WO2010133806A2 - Peptides marques et leur utilisation pour le dosage d'irap circulant - Google Patents

Peptides marques et leur utilisation pour le dosage d'irap circulant Download PDF

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Serge Bottari
Georges Vauquelin
Dirk Tourwe
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Universite Joseph Fourier
Vrije Universiteit Brussel
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    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads

Definitions

  • the protein IRAP (Insulin-Regulated Amino Peptidase, EC 3.4.11.3) also known as Placental Leucine Amino Peptidase (P-LAP) and Leucine-cystinyl aminopeptidase (L-CAP) is a transmembrane zinc metalloproteinase protein that exists under three isoforms (Swiss-Prot: Q9UIQ6: 1, 2 and 3, respectively represented by SEQ ID NO: 1 to 3).
  • This enzyme degrades oxytocin (Naruki, M., et al., (1996) Peptides 17 (2), 257-261), vasopressin (Wallis, M. Cet (2007) Am J Physiol Endocrinol Metab 293 (4), E1092-1102), angiotensin II and III (Matsumoto, H., et al (2000) Eur J Biochem 267 (1), 46-52) as well as a series of other peptides (Albiston , AL, et al (2007) Pharmacol Ther 116 (3), 417-427). Serum concentrations of this aminopeptidase have never been reported in humans.
  • P-LAP corresponds to the IRAP protein as well as to the angiotensin IV receptor (Keller, SR, et al., (1995) J Biol Chem 270 (40), 23612 Rogi, T., et al (1996) Biol Chem 271 (1), 56-61, Albiston, AL, et al (2001) J Biol Chem 276 (52), 48623-48626).
  • International Application WO 2005/038462 discloses a reagent for the diagnosis and / or prognostic evaluation of carcinomas which comprises a polyclonal anti-P-LAP antibody, obtained by immunization with the entire P-LAP protein. Given the homology between the different aminopeptidases, the antibody is probably not specific for IRAP and will also recognize other aminopeptidases. It should therefore not be possible to diagnose a pathology specifically related to a change in the expression or plasma concentration of IRAP.
  • IRAP indeed reduces sensitivity to anticancer drugs by inhibiting the expression of the triggering factor of apoptosis and increases the expression of the factor of inhibition of apoptosis.
  • the extracellular domain of IRAP is cleaved by metalloproteases belonging probably to the ADAM family including ADAM9 and ADAM 12 (Ito, N., et al., (2004) Biochem Biophys Res Commun 314 (4), 1008-1013). and released into the bloodstream.
  • ADAM9 MDC9
  • MDC9 MDC9
  • IRAP extracellular domain of IRAP
  • a biological medium and a pathology concern severe preeclampsia as well as the threat of premature labor.
  • the problem to be solved is even more complicated than that of the IRAP assay in its native form, partly because of the presence, in the serum or the plasma, of many elements. especially proteases liable to degrade the potential ligands of IRAP, and secondly the need to implement relatively heavy means.
  • the purpose of the invention is to provide a reliable, specific and quantitative method for measuring the amount of circulating IRAP protein.
  • Another object of the invention is to provide circulating IRAP ligands for its detection.
  • the invention relates to a method for assaying the circulating extracellular portion of the IRAP protein ("insulin responsive aminopeptidase") comprising at least one step of quantitatively assaying said extracellular, secreted, purified part of IRAP, by means of at least one labeled peptide, said labeled peptide interacting specifically with said extracellular part of IRAP, said labeled peptide preferably being labeled with at least one radioactive isotope, said labeled peptide being an IRAP ligand, and in particular either a labeled substrate of the IRAP protein, an inhibitory peptide labeled with the IRAP protein, said peptide being optionally modified by the presence of at least one non-natural amino acid, and / or at least one ⁇ -homo amino acid, whether natural or not, subject to that said unmodified labeled peptide is different from angiotensin IV, and in particular that said unmodified labeled peptide is different from the SEQ ID
  • the invention relates to a method for assaying the circulating extracellular portion of the protein IRAP ("insulin responsive aminopeptidase") comprising at least one step of quantitatively assaying said extracellular, secreted, purified part of IRAP by means of less a modified and labeled peptide, said labeled peptide interacting specifically with said extracellular part of IRAP, said peptide being modified by the presence of at least one non-natural amino acid, and / or at least one natural ⁇ -homo amino acid, or not, said labeled peptide being preferentially labeled with at least one radioactive isotope, provided that - said peptide is not an antibody and
  • said modified peptide, labeled with a 125 I iodine atom is different from the Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe sequence (SEQ ID No. 23).
  • the present invention is based on the unexpected finding made by the inventors that labeled peptides allow effective quantitative detection of the extracellular portion of circulating IRAP.
  • extracellular portion of the IRAP protein is defined in the invention as the domain, or chain of amino acids, of the IRAP protein that is exposed outside the cell when the IRAP protein is anchored. in the plasma membrane of cells.
  • the "circulating extracellular portion" of the IRAP protein is defined in the invention as the extracellular portion of the IRAP protein as defined above which is no longer covalently bound to the transmembrane portion of the IRAP protein. This extracellular part is called circulating because, after its cleavage, it is found in the extracellular environment, and can be found in particular in plasma, serum, lymph, cerebrospinal fluid or urine.
  • the extracellular part of circulating IRAP is called the extracellular part of secreted IRAP when it is found in the general circulation of the body, that is to say plasma, serum, lymph, cerebrospinal fluid. or urine.
  • the terms "circulating extracellular portion of IRAP” and “extracellular portion of circulating IRAP” both refer to the extracellular domain of the IRAP protein which is no longer associated with the membrane portion of IRAP, and therefore no longer associated with the cell membrane.
  • the IRAP protein that is the subject of the invention is represented by the amino acid sequence SEQ ID No. 1.
  • peptide any peptide chain corresponding to a covalent succession of at least two amino acids, or amino acid derivatives, linked by an amide function (-CO-NH-), said amino acids being natural or not and said amino acid derivatives being natural or non-naturally occurring amino acid derivatives.
  • labeled peptide in the invention a peptide as defined above having a molecule or an atom allowing its detection other than by conventional detection methods of proteins or peptides, that is to say -describe methods other than immunological methods.
  • the labeled peptides according to the invention can be coupled to either fluorescent molecules (cyanines, coumarins, rhodamines, xanthenes, quantum dots (nanocrystals of semiconductor materials), etc.), or can contain at least one, one or more radioactive atom (s), said radioactive atom being also called radioactive isotope.
  • radioactive isotopes which may be used in the invention, mention may be made of tritium ( 3 H), carbon 14 ( 14 C), iodine 131 ( 131 I) and iodine 125 ( 125 I). or phosphate 32 or 33 ( 32 P OR 33 P).
  • the peptides according to the invention are labeled with one or more 125 I ( 125 I) atoms, preferably with a single 125 I ( 125 I) atom.
  • the radioactive isotopes are capable of disintegrating and emitting particles in the form of radiation, said radiation being measurable by means for example of scintillation counters or not, and said proportional radiation being the amount of isotope.
  • the quantification of the extracellular portion of IRAP is performed from the extracellular portion of IRAP that has been purified.
  • Methods for purifying the circulating IRAP protein may be any method of purifying proteins known to those skilled in the art.
  • a preferred, but not limiting, method is an immunological method and in particular the immunoprecipitation or immunocapture of the circulating IRAP protein, by means of a specific antibody directed against the extracellular portion of the IRAP protein.
  • the immunological immunocapture method of the extracellular portion of circulating IRAP is described in the examples.
  • the term "quantitative assay” means the action of precisely determining the amount of circulating IRAP protein contained in a biological sample of an individual or an animal.
  • said labeled peptide interacting specifically with said extracellular portion of IRAP used in the invention mean that at least one labeled peptide according to the invention and the purified extracellular portion of circulating IRAP form a complex of high affinity.
  • the order of magnitude of the affinity between said peptides and said circulating extracellular portion of IRAP is between about 10 -10 M to 10 -5 M, preferably between about 0.1 nM and about 100 nM.
  • the terms are used to include the measurement variability of said affinity, said variation being generally from 5 to 10% error on the measurement.
  • the intensity of the interaction is measured for example as described in Lukaszuk et al. (J. Med Chem 2008, 51, pp: 2291-2296).
  • the interaction is said to be specific, which means that the labeled peptide according to the invention is capable of forming a complex with the circulating extracellular portion of the IRAP protein, but said labeled peptide is not capable of forming a complex of the same affinity at the same concentrations with another protein having an amino acid sequence different from the amino acid sequence of said extracellular portion of IRAP.
  • the labeled peptide of the invention is an IRAP ligand, and in particular is a labeled substrate of the IRAP protein, or an inhibitory peptide labeled with the IRAP protein, or any peptide whose affinity for the extracellular portion of circulating IRAP. is less than or equal to 10 ⁇ M ( ⁇ 10 nM).
  • the peptide defined above can be modified by the presence of at least one non-natural amino acid, and / or at least one ⁇ -homo amino acid, natural or non-natural.
  • non-natural amino acid is meant in the invention amino acids that are not found naturally in proteins when synthesized in a living organism, or acellular system using the natural machinery of protein synthesis (mRNA , TRNA, ribosomes ).
  • the natural amino acids are the 20 amino acids known to those skilled in the art and whose correspondence with the triplets of nucleotides is given by the genetic code.
  • the non-natural amino acids used in the invention include, but are not limited to, amino acids derived from leucine such as cycloleucine (CIe), norleucine (Nie) or tert-leucine (ITe).
  • ⁇ -homo amino acid it is defined in the invention an amino acid having an additional carbon.
  • the amino acids correspond to 2- (or ⁇ ) amino 2- [side chain (R)] acetic acids
  • the ⁇ homo amino acids correspond to 3 - (or ⁇ homo) 2 - [Side chain (R)] amino propanoic acids ( ⁇ 2 homo amino acid), or 3 - (or ⁇ homo) 3- [Side chain (R)] amino propanoic acids ( ⁇ 3 homo amino acid).
  • the formulas of the ⁇ 2 homo amino acid and the ⁇ 3 homo amino acid are as follows:
  • the invention does not relate to the use of an unmodified labeled peptide which would be angiotensin IV, and in particular human Angiotensin IV of sequence SEQ ID NO: 21
  • the invention does not relate to the use of a modified peptide, labeled with an Iodine 125 I atom, corresponding to Angiotensin IV or valine in position 1 is replaced by a Nie and represented by the sequence SEQ ID NO : 23 (Nle-Tyr-Isle-His-Pro-Phe).
  • the specific sequences will reveal natural amino acids, non-natural amino acids, and ⁇ 2 or ⁇ 3 derivatives of said natural amino acids or not.
  • the labeling does not appear in the sequence, for which reason the labeled peptide of sequence X will be represented by the sequence SEQ ID NO X unlabeled, and the type of labeling is specified.
  • the peptide X labeled with radioactive iodine will be indicated as follows: peptide of sequence SEQ ID NO X labeled with iodine 125 I.
  • the subject of the invention is a method for assaying the circulating extracellular portion of IRAP as defined above, wherein said labeled peptide is not modified, provided that said unmodified labeled peptide is different from the angiotensin IV, and in particular that said unmodified labeled peptide is different from the sequence SEQ ID No. 21 (VaI-Tyr-Ile-His-Pro-Phe).
  • These unmodified labeled peptides have the advantage of being similar or equivalent to the unlabeled peptides, and therefore of having a high affinity for the extracellular portion of the circulating IRAP protein.
  • the invention relates to a method for assaying the circulating extracellular portion of IRAP as defined above, wherein said labeled peptide is modified by the presence of at least one non-natural amino acid, and / or at least one ⁇ -homo amino acid, natural or non-natural, said modified labeled peptide interacting specifically with said extracellular part of IRAP, provided that said modified peptide, labeled with an iodine atom 125 I, is different from the Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe sequence (SEQ ID No. 23).
  • modified labeled peptides have the advantage of having a high affinity for the extracellular portion of the circulating IRAP protein, and of having a high stability, especially in a sample containing numerous proteases or peptidases.
  • the stability of the peptides according to the invention may in particular be measured by evaluating the inhibitory properties exerted by said peptides on the aminopeptidase activity of IRAP. This measure of stability is illustrated in the examples.
  • the invention also relates, in an advantageous embodiment, to a method for assaying the circulating extracellular portion of IRAP as defined above, comprising at least:
  • the method according to the invention comprises at least one step of purifying the extracellular portion of IRAP in a biological sample. This purification step is followed by a step of quantification of said extracellular portion of IRAP purified in the previous step. This second step is implemented using at least one modified peptide as defined above.
  • the purification of the circulating extracellular portion of IRAP can be carried out by an immunological method, that is to say a method using an antibody directed against the IRAP protein, in particular immunoprecipitation or immunocapture.
  • This method is specific when it uses a specific antibody that recognizes only the extracellular portion of the IRAP protein, and makes it possible to obtain an extracellular portion of the pure IRAP protein.
  • the degree of contamination by other proteins can be evaluated by a conventional method of protein separation (SDS-PAGE) coupled with a protein detection method (silver staining, colloidal blue staining, etc.). methods known to those skilled in the art.
  • Immunoprecipitation or immunocapture allows a purification to a very widely acceptable degree (> 90%), and in particular makes it possible to isolate a protein from its environment, for example contaminating proteases.
  • the invention relates, in another advantageous embodiment, to a method for assaying the circulating extracellular portion of IRAP as defined above, in which the said inhibitory peptide labeled with the IRAP protein is modified and is chosen from: Angiotensin IV labeled and modified and the labeled and modified LVV-hemorphin-7, or said labeled substrate of the IRAP protein is modified and is selected from: the labeled and modified [Arg] vasopressin, the modified and modified oxytocin, MeWLeu-enkephaline labeled and modified, labeled and modified Somatostatin, labeled and modified CCK-8, labeled and modified Neurokinin A, labeled and modified Neuromedin B, labeled and modified Lys-bradykinin and modified and modified modified modified Dynorphin A.
  • the modified labeled peptides that may be used in the invention correspond to either substrates of the IRAP protein or to peptide inhibitors of the IRAP protein.
  • the inhibitory peptides are chosen from LVV-hemorphin-7 or angiotensin IV. These inhibitory peptides are modified and labeled.
  • the IRAP protein is a protease, so it is able to cleave proteins, said proteins being IRAP substrates.
  • the aforementioned proteins as IRAP substrate are therefore proteins susceptible to be cleaved by IRAP.
  • the catalytic activity of IRAP can be blocked by compounds known as inhibitors.
  • the inhibitors bind to the active site of an enzyme, are not metabolized by said enzyme, and prevent it from accessing its substrates. This kind of inhibition is a competitive inhibition.
  • LVV-hemorphin-7 or angiotensin IV are peptides that inhibit IRAP activity.
  • the invention relates to a method for assaying the circulating extracellular portion of IRAP as defined above, wherein said purification of the circulating portion of the IRAP protein is carried out by means of at least an antibody specific for said extracellular portion of IRAP, in particular by immunoprecipitation or immunocapture.
  • the invention proposes to use an antibody specifically recognizing the extracellular portion of IRAP, and not recognizing the transmembrane or intracellular portion of said IRAP protein.
