histidine (His) de la protéine PBPlb de E. coli. En présence d'un inhibiteur, la moénomycine marquée ([3H] -Moénomycine) ne peut se lier au site de transglycosylation de la protéine. En l'absence de l'inhibiteur, la liaison s'effectue et un signal est émis.
Figure 2 : représentation de la tritiation de la moénomycine par saturation d'une double liaison sur la chaîne latérale. T : tritium, Ca : catalyseur.
Les exemples ci-dessous illustrent une mise en œuvre de l'invention, mais ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention.
EXEMPLES Exemple 1 : Réactifs et matériels
Billes PVT Copper His-Tag AMERSHAM: 200μg / 100 μl / puits
PBPlb E.coli purifiée 0,860 mg/ml; PM=89 kDa; 8.31 μM; 5 pmoles / 10 μV puits. Moénomycine: PM=1580 Da; 200 pmoles / 1 Oμl / puits pour suivre le niveau non spécifique.
Inhibiteur: Dilution en DMSO; 10 μPpuits.
3H-Moénomycine: 8,5 MBq/ml; 8,9 μM ; 12,5 pmoles / lOOul / puits.
Trizma hydrochloride SIGMA Acide Maléique MERCK
MgCl2 MERCK
NOG SIGMA (n-octyl β-D glucopyranoside)
NaCl MERCK
Tampon 1: Tris,maléate 10 mM; MgCl2 10 mM; NaCl 0,2 M; NOG 1 %; pH 7,2 PBS lOx GTBCO BRL
Tween 20 ACROS
Tampon 2: PBS lx; Tween 20 0,5 % BSA CALBIOCHEM
Tampon 3: PBS2x; BSA 2%
Compteur de radioactivité WALLAC Microbéta 1450
Exemple 2 : Protocole
2.1 Fixation de la PBPlb sur les billes Prélever la quantité voulue de billes après avoir bien agité la solution. Diluer au 1/5 en eau Milli-Q. Diluer une nouvelle fois au 1/2 en tampon 3 Préparer la solution de PBP lb en diluant dans le tampon 1.
Dans un tube vacutainer, mélanger ( 100 μl de billes + 10 μl de solution de PBPlb) par le nombre de puits à faire
Incuber 30 mn à 37°C à 250 tours / minute.
2.2. Compétition 3H-traceur / Inhibiteur
Préparer la Moénomvcine radioinerte pour la détermination du niveau de liaison non spécifique:
Solution mère à 1,58 mg/ml, soit 1 mM en tampon 2 ( conserver à-80°C) Diluer cette solution mère au 1/10 puis au 1/5 en tampon 2.
Préparer la 3H-Moénomycine:
Solution mère à 8,9 μM. Prélever le volume nécessaire pour avoir une solution à 125 nM finale. Evaporer sous un flux d'azote, reprendre par le volume final de tampon 2.
Préparer les inhibiteurs:
Les dilutions sont faites en DMSO. Les concentrations initiales sont telles que l'inhibiteur est à la bonne concentration finale en déposant lOμl / puits.
Dans une plaque 96 puits translucide Greiner. déposer :
10 μl de Moéno radioinerte dans les puits niveau de liaison non spécifique. 10 μl d'inhibiteur dans les puits tests 100 μl 1 de 3H-Moéno dans tous les puits. 10 μî de DMSO dans les puits sans protéine, niveau de liaison maximum, niveau de liaison non spécifique.
Faire 2 lavages des billes/PBPlb en PBS lx;Tween20 0,5% pour éliminer la PBPlb non fixée.
Entre chaque lavage/aspiration, centrifuger 5 mn à 1000G à température ambiante. Après la dernière centrifugation reprendre les billes/PBPlb par ( 110 μl tampon 2) x nombre de puits à faire. Déposer 110 μl de billes / PBPlb par puits. Couvrir la plaque d'un film plastique autocollant. Incuber 1 nuit à 4°C sans agitation.
Des incubations de 24 h, 48 h et même 72 h à 4 °C ne donnent pas de résultats significativement différents
Comptage
Compter sans lavage ni centrifugation sur un compteur de radioactivité.
Exemple 3 : Calculs
Calculer le pourcentage d'inhibition de fixation de la 3H-Moénomycine avec chaque concentration d'inhibiteur par rapport à la fixation maximale ( puits niveau de liaison maximum). Tracer une courbe % inhibition = f( [inhibiteur] ) pour déterminer TIC50.
