WO2003002549A1 - Eurotinone und derivate davon, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung derselben - Google Patents

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acceptable salts
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Claudia Eder
Herbert Kogler
Luigi Toti
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Aventis Pharma Deutschland Gmbh
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    • C07D313/12—[b,e]-condensed
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to novel compounds of general formula I.
  • R (1), R (2), R (3), R (4) independently represent hydrogen or an alkyl radical.
  • the compounds of the formula I are inhibitors of KDR kinase and, because of their antiangiogenic effect, are suitable for the prevention and / or treatment of malignant diseases.
  • the compounds of the formula I are obtainable by fermentation of the microorganism Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) or by chemical derivatization of the compounds obtained after fermentation of said microorganism.
  • the invention thus also relates to a process for the preparation of the compounds of the formula I, the use of the compounds of the formula I for the manufacture of a medicament for the treatment of malignant diseases and diseases which can be treated by inhibiting the KDR kinase, and pharmaceutical preparations with a Content of at least one compound of the formula I.
  • Cancer is a mostly fatal disease of humans and animals, which is caused by the uncontrolled growth of endogenous cells. Cancer is the name given to the formation of malignant tumors (malignancies), neoplasms (tumors or carcinomas) or malignant degeneration
  • cancer white blood cells
  • leukemia blood cancer
  • Cancer or tumor cells are formed by the transformation of the body's own cells.
  • the malignancy of the cancer cell It expresses itself in the autonomy of growth, that is, in its capacity to infiltrate without inhibition and without classification in the blueprint of the organs and under tissue destruction.
  • a sure sign of malignancy is the formation of tumor-distant colonies (metastases) after haematogenous or lymphogenic spread of tumor cells.
  • Cancer is one of the most common causes of human death, and there is a great need for methods and means of curing or treating malignant degeneration.
  • the possibility of treating malignant tumors includes not only radical removal of the tumor, if possible, but also radiological therapy
  • X-rays, ⁇ -, ß-, ⁇ -rays, immunotherapy and chemotherapy are currently only applicable to a limited extent.
  • Chemotherapy of tumors is the administration of cytotoxic agents for the treatment of tumors and residual tumor cells after local surgical treatment or radiation. These substances specifically engage in certain processes of cell division, so that tissues with a high proportion of dividing cells, such as the rapidly growing tumor tissue, react more sensitively.
  • alkylating compounds such.
  • cyclophosphamide The Merck Index, 12th Ed., Page 463
  • antimetabolites such as methotrexate
  • alkaloids such as vincristine
  • tumors require an adequate supply of the tumor with oxygen, which is only guaranteed by a sufficient blood flow (vascularization) of the tumor.
  • angiogenesis is a complex, multi-step process that involves activation, migration, proliferation and survival of endothelial cells.
  • VEGFRs vascular endothelial growth factors
  • VEGFR family includes the subtypes VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR) and VEGFR-3 (Fit-4). While VEGFR-1 and VEGFR-2 function as universal regulators of endothelial cells, VEGFR-3 mainly controls the growth of the lymphatic vasculature. VEGFRs play a key role in all stages of the angiogenic process.
  • the microorganism Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) is able to form an active substance which has a marked inhibitory effect on KDR kinase and thus represents an effective angiogenesis inhibitor.
  • the new compound is called in the following Eurotinone and is, together with Eurotinone derivatives, the subject of the invention.
  • the present invention therefore relates to compounds of general formula I.
  • R (1), R (2), R (3) and R (4) independently of one another, each represents hydrogen or an alkyl radical, in all their stereochemical forms and mixtures of these forms in any ratio, as well as their physiologically acceptable salts.
  • An alkyl radical in formula I can be, for example, (C 1 -C 4 alkyl, (C 2 -C 6 ) alkenyl, (C 2 -C 6 ) alkynyl, C 3 -Ce cycloalkyl or (C 1 -C 3 ) Alkyl (C 3 -C 6 ) cycloalkyl.