  • This purification method may be an immunoprecipitation where an antibody specific for the extracellular portion of IRAP is attached to sugar polymer beads (agarose, sepharose).
  • the purification method may also be an immunocapture in the context of an ELISA or an immunomagnetic radio test (IRMA) in which the said specific antibodies are fixed on a support, in particular the wall of a tube, and immobilize IRAP on this support. this.
  • IRAP extracellular concentration of IRAP must be measured at least one of the following products: - chelators of cations such as: EDTA, EGTA, 1,10-orthophenantroline, dimercaprol, lipoic acid, BAPTA (1,2-bis (o-aminophenoxy) ethane-N, N, N ', N'-tetraacetic acid), DTPA (diethylene acid) triamine pentaacetic), DMPS (2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid), DMSA (dimercaptosuccinic acid), penicillamine, deferroxamine, sulfosalicylic acid, citric acid, oxalic acid, tartaric acid, N 5 N-Dimethyldecylamine N-oxide, acid nitrilotriacetic acid, pyromellitic acid,
  • - chelators of cations such as: EDTA, EGTA, 1,10-
  • inhibitors of proteases and peptidases such as: AEBSF (4- (2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride), 6-aminohexanoic acid, antipain, aprotinin, benzamidine dine, bestatin, chymostatin, E-64, leupeptin, pepstatin, phosphoramidon, trypsin inhibitor, diisopropyl fluorophosphate, PMSF, p-chloromercuribenzoic acid, diethyl pyrocarbonate, 2-Mercaptoethylamine, Apstatin, Phebestin, Bromoenol lactone, Ecotin (acid 1, 4 , 5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carboxilic acid), N-acetyl-eglin C, Gabexate mesylate, N-Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone, Na-T-
  • the invention relates to a method for assaying the circulating extracellular portion of IRAP defined above, wherein said IRAP protein is represented by
  • the homologs of the IRAP protein correspond to proteins having a sequence homologous to the sequence SEQ ID No. 1 but having amino acid substitutions.
  • the isoforms of the IRAP protein defined in the invention correspond to products of the alternative splicing of the product of the gene encoding the IRAP protein, so that the protein
  • the resulting isoforms of the invention correspond to truncated proteins in the aminoterminal portion of several amino acids.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to an assay method defined above, where
  • Said variants of the IRAP protein have an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO 4 to SEQ ID NO 7, and
  • Said isoforms of the IRAP protein have an amino acid sequence selected from the sequences SEQ ID NO 8 to SEQ ID NO 15.
  • the invention relates to an assay method as defined above, wherein said circulating extracellular portion of the IRAP protein has an amino acid sequence represented by the sequences chosen from the following sequences: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 20.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a previously defined assay method, wherein said labeled modified peptide is labeled with at least one tritium atom or at least one 125 I iodine atom, that is to say an iodine atom or more, preferably a single 125 I iodine atom.
  • the invention also relates in a preferred embodiment to a previously defined assay method, wherein said modified modified peptide is represented by the following general formula (III):
  • R 1 is chosen from: a group -CH (CH 3 ) 2 , a group -CH 2 -CH (CH 3 ) 2, a group -CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 , a group - (CH 2 ) 3 -CH 3 and a group C (CH 3 ) 3 , and R 1 'is a hydrogen atom, or R 1 and R 1' together with the carbon which carry them a cyclopentyl, where (R 2 , R 2 ') are such that: if R2 is chosen from: a group -CH 2 -CH (CH 3 ) 2 , a group -CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 , a group - (CH 2 ) 3 -CH 3 and a group C (CH 3 ) 3 , R 2 'is a hydrogen atom, or
  • R2 and R2 ' together with the carbon which carries them a cyclopentyl, the pairs (R 1 , R 1 ') and (R 2 , R 2 ') being chosen independently of each other, where A is selected from the following groups
  • said modified modified peptide being in the form of a racemate, any of its enantiomers, or any of the various tautomers corresponding to said racemates and enantiomers,
  • A is represented by the formula IHa and if a, b, c, d, e, f, g, h, i and j are 0,
  • modified modified peptide corresponds to one of the following three general formulas:
  • the invention also relates in a preferred embodiment to a previously defined assay method, wherein said modified modified peptide is represented by the following general formula (I):
  • a, b, c, d, e, f, g, h, i, and j may be 0 or 1, such that (a + b) ⁇ l, (c + d) ⁇ l, (e + f) ⁇ l, (g + h) ⁇ l and (i, j) ⁇ l, (a, b), (c, d), (e, f), (g, h) and (i, j ) being independent of one another, where (Ri, Ri ') are such that:
  • R 1 is chosen from: a group -CH (CH 3 ) 2 , a group -CH 2 -CH (CH 3 ) 2, a group -CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 , a group - (CH 2 ) 3 -CH 3 and a group C (CH 3 ) 3 , and R 1 'is a hydrogen atom, or R 1 and R 1' together with the carbon which carry them a cyclopentyl, where (R 2 , R 2 ') are such that: if R2 is chosen from: a group -CH 2 -CH (CH 3 ) 2 , a group -CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 , a group - (CH 2 ) 3 -CH 3 and a group C (CH 3 ) 3 , R 2 'is a hydrogen atom, or
  • the invention relates to a previously defined assay method, in which the labeled modified peptide is chosen from the following peptides:
  • the invention also relates to an assay method as defined above, wherein said labeled and modified peptide consists of the following sequence:
  • X1 can be a Valine (Val), a Leucine (Leu), an Isoleucine (Ile), a Norleucine (Nie), a Cycloleucine (CIe) or a tert-leucine (TIe), or a derivative ⁇ 2 or ⁇ 3 of one of these amino acids,
  • X2 may be a tyrosine, or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of tyrosine,
  • X3 can be a Leucine (Leu), an Isoleucine (Ile), a Norleucine (Nie), a Cycloleucine (CIe) or a tert-leucine (TIe), or a derivative ⁇ 2 or ⁇ 3 of one of these amino acids ,
  • X4 may be a proline or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of proline
  • X5 may be a phenylalanine, or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of phenylalanine, and (His-X4) may be
  • At least one of the amino acids X1 to X5 is a non-natural amino acid, and / or a ⁇ -homo amino acid, natural or otherwise provided that the sequence SEQ ID NO 22 labeled with an iodine atom 125 I is different from the Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe sequence (SEQ ID NO 23).
  • the invention relates to an aforementioned assay method, wherein said labeled and modified peptide consists of the following sequence: X1-X2-X3-His-X4-X5 (SEQ ID NO 22) where
  • X1 can be a Valine (Val), a Leucine (Leu), an Isoleucine (Ile), a Norleucine (Nie), a Cycloleucine (CIe) or a tert-leucine (TIe), or a derivative ⁇ 2 or ⁇ 3 of one of these amino acids
  • X2 may be a tyrosine, or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of tyrosine,
  • X3 can be a Leucine (Leu), an Isoleucine (Ile), a Norleucine (Nie), a Cycloleucine (CIe) or a tert-leucine (TIe), or a derivative ⁇ 2 or ⁇ 3 of one of these amino acids ,
  • X4 can be proline or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of proline
  • X5 may be a phenylalanine, or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of phenylalanine, at least one of amino acids X 1 to X 5 being a non-natural amino acid, and / or a ⁇ -homo amino acid, natural or non-natural. provided that the sequence SEQ ID No. 22 labeled with a 125 I iodine atom is different from the Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe sequence (SEQ ID No. 23).
  • the modified modified peptide consisting of the amino acid sequence SEQ ID No. 22 corresponds to the peptide of general formula (I) defined above, in which all the amino acids are in an L configuration according to the L nomenclature. / D known to those skilled in the art.
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a previously defined assay method, wherein said labeled and modified peptide consists of the following sequence:
  • Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID No. 22) and wherein at least one of amino acids X1 to X5 is a ⁇ -homo amino acid, natural or not.
  • at least one of the amino acids X1, or X2, or X3, or X4 or X4 or X5 corresponds to an amino acid chosen from: ⁇ 2homo valine, ⁇ 3homo valine, ⁇ 2homo leucine, ⁇ 3homo leucine, ⁇ 2homo isoleucine, ⁇ 3homo isoleucine, ⁇ 2homo tyrosine, ⁇ 3homo tyrosine, ⁇ 2homo proline, ⁇ 3homo proline, ⁇ 2homo phenylalanine, ⁇ 3homo phenylalanine, ⁇ 2 homo norleucine, ⁇ 3 homo norleucine, ⁇ 2 homo tertleucine, ⁇ 3 homo tertleu
  • the invention relates to a previously defined assay method, wherein said labeled modified peptide is labeled
  • At least one 125 I iodine atom on tyrosine X 2 preferably one single 125 I iodine atom, in particular on the phenyl group, or
  • the modified labeled peptide of the invention is labeled with an iodine atom 125
  • said peptide has at least one 125 I atom, or two 125 I atoms, in the meta position on the benzyl ring of tyrosine, or in the meta position on the benzyl ring of the ⁇ 2 homo tyrosine or ⁇ 3 homo tyrosine derivatives.
  • the peptide is labeled with a single 125 I iodine atom.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a previously defined assay method, wherein said labeled modified peptide is selected from the following peptides: ⁇ 2 hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24 ), of formula:
  • the above peptides have a high affinity for the circulating extracellular portion of IRAP, are stable, and easily detectable by counting the radioactivity emitted by 125 I iodine.
  • the invention relates to a previously defined assay method, wherein said labeled modified peptide is selected from the following peptides: - ⁇ 2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24),
  • the above peptides have a high affinity for the circulating extracellular portion of IRAP, are stable, and easily detectable by counting the radioactivity emitted by tritium H.
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to an assay method defined above, comprising
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to a previously defined assay method, comprising: a step of purifying said circulating extracellular portion of IRAP, and
  • the invention also relates to a labeled modified peptide represented by the following general formula (III):
  • R 1 is chosen from: a group -CH (CH 3 ) 2 , a group -CH 2 -CH (CH 3 ) 2, a group -CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 , a group - (CH 2 ) 3 -CH 3 and a group C (CH 3 ) 3 , and R 1 'is a hydrogen atom, or R 1 and R 1' together with the carbon which carry them a cyclopentyl, where (R 2 , R 2 ') are such that: if R2 is chosen from: a group -CH 2 -CH (CH 3 ) 2 , a group -CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 , a group - (CH 2 ) 3 -CH 3 and a group C (CH 3 ) 3 , R 2 'is a hydrogen atom, or
  • R2 and R2 ' together with the carbon which carries them a cyclopentyl, the pairs (R 1 , R 1 ') and (R 2 , R 2 ') being chosen independently of each other, where A is selected from the following groups
  • said modified modified peptide being in the form of a racemate, any of its enantiomers, or any of the various tautomers corresponding to said racemates and enantiomers,
  • A is represented by the formula IHa and if a, b, c, d, e, f, g, h, i and j are 0,
  • the invention also relates to a labeled modified peptide represented by the following general formula (I):
  • said peptide possibly modified by the presence of at least one non-natural amino acid, and / or at least one ⁇ -homo amino acid, natural or not, where a, b, c, d, e, f, g, h, i and j may be equal to 0 or 1, such that (a + b) ⁇ l, (c + d) ⁇ l, (e + f) ⁇ l, (g + h) ⁇ l and (i, j) ⁇ 1, (a, b), (c, d), (e, f), (g, h) and (i, j) being independent of each other, where (Ri, Ri ') are such than :
  • R1 is chosen from: a group -CH (CH 3 ) 2 , a group -CH 2 -CH (CH 3 ) 2i a group -CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 , a group - (CH 2 ) 3 -CH 3 and a group C (CH 3 ) 3 , and R 1 'is a hydrogen atom, or - R 1 and R 1' together with the carbon which bears them a cyclopentyl, where (R 2 , R 2 ') are such as : - if R2 is chosen from: a group -CH 2 -CH (CH 3 ) 2, a group -CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 , a group - (CH 2 ) 3 -CH 3 and a group C (CH 3 ) 3 , R2 'is a hydrogen atom, or
  • An advantageous embodiment of the invention relates to a labeled peptide as defined above, represented by the general formula Ic, Id, Ie, If, Ig, Ih, Ii, Ij, Ik, II, Im, In, Io, IHd or IHe as defined above.
  • the invention also relates, in an advantageous embodiment, to a labeled and modified peptide consisting of the following sequence:
  • X1 can be a Valine (Val), a Leucine (Leu), an Isoleucine (Ile), a Norleucine (Nie), a Cycloleucine (CIe) or a tert-leucine (TIe), or a derivative ⁇ 2 or ⁇ 3 of one of these amino acids,
  • X2 may be a tyrosine, or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of tyrosine,
  • X3 can be a Leucine (Leu), an Isoleucine (Ile), a Norleucine (Nie), a Cycloleucine (CIe) or a tert-leucine (TIe), or a derivative ⁇ 2 or ⁇ 3 of one of these amino acids
  • X4 may be a proline or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of proline
  • X5 may be a phenylalanine, or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of phenylalanine, and (His-X4) may be an aba-gly of formula lia or
  • At least one of the amino acids X1 to X5 is a non-natural amino acid, and / or a ⁇ -homo amino acid, natural or otherwise provided that the sequence SEQ ID NO 22 labeled with an iodine atom 125 I is different from the Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe sequence (SEQ ID NO 23).
  • the invention relates to the aforementioned modified unlabeled peptides, in particular the peptides of formulas IbbI and IIIc that follow:
  • An advantageous aspect of the invention relates to a labeled peptide defined above, said peptide being labeled with at least one radioactive isotope consisting of the following sequence: X1-X2-X3-His-X4-X5 (SEQ ID NO. 22) ) said modified peptide, where
  • X1 can be Valine (Val), Leucine (Leu), Isoleucine (Ile), or an unnatural amino acid derived from leucine, in particular Norleucine (Nie), Cyclo leucine (CIe) or tert- leucine (TIe), or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of either these natural or unnatural amino acids,
  • X2 may be a tyrosine, or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of tyrosine,
  • X3 may be Leucine (Leu), Isoleucine (Ile), or an unnatural amino acid derived from leucine, in particular Norleucine (Nie), Cycloleucine (CIe) or tert-leucine (TiE), or a derivative thereof ⁇ 2 or ⁇ 3 of one of these natural or unnatural amino acids
  • X4 can be proline or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of proline
  • X5 can be a phenylalanine, or a ⁇ 2 or ⁇ 3 derivative of phenylalanine and provided that said unmodified labeled peptide is different from angiotensin IV, and in particular that said unmodified labeled peptide is different from SEQ ID NO.
  • the invention relates to a modified modified peptide defined above, consisting of the following sequence:
  • X1-X2-X3-His-X4-X5 SEQ ID NO 22
  • said peptide being modified such that at least one amino acid X1 to X5 is a ⁇ -homo amino acid, natural or not.
  • Another advantageous aspect of the invention relates to a modified modified peptide defined above, said modified labeled peptide being labeled:
  • the invention relates to a modified modified peptide mentioned above, wherein said modified labeled peptide is selected from the following peptides:
  • the invention relates to a modified modified peptide mentioned above, wherein said modified labeled peptide is selected from the following peptides:
  • FIGS. 1A-Q represent the absorption spectra at 215 nm of elutions on reverse phase HPLC in the presence of water / acetonitrile solvent, the mobile phase containing 0.1% of TFA.