Exemple 4 : Bilan des concentrations [ [iinniittiiaallee]] pmoles /puit [finale]
Billes 2 mg/ml 200 μg/100 μl 0.9 mg/ml
PBPlb 500 nM 5 pmoles/10 μl #24 nM
H-Moénomycine 125 nM 12,5 pmoles/100 μl 57 nM
Inhibiteurs ± ImM ± 10 nmoles/10 μl ± 45 μM Exemple 5 : test à haut débit
L'utilisation du procédé selon l'invention a permis de tester environ 500 000 composés en 5 jours, et d'en sélectionner environ 1000. Ainsi, le procédé est rapide, à haut débit, et relativement discriminatif.
Exemple 6 : Tritiation de la moénomycine Dans un ballon à tritiation de 1cm3 on introduit : 6mg de moénomycine soit -lOμmol. 300μl de méthanol. 2mg de catalyseur Palladium à 18% sur charbon (Degussa type E10N/D).
On place sur le banc, piège, vide et pressurise avec du tritium.
Après retour à 20° on agite durant 15mn de façon à obtenir une chute de pression de 400mBar soit environ 20μmol de tritium (volume total du tritium 1cm ).
Après récupération de l'excès de tritium, le milieu réactionnel est filtré, concentré sous vide et le résidu est repris par 100cm3 d'éthanol et compté.
On obtient : 1,1 Ci (théorie pour 20μmol de tritium : l,2Ci).
Le produit est analysé en HPLC dans les conditions suivantes :
Colonne Symmetry C8 5μ 3.9x150mm
Solvant : Acetonitrile/eau/TFA : 55/45/0,1,
Débit :lcm3/mn Détection : UN 220nm et radioactivité.
La composition du mélange est la suivante : produit inchangé : 24% (en UN), mono saturé :29%, di saturé : 28% (complément à 100% en radioactivité: produits polysaturés).
Purification sur colonne préparative :
Colonne Symmetry C8 7μ, 7.8x300mm. Solvant : Acetonitrile/eau/TFA : 55/45/0.1 . Débit :4cm3/mn. Détection : UN 220nm et radioactivité.
Caractéristiques de deux lots : Lot A : Activité totale : 6,56GBq (177mCi) Activité Spécifique l,9TBq/mmol (~2T/mole)
Activité volumique 37MBq /cm3 (Ethanol à 5% d'eau). Stockage : -80°C sous gaz inerte.
ot B : Activité totale : 8,28GBq (223mCi). Activité Spécifique 4,92TBq/mmol (~4.5T/mole).
Activité volumique 37MBq /cm3 (Ethanol à 5% d'eau). Stockage : -80°c sous gaz inerte.

Claims

Revendications
1. Procédé d'identification d'un composé se liant au site de transglycosylation d'une glycosyl transferase recombinante, comprenant les étapes consistant à : a) mettre ledit composé en contact avec ladite protéine recombinante, avant, après ou de façon concomitante à la mise en contact de ladite protéine recombinante avec un inhibiteur de l'activité de transglycosylation, ledit inhibiteur étant marqué par un marqueur générant un signal direct ou indirect, b) étudier ledit signal lié à ladite protéine recombinante, la liaison dudit composé au site de transglycosylation étant déduite de la différence de signal obtenu dans l'étape b) par rapport au signal obtenu en l'absence dudit composé.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est la moénomycine.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite protéine recombinante est fixée à un support solide, de préférence des billes, notamment portant des groupements cuivre.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur radioactif ou fluorescent.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit signal est mesuré de façon directe.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit signal est mesuré de façon indirecte, par exemple par SPA (Scintillation Proximity Assay) ou FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer).
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on déduit le signal lié à ladite protéine recombinante par mesure du signal non lié à la protéine, en fonction du signal total de départ.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est tritié.
9. Procédé d'identification d'un produit ayant une activité antibactérienne, comportant les étapes de : a) mise en œuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de mesure d'activité antibiotique, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité antibiotique supérieure à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a).
10. Utilisation d'un composé pouvant se lier au site de transglycolsylation d'une glycosyl transferase et possédant éventuellement une activité antibiotique, pouvant être obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'infections bactériennes.
11. Procédé de préparation de moénomycine tritiée, comprenant une étape de fixation de tritium sur une ou plusieurs doubles liaisons de la chaîne latérale de la moénomycine.
12. Moénomycine présentant une molécule de tritium incorporée dans son squelette.
13. Procédé de préparation d'une glycosyl transferase recombinante à partir d'un vecteur comprenant le gène de ladite glycosyl transferase, comprenant les étapes de : a) fermentation d'une cellule dans laquelle est introduite ledit vecteur, dans des conditions permettant la production de la glycosyl transferase recombinante b) purification de ladite glycosyl transferase recombinante, en 5 présence d'un détergent de préférence non ionique.
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