  • C 1 -C 6 -alkyl can be a straight-chain or branched alkyl having 1 to 6 C atoms, such as, for example, methyl, ethyl, isopropyl, tert-butyl and hexyl;
  • C 2 -C 6 alkenyl is a straight-chain or branched alkenyl having 2 to 6 C atoms, such as allyl, crotyl and pentenyl
  • C 2 -C 6 - alkynyl is a straight-chain or branched alkynyl having 2 to 6 C atoms, such as propynyl, butynyl and pentynyl, mean.
  • Examples of (C 3 -C 6) -cycloalkyl are cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl.
  • alkyl radicals may be substituted by one or more radicals. These may be, for example, halogen, such as chlorine, bromine, fluorine; hydroxy; Alkoxy with 1-4 C-atoms, in particular methoxy and / or trifluoromethyl.
  • R (1) - R (4) in the formula I are each independently of one another hydrogen or (CC 6 ) -alkyl.
  • the invention thus relates in particular to the eurotinone of the formula
  • the invention further relates to the 2,12-dimethyleurotinone of the formula
  • the compounds of the formula I are obtainable by fermentation of the microorganism Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) or its variants or mutants under suitable conditions.
  • DSM 13872 microorganism Eurotium echinulatum Delacroix
  • the eurotinones are obtained.
  • the invention therefore further relates to a process for the preparation of a compound of formula I, characterized in that the microorganism Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) or its variants or mutants is fermented under suitable conditions in a culture medium until the eurotinone in the culture medium or in Microorganism accumulates and then out the culture medium or microorganism is isolated and optionally converted into chemical derivatives and / or physiologically acceptable salts.
  • DSM 13872 microorganism Eurotium echinulatum Delacroix
  • alkylation of phenols can therefore be carried out by known chemical reactions.
  • Derivatization to the alkylated derivatives of the eurotinone can be carried out, for example, by reaction with alkyl halides such as alkyl bromides or alkyl iodides, alkyl sulfonic acid esters such as mesylates, tosylates or triflates and diazoalkanes such as diazomethylene or trimethylsilyl-diazomethane.
  • alkyl halides such as alkyl bromides or alkyl iodides
  • alkyl sulfonic acid esters such as mesylates, tosylates or triflates
  • diazoalkanes such as diazomethylene or trimethylsilyl-diazomethane.
  • the Eurotinones according to the invention are produced by the fungus Eurotium echinulatum, preferably by Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872.
  • the fungus Eurotium has a yellow / brown substrate mycelium and little aerial mycelium. In culture it forms the fruiting bodies characteristic of Eurium, the cleistothecia.
  • the ascospores are flattened spherical spheres. They have a typical equatorial comb.
  • the fungus is ubiquitous and prefers dry habitats.
  • Aspergillus echinulatus is also used synonymously.
  • Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 produces the Eurotinone according to the invention.
  • Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 and its mutants and variants can be used, which also synthesize the Eurotinones invention.
  • Such mutants can be prepared in a manner known per se by physical means, for example irradiation, such as with ultraviolet or X-rays, or chemical mutagens, such as, for example, ethyl methanesulfonate (EMS), 2-hydroxy-4-methoxy-benzophenone (MOB) or N-methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) or produced using genetic engineering methods.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • MOB 2-hydroxy-4-methoxy-benzophenone
  • MNNG N-methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • the fermentation conditions described below apply to Eurotium echinulatum, the deposited isolate Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872, and mutants and variants thereof.
  • the process according to the invention can be used for fermentation on a laboratory scale (milliliter to liter range) and on an industrial scale (cubic meter scale). All percentages are by weight unless otherwise specified. Mixing ratios for liquids are by volume unless otherwise specified.
  • the method according to the invention comprises the cultivation of Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, its mutants and / or variants under aerobic conditions in a culture medium containing a carbon and nitrogen source, inorganic salts and optionally trace elements.
  • the strain Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872 forms the eurotinone on glucose, starch, oatmeal or glycerol-containing nutrient solutions.
  • Suitable carbon sources for the fermentation are assimilable carbohydrates and sugar alcohols such as glucose, lactose, sucrose or D-mannitol and carbohydrate-containing natural products such as malt extract or yeast extract.
  • Suitable nitrogen-containing nutrients are: amino acids, peptides and proteins and their degradation products, such as casein, peptones or tryptones, furthermore Meat extracts, yeast extracts, ground seeds, for example of corn, wheat, beans, soybean or cotton plant, distillation residues of alcohol production, meat flours or yeast extracts, but also ammonium salts and nitrates, but in particular also synthetically or biosynthetically derived peptides.
  • the nutrient solution may contain, for example, chlorides, carbonates, sulfates or phosphates of the alkali or alkaline earth metals, iron, zinc, cobalt and manganese.
  • the formation of the eurotinone according to the invention proceeds particularly well, e.g. in a nutrient solution containing about 0.05 to 5%, preferably 1 to 2% malt extract containing about 0.05 to 3%, preferably 0.05 to 1% yeast extract and 0.2 to 5%, preferably 0.5 to 2% Glucose, 0.5 to 3%, preferably 1.5 to 3% oatmeal.
  • the percentages are in each case based on the weight of the entire nutrient solution.
  • the cultivation of the microorganism takes place aerobically, that is, for example, submerged with shaking or stirring in shake flasks or fermenters or on solid medium, optionally with the introduction of air or oxygen. It can be carried out in a temperature range of about 15 to 35 ° C, preferably at about 20 to 35 ° C, in particular at 25 to 30 ° C.
  • the pH range should be between 3 and 10, preferably between 6.5 and 7.5.
  • Microorganism under these conditions generally over a period of 48 to 720 hours, preferably 72 to 720 hours. It is advantageous to cultivate in several stages, ie one first produces one or more precultures in a liquid nutrient medium, which are then inoculated into the actual production medium, the main culture, for example in a volume ratio of 1: 10-1: 100.
  • the preculture is obtained z. B., by inoculating the mycelium in a nutrient solution and about 20 to 120 hours, preferably 48 to 72 hours to grow.
  • the mycelium can be obtained, for example, by growing the stem for about 1 to 40 days, preferably 15 to 20 days, on a solid or liquid medium such as yeast malt agar, oatmeal agar or potato dextrose agar.
  • the fungus Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872 can form the compound eurotinone in a surface or stand culture on solid nutrient media.
  • Solid nutrient media are prepared by adding, for example, agar or gelatin to aqueous nutrient media.
  • the eurotinone can be found both in the mycelium and in the culture filtrate, usually the main amount is in the culture filtrate.
  • the mycelium is first separated from the culture broth by the usual methods, and then the eurotinone is extracted from the cell mass with an organic solvent which may be miscible with water.
  • the organic solvent phase contains the natural product according to the invention, it is optionally concentrated in vacuo and further purified as described below.
  • the culture filtrate is optionally combined with the concentrate of the mycelial extract and extracted with a suitable, water-immiscible organic solvent, for example with n-butanol.
  • a suitable, water-immiscible organic solvent for example with n-butanol.
  • the subsequently separated organic phase is optionally concentrated in vacuo.
  • the culture filtrate is separated directly by chromatography as described below.
  • the surface culture is expediently freeze-dried first and then extracted with methanol or 2-propanol, but other solvents can also be used.
  • the extract obtained is then lyophilized.
  • the further purification of the Eurotinons according to the invention is carried out by chromatography on suitable materials, for example on molecular sieves, on normal phase carrier, such as. As silica gel, alumina, to ion exchangers, but preferably to adsorber resins and reverse phases (reversed phase, RP). With the help of this chromatography, the eurotinone is isolated.
  • the chromatography is carried out with buffered aqueous solutions or mixtures of aqueous and organic solutions.
  • aqueous or organic solutions are all water-miscible organic solvents, preferably methanol, 2-propanol and acetonitrile, in a concentration of 10 to 80% solvent, preferably 15 to 55% solvent or all buffered aqueous solutions with organic solvents are miscible.
  • Buffered or acidified aqueous solutions are understood as meaning e.g. Water, phosphate buffer, ammonium acetate, citrate buffer in a concentration of 1 mM to 0.5 M and formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid or all commercially available acids known in the art, preferably in a concentration of 0.01 to 3%, in particular 0.1% ,
  • Chromatography is carried out with a gradient beginning with 100% aqueous buffer and ending with 100% solvent, preferably 2-propanol or acetonitrile.
  • solvent preferably 2-propanol or acetonitrile.
  • a linear gradient of from 10 to 60% acetonitrile in buffered aqueous solution is preferably run.
  • the eurotinone and derived chemical derivatives of the formula I can be converted into the corresponding physiologically acceptable salts by methods known to those skilled in the art.
  • Physiologically acceptable salts of compounds of the formula I and II are understood as meaning both their organic and inorganic salts, as described in Remington's Pharmaceutical Sciences (17th Edition, page 1418 (1985)). Due to their physical and chemical stability and solubility, acidic groups are preferred to sodium, potassium, calcium and ammonium salts, among others; salts of hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid or of carboxylic acids or sulfonic acids, such as, for example, acetic acid, citric acid, benzoic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid and p-toluenesulfonic acid, are preferred for basic groups.
  • the present invention includes all stereoisomeric forms of the compounds of formula I.
  • Asymmetric centers contained in the compounds of the formula I can all independently of one another have the S configuration or the R configuration.
  • the invention includes all possible enantiomers and diastereomers, as well as mixtures of two or more stereoisomeric forms, for example mixtures of enantiomers and / or diastereomers, in all ratios.
  • Enantiomers are thus in enantiomerically pure form, both as levorotatory and as dextrorotatory antipodes, R and S configurations, in the form of racemates and in the form of mixtures of the two enantiomers in all proportions of the invention.
  • a cis / trans isomerism both the cis form and the trans form and mixtures of these forms in all proportions are the subject of the invention.
  • the tyrosine kinase receptor KDR represents the test target.
  • KDR plays a key role in the growth of endothelium and in angiogenesis and is thus also involved in the development of tumors. KDR is thus an important therapeutic target for cancer and other proliferative diseases.
  • the activity of the KDR kinase is measured by the phosphorylation of a specific peptide substrate.
  • other kinases which are also involved in carcinogenesis or in the inflammatory cascade, are inhibited by the eurotinones.
  • the compounds according to the invention are suitable for specific use as medicaments in human and / or veterinary medicine.
  • the compounds of the invention can be used in cancers, especially as chemotherapeutic agents. Because of their anti-angiogenetic properties and related
  • Antitumor activity they can particularly as agents for malignant degenerations in animals and 'be used in humans.
  • a use for prevention is conceivable to prevent re-growth of a tumor after therapy.
  • the Eurotinones of the formula I according to the invention can be used both for monotherapy and in combination therapy with other cytostatics in the context of a chemotherapeutic tumor treatment. Due to the different targets of cytostatics and angiogenesis inhibitors, the combination therapy can lead to a synergistic effect of KDR inhibitors with the previously known cytostatics.
  • the invention also relates to pharmaceutical preparations which contain one or more of the novel Eurotinones of the formula I and, if appropriate, additionally a cytostatic agent as further active ingredient.
  • a cytostatic agent as further active ingredient.
  • suitable excipients or carrier material As a carrier material in humans all pharmacologically acceptable carrier materials and / or adjuvants can be used.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a medicament according to the invention, which comprises bringing at least one of the compounds according to the invention into a suitable administration form with a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable carrier and optionally further suitable active ingredients, additives or excipients.
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, tablets, dragées, (micro) capsules, suppositories, syrups, emulsions, suspensions, aerosols, drops or injectable solutions in the form of ampoules and preparations with protracted release of active ingredient, in the preparation of which usually carriers and additives and / or aids such as disintegrants, binders, coatings, swelling, lubricants or lubricants, flavorings, sweeteners or solubilizers use.
  • Frequently used vehicles or excipients such as magnesium carbonate, titanium dioxide, lactose, mannitol and other 'sugars, talc, milk protein, gelatin, Starch, vitamins, cellulose and its derivatives, animal or vegetable oils, polyethylene glycols and solvents, such as sterile water, alcohols, glycerol and polyhydric alcohols called.
  • the dosage units for oral administration may be microencapsulated to delay or prolong delivery over a longer period of time, such as by coating or embedding the active ingredient in particulate form into suitable polymers, waxes or the like.
  • the pharmaceutical preparations are prepared and administered in dosage units, each unit containing as active ingredient a specific dose of one or more compounds of the Eurotinones of the formula I according to the invention.
  • this dose may be up to about 500 mg, but preferably about 0.1 to 200 mg, and for injection solutions in ampoule form up to about 500 mg, but preferably about 0.1 to 100 mg, per Day.
  • the daily dose to be administered depends on the body weight, age, gender and condition of the patient. However, higher or lower daily doses may be appropriate.
  • the administration of the daily dose can be carried out either by a single dose or in several smaller dosage units as well as by a multiple administration of divided doses at specific intervals.
  • Example 3 Preparation of a main culture Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872 on solid medium plates.
  • the maximum production of the eurotinone according to the invention is achieved after about 360 hours. For inoculating 10 to 200 L
  • Fermenters is sufficient for a 96-144 h old submersed culture (inoculation amount approx. 10%) from the same nutrient solution.
  • the conditions for these fermenters are: temperature 25 ° C stirrer speed: 200 rpm aeration 15 l min "1 ⁇
  • KDR kinase To determine the KDR kinase, purified enzyme is used in 384 well microtiter plates (Coated FlashPlates NEN Life Science). The enzyme activities are determined by the phosphorylation of a specific peptide substrate. A previously prepared dilution series of eurotinones with concentrations of 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.7813, 0.3906, 0.195, 0.094, 0.047 and 0 ⁇ M is pipetted into the test batches in the appropriate order. Subsequently, the addition of the reaction mixture (radioactively labeled ATP, buffer solution pH 7.4 and enzyme solutions) and incubation for 1 h at RT.
  • reaction mixture radioactively labeled ATP, buffer solution pH 7.4 and enzyme solutions
  • Substrate peptide PLC ⁇ l enzyme: KDR kinase (VEGF receptor)
  • 384-well FlashPlates are coated overnight with 60 ⁇ l (1.2 ⁇ g / well) of the peptide substrate at 4 ° C. and washed 3 ⁇ with 80 ⁇ l PBS each time.
  • the so coated Plates can be stored for shorter periods of time at 4 ° C and for longer periods at -20 ° C.
  • the reaction mixture is allowed to stand for one hour at room temperature.
  • the plates are washed three times with 75 ⁇ l of wash solution each time and the radioactivity is measured in a MicroBeta counter (Wallac) for 30 seconds.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin R(1), R(2), R(3), R(4) unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Alkylrest bedeuten. Die Verbindungen der Formel (I) sind Inhibitoren der KDR-Kinase und sind aufgrund ihrer antiangiogenetischen Wirkung zur Prävention und/oder Behandlung von malignen Erkrankungen geeignet. Die Verbindungen der Formel (I) sind erhältlich durch Fermentation des Mikroorganismus Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) oder durch chemische Derivatisierung der nach Fermentation des genannten Mikroorganismus erhaltenen Verbindungen. Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), die Verwendung der Verbindungen der Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von malignen Erkrankungen und von Krankheiten die durch Hemmen der KDR-Kinase behandelt werden können, sowie pharmazeutischen Zubereitungen mit einem Gehalt an mindestens einer Verbindung der Formel (I).

Description

Beschreibung:
Eurotinone und Derivate davon, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung derselben.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen der allgemeinen Formel I
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worin R(1), R(2), R(3), R(4) unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Alkylrest bedeuten. Die Verbindungen der Formel I sind Inhibitoren der KDR-Kinase und sind aufgrund ihrer antiangiogenetischen Wirkung zur Prävention und/oder Behandlung von malignen Erkrankungen geeignet. Die Verbindungen der Formel I sind erhältlich durch Fermentation des IVlikroorganismus Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) oder durch chemische Derivatisierung der nach Fermentation des genannten Mikroorganismus erhaltenen Verbindungen. Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, die Verwendung der Verbindungen der Formel I zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von malignen Erkrankungen und von Krankheiten die durch Hemmen der KDR-Kinase behandelt werden können, sowie pharmazeutischen Zubereitungen mit einem Gehalt an mindestens einer Verbindung der Formel I.
Krebs ist eine zumeist tödlich verlaufende Erkrankung von Mensch und Tier, die durch das unkontrollierte Wachsen von körpereigenen Zellen verursacht wird. Krebs ist die Bezeichnung für die Bildung von bösartigen Geschwülsten (Malignome), von Neoplasmen (Tumoren bzw. Carcinoma) oder für die maligne Entartung sowie
Reifungsstörung weißer Blutzellen (Leukämie, Blutkrebs). Krebs- oder Tumorzellen entstehen durch Umwandlung körpereigener Zellen. Die Bösartigkeit der Krebszelle drückt sich in der Autonomie des Wachstums aus, das heißt in ihrer Fähigkeit, ungehemmt und ohne Einordnung in den Bauplan der Organe und unter Gewebszerstörung infiltrierend zu wachsen. Ein sicheres Zeichen der Malignität ist die Bildung tumorferner Absiedlungen (Metastasen) nach hämatogener oder lymphogener Ausbreitung von Tumorzellen. Krebs gehört zu den häufigsten Todesursachen des Menschen und deshalb besteht ein großer Bedarf an Methoden und Mitteln zur Heilung oder Behandlung von malignen Entartungen.
Die Möglichkeit einer Therapie maligner Tumoren umfaßt neben der - wenn möglich radikalen - operativen Entfernung des Tumors, die radiologische Therapie mit
Röntgenstrahlen, α-, ß-, γ-Strahlen, die Immuntherapie und die Chemotherapie. Die Immuntherapie ist derzeit nur in eingeschränktem Maß anwendbar. Unter der Chemotherapie von Tumoren versteht man die Gabe von Zellgiften (Zytostatika) zur Behandlung von Tumoren und von verbliebenen Tumorzellen nach lokaler chirurgischer Behandlung oder Bestrahlung. Diese Stoffe greifen spezifisch in bestimmte Vorgänge der Zellteilung ein, so daß Gewebe mit hohem Anteil an sich teilenden Zellen, wie das rasch wachsende Tumorgewebe, empfindlicher reagieren. Zum Einsatz kommen alkylierende Verbindungen, wie z. B. das Cyclophosphamid (The Merck Index, 12. Ed. Seite 463), Antimetabolite, wie das Methotrexat (The Merck Index, 12. Ed. Seite 1025), Alkaloide, wie das Vincristin (The Merck Index, 12. Ed.
Seite 1704) und Antibiotika, wie das Daunomycin (The Merck Index, 12. Ed. Seite 479) sowie das Adriamycin (The Merck Index, 12. Ed. Seite 581-582). All diese Agenzien haben aber aufgrund von massiven Nebenwirkungen große Nachteile, so daß der Tod der Erkrankten nur hinausgezögert, nicht jedoