HRP20040216A2 - Method of identifying glycosyl transferase binding compounds - Google Patents
Method of identifying glycosyl transferase binding compounds Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20040216A2 HRP20040216A2 HR20040216A HRP20040216A HRP20040216A2 HR P20040216 A2 HRP20040216 A2 HR P20040216A2 HR 20040216 A HR20040216 A HR 20040216A HR P20040216 A HRP20040216 A HR P20040216A HR P20040216 A2 HRP20040216 A2 HR P20040216A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- signal
- moenomycin
- glycosyl transferase
- activity
- inhibitor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 68
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 43
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 title claims description 29
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 title claims description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 title description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 36
- PERZMHJGZKHNGU-JGYWJTCASA-N bambermycin Chemical group O([C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O1)CO[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1NC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)C(=O)NC=1C(CCC=1O)=O)O)C)[C@H]1[C@@H](OP(O)(=O)OC[C@@H](OC\C=C(/C)CC\C=C\C(C)(C)CCC(=C)C\C=C(/C)CCC=C(C)C)C(O)=O)O[C@H](C(O)=O)[C@@](C)(O)[C@@H]1OC(N)=O PERZMHJGZKHNGU-JGYWJTCASA-N 0.000 claims description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 claims description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 230000006098 transglycosylation Effects 0.000 claims description 16
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 claims description 16
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 2
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 claims 1
- UFHFLCQGNIYNRP-JMRXTUGHSA-N ditritium Chemical compound [3H][3H] UFHFLCQGNIYNRP-JMRXTUGHSA-N 0.000 claims 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims 1
- 101710202686 Penicillin-sensitive transpeptidase Proteins 0.000 description 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000005533 tritiation Methods 0.000 description 8
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108090000279 Peptidyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108700020474 Penicillin-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDNDQOCRJGGSJO-UHFFFAOYSA-N 1-amino-2-phenylpropan-2-ol Chemical compound NCC(O)(C)C1=CC=CC=C1 BDNDQOCRJGGSJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100516806 Caenorhabditis elegans nog-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001517041 Corynebacterium jeikeium Species 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 1
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101150109665 PBP gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- XPIVOYOQXKNYHA-RGDJUOJXSA-N [(2r,3s,4s,5r,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methoxyoxan-2-yl]methyl n-heptylcarbamate Chemical compound CCCCCCCNC(=O)OC[C@H]1O[C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O XPIVOYOQXKNYHA-RGDJUOJXSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N n-octyl beta-D-glucopyranoside Natural products CCCCCCCCOC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000011995 wilkinson's catalyst Substances 0.000 description 1
- UTODFRQBVUVYOB-UHFFFAOYSA-P wilkinson's catalyst Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)[Rh+](P(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)P(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 UTODFRQBVUVYOB-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Prikazani izum se odnosi na postupak identifikacije spojeva sa sposobnošću vezanja na transglikozilatno mjesto bakterijske glikozil transferaze. Izum se isto tako odnosi i na postupak dobivanja navedenih spojeva, te njihovu primjenu.
Peptidoglikan je polimer koji sintetizira bakterija i neophodan je za njezino preživljavanje. Enzimi koji sudjeluju u sintezi strukture navedenog bakterijskog peptidoglikana, porijeklom iz prokariota, predstavljaju isto tako moguće, izrazito interesantne ciljeve istraživanja na području novih antibiotika.
Između navedenih PBP (Penicilin vežući proteini, proteini koji vežu penicilin), koji tvore dijelove staničnih membrana, predstavljaju predmet brojnih istraživanja. Navedeni interes je povezan uglavnom sa prisustvom transpeptidazne aktivnosti koju inhibiraju penicilini (van Heijenoort, J. 1996, str. 1025-1034. U Neidhardt i sur., (ed.), Escherichia coli and Salmonella, 2. izdanje ed,: Stanična i molekularna biologija, ASM Press, Mashington, D.C.).
Najviše su ispitivani PBP razreda A koji predstavljaju modulacijske proteine sa dvostrukom enzimatskom aktivnošću: transpeptidazna aktivnost (predstavljena slijedom od približno 340 amino kiselina) i glikoziltransferazna aktivnost (otprilike 300 amino kiselina u području regije N-završetka).
Navedena glikoziltransferazna aktivnost nije još dovoljno poznata, što zbog teškoće u praćenju enzimske reakcije, što zbog nedostatka ukupnog kristalografskog donosa. Premda je poznat jedan inhibitor navedene aktivnosti, moenomicin, no potrebno je razjasniti točan mehanizam njegova djelovanja (Wasielewski i sur., 1965, Antimicrob. Agents and Chem., 743-748).
Važno je uočiti da do danas, niti jedan PBP razreda A nije u cijelosti kristaliziran.
Uz navedene bifunkcionalne PBP postoje istovremeno dva monofunkcionalna sustava:
- s jedne su strane monofunkcionalni PBP koji posjeduju jedinstvenu transpeptidaznu aktivnost: Jedan od navedenih PBP je nedavno kristaliziran (Gordon i sur., 2000, J.Mol.Biol., 299, 477-485).
- s druge strane se nalaze enzimi koji posjeduju samo glikoziltransferaznu aktivnost, označeni kao MgtA (isto tako poznati pod nazivom MtgA) (Di Berardino i sur, 1996, FEBS Lett., 392, 184-188)
Važno je otkriti nove inhibitore glikozil transferazne aktivnosti koji se istovremeno mogu koristiti kao nova antibiotska sredstva.