  • the standard gradient corresponds to a 20 min migration from 3% to 97% acetonitrile, at a rate of 1 mL / min.
  • FIG. 1A represents the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide H- ⁇ 3hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
  • FIG. 1B shows the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide H-VaI- ⁇ 3hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
  • FIG. 1C represents the UV absorption spectrum as a function of time of the H-VaI-peptide.
  • FIG. 1D shows the UV absorption spectrum as a function of time of the H-VaI-peptide.
  • FIG. 1E represents the UV absorption spectrum as a function of time of the H-VaI-peptide.
  • Figure IF shows the UV absorption spectrum as a function of time of the first diastereoisomer of the peptide H- ⁇ 2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
  • FIG. 1G shows the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide of the second diastereoisomer of the peptide H- ⁇ 2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
  • FIG. 1H shows the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H-Val- ⁇ 2hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH peptide racemates.
  • FIG. II represents the UV absorption spectrum as a function of time of the first diastereoisomer of the peptide H-Val-Tyr- ⁇ 2hLeu-His-Pro-Phe-OH
  • FIG. 1J represents the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H-Val-Tyr- ⁇ 2hLeu-His-Pro-Phe-OH peptide racemates
  • FIG. 1K represents the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide H-VaI-Tyr-Ile-His- ⁇ 2hPro-Phe-OH
  • FIG. 11 represents the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H-Val-Tyr-Ile-His-Pro- ⁇ 2hPhe-OH peptide racemates.
  • FIG. 1I shows the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide H- ⁇ 2hVal-Tyr-Ile-His-Pro- ⁇ 3hPhe-OH.
  • FIG. 1N represents the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide.
  • FIG. 10 represents the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H- ⁇ 2hNle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH peptide racemates.
  • FIG. 1P represents the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H- ⁇ 2HLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH peptide racemates.
  • FIG. 10 represents the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H- ⁇ 2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro- ⁇ 3hPhe-OH peptide racemates
  • FIGS. 2A-Q show the absorption spectra at 215 nm of elutions on reverse phase HPLC in the presence of water / methanol solvent, the mobile phase containing 0.1% of TFA.
  • the standard gradient corresponds to a 20 min migration from 3% to 97% methanol, at a rate of 1 mL / min.
  • FIG. 2A represents the UV absorption spectrum as a function of time of the H- ⁇ 3hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH peptide.
  • FIG. 2B represents the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide H-VaI- ⁇ 3hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
  • FIG. 2C represents the UV absorption spectrum as a function of time of the H-VaI-peptide.
  • FIG. 2D represents the UV absorption spectrum as a function of time of the H-VaI-peptide.
  • FIG. 2E represents the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide H-VaI-Tyr-Ile-His-Pro- ⁇ 3hPhe-OH.
  • FIG. 2F represents the UV absorption spectrum as a function of time of the first diastereoisomer of the peptide H- ⁇ 2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
  • FIG. 2G represents the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide of the second diastereoisomer of the peptide H- ⁇ 2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
  • FIG. 2H shows the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H-Val- ⁇ 2hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH peptide racemates.
  • FIG. 21 represents the UV absorption spectrum as a function of time of the first diastereoisomer of the H-Val-Tyr- ⁇ 2hLeu-His-Pro-Phe-OH peptide;
  • FIG. 2 J represents the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H-Val-Tyr- ⁇ 2hLeu-His-Pro-Phe-OH peptide racemates.
  • FIG. 2K represents the UV absorption spectrum as a function of time of the H-VaI-peptide.
  • FIG. 2L shows the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H-Val-Tyr-Ile-His-Pro- ⁇ 2hPhe-OH peptide racemates.
  • FIG. 2M represents the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide H- ⁇ 2hVal-Tyr-Ile-His-Pro- ⁇ 3hPhe-OH
  • FIG. 2N represents the UV absorption spectrum as a function of time of the peptide
  • FIG. 20 represents the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H- ⁇ 2hNle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH peptide racemates.
  • FIG. 2P represents the UV absorption spectrum as a function of mixing time of the H- ⁇ 2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH peptide racemates
  • FIG. 20 shows the UV absorption spectrum as a function of time of the mixture of the H- ⁇ 2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro- ⁇ 3hPhe-OH peptide racemates
  • Figures 3A-D show HPLC profiles of iodination of peptides # 6, 11, and 17 and angiotensin IV.
  • the x-axis represents the retention time in minutes, and the y-axis represents the intensity expressed in mV / I *.
  • FIG. 3A represents the profile of the peptide of angiotensin IV
  • FIG. 3B represents the profile of ligand 6
  • FIG. 3C represents the profile of ligand 11
  • Figure 3D shows the profile of ligand 16.
  • Figure 4 depicts HPLC profiles of iodination of peptide No. 17 mono iodine.
  • the x-axis represents the retention time in minutes, and the y-axis represents the intensity expressed in mV / I *.
  • Figure 5 shows the binding of angiotensin IV and peptide derivatives (ligands 6,11 and 17) to the recombinant IRAP-His protein.
  • the abscissa axis represents the amount of recombinant IRAP expressed in ⁇ g / mL, the ordinate axis represents the radioactivity of iodine 125 expressed in B / Bmax.
  • the peptides were synthesized on a Boc-Phe Merrified Resin (0.57 mmol / g), a Wang Fmoc-Phe resin (0.76 mmol / g) or a 2-chlorotrityl chloride resin (1.5 mmol / g). ).
  • the side chain protection groups were Tyr (t-Bu), ⁇ 3-hTyr (t-Bu), and His (Trt) for Fmoc synthesis, and Tyr (2,6-di-Cl-Bzl) and His ( Tos) for Boc synthesis.
  • the Fmoc protection groups were removed with a solution of 20% piperidine in dimethyl formamide (DMF) (2 x 5 min), and the cleavage of the Boc protection groups was carried out in a solution of 50% trifluoroacetic acid ( TFA) in dichloromethane (DCM) (2 x 10 min) and a solution of 10% triethylamine (TEA) in DCM (2 x 5 min) was used for the neutralization.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • DCM dichloromethane
  • TEA triethylamine
  • the amino acid coupling was carried out in DMF / DCM (Iv / Iv) using O- (Benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) (3 equivalents) and diisopropylethylamine (DIPEA) (6 equivalents).
  • TBTU Benzotriazol-1-yl
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • the 3 eq of amino acids (relative to the resin) and 6 eq of DIPEA (relative to the resin) were dissolved in CH 2 Cl 2 (10 ml per 1 g of resin), containing, if necessary a small amount of DMF to facilitate the solubility of the amino acid.
  • the 2-chlorotritilchloride resin was pre-stabilized in CH 2 Cl 2 for 1 h, and after adding the mixture the resin was mixed for 30-120 min. Later, the resin was washed three times with CH 2 Cl 2 / MeOH / DIPEA (17: 2: 1), then twice with DMF and three times with CH 2 Cl 2 .
  • the amino-Boc acid was dissolved in EtOH (2 mL / mmol) and at 0. 5 mL / mmol, the pH was adjusted to 7 with 2M aqueous CS2CO3 solution. The solution was evaporated by drying, the residues were evaporated twice with dioxane.
  • the Merrified resin was pre-stabilized in CH 2 Cl 2 for 1 h and washed with DMF. The cesium salt of amino acid (1.2 eq) in DMF was added to the resin, and the whole heated at 50 0 C overnight. At the end of the reaction, the resin was washed three times in DMF, three times in DMF / water (1: 1), three times in DMF, three times in CH 2 Cl 2 , and three times in MeOH.
  • the colorimetric test corresponds to a Kaiser test. This test consists of 3 solutions: A: 5 g of ninhydrin in 100 ml of n-BuOH; B: 80 g of phenol in 20 ml of n-BuOH; C: 2 mL 0.001 M aqueous KCN in 98 mL of pyridine.
  • Some resin beads are placed in a test tube. 3 drops of each of the solutions are added and the tube is heated at 100 ° C. for 5 minutes. When the resin or solution is colorless or yellowish, the result is negative. A blue color indicates the presence of a primary amine, and a brown / red color indicates the presence of a secondary amine.
  • the peptides were cleaved from the resin by treatment with a TFA / H 2 O / triethylsylan (TES) mixture (95: 2.5: 2.5) for 2 h, either with HF hydrofluoric acid, or a TF A / trifluoromethanesulphonic acid mixture ( TFMSA) / TES (20: 2: 3) in the case of a Merrif ⁇ eld resin.
  • TES triethylsylan
  • TFMSA trifluoromethanesulphonic acid mixture
  • TES triethylsylan
  • the peptides were purified by reverse phase HPLC on a C18 Supelco Disco-BIO Wide Pore column. Each peptide was at least 98% pure after thin layer chromatography (TLC) and reversed phase HPLC analysis in water / acetonitrile solvent (FIGS. IA-IQ), or in a water / methanol solvent (FIGS. 2A-2Q). ). Molecular weights were confirmed by mass spectrometry-electrospay / ionization (ESI-MS).
  • M cal corresponds to the predicted mass
  • ESI MS corresponds to the mass obtained by mass spectrometry
  • R corresponds to the yield in percent relative to the crude peptides
  • Time Retl corresponds to the time at the time of elution water / acetonitrile
  • purity% l 1 corresponds to the purity of the product obtained after elution water / acetonitrile
  • Time Ret2 corresponds to the retention time when eluting water / methanol
  • purity% 2 corresponds to the purity of the product obtained after elution water / methanol.
  • the neosynthesized and unpurified peptides were tritiated by catalytic saturation according to the procedure described in T ⁇ th G et al. (1997 Methods Mol Biol Vol 73, pp: 219-30).
  • the tritiated gaseous dihydrogen gas 3 H 2 used is obtained from Technobexport, ( Russian) and contains a tritium content greater than or equal to 98%.
  • the radioactivity of the crude peptides was measured using a TRI-CARB 2100TR scintillation counter in a scintillant composed of a toluene-Triton X-100 mixture.
  • the measurement of the radioactivity was approximately 10OmCi (3.7 GBq)
  • the tritiated peptides were purified by HPLC using a Grace Vydac 218TP54 C18 column, and detection of the scintillation fluid was performed on a Canberra Packard Radiomatic 505TR Flow Radiochromatography detector using Ultima-Flo M scintillant. Specific activity tritiated purified peptides were measured by HPLC using a standard curve. The specific activity obtained was between about 30.0 Ci mmol- 1 and
  • the iodination of the peptides can be carried out according to several protocols known to those skilled in the art.
  • the principle of protein iodination is based on the conversion of IT (NaI) to I + or I 3 " in the presence of oxidizing agents such as chloramine-T, iodogen (1,3,4,6-tetrachloro) - 3 ⁇ , 6 ⁇ -diphenyl-glycoluril), the JV-chloro-benzenesulfonamide or the lactoperoxidase I + or I 3 " are reactive species that attack the aromatic ring tyrosines meta position as described in" Antibodies: a laboratory manual " E. Harlow and D. Lane, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1988 pp. 324 - 339.
  • radioactive iodine is used as Na 125 I in a basic solution at about 1 mCi (37 MBq) / 10 ⁇ L IODINE-125 (Amersham, IMS30).
  • Stabilization solution (10% sodium thiosulfate + 0.1N NaOH) • IODO-BEAD TM (PIERCE): grafted with an oxidizing agent (N-chlorobenzenesulfonamide)
  • the peptides are added to the solution (between 1 to 100 ⁇ g of peptide)
  • the fractions of the column are collected, and the radioactivity of each of the fractions is measured, using a scintillation counter.
  • Labeling buffer 25mM ammonium acetate buffer pH 5.3
  • 3rd step co-elution of the fraction F1 of the ligand labeled with TI125 and the fraction "monoiodée"
  • Example 4 Specificity of peptides: measurement of labeled peptide binding / extracellular portion of IRAP.
  • the incubations were performed in 24-well plates in a final volume of 300 ⁇ L comprising 100 ⁇ l of the extracellular portion of IRAP, 50 ⁇ l of an EDTA / 1,10-phenanthroline mixture with a final concentration of 500 ⁇ M of EDTA and 100 ⁇ M of 1,10-phenanthroline, and either 50 ⁇ l of binding buffer, or 50 ⁇ l of binding buffer containing the unlabeled peptides for the competition tests.
  • 50 ⁇ l of labeled peptides were added at a final concentration of 0.5 to 0.8 nM for the saturation tests, ie at a concentration of 3nM for the other tests.
  • Incubation was performed at 37 ° C, at varying times (kinetics) up to 60 min.
  • the radioactivity was then measured using a scintillation counter in the presence of ad hoc scintillation.
  • the peptides were then separated from the serum by filtration gel and incubated at concentrations ranging from 0.1 nM to 1 .mu.M with the extracellular domain of IRAP purified in the presence of [125 I] - AnglV (0.1 - 1 nM) or [ 125 I] -NiE-AnglV (0.1 - 1 nM) and peptidase inhibitors and proteases.
  • the stability of the peptides in the serum sample is then measured indirectly by measuring the competition of the I-labeled peptides with the binding of [I] -AngIV or [I] -Nle-AnglV to the extracellular domain of IRAP (see A. Lukaszuk et al., Chem Chem 51, 2291-2226, 2008).
  • Example 6 IRAP RIA
  • the assay of the circulating extracellular portion of IRAP (extIRAPc) uses an immunoradiometric method.
  • the circulating extracellular portion of IRAP present in samples from patients where the standards is recognized by a monoclonal antibody (Mab) specific for the extracellular portion of IRAP, said monoclonal antibody being bound to the inner surface of the polystyrene tubes.
  • Mob monoclonal antibody
  • peptide * having a high affinity for extIRAPc induces the formation of a solid phase-bound sandwich complex (tube): Mab-extIRAPc - peptide * .
  • the peptide fraction * not bound to the solid phase is removed by suction and washing.
  • the formation of the complex is only realized in the presence of extIRAPc, the radioactivity related to the solid phase (tube) is directly proportional to the concentration of extIRAPc in the sample.
  • a calibration curve makes it possible to determine, by interpolation, the concentration of extIRAPc of the samples to be assayed.
  • the assay can be performed on human serum. If the assay is performed within 24 hours of collection, samples may be stored at 2-8 ° C. Otherwise, they must be aliquoted and frozen at -20 ° C. or at lower temperatures for a maximum of five months. If the samples have been frozen, wait until they are completely thawed and homogenize them before the assay. Avoid repeated freeze / thaw cycles.
  • DILUTION OF THE WASH PAD Add 900 mL of distilled water to 100 mL of concentrated wash buffer. Avoid foaming, (wash buffer: PBS, 0.1% albumin, pH 7.4).
  • ASSAY PROTOCOL Prior to use, coated tubes, standards, control sera and test sera are placed at room temperature (18-25 ° C) for at least 30 minutes; then their contents are mixed with the Vortex. It is recommended to run the assay in duplicate for both standards, control sera and samples. Carefully observe the order of use of the reagents: 1. Pipette 50 ⁇ L of each sample (standard, control serum and sample) and deposit as many tubes coated with the Mabs as samples taken, and in as many samples. uncoated tubes as samples taken.

