FR2945808A1 - Peptides marques et leur utilisation pour le dosage d'irap circulant - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP (« insulin responsive aminopeptidase ») comprenant au moins une étape de dosage quantitatif de ladite partie extracellulaire, sécrétée, purifiée, d'IRAP, au moyen d'au moins un peptide marqué, ledit peptide marqué interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP.

Description

PEPTIDES MARQUES ET LEUR UTILISATION POUR LE DOSAGE D'IRAP CIRCULANT. La présente invention concerne des peptides marqués et leur utilisation pour le dosage de la protéine IRAP circulante

La protéine IRAP (Insulin-Regulated AminoPeptidase ; EC 3.4.11.3) également connue sous le nom de Placental Leucine AminoPeptidase (P-LAP) et de Leucine-cystinyl aminopeptidase (L-CAP) est une protéine métalloprotéinase à zinc transmembranaire qui existe sous trois isoformes (Swiss-Prot: Q9UIQ6 :1, 2 et 3; représentées respectivement par les SEQ ID NO: 1 à 3). Lorsqu'elle est insérée au niveau de la membrane plasmique, sous sa forme native, son domaine extracellulaire peut être clivé et sécrété. La partie sécrétée d'une isoforme non-spécifiée de la protéine IRAP a été dosée dans le sang par une méthode enzymatique en utilisant un substrat synthétique non spécifique, la L-leucine-nitroanilide en présence de méthionine (Mizutani, S., Yoshino, M., and Oya, M. (1976) Clin Biochem 9(1), 16-18). Utilisant cette méthode Mizutani, Oya et Tomoda ont mis en évidence une cystinyl-leucine aminopeptidase. Cette aminopeptidase est essentiellement d'origine placentaire, raison pour laquelle elle a été appelée P-LAP (Tsujimoto, M., Mizutani, S., Adachi, H., Kimura, M., Nakazato, H., and Tomoda, Y. (1992) Arch Biochem Biophys 292(2), 388-392) et correspond au domaine sécrété de la protéine. Cette enzyme dégrade l'oxytocine (Naruki, M.,et al. (1996) Peptides 17(2), 257-261), la vasopressine (Wallis, M. G.et al. (2007) Am J Physiol Endocrinol Metab 293(4), E1092- 1102), l'angiotensine II et III (Matsumoto, H., et al. (2000) Eur J Biochem 267(1), 46-52) ainsi qu'une série d'autres peptides (Albiston, A. L., et al. (2007) Pharmacol Ther 116(3), 417-427). Les concentrations sériques de cette aminopeptidase n'ont jamais été rapportées chez l'homme. A l'occasion de son clonage, il est apparu que P-LAP correspond à la protéine IRAP ainsi qu'au récepteur de l'angiotensine IV (Keller, S. R., et al. (1995) J Biol Chem 270(40), 23612-23618; Rogi, T., et al. (1996) J Biol Chem 271(1), 56-61; Albiston, A. L., et al (2001) J Biol Chem 276(52), 48623-48626). La demande internationale WO 2005/038462 décrit un réactif pour le diagnostic et/ou une évaluation pronostique de carcinomes qui comprend un anticorps polyclonal anti-P-LAP, obtenu par immunisation avec la protéine P-LAP entière. Compte tenu de la forte homologie entre les différentes aminopeptidases, l'anticorps n'est vraisemblablement pas spécifique pour IRAP et va aussi reconnaître d'autres aminopeptidases. Il ne devrait donc pas permettre de diagnostiquer une pathologie liée de façon précise à une modification de l'expression ou de la concentration plasmatique d'IRAP. Il a été montré une relation entre la protéine IRAP et le développement de la chimiorésistance aux médicaments anticancéreux (Kondo C. et al., Int J. Cancer, 118, 1390-1394, 2006). Selon cet article, IRAP réduit en effet la sensibilité aux médicaments anticancéreux en inhibant l'expression du facteur de déclenchement de l'apoptose et augmente l'expression du facteur d'inhibition de l'apoptose. Les travaux de Lukazuk et al. (J. Med. Chem. 2008, 51, pp : 2291-2296) ont montré que des peptides derives de l'angiotensine IV étaient capable de se lier spécifiquement à la protéine IRAP localisée à la surface des cellules. A ce jour, il n'existe pas de méthode permettant de mesurer et de quantifier la protéine IRAP 15 sous sa forme native, c'est-à-dire non clivée et ancrée dans la membrane plasmique.

Le domaine extracellulaire d'IRAP est clivé par des métalloprotéases appartenant vraisemblablement à la famille des ADAM dont ADAM9 et ADAM 12 (Ito, N., et al. (2004) Biochem Biophys Res Commun 314(4), 1008-1013) et relargué dans la circulation sanguine. 20 ADAM9 (MDC9) est exprimée notamment dans le cerveau, le foie, le coeur, les reins et les poumons (Hotoda, N., et al. (2002) Biochem Biophys Res Commun 293(2), 800-805) et plusieurs autres membres de cette famille sont exprimés dans le muscle et le tissu adipeux. A ce jour, les seules relations établies entre la concentration du domaine extracellulaire d'IRAP dans un milieu biologique et une pathologie concernent la prééclampsie sévère ainsi 25 que la menace d'accouchement prématuré. Ainsi, il apparait nécessaire de doser de manière précise et quantitative le domaine extracellulaire circulant de la protéine IRAP. A ce jour, la protéine IRAP circulante n'a jamais été dosée quantitativement dans le sérum. Le problème à résoudre est encore plus compliqué que celui du dosage d'IRAP sous sa forme 30 native, compte tenu d'une part de la présence, dans le sérum ou le plasma, de nombreux éléments notamment des protéases susceptibles de dégrader les ligand potentiels d'IRAP, et d'autre part de la nécessité de mise en oeuvre de moyens relativement lourds.

Ainsi, il est nécessaire de disposer d'un moyen de doser la protéine IRAP circulante dans le sérum au moyen de composés capables de résister aux dégradations engendrées par les protéases contenues dans le sérum. Il est également nécessaire de disposer de composés spécifiques, stables, pouvant être utilisés pour la mise en oeuvre d'un dosage quantitatif et fiable de la protéine IRAP, dans un échantillon biologique ne contenant pas de cellules.

Ainsi, l'invention a pour but de fournir une méthode fiable, spécifique et quantitative permettant de mesurer la quantité de protéine IRAP circulante.

Un autre objet de l'invention est de fournir des ligands d'IRAP circulante permettant sa détection.

Ainsi, l'invention concerne une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP ( insulin responsive aminopeptidase ) comprenant au moins une étape de dosage quantitatif de ladite partie extracellulaire, sécrétée, purifiée, d'IRAP, au moyen d'au moins un peptide marqué, ledit peptide marqué interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP, ledit peptide marqué étant marqué préférentiellement par au moins un isotope radioactif, ledit peptide marqué étant un ligand d'IRAP, et notamment - soit un substrat marqué de la protéine IRAP, - soit un peptide inhibiteur marqué de la protéine IRAP, ledit peptide étant éventuellement modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un 13-homo acide aminé, naturel ou non, sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), et sous réserve que ledit peptide modifié, marqué par un atome d'iode 125I, soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).

La présente invention repose sur la constatation inattendue faite par les inventeurs que des peptides marqués permettent une détection quantitative efficace de la partie extracellulaire d'IRAP circulante.

La partie extracellulaire de la protéine IRAP est définie dans l'invention comme le domaine, ou l'enchainement d'acides aminés, de la protéine IRAP qui se trouve exposé à l'extérieur de la cellule lors que la protéine IRAP est ancrée dans la membrane plasmique des cellules.

La partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP est définie dans l'invention comme la partie extracellulaire de la protéine IRAP telle que définie ci-dessus qui n'est plus covalamment liée à la partie transmembranaire de la protéine IRAP. Cette partie extracellulaire est dite circulante car, après son clivage, elle se retrouve dans le milieu intérieur, et peut notamment se retrouver dans le plasma, la lymphe ou encore l'urine.

Egalement, la partie extracellulaire d'IRAP circulante est appelée partie extracellulaire d'IRAP sécrétée lorsqu'elle est retrouvée dans la circulation générale de l'organisme, c'est-à-dire le plasma, la lymphe ou l'urine. Dans ce qui suit et ce qui précède, les termes partie extracellulaire circulante d'IRAP et partie extracellulaire d'IRAP circulante réfèrent tous deux au domaine extracellulaire de la protéine IRAP qui n'est plus associé à la partie membranaire d'IRAP, et donc n'est plus associé à la membrane cellulaire.