Prikazani izum se tako odnosi na novi postupak identifikacije, detekcije i/ili probira spojeva sa sposobnošću vezanja na transglikozilacijsko mjesto glikozil transferaze, navedeni postupak mora biti jednostavan za primjenu, a kao što je prethodno navedeno glikozil transferaza predstavlja bilo protein PBP razreda A, bilo protein tipa MgtA (isto tako poznat pod nazivom MtgA), osjetljiv na moenomicin (na primjer MgtA stafilokoka i streptokoka, kao što su S. aureus ili S. pneumoniae). Postupak u skladu s izumom omogućava isto tako probir velikog broja uzoraka, odnosno predstavlja mogućnost ispitivanja na jednostavan način nekoliko spojeva u isto vrijeme. Navedeni postupak tako omogućava dobitak na vremenu i važnu uštedu prilikom detekcije novih mogućih spojeva sa sposobnošću vezanja glikozil transferaze, a način realizacije navedenog postupka je prikazan na slici 1.
Određeni broj postupaka detekcije spojeva, može se između ostalog povezati sa mjestom transglikozilacije jedne glikozil transferaze, a u literaturi se mogu pronaći slijedeće publikacije (Branstrom A., Midha S., Goldman R. FEM5 Microbiool. Lett., 2000., 191, 187-190; Barbosa M., Yang G-, Fang G., Kurilla M., Pompliano D,, Antimicrob Agents. Chemother., 2002, 46, 4, 943-946; Vollmer W, Holtje, JV, Antimicrob Agents. Chemother., 2000, 44, 5, 1181-1185). Navedeni postupci zajedno posjeduju određene nedostatke obzirom na cilj postavljenog problema. Dakle, navedene tehnike ne ciljaju specifično transglikozilatnu aktivnost sinteze bakterijskog peptidoglikana i nisu uopće prilagođene postupcima probira velikog broja uzoraka za otkrivanje molekula od farmaceutskog interesa.
U prvom ostvarenju, izum se odnosi na postupak identifikacije i/ili probira i/ili selekcije spoja sa sposobnošću vezanja na transglikozilacijskog mjesto rekombinantne glikozil transferaze, a sastoji se od slijedećih koraka:
a) dovođenje prethodno navedenog spoja u kontakt sa prethodno navedenim rekombinantnim proteinom, prije, nakon ili istovremeno sa kontaktom prethodno navedenog rekombinantnog proteina sa inhibitorom aktivnosti transglikozilaze, prethodno navedeni inhibitor je označen uobičajenim markerom koji daje izravan ili neizravan signal,
b) proučavanje povezanosti prethodno navedenog signala s prethodno navedenim rekombinantnim proteinom,
stvorena veza na mjestu transglikozilacije potječe iz razlike signala dobivenog u koraku b) u odnosu na signal dobiven u odsustvu navedenog spoja.
U prikladnom ostvarenju, prethodno navedena rekombinantna glikozil transferaza predstavlja PBP razreda A, a još prikladnije PBPlb iz Escfierichiae coli. Navedeni protein ima ključnu ulogu u aktivnosti glikozil transferaze, a neophodan je za sintezu stanične stjenke bakterije in vitro. Između ostalog, posjeduje važnu podudarnost sa PBP razreda A prisutnih u drugim bakterijama. Premda se prikladno koristi PBP1b koji odgovara SEQ ID Br. 2, SEQ ID Br. 1 i koji predstavlja fuzijski protein konstruiran za proizvodnju rekombinantnog PBP1b. Postupak se isto tako može prilagoditi i mogu se koristiti svi PBP razreda A, uz uvjet da mikroorganizam posjeduje peptidoglikan, tako da je Grani + ili Gram -. Prikladno se koriste PBP razreda A porijeklom iz za čovjeka patogenih mikroorganizama, na primjer S. aureus, S. pneumoniae, M. leprae, L. pneumophilia, M. catarrhalis, C. Jeikeium, H. influenzae, P. aeruginosa...
Dakle, ispituje se vezanje na mjestu transglikozilacije kompeticijom uz primjenu inhibitora. Navedeni postupak omogućava dobivanje spojeva specifičnih za aktivnost transglikozilacije, koji isto tako povećavaju vjerojatnost inhibicije navedene aktivnosti. Uporaba rekombinantnog proteina isto tako smanjuje rizik od vezanja različitih ispitivanih spojeva do kojeg može doći ako se koristi protein pripravljen izravno iz bakterijske membrane, a takav pripravak može isto tako sadržavati i kontaminirane proteine.
U osobito prikladnom ostvarenju navedeni inhibitor je moenomicin. Isto je tako važno shvatiti da se jednako mogu koristiti i analozi moenomicina, kao što su oni opisani u WO 99/26956, ili svi drugi spojevi sa sposobnošću inhibicije aktivnosti transglikozilacije.
U osobito prikladnom ostvarenju, prethodno navedeni rekombinantni protein je fiksiran na krutom nosaču. Navedeni nosač može predstavljati stupić ili ravnu površinu. Prikladno je, da se kruti nosač u skladu s izumom sastoji od kuglica, koje predstavljaju grupaciju sa sposobnošću vezanja rekombinantnog proteina, odnosno grupaciju bakrenih iona ili ostatak glutationa. Naime, uporaba kuglica omogućava boji kontakt otopine proteina sa inhibitorima i ispitivanim spojevima, odnosno općenito pospješuje sposobnost vezanja, u odnosu na ravnu površinu (dvodimenzionalno).
U posebnom ostvarenju, navedeni je rekombinantni protein modificiran tehnikama genetskog inžinjeringa, kako bi se stvorila modifikacija koja omogućava navedeno vezanje. Navedene modifikacije su poznate osobi iz struke, a sadrže između ostalog dodatne ostatke histidina na krajnjem dijelu N-ili C-završetka proteina, a koji omogućavaju vezanje sa kelatnim metalom (bakar, na primjer). Isto tako se mogu koristiti sustavi koji se temelje na glutationu.
U jednom od načina primjene u skladu s izumom, navedeni marker predstavlja radioaktivno ili fluorescentno sredstvo. Dakle mogu se koristiti svi radioaktivni markeri (osobito je prikladan 3H) , na primjer za inkorporiranje radioaktivnih spojeva u strukturu inhibitora. Primjena tricija smatra se izrazito prikladnom, u slučaju kada označeni inhibitor korišten u postupku prikazanog izuma predstavlja organsku molekulu. Unatoč tome, isto tako se može primjeniti inkorporacija 13C ili 14C u strukturu inhibitora. Dakle, može se koristiti prekursor označen sa 14C (glukoza, propionat...), za vrijeme sinteze inhibitora, kada je navedeni pripravljen fermentacijom. Kada je pripravljen kemijskom sintezom, koriste se već označeni elementi.
Navedeni inhibitor se može isto tako označiti sa fluorescentnim markerom ili markerom neke druge prirode, bilo da se emitirani signal detektira izravno, bilo da se javlja samo za vrijeme kontakta (ili blizine) proteina i inhibitora (neizravna detekcija). Dakle, mogu se istovremeno označiti inhibitor i protein fluorescentnim spojevima, veza između dva entiteta je već određena «gašenjem», ili drugim postupcima (na primjer SPA (Scintillation Proximity Assay) ili FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer).
U prikladnom ostvarenju, PBP1b je vezan na kuglice SPA (Amersham) koja sadrže scintilant. Dovode se u kontakt navedene kuglice-PBP sa mogućim inhibitorom i označenim moenomicinom. Ako PBP veže inhibitor, ne vidi se signal. Ako PBP veže označeni moenomicin, blizina radioaktivnog elementa i kuglice emitira signal (emisija fotona iz scintilanta sadržanog u kuglici SPA).
U jednom ostvarenju, moguće je otkriti signal povezan sa prethodno navedenim rekombinantnim proteinom mjerenjem signala nevezanog uz protein, u odnosu na ukupno odaslani signal. Pored toga, kada je poznata količina inhibitora dodanog u postupak u skladu s izumom, poznata je količina početnog signala. Na taj je način moguće, nakon dovođenja inhibitora na protein, te različitih ispiranja, odrediti količinu nevezanog inhibitora, te iz toga izračunati količinu na protein vezanog inhibitora. Ovdje se isto tako radi o indirektnom postupku.
Unatoč tome, postupak u kojem se mjeri izravno količina inhibitora vezanog na protein smatra se prikladnijim.
Izum se odnosi isto tako na postupak: identifikacije produkta koji posjeduje antibakterijsko djelovanje, a sastoji se od slijedećih etapa:
a) izvođenje postupka u skladu s izumom,
b) modifikacije produkta odabranog u postupku a) dodavanjem ostataka na osnovnu kemijsku strukturu,
c) ispitivanja modificiranog produkta iz etape b) postupcima in vitro i/ili in vivo, na modelima za mjerenje antibiotske aktivnosti,
d) identifikacije produkta sa superiornim antibiotskim djelovanjem u odnosu na aktivnost dobivenu djelovanjem produkta odabranog u etapi a).
Pored toga, na razvoj lijeka često utječu slijedeća načela:
- probir spojeva koji posjeduju aktivnost utvrđenu prikladnim postupkom,
- odabir spojeva koji odgovaraju «uvjetima za odabir» (ovdje, vezanje na mjestu za transglikozilaciju glikozil transferaze),
- određivanje strukture (osobito slijeda (eventualno tercijarnog) ako se sastoji od peptida, formule i strukture ako se sastoji od kemijskih spojeva) odabranih spojeva,
- opitimalizacija odabranih spojeva, modifikacijom strukture (na primjer promjenom stereokemijske konformacije (na primjer promjena L oblika u D amino kiselina u peptidu), dodatkom supstituenata na peptidne ili kemijske strukture, osobito dodatkom ostataka na osnovnu strukturu, modifikacijom peptida (vidjeti Gante «Peptidomimetika», u Angewandte Chemie-International Edition Engl. 1994, 33. 1699-1720),
- ispitivanje i probir dobivenih spojeva na prikladnim modelima koji često predstavljaju modele najbliže ispitivanoj patologiji. U navedenoj fazi, koriste se često životinjski modeli, općenito glodavci (miševi, štakori...), ili psi, odnosno sisavci.
Modele za in vitro ispitivanja jednostavno izvodi osoba iz struke. U ciljne bakterijske kulture, dodaju se spojevi odabrani postupcima u skladu s izumom (eventualno uz određene modifikacije strukture), u različitim koncentracijama i proučava se proživljenje bakterija svim prikladnim postupcima, kao što su rast u krutim medijima te brojenje nastalih kolonija.
Životinjski modeli koji se mogu koristiti dobro su poznati osobi iz struke. Koriste se, na primjer, modeli koji se temelje na imunodeficijentnim miševima (na primjer scid/scid), koji su zaraženi bakterijama, te kod kojih dolazi do razvoja infekcije. Proučava se učinkovitost odabranih spojeva, postupkom u skladu s izumom, obzirom na povlačenje infekcije.
Izum se isto tako odnosi na spoj sa sposobnošću vezanja na transglikozilacijsko mjesto glikozil transferaze, te koji prikladno ima antibiotsko djelovanje, a može se dobiti postupkom u skladu s prikazanim izumom, ili se može izravno dobiti prethodno opisanim postupcima.
Navedeni spoj u skladu s izumom može biti spoj kemijske strukture (vrsta male organske molekule), lipid, šećer, protein, peptid, hibridni spoj protein-lipid, protein-šećer, peptid-lipid ili peptid-šećer, protein ili peptid na koji su dodane kemijski ogranci.
Između organskih spojeva uzetih u obzir, nalaze se oni koji sadrže jednu ili više cikličkih struktura, aromatski ili nearomatski, kao i koji sadrže nekoliko ostataka različitih vrsta (na primjer niži alkil, odnosno alkil koji sadrži od 1 do 6 atoma ugljika). Međutim, spoj u skladu s izumom ne predstavlja moenomicin, niti spojeve prikazane u WO 99/26956.
Izum se isto tako odnosi na spoj prikazanog izuma, naziv lijeka, samog ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, kao i na primjenu navedenih spojeva za pripravljanje lijeka namijenjenog liječenju bakterijskih infekcija.
Izum se isto tako osobito odnosi na primjenu spojeva koje se mogu dobiti postupkom u skladu s izumom, te koji posjeduju sposobnost vezanja na transglikozilacijsko mjesto glikozil transferaze i/ili inhibiciju aktivnosti navedenog enzima, te na pripravljanje lijeka namjenjenog liječenju bakterijskih infekcija. Prikladno, povoljan spoj posjeduje pored toga antibiotsku aktivnost koja se jednostavno može ispitati na životinjskim modelima ili in vitro, na staničnim kulturama. Navedeni spoj ne predstavlja moenomicin, a ponaša se kao kompetitor produkta iz postupka u skladu s prikazanim izumom.
Zanimljivi inhibitor glikozil transferaznog mjesta je moenomicin, a u povoljnom ostvarenju izuma, koristi se navedeni spoj nakon tricijacije, koja omogućava prikladno izvođenje izuma, u mjeri u kojoj navedeno modificiranje ne mijenja značajno svojstva moenomicina, a omogućava laganu detekciju, osobito putem SPA.
Broj zasićenih veza utječe na povećanje ili smanjenje lipofilnih svojstava molekule i tako vjerojatno utječe na odaslani signal / bazični šum zabilježen za vrijeme izvođenja testa (povećanje vezanja sa lipofilnošću), zanimljivo je pokušati ograničiti broj zasićenih veza.
Hidrogenacija u prisustvu Wilkinsonova katalizatora omogućava postizanje navedenog cilja primjenom vodika, no daje promjenjive rezultate kod upotrebe tricija.
Razvijen je alternativni postupak koji se sastoji od tricijacije u heterogenoj sredini, prikladno se mjeri količina apsorbiranog tricija, a reakcija se zaustavlja kod približno dva mola tricija na mol moenomicina. Tako je ostvarena kontrolirana tricijacija moenomicina.
Dobivena smjesa je zatim prikladno razdvojena kromatografskim postupkom na način grupiranja produkata sa specifičnom identičnom aktivnošću (dakle prema broju dvostrukih zasićenih veza sa tricijem).
Izum se isto tako odnosi na postupak pripravljanja tricijacijom obrađenog moenomicina, a koji obuhvaća fiksaciju tricija na jednu ili nekoliko dvostrukih veza postraničnog lanca moenomicina (slika 2). Navedeni postupak je izveden prikladno u heterogenoj sredini, u prisustvu katalizatora kao što je paladij.
Prikladno, navedeni katalizator je paladij na drvenom ugljenu, odnosno 12-25% paladij na drvenom ugljenu, a najprikladnije 18% paladij na drvenom ugljenu.
U povoljnom ostvarenju, moenomicin je otopljen u organskom solventu, prikladno etanolu ili metanolu. Izbor solventa odabranog za obradu moenomicina ovisi o osobi iz struke.
U prisustvu katalizatora, uveden je tricij i smjesa je ostavljena na temperaturi od približno 45-50°C, prikladno nižoj od približno 30°C, a najprikladnije na temperaturi okoline, odnosno otprilike 20°C.
Tresenje se izvodi na temperaturi okoline, kako bi se snizio tlak, zatim se reakcijska smjesa filtrira, te koncentrira na prazno, a ostatak se sakuplja. Tresenje se sprovodi tijekom vremena koje je neophodno za ugradnju jednog do dva mola tricija po molu moenomicina. Navedeno vrijeme ovisi o temperaturi i može ga odrediti osoba iz struke, no obično iznosi približno 15 minuta uz tresenje na temperaturi od 20°C.
Filtriranje smjese se izvodi nakon uklanjanja viška tricija.
Potom se može analizirati smjesa, na primjer putem HPLC, te pročistiti na preparativnom stupcu, u skladu s protokolima poznatim osobi iz struke.
Postupak u skladu s izumom omogućava na reprodutivan način dobivanje tricijacijom obrađenog moenomicina, te se može kontrolirati količina ugrađenog tricija u moenomicin, u odnosu na količinu unesenog tricija u reakciju.
Dakle, postupak u skladu s izumom omogućava dobivanje moenomicina označenog tricijem, na takav način da tricij može zasititi samo određeni broj (jednu ili dvije) dvostrukih veza, što omogućava očuvanje svojstava i karakteristika moenomicina.
Štoviše, razdvajanje kromatografijom (HPLC) mono i bi zasićenih produkata omogućava jednostavan rad sa specifičnim reproducibilnim aktivnostima. Navedeno se može činiti važnim u procjeni kvalitete i učinka kompetitora produkata koji se ispituju u postupku prikazanog izuma. Prikladno je izložiti identificirane dijelove dobro definiranih svojstava. Potrebno je uočiti da je moguće koristiti i sve druge postupke razdvajanja produkata.
Izum se odnosi isto tako na moenomicin obrađen tricijacijom, u postojećem obliku ili dobiven postupkom tricijacije u skladu s izumom, a tricij je inkorporiran prikladno zasićenjem jedne dvostruke veze u njegovom postraničnom lancu, i/ili je sintetiziran fermentacijom u prisustvu radioaktivnih prekursora.
U izumu se koristi isto tako rekombinantna glikozil transferaza. Navedeni membranski protein je pripravljen prikladno tako da se može topiti, na način da posjeduje određenu čistoću, sa svrhom dobivanja veće specifičnosti u postupku koji je predmet prikazanog izuma. Dakle, izum se odnosi na postupak pripravljanja rekombinantne glikozil transferaze iz vektora koji sadrži gel za navedenu glikozil transferazu, a obuhvaća slijedeće korake:
a) fermentaciju stanice u koju je uveden navedeni vektor, u uvjetima koji omogućavaju produkciju rekombinantne glikozil transferaze
b) pročišćavanje navedene rekombinantne glikozil transferaze, u prisustvu ne ionskog detergenta.
Prikladno, navedeni postupak pripravljanja jednog PBP razreda A, osobito PBP1b E.coli, odgovornog za aktivnost glikoziltransferaze neophodne u sintezi stanične stijenke bakterije in vitro.
Prikladno, vektor unesen u bakterijsku stanicu sadrži gen za PBP, na završetku gdje je umetnut, postupcima molekularne biologije, polihistidinski nastavak. To omogućava vezanje rekombinantnog proteina na kuglice tipa SPA za vrijeme trajanja postupka prikazanog izuma. Dakle, dobiveni protein sadrži slijed amino kiselina koje se nalaze u blizini SEQ ID Br. 1, a označen je na slici, amino kiseline 1 do 23 odgovaraju polihistidinskom nastavku, amino kiseline 24 do 822 odgovaraju PBP E.coli (SEQ ID Br 2).
Fermentacija se izvodi uobičajenim postupcima. U skladu s navedenim postupcima koristi se određeni promotor, koji inducira produkciju (vidi superprodukciju) proteina, koja se isto tako može sprovesti promjenom temperature fermentacije. Sve navedeno je dobro poznato osobi iz struke.
Protein PBP je hidrofobni membranski protein. Neophodno ga je zato pročistiti u prisustvu detergenta. Korišteni postupci pročišćavanja su isto tako dobro poznati osobi iz struke. Prikladno je koristiti neionski detergent, povoljnim se smatra HOG (N-oktil glukopiranozid). Isto tako se može odabrati neki drugi neionski detergent, kao što je Hecameg, Triton X-100, tetraetilen glikol mono-oktilni eter ili Nonidet P-40. Detergent se koristi u svim fazama pročišćavanja.
Izvođenje postupka u skladu s prikazanim izumom se odvija u prikladnom slučaju u prisustvu neionskog detergenta, osobito detergenta korištenog u pročišćavanju, odnosno NOG. Navedeno izaziva dobru enzimatsku aktivnost.
Opis slika:
Slika 1: predstavlja shematski prikaz postupka u skladu s prikazanim izumom. Kuglice SPA koje nose grupacije bakra, prikazane su ovalnim oblicima, s mjestom vezanja poli-histidinskog (His) kraja na protein PBP1b E.coli. U prisustvu inhibitora, označeni moenomicin ([3H]-Moenomicin) ne može se vezati na transglikozilacijsko mjesto proteina. U odsustvu inhibitora, vezanje je ostvareno i signal je emitiran.
Slika 2: predstavlja tricijaciju moenomicina zasićenjem jedne od dvostrukih veza postraničnog lanca. T: tricij, Ca: katalizator.
Dolje navedeni primjeri prikazuju izvođenje izuma, no nije im namjera ograničiti izum.
PRIMJERI
Primjer 1:
Reagansi i materijali
Kuglice PVT bakar His-Tag AMERSHAM: 200 μg / 100 μl / jažici
PBPl1b E.coli pročišćeni 0,860 mg/ml; PM=89 kDa; 8.31 μM; 5 pmola/ 10 μl/ jažici.
Moenomicin: PM=1580 Da; 200 pmol/ 10 μl/ jažici kako bi se pratila nespecifična razina.
Inhibitor: Dilucija u DMSO; 10 μl/jažici.
3H-Moenomicin: 8,5 MBq/ml; 8,9 μM; 12,5 pmola/ 100ul/ jažici.
Trizma hidroklorid SIGMA
Maleična kiselina MERCK
MgCl2 MERCK
NOG SIGMA (n-oktil β-D glukopiranozid)
NaCl MERCK
Pufer 1: Tris, maleat 10 mM; MgCl2 10 mM; NaCl 0,2 M; NOG 1%; pH 7,2
PES 10x GIBCO BRL
Tween 20 ACROS
Pufer 2: PBS 1x; Tween 20 0,5%
BSA CALBIOCHEM
Pufer 3: PBS 2x; BSA 2%
Brojač radioaktivnosti WALLAC Microbeta 1450
Primjer 2:
Protokol
2.1 Fiksiranje PBP1b na kuglice
Uzeti željenu količinu kuglica nakon što je otopina dobro protresena.
Razrijediti u omjeru 1/5 u vodi Milli-Q.
Razrijediti ponovno u omjeru 1/2 u puferu 3
Pripraviti otopinu PBP1b razrjeđenjem u puferu 1.
U vakutanerskoj cijevi, pomiješati (100 μl kuglica + 10 μl PBP1b) po broju jažica koje se koriste
Inkubirati tijekom 30 min na 37°C pri 250 okretaja/minuti.
2.2 Kompeticija 3H-obilježenog spoja / inhibitora
Pripravljanje radioinertnog Moenomicina za određivanje razine nespecifične veze:
Matična otopina od 1,58 mg/ml, u 1 mM pufera 2 (držati na -80°C)
Razrijediti navedenu matičnu otopinu u omjeru od 1/10, a zatim 1/5 u puferu 2.
Pripravljanje 3H-Moenomicina:
Matična otopina od 8,9 μM. Uzeti neophodan volumen za dobivanje otopine od 125 nM. Uparavati pod strujom tekućeg dušika. Ponovno obraditi sa konačnim volumenom pufera 2.
Pripravljanje inhibitora:
Razrijeđenja su pripravljana u DMSO. Početne koncentracije su takve da se inhibitor nalazi pohranjen u prikladnoj končanoj koncentraciji od 10 μl / jažici.
Na 96 jažičnoj prozirnoj ploči nalazi se:
10 -μl Moeno radioinertnog sredstva u jažicama sa razinom nespecifičnog vezanja.
10 μl inhibitora u ispitivanim jažicama.
100 μl 3H-Moeno u svim jažicama.
10 μl DMSO u jažicama bez proteina, razina maksimalnog vezanja, razina nespecifičnog vezanja.
Dva puta isprati kuglice/PBP1b u PBS lx; Tween20 0,5% kako bi se uklonio nevezani PBP1b.
Između svakog ispiranja/aspiracije, centrifugirati tijekom 5 min na 1000G pri sobnoj temperaturi.
Nakon zadnjeg centrifugiranja ponovno uzeti kuglice/PBP1b (110 μl po puferu 2) x broj jažica za obradu.
Položiti 110 μl kuglica / PBP1b po jažici.
Prekriti ploču plastičnim samoljepljivim filmom.
Inkubirati 1 noć na 4°C bez tresenja.
Inkubacija tijekom 24 h, 48 h kao i 72 sata na 4°C ne daje značajno različite rezultate.
Brojenje
Brojiti bez ispiranja i bez centrifugiranja na radioaktivnom brojaču.
Primjer 3:
Izračun
Izračunati postotak inhibicije fiksacije 3H-Moenomicina pri svakoj koncentraciji inhibitora obzirom na maksimalnu fiksaciju (jažice sa maksimalnom razinom vezanja).
Nacrtati krivulju % inhibicije = f([inhibitor] kako bi se odredila IC50.
Primjer 4:
Rezultati koncentracija
[početna] pmoli/jažici [završna]
kuglice 2 mg /ml 200 μg/100 μl 0. 9 mg /ml
PBP1b 500 nM 5 pmola/10 μl #24 nM
3H-Moenomicin 125 nM 12, 5 pmola/100 μl 57 nM
Inhibitori ± 1 mM ± 10 nmola/10 μl ± 45 μM
Primjer 5:
ispitivanje velikog broja uzoraka
Primjena postupka u skladu s izumom omogućava ispitivanje približno 500 000 spojeva u 5 dana, te selekciju približno 100. Dakle, postupak je brz, obrađuje se velik broj uzoraka i relativno je diskriminacijski.
Primjer 6:
Tricijacija moenomicina
U balon za tricijaciju volumena 1 cm3 uvodi se:
6 mg moenomicina što iznosi ~ 10 μmola.
300 μl metanola.
2 mg katalizatora paladija od 18% na drvenom ugljenu (Degussa tip E10N/D).
Položi se na ploču za ispitivanje, u vakuum pod tlak tricija.
Nakon povratka na 20°, trese se tijekom 15 minuta kako bi se dobio pad tlaka od 400 mBara što iznosi približno 20 μmola tricija (ukupni volumen tricija iznosi l cm3).
Nakon sakupljanja viška tricija, reakcijska smjesa se filtrira, koncentrira pod vakuumom, a ostatak se obrađuje sa 100 cm3 etanola i broji.
Dobiveno je: 1,1Ci (teoretski 20 μmola tricija : l,2Ci).
Produkt je analiziran HPLC u slijedećim uvjetima:
Simetričnost stupca C8 5 μ 3.9xl50mm
Solvent: Acetonitril/voda/TFA : 55/45/0,1,
Protok: 1 cm3/min
Detekcija: UV 220 nm i radioaktivnost.
Sastav smjese je slijedeći: nepromijenjeni produkt : 24% (UV),
monozasićeni : 29%,
dvostruko zasićeni : 28%
(dodatak do 100% radioaktivnosti: polizasićeni produkti).
Pročišćavanje na preparativnom stupcu:
Simetričnost stupca C8 7μ, 7.8x300mm.
Solvent: Acetonitril/voda/TFA : 55/45/0.1.
Protok: 4 cm3/min.
Detekcija: UV 220 nm i radioaktivnost.
Svojstva dva donosa:
Donos A: Ukupna aktivnost: 6,56GBq (177Ci).
Specifična aktivnost: l,9TBq/mmol (~2T/molu).
Aktivnost po volumenu: 37MBq/cm3 (Etanol na 5% vode).
Pohranjivanje: -80°C pod u inertnoj atmosferi.
Donos B: Ukupna aktivnost: 8,286GBq (233mCi).
Specifična aktivnost: 4,92TBq/mmol (~4.5T/molu).
Aktivnost po volumenu: 37MBq/cm3 (Etanol na 5% vode).
Pohranjivanje: -80°C pod u inertnoj atmosferi.
Claims (13)
1. Postupak identifikacije spoja sa sposobnošću vezanja na transglikozilacijsko mjesto rekombinantne glikozil transferaze, naznačen time, da obuhvaća slijedeće korake:
a) dovođenje u kontakt prethodno navedenog spoja sa prethodno navedenim rekombinantnim proteinom, prije, nakon ili istovremeno sa kontaktom navedenog rekombinantnog proteina s inhibitorom aktivnosti transglikozilacije, a navedeni je inhibitor označen uobičajenim markerom koji proizvodi izravno ili neizravno signal,
b) proučavanje povezanosti navedenog signala sa rekombinantnim proteinom, veza između spoja i transglikozilatnog mjesta potječe iz razlike signala dobivenog u koraku (b) i signala dobivenog u odsustvu navedenog spoja.
2. Postupak u skladu sa zahtjevom 1, naznačen time, da prethodno navedeni inhibitor predstavlja moenomicin.
3. Postupak u skladu sa zahtjevom 1 ili 2, naznačen time, da je navedeni rekombinantni protein fiksiran na krutu podlogu, prikladno na kuglice, osobito one koje nose nakupine bakra.
4. Postupak u skladu sa bilo kojim zahtjevom od 1 do 3, naznačen time, da navedeni marker predstavlja radioaktivno ili fluorescentno sredstvo.
5. Postupak u skladu sa bilo kojim zahtjevom od 1 do 4, naznačen time, da je dobiveni signal izmjeren na izravan način.
6. Postupak u skladu sa bilo kojim zahtjevom od 1 do 4, naznačen time, da je dobiveni signal izmjeren na indirektni način, na primjer putem SPA (Scintilacijski proksimitetni test) ili FRET (Prijenos energije fluorescentne rezonance).
7. Postupak u skladu sa bilo kojim zahtjevom od 1 do 4, naznačen time, da je izračunati signal rekombinantnog proteina dobiven na temelju mjerenja signala nevezanog proteina, u odnosu na ukupni početni signal.
8. Postupak u skladu sa bilo kojim zahtjevom od 1 do 7, naznačen time, da je navedeni inhibitor tricijacijom obrađen.
9. Postupak identifikacije produkta koji posjeduje antibakterijsko djelovanje, naznačen time, da sadrži slijedeće korake:
a) izvođenje postupka u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 8,
b) modifikacija odabranog produkta iz koraka a) dodavanjem ostataka na kemijsku strukturu,
c) ispitivanje modificiranog produkta u koraku b) in vitro i in vivo postupcima, na modelima za mjerenje antibiotske aktivnosti,
d) identifikacija produkta s visokim antibiotskim djelovanjem u odnosu na djelovanje produkta odabranog u koraku a).
10. Primjena spoja sa sposobnošću vezanja na transglikozilacijsko mjesto glikozil transferaze, koji posjeduje po mogućnosti antibiotsku aktivnost, a može se dobiti postupkom u skladu sa bilo kojim od zahtjeva 1 do 9, naznačenog time, da je namijenjen pripravljanju lijeka za liječenje bakterijskih infekcija.
11. Postupak pripravljanja tricijacijom obrađenog moenomicina, naznačen time, da obuhvaća fiksaciju tricija na jednu ili više dvostrukih veza postraničnog lanca moenomicina.
12. Moenomicin, naznačen time, da sadrži inkorporiranu molekulu tricija.
13. Postupak pripravljanja rekombinantne glikozil transferaze iz vektora koji sadrži gen za navedenu glikozil transferazu, naznačen time, da obuhvaća slijedeće korake:
a) fermentaciju stanice u koju je uveden navedeni vektor, u uvjetima koji omogućavaju produkciju rekombinantne glikozil transferaze,
b) pročišćavanje navedene rekombinantne glikozil transferaze, prikladno neionskim detergentom.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0111469A FR2829153B1 (fr) | 2001-09-05 | 2001-09-05 | Procede d'identification de composes liant une glycosyl transferase |
| PCT/FR2002/002989 WO2003020962A2 (fr) | 2001-09-05 | 2002-09-02 | Procede d'identification de composes liant une glycosyl transferase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20040216A2 true HRP20040216A2 (en) | 2004-08-31 |
Family
ID=8866977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20040216A HRP20040216A2 (en) | 2001-09-05 | 2004-03-04 | Method of identifying glycosyl transferase binding compounds |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050026214A1 (hr) |
| EP (1) | EP1427846A2 (hr) |
| JP (1) | JP2005501562A (hr) |
| AU (1) | AU2002341068A1 (hr) |
| FR (1) | FR2829153B1 (hr) |
| HR (1) | HRP20040216A2 (hr) |
| WO (1) | WO2003020962A2 (hr) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008021367A2 (en) | 2006-08-11 | 2008-02-21 | President And Fellows Of Harvard College | Moenomycin biosynthesis-related compositions and methods of use thereof |
| US8604004B2 (en) * | 2007-10-04 | 2013-12-10 | President And Fellows Of Harvard College | Moenomycin analogs, methods of synthesis, and uses thereof |
| TW200930817A (en) * | 2008-01-15 | 2009-07-16 | Academia Sinica | Expression of penicillin-binding proteins and application for high-throughput discovery of antibiotics thereof |
| US9902985B2 (en) | 2012-04-06 | 2018-02-27 | President And Fellows Of Harvard College | Chemoenzymatic methods for synthesizing moenomycin analogs |
| US9273084B2 (en) | 2012-04-06 | 2016-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Moenomycin analogs, methods of synthesis, and uses thereof |
| EP2850091A1 (en) * | 2012-04-06 | 2015-03-25 | President and Fellows of Harvard College | Methods and compounds for identifying glycosyltransferase inhibitors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2063316A1 (en) * | 1991-03-19 | 1992-09-20 | Larry C. Blaszczak | Dna and amino acid sequence of penicillin binding protein 2a from staphylococcus aureus strain 27r and derivatives for use in purification thereof and assay for compounds effective against methicillin resistant organisms |
| SE9404072D0 (sv) * | 1994-11-24 | 1994-11-24 | Astra Ab | Novel polypeptides |
| US5922540A (en) * | 1996-12-20 | 1999-07-13 | Eli Lilly And Company | Monofunctional glycosyltransferase gene of Staphylococcus aureus |
| US6461829B1 (en) * | 1999-03-03 | 2002-10-08 | The Trustees Of Princeton University | Bacterial transglycosylases: assays for monitoring the activity using Lipid II substrates analogs and methods for discovering new antibiotics |
-
2001
- 2001-09-05 FR FR0111469A patent/FR2829153B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-09-02 JP JP2003525663A patent/JP2005501562A/ja active Pending
- 2002-09-02 AU AU2002341068A patent/AU2002341068A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-02 EP EP02774894A patent/EP1427846A2/fr not_active Withdrawn
- 2002-09-02 US US10/489,034 patent/US20050026214A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-02 WO PCT/FR2002/002989 patent/WO2003020962A2/fr not_active Application Discontinuation
-
2004
- 2004-03-04 HR HR20040216A patent/HRP20040216A2/hr not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2829153A1 (fr) | 2003-03-07 |
| WO2003020962A2 (fr) | 2003-03-13 |
| EP1427846A2 (fr) | 2004-06-16 |
| AU2002341068A1 (en) | 2003-03-18 |
| FR2829153B1 (fr) | 2004-12-31 |
| US20050026214A1 (en) | 2005-02-03 |
| WO2003020962A3 (fr) | 2004-01-22 |
| JP2005501562A (ja) | 2005-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3753740B2 (ja) | インフルエンザウイルスの検出方法およびこれに用いる化合物 | |
| JP6942147B2 (ja) | Ｍｔ１−ｍｍｐに対して特異的な二環式ペプチド−毒素コンジュゲート | |
| Gademann et al. | Multiple toxin production in the cyanobacterium Microcystis: Isolation of the toxic protease inhibitor cyanopeptolin 1020 | |
| US7759459B2 (en) | Fluorescent assays for protein kinases | |
| US8367680B2 (en) | Antibacterial small molecules and methods for their synthesis | |
| Liu et al. | Synthesis and characterization of the arylomycin lipoglycopeptide antibiotics and the crystallographic analysis of their complex with signal peptidase | |
| CA2815381A1 (en) | Coelenterazine derivatives and methods of using same | |
| WO2002083933A2 (de) | Verfahren zur bestimmung der substratspezifität einer enzymatischen aktivität und vorrichtung hierzu | |
| Moreira et al. | The effect of replacing the ester bond with an amide bond and of overall stereochemistry on the activity of daptomycin | |
| Hayashi et al. | Kozupeptins, antimalarial agents produced by Paracamarosporium species: isolation, structural elucidation, total synthesis, and bioactivity | |
| HRP20040216A2 (en) | Method of identifying glycosyl transferase binding compounds | |
| NZ541667A (en) | The detection and identification of saxiphilins using saxitoxin-biotin conjugates | |
| CN108368051A (zh) | 三官能交联试剂 | |
| Bakka et al. | Methyl propiolate and 3-butynone: Starting points for synthesis of amphiphilic 1, 2, 3-triazole peptidomimetics for antimicrobial evaluation | |
| US20220281918A1 (en) | Pbp binding bicyclic peptide ligands | |
| Viht et al. | Fluorometric TLC assay for evaluation of protein kinase inhibitors | |
| US7169919B2 (en) | Process for preparing lipid II | |
| US20080269065A1 (en) | Conformationally Constrained Analytical Probes | |
| Brands et al. | Novel antibiotics for the treatment of gram-positive bacterial infections | |
| Sztaricskai et al. | A new series of glycopeptide antibiotics incorporating a squaric acid moiety | |
| US20180339972A1 (en) | Lactone-based probes and methods of use thereof | |
| Songok et al. | Structural modification of the tripeptide KPV by reductive “glycoalkylation” of the lysine residue | |
| EP1417223B1 (en) | Process for preparing lipid ii | |
| KR102273736B1 (ko) | 이중 인식 이광자 형광 프로브 및 이의 용도 | |
| CN111153962B (zh) | 一种血栓性血小板减少性紫癜病诊断探针及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| ARAI | Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application | ||
| OBST | Application withdrawn |