WO2003004597A1 - Dispositif de synthese de chaines glucidiques - Google Patents

Dispositif de synthese de chaines glucidiques Download PDF

Info

Publication number
WO2003004597A1
WO2003004597A1 PCT/JP2002/006642 JP0206642W WO03004597A1 WO 2003004597 A1 WO2003004597 A1 WO 2003004597A1 JP 0206642 W JP0206642 W JP 0206642W WO 03004597 A1 WO03004597 A1 WO 03004597A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reaction
separation means
sugar chain
sugar
flow path
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/006642
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kisaburo Deguchi
Genzo Hirata
Junkichi Miura
Masahito Ito
Shinichiro Nishimura
Susumu Nishiguchi
Atsushi Toda
Hiroaki Nakagawa
Kuriko Yamada
Kazuhito Fujiyama
Tatsuji Seki
Original Assignee
Hitachi, Ltd.
Toyobo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi, Ltd., Toyobo Co., Ltd. filed Critical Hitachi, Ltd.
Priority to US10/482,626 priority Critical patent/US6962809B1/en
Priority to JP2003510756A priority patent/JP4005557B2/ja
Priority to EP02743770A priority patent/EP1405905B1/en
Priority to DE60218043T priority patent/DE60218043T2/de
Publication of WO2003004597A1 publication Critical patent/WO2003004597A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Definitions