La protéine IRAP dont il est question dans l'invention est représentée par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO 1.

Par peptide on entend toute chaîne peptidique correspondant à une succession covalente d'au moins deux acides aminés, ou de dérivés d'acides aminés, reliés par une fonction amide (-CO-NH-), lesdits acides aminés étant naturels ou non et lesdits dérivés d'acides aminés étant des dérivés d'acides aminés naturels ou non. Par peptide marqué , on entend dans l'invention un peptide tel que défini ci-dessus possédant une molécule ou un atome permettant sa détection autre que par des méthodes de détection classique des protéines ou des peptides, c'est-à-dire des méthodes autres que les méthodes immunologiques. Ainsi, les peptides marqués selon l'invention peuvent être couplés soit à des molécules fluorescentes (cyanines, coumarines, rhodamines, xanthènes, quantum dots (nanocristaux de matériau semi-conducteur)), soit peuvent contenir au moins un, c'est-à-dire un ou plusieurs, atome(s) radioactif(s), ledit atome radioactif étant également appelé isotope radioactif. Parmi les isotopes radioactifs susceptibles d'être utilisés dans l'invention, on peut citer, le tritium (3H), le carbone 14 (14C), l'iode 131 (131I), l'iode 125 (125f) ou encore le phosphate 32 ou 33 (32P ou 33P). Les isotopes radioactifs sont capables de se désintégrer et d'émettre des particules sous formes de rayonnement, ledit rayonnement étant mesurable au moyen par exemple de compteurs à scintillation, et ledit rayonnement proportionnel étant à la quantité d'isotope.

Dans le dosage décrit dans l'invention, la quantification de la partie extracellulaire d'IRAP est réalisée à partir de la partie extracellulaire d'IRAP qui a été purifiée. Les méthodes de purification de la protéine IRAP circulante peuvent être n'importe quelle méthode de purification de protéines connues de l'homme de métier. Une méthode préférée, mais non limitative, est une méthode immunologique et notamment l'immunoprécipitation ou l'immunocapture de la protéine IRAP circulante, au moyen d'un anticorps spécifique dirigé contre la partie extracellulaire de la protéine IRAP. La méthode immunologique d'immunocapture de la partie extracellulaire d'IRAP circulante est décrite dans les exemples. Dans l'invention, on entend par dosage quantitatif l'action qui consiste à déterminer, de manière précise, la quantité de protéine IRAP circulante contenu dans un échantillon biologique d'un individu ou d'un animal. Les termes ledit peptide marqué interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP , utilisés dans l'invention, signifient qu'au moins un peptide marqué selon l'invention et la partie extracellulaire purifié d'IRAP circulant forment un complexe de haute affinité. L'ordre de grandeur de l'affinité entre lesdits peptides et ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP est compris entre environ 10-9 M à 10 3 M, préférentiellement entre environ 0,1 nM et environ 100 nM. Les termes environ sont utilisés pour inclure la variabilité de mesure de ladite affinité, ladite variation étant généralement de 5 à 10% d'erreur sur la mesure. L'intensité de l'interaction est mesurée par exemple comme cela est décrit dans Lukazuk et al. (J. Med. Chem. 2008, 51, pp : 2291-2296). L'interaction est dite spécifique, ce qui signifie que le peptide marqué selon l'invention est capable de former un complexe avec la partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP, mais ledit peptide marqué n'est pas capable de former un complexe, aux mêmes concentrations, avec une autre protéine possédant une séquence en acides aminés différente de la séquence en acides aminés de ladite partie extracellulaire d'IRAP. Le peptide marqué de l'invention est un ligand d'IRAP, et notamment soit un substrat marqué de la protéine IRAP, soit un peptide inhibiteur marqué de la protéine IRAP, soit tout peptide dont l'affinité pour la partie extracellulaire d'IRAP circulant est environ inférieur ou égale à 10mM(<10nM). Selon l'invention, le peptide définis ci-dessus peut être modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un (3-homo acide aminé, naturel ou non.

Par acide aminé non naturel , on entend dans l'invention des acides aminés qui ne sont pas retrouvés naturellement dans les protéines lorsqu'elles sont synthétisées dans un organisme vivant, ou un système acellulaire utilisant la machinerie naturelle de synthèse des protéines (ARNm, ARNt, ribosomes...). Les acides aminés naturels sont les 20 acides aminés connus de l'homme de métier et dont la correspondance avec les triplets de nucléotides est donnée par le code génétique. Les acides aminés non naturels utilisés dans l'invention sont notamment, sans pour autant être limitatifs, les acides aminés dérivés de la leucine tels que la cycloleucine (Cle), la norleucine (Nle) ou la tert-leucine (Tle). Par [3-homo acide aminé , il est défini dans l'invention un acide aminé possédant un carbone supplémentaire. En d'autres termes, les acides aminés correspondent à des 2-(ou a) amino 2-[Chaine latérale (R)] acides acétiques, et les homo acides aminés correspondent à des 3 -(ou homo) 2-[Chaine latérale (R)] amino acides propanoïques ((32homo acide aminé), ou des 3 -(ou homo) 3-[Chaine latérale (R)] amino acides propanoïques ((33homo acide aminé).

Les formules des (32homo acide aminés et des (33homo acide aminés sont les suivantes :

O R O H2N O H2N OH R (32homo acide aminé 03homo acide aminé où R représente l'un quelconque des résidus déterminants les acides aminés.

L'invention ne concerne pas l'utilisation d'un peptide marqué non modifié qui serait l'angiotensine IV, et notamment l'Angiotensine IV humaine de séquence SEQ ID NO : 21 (Val-Tyr-I le-His-Pro-Phe). L'invention ne concerne pas l'utilisation d'un peptide modifié, marqué par un atome d'iode 125I, correspondant à l'Angiotensine IV ou la valine en position 1 est remplacée par une Nle et représenté par la séquence SEQ ID NO : 23 (Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe).

Dans ce qui précède et ce qui suit, par convention, les séquences spécifiques feront apparaitre les acides aminés naturels, les acides aminés non naturels, et les dérivés (32 ou R3 desdits acides aminés naturels ou non. Par contre, le marquage ne figure pas dans la séquence, raison pour laquelle le peptide marqué de séquence X sera représenté par la séquence SEQ ID NO X non marquée, et le type de marquage est précisé. Par exemple le peptide X marqué par de l'iode radioactif sera indiqué de la manière suivante : peptide de séquence SEQ ID NO X marqué à l'iode 1251.

Avantageusement, l'invention a pour objet une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP telle que défini ci-dessus, où ledit peptide marqué n'est pas modifié, sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe).

Ces peptides marqués non modifiés ont pour avantage d'être similaires ou équivalents aux peptides non marqués, et donc d'avoir une forte affinité pour la partie extracellulaire de la protéine IRAP circulante.

Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP tel que défini ci-dessus, où ledit peptide marqué est modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un R-homo acide aminé, naturel ou non, ledit peptide marqué modifié interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP, sous réserve que ledit peptide modifié, marquée par un atome d'iode 1251, soit 25 différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23). Ces peptides marqués modifiés ont pour avantage d'avoir une forte affinité pour la partie extracellulaire de la protéine IRAP circulante, et d'avoir une grande stabilité, notamment dans un échantillon contenant de nombreuses protéases ou peptidases. La stabilité des peptides selon l'invention peut être notamment mesurée en évaluant les 30 propriétés inhibitrices qu'exercent lesdits peptides sur l'activité amino peptidase d'IRAP. Cette mesure de la stabilité est illustrée dans les exemples.

L'invention concerne également, dans un mode de réalisation avantageux, une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP telle que définie précédemment, comprenant au moins : • une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et • une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié marqué. Ainsi, la méthode selon l'invention comprend au moins une étape de purification de la partie extracellulaire d'IRAP dans un échantillon biologique. Cette étape de purification est suivie par une étape de quantification de ladite partie extracellulaire d'IRAP purifiée à l'étape précédente. Cette seconde étape est mise en oeuvre au moyen d'au moins un peptide modifié tel que défini précédemment.

Comme indiquée précédemment, la purification de la partie extracellulaire circulante d'IRAP peut être mise en ouvre par une méthode d'immunologique, c'est-à-dire une méthode utilisant un anticorps dirigé contre la protéine IRAP, notamment l'immunoprécipitation ou l'immunocapture. Cette méthode est spécifique lorsqu'elle utilise un anticorps spécifique qui ne reconnait que la partie extracellulaire de la protéine IRAP, et permet d'obtenir une partie extracellulaire de la protéine IRAP pure. Le degré de contamination par d'autres protéines peut être évalué par une méthode classique de séparation des protéines (SDS-PAGE) couplé à une méthode de détection des protéines (coloration argentique, coloration au bleu de Coomassie colloïdal...), méthodes connues de l'homme de métier. L'immunoprécipitation ou l'immunocapture permet une purification a un degré très largement acceptable (> 90%), et notamment permet d'isoler une protéine de son environnement, par exemple des protéases contaminantes.

L'invention concerne, dans un autre mode de réalisation avantageux, une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP telle que définie précédemment, où - ledit peptide inhibiteur marqué de la protéine IRAP est modifié et est choisi parmi : l'Angiotensine IV marquée et modifiée et la LVV-hemorphin-7 marquée et modifiée, ou ledit substrat marqué de la protéine IRAP est modifié et est choisi parmi : la [Arg]-vasopressine marquée et modifiée, l'Oxytocine marquée et modifiée, la Met-/Leuenkephaline marquée et modifiée, la Somatostatine marquée et modifiée, la CCK-8 marquée et modifiée, la Neurokinine A marquée et modifiée, la Neuromedine B marquée et modifiée, la Lys-bradykinine marquée et modifiée et la Dynorphine A modifiée marquée et modifiée. Les peptides modifiés marqués susceptibles d'être utilisés dans l'invention correspondent soit à des substrats de la protéine IRAP, soit à des peptides inhibiteurs de la protéine IRAP. Les peptides inhibiteurs sont choisis parmi la LVV-hemorphine-7 ou l'angiotensine IV. Ces peptides inhibiteurs sont modifiés et marqués. La protéine IRAP est une protéase, elle est donc capable de cliver des protéines, lesdites protéines étant des substrats d'IRAP. Les protéines susmentionnées comme substrat d'IRAP sont donc des protéines susceptibles d'être clivées par IRAP. Comme toute enzyme, l'activité catalytique d'IRAP peut être bloquée par des composés appelés inhibiteurs. Généralement les inhibiteurs se fixent dans le site actif d'une enzyme, ne sont pas métabolisés par ladite enzyme, et l'empêche d'accéder à ses substrats. Ce genre d'inhibition est une inhibition compétitive. LVV-hemorphine-7 ou l'angiotensine IV sont des peptides inhibant l'activité d'IRAP.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP telle que définie ci-dessus, où ladite purification de la partie circulante de la protéine IRAP est effectuée au moyen d'au moins un anticorps spécifique de ladite partie extracellulaire d'IRAP, notamment par immunoprécipitation ou immunocapture. Ainsi, afin de purifier la partie extracellulaire d'IRAP circulante dans un échantillon biologique, l'invention propose d'utiliser un anticorps reconnaissant spécifiquement la partie extracellulaire d'IRAP, et ne reconnaissant pas la partie transmembranaire ou intracellulaire de ladite protéine IRAP. Cette méthode de purification peut être une immunoprécipitation où un anticorps spécifique de la partie extracellulaire d'IRAP est accroché à des billes de polymères de sucre (agarose, sépharose). La méthode de purification peut également être une immunocapture dans le cadre d'un ELISA ou d'un test Radioimmunmétrique (IRMA) où lesdits anticorps spécifiques sont fixés sur un support, notamment la paroi d'un tube, et immobilisent IRAP sur celui-ci.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP définie précédemment, où ladite protéine IRAP est représentée par la protéine IRAP de séquence SEQ ID NO 1, ou - une protéine homologue à la protéine IRAP présentant une identité de séquence d'au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO 1, sous réserve que ladite protéine homologue soit capable d'interagir spécifiquement avec les ligands d'IRAP ou les peptides inhibiteurs d'IRAP tels que définis précédemment, ou - une isoforme de la protéine IRAP, ladite isoforme étant le produit de l'épissage alternatif de l'ARN codant la protéine IRAP SEQ ID NO 1, sous réserve que ladite isoforme soit capable d'interagir spécifiquement avec les ligands d'IRAP ou les peptides inhibiteurs d'IRAP tels que définis précédemment, lesdites isoforme de la protéine IRAP SEQ ID NO 1 étant notamment représentées par les protéines SEQ ID NO 2 ou 3.

Dans l'invention, les homologues de la protéine IRAP correspondent à des protéines possédant une séquence homologue à la séquence SEQ ID NO 1 mais possédant des substitutions d'acides aminés. Les isoformes de la protéine IRAP définis dans l'invention correspondent à des produits de l'épissage alternatif du produit du gène codant la protéine IRAP, de telle sorte que la protéine qui en découle possède une séquence plus courte que la protéine IRAP SEQ ID NO 1. Les isoformes préférés de l'invention correspondent à des protéines tronquées dans la partie amino-terminale de plusieurs acides aminés.

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage 25 définie précédemment, où • lesdits variants de la protéine IRAP possèdent une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 4 à SEQ ID NO 7, et • lesdites isoformes de la protéine IRAP possèdent une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 8 à SEQ ID NO 15. 30 Egalement, selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage tel que défini précédemment, dans laquelle ladite partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP possède une séquence d'acides aminée représentée par les séquences choisies parmi les séquences suivantes : SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO 20.

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage 5 définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est marqué par au moins un atome de tritium ou au moins un atome d'iode 125I.

L'invention concerne également dans un mode de réalisation avantageux une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est représenté par la formule 10 générale (I) suivante : H2 N (I) où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à 0 ou 1, de telle sorte que (a+b)<_1, (c+d)<_1, (e+f)<1, (g+h)<_1 et (i,j)<_1, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendants les uns des autres, 15 où (R1, R1') sont tels que : - RI est choisi parmi : un groupement -CH(CH3)2, un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et R1' est un atome d'hydrogène, ou - RI et R1' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, 20 où (R2, R2') sont tels que : si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou - R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, 25 les couples (R1, R1') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, ledit peptide modifié marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énantiomères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères, OH sous réserve que si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0, * si (R1,R1')=( -CH(CH3)2;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H), et * si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3;H) alors (R1,R1') est différent de (-CH(CH3)2 ;H) et sous réserve que si ledit peptide modifié est marquée par un atome d'iode 125I, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (R1,R1') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).

En d'autres termes, le peptide de formule (Ia) suivante : o I est exclu de l'utilisation selon l'invention, quel que soit son marquage. Est également exclu de l'utilisation selon l'invention, le peptide de formule (lb) suivante o o H2N marqué par un atome au moins un atome d'iode 125 (125I), notamment marqué par un atome d'iode 125 sur le cycle aromatique du résidu 4-hydroxy benzyle. 15 Ainsi, les deux peptides suivants de formule Ibl et 1b2 sont exclus : o o H (Ib2) Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage définie 5 précédemment, dans laquelle le peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides de formules suivantes : N H H O N N OH H 2 NH < N H (Id) H H2N N O H N OH H2N H O H2N H N H O H N H2 N O H N O N H N H O H N H2 N O O H2N N H O o H

N~\H II ~ OH H2N H N N H O H2N N H Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage susmentionnée, où ledit peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante : X1-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) où X1 peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (I1e), une Norleucine (Nle), une Cycloleucine (Cle) ou une tert-leucine (Tle), ou un dérivé [32 ou [33 de l'un ces acides aminés, X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé 132 ou (33 de la tyrosine, X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nle), une Cycloleucine (Cle) ou une tert-leucine (Tle), ou un dérivé 132 ou (33 de l'un ces acides aminés, X4 peut être proline ou un dérivé (32 ou (33 de la proline, X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé R2 ou f33 de la phénylalanine, l'un au moins des acides aminés X l à X5 étant un acide aminé non naturel, et/ou un 13-homo acide aminé, naturel ou non. sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 125I soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).

Selon l'invention, le peptide marqué modifié constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO 22 correspond au peptide de formule générale (I) défini ci-dessus, dans lequel tous les acides aminés sont dans une configuration L selon la nomenclature L/D connue de l'homme de métier. Le nom ainsi que la formule développée des différents acides aminés naturels ou non, et les dérivés f32 ou (33 desdits acides aminés naturels ou non sont représentés dans le tableau 1 suivant. La colonne N indique la nature de l'acide aminé correspondant : naturel (0) ou non naturel (N). Acide aminé N Dérivé P3 Dérivé 132 H2N ^ r /OH H2N OH OH O H2N O 133homo valine (32homo valine O Valine (acide 3-isopropyle 3-amino (acide 2-isopropyle 3-amino propionique) propionique) ÇOH O H2N /OH H2N OH O O H2N ~33homo Leucine (32homo Leucine O Leucine (acide 3-isobutyle 3-amino propionique) (acide 2-isobutyle 3-amino propionique) ~OH O HZN / OH HZN OH HZN O O P2homo Isoleucine (33homo Isoleucine O (acide 3-sec-butyle 3-amino propionique) (acide 2-sec-butyle 3-amino propionique) Isoleucine OH O H HN OH H N\~ OH O _ r - O 0 (33homo Proline p2homo valine Proline Proline (acide 3-pipéridine carboxylique) (acide 2-pyrrolidine acétique) O H2N\ /OH H2N OH O 0 OH H2N 0 (33homo Phénylalanine (32homo valine Phénylalanine (acide 3-benzyle 3-amino propionique) (acide 2-benzyle 3-amino propionique) Phenylalanine OH H2N OH OH O H2N OH OH o HO 0 HZN ~33homo Tyrosine I32homo Tyrosine O (acide 3-parahydroxybenzyle 3-amino (acide 3-parahydroxybenzyle 3-amino Tyrosine propionique) propionique) H2 OH = O OH N H2N OH H2N O 0 (33homo Norleucine (acide 3-N-butyle 3-amino propionique) p2homo Norleucine Norleucine (acide 2-N-butyle 3-amino propionique) OH H2N / OH H2N OH r O O l33homo Tertleucine H2N N O (32homo Tertleucine (acide 3-tert-butyle 3-amino (acide 2-tert-butyle 3-amino Tertleucine propionique) propionique) HzN OH HZN OH OH HzN N O R3homo Cycloleucine (32homo Cycloleucine Cycloleucine (acide 1-aminocyclopentane acétique) (acide 1-aminomethyl cyclopentane carboxylique) Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante : X1-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) et où l'un au moins un des acides aminés Xl à X5 est un 13-homo acide aminé, naturel ou non. En d'autres termes, l'un au moins des acides aminés X1, ou X2, ou X3, ou X4 ou X4 ou X5 correspond à un acide aminé choisi parmi : la 32homo valine, la (33homo valine, la f32homo leucine, la [33homo leucine, la 132homo isoleucine, la 133homo isoleucine, la P homo tyrosine, la F33homo tyrosine, la P2homo proline, la (33homo proline, la (32homo phénylalanine, la (33homo phénylalanine, la (32homo norleucine, la (33homo norleucine, la f32homo tertleucine, la (33homo tertleucine, la I32homo cycloleucine et la Phomo cycloleucine.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est marqué • par au moins un atome d'iode 125I sur la tyrosine X2, notamment sur le groupement phényle, ou • par le remplacement de l'un au moins des atomes d'hydrogène par un atome de tritium 3H. Dans cas ou le peptide marqué modifié de l'invention est marqué par un atome d'iode 125, ledit peptide possède au moins un atome de 125I, ou deux atomes de 125I, en position meta sur le cycle benzyle de la tyrosine, ou en position meta sur le cycle benzyle des dérivés (32homo tyrosine ou 133homo tyrosine.

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides suivants : - f32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), de formule : o o (- 32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe- (SEQ ID NO 25), de formule et (32hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe- (SEQ ID NO 26), de formule OH préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant iodé. Les peptides ci-dessus ont une haute affinité pour la partie extracellulaire circulante d'IRAP, sont stables, et facilement détectables par comptage de la radioactivité émise par l'iode 125I. Avantageusement, l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides suivants : - (32hVa1-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), - (32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-133hPhe- (SEQ ID NO 25), et - P2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe- (SEQ ID NO 26), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant tritié. Les peptides ci-dessus ont une haute affinité pour la partie extracellulaire circulante d'IRAP, sont stables, et facilement détectables par comptage de la radioactivité émise par le tritium 3H. 20 Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie ci-dessus, comprenant • une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et • une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 25 marqué par l'iode radioactif 125I_

Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, comprenant • une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et • une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 25, tritié.

L'invention concerne également un peptide marqué représenté par la formule générale (I) suivante : 15 (I) ledit peptide éventuellement modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un (3-homo acide aminé, naturel ou non, où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à 0 ou 1, de telle sorte que (a+b)_<1, (c+d)<_l, 20 (e+f)<_1, (g+h)<_1 et (i,j)<_1, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendant les uns des autres, où (R1, R1') sont tels que : - R1 est choisi parmi : un groupement -CH(CH3)2, un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et R1' est un atome d'hydrogène, ou 25 - R1 et R1' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, où (R2, R2') sont tels que : 10 H2N N H OH - si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou - R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, les couples (R1, R1') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, ledit peptide marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énantiomères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères, sous réserve que si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0, si (RI,RI')=( -CH(CH3)2 ;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H) et si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3iH) alors (R1,R1') est différent de ( - CH(CH3)2 ;H) et sous réserve que si ledit peptide marqué est marquée par un atome d'iode 125I, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (R1,R1') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).

Les peptides précédents sont nouveaux. Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un peptide marqué tel que défini précédemment, représenté par la formule générale Ic, Id, Ie, If, Ig, Ih, Ii, Ij, Ik, Il, Im, In ou Io, telle que définie ci-dessus.

Un aspect avantageux de l'invention concerne un peptide marqué défini ci-dessus, ledit peptide étant marqué par au moins un isotope radioactif consistant en la séquence suivante : X1-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22), ledit peptide éventuellement modifié, où Xl peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), ou un acide aminé non naturel dérivé de la leucine, notamment la Norleucine (Nle), la Cycloleucine (Cle) ou la tert-leucine (Tle), ou un dérivé (32 ou (33 de l'un ces acides aminés naturels ou non naturels, X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé [32 ou 133 de la tyrosine, X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), ou un acide aminé non naturel dérivé de la leucine, notamment la Norleucine (Nle), la Cycloleucine (Cle) ou la tert-leucine (Tle), ou un dérivé (32 ou [33 de l'un ces acides aminés naturels ou non naturels, X4 peut être proline ou un dérivé (32 ou 03 de la proline, X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé (32 ou R3 de la phénylalanine, et sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 125I soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).

Avantageusement, l'invention concerne un peptide marqué défini ci-dessus, consistant en la séquence suivante : X1-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22), ledit peptide étant modifié de telle sorte que l'un au moins des acides aminés Xl à X5 soit un (3-homo acide aminé, naturel ou non.

Un autre aspect avantageux de l'invention concerne un peptide marqué défini précédemment, ledit peptide marqué modifié étant marqué : • par au moins un atome d'iode 125I sur la tyrosine X2, notamment sur le groupement phényle, ou • par le remplacement de l'un au moins des atomes d'hydrogène par un atome de tritium 3H.

Dans un autre aspect avantageux, l'invention concerne un peptide marqué mentionné précédemment, où ledit peptide marqué modifié est choisi parmi les peptides suivants : - 132hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), - (32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe- (SEQ ID NO 25), et - (32hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe- (SEQ ID NO 26), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant iodé.

Dans un autre aspect avantageux, l'invention concerne un peptide marqué mentionné précédemment, où ledit peptide marqué modifié est choisi parmi les peptides suivants : - J32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), (32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-[33hPhe- (SEQ ID NO 25), et - 132hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-f33hPhe- (SEQ ID NO 26), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant tritié. L'invention est illustrée par les figures 1A-Q, les figures 2A-Q et les exemples suivants, sans pour autant se limiter auxdits exemples.

Légende des figures : 10 Les figures IA-Q représentent les spectres d'absorption à 215 nm des élutions sur HPLC en phase inverse en présence de solvant eau/acétonitrile, la phase mobile contenant 0,1% de TFA. Le gradient standard correspond à une migration de 20 min de 3% à 97% d'acétonitrile, à un taux de 1 mL/min. La figure lA représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-15 (33hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH . La figure 1B représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-(33hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH. La figure 1C représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-Tyr-(33hIle-His-Pro-Phe-OH. 20 La figure 1D représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-f33hPro-Phe-OH. La figure lE représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-Pro- 33hPhe-OH. La figure 1F représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du premier 25 diastéréoisomère du peptide H-NhVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH. La figure 1G représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide du second diastéréoisomère du peptide H-(32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH. La figure 1H représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-Val-f32hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH 30 La figure lI représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du premier diastéréoisomère du peptide H-Val-Tyr-132hLeu-His-Pro-Phe-OH La figure 1J représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-Val-Tyr-(32hLeu-His-Pro-Phe-OH5 La figure 1K représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-j32hPro-Phe-OH La figure 1L représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-Pro-(32hPhe-OH La figure 1M représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-(32hVa1-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe-OH La figure 1N représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide NH2CO-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH La figure 10 représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des 10 racémates du peptide H-02hNle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH La figure 1P représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-02hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH La figure 1Q représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-(32hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe-OH 15 Les figures 2A-Q représentent les spectres d'absorption à 215 nm des élutions sur HPLC en phase inverse en présence de solvant eau/méthanol, la phase mobile contenant 0,1% de TFA. Le gradient standard correspond à une migration de 20 min de 3% à 97% de méthanol, à un taux de 1 mL/min. 20 La figure 2A représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-33hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH . La figure 2B représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-(33hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH. La figure 2C représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-25 Tyr-f33hlle-His-Pro-Phe-OH. La figure 2D représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-133hPro-Phe-OH. La figure 2E représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-Pro-133hPhe-OH. 30 La figure 2F représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du premier diastéréoisomère du peptide H- 32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH. La figure 2G représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide du second diastéréoisomère du peptide H-132hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.

La figure 2H représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-Val-[32hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH La figure 2I représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du premier diastéréoisomère du peptide H-Val-Tyr-02hLeu-His-Pro-Phe-OH La figure 2J représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-Val-Tyr-(32hLeu-His-Pro-Phe-OH La figure 2K représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-132hPro-Phe-OH La figure 2L représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-Pro-(32hPhe-OH La figure 2M représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-(32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe-OH La figure 2N représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide NH2ùx CO-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH La figure 20 représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-02hNle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH La figure 2P représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-02hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH La figure 2Q représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des racémates du peptide H-02hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe-OH EXEMPLES Exemple 1 : synthèse des peptides La synthèse de tous les peptides a été réalisée par synthèse peptidique en phase solide en utilisant des acides amines protégés en position amino terminale par du tert-butoxycarbonyl 5 (Boc) ou du N-9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). Les peptides ont été synthétisés sur une résine Merrifield Boc-Phe (0,57 mmol/g), une résine Wang Fmoc-Phe (0,76 mmol/g) ou une résine de 2-chlorotrityle chloride (1,5 mmol/g). Les groupes de protection des chaines latérales étaient Tyr(t-Bu), P3-hTyr (t-Bu), et His(Trt) pour la synthèse Fmoc, et Tyr (2,6-di-Cl-Bzl) et His(Tos) pour la synthèse Boc. 10 Les groupes de protection Fmoc ont été retirés avec une solution de 20% de pipéridine dans du diméthyle formamide (DMF) (2 x 5 min), et le clivage des groupes de protection Boc ont été réalisés dans une solution de 50% acide trifluoroacétique (TFA) dans du dichlorométhane (DCM) (2 x 10 min) et une solution de 10% triéthylamine (TEA) dans du DCM (2 X 5 min) a été utilisé pour la neutralisation. 15 Le couplage des acides aminés a été réalisé dans du DMF/DCM (lv/lv) en utilisant du O-(Benzotriazo l-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) (3 équivalents) et du diisopropyléthylamine (DIPEA) (6 équivalents). Les protocoles de synthèse ont été les suivants : Cycle Fmoc standard : Etape Procédé Répétition Temps Remarque Stabilisation de la résine 1 1h avec du CH2C12 Déprotection Fmoc 2 2x 5 et 10 min 20% piperidin/DMF 3 Lavage avec du CH2C12 3x 1 min 4 Lavage avec de l'iPrOH 3x 1 min Lavage avec du CH2C12 3x 1 min Si négatif retour à 6 Test colorimétrique l'étape 3 7 Couplage 2h ou la nuit 8 Lavage avec du CH2C12 3x 1 min 9 Lavage avec de l'iPrOH 3x 1 min Lavage avec du CH2C12 3x 1 min Si positif retour à 11 Test colorimétrique l'étape 7 12 Répétition des étapes 2 ù- 11 Les 3 eq d'acides aminé (par rapport à la résine) et le 6 eq de DIPEA (par rapport à la résine) ont été dissouts dans du CH2C12 (10 mL pour 1 g de résine), contenant, si nécessaire, une petite quantité de DMF pour facilité la solubilité de l'acide aminé. La résine 2-chlorotritilchloride a été préstabilisée dans du CH2C12 pendant 1h, et après ajout du mélange la résine a été mélangée pendant 30-120 min. Plus tard, la résine a été lavée trois fois avec un mélange CH2C12/MeOH/DIPEA (17:2:1), puis deux fois au DMF et trois fois au CH2C12. Cycle Boc standard : Etape Procédé Répétition Temps Remarque 1 Stabilisation de la résine 1h Déprotection Boc 2 2x 5 et 15 min 50% TFA/CH2C12 3 Lavage avec du CH2C12 3x 1 min 4 Lavage avec de l'iPrOH 3x 1 min 5 Lavage avec du CH2C12 3x 1 min Neutralisation 6 10% DIPEA/CH2C12 7 Lavage avec du CH2C12 3x 1 min 8 Lavage avec de l'iPrOH 3x 1 min 9 Lavage avec du CH2C12 3x 1 min Si négatif retour à Test colorimétrique l'étape 3 2h or 11 Couplage overnight 12 Lavage avec du CH2C12 3x 1 min 13 Lavage avec de l'iPrOH 3x 1 min 14 Lavage avec du CH2C12 3x 1 min Si positif retour à Test colorimétrique l'étape 7 16 Répétition des étapes 2 ù+ 15 L'acide amine-Boc a été dissout dans de l'EtOH (2 mL/mmol) et de l'au (0,5 mL/mmol), le 10 pH est ajusté à 7 avec 2 M de solution aqueuse Cs2CO3. La solution a été est évaporée par dessèchement, les résidus ont été évaporés deux fois avec du dioxane. La résine Merrifield a été préstabilisée dans du CH2C12 pendant 1h et lavée au DMF. Le sel de césium d'acide aminé (1,2 eq) dans le DMF a été ajouté à la résine, et le tout chauffé à 50°C toute la nuit. A la fin de la réaction, la résine a été lavée trois fois dans du DMF, trois fois dans un mélange DMF/eau 15 (1:1), trois fois dans du DMF, trois fois dans du CH2C12, et trois fois dans du MeOH.

Dans les deux stratégies (Boc et Fmoc), 3 éq. d'acide aminé, 3 éq. de TBTU et 6 éq. de DIPEA ont été mélangés et laissés pendant 3 min pour permettre l'activation. La solution est alors ajoutée sur la résine et agitée pendant deux heures ou toute la nuit.

Le test colorimétrique correspond à un test de Kaiser . Ce test consiste en 3 solutions: A: 5 g de ninhydrine dans 100 mL de n-BuOH; B: 80 g de phénol dans 20 mL de n-BuOH; C: 2 mL 0.001 M KCN aqueux dans in 98 mL de pyridine. Quelques billes de résine sont placées dans un tube à essai. 3 gouttes de chacune des solutions sont ajoutées et le tube est chauffé à 100°C pendant 5 min. Lorsque la résine ou la solution est incolore ou jaunâtre, le résultat est négatif. Une coloration bleue témoigne de la présence d'une amine primaire, et une coloration marron/rouge témoigne de la présence d'une amine secondaire.

Les peptides ont été clivés de la résine par traitement avec un mélange TFA/H2O/Triéthylsylane (TES) (95:2.5:2.5) pendant 2 h, soit avec de l'acide fluorhydrique HF, soit un mélange TFA/acide trifluoromethanesulfonique (TFMSA)/TES (20:2:3) dans le cas d'une résine Merrifield. Dans les deux cas de l'éthanol est ajouté pour précipiter les peptides. Les précipités sont lavés avec de l'EtOH.

Les peptides ont été purifiés par HPLC en phase inverse sur une colonne C18 Supelco Discovery BIO Wide Pore. Chaque peptide était pur à au moins 98% après test sur chromatographie en couche mince (CCM) et analyse HPLC en phase inverse dans un solvant eau/acétonitrile (figures 1A-1Q), ou dans un solvant eau/méthanol (figures 2A-2Q).

Les poids moléculaires ont été confirmés par spectrométrie de masse-electrospay/ionisation (ESI-MS).

Le tableau suivant récapitule les propriétés des peptides synthétisés, M cale correspond à la masse prédite, ESI MS correspond à la masse obtenue par spectrométrie de masse, R% correspond au rendement en pourcent par rapport aux peptides bruts, Temps Ret1 correspond au temps de rétention lors de l'élution eau/acétonitrile, Pureté%1 1 correspond à la pureté du produit obtenu après l'élution eau/acétonitrile Temps Ret2 correspond au temps de rétention lors de l'élution eau/méthanol, Pureté%2 correspond à la pureté du produit obtenu après l'élution eau/méthanol. Composé M calé ESI MS R % Temps Pureté Temps Pureté Retl %1 Ret2 %2 H-(i3hVa1-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH 788,42 789,41 46,6 9,75 >99 14,59 >99 (AL-1) H-Val-(33hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH 788 ,42 789,33 70 9,75 >99 14,97 >99 (AL-2) H-Val-Tyr-(33hI1e-His-Pro-Phe-OH 788 ,42 789,42 41,6 9,22 >99 14,23 >99 (AL-3) H Val Tyr Ile His (i3hPro-Phe OH 788,42 789,30 77,9 9,80 >99 15,26 >99 (AL-4) H-Val-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe-OH 788 ,42 789,30 87,3 9,58 >99 14,92 >99 (AL-5) H-(32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH 788 ,42 789,39 83,6 9,79 >99 15,31 >99 (AL-6a) H-32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH 788 ,42 789,39 83,6 10,13 >99 15,86 >99 (AL-6b) H-Val-(i2hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH 788 ,42 789,42 86,8 99,'7397 >99 14,72 >99 (AL-7ab) H-Val-Tyr-(32hLeu-His-Pro-Phe-OH. 788,42 789,55 89 9,87 >99 15,25 >99 (AL-8a) H-Val-Tyr-(i2hLeu-His-Pro-Phe-OH 788,42 789,55 89 9,29 >99 14,80 >99 (AL-8ab) 9,91 15,27 H Val Tyr Ile His (i2hPro Phe OH 788,42 789,40 77,9 9,56 >99 14,93 >99 (AL-9) H Val Tyr Ile His Pro (i2hPhe OH 788,42 789,50 37,3 9,73 >99 14,79 >99 (AL-10ab) H-(32hVa1-Tyr-Ile-His-Pro-(i3hPhe-OH 802,44 803,37 53,3 10,16 >99 15,72 >99 (AL-11) NH2CO-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH 800,94 801,39 89 9,96 >99 14,77 >99 (AL-12) H-(32hNle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH 802,96 804,01 96 10,30 >99 15,38 >99 (AL-13ab) 10,65 16,10 H (32hLeu Tyr Ile His Pro-Phe OH 802,96 804,00 97 10,24 >99 15,29 >99 (AL-14ab) H-(32hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe-OH 816,99 817,45 65 10,5 >99 15,92 >99 (AL-15ab) 16,51 Au cours de la synthèse, tous les R2 homo acide aminés utilisés étaient sous forme de racémates, et après synthèse, deux diastéréoisomères ont été obtenus. La séparation de ces diastéréoisomères est indiquée par la présence des lettres a et b . Lorsque les diastéréoisomères n'ont pas pu être séparés, les ils sont représentes par ab . Par convention, les diastéréoisomères a sont élués avant les diastéréoisomères b lors de la HPLC en phase inverse.10 Exemple 2: Marquage au tritium Les peptides néosynthétisés et non purifiés ont été tritiés par saturation catalytique selon la procédure décrite dans Tôth G et al. (1997 Methods Mol Biol. vol 73, pp:219-30). Le dihydrogène tritié gazeux 3H2 utilisé est obtenu de Technobexport, (Russie) et contient une quantité de tritium supérieure ou égale à 98%. La radioactivité des peptides bruts a été mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation TRICARB 2100TR dans un scintillant composé de d'un mélange toluène-Triton X-100. La mesure de la radioactivité était d'environ 100mCi (3.7 GBq) Les peptides tritiés ont été purifies par HPLC en utilisant une colonne Grace Vydac 218TP54 C18, et la détection du liquide de scintillation a été réalisée sur un détecteur Canberra Packard Radiomatic 505TR Flow Radiochromatography en utilisant du scintillant Ultima-Flo M. L'activité specifique des peptides purifiés tritiés a été mesurée par HPLC en utilisant une courbe étalon. L'activité spécifique obtenue était comprise entre environ 30,0 Ci mmol-1 et 45,0 Ci mmol-l.

Exemple 3 : Marquage à l'Iode 125 (1251) L'iodation des peptides peut être réalisée selon plusieurs protocoles connus de l'homme de métier. Le principe de l'iodation des protéines repose sur la conversion de l'I- (Nal) en I+ ou I3" en présence d'agents oxydants tels que la chloramine-T, l'iodogène (1,3,4,6-tetrachloro- 3a,6a-diphenyl-glycoluril), le N-chloro-benzenesulfonamide ou la lactoperoxydase. I+ ou I3-sont des espèces réactives qui attaquent le cycle aromatique des tyrosines en position méta comme décrit dans "Antibodies: a laboratory manual" E. Harlow et D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 pp. 324 - 339.

Matériel pour l'iodation par le N-chloro-benzenesulfonamide L'iode radioactive 125I est utilisée sous forme de Na125I dans une solution basique à environ 1 mCi(37 MBq)/10 l IODINE-125(Amersham; IMS30). Réactifs • 0.1 M tampon phosphate, pH 7,0 • Tampon Tris-buffered saline (TBS) • 5% BSA dans du TBS • Solution de stabilisation (10% thiosulfate de sodium + 0,1N NaOH) • IODO-BEADTM(PIERCE): billes greffées avec un agent oxydant (N-chlorobenzenesulfonamide) • microseringue Hamilton (model 702, 25pl, aiguille 22S, style 2) • colonne de dessalage (Bio-rad DG-10 etc.) Procedure 1. Dans un tube en plastique, 2000L de tampon phosphate 0,1M, pH 7 sont mélangés avec 5001ICi de Na125I (5 L) et 1 à deux doses de IODO-BEADs. 2. le mélange est incubé à température ambiante pendant 5 min. 3. Les peptides sont ajoutés à la solution (entre 1 à 100 g de peptide) 4. le nouveau mélange est incubé à température ambiante pendant 10-25 min 5. le surnageant est prélevé et placé sur une colonne dessalage, afin d'éliminer sels, Na125I et I+ ou 13_ libres. 6- les fractions de la colonne sont collectées, et la radioactivité de chacune des fractions est mesurée, en utilisant un compteur à scintillation. 7- dans les fractions radioactives, '/4 du volume d'une solution de 5% BSA est ajoutée afin de prévenir la décomposition par radiation.

Exemple 4 : Spécificité des peptides : mesure de la liaison peptide marqués/partie extracellulaire d'IRAP.

La mesure de la liaison entre les peptides marqués et le domaine extracellulaire d'IRAP a été effectuée par un test de liaison adapté du test décrit par Demaegdt et al. (Demaegdt et al., 2004, Biochem. Pharmacol. 68, 885-892). Le domaine extracellulaire d'IRAP recombinant produit dans des cellules d'insecte (HighFive) purifié par affinité a été repris dans un tampon de liaison 50 mM Tris-HC1 (pH 7,4) contenant 140 mM de NaCl.

Les incubations ont été réalisées dans des plaques 24 puits dans un volume final de 300 L comprenant 100 L de la partie extracellulaire d'IRAP, 50 pl d'un mélange EDTA/1,10-phénanthroline avec une concentration finale de 500 M d'EDTA et 100 pM de 1,10-phénanthroline, et : - soit 50 pl de tampon de liaison, - soit 50 pl de tampon de liaison contenant les peptides non marqués pour les tests de compétition. 50 l de peptides marqués ont été ajoutés à une concentration finale de 0,5 à 0,8 nM pour les tests de saturation, soit à une concentration de 3nM pour les autres tests.

L'incubation a été réalisée à 37°C, à des temps variables (cinétique) jusqu'à 60 min. Les puits dans lesquels est adsorbée la partie extracellulaire d'IRAP ont ensuite été lavés plusieurs fois avec du tampon d'incubation afin d'éliminer la radioactivité libre. La radioactivité a alors été mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation, en présence de scintillant ad hoc. L'affinité des peptides marqués pour la partie extracellulaire d'IRAP à été évaluée entre 1 et 100 nM

Exemple 5 : Stabilité des peptides marqués Afin de mesurer la stabilité des peptides marqués dérivés de l'angiotensine IV, leurs homologues marqués à l'iode froide (127I) ont été incubés à une concentration de 100 M pendant 40 min dans un échantillon de sérum, lequel sérum n'est pas traité au préalable avec des inhibiteurs de protéases. Les peptides ont ensuite été séparés du sérum par gel filtration et incubés à des concentrations allant de 0,1 nM à 1 M avec le domaine extracellulaire d'IRAP purifié en présence de [125I]-AngIV (0,1 - 1 nM) ou de [125I]-Nle-AngIV (0,1 û 1 nM) et d'inhibiteurs de peptidases et protéases. La stabilité des peptides dans l'échantillon de sérum est alors mesurée indirectement en mesurant la compétition des peptides marqués à 1'1251 avec la liaison de [125I]-AngIV ou de [125I]-Nle-AngIV au domaine extracellulaire d'IRAP (cf A. Lukaszuk et al. Med Chem. 51, 2291û2296, 2008).

Exemple 6 : RIA IRAP PRINCIPE DE LA PROCÉDURE Le dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP (extIRAPc) selon l'Invention fait appel à une méthode immunoradiométrique. La partie extracellulaire circulante d'IRAP présente dans les échantillons issus de patients ou les étalons est reconnue par un anticorps monoclonal (Mab) spécifique de la partie extracellulaire d'IRAP, ledit anticorps monoclonal étant lié à la surface intérieure des tubes de polystyrène. L'ajout d'un peptide marqué à l'Iode 125 ou au tritium (peptide*), possédant une haute affinité pour extIRAPc induit la formation d'un complexe sandwich lié à la phase solide (tube): Mab- extIRAPc - peptide*. A la fin de l'incubation, la fraction de peptide* non liée à la phase solide est éliminée par aspiration et par lavages. La formation du complexe ne se réalisant qu'en présence d' extIRAPc, la radioactivité liée à la phase solide (tube) est directement proportionnelle à la concentration d' extIRAPc dans l'échantillon. Une courbe d'étalonnage permet de déterminer, par interpolation, la concentration d' extIRAPc des échantillons à doser.

PRÉLÈVEMENT, PRÉPARATION ET CONSERVATION DES ÉCHANTILLONS Le dosage peut être effectué sur du sérum humain. Si le dosage est exécuté dans les 24 heures suivant le prélèvement, les échantillons peuvent être conservés à 2-8°C. Dans le cas contraire, ils doivent être aliquotés et congelés à -20°C ou à des températures plus basses pendant un maximum de cinq mois. Si les échantillons ont été congelés, il y a lieu attendre qu'ils soient complètement décongelés et les homogénéiser avant le dosage. Il faut éviter les cycles de congélation/décongélation répétés. Si l'on prévoit des niveaux d'extIRAPc élevés, il est nécessaire de diluer l'échantillon avec l'étalon zéro (cf. infra). Il est recommandé d'utiliser des tubes en plastique lors de la 15 préparation des dilutions. PROCÉDURE DE DOSAGE RECONSTITUTION DES RÉACTIFS LYOPHILISÉS • Reconstituer l'étalon zéro avec 5 mL d'eau distillée, l'étalon zéro correspondant à un échantillon ne possédant pas d'extIRAPc. 20 • Reconstituer les étalons 1 à 6 (échantillons de sérum pour lesquels la quantité d'extIRAPc est connue) et les contrôles G1 et G2 (G1 et G2 correspondent à des solutions contenant de l'extIRAPc) de avec 1 mL d'eau distillée. Reconstituer les réactifs plusieurs minutes avant l'utilisation et mélanger délicatement (éviter la formation de mousse). 25 DILUTION DU TAMPON DE LAVAGE: Ajouter 900 mL d'eau distillée à 100 mL de tampon de lavage concentré. Eviter la formation de mousse. (tampon de lavage: PBS, albumine 0,1%, pH 7.4).

30 PROTOCOLE DE DOSAGE Avant utilisation, les tubes revêtus, les étalons, les sérums contrôle et les sérums à analyser sont placés à température ambiante (18-25°C) pendant au moins 30 minutes; puis leur contenu est mélangé au Vortex. Il est recommandé d'exécuter l'analyse en double aussi bien pour les étalons que pour les sérums de contrôle et les échantillons. Observer scrupuleusement l'ordre d'utilisation des réactifs: 1. Pipeter 50 L de chaque échantillon (étalons, sérum contrôle et échantillon) et déposer au fond d'autant de tubes revêtus avec les Mab que d'échantillons prélevés, et dans autant de tubes non revêtus que d'échantillons prélevés. 2. Distribuer 200 O. de peptide* dans chacun des tubes y compris ceux non revêtus destinés à l'évaluation de l'activité totale. 3. Incuber pendant 2 heures 5 minutes à température ambiante (18-25°C) sur un agitateur horizontal (200-300 tours/minute). 4. Laver les tubes de la manière suivante: aspirer soigneusement le contenu des tubes (sauf ceux destinés à l'évaluation de l'activité totale), ajouter 1 mL de tampon de lavage dilué dans chaque tube (sauf ceux destinés à l'évaluation de l'activité totale) et aspirer la solution de lavage. Répéter le lavage une deuxième fois. Pour obtenir des résultats reproductibles et fiables il est nécessaire d'exécuter le lavage correctement. Le respect soigneux des temps d'incubation et l'élimination complète de la solution de lavage sont fondamentaux pour une bonne réussite de l'analyse. 5. Mesurer à l'aide d'un compteur gamma l'activité de tous les tubes, y compris ceux destinés à l'évaluation de l'activité totale. CONTRÔLE DE QUALITÉ Il est recommandé d'inclure dans chaque analyse des échantillons contrôle afin de vérifier la qualité des résultats obtenus. Tous les échantillons doivent être traités de la même manière et les résultats sont analysés avec une méthode statistique adéquate. Si les valeurs des sérums contrôle ne sont pas comprises dans l'intervalle d'acceptabilité indiqué, le dosage doit être refait.

CALCUL DES RÉSULTATS 1. Calculer la moyenne des comptages pour chaque étalon, contrôle ou échantillon. 2. Tracer la courbe d'étalonnage à l'aide des comptages moyens de chaque étalon reportés sur l'axe des ordonnées en fonction des concentrations respectives d'insuline sur l'axe des abscisses. 3. Calculer les concentrations des contrôles et des échantillons par interpolation de la courbe d'étalonnage à l'aide des comptages moyens respectifs en corrigeant, le cas échéant, par le facteur de dilution utilisé.

Claims (26)

1. Revendications1. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP ( insulin responsive aminopeptidase ) comprenant au moins une étape de dosage quantitatif de ladite partie extracellulaire, sécrétée, purifiée, d'IRAP, au moyen d'au moins un peptide marqué, ledit peptide marqué interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP, ledit peptide marqué étant marqué préférentiellement par au moins un isotope radioactif, ledit peptide marqué étant un ligand d'IRAP, et notamment soit un substrat marqué de la protéine IRAP, - soit un peptide inhibiteur marqué de la protéine IRAP, ledit peptide étant éventuellement modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un [3-homo acide aminé, naturel ou non, sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), et sous réserve que ledit peptide modifié, marqué par un atome d'iode 1251, soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
2. 2. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon la revendication 1, où ledit peptide marqué n'est pas modifié, sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe),
3. 3. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon la revendication 1, où ledit peptide marqué est modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un [3-homo acide aminé, naturel ou non, ledit peptide marqué modifié interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP, sous réserve que ledit peptide modifié, marqué par un atome d'iode 125I, soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
4. 4. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, comprenant au moins : • une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et • une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié marqué.
5. 5. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3 à 4, où ledit peptide inhibiteur marqué de la protéine IRAP est modifié et est choisi parmi : l'Angiotensine IV marquée et modifiée et la LVV-hemorphin-7 marquée et modifiée, ou ledit substrat marqué de la protéine IRAP est modifié et est choisi parmi : la [Arg]-vasopressine marquée et modifiée, l'Oxytocine marquée et modifiée, la Met-/Leuenkephaline marquée et modifiée, la Somatostatine marquée et modifiée, la CCK-8 marquée et modifiée, la Neurokinine A marquée et modifiée, la Neuromedine B marquée et modifiée, la Lys-bradykinine marquée et modifiée et la Dynorphine A modifiée marquée et modifiée.
6. 6. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon les revendications 1 ou 4, où ladite purification de la partie circulante de la protéine IRAP est effectuée au moyen d'au moins un anticorps spécifique de ladite partie extracellulaire d'IRAP, notamment par immunoprécipitation ou immunocapture.
7. 7. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, où ladite protéine IRAP est représentée par la protéine IRAP de séquence SEQ ID NO 1, ou - une protéine homologue à la protéine IRAP présentant une identité de séquence d'au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO 1, sous réserve que ladite protéine homologue soit capable d'interagir spécifiquement avec les ligands d'IRAP ou les peptides inhibiteurs d'IRAP, ou - une isoforme de la protéine IRAP, ladite isoforme étant le produit de l'épissage alternatif de l'ARN codant la protéine IRAP SEQ ID NO 1, sous réserve que ladite isoforme soit capable d'interagir spécifiquement avec les ligands d'IRAP ou lespeptides inhibiteurs d'IRAP, lesdites isoforme de la protéine IRAP SEQ ID NO 1 étant notamment représentées par les protéines SEQ ID NO 2 ou 3.
8. 8. Méthode de dosage selon la revendication 7, où • lesdits variants de la protéine IRAP possèdent une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 4 à SEQ ID NO 7, et • lesdites isoformes de la protéine IRAP possèdent une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 8 à SEQ ID NO 15.
9. 9. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle ladite partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP possède une séquence d'acides aminée représentée par les séquences choisies parmi les séquences suivantes : SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO 20.
10. 10. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3 à 9, où ledit peptide modifié marqué est marqué par au moins un atome de tritium ou au moins un atome d'iode 125I.
11. 11. Méthode de dosage selon l'une quelconque des 1 ou 3 à 10, où ledit peptide modifié marqué est représenté par la formule générale (I) suivante : Hz N (I) où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à 0 ou 1, de telle sorte que (a+b)<_1, (c+d)S1, (e+f)_1, (g+h)51 et (i,j)<_1, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendants les uns des autres, où (R1, R1') sont tels que : - R1 est choisi parmi : un groupement -CH(CH3)2, un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et Rl' est un atome d'hydrogène, ou OH- RI et Rl' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, où (R2, R2') sont tels que : - si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou - R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, les couples (R1, R1') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, ledit peptide modifié marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énantiomères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères, sous réserve que si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0, * si (R1,R1')=( -CH(CH3)2;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H), et * si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3;H) alors (R1,R1') est différent de (-CH(CH3)2 ;H) et sous réserve que si ledit peptide modifié est marquée par un atome d'iode 1251, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (R1,R1') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).
12. 12. Méthode de dosage selon la revendication 11, où ledit peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante : X1-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) où Xl peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nle), une Cycloleucine (Cle) ou une tert-leucine (Tle), ou un dérivé [32 ou (33 de l'un ces acides aminés, X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé (32 ou 133 de la tyrosine, X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (11e), une Norleucine (Nle), une Cycloleucine (Cle) ou une tert-leucine (Tle), ou un dérivé [32 ou 133 de l'un ces acides aminés, X4 peut être proline ou un dérivé (32 ou 133 de la proline, X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé (32 ou 133 de la phénylalanine, l'un au moins des acides aminés Xl à X5 est un acide aminé non naturel, et/ou un [3-homo acide aminé, naturel ou non sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 125I soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
13. 13. Méthode de dosage selon la revendication 11 ou 12, où ledit peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante : X1-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) et où l'un au moins des acides aminés Xl à X5 est un [3-homo acide aminé, naturel ou non.
14. 14. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, où ledit peptide modifié marqué est marqué • par au moins un atome d'iode 125I sur la tyrosine X2, notamment sur le groupement phényle, ou • par le remplacement de l'un au moins des atomes d'hydrogène par un atome de tritium 3H.
15. 15. Méthode de dosage selon quelconque des revendications 11 à 14, où ledit peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides suivants : 1- 32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), - (32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-[33hPhe- (SEQ ID NO 25), et - [32hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-[33hPhe- (SEQ ID NO 26), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant iodé.
16. 16. Méthode de dosage selon quelconque des revendications 11 à 14, où ledit peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides suivants : - (32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), (32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe- (SEQ ID NO 25), et - f32hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe- (SEQ ID NO 26), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant tritié.
17. 17. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3 à 14 ou 15, comprenant • une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et41 • une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 25 marqué par l'iode radioactif 1251
18. 18. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3 à 14 ou 16, comprenant • une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et • une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié marqué de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 25 tritié.
19. 19. Peptide marqué représenté par la formule générale (I) suivante : H2 N (I) ledit peptide éventuellement modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un 13-homo acide aminé, naturel ou non, où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à 0 ou 1, de telle sorte que (a+b)<_l, (c+d)1, (e+f)S1, (g+h)<_1 et (i,j)<_1, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendant les uns des autres, où (RI, Ri') sont tels que : - RI est choisi parmi : un groupement -CH(CH3)2, un groupement -CH2-CH(CH3)2. un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et R1' est un atome d'hydrogène, ou - RI et Rl' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, où (R2, R2') sont tels que : - si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou - R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, OHles couples (R1, R1') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, ledit peptide marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énantiomères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères, sous réserve que si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0, si (R1,R1')=( -CH(CH3)2 ;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H) et si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3;H) alors (R1,Rl') est différent de ( - CH(CH3)2 ;H) et sous réserve que si ledit peptide marqué est marquée par un atome d'iode 125I, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (R1,R1') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).
20. 20. Peptide marqué selon la revendication précédente, ledit peptide étant marqué par au moins un isotope radioactif consistant en la séquence suivante : X1-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22), ledit peptide éventuellement modifié, où Xl peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), ou un acide aminé non naturel dérivé de la leucine, notamment la Norleucine (Nle), la Cycloleucine (Cle) ou la tert-leucine (Tle), ou un dérivé (32 ou [33 de l'un ces acides aminés naturels ou non naturels, X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé (32 ou R3 de la tyrosine, X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), ou un acide aminé non naturel dérivé de la leucine, notamment la Norleucine (Nle), la Cycloleucine (Cle) ou la tert-leucine (Tle), ou un dérivé [32 ou (33 de l'un ces acides aminés naturels ou non naturels, X4 peut être proline ou un dérivé R2 ou 133 de la proline, X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé [32 ou [33 de la phénylalanine, et sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 1251 soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
21. 21. Peptide marqué selon la revendication précédente, consistant en la séquence suivante : X1-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO
22. 22), ledit peptide étant modifié de telle sorte que l'un au moins des acides aminés X1 à X5 soit un [3-homo acide aminé, naturel ou non. 22. Peptide marqué selon la revendication 20 ou 21, ledit peptide marqué modifié étant marqué • par au moins un atome d'iode 125I sur la tyrosine X2, notamment sur le groupement phényle, ou • par le remplacement de l'un au moins des atomes d'hydrogène par un atome de tritium 3H.
23. 23. Peptide marqué selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, où ledit peptide marqué modifié est choisi parmi les peptides suivants : - 02hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO
24. 24), - (32hVa1-Tyr-Ile-His-Pro-[33hPhe- (SEQ ID NO
25. 25), et - (32hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe- (SEQ ID NO
26. 26), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant iodé. 24. Peptide marqué selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, où ledit peptide marqué modifié est choisi parmi les peptides suivants : - (32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), - [32hVal-Tyr-Ile-His-Pro-f33hPhe- (SEQ ID NO 25), et - (32hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-(33hPhe- (SEQ ID NO 26), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant tritié.