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Abstract

L'invention a pour objet une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP (« insulin responsive aminopeptidase ») comprenant au moins une étape de dosage quantitatif de ladite partie extracellulaire, sécrétée, purifiée, d'IRAP, au moyen d'au moins un peptide marqué, ledit peptide marqué interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP.

Description

PEPTIDES MARQUES ET LEUR UTILISATION POUR LE DOSAGE
D'IRAP CIRCULANT
La présente invention concerne des peptides marqués et leur utilisation pour le dosage de la protéine IRAP circulante
La protéine IRAP (Insulin-Regulated AminoPeptidase ; EC 3.4.11.3) également connue sous le nom de Placental Leucine AminoPeptidase (P-LAP) et de Leucine-cystinyl aminopeptidase (L-CAP) est une protéine métalloprotéinase à zinc transmembranaire qui existe sous trois iso- formes (Swiss-Prot: Q9UIQ6 :1, 2 et 3; représentées respectivement par les SEQ ID NO: 1 à 3).
Lorsqu'elle est insérée au niveau de la membrane plasmique, sous sa forme native, son domaine extracellulaire peut être clivé et sécrété. La partie sécrétée d'une isoforme non-spécifïée de la protéine IRAP a été dosée dans le sang par une méthode enzymatique en utilisant un substrat synthétique non spécifique, la L- leucine-nitroanilide en présence de méthionine (Mizutani, S., Yoshino, M., and Oya, M. (1976) Clin Biochem 9(1), 16-18).
Utilisant cette méthode Mizutani, Oya et Tomoda ont mis en évidence une cystinyl- leucine aminopeptidase. Cette aminopeptidase est essentiellement d'origine placentaire, raison pour laquelle elle a été appelée P-LAP (Tsujimoto, M., Mizutani, S., Adachi, H., Kimura, M., Na- kazato, H., and Tomoda, Y. (1992) Arch Biochem Biophys 292(2), 388-392) et correspond au domaine sécrété de la protéine.
Cette enzyme dégrade l'oxytocine (Naruki, M., et al. (1996) Peptides 17(2), 257-261), la va- sopressine (Wallis, M. Cet al. (2007) Am J Physiol Endocrinol Metab 293(4), E1092-1102), l'angiotensine II et III (Matsumoto, H., et al. (2000) Eur J Biochem 267(1), 46-52) ainsi qu'une série d'autres peptides (Albiston, A. L., et al. (2007) Pharmacol Ther 116(3), 417- 427). Les concentrations sériques de cette aminopeptidase n'ont jamais été rapportées chez l'homme. A l'occasion de son clonage, il est apparu que P-LAP correspond à la protéine IRAP ainsi qu'au récepteur de l'angiotensine IV (Keller, S. R., et al. (1995) J Biol Chem 270(40), 23612- 23618; Rogi, T., et al. (1996) J Biol Chem 271(1), 56-61; Albiston, A. L., et al (2001) J Biol Chem 276(52), 48623-48626). La demande internationale WO 2005/038462 décrit un réactif pour le diagnostic et/ou une évaluation pronostique de carcinomes qui comprend un anticorps polyclonal anti-P-LAP, obtenu par immunisation avec la protéine P-LAP entière. Compte tenu de l'homologie entre les différentes aminopeptidases, l'anticorps n'est vraisemblablement pas spécifique pour IRAP et va aussi reconnaître d'autres aminopeptidases. Il ne devrait donc pas permettre de diagnostiquer une pathologie liée de façon précise à une modification de l'expression ou de la concentration plasmatique d'IRAP.
Il a été montré une relation entre la protéine IRAP et le développement de la chimiorésistance aux médicaments anticancéreux (Kondo C. et al., Int J. Cancer, 118, 1390-1394, 2006). Selon cet article, IRAP réduit en effet la sensibilité aux médicaments anticancéreux en inhibant l'expression du facteur de déclenchement de l'apoptose et augmente l'expression du facteur d'inhibition de l'apoptose.
Les travaux de Lukaszuk et al. (J. Med. Chem. 2008, 51, pp : 2291-2296) ont montré que des peptides dérivés de l'angiotensine IV étaient capable de se lier spécifiquement à la protéine IRAP localisée à la surface des cellules.
A ce jour, il n'existe pas de méthode permettant de mesurer et de quantifier la protéine IRAP sous sa forme native, c'est-à-dire non clivée et ancrée dans la membrane plasmique.
Le domaine extracellulaire d'IRAP est clivé par des métalloprotéases appartenant vraisembla- blement à la famille des ADAM dont ADAM9 et ADAM 12 (Ito, N., et al. (2004) Biochem Biophys Res Commun 314(4), 1008-1013) et relargué dans la circulation sanguine. ADAM9 (MDC9) est exprimée notamment dans le cerveau, le foie, le cœur, les reins et les poumons (Hotoda, N., et al. (2002) Biochem Biophys Res Commun 293(2), 800-805) et plusieurs autres membres de cette famille sont exprimés dans le muscle et le tissu adipeux. A ce jour, les seules relations établies entre la concentration du domaine extracellulaire d'IRAP dans un milieu biologique et une pathologie concernent la prééclampsie sévère ainsi que la menace d'accouchement prématuré.
Ainsi, il apparait nécessaire de doser de manière précise et quantitative le domaine extracellulaire circulant de la protéine IRAP. A ce jour, la protéine IRAP circulante n'a jamais été dosée quantitativement dans le sérum.
Le problème à résoudre est encore plus compliqué que celui du dosage d'IRAP sous sa forme native, compte tenu d'une part de la présence, dans le sérum ou le plasma, de nombreux élé- ments notamment des protéases susceptibles de dégrader les ligand potentiels d'IRAP, et d'autre part de la nécessité de mise en œuvre de moyens relativement lourds.
Ainsi, il est nécessaire de disposer d'un moyen de doser la protéine IRAP circulante dans le sérum ou le plasma au moyen de composés capables de résister aux dégradations engendrées par les protéases contenues dans le sérum ou le plasma.
Il est également nécessaire de disposer de composés spécifiques, stables, pouvant être utilisés pour la mise en œuvre d'un dosage quantitatif et fiable de la protéine IRAP, dans un échantillon biologique ne contenant pas de cellules.
Ainsi, l'invention a pour but de fournir une méthode fiable, spécifique et quantitative permettant de mesurer la quantité de protéine IRAP circulante.
Un autre objet de l'invention est de fournir des ligands d'IRAP circulante permettant sa détection.
Ainsi, l'invention concerne une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP (« insulin responsive aminopeptidase ») comprenant au moins une étape de dosage quantitatif de ladite partie extracellulaire, sécrétée, purifiée, d'IRAP, au moyen d'au moins un peptide marqué, ledit peptide marqué interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP, ledit peptide marqué étant marqué préférentiellement par au moins un isotope radioactif, ledit peptide marqué étant un ligand d'IRAP, et notamment soit un substrat marqué de la protéine IRAP, soit un peptide inhibiteur marqué de la protéine IRAP, ledit peptide étant éventuellement modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un β-homo acide aminé, naturel ou non, sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), et sous réserve que ledit peptide modifié, marqué par un atome d'iode 125I, soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23). L'invention concerne une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP (« insulin responsive aminopeptidase ») comprenant au moins une étape de dosage quantitatif de ladite partie extracellulaire, sécrétée, purifiée, d'IRAP, au moyen d'au moins un peptide modifié et marqué, ledit peptide marqué interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP, ledit peptide étant modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un β-homo acide aminé, naturel ou non, ledit peptide marqué étant marqué préférentiellement par au moins un isotope radioactif, sous réserve que - ledit peptide ne soit pas un anticorps et
- ledit peptide modifié, marqué par un atome d'iode 125I, soit différent de la séquence Nle-Tyr- Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
La présente invention repose sur la constatation inattendue faite par les inventeurs que des peptides marqués permettent une détection quantitative efficace de la partie extracellulaire d'IRAP circulante.
La « partie extracellulaire » de la protéine IRAP est définie dans l'invention comme le domaine, ou l'enchainement d'acides aminés, de la protéine IRAP qui se trouve exposé à l'extérieur de la cellule lors que la protéine IRAP est ancrée dans la membrane plasmique des cellules.
La « partie extracellulaire circulante » de la protéine IRAP est définie dans l'invention comme la partie extracellulaire de la protéine IRAP telle que définie ci-dessus qui n'est plus liée de façon covalente à la partie transmembranaire de la protéine IRAP. Cette partie extracellulaire est dite circulante car, après son clivage, elle se retrouve dans le milieu extracellulaire, et peut notamment se retrouver dans le plasma, le sérum, la lymphe, le liquide céphalorachidien ou encore l'urine.
Egalement, la partie extracellulaire d'IRAP circulante est appelée partie extracellulaire d'IRAP sécrétée lorsqu'elle est retrouvée dans la circulation générale de l'organisme, c'est-à- dire le plasma, le sérum, la lymphe, le liquide céphalorachidien ou l'urine. Dans ce qui suit et ce qui précède, les termes « partie extracellulaire circulante d'IRAP » et « partie extracellulaire d'IRAP circulante » réfèrent tous deux au domaine extracellulaire de la protéine IRAP qui n'est plus associé à la partie membranaire d'IRAP, et donc n'est plus associé à la membrane cellulaire. La protéine IRAP dont il est question dans l'invention est représentée par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO 1.
Par « peptide » on entend toute chaîne peptidique correspondant à une succession covalente d'au moins deux acides aminés, ou de dérivés d'acides aminés, reliés par une fonction amide (-CO-NH-), lesdits acides aminés étant naturels ou non et lesdits dérivés d'acides aminés étant des dérivés d'acides aminés naturels ou non.
Par « peptide marqué », on entend dans l'invention un peptide tel que défini ci-dessus possédant une molécule ou un atome permettant sa détection autre que par des méthodes de détec- tion classique des protéines ou des peptides, c'est-à-dire des méthodes autres que les méthodes immuno logiques.
Ainsi, les peptides marqués selon l'invention peuvent être couplés soit à des molécules fluorescentes (cyanines, coumarines, rhodamines, xanthènes, quantum dots (nanocristaux de matériaux semi-conducteurs), ...), soit peuvent contenir au moins un, c'est-à-dire un ou plusieurs, atome(s) radioactif(s), ledit atome radioactif étant également appelé isotope radioactif. Parmi les isotopes radioactifs susceptibles d'être utilisés dans l'invention, on peut citer, le tritium (3H), le carbone 14 (14C), l'iode 131 (131I), l'iode 125 (125I) ou encore le phosphate 32 ou 33 (32P OU 33P). Ci-après les peptides selon l'invention sont marqués à l'aide d'un ou plusieurs atomes d'iode 125 (125I), préférentiellement par un seul atome d'iode 125 (125I).
Les isotopes radioactifs sont capables de se désintégrer et d'émettre des particules sous forme de rayonnement, ledit rayonnement étant mesurable au moyen par exemple de compteurs à scintillation ou non, et ledit rayonnement proportionnel étant à la quantité d'isotope. Dans le dosage décrit dans l'invention, la quantification de la partie extracellulaire d'IRAP est réalisée à partir de la partie extracellulaire d'IRAP qui a été purifiée.
Les méthodes de purification de la protéine IRAP circulante peuvent être n'importe quelle méthode de purification de protéines connues de l'homme de métier. Une méthode préférée, mais non limitative, est une méthode immunologique et notamment l'immunoprécipitation ou l'immunocapture de la protéine IRAP circulante, au moyen d'un anticorps spécifique dirigé contre la partie extracellulaire de la protéine IRAP. La méthode immunologique d'immunocapture de la partie extracellulaire d'IRAP circulante est décrite dans les exemples. Dans l'invention, on entend par « dosage quantitatif » l'action qui consiste à déterminer, de manière précise, la quantité de protéine IRAP circulante contenu dans un échantillon biologique d'un individu ou d'un animal.
Les termes « ledit peptide marqué interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellu- laire d'IRAP », utilisés dans l'invention, signifient qu'au moins un peptide marqué selon l'invention et la partie extracellulaire purifié d'IRAP circulant forment un complexe de haute affinité. L'ordre de grandeur de l'affinité entre lesdits peptides et ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP est compris entre environ 10~10 M a 10~5 M, préférentiellement entre environ 0,1 nM et environ 100 nM. Les termes environ sont utilisés pour inclure la variabilité de mesure de ladite affinité, ladite variation étant généralement de 5 à 10% d'erreur sur la mesure.
L'intensité de l'interaction est mesurée par exemple comme cela est décrit dans Lukaszuk et al. (J. Med. Chem. 2008, 51, pp : 2291-2296). L'interaction est dite spécifique, ce qui signifie que le peptide marqué selon l'invention est capable de former un complexe avec la partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP, mais ledit peptide marqué n'est pas capable de former un complexe de même affinité, aux mêmes concentrations, avec une autre protéine possédant une séquence en acides aminés différente de la séquence en acides aminés de ladite partie extracellulaire d'IRAP. Le peptide marqué de l'invention est un ligand d'IRAP, et notamment soit un substrat marqué de la protéine IRAP, soit un peptide inhibiteur marqué de la protéine IRAP, soit tout peptide dont l'affinité pour la partie extracellulaire d'IRAP circulant est environ inférieur ou égale à 10 μM (≤ 10 nM) .
Selon l'invention, le peptide défini ci-dessus peut être modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un β-homo acide aminé, naturel ou non. Par « acide aminé non naturel », on entend dans l'invention des acides aminés qui ne sont pas retrouvés naturellement dans les protéines lorsqu'elles sont synthétisées dans un organisme vivant, ou un système acellulaire utilisant la machinerie naturelle de synthèse des protéines (ARNm, ARNt, ribosomes...). Les acides aminés naturels sont les 20 acides aminés connus de l'homme de métier et dont la correspondance avec les triplets de nucléotides est donnée par le code génétique.
Les acides aminés non naturels utilisés dans l'invention sont notamment, sans pour autant être limitatifs, les acides aminés dérivés de la leucine tels que la cycloleucine (CIe), la norleucine (Nie) ou la tert-leucine (TIe). Par « β-homo acide aminé », il est défini dans l'invention un acide aminé possédant un carbone supplémentaire. En d'autres termes, les acides aminés correspondent à des 2-(ou α) ami- no 2-[Chaine latérale (R)] acides acétiques, et les β homo acides aminés correspondent à des 3 -(ou β homo) 2-[Chaine latérale (R)] amino acides propanoïques (β2homo acide aminé), ou des 3 -(ou β homo) 3-[Chaine latérale (R)] amino acides propanoïques (β3homo acide aminé). Les formules des β2homo acide aminés et des β3homo acide aminés sont les suivantes :
Figure imgf000008_0001
β2homo acide aminé β3homo acide aminé où R représente l'un quelconque des résidus déterminants les acides aminés.
L'invention ne concerne pas l'utilisation d'un peptide marqué non modifié qui serait l'angiotensine IV, et notamment l'Angiotensine IV humaine de séquence SEQ ID NO : 21
(Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe).
L'invention ne concerne pas l'utilisation d'un peptide modifié, marqué par un atome d'iode 125I, correspondant à l'Angiotensine IV ou la valine en position 1 est remplacée par une Nie et représenté par la séquence SEQ ID NO : 23 (Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe).
Dans ce qui précède et ce qui suit, par convention, les séquences spécifiques feront apparaitre les acides aminés naturels, les acides aminés non naturels, et les dérivés β2 ou β3 desdits aci- des aminés naturels ou non. Par contre, le marquage ne figure pas dans la séquence, raison pour laquelle le peptide marqué de séquence X sera représenté par la séquence SEQ ID NO X non marquée, et le type de marquage est précisé. Par exemple le peptide X marqué par de l'iode radioactif sera indiqué de la manière suivante : peptide de séquence SEQ ID NO X marqué à l'iode 125I.
Avantageusement, l'invention a pour objet une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP telle que défini ci-dessus, où ledit peptide marqué n'est pas modifié, sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (VaI- Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Ces peptides marqués non modifiés ont pour avantage d'être similaires ou équivalents aux peptides non marqués, et donc d'avoir une forte affinité pour la partie extracellulaire de la protéine IRAP circulante.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP tel que défini ci-dessus, où ledit peptide marqué est modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un β-homo acide aminé, naturel ou non, ledit peptide marqué modifié interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP, sous réserve que ledit peptide modifié, marquée par un atome d'iode 125I, soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
Ces peptides marqués modifiés ont pour avantage d'avoir une forte affinité pour la partie extracellulaire de la protéine IRAP circulante, et d'avoir une grande stabilité, notamment dans un échantillon contenant de nombreuses protéases ou peptidases. La stabilité des peptides selon l'invention peut être notamment mesurée en évaluant les propriétés inhibitrices qu'exercent lesdits peptides sur l'activité aminopeptidase d'IRAP. Cette mesure de la stabilité est illustrée dans les exemples.
L'invention concerne également, dans un mode de réalisation avantageux, une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP telle que définie précédemment, comprenant au moins :
• une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et
• une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié marqué. Ainsi, la méthode selon l'invention comprend au moins une étape de purification de la partie extracellulaire d'IRAP dans un échantillon biologique. Cette étape de purification est suivie par une étape de quantification de ladite partie extracellulaire d'IRAP purifiée à l'étape précédente. Cette seconde étape est mise en œuvre au moyen d'au moins un peptide modifié tel que défini précédemment.
Comme indiquée précédemment, la purification de la partie extracellulaire circulante d'IRAP peut être mise en ouvre par une méthode d'immunologique, c'est-à-dire une méthode utilisant un anticorps dirigé contre la protéine IRAP, notamment l'immunoprécipitation ou l'immunocapture. Cette méthode est spécifique lorsqu'elle utilise un anticorps spécifique qui ne reconnait que la partie extracellulaire de la protéine IRAP, et permet d'obtenir une partie extracellulaire de la protéine IRAP pure. Le degré de contamination par d'autres protéines peut être évalué par une méthode classique de séparation des protéines (SDS-PAGE) couplé à une méthode de détection des protéines (coloration argentique, coloration au bleu de Coomas- sie colloïdal...), méthodes connues de l'homme de métier. L'immunoprécipitation ou l'immunocapture permet une purification a un degré très largement acceptable (> 90%), et notamment permet d'isoler une protéine de son environnement, par exemple des protéases contaminantes.
L'invention concerne, dans un autre mode de réalisation avantageux, une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP telle que définie précédemment, où ledit peptide inhibiteur marqué de la protéine IRAP est modifié et est choisi parmi : l'Angiotensine IV marquée et modifiée et la LVV-hemorphin-7 marquée et modifiée, ou ledit substrat marqué de la protéine IRAP est modifié et est choisi parmi : la [Arg]- vasopressine marquée et modifiée, l'Oxytocine marquée et modifiée, la MeWLeu- enkephaline marquée et modifiée, la Somatostatine marquée et modifiée, la CCK-8 marquée et modifiée, la Neurokinine A marquée et modifiée, la Neuromedine B mar- quée et modifiée, la Lys-bradykinine marquée et modifiée et la Dynorphine A modifiée marquée et modifiée.
Les peptides modifiés marqués susceptibles d'être utilisés dans l'invention correspondent soit à des substrats de la protéine IRAP, soit à des peptides inhibiteurs de la protéine IRAP. Les peptides inhibiteurs sont choisis parmi la LVV-hemorphine-7 ou l'angiotensine IV. Ces peptides inhibiteurs sont modifiés et marqués.
La protéine IRAP est une protéase, elle est donc capable de cliver des protéines, lesdites protéines étant des substrats d'IRAP. Les protéines susmentionnées comme substrat d'IRAP sont donc des protéines susceptibles d'être clivées par IRAP.
Comme toute enzyme, l'activité catalytique d'IRAP peut être bloquée par des composés appe- lés inhibiteurs. Généralement les inhibiteurs se fixent dans le site actif d'une enzyme, ne sont pas métabolisés par ladite enzyme, et l'empêche d'accéder à ses substrats. Ce genre d'inhibition est une inhibition compétitive. LVV-hemorphine-7 ou l'angiotensine IV sont des peptides inhibant l'activité d'IRAP. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP telle que définie ci-dessus, où ladite purification de la partie circulante de la protéine IRAP est effectuée au moyen d'au moins un anticorps spécifique de ladite partie extracellulaire d'IRAP, notamment par immunoprécipitation ou immunocapture.
Ainsi, afin de purifier la partie extracellulaire d'IRAP circulante dans un échantillon biologique, l'invention propose d'utiliser un anticorps reconnaissant spécifiquement la partie extracellulaire d'IRAP, et ne reconnaissant pas la partie transmembranaire ou intracellulaire de ladite protéine IRAP .
Cette méthode de purification peut être une immunoprécipitation où un anticorps spécifique de la partie extracellulaire d'IRAP est accroché à des billes de polymères de sucre (agarose, sépharose). La méthode de purification peut également être une immunocapture dans le cadre d'un ELISA ou d'un test Radio immunmétrique (IRMA) où lesdits anticorps spécifiques sont fixés sur un support, notamment la paroi d'un tube, et immobilisent IRAP sur celui-ci.
Avantageusement, il peut être ajouté dans l'échantillon de sérum, de plasma, de lymphe, de liquide céphalorachidien ou d'urine dans lequel la concentration en partie extracellulaire d'IRAP doit être mesurée au moins un des produits suivants : - des chélateurs de cations tels: EDTA, EGTA, 1,10-orthophenantroline, dimercaprol, acide lipoïque, BAPTA (acide l,2-bis(o-aminophenoxy)éthane-N,N,N',N'-tétraacétique) , DTPA (acide diéthylène triamine pentaacétique) , DMPS (acide 2,3-dimercapto-l- propanesulfonique), DMSA (acide dimercaptosuccinique), penicillamine, deferroxamine, acide sulfosalicylique, acide citrique, acide oxalique, acide tartrique, N5N- Dimethyldecylamine N-oxide, acide nitrilotriacetique, acide pyromellitique, EDTMP (ethyle- nediamine tetra(methylene phosphonic acid)), ferrocyanure ferrique, 2,2'-bipyridine, N,IΨ,N'- tris(2-pyridylmethyl)-cώ,cώ-l,3,5,-triaminocyclohexane (tachpyr) et ses analogues, l'azoben- zène et ses analogues, diethyldithiocarbamate, TPEN (N,N,N',N'-tetrakis(2- pyridylmethyl)ethylenediamine),acide 1,2-cyclohexylenedinitrilotetraacetique, maltol, thio- maltol, éthylmaltol, ethylthio maltol, oxide de 2-mercaptopyridine et autres chélateurs biden- tés,
- des inhibiteurs de protéases et de peptidases tels que: AEBSF (4-(2-Aminoethyl) benzene- sulfonyl fluoride hydrochloride), acide 6-aminohexanoïque, antipaïne, aprotinine,_benzami- dine, bestatine, chymostatine, E-64, leupeptine, pepstatine, phosphoramidon, inhibiteur de trypsine, Diisopropyl fluorophosphate, PMSF, acide p-chloromercuribenzoic, diethyl pyrocarbonate, 2-Mercaptoethylamine, Apstatin, Phebestin, Bromoenol lactone, Ecotine (acide 1, 4,5, 6-tetrahydro-2- methyl-4-pirymidine carboxilique), N-Acetyl-eglin C, Gabexate mesy- late, N-Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone, Na-T-Boc-Deacetylleupeptin, 3,4- Dichloroisocoumarin, Amastatin, (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-(4-nitro-phenyl)butanoyl-L- leucine, Actinonin, Epiamastatin, N-[(2S)-(Methoxycarbonylmethyl)-4-methylpentanoyl]-L- tryptophan-methylamide, 2,2'-Dipyridyl, L-Leucinethil oxydé, Epibestatin - d'autres composés : methionine, dithiotreitol, dithioerythritol, β-mercaptoethanol, TCEP(tm(2-carboxyethyl)phosphine), cysteine, N-ethylmaleimide, mercaptoethylamine, détergents non ioniques (Triton X-IOO, Tween20, ...)
Tous ces produits sont connus de l'homme de métier et peuvent être utilisés à des concentrations standards.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP définie précédemment, où ladite protéine IRAP est représentée par
- la protéine IRAP de séquence SEQ ID NO 1, ou une protéine homologue à la protéine IRAP présentant une identité de séquence d'au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO 1, sous réserve que ladite protéine homologue soit capable d'interagir spécifiquement avec les ligands d'IRAP ou les peptides inhibiteurs d'IRAP tels que définis précédemment, ou une iso forme de la protéine IRAP, ladite iso forme étant le produit de l'épissage alternatif de l'ARN codant la protéine IRAP SEQ ID NO 1, sous réserve que ladite iso- forme soit capable d'interagir spécifiquement avec les ligands d'IRAP ou les peptides inhibiteurs d'IRAP tels que définis précédemment, lesdites iso forme de la protéine IRAP SEQ ID NO 1 étant notamment représentées par les protéines SEQ ID NO 2 ou 3.
Dans l'invention, les homologues de la protéine IRAP correspondent à des protéines possé- dant une séquence homologue à la séquence SEQ ID NO 1 mais possédant des substitutions d'acides aminés.
Les isoformes de la protéine IRAP définis dans l'invention correspondent à des produits de l'épissage alternatif du produit du gène codant la protéine IRAP, de telle sorte que la protéine qui en découle possède une séquence plus courte que la protéine IRAP SEQ ID NO 1. Les isoformes préférés de l'invention correspondent à des protéines tronquées dans la partie ami- no-terminale de plusieurs acides aminés.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où
• lesdits variants de la protéine IRAP possèdent une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 4 à SEQ ID NO 7, et
• lesdites isoformes de la protéine IRAP possèdent une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 8 à SEQ ID NO 15.
Egalement, selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage tel que défini précédemment, dans laquelle ladite partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP possède une séquence d'acides aminée représentée par les séquences choisies parmi les séquences suivantes : SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO 20.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est marqué par au moins un atome de tritium ou au moins un atome d'iode 125I, c'est-à-dire un atome d'iode ou plus, préférentielle- ment un seul atome d'iode 125I.
L'invention concerne également dans un mode de réalisation avantageux une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est représenté par la formule générale (III) suivante :
Figure imgf000013_0001
(III) où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à 0 ou 1, de telle sorte que (a+b)≤l, (c+d)≤l, (e+f)≤l, (g+h)≤l et (i,j)≤l, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendants les uns des autres, où (R1, R1') sont tels que :
- Rl est choisi parmi : un groupement -CH(CH3)2, un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et Rl ' est un atome d'hydrogène, ou Rl et Rl ' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, où (R2, R2') sont tels que : si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)- CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou
R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, les couples (R1, R1') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, où A est choisi parmi les groupes suivants
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000014_0003
ledit peptide modifié marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énantio mères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères,
sous réserve que si A est représenté par la formule IHa et si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0,
* si (RhRi')=( -CH(CH3)2;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H), et
* si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3;H) alors (Ri5Ri') est différent de (-CH(CH3)2 ;H) et sous réserve que si ledit peptide modifié est marqué par un atome d'iode 125I, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (Ri5Ri') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).
En d'autres termes, le peptide modifié marqué répond à l'une des trois formules générales suivantes :
Figure imgf000015_0001
formule I ou IHaI
Figure imgf000015_0002
formule HIb 1, ou
Figure imgf000015_0003
L'invention concerne également dans un mode de réalisation avantageux une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est représenté par la formule générale (I) suivante :
Figure imgf000016_0001
où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à 0 ou 1, de telle sorte que (a+b)≤l, (c+d)≤l, (e+f)≤l, (g+h)≤l et (i,j)≤l, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendants les uns des autres, où (Ri , Ri ') sont tels que :
- Rl est choisi parmi : un groupement -CH(CH3)2, un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et Rl ' est un atome d'hydrogène, ou Rl et Rl ' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, où (R2, R2') sont tels que : si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)- CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou
R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, les couples (R1, R1') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, ledit peptide modifié marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énantiomères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères, sous réserve que si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0, * si (RhRi')=( -CH(CH3)2;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H), et * si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3;H) alors (Ri5Ri') est différent de (-CH(CH3)2 ;H) et sous réserve que si ledit peptide modifié est marquée par un atome d'iode 125I, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (Ri5Ri') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).
En d'autres termes, le peptide de formule (Ia) suivante
Figure imgf000017_0001
est exclu de l'utilisation selon l'invention, quel que soit son marquage. Est également exclu de l'utilisation selon l'invention, le peptide de formule (Ib) suivante
Figure imgf000017_0002
marqué par un atome au moins un atome d'iode 125 ( cl25τ I), notamment marqué par un atome d'iode 125 sur le cycle aromatique du résidu 4-hydroxy benzyle. Ainsi, les deux peptides suivants de formule IbI et Ib2 sont exclus :
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0002
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, dans laquelle le peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides de formules suivantes :
Figure imgf000018_0003
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
L'invention concerne également une méthode de dosage telle que définie ci-dessus, où ledit peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante :
Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) où
Xl peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nie), une Cycloleucine (CIe) ou une tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés,
X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé β2 ou β3 de la tyrosine,
X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nie), une Cycloleucine (CIe) ou une tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés,
X4 peut être une proline ou un dérivé β2 ou β3 de la proline,
X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé β2 ou β3 de la phénylalanine, et (His-X4) pouvant être
un aba-gly de formule lia
Figure imgf000022_0002
ou un aia-gly de formule Hb
Figure imgf000023_0001
(Hb),
l'un au moins des acides aminés Xl à X5 est un acide aminé non naturel, et/ou un β-homo acide aminé, naturel ou non sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 125I soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage susmentionnée, où ledit peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante : Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) où
Xl peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nie), une Cycloleucine (CIe) ou une tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés, X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé β2 ou β3 de la tyrosine,
X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nie), une Cycloleucine (CIe) ou une tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés,
X4 peut être proline ou un dérivé β2 ou β3 de la proline,
X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé β2 ou β3 de la phénylalanine, l'un au moins des acides aminés Xl à X5 étant un acide aminé non naturel, et/ou un β-homo acide aminé, naturel ou non. sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 125I soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
Selon l'invention, le peptide marqué modifié constitué par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO 22 correspond au peptide de formule générale (I) défini ci-dessus, dans lequel tous les acides aminés sont dans une configuration L selon la nomenclature L/D connue de l'homme de métier.
Le nom ainsi que la formule développée des différents acides aminés naturels ou non, et les dérivés β2 ou β3 desdits acides aminés naturels ou non sont représentés dans le tableau 1 sui- vant. La colonne N indique la nature de l'acide aminé correspondant : naturel (O) ou non naturel (N). propioni
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante :
Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) et où l'un au moins un des acides aminés Xl à X5 est un β-homo acide aminé, naturel ou non. En d'autres termes, l'un au moins des acides aminés Xl, ou X2, ou X3, ou X4 ou X4 ou X5 correspond à un acide aminé choisi parmi : la β2homo valine, la β3homo valine, la β2homo leucine, la β3homo leucine, la β2homo isoleucine, la β3homo isoleucine, la β2homo tyrosine, la β3homo tyrosine, la β2homo proline, la β3homo proline, la β2homo phénylalanine, la β3homo phénylalanine, la β2homo norleucine, la β3homo norleucine, la β2homo tertleucine, la β3homo tertleucine, la β2homo cycloleucine et la β3homo cycloleucine.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est marqué
• par au moins un atome d'iode 125I sur la tyrosine X2, préférentiellement un seul atome d'iode 125I, notamment sur le groupement phényle, ou
• par le remplacement de l'un au moins des atomes d'hydrogène par un atome de tritium 3H.
Dans cas ou le peptide marqué modifié de l'invention est marqué par un atome d'iode 125, ledit peptide possède au moins un atome de 125I, ou deux atomes de 125I, en position meta sur le cycle benzyle de la tyrosine, ou en position meta sur le cycle benzyle des dérivés β2homo tyrosine ou β3homo tyrosine.
Préférentiellement, le peptide est marqué par un seul atome d'iode 125I.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides suivants : - β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), de formule :
Figure imgf000026_0001
β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 25), de formule
Figure imgf000026_0002
β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 26), de formule
Figure imgf000027_0001
Val-Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe- (SEQ ID NO 27), de formule
Figure imgf000027_0002
β2hVal-Tyr-Ile-Aba-Gly-Phe-(SEQ ID NO 28), de formule
Figure imgf000027_0003
β2hVal-Tyr-Ile-Aia-Gly-Phe-(SEQ ID NO 29), de formule
Figure imgf000027_0004
préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant iodé.
Les peptides ci-dessus ont une haute affinité pour la partie extracellulaire circulante d'IRAP, sont stables, et facilement détectables par comptage de la radioactivité émise par l'iode 125I.
Avantageusement, l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, où ledit peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides suivants : - β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24),
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 25), - β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 26),
- Val-Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe- (SEQ ID NO 27),
- β2hVal-Tyr-Ile-Aba-Gly-Phe-(SEQ ID NO 28), et
- β2hVal-Tyr-Ile-Aia-Gly-Phe-(SEQ ID NO 29), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant tritié.
Les peptides ci-dessus ont une haute affinité pour la partie extracellulaire circulante d'IRAP, sont stables, et facilement détectables par comptage de la radioactivité émise par le tritium H.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie ci-dessus, comprenant
• une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et
• une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 25 marqué par l'iode radioactif 125I, préférentiel- lement un seul atome d'iode radioactif 125T I.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de dosage définie précédemment, comprenant • une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et
• une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 25, tritié.
L'invention concerne également un peptide modifié marqué est représenté par la formule générale (III) suivante :
Figure imgf000028_0001
(III) où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à 0 ou 1, de telle sorte que (a+b)≤l, (c+d)≤l, (e+f)≤l, (g+h)≤l et (i,j)≤l, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendants les uns des autres, où (R1, R1') sont tels que :
- Rl est choisi parmi : un groupement -CH(CH3)2, un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et Rl ' est un atome d'hydrogène, ou Rl et Rl ' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, où (R2, R2') sont tels que : si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)- CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou
R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, les couples (R1, R1') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, où A est choisi parmi les groupes suivants
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000029_0003
ledit peptide modifié marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énantio mères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères,
sous réserve que si A est représenté par la formule IHa et si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0,
* si (RhRi')=( -CH(CH3)2;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H), et
* si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3;H) alors (Ri5Ri') est différent de (-CH(CH3)2 ;H) et sous réserve que si ledit peptide modifié est marquée par un atome d'iode 125I, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (Ri5Ri') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).
L'invention concerne également un peptide modifié marqué représenté par la formule générale (I) suivante :
Figure imgf000030_0001
ledit peptide éventuellement modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un β-homo acide aminé, naturel ou non, où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à O ou 1, de telle sorte que (a+b)≤l, (c+d)≤l, (e+f)≤l, (g+h)≤l et (i,j)≤l, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendant les uns des autres, où (Ri, Ri') sont tels que :
Rl est choisi parmi : un groupement -CH(CH3)2, un groupement -CH2-CH(CH3)2i un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et Rl ' est un atome d'hydrogène, ou - Rl et Rl ' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, où (R2, R2') sont tels que : - si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)- CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou
R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, les couples (R1, R1') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, ledit peptide marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énan- tiomères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères, sous réserve que si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0, si (Rl5Rl ')=( -CH(CH3)2 ;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H) et si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3;H) alors (Rl ,Rl ') est différent de ( - CH(CH3), ;H) et sous réserve que si ledit peptide marqué est marquée par un atome d'iode 125I, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (Rl ,Rl') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).
Les peptides précédents sont nouveaux.
Un mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un peptide marqué tel que défini précédemment, représenté par la formule générale Ic, Id, Ie, If, Ig, Ih, Ii, Ij, Ik, II, Im, In , Io, IHd ou IHe telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également, dans un mode de réalisation avantageux, un peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante :
Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) où
Xl peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nie), une Cycloleucine (CIe) ou une tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés,
X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé β2 ou β3 de la tyrosine,
X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nie), une Cycloleucine (CIe) ou une tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés, X4 peut être une proline ou un dérivé β2 ou β3 de la proline,
X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé β2 ou β3 de la phénylalanine, et (His-X4) pouvant être un aba-gly de formule lia ou
un aia-gly de formule Hb
Figure imgf000032_0001
l'un au moins des acides aminés Xl à X5 est un acide aminé non naturel, et/ou un β-homo acide aminé, naturel ou non sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 125I soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
Dans un autre aspect, l'invention concerne les peptides modifié susmentionnés non marqués, notamment les peptides de formules IHbI et IIIcl suivants :
formule HIb 1, ou
Figure imgf000032_0002
formule Hc 1
Un aspect avantageux de l'invention concerne un peptide marqué défini ci-dessus, ledit pep- tide étant marqué par au moins un isotope radioactif consistant en la séquence suivante : Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22), ledit peptide éventuellement modifié, où
Xl peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), ou un acide aminé non naturel dérivé de la leucine, notamment la Norleucine (Nie), la Cy clo leucine (CIe) ou la tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés naturels ou non naturels,
X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé β2 ou β3 de la tyrosine,
X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), ou un acide aminé non naturel dérivé de la leucine, notamment la Norleucine (Nie), la Cycloleucine (CIe) ou la tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés naturels ou non naturels, X4 peut être proline ou un dérivé β2 ou β3 de la proline, X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé β2 ou β3 de la phénylalanine, et sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 125I soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
Avantageusement, l'invention concerne un peptide modifié marqué défini ci-dessus, consistant en la séquence suivante :
Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22), ledit peptide étant modifié de telle sorte que l'un au moins des acides aminés Xl à X5 soit un β-homo acide aminé, naturel ou non.
Un autre aspect avantageux de l'invention concerne un peptide modifié marqué défini précédemment, ledit peptide marqué modifié étant marqué :
• par au moins un atome d'iode 125I sur la tyrosine X2, notamment sur le groupement phényle, ou • par le remplacement de l'un au moins des atomes d'hydrogène par un atome de tritium 3H. Dans un autre aspect avantageux, l'invention concerne un peptide modifié marqué mentionné précédemment, où ledit peptide marqué modifié est choisi parmi les peptides suivants :
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24),
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 25), - β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 26),
- Val-Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe- (SEQ ID NO 27),
- β2hVal-Tyr-Ile-Aba-Gly-Phe-(SEQ ID NO 28), et
- β2hVal-Tyr-Ile-Aia-Gly-Phe-(SEQ ID NO 29), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant iodé, préférentiellement par un seul atome d'iode 125I.
Dans un autre aspect avantageux, l'invention concerne un peptide modifié marqué mentionné précédemment, où ledit peptide marqué modifié est choisi parmi les peptides suivants :
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), - β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 25),
- β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 26),
- Val-Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe- (SEQ ID NO 27),
- β2hVal-Tyr-Ile-Aba-Gly-Phe-(SEQ ID NO 28), et
- β2hVal-Tyr-Ile-Aia-Gly-Phe-(SEQ ID NO 29), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant tritié.
L'invention est illustrée par les figures IA-Q, les figures 2A-Q et les exemples suivants, sans pour autant se limiter auxdits exemples.
Légende des figures :
Les figures IA-Q représentent les spectres d'absorption à 215 nm des élutions sur HPLC en phase inverse en présence de solvant eau/acétonitrile, la phase mobile contenant 0,1% de TFA. Le gradient standard correspond à une migration de 20 min de 3% à 97% d'acétonitrile, à un taux de lmL/min.
La figure IA représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H- β3hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH . La figure IB représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI- β3hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
La figure IC représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI-
Tyr-β3hIle-His-Pro-Phe-OH. La figure ID représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI-
Tyr-Ile-His-β3hPro-Phe-OH.
La figure IE représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI-
Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe-OH.
La figure IF représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du premier diasté- réoisomère du peptide H-β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
La figure IG représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide du second diastéréoisomère du peptide H-β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
La figure IH représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-Val-β2hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH La figure II représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du premier diastéréoisomère du peptide H-Val-Tyr-β2hLeu-His-Pro-Phe-OH
La figure IJ représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-Val-Tyr-β2hLeu-His-Pro-Phe-OH
La figure IK représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI- Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe-OH
La figure IL représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-Pro-β2hPhe-OH
La figure IM représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe-OH La figure IN représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide
NH2->: >CO-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH
La figure IO représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-β2hNle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH
La figure IP représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH
La figure IQ représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe-OH Les figures 2A-Q représentent les spectres d'absorption à 215 nm des élutions sur HPLC en phase inverse en présence de solvant eau/méthanol, la phase mobile contenant 0,1% de TFA.
Le gradient standard correspond à une migration de 20 min de 3% à 97% de méthanol, à un taux de lmL/min.
La figure 2A représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H- β3hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH .
La figure 2B représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI- β3hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH. La figure 2C représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI-
Tyr-β3hIle-His-Pro-Phe-OH.
La figure 2D représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI-
Tyr-Ile-His-β3hPro-Phe-OH.
La figure 2E représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI- Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe-OH.
La figure 2F représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du premier diasté- réoisomère du peptide H-β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH.
La figure 2G représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide du second diastéréoisomère du peptide H-β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH. La figure 2H représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-Val-β2hTyr-Ile-His-Pro-Phe-OH
La figure 21 représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du premier diastéréoisomère du peptide H-Val-Tyr-β2hLeu-His-Pro-Phe-OH
La figure 2 J représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-Val-Tyr-β2hLeu-His-Pro-Phe-OH
La figure 2K représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H-VaI-
Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe-OH
La figure 2L représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-Val-Tyr-Ile-His-Pro-β2hPhe-OH La figure 2M représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide H- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe-OH La figure 2N représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du peptide
NH2- v^CO-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH
La figure 20 représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-β2hNle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH La figure 2P représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH
La figure 2Q représente le spectre d'absorption UV en fonction du temps du mélange des ra- cémates du peptide H-β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe-OH
Les figures 3A-D représentent profils HPLC d'iodation des peptides n° 6, 11, et 17 et de l'angiotensine IV. L'axe des abscisses représente le temps de rétention en minutes, et l'axe des ordonnées représente l'intensité exprimée en mV/I*.
La figure 3 A représente le profil du peptide de l'angiotensine IV,
La figure 3B représente le profil du ligand 6, La figure 3 C représente le profil du ligand 11, et
La figure 3D représente le profil du ligand 16.
La figure 4 représente profils HPLC d'iodation du peptide n° 17 mono iodé. L'axe des abscisses représente le temps de rétention en minutes, et l'axe des ordonnées représente l'intensité exprimée en mV/I*.
La figure 5 représente la fixation de l'angiotensin IV et des dérivés peptidiques (ligands 6,11 et 17) sur la protéine IRAP-His recombinante. L'axe des abscisses représente la quantité d'IRAP recombinant exprimé en μg/mL, l'axe des ordonnées représente la radioactivité d'iode 125 exprimée en B/Bmax. EXEMPLES
Exemple 1 : synthèse des peptides
La synthèse de tous les peptides a été réalisée par synthèse peptidique en phase solide en utilisant des acides aminés protégés en position amino terminale par du te/t-butoxycarbonyl (Boc) ou du Λ/-9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc).
Les peptides ont été synthétisés sur une résine Merrifïeld Boc-Phe (0,57 mmol/g), une résine Wang Fmoc-Phe (0,76 mmol/g) ou une résine de 2-chlorotrityle chloride (1,5 mmol/g). Les groupes de protection des chaines latérales étaient Tyr(t-Bu), β3-hTyr (t-Bu), et His(Trt) pour la synthèse Fmoc, et Tyr (2,6-di-Cl-Bzl) et His(Tos) pour la synthèse Boc. Les groupes de protection Fmoc ont été retirés avec une solution de 20% de pipéridine dans du diméthyle formamide (DMF) (2 x 5 min), et le clivage des groupes de protection Boc ont été réalisés dans une solution de 50% acide trifluoroacétique (TFA) dans du dichlorométhane (DCM) (2 x 10 min) et une solution de 10% triéthylamine (TEA) dans du DCM (2 x 5 min) a été utilisé pour la neutralisation. Le couplage des acides aminés a été réalisé dans du DMF/DCM (Iv/ Iv) en utilisant du O- (Benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) (3 équivalents) et du diisopropyléthy lamine (DIPEA) (6 équivalents). Les protocoles de synthèse ont été les suivants : Cycle Fmoc standard :
Figure imgf000038_0001
Les 3 eq d'acides aminé (par rapport à la résine) et le 6 eq de DIPEA (par rapport à la résine) ont été dissouts dans du CH2Cl2 (10 mL pour 1 g de résine), contenant, si nécessaire, une petite quantité de DMF pour facilité la solubilité de l'acide aminé. La résine 2- chlorotritilchloride a été préstabilisée dans du CH2Cl2 pendant Ih, et après ajout du mélange la résine a été mélangée pendant 30-120 min. Plus tard, la résine a été lavée trois fois avec un mélange CH2C12/MeOH/DIPEA (17:2:1), puis deux fois au DMF et trois fois au CH2Cl2.
Cycle Boc standard
Figure imgf000039_0001
L'acide amine-Boc a été dissout dans de l'EtOH (2 mL/mmol) et de l'au (0,5 mL/mmol), le pH est ajusté à 7 avec 2 M de solution aqueuse CS2CO3. La solution a été est évaporée par dessèchement, les résidus ont été évaporés deux fois avec du dioxane. La résine Merrifïeld a été préstabilisée dans du CH2Cl2 pendant Ih et lavée au DMF. Le sel de césium d'acide aminé (1,2 eq) dans le DMF a été ajouté à la résine, et le tout chauffé à 500C toute la nuit. A la fin de la réaction, la résine a été lavée trois fois dans du DMF, trois fois dans un mélange DMF/eau (1 :1), trois fois dans du DMF, trois fois dans du CH2Cl2, et trois fois dans du MeOH. Dans les deux stratégies (Boc et Fmoc), 3 éq. d'acide aminé, 3 éq. de TBTU et 6 éq. de DI- PEA ont été mélangés et laissés pendant 3 min pour permettre l'activation. La solution est alors ajoutée sur la résine et agitée pendant deux heures ou toute la nuit.
Le test colorimétrique correspond à un test de Kaiser . Ce test consiste en 3 solutions: A: 5 g de ninhydrine dans 100 mL de n-BuOH; B: 80 g de phénol dans 20 mL de n-BuOH; C: 2 mL 0.001 M KCN aqueux dans in 98 mL de pyridine.
Quelques billes de résine sont placées dans un tube à essai. 3 gouttes de chacune des solutions sont ajoutées et le tube est chauffé à 1000C pendant 5 min. Lorsque la résine ou la solution est incolore ou jaunâtre, le résultat est négatif. Une coloration bleue témoigne de la présence d'une aminé primaire, et une coloration marron/rouge témoigne de la présence d'une aminé secondaire.
Les peptides ont été clivés de la résine par traitement avec un mélange TFA/H2θ/Triéthylsylane (TES) (95:2.5:2.5) pendant 2 h, soit avec de l'acide fluorhydrique HF, soit un mélange TF A/acide trifluoromethanesulfonique (TFMSA)/TES (20:2:3) dans le cas d'une résine Merrifïeld. Dans les deux cas de l'éthanol est ajouté pour précipiter les peptides. Les précipités sont lavés avec de l'EtOH.
Les peptides ont été purifiés par HPLC en phase inverse sur une colonne C18 Supelco Disco- very BIO Wide Pore. Chaque peptide était pur à au moins 98% après test sur chromatographie en couche mince (CCM) et analyse HPLC en phase inverse dans un solvant eau/acétonitrile (figures IA- IQ), ou dans un solvant eau/méthanol (figures 2A-2Q). Les poids moléculaires ont été confirmés par spectrométrie de masse-electrospay/ionisation (ESI-MS).
Le tableau suivant récapitule les propriétés des peptides synthétisés, M cale correspond à la masse prédite, ESI MS correspond à la masse obtenue par spectrométrie de masse, R% cor- respond au rendement en pourcent par rapport aux peptides bruts, Temps Retl correspond au temps de rétention lors de l'élution eau/acétonitrile, Pureté%l 1 correspond à la pureté du produit obtenu après l'élution eau/acétonitrile Temps Ret2 correspond au temps de rétention lors de l'élution eau/méthanol, Pureté%2 correspond à la pureté du produit obtenu après l'élution eau/méthanol.
Au cours de la synthèse, tous les β2 homo acide aminés utilisés étaient sous forme de racéma- tes, et après synthèse, deux diastéréoiso mères ont été obtenus. La séparation de ces diastéréoi- somères est indiquée par la présence des lettres « a » et « b ». Lorsque les diastéréoisomères n'ont pas pu être séparés, les ils sont représentes par « ab ». Par convention, les diastéréoisomères « a » sont élues avant les diastéréoisomères « b » lors de la HPLC en phase inverse. Exemple 2: Marquage au tritium
Les peptides néosynthétisés et non purifiés ont été tritiés par saturation catalytique selon la procédure décrite dans Tόth G et al. (1997 Methods Mol Biol. vol 73, pp:219-30). Le dihydrogène tritié gazeux 3H2 utilisé est obtenu de Technobexport, (Russie) et contient une quantité de tritium supérieure ou égale à 98%.
La radioactivité des peptides bruts a été mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation TRI- CARB 2100TR dans un scintillant composé de d'un mélange toluène-Triton X-IOO. La mesure de la radioactivité était d'environ 10OmCi (3.7 GBq)
Les peptides tritiés ont été purifies par HPLC en utilisant une colonne Grâce Vydac 218TP54 C 18, et la détection du liquide de scintillation a été réalisée sur un détecteur Canberra Packard Radiomatic 505TR Flow Radiochromatography en utilisant du scintillant Ultima-Flo M. L'activité spécifique des peptides purifiés tritiés a été mesurée par HPLC en utilisant une courbe étalon. L'activité spécifique obtenue était comprise entre environ 30,0 Ci mmol"1 et
45,0 Ci mmol"1.
Exemple 3 : Marquage à l'Iode 125 (125I)
L'iodation des peptides peut être réalisée selon plusieurs protocoles connus de l'homme de métier. Le principe de l'iodation des protéines repose sur la conversion de IT (NaI) en I+ ou I3" en présence d'agents oxydants tels que la chloramine-T, l'iodogène ( 1,3,4, 6-tetrachloro- 3α,6α-diphenyl-glycoluril), le JV-chloro-benzenesulfonamide ou la lactoperoxydase. I+ ou I3" sont des espèces réactives qui attaquent le cycle aromatique des tyrosines en position meta comme décrit dans "Antibodies: a laboratory manual" E. Harlow et D. Lane, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1988 pp. 324 - 339.
Matériel pour l'iodation par le JV-chloro-benzenesulfonamide
L'iode radioactive 125I est utilisée sous forme de Na125I dans une solution basique à environ 1 mCi(37 MBq)/10μl IODINE-125(Amersham; IMS30).
Réactifs
• 0.1 M tampon phosphate, pH 7,0 • Tampon Tris-buffered saline (TBS)
• 5% BSA dans du TBS
• Solution de stabilisation (10% thiosulfate de sodium + 0,1N NaOH) • IODO-BEAD™(PIERCE): billes greffées avec un agent oxydant (N-chloro- benzenesulfonamide)
• microseringue Hamilton (model 702, 25μl, aiguille 22S, style 2)
• colonne de dessalage (Bio-rad DG-IO etc.) Procédure
1. Dans un tube en plastique, 200μL de tampon phosphate O,1M, pH 7 sont mélangés avec 500μCi de Na125I (5μL) et 1 à deux doses de IODO-BEADs.
2. le mélange est incubé à température ambiante pendant 5 min.
3. Les peptides sont ajoutés à la solution (entre 1 à 100 μg de peptide)
4. le nouveau mélange est incubé à température ambiante pendant 10-25 min
5. le surnageant est prélevé et placé sur une colonne dessalage, afin d'éliminer sels, Na125I et I+ ou I3" libres.
6- les fractions de la colonne sont collectées, et la radioactivité de chacune des fractions est mesurée, en utilisant un compteur à scintillation.
7- dans les fractions radioactives, 1A du volume d'une solution de 5% BSA est ajoutée afin de prévenir la décomposition par radiation.
Procédure alternative d'iodination Réactifs
• Tampon de marquage = Tampon acétate d'ammonium 25OmM pH 5.3
• Tampon de conditionnement = PBS + 0.1% BSA
• Tampon purification = 20% Acétonitrile + 0.5% TFA
• purification HPLC , colonne Cl 8
• reconstitution des ligands en tampon de marquage [ ligand ] = lOOμg/ml
Figure imgf000043_0001
Marquage
Activité spécifïque= 500μCi/μg soit 18.5MBq/μg de ligand • 5μg (50μL) ligand
• 92.5MBq d'iode
• 15μg ChT
• temps de contact = 60s
• 15μg MBS
• temps de contact = 30s
• purification = HPLC phase inverse suivi DO a 275nm en suivant le gradient suivant
Figure imgf000044_0001
Résultats : les profils HPLC des ligands synthétiques IRAP et de l'angiotensine IV marqués à l'iode 125 sont représentés dans les figures 3A à 3D
• Détermination de la fraction « mono-iodée » le étape = marquage du ligand 17 avec de l'iode « froid » , purification par HPLC, analyse des fractions obtenues par spectrométrie de masse, collecte de la fraction « mono-iodée » _ 2e étape = injection simultanée de la fraction « mono-iodée » obtenue lors de la le étape et de la fraction Fl du Ligand 17 marque a l'iode 125
_ 3e étape = co-elution de la fraction Fl du ligand marque a TI125 et de la fraction « monoiodée »
La figure 4 montre que la fraction Fl est bien « mono-iodée » .
Exemple 4 : Spécificité des peptides : mesure de la liaison peptide marqués/partie extracellulaire d'IRAP.
La mesure de la liaison entre les peptides marqués et le domaine extracellulaire d'IRAP a été effectuée par un test de liaison adapté du test décrit par Demaegdt et al. (Demaegdt et al, 2004, Biochem. Pharmacol. 68, 885-892). Le domaine extracellulaire d'IRAP recombinant produit dans des cellules d'insecte (High- Five) purifié par affinité a été repris dans un tampon de liaison 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) contenant 140 mM de NaCl.
Les incubations ont été réalisées dans des plaques 24 puits dans un volume final de 300μL comprenant 100 μL de la partie extracellulaire d'IRAP, 50 μl d'un mélange EDTA/1,10- phénanthroline avec une concentration finale de 500μM d'EDTA et 100 μM de 1,10- phénan- throline, et : soit 50 μl de tampon de liaison, - soit 50 μl de tampon de liaison contenant les peptides non marqués pour les tests de compétition.
50 μl de peptides marqués ont été ajoutés à une concentration finale de 0,5 à 0,8 nM pour les tests de saturation, soit à une concentration de 3nM pour les autres tests.
L'incubation a été réalisée à 37°C, à des temps variables (cinétique) jusqu'à 60 min.
Les puits dans lesquels est adsorbée la partie extracellulaire d'IRAP ont ensuite été lavés plu- sieurs fois avec du tampon d'incubation afin d'éliminer la radioactivité libre.
La radioactivité a alors été mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation, en présence de scintillant ad hoc.
L'affinité des peptides marqués pour la partie extracellulaire d'IRAP à été évaluée entre 1 et 10O nM
Exemple 5 : Stabilité des peptides marqués
Afin de mesurer la stabilité des peptides marqués dérivés de l'angiotensine IV, leurs homologues marqués à l'iode froide (127I) ont été incubés à une concentration de 100 μM pendant 40 min dans un échantillon de sérum, lequel sérum n'est pas traité au préalable avec des inhibi- teurs de protéases.
Les peptides ont ensuite été séparés du sérum par gel fîltration et incubés à des concentrations allant de 0,1 nM à 1 μM avec le domaine extracellulaire d'IRAP purifié en présence de [125I]- AnglV (0,1 - 1 nM) ou de [125I]-NIe- AnglV (0,1 - 1 nM) et d'inhibiteurs de peptidases et protéases. La stabilité des peptides dans l'échantillon de sérum est alors mesurée indirectement en mesu- rant la compétition des peptides marqués à l' I avec la liaison de [ I]-AngIV ou de [ I]- Nle-AnglV au domaine extracellulaire d'IRAP (cf. A. Lukaszuk et al. Med Chem. 51, 2291- 2296, 2008). Exemple 6 : RIA IRAP
PRINCIPE DE LA PROCÉDURE Le dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP (extIRAPc) selon l'Invention fait appel à une méthode immunoradiométrique. La partie extracellulaire circulante d'IRAP présente dans les échantillons issus de patients ou les étalons est reconnue par un anticorps mo- noclonal (Mab) spécifique de la partie extracellulaire d'IRAP, ledit anticorps monoclonal étant lié à la surface intérieure des tubes de polystyrène. L'ajout d'un peptide marqué à l'Iode 125 ou au tritium (peptide*), possédant une haute affinité pour extIRAPc induit la formation d'un complexe sandwich lié à la phase solide (tube): Mab- extIRAPc - peptide*.
A la fin de l'incubation, la fraction de peptide* non liée à la phase solide est éliminée par aspiration et par lavages. La formation du complexe ne se réalisant qu'en présence d' extIRAPc, la radioactivité liée à la phase solide (tube) est directement proportionnelle à la concentration d' extIRAPc dans l'échantillon. Une courbe d'étalonnage permet de déterminer, par interpolation, la concentration d' extIRAPc des échantillons à doser.
PRÉLÈVEMENT, PRÉPARATION ET CONSERVATION DES ÉCHANTILLONS Le dosage peut être effectué sur du sérum humain. Si le dosage est exécuté dans les 24 heures suivant le prélèvement, les échantillons peuvent être conservés à 2-8°C. Dans le cas contraire, ils doivent être aliquotés et congelés à -200C ou à des températures plus basses pendant un maximum de cinq mois. Si les échantillons ont été congelés, il y a lieu attendre qu'ils soient complètement décongelés et les homogénéiser avant le dosage. Il faut éviter les cycles de congélation/décongélation répétés.
Si l'on prévoit des niveaux d'extIRAPc élevés, il est nécessaire de diluer l'échantillon avec l'étalon zéro (cf. infra). Il est recommandé d'utiliser des tubes en plastique lors de la préparation des dilutions.
PROCÉDURE DE DOSAGE RECONSTITUTION DES RÉACTIFS LYOPHILISÉS
• Reconstituer l'étalon zéro avec 5 mL d'eau distillée, l'étalon zéro correspondant à un échantillon ne possédant pas d'extIRAPc.
• Reconstituer les étalons 1 à 6 (échantillons de sérum pour lesquels la quantité d'extIRAPc est connue) et les contrôles Gl et G2 (Gl et G2 correspondent à des solutions contenant de l'extlRAPc) de avec 1 mL d'eau distillée.
Reconstituer les réactifs plusieurs minutes avant l'utilisation et mélanger délicatement (éviter la formation de mousse).
DILUTION DU TAMPON DE LAVAGE: Ajouter 900 mL d'eau distillée à 100 mL de tampon de lavage concentré. Eviter la formation de mousse, (tampon de lavage: PBS, albumine 0,1%, pH 7.4).
PROTOCOLE DE DOSAGE Avant utilisation, les tubes revêtus, les étalons, les sérums contrôle et les sérums à analyser sont placés à température ambiante (18-25°C) pendant au moins 30 minutes; puis leur contenu est mélangé au Vortex. Il est recommandé d'exécuter l'analyse en double aussi bien pour les étalons que pour les sérums de contrôle et les échantillons. Observer scrupuleusement l'ordre d'utilisation des réactifs: 1. Pipeter 50 μL de chaque échantillon (étalons, sérum contrôle et échantillon) et déposer au fond d'autant de tubes revêtus avec les Mab que d'échantillons prélevés, et dans autant de tubes non revêtus que d'échantillons prélevés.
2. Distribuer 200 μL de peptide* dans chacun des tubes y compris ceux non revêtus destinés à l'évaluation de l'activité totale. 3. Incuber pendant 2 heures ± 5 minutes à température ambiante (18-25°C) sur un agitateur horizontal (200-300 tours/minute).
4. Laver les tubes de la manière suivante: aspirer soigneusement le contenu des tubes (sauf ceux destinés à l'évaluation de l'activité totale), ajouter 1 mL de tampon de lavage dilué dans chaque tube (sauf ceux destinés à l'évaluation de l'activité totale) et aspirer la solution de Ia- vage. Répéter le lavage une deuxième fois. Pour obtenir des résultats reproductibles et fiables il est nécessaire d'exécuter le lavage correctement. Le respect soigneux des temps d'incubation et l'élimination complète de la solution de lavage sont fondamentaux pour une bonne réussite de l'analyse.
5. Mesurer à l'aide d'un compteur gamma l'activité de tous les tubes, y compris ceux destinés à l'évaluation de l'activité totale.
CONTRÔLE DE QUALITÉ
II est recommandé d'inclure dans chaque analyse des échantillons contrôle afin de vérifier la qualité des résultats obtenus.
Tous les échantillons doivent être traités de la même manière et les résultats sont analysés avec une méthode statistique adéquate. Si les valeurs des sérums contrôle ne sont pas comprises dans l'intervalle d'acceptabilité indiqué, le dosage doit être refait. CALCUL DES RÉSULTATS
1. Calculer la moyenne des comptages pour chaque étalon, contrôle ou échantillon.
2. Tracer la courbe d'étalonnage à l'aide des comptages moyens de chaque étalon reportés sur l'axe des ordonnées en fonction des concentrations respectives d'insuline sur l'axe des abscisses. 3. Calculer les concentrations des contrôles et des échantillons par interpolation de la courbe d'étalonnage à l'aide des comptages moyens respectifs en corrigeant, le cas échéant, par le facteur de dilution utilisé.
Exemple de RIA *4G6 : Anticorps monoclonal anti IRAP (IgG3a) dirige contre la séquence peptidique
QKKGKELFIQQER (séquence peptidique de l'IRAP N°3)
*Tube: BSA-biotine-avidine-4G6-biot
*Proteine recombinante IRAP-HIS (Iot712-CAP-O5p) a 410μg/ml
Gamme entre 0 et 12.5μg/ml Tampon gamme "IRAP-HIS" : PBS (1 ImM PO4+140mM Nacl) + 1% BSA free protease
+ 0.1% proclin + 5mM EDTA
*Tampon conditionnement traceurs = Tampon IRAP-HIS + 120-M Phénanthroline
^Traceurs , fractions Fl des les ligands marques a lμci/ml
*Ligand 6
*Ligand 11
*Ligand 17
*Angiotensine IV
^Solution de lavage : H2O+0.05% tween 20
Protocole
*200μl/ tube IRAP-His
Incubation 4h TA sous agitation (750 rpm) *2 lavages = aspiration + (2 x 2ml / tube) *200μl ligand * / tube Incubation une nuit à TA *2 lavages = aspiration + (2 x 2ml / tube) * comptage de la radioactivité sur lmn
Les résultats sont présentés dans la figure 5.

Claims

Revendications
1. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP (« insulin responsive aminopeptidase ») comprenant au moins une étape de dosage quantitatif de ladite partie extracellulaire, sécrétée, purifiée, d'IRAP, au moyen d'au moins un peptide modifié et marqué, ledit peptide marqué interagissant spécifiquement avec ladite partie extracellulaire d'IRAP, ledit peptide étant modifié par la présence d'au moins un acide aminé non naturel, et/ou au moins un β-homo acide aminé, naturel ou non, ledit peptide marqué étant marqué préférentiellement par au moins un isotope radioactif, sous réserve que
- ledit peptide ne soit pas un anticorps et
- ledit peptide modifié, marqué par un atome d'iode 125I, soit différente de la séquence NIe- Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
2. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon la revendication 1, où ledit peptide modifié et marqué est un ligand d'IRAP qui est soit un substrat marqué de la protéine IRAP, choisi parmi • la [Arg]-vasopressine marquée et modifiée,
• l'Oxytocine marquée et modifiée,
• la Met-/Leu-enkephaline marquée et modifiée,
• la Somatostatine marquée et modifiée,
• la CCK-8 marquée et modifiée, • la Neurokinine A marquée et modifiée,
• la Neuromedine B marquée et modifiée,
• la Lys-bradykinine marquée et modifiée, et
• la Dynorphine A modifiée marquée et modifiée, soit un peptide inhibiteur marqué de la protéine IRAP, choisi parmi • l'Angiotensine IV marquée et modifiée, et
• la LVV-hemorphin-7 marquée et modifiée,
3. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon la revendication 1 ou 2, comprenant au moins :
• une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et
• une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié marqué tel que défini dans la revendication 1 ou 2.
4. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où ladite purification de la partie circulante de la protéine IRAP est effectuée au moyen d'au moins un anticorps spécifique de ladite partie extracellulaire d'IRAP, notamment par immunoprécipitation ou immunocapture.
5. Méthode de dosage de la partie extracellulaire circulante d'IRAP selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où ladite protéine IRAP est représentée par - la protéine IRAP de séquence SEQ ID NO 1, ou une protéine homologue à la protéine IRAP présentant une identité de séquence d'au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO 1, sous réserve que ladite protéine homologue soit capable d'interagir spécifiquement avec les ligands d'IRAP ou les peptides inhibiteurs d'IRAP, ou - une iso forme de la protéine IRAP, ladite iso forme étant le produit de l'épissage alternatif de l'ARN codant la protéine IRAP SEQ ID NO 1, sous réserve que ladite isoforme soit capable d'interagir spécifiquement avec les ligands d'IRAP ou les peptides inhibiteurs d'IRAP, lesdites isoforme de la protéine IRAP SEQ ID NO 1 étant notamment représentées par les protéines SEQ ID NO 2 ou 3.
6. Méthode de dosage selon la revendication 5, où
• lesdits variants de la protéine IRAP possèdent une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 4 à SEQ ID NO 7, et
• lesdites isoformes de la protéine IRAP possèdent une séquence d'acides ami- nés choisie parmi les séquences SEQ ID NO 8 à SEQ ID NO 15.
7. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ladite partie extracellulaire circulante de la protéine IRAP possède une séquence d'acides ami- née représentée par les séquences choisies parmi les séquences suivantes : SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO 20.
8. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, où ledit peptide mo- difïé marqué est marqué par au moins un atome de tritium ou au moins un atome d'iode
125I, préférentiellement un seul atome d'iode 125I.
9. Méthode de dosage selon l'une quelconque des 1 à 8, où ledit peptide modifié marqué est représenté par la formule générale (III) suivante :
Figure imgf000052_0001
où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à O ou 1, de telle sorte que (a+b)≤l, (c+d)≤l,
(e+f)≤l, (g+h)≤l et (i,j)≤l, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendants les uns des autres, où (Ri, Ri') sont tels que :
Rl est choisi parmi : un groupement -CH(CHs)2, un groupement -CH2-CH(CHs)2, un groupement -CH(CH3)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et Rl ' est un atome d'hydrogène, ou Rl et Rl ' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, où (R2, R2') sont tels que : si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)- CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou
R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, les couples (Ri, Ri') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, où A est choisi parmi les groupes suivants
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000053_0003
ledit peptide modifié marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énantio mères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères,
sous réserve que si A est représenté par la formule IHa et si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0,
* si (Ri,Ri')=( -CH(CH3)2;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H), et
* si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3;H) alors (Ri5Ri') est différent de (-CH(CH3)2 ;H) et sous réserve que si ledit peptide modifié est marquée par un atome d'iode 125I, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (Ri5Ri') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).
10. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, où ledit peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante : Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) ou
Xl peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nie), une Cycloleucine (CIe) ou une tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés,
X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé β2 ou β3 de la tyrosine,
X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), une Norleucine (Nie), une Cycloleucine (CIe) ou une tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés,
X4 peut être une proline ou un dérivé β2 ou β3 de la proline,
X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé β2 ou β3 de la phénylalanine, et (His-X4) pouvant être
un aba-gly de formule lia ou
un aia-gly de formule Hb
Figure imgf000054_0001
l'un au moins des acides aminés Xl à X5 est un acide aminé non naturel, et/ou un β-homo acide aminé, naturel ou non sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 125I soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
11. Méthode de dosage selon la revendication 9 ou 10, où ledit peptide marqué et modifié consiste en la séquence suivante :
Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22) et où l'un au moins des acides aminés Xl à X5 est un β-homo acide aminé, naturel ou non.
12. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, où ledit peptide modifié marqué est marqué • par au moins un atome d'iode 125I sur la tyrosine X2, préférentiellement un seul atome d'iode 125I, notamment sur le groupement phényle, ou
• par le remplacement de l'un au moins des atomes d'hydrogène par un atome de tritium 3H.
13. Méthode de dosage selon quelconque des revendications 9 à 12, où ledit peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides suivants :
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24),
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 25), - β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 26),
- Val-Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe- (SEQ ID NO 27),
- β2hVal-Tyr-Ile-Aba-Gly-Phe-(SEQ ID NO 28), et
- β2hVal-Tyr-Ile-Aia-Gly-Phe-(SEQ ID NO 29), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant iodé, préférentiellement par un seul atome d'iode 125I.
14. Méthode de dosage selon quelconque des revendications 9 à 12, où ledit peptide modifié marqué est choisi parmi les peptides suivants :
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), - β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 25),
- β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 26),
- Val-Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe- (SEQ ID NO 27),
- β2hVal-Tyr-Ile-Aba-Gly-Phe-(SEQ ID NO 28), et
- β2hVal-Tyr-Ile-Aia-Gly-Phe-(SEQ ID NO 29), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant tritié.
15. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, comprenant
• une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et • une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 25 marqué par l'iode radioactif 125I, préférentiellement par un seul atome d'iode 125I.
16. Méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, comprenant
• une étape de purification de ladite partie extracellulaire circulante d'IRAP, et
• une étape de quantification de ladite partie extracellulaire circulante purifiée à l'étape précédente, au moyen d'au moins un peptide modifié marqué de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 25 tritié.
17. Peptide modifié marqué représenté par la formule générale (III) suivante :
Figure imgf000056_0001
où a, b, c, d, e, f, g, h, i et j peuvent être égaux à 0 ou 1, de telle sorte que (a+b)≤l, (c+d)≤l, (e+f)≤l, (g+h)≤l et (i,j)≤l, (a,b), (c,d), (e,f), (g,h) et (i,j) étant indépendants les uns des autres, où (R1, R1') sont tels que :
- Rl est choisi parmi : un groupement -CH(CH3)2, un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CHs)-CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, et Rl ' est un atome d'hydrogène, ou
Rl et Rl ' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, où (R2, R2') sont tels que :
- si R2 est choisi parmi : un groupement -CH2-CH(CH3)2, un groupement -CH(CH3)- CH2-CH3, un groupement -(CH2)3-CH3 et un groupement C(CH3)3, R2' est un atome d'hydrogène, ou
R2 et R2' forment ensemble avec le carbone qui les porte un cyclopentyle, les couples (R1, R1') et (R2, R2') étant choisis indépendamment l'un de l'autre, où A est choisi parmi les groupes suivants
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000057_0002
Figure imgf000057_0003
ledit peptide modifié marqué étant sous la forme d'un racémate, de l'un quelconque de ses énantiomères, ou de l'un quelconque des différents tautomères correspondant aux dits racémates et énantiomères,
sous réserve que si A est représenté par la formule IHa et si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0,
* si (Ri,Ri')=( -CH(CH3)2;H) alors (R2, R2') est différent de (-CH(CH3)-CH2-CH3;H), et
* si (R2, R2')=(-CH(CH3)-CH2-CH3;H) alors (Ri5Ri') est différent de (-CH(CH3)2 ;H) et sous réserve que si ledit peptide modifié est marquée par un atome d'iode 125I, si a, b, c, d, e, f, g, h, i et j sont égaux à 0 alors (Ri5Ri') est différent de (-(CH2)3-CH3;H).
18. Peptide modifié marqué, ledit peptide étant marqué par au moins un isotope radioactif consistant en la séquence suivante : Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22), ledit peptide étant modifié, où
Xl peut être une Valine (Val), une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), ou un acide aminé non naturel dérivé de la leucine, notamment la Norleucine (Nie), la Cy clo leucine (CIe) ou la tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés naturels ou non naturels,
X2 peut être une tyrosine, ou un dérivé β2 ou β3 de la tyrosine,
X3 peut être une Leucine (Leu), une Isoleucine (Ile), ou un acide aminé non naturel dérivé de la leucine, notamment la Norleucine (Nie), la Cycloleucine (CIe) ou la tert-leucine (TIe), ou un dérivé β2 ou β3 de l'un ces acides aminés naturels ou non naturels,
X4 peut être proline ou un dérivé β2 ou β3 de la proline,
X5 peut être une phénylalanine, ou un dérivé β2 ou β3 de la phénylalanine, et (His-X4) pouvant être
un aba-gly de formule lia
un aia-gly de formule Hb
Figure imgf000058_0001
et sous réserve que ledit peptide marqué non modifié soit différent de l'angiotensine IV, et en particulier que ledit peptide marqué non modifié soit différent de la séquence SEQ ID NO 21 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), sous réserve que la séquence SEQ ID NO 22 marquée par un atome d'iode 125I soit différente de la séquence Nle-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO 23).
19. Peptide modifié marqué selon la revendication 18, consistant en la séquence suivante : Xl-X2-X3-His-X4 -X5 (SEQ ID NO 22), ledit peptide étant modifié de telle sorte que l'un au moins des acides aminés Xl à X5 soit un β-homo acide aminé, naturel ou non.
20. Peptide modifié marqué selon la revendication 18 ou 19, ledit peptide marqué modifié étant marqué
• par au moins un atome d'iode 125I sur la tyrosine X2, préférentiellement un seul atome d'iode 125I, notamment sur le groupement phényle, ou
• par le remplacement de l'un au moins des atomes d'hydrogène par un atome de tritium 3H.
21. Peptide modifié marqué selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, où ledit peptide marqué modifié est choisi parmi les peptides suivants :
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24),
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 25), - β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 26),
- Val-Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe- (SEQ ID NO 27),
- β2hVal-Tyr-Ile-Aba-Gly-Phe-(SEQ ID NO 28), et
- β2hVal-Tyr-Ile-Aia-Gly-Phe-(SEQ ID NO 29), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant iodé, préférentiellement par un seul atome d'iode 125T I.
22. Peptide modifié marqué selon l'une quelconque des revendications 8 à 20, où ledit peptide marqué modifié est choisi parmi les peptides suivants :
- β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- (SEQ ID NO 24), - β2hVal-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 25),
- β2hLeu-Tyr-Ile-His-Pro-β3hPhe- (SEQ ID NO 26),
- Val-Tyr-Ile-His-β2hPro-Phe- (SEQ ID NO 27),
- β2hVal-Tyr-Ile-Aba-Gly-Phe-(SEQ ID NO 28), et
- β2hVal-Tyr-Ile-Aia-Gly-Phe-(SEQ ID NO 29), préférentiellement le peptide SEQ ID NO 25, ledit peptide modifié marqué étant tritié.
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