  • the present invention relates to a sugar chain synthesizing apparatus for automating the synthesis and separation of sugar chains.
  • Glycoconjugates in cells play an important role in signal transmission and discrimination between cells, for example, recognition of viruses, cancer cells, and blood types. Elucidation of sugar chain functions is one of the targets of bost genome research. It is positioned as one.
  • the target sugar chains are sequentially synthesized while protecting the O H groups other than the O H groups to be chemically bonded, and thus the reaction steps are complicated.
  • the method (2) a desired sugar chain can be obtained in a large amount, but the subsequent purification process is complicated.
  • the method (3) has been developed as a method for overcoming the complexity of the above (1) and (2), and is disclosed, for example, in Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-42096. It is a thing.
  • selective glycosyltransferase is used. It is not necessary to protect the OH group as in (1) for the synthesis described above. Also, since there are few by-products, the purification process after synthesis is easy.
  • bioactive proteins are glycoproteins, and the sugar chains to be bound differ depending on the host, and the activity may be lost or may be significantly reduced.
  • the sugar chain to be bound changes, but it does not always change to the desired one.
  • the method (B) is desirable.
  • a method utilizing the transglycosylation reaction of endodaricosidase for example, there is JP-A-5-64594. Examples of the method using exozolicosidase and glycosyltransferase include the method disclosed in Eur. J. Biochem. 191: 71-73 (1990).
  • each method only modifies the sugar residue at the non-reducing terminal at most, and cannot be said to be a full-scale modification of the sugar chain.
  • the method is disclosed in J. Am. Chem. Soc., 119: 2114-2118 (1997).
  • N- remaining on the protein after hydrolysis with endoglycosidase The sugar chain is extended to the non-reducing end of the acetyltilcosamine residue by a glycosyltransferase, and the sugar chain is modified into a glycoprotein to which a sialyl Lewis X4 sugar is bound. This is the non-reducing terminal portion of, which is insufficient in modifying the entire sugar chain.
  • An object of the present invention is to provide a sugar chain synthesizing apparatus capable of easily synthesizing a sugar chain.
  • a characteristic feature of the present invention is that one or a plurality of reaction columns on which a glycosyltransferase and / or a carbohydrate hydrolase are immobilized, and an eluate from the reaction column which is disposed downstream of the reaction column Reaction products and unreacted And one or a plurality of separation means for separating the by-products and by-products, and further provided with a circulation flow path for selectively and repeatedly circulating them.
  • in order to bind or dissociate a saccharide to or from a water-soluble polymer primer it is possible to easily send the saccharide bound to the primer to a reaction column necessary for a target reaction. It becomes possible. Therefore, desired sugar chains can be easily synthesized.
  • FIG. 1 is a system configuration diagram of the first embodiment.
  • FIG. 2 is a flow chart of the sugar chain synthesizing apparatus of Example 1.
  • FIG. 3 is a modification of the first embodiment.
  • FIG. 4 is a system configuration diagram of the second embodiment.
  • FIG. 5 is a flow chart of the sugar chain synthesizing apparatus of Example 2.
  • FIG. 6 is a system configuration diagram of the third embodiment.
  • FIG. 7 is a flow chart of the sugar chain synthesis device of the third embodiment.
  • FIG. 8 is a system configuration diagram of the fourth embodiment.
  • FIG. 9 is a flow chart of the sugar chain synthesizing apparatus of Example 4.
  • FIG. 10 is a diagram showing a configuration example of an ultrafiltration column. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • FIG. 1 is a system configuration diagram of the present embodiment.
  • the sugar chain synthesizing system is a pump that has a function of selecting a plurality of solvents, mixing them over time, and sending the solution while changing the composition of the sending solvent (a so-called low-pressure gradient function).
  • Valves 3 to 8 for switching channels, reaction columns 18 to 20, separation columns 21 to 23, consists of detectors 9 and 10 for detecting reaction products, and a controller 11 for controlling them.
  • a refractive index detector (RI), an ultraviolet-visible spectral detector (UV), and a diode array absorbance detector (DAD) are used to monitor the product.
  • RI refractive index detector
  • UV ultraviolet-visible spectral detector
  • DAD diode array absorbance detector
  • MS mass spectrometer
  • NMR nuclear magnetic resonance apparatus
  • reaction column may be a glycosyltransferase (eg, galactose transferase, N-acetyldarcosamine transferase, N-acetylgalactosamine transferase, fucose transferase, sialyltransferase, mannose transferase, etc.).
  • a glycosyltransferase eg, galactose transferase, N-acetyldarcosamine transferase, N-acetylgalactosamine transferase, fucose transferase, sialyltransferase, mannose transferase, etc.
  • carbohydrate hydrolase eg, mannosidase, galactosidase, fucosidase, sialidase, xylosidase, etc.
  • reaction column is referred to as a reaction column Rn.
  • the reaction product is a primer of a water-soluble polymer (for example, biopolymers such as proteins, glycoproteins, glycopeptides, lipids, glycolipids, oligosaccharides, and polysaccharides, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-42096).
  • Synthetic polymers such as polyacrylamide derivatives described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-220399, and more preferably those having a molecular weight of 10,000 or more. ), And those in which sugars (s n ) are chemically bonded (hereinafter referred to as primers (P_Sschreib)).
  • a column having a function of separating a reaction product from a sugar nucleotide, a nucleotide, or a monosaccharide or an oligosaccharide generated by hydrolysis is used.
  • gel filtration chromatography And column chromatography using methods such as ion exchange chromatography, anion exchange chromatography, affinity chromatography, dialysis, and ultrafiltration.
  • FIG. 2 is a flow chart of the present embodiment.
  • bottle 13 is a primer (P)
  • bottle 14 is a buffer solution
  • bottles 15 to 17 are sugar nucleotide solutions (for example, peridine- 15 , monophosphogalactose, peridine-5′-diphospho N).
  • sugar nucleotide solutions for example, peridine- 15 , monophosphogalactose, peridine-5′-diphospho N.
  • bottles 15 to 17 are sugar nucleotide solutions (for example, peridine- 15 , monophosphogalactose, peridine-5′-diphospho N).
  • the bottle is hereinafter referred to as Xn-Sn.).
  • Bottle 12 is a preparative bottle (FC: fraction collector), and drain (1) and drain (2) are drain bottles.
  • the primers P a sugar S 1; S 2) S 3 is, P - S x - S 2 - assumed to be combined in the order of S a.
  • the reaction column is a column to which glycosyltransferase is immobilized.
  • the order of the sugars S 2 , S 3 is not limited, and:? Repeat of-3 1 -3 2 -3 1 -3 3 and clouds ivy S is possible.
  • reaction column 19 or 20 To replace ⁇ with another The routes, ie, the reaction column and the separation means (hereinafter referred to as the separation column), are expanded to four rows. The same applies to the case of continuous repetition of S 2 (or S 3 ).
  • the separation column When dissociating sugars, add a column on which the carbohydrate hydrolase is immobilized to the reaction column. A sugar nucleotide solution is not required for treatment with a column on which carbohydrate hydrolase is immobilized.
  • this device When reacting in the order of P _ S — S 2 — S 3 , this device basically consists of the following 10 steps.
  • Step 1 Introduction and reaction of primer (P) and sugar nucleotide (X—) on reaction column 18 (R t ).
  • Step 3 Introduction of primer ( ⁇ — and sugar nucleotide (X 2 — S 2 ) into reaction column 19 (R 2 ).
  • Step 4 Reaction of primer (P—SJ and sugar nucleotide (X 2 —S 2 ) and separation column 21 (C washing.
  • Step 5 Separate the unreacted sugar nucleotide (X 2 —S 2 ) and nucleotide (X 2 ), a reaction by-product, with the separation column 22 (C 2 ) from the primer (P—Si—S 2 ).
  • Step 7 Reaction of the primer (P—S—S 2 ) with the sugar nucleotide (X 3 —S 3 ) and washing of the separation column 22 (C 2 ).
  • Step 8 Separation of unreacted sugar nucleotide (X 3 —S 3 ) and nucleotide (X 2 ), a by-product of the reaction, with the primer (P—S—S 2 —S 3 ) using column 23 (C 3 ) .
  • Step 9 Preparing the primers (P— — S 2 — S 3 ) (FC).
  • Step 10 Wash separation column 23 (C 3 ).
  • Table 1 shows the position of each valve in each step.
  • valves 101 to 106 are “closed” except for “open”.
  • Valves 3 to 5 (V) indicate the connected position as “P1" to "P4", and valves 6 to 8 (W) indicate whether they are on the detector side or on the drain side. Shown as "Detect” or "D”.
  • Xi—Introduction amount of Si (ml) flow rate (m 1 Zmin) X time (rain)... [2] Assuming the same liquid sending time, the primer (P) and sugar nucleotide (X x -S x ) The ratio is determined by the flow ratio. For example, when 50% Z50%, the flow rate of pump 1 is equal to the flow rate of pump 2.
  • reaction column 1 8 which is a reaction product of R primer (P- and unreacted sugar nucleotide (X a - S x) and reaction by-products of the nucleotides (X, sugar nucleotides ( — Sugar (without SJ) from SJ is led to separation column 21 (C) for separation.
  • R primer P- and unreacted sugar nucleotide
  • X sugar nucleotides
  • C separation column 21
  • reaction column 19 R 2
  • the flow rate is decreased, and the reaction is continued for a certain time, for example, at a flow rate of Om1 / rain.
  • the buffer 1 is sent to the reaction column only by the pump 2.
  • the pump 12 continues the flow of the buffer 14 to the separation column 23 (C 3 ), and the unreacted sugar nucleotide (X 3 — S 3 ) retained on the column and the reaction by-product nucleotide (X 3 ) From the column.
  • FIG. 3 shows a modification of this embodiment.
  • FIG. 3 is a flow diagram when a detector 10 is added.
  • the detector 10 is connected upstream of the detector 9 via a splitter (Sp), and obtains a molecular structure of a component eluted from each separation column.
  • Sp splitter
  • the preparation procedure for sugar synthesis can be performed in the same manner as in FIG.
  • the detector 10 that detects information on the molecular structure of the reaction product is provided, so that it is possible to confirm whether or not the synthesis reaction was performed as expected for each reaction. . If the reaction yield does not reach the expected level, the next synthesis reaction is stopped, which has the effect of eliminating wasted reaction reagents and time.
  • the switching of the flow path by each valve is performed based on the detection result of the detector 9, but the scheduled sugar modification processing is performed, and the reaction is performed in advance. If the passage time of the eluate in the column or the separation column is known, the switching of each valve may be controlled by the passage of time without depending on the result of the detector 9.
  • FIG. 4 is a system configuration diagram of the present embodiment.
  • the sugar chain synthesizing unit has pumps 1 2 2 4 2 7 (six units) that have the function of sending each solvent in the bottles 13 17 at a constant flow rate for a fixed time. It consists of valves 3 to 8 (six) for switching the path, detectors 9, 10 (two) for detecting reaction products, and a controller 11 for controlling these.
  • the detectors 9, 10 used in the present embodiment are the same as those in the first embodiment.
  • FIG. 5 is a flow chart of the present apparatus. Note that this flow chart shows a case where one detector is used.
  • the six pumps 1, 2, 24 to 27 send the solutions of bottles 13 to 17 at a constant flow rate and for a fixed time, respectively, under the control of the controller 11.
  • the difference from Example 1 is that the sugar nucleotide solution (X “S 2 -S 2 , X 3 -S 3 ) was directly supplied to the reaction column 18 to 20 (R ⁇ R 2 , R 3 ).
  • the pumps 1 and 2 only send the same buffer 14, and a so-called low-pressure gradient function is not required.
  • pumps 25, 26, and 27 send sugar nucleotide solutions (X—SX 2 —S 2 , X 3 —S 3 ) to reaction columns 18 to 20 without passing through the respective solenoid valves. Therefore, opening and closing of the solenoid valves is different from the low pressure gradient function which is synchronized with the suction process of the pump, more precisely, primer one (P) and sugar nucleotide solution (Xi- x 2 - s 2, x 3 - There is an effect that it is possible to control the time during which s 3 ) is fed.
  • FIG. 6 is a system configuration diagram of the present embodiment.
  • Two pumps having the function of sending buffers (B1, B2) 14 and 30 at a constant flow rate and for a fixed time, a sample injector 28 that introduces the primer (P) 13 into the flow path 28, a sugar Nucleotide solution (X — S 1; X 2 — S 2 , X 3 — S 3 )
  • Sample injector 29 for introducing 15, 15, 16, 17 into the flow path
  • valve 3 for switching the flow path ⁇ 8 (6 units)
  • the detectors 9 and 10 used in this embodiment are the same as those in the first embodiment.
  • FIG. 7 is a flow chart of the present apparatus. This flow chart shows a case where one detector is used.
  • the two pumps 1 and 2 can use buffers 14 and 30 (the buffers need not always be provided for each pump, and a common buffer can be used.
  • the solution is sent at a constant flow rate for a certain period of time.
  • the primer (P) a sugar nucleotide solution (Xi- S, X 2 - S 2> X 3 - S 3) is introduced into the flow path using a sample injector 2 8, 2 9, the reaction column 1 8, 1 9, 2 0 (R ⁇ , R 2, R 3), is to be sent by Bruno Ffa 1 4 (or buffer 3 0).
  • the pumps 1 and 2 only feed the buffer 14 or the buffer 30 and do not need a so-called low-pressure gradient function.
  • the primer (P) and the sugar nucleotide solution (X 1 -S 1, x 2 -S 2 , x 3 -s 3 ) are introduced into the channel via the sample injector in required amounts. Therefore, unlike the low pressure gradient function in which the opening and closing of the solenoid valve is synchronized with the pump suction process, the primer (P) and the sugar nucleotide solution (x — s x 2 — s 2 , x 3 — s 3 ) This has the effect that wasteful consumption can be eliminated.
  • FIG. 8 is a system configuration diagram of the present embodiment
  • FIG. 9 is a flow diagram.
  • either one detector or two detectors may be used. If the analysis time has already been set, the control may be performed without using the detector.
  • the difference from Example 3 is that the separation columns and valves connected in series to the respective reaction columns are combined into one separation column. Another difference is that an ultrafiltration column 40 was used as the separation column.
  • a non-revolution 41 is provided in place of the valves 6 to 8 by sharing the separation force ram.
  • the configuration of the ultrafiltration ram 40 is shown in FIG.
  • the ultrafiltration ram 40 has a cylindrical ultrafiltration membrane 48 inside, and also discharges components having a large molecular weight that do not pass through the membrane among the components introduced from the inlet 45. There are two outlets, one outlet 47 for discharging the components passing through the membrane, and the other outlet 46 for discharging the components passing through the membrane.
  • the ultrafiltration membrane 48 is selected so that, for example, the primer does not pass and the sugar nucleotide—nucleotide passes.
  • the molecular weight of the primer is about 10 000 or more, and the molecular weight of the sugar nucleotide ⁇ nucleotide is about 400. Because of this, there are considerable differences in size and they are easily separable.
  • a three-way valve 42 Downstream of the discharge port 47, a three-way valve 42 is provided. This valve is configured to selectively communicate the flow path on the detector side with one of the outlets 46 and 47. The flow path of the discharge port on the side that is not communicated is blocked by the valve.
  • this ultrafiltration column 40 Separation on this ultrafiltration column 40 is performed as follows. That is, when the eluate from the reaction column is introduced, the three-way valve 42 is set to the outlet 46 side, and only the permeate through the ultrafiltration membrane 48 is discharged. The high molecular weight primer and the sugar bound to the primer remain on the ultrafiltration membrane 48 ⁇ . After a lapse of a predetermined time, when the three-way valve 42 is switched to the outlet 47 side, the primer and the sugar bound to the primer accumulated in the ultrafiltration membrane 48 are discharged to the detector side.
  • the operation in this embodiment is basically common to the operation shown in the first embodiment. You. Although the separation column is shared, the valve 41 is switched to the flow path on the dotted line at the timing when the valves 6 to 8 in Example 1 are switched to the drain. The same operation as in Example 1 can be realized.
  • the configuration of the apparatus can be simplified by using a common separation column. Also, by using an ultrafiltration column as the separation column, the primer (P) is once concentrated in the ultrafiltration column. Accordingly, the problem of the broadening of the primary (P) band as described in Step 3 of Example 1 is eliminated, and there is an effect that introduction into the next reaction column is facilitated.
  • the present invention is applied to a sugar chain synthesizing apparatus, synthesis or separation of a sugar chain can be easily performed.

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

明細書
技術分野
本発明は、糖鎖の合成， 分離処理の自動化を図るための糖鎖合成装置 に関する。 背景技術
細胞内における複合糖質は、 情報伝達や細胞間の識別、 例えば、 ウイ ルス， がん細胞， 血液型の認識等の重要な役割を果たしており、 糖鎖の 機能解明はボストゲノム研究のターゲットの一つに位置付けられてい る。
しかしながら、 オリゴ核酸やペプチド合成法は、すでに確立され自動 ィ匕されているが、 糖鎖合成法は、 まだ多くの課題を残している。 糖鎖の 機能解明に向けて、糖鎖合成法の確立と、 効率的な合成装置の実現が望 まれており、 現在、 以下の 3つの糖鎖合成の方法が行なわれている。
( 1 ) 化学合成による方法
( 2 ) 遺伝子組換え細胞あるいは微生物による発酵法
( 3 ) 糖転移酵素を用いて合成する方法
前記 （1 ) の方法は、 化学結合させる O H基以外の O H基を保護しな がら、 目的とする糖鎖を順次合成するため、反応ステップが多く複雑に なる。 前記 （2 ) の方法は、 目的の糖鎖を大量に得ることができるが、 その後の精製過程が複雑である。
前記 （3 ) の方法は、 上記 （1 )， ( 2 ) の複雑さを克服する方法とし て開発されたものであり、例えば、特開平 1 1— 4 2 0 9 6号公報に開 示されたものである。 この （3 ) の方法では、 選択的な糖転移酵素によ る合成のため、 （1 ) のような O H基を保護する必要はない。 また、 副 産物も少ないので、 合成後の精製過程も容易である。
また近年、遺伝子組換え技術の発達により生理活性蛋白質を容易に調 製できるようになった。 しかし、大半の生理活性蛋白質は糖蛋白質であ り、 宿主により結合する糖鎖が異なり、 活性が失われたり、 著しく低下 することがある。
もし、この異なってしまった糖鎖を元の糖鎖に改変できる方法があれ ば、 非常に有用である。 また、 もともと結合していた糖鎖とは異なる糖 鎖に改変することにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立つこ とが期待される。 糖蛋白質糖鎖を改変する方法としては、 大きく分けて 2つの方法が現在採られている。
(A) 宿主の変更、糖転移酵素遺伝子の宿主への導入により改変した 宿主を利用した発酵法
( B )得られた糖蛋白質のェンドあるいはェキゾグリコシターゼと糖 転移酵素を利用した発酵法
(A) の方法では、 結合する糖鎖は変わるが、 必ずしも望むものに変 わるとは限らない。 特定の糖鎖に改変するためには （B ) の方法が望ま しい。 エンドダリコシターゼの糖転移反応を利用した方法としては、例 えば、特開平 5— 6 4 5 9 4号公報などがある。 ェキゾダリコシターゼ と糖転移酵素を用いる方法としては、 例えば、 Eur. J. Biochem. 1 9 1 ： 7 1 - 7 3 ( 1 9 9 0 ) などに開示されている方法がある。
しかしながら、いずれの方法もせいぜい非還元末端の糖残基を改変す る程度であり、 本格的な糖鎖の改変とはいえない。 また、 エンドグリコ シターゼと糖転移酵素を用いる方法もあり、 例えば、 J . Am. Chem. Soc. , 119:2114-2118 ( 1 9 9 7 ) にその方法が開示されている。 ここ では、 エンドグリコシターゼで加水分解した後、 蛋白質上に残った N— ァセチルダルコサミン残基の非還元末端に糖転移酵素により糖鎖を伸 長させ、 シァリルルイス X 4糖が結合した糖蛋白質へ改変しているが、 結合している糖鎖は、糖蛋白質糖鎖の非還元末端部分であり、糖鎖全体 を改変するという点では不十分である。
糖鎖合成装置に関しては、特表平 5 _ 5 0 0 9 0 5号公報に開示され たものがある。 発明の開示
上記 （3 ) あるいは （B ) の方法を用いる糖鎖の合成を実際の装置を 用いて実現する際、 現在は、 各ステップ毎に、 生成物の分離精製を行い 、 その後、 次の反応に進むと云うバッチ方式で行われており、 全ての処 理を行うためには、 必ず人の手を介していた。
上記特表平 5— 5 0 0 9 0 5号公報に開示されている装置では、糖転 移酵素を用いて単糖、 オリゴ糖、 糖蛋白質などを基質に糖鎖を伸長させ ることが可能になるが、反応させる糖の順序に応じて、反応カラムおよ び分離精製手段を、 シリーズに、 連続的に連結することが必要になる。 即ち、 同種の糖を繰り返し反応させる場合であっても、 その数だけ反応 カラムおよび分離精製手段も必要となり、装置が大掛かりなものになる と云う問題がある。 また、糖鎖合成を自動的に連続して行う方法が示さ れていない。 さらに、 用いる酵素は、 糖転移酵素のみであり、 糖質加水 分解酵素を用いるようにはなっていない。
本発明の目的は、糖鎖の合成を容易に行うことのできる糖鎖合成装置 を提供することである。
本発明の特徴的な構成は、 糖転移酵素及び/または糖質加水分解酵素 を固定化した一つまたは複数の反応カラムと、当該反応カラムの下流側 に配置され、前記反応カラムからの溶出液中の反応生成物と未反応およ び副産物を分離する一つまたは複数の分離手段を備え、 更に、 これらを 選択的に繰り返し循環させるための循環流路を備えたものである。 本発明においては、 水溶性ポリマーのプライマーに対して糖を結合、 または、 解離させるために、 プライマーに結合した糖を、 目的の反応に 必要な反応カラムに対して、 容易に送液することが可能となる。 したが つて、 所望の糖鎖の合成を容易に行うことができる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 実施例 1のシステム構成図である。
第 2図は、 実施例 1の糖鎖合成装置の流路図である。
第 3図は、 実施例 1の変形例である。
第 4図は、 実施例 2のシステム構成図である。
第 5図は、 実施例 2の糖鎖合成装置の流路図である。
第 6図は、 実施例 3のシステム構成図である。
第 7図は、 実施例 3の糖鎮合成装置の流路図である。
第 8図は、 実施例 4のシステム構成図である。
第 9図は、 実施例 4の糖鎖合成装置の流路図である。
第 1 0図は、 限外ろ過カラムの構成例を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
〔実施例 1〕
図 1は、 本実施例のシステム構成図である。
糖鎖合成装置は、 複数の溶媒を選択し、 時間と共にそれら溶媒を混合 しながら、 かつ、 送液溶媒の組成を変えながら送液できる機能 （いわゆ る低圧グラジェント機能） を有するポンプ 1 , 2、 流路を切り替えるた めのバルブ 3〜 8 ( 6台）、 反応カラム 1 8〜2 0、 分離カラム 2 1〜 23， 反応生成物を検出する検知器 9, 1 0、 そして、 これらを制御す るコントローラ 1 1により構成されている。
本装置で用いる検知器 9には、生成物をモニターするために、例えば 、 屈折率検知器 （R I ), 紫外可視分光検知器 （UV), ダイオードァレ ィ吸光度検知器 （DAD) が用いられる。 検知器 1 0には、 分子構造情 報を得るために、 ダイオードアレイ吸光度検知器 （DAD)、 質量分析 計 （MS)、 核磁気共鳴装置 （NMR) が用いられる。
また、 反応カラムは、 糖転移酵素 （例えば、 ガラク トース転移酵素、 N -ァセチルダルコサミン転移酵素、 N-ァセチルガラク トサミン転移酵 素、 フコース転移酵素、 シアル酸転移酵素、 マンノース転移酵素等） あ るいは糖質加水分解酵素 （例えば、 マンノシダーゼ、 ガラクトシダーゼ 、 フコシダーゼ、 シァリダーゼ、 キシロシダーゼなど) を固定化したも のである。 糖転移酵素を固定化したカラムを用いれば、糖鎖に新たな糖 を結合させて伸長させることができ、糖質加水分解酵素を固定化した力 ラムを用いれば、糖鎖から所定の糖を解離させる （切り離す） ことが可 能になる。 本実施例では、 反応カラム Rnと称す。
また、 反応生成物とは、 水溶性ポリマーのプライマー （例えば、 蛋白 質、 糖蛋白質、 糖ペプチド、 脂質、 糖脂質、 オリゴ糖、 多糖などの生体 高分子や、特開平 1 1一 42096号公報ゃ特開 200 1— 220 3 9 9号公報に記載されているポリアクリルアミ ド誘導体等の合成高分子 であり、 分子量 10000以上のものが更に望ましい。 本実施例では、 以下、 プライマー （P) と呼ぶ） と、 糖 （sn) が化学結合したもの （ 以下、 プライマー （P_S„) と称す。） を云う。
また、 分離カラムとしては、 反応生成物と糖ヌクレオチド、 ヌクレオ チド、あるいは加水分解により生じた単糖やオリゴ糖とを分離できる機 能を有するものを用いる。例えばゲルろ過クロマトグラフィー、 陽ィォ ン交換クロマトグラフィー、 陰イオン交換ク口マトグラフィー、 ァフィ 二ティークロマトグラフィー、透析、 限外ろ過などの方法を用いたカラ ムが挙げられる。
図 2は、 本実施例の流路図である。
ポンプ 1, 2は、 ボトル 1 3〜 1 7内の溶液を送液する。 ここで、 ボ トル 1 3はプライマー （P)、 ボトル 14はバッファー溶液、 そして、 ボトル 1 5〜 1 7は糖ヌクレオチド溶液 （例えば、 ゥリジン一 5，一ジ ホスホガラク トース， ゥリジン一 5'—ジホスホー N—ァセチノレグノレコ サミン， ゥリジン一 5'—ジホスホー N—ァセチルガラク トサミン、 グ ァノシン一 5 '―ジホスホフコース、 グアノシン一 5，ージホスホマンノ ース、 シチジン一 5'—モノホスホ- N-ァセチルノイラミン酸等。 本実 施例では、 以下、 Xn— S nと称す。） を入れたボトルである。
各ボトノレには、 ポンプに内蔵されているソレノィ ドバルブ 1 0 1〜 1 06がそれぞれ割り当てられており、このバルブが開になった溶液がポ ンプで送液される。 また、 ボトル 1 2は分取用ボトル （FC ：フラクシ ヨ ンコレクタ一）、 ドレイン （1)， ドレイン （ 2) はドレインボトノレで ある。
図 2に基づき本装置の動作を説明する。
ここでは、 プライマー Pと糖 S 1; S 2) S3は、 P - S x- S 2- S a の順序で結合させるものと仮定する。 また、 反応カラムは、 糖転移酵素 を固定化したカラムを用いるものとする。 し力 し、 実際には、 糖 S 2, S 3の順序には制限はなく、 また、 ：？ー31—32—31—33と云 つた S の繰り返しも可能である。
但し、 P— S — S iと云うように同じ糖 S の繰り返しが連続する場 合は、 ボトル 1 6か 1 7を糖ヌクレオチド — に入ったものに置 き換え、 さらに反応カラム 1 9か 20を に置き換える力 \ もう 1流 路、 即ち、 反応カラムおよび分離手段 （以下分離カラムと呼ぶ） を 4列 に拡張する。 S 2 (または S 3) の連続繰り返しの場合も同様である。 また、 糖の解離を行う場合は、 反応カラムに糖質加水分解酵素を固定 化したカラムを加える。糖質加水分解酵素を固定化したカラムでの処理 については、 糖ヌクレオチド溶液は必要としない。
P _ S — S 2— S 3の順序で反応させる場合、 本装置は基本的には、 次の 1 0ステップからなる。
ステップ 1 ： プライマー （P) および糖ヌクレオチド （X — の反応カラム 1 8 (Rt) への導入と反応。
ステップ 2 ：プライマー （P— と未反応の糖ヌクレオチド （X
1- S 1) 及び反応副産物であるヌクレオチド (Χα) を分離カラム 2 1 (C J で分離。
ステップ 3 ： プライマー （Ρ— と糖ヌクレオチド （X2— S 2) の反応カラム 1 9 (R2) への導入。
ステップ 4 ：プライマー （P— S J と糖ヌクレオチド （X2— S 2) の反応と分離カラム 2 1 (C の洗浄。
ステップ 5 ： プライマー （P— S i— S 2) と未反応の糖ヌクレオチ ド （X2— S 2) 及び反応副産物であるヌクレオチド （X2) を分離カラ ム 2 2 (C2) で分離。
ステップ 6 ： プライマー ( P— S Ί— S 2 ) と糖ヌクレオチド (X3- S 3) の反応カラム 2 0 (R 3) への導入。
ステップ 7 ：プライマー （P— S — S 2) と糖ヌクレオチド （X3— S 3) の反応と分離カラム 2 2 (C2) の洗浄。
ステップ 8 ：プライマー （P— S — S 2— S 3) と未反応の糖ヌクレ ォチド （X3— S 3) 及び反応副産物であるヌクレオチド （X2) を分離 カラム 2 3 (C3) で分離。 ステップ 9 ： プライマー （P— — S2— S3) の分取 （FC)。 ステップ 1 0 ：分離カラム 23 (C3) の洗浄。
以下、 図 2に基づき各ステップの詳細を説明する。 また、 表 1に各ス テツプにおける各バルブの位置について示す。
表 1
(実施例 1 )
Figure imgf000011_0001
尚、 表 1において、 バルブ 101〜106は、 "開" 以外は、 全て "閉" である。 また、 バルブ 3〜5 (V) は、 接続されるポジション位置を " P 1" 〜 "P 4" として示し、 バルブ 6〜 8 (W) は、 検出器側である かドレイン側であるかを "検" または "D" として示している。
<ステップ 1の説明〉
( 1 ) ポンプ 1のバノレブ 1 0 1， ポンプ 2のバルブ 1 04を開き、 バルブ 3， 5を、 それぞれポジション （2) に接続し、 プライマー （P ) と糖ヌクレオチド （Xi— S . を反応カラム 1 8 (RJ に導入する 。 導入量は、 式 （1) および （2) で示すように流量と送液時間で決ま る。
Pの導入量 （nil) =流量 （mlZmin) X時間 （ηήη) … 〔1〕
Xi— S iの導入量 （ml) =流量 （m 1 Zmin) X時間 （rain) … 〔2〕 送液時間を同じとした場合、 プライマー （P) と糖ヌクレオチド (X x- S x) の比率は、 流量比率で決まる。 例えば、 5 0%Z50 %のと き、 ポンプ 1の流量 =ポンプ 2の流量となる。
(2) ポンプ 1のバルブ 1 0 2， ポンプ 2のバルブ 1 0 3を開き、 バッファー 1 4を同じ流量で流して、 プライマー （P) と糖ヌクレオチ ド — を反応カラム 1 8 (R に導入する。 その後、 流量を 下げ、 例えば、 流量 = 0 m 1 /minで一定時間反応を継続させる。
くステップ 2の説明〉
反応終了後、 ポンプ流量を上げて、 反応カラム 1 8 (R における 反応生成物であるプライマー （P— と未反応の糖ヌクレオチド （ Xa- S x) および反応副産物のヌクレオチド （X 、 糖ヌクレオチド （ — S J から糖 （S J が外れたもの） を分離カラム 2 1 (C に 導き、 分離する。 分離モードとして、 例えば、 以下のものが考えられる。
(a) ゲルろ過： プライマー （P— S J の分子量が G PCカラム の排除限界を超えているならば、 糖ヌクレオチド （X — S ^ ゃヌク レオチド （X^ より早く溶出する （保持容量が小さい）。
(b) 陰イオン交換： 中性であるプライマー （P— は保持さ れないが、 陰イオンである糖ヌクレオチド （X — ゃヌクレオチ ド （XJ はカラムに保持されることから溶出が遅れる。
(c) 陽イオン交換： 中性であるプライマー （P— S J は保持さ れないが、 陰イオンである糖ヌクレオチド （X — S ゃヌクレオチ ド （x はイオン排除されることにより、 溶出が早まる。
(d) 限外ろ過：分子サイズが小さい未反応糖ヌクレオチドゃ反応 副産物であるヌクレオチドをろ過し、分子サイズが大きいプライマーと 分離する。
以下のステップは、 分離モード （b) を用いた場合のものである。 <ステップ 3の説明 >
(1) プライマー （P— が検知器 9で検出されたら、 バルブ 4 を反応カラム 1 9 (R2) のポジション （3) に切り替えると共に、 バ ルブ 7をドレイン側に切り替える。 同時に、 ポンプ 2のバルブ 1 05を 開き、 且つバルブ 5を反応カラム 1 9 (R2) のポジション （3) にし て、 糖ヌクレオチド （X2— S2) を送液する。 もし、 糖ヌクレオチド (X2- S 2) の比率が 50%ならば、 ポンプ 1， 2の流量は同じとす る （ステップ 1と同じ）。
導入は、 プライマー （P— が検出終了するまで行う。 もし、 プ ライマー （P— の容積がバンドの拡がりによって、 ポンプ 1 , 2 の流量 X導入時間が反応カラム 1 9 (R2) の容積を超えてしまう場合 は、 導入を途中で止め （ポンプ流量 =0)、 導入された分を一旦、 反応 させた後、 残り分を再導入する必要がある。
(2) プライマ一 (P - S が、 反応カラム 1 9 (R 2) に移行し 終わったら、 バルブ 4をドレインポジション （1) に、 また、 ノ ルブ 7 を元に戻す。バルブ 1 0 3を開いてポンプ 2の送液する溶液をバッファ 一 1 4に切り替えてプライマー （P— と糖ヌクレオチド （X2—
S 2) を、 全て反応カラム 1 9 (R2) に導入する。 その後、 流量を下 げて、 例えば、 流量 = Om 1 /rainで一定時間反応を継続する。 このと き、 反応カラムへのバッファ一の送液は、 ポンプ 2のみで行う。
くステップ 4の説明〉
プライマー （P— と糖ヌクレオチド （X2— S 2) が反応カラム 1 9 (R2) で反応している間に、 ポンプ 1は、 バッファー 1 4を分離 カラム 2 1 (C に流し続け、 カラムに保持されている未反応糖ヌク レオチド — S J と反応副産物のヌクレオチド （XJ をカラムか ら洗い出す。
くステップ 5の説明〉
プライマー (P- s α) と糖ヌクレオチド (x2- S 2) の反応終了後 、 バルブ 3をポジション （3) にする。 ポンプ 1， 2によってバッファ 一 1 4の流量を上げて、 プライマー （Ρ— S — S J と未反応の糖ヌ クレオチド （X2_ S 2)、 および反応副産物のヌクレオチド （X2) を 分離カラム 2 2 (C2) 内で分離する。
くステップ 6の説明 >
(1 ) プライマー （P— S i— S 2) が検知器 9で検出されたら、 バルブ 4をポジション （4) に切り替え、 同時に、 バルブ 8をドレイン ポジション (2) 側に切り替える。 同時に、 バルブ 5をポジション (4 ) にして、 糖ヌクレオチド （X3— S 3) を送液する。 もし、 糖ヌクレ ォチド （X3— S 3) の比率が 5 0%ならば、 ポンプ 1 , 2の流量は同 じにする （ステップ 1と同じ）。 導入は、 プライマ一 （P— — s2) が検出終了するまで行う。
(2) プライマー （P— S i— S2) 力 反応カラム 20 (R3) に 移行し終わったら、 バルブ 4をドレインポジション （1) に切り替え、 バルブ 8を元に戻す。 ポンプ 2をバッファー 14に切り替えて， プライ マー （P— S i—S と糖ヌクレオチド （X3— S 3) を、 全て反応力 ラム 20 (R3) に導入した後、 バッファーの送液をポンプ 2のみで行 うとともに、 流量を下げて、 例えば、 流量 = Om 1 /minで、 一定時間 反応を継続させる。
<ステップ 7の説明 >
プライマー （P— — s2) と糖ヌクレオチド （x3— s3) が反応 カラム 20 (R3) で反応している間に、 ポンプ 1は、 ノ ッファー 14 を分離カラム 22 (C2) に流し続け、 カラムに保持されている未反応 糖ヌクレオチド （X2_S2) と反応副産物のヌクレオチド （X2) を力 ラムから洗い出す。
くステップ 8の説明〉
プライマ一 (P— S「 S 2) と糖ヌクレオチド (X3— S 3) の反応 終了後、 バルブ 3をポジション （4) にする。 ポンプ 1， 2によってバ ッファ一 1 4の流量を上げて、 水溶性ポリマー （P— S — Ss— S3) と未反応の糖ヌクレオチド （X3—S3)、 および反応生成物ヌクレオチ ド (X3) を分離カラム 23 (C3) 内で分離する。
くステップ 9の説明 >
(1) プライマー （P— S2— S3) 力 検知器 9で検出され たら、 バルブ 4を分取ポジション （5) に切り替え、 糖鎖合成物をボト ノレ 1 2 (F C) に分取する。
( 2 ) 検知器 9で検出されなくなったら、 バルブ 4をドレインポジ ヨン （ 1 ) に戻す。
くステップ 1 0の説明〉
ポンプ 1 2は、 バッファー 1 4を分離力ラム 2 3 ( C 3 ) に流し続 け、 カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド （X 3— S 3 ) と反 応副産物のヌクレオチド （X 3 ) をカラムから洗い出す。
以上が、 本実施例における糖鎖合成物 （P— S i—S s— S 3 ) を作成 するときの手順である。
図 3に本実施例の変形例を示す。 図 3は、 検知器 1 0を追加した場合 の流路図である。 検出器 1 0は、 スプリツター （Sp) を介して検出器 9 の上流に接続され、 各分離カラムからの溶出成分の分子構造を得る。 こ の図 3の場合でも、糖鎮合成における作成手順は図 2の場合と同様に行 える。
図 3の構成では、反応生成物の分子構造に関する情報を検出する検知 器 1 0を備えたことにより、合成反応が予想通りに行なわれたかどうか を、 各反応毎に確認することが可能になる。 もし、 反応収率が、 期待し たレベルに到達しない場合は、 次の合成反応を中止し、 反応試薬と時間 の無駄を省くことができると云つた効果がある。
尚、 本実施例では、 各バルブによる流路を切り換えるタイミングとし て、検出器 9の検出結果を基に切り換える例を示したが、 予定された糖 の改変処理を行うものであって、予め反応カラムや分離カラムにおける 溶出液の通過時間が分かっている場合は、 各バルブの切り換えは、 検出 器 9の結果によらずに時間経過によって制御しても良い。
〔実施例 2〕
図 4は、 本実施例のシステム構成図である。
糖鎖合成装置は、ボトル 1 3 1 7の各溶媒をそれぞれ一定流量で一 定時間送液できる機能を有するポンプ 1 2 2 4 2 7 ( 6台）、 流 路を切り変えるためのバルブ 3〜 8 (6台）、 反応生成物を検出する検 知器 9， 1 0 (2台）、.そして、 これらを制御するコントローラ 1 1に より構成されている。 本実施例で用いる検知器 9, 1 0は、 実施例 1と 同じものである。
図 5は、 本装置の流路図である。 なお、 この流路図は、 使用する検出 器が 1台の場合を示している。 6台のポンプ 1、 2、 24〜2 7は、 コ ントロ一ラ 1 1による制御に従ってボトル 1 3〜 1 7の溶液を、一定流 量で一定時間それぞれ送液する。 実施例 1との違いは、 糖ヌクレオチド 溶液 (X「 Sい 2-S 2, X3- S 3) がそれぞれのポンプ 25， 2 6, 2 7で、 直接、 反応カラム 1 8〜20 (R^ R2， R3) に送液さ れることである。
本実施例では、ポンプ 1と 2は同じバッファー 14を送液するだけと なり、 いわゆる低圧グラジェント機能は不要である。 また、 ポンプ 25 ， 26， 27が、 糖ヌクレオチド溶液 （X — S X2— S2, X3— S 3) をそれぞれのソレノイドバルブを介さず、 反応カラム 1 8〜20に 送り込める。 このため、 ソレノイ ドバルブの開閉が、 ポンプの吸引過程 と同期している低圧グラジェント機能と異なり、 より正確に、 プライマ 一 (P) と糖ヌクレオチド溶液 （Xi— x2— s 2, x3— s3) を 送液する時間を制御することが可能になると云つた効果がある。
〔実施例 3〕
図 6は、 本実施例のシステム構成図である。
バッファー （B l, B 2) 14, 30をそれぞれ一定流量で一定時間 送液できる機能を持ったポンプ 2台 （ポンプ 2)， プライマー （P ) 1 3を流路に導入するサンプルインジェクター 28， 糖ヌクレオチド 溶液 （X — S 1; X2— S2, X3—S3) 1 5， 1 6, 1 7を流路に導 入するサンプルインジェクター 29、流路を切り替えるためのバルブ 3 〜8 (6台）、 反応生成物を検出する検知器 9， 1 0 (2台）、 そして、 これらを制御するコントロ一ラ 1 1により構成されている。本実施例で 用いる検知器 9, 1 0は、 実施例 1と同じものである。
図 7は本装置の流路図である。 なお、 この流路図は、 使用する検出器 が 1台の場合を示している。 2台のポンプ 1， 2は、 コントローラ 1 1 による制御に従って、 バッファー 1 4， 3 0 (必ずしもバッファーをポ ンプごとに備える必要は無く、共通のバッファーを使用することも可能 。 図 7は、 その際の例を示す） の溶液を、 一定流量で一定時間、 それぞ れ送液する。 実施例 1との違いは、 プライマー （P), 糖ヌクレオチド 溶液 （Xi— S , X2- S 2> X3- S 3) がサンプルインジェクター 2 8 , 2 9を用いて流路に導入され、 反応カラム 1 8， 1 9, 2 0 (R Ύ , R2, R3) に、 ノ ッファー 1 4 (或いはバッファー 3 0) によって 送られることである。
本実施例では、 ポンプ 1， 2はバッファー 1 4, 或いはバッファ一 3 0を送液するだけとなり、いわゆる低圧グラジェント機能は不要である 。 また、 プライマー （P)， 糖ヌクレオチド溶液 （X 1— S 1 , x2- S 2， x3- s 3) は、 必要な量だけサンプルインジェクターを介して、 流 路に導入される。 このため、 ソレノイ ドバルブの開閉が、 ポンプの吸引 過程と同期している低圧グラジェント機能と異なり、 プライマー （P) と糖ヌクレオチド溶液 （x — sい x2— s 2， x3— s 3) の無駄な消 費を無くすることができると云う効果がある。
〔実施例 4〕
図 8は、 本実施例のシステム構成図であり、 図 9は流路図である。 な お、 この実施例において、 使用する検出器は 1台の場合でも、 2台の場 合でも良い。 また、 予め分析時間が既値である場合は、 検出器を使用せ ずに制御しても良い。 実施例 3との違いは、それぞれの反応カラムに直列に接続されていた 分離カラムおよびバルブを、一本の分離カラムに集約している点である 。 また、 分離カラムに限外ろ過カラム 4 0を使用した点である。
分離力ラムを共用化したことにより、 本実施例では、 バルブ 6 〜 8に 代えて、 ノ ノレブ 4 1が設けられる。
限外ろ過力ラム 4 0の構成を図 1 0に示す。 限外ろ過力ラム 4 0は、 内部に円筒状の限外ろ過膜 4 8を有し、 更に、 導入口 4 5から導入され た成分の内、膜を通過しないような大きな分子量の成分を排出する排出 口 4 7と、膜を通過した成分を排出する排出口 4 6の二つの排出ロを備 えている。 限外ろ過膜 4 8は、 例えば、 プライマーは通過せず、 糖ヌク レオチドゃヌクレオチドは通過するようなものを選択する。プライマー の分子量は、 約 1 0 、 0 0 0以上であり、 糖ヌクレオチドゃヌクレオチ ドの分子量は約 4 0 0程度である。 そのために、 大きさにかなりの差が あり、 容易に分離可能である。
排出口 4 7の下流には、 三方バルブ 4 2が設けられる。 このバルブは 、 検出器側の流路と、 何れかの排出口 4 6 , 4 7を選択的に連通させる ように構成される。連通されない側の排出口はバルブによって流路が遮 断されることになる。
この限外ろ過カラム 4 0での分離は、 次のように行う。 即ち、 反応力 ラムからの溶出液が導入された当初は、三方バルブ 4 2を排出口 4 6側 にしておき、 限外ろ過膜 4 8を透過したもののみを排出する。 分子量の 大きなプライマーとプライマーに結合した糖は、限外ろ過膜 4 8內に残 される。 所定時間経過後、 三方バルブ 4 2を排出口 4 7側に切り換える と、限外ろ過膜 4 8内に蓄積されたプライマーとプライマーに結合した 糖が検出器側に排出される。
本実施例における動作は、実施例 1で示した動作と基本的に共通であ る。 分離カラムが共通化されているが、 実施例 1におけるバルブ 6〜 8 がドレインに切り替わるタイミングで、バルブ 4 1が点線側の流路に切 り換えられることで、分離カラムを共通化しても実施例 1 と同様の動作 を実現することができる。
本実施例においては、 分離カラムを共通化したことにより、 装置構成 を簡易化することができる。 また、 分離カラムとして限外ろ過カラムを 用いることにより、 プライマー （P ) は、 一旦限外ろ過カラム中に濃縮 されることになる。 従って、 実施例 1のステップ 3で述べたようなプラ イマ一 （P ) のバンドの拡がりという問題が無くなり、 次の反応カラム への導入が容易になると云う効果がある。
以上説明したように、 本発明によれば、複雑な糖鎖合成であっても容 易に実行することが可能になる。 産業上の利用可能性
本発明を糖鎖合成装置へ適用すれば、 糖鎖の合成、 或いは分離を容 易に行うことができる。

Claims

請求の範囲
1 . 糖転移酵素及び/または糖質加水分解酵素を固定化した一つまた は複数の反応カラムと、
前記反応カラムの下流側に配置され、前記反応カラムからの溶出液中 の反応生成物ど未反応および副産物を分離する一つまたは複数の分離 手段と、
水溶性ポリマーのプライマ一及びバッファー溶液を第 1の切換バル ブを介して前記反応カラムに送液する第 1のポンプと、
バッファー溶液及び糖ヌクレオチド溶液を第 2の切換バルブを介し て前記反応カラムの何れかに送液する第 2のポンプと、
前記分離手段下流側の流路と前記各反応力ラムの上流側の流路を結 ぶーつまたは複数の循環流路と、
前記分離手段と前記一つまたは複数の循環流路間に配置され、分離手 段と任意の循環流路を選択的に連通する第 3の切換バルブとを備えた ことを特徴とする糖鎖合成装置。
2 . 請求の範囲第 1項において、 前記第 3の切換バルブには、 反応生 成物を分取するための分取用流路が接続される糖鎖合成装置。
3 . 請求の範囲第 1項において、 前記第 1及び第 2のポンプは、 開閉 によって送液を行う複数のソレノィ ドバルブを有し且つ低圧グラジェ ント機能を有するポンプであって、前記各溶液が入ったボトルは、 それ ぞれ前記ソレノイ ドバルプに接続される糖鎖合成装置。
4 . 請求の範囲第 1項において、 水溶性ポリマ一のプライマー、 バッ ファー溶液、糠ヌクレオチド溶液が入ったボトルごとに、各溶液を前記
• 第 1又は第 2の切換バルブに送液するポンプを備えた糖鎖合成装置。
5 .請求の範囲第 1項において、前記第 1のポンプと前記第 1の切換 バルブ間の流路に、水溶性ポリマーのブラィマ一を導入する第 1のサン プルインジェク夕一を備え、前記第 2のポンプと前記第 2の切換バルブ 間の流路に、糖ヌクレオチド溶液を導入する第 2のサンプルィンジェク 夕一を備えた糖鎖合成装置。
6 . 請求の範囲第 1項において、 前記分離手段の下流に、 分離手段か らの溶出液を検出する検知器を備え、 前記検知器は、 屈折率検知器（R ェ）， 紫外可視分光検知器 （U V)， ダイオードアレイ吸光度検知器（D A D ) の何れかである糖鎖合成装置。
7 . 請求の範囲第 6項において、 前記分離カラムと前記検知器間の流 路に、 前記流路を分岐するスプリツ夕一を備え、前記スプリツ夕一には 、溶出液の分子構造を検出可能な第 2の検知器を接続する糖鎖合成装置
8 . 請求の範囲第 7項において、'前記第 2の検知器は、 ダイォ一ドア レイ吸光度検知器（D A D )、 質量分析計 （M S )、 核磁気共鳴装置 （N M R ) の何れかである糖鎖合成装置。'
9 . 請求の範囲第 1項において、 前記分離手段は、 ゲルろ過クロマト グラフィー、 陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマト グラフィ一、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 限外ろ過のいずれか である糖鎖合成装置。
1 0 . 請求の範囲第 1項において、 前記反応カラムを複数備え、 且つ
、 各反応カラムの下流に分離手段を備えた場合に、前記各分離手段の下 流に、前記分離手段と前記第 3の切換バルブを結ぶ流路と、前記分離手 段とドレインとを結ぶ流路を選択的に切り換える第 4のバルブを備え た糖鎖合成装置。
1 1 . 請求の範囲第 1項において、 前記反応カラムを複数備え、 且つ 各反応カラムからの溶出液を一つの分離手段に導入する場合に、前記反 応力ラムと前記分離手段の間に、前記反応力ラムと前記分離手段を結ぶ 流路と、前記第 1のバルブとドレインを結ぷ流路を形成する第 1の状態 と、 前記第 1のバルブと前記分離手段を結ぶ流路と、 前記反応カラムと ドレインとを結ぶ流路を形成する第 2の状態を選択的に切り換える第 5のバルブを備えた糖鎖合成装置。
PCT/JP2002/006642 2001-07-02 2002-07-01 Dispositif de synthese de chaines glucidiques WO2003004597A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/482,626 US6962809B1 (en) 2001-07-02 2002-07-01 Sugar chain synthesizer
JP2003510756A JP4005557B2 (ja) 2001-07-02 2002-07-01 糖鎖合成装置
EP02743770A EP1405905B1 (en) 2001-07-02 2002-07-01 Sugar chain synthesizer
DE60218043T DE60218043T2 (de) 2001-07-02 2002-07-01 Zuckerketten-synthesevorrichtung

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001200290 2001-07-02
JP2001-200290 2001-07-02
JP2002134871 2002-05-10
JP2002-134871 2002-05-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003004597A1 true WO2003004597A1 (fr) 2003-01-16

Family

ID=26617957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2002/006642 WO2003004597A1 (fr) 2001-07-02 2002-07-01 Dispositif de synthese de chaines glucidiques

Country Status (5)

Country Link
US (1) US6962809B1 (ja)
EP (1) EP1405905B1 (ja)
JP (1) JP4005557B2 (ja)
DE (1) DE60218043T2 (ja)
WO (1) WO2003004597A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1422290A1 (en) * 2002-11-20 2004-05-26 Hitachi High-Technologies Corporation Apparatus for oligosaccharide synthesis
EP1582581A2 (en) * 2004-03-31 2005-10-05 Hitachi High-Technologies Corporation Saccharide composition synthesizer
JP2009060809A (ja) * 2007-09-04 2009-03-26 Hiroshima Univ アデノシン三リン酸を増幅させるための反応器およびアデノシン三リン酸の増幅方法、並びにその利用
US7556962B2 (en) * 2004-03-31 2009-07-07 Hitachi High-Technologies Corporation Saccharide composition purification instrument
EP1852382B1 (en) 2005-02-25 2015-12-30 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Elevator apparatus

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3816610B1 (en) 2018-06-07 2023-05-03 Yokogawa Electric Corporation Optical analysis system and optical analysis method
CN116916967A (zh) * 2021-02-09 2023-10-20 启德医药科技（苏州）有限公司 偶联设备及生成偶联物的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01174395A (ja) * 1987-12-28 1989-07-10 Natl Food Res Inst 固定化酵素膜を用いたフラクトオリゴ糖を含有する甘味料の製造法
WO1991016449A1 (en) * 1990-04-16 1991-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
JPH0998795A (ja) * 1995-10-06 1997-04-15 Aomori Pref Gov モノ及びオリゴガラクツロン酸の製造装置
JPH1146788A (ja) * 1997-08-07 1999-02-23 Ensuiko Sugar Refining Co Ltd ガラクトシルスクロースの製造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4865976A (en) * 1986-09-10 1989-09-12 Uop Method of cyclodextrin manufacture using an immobilized cyclodextrin glycosyltransferase
US5583042A (en) * 1990-04-16 1996-12-10 Neose Pharmaceuticals, Inc. Apparatus for the synthesis of saccharide compositions
AU642253B2 (en) 1990-04-16 1993-10-14 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
JP3105306B2 (ja) 1991-09-03 2000-10-30 寳酒造株式会社 糖質又は複合糖質の製造方法
US5856082A (en) * 1994-08-31 1999-01-05 University Of British Columbia Devices and methods for characterizing proteins and peptides
JP4003093B2 (ja) 1997-07-29 2007-11-07 東洋紡績株式会社 糖類の製造方法
US6329182B1 (en) * 1997-11-26 2001-12-11 Novozymes A/S Method of producing oligosaccharide syrups, a system for producing the same and oligosaccharide syrups

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01174395A (ja) * 1987-12-28 1989-07-10 Natl Food Res Inst 固定化酵素膜を用いたフラクトオリゴ糖を含有する甘味料の製造法
WO1991016449A1 (en) * 1990-04-16 1991-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
JPH0998795A (ja) * 1995-10-06 1997-04-15 Aomori Pref Gov モノ及びオリゴガラクツロン酸の製造装置
JPH1146788A (ja) * 1997-08-07 1999-02-23 Ensuiko Sugar Refining Co Ltd ガラクトシルスクロースの製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1405905A4 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1422290A1 (en) * 2002-11-20 2004-05-26 Hitachi High-Technologies Corporation Apparatus for oligosaccharide synthesis
US7070988B2 (en) 2002-11-20 2006-07-04 Hitachi High Technologies Corporation Oligosaccharide synthesizer
EP1582581A2 (en) * 2004-03-31 2005-10-05 Hitachi High-Technologies Corporation Saccharide composition synthesizer
EP1582581A3 (en) * 2004-03-31 2007-03-07 Hitachi High-Technologies Corporation Saccharide composition synthesizer
US7556962B2 (en) * 2004-03-31 2009-07-07 Hitachi High-Technologies Corporation Saccharide composition purification instrument
US7883873B2 (en) 2004-03-31 2011-02-08 Hitachi High-Technologies Corporation Saccharide composition synthesizer
EP1852382B1 (en) 2005-02-25 2015-12-30 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Elevator apparatus
JP2009060809A (ja) * 2007-09-04 2009-03-26 Hiroshima Univ アデノシン三リン酸を増幅させるための反応器およびアデノシン三リン酸の増幅方法、並びにその利用

Also Published As

Publication number Publication date
US6962809B1 (en) 2005-11-08
EP1405905A4 (en) 2005-02-02
JPWO2003004597A1 (ja) 2004-10-28
EP1405905B1 (en) 2007-02-07
JP4005557B2 (ja) 2007-11-07
EP1405905A1 (en) 2004-04-07
DE60218043D1 (de) 2007-03-22
DE60218043T2 (de) 2007-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3426670B1 (en) Separation of oligosaccharides from fermentation broth
Li et al. Efficient chemoenzymatic synthesis of an N-glycan isomer library
Seitz et al. Chemoenzymatic solution-and solid-phase synthesis of O-glycopeptides of the mucin domain of MAdCAM-1. A general route to O-LacNAc, O-sialyl-LacNAc, and O-sialyl-Lewis-X peptides
Nilsson Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US8232079B2 (en) Oligosaccharide synthesizer
Serna et al. Construction of N‐Glycan Microarrays by Using Modular Synthesis and On‐Chip Nanoscale Enzymatic Glycosylation
Kelly et al. A novel N-linked flagellar glycan from Methanococcus maripaludis
EP3456836A1 (en) Separation of sialylated oligosaccharides from fermentation broth
Linsley et al. Applications of electrospray mass spectrometry to erythropoietin N-and O-linked glycans
Campo et al. Cyclooligomerisation of azido-alkyne-functionalised sugars: synthesis of 1, 6-linked cyclic pseudo-galactooligosaccharides and assessment of their sialylation by Trypanosoma cruzi trans-sialidase
WO2003004597A1 (fr) Dispositif de synthese de chaines glucidiques
Campo et al. Chemical and chemoenzymatic synthesis of glycosyl-amino acids and glycopeptides related to Trypanosoma cruzi mucins
Calderon et al. An enzymatic strategy to asymmetrically branched N-glycans
WO2021259670A1 (en) Improved export of oligosaccharides from bacterial cells
KR20210105385A (ko) 올리고당류의 분리
Ohtsuka et al. Synthesis of a library of fucopyranosyl-galactopyranosides consisting of a complete set of anomeric configurations and linkage positions
CN100432085C (zh) 一种寡糖的合成方法
US7883873B2 (en) Saccharide composition synthesizer
EP1801118A1 (en) Process for synthesis of mucin-type peptides and muc1-related glycopeptides
van Dorst et al. Synthesis of Hex p-(1→ 4)-β-d-Glc pNAc-(1→ 2)-α-d-Man p-(1→ O)(CH2) 7CH3 probes for exploration of the substrate specificity of glycosyltransferases: Part I, Hex= β-d-Gal, 4-deoxy-β-d-Gal, 4-O-methyl-β-d-Gal, 4-deoxy-4-fluoro-β-d-Gal, or β-d-Glc
Hunt et al. Synthesis of 6′-galactosyllactose, a deviant human milk oligosaccharide, with the aid of Candida antarctica lipase-B
JP2005287372A6 (ja) 糖鎖合成装置
Kanie et al. Carbohydrate Libraries by the Random Glycosylation Approach
Treuheit et al. HPLC of individual site glycoforms in serum orosomucoid
Liu et al. Calcium iodide mediated coupling of complex fluorooligosaccharides to phenolic peptide

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003510756

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002743770

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10482626

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002743770

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2002743770

Country of ref document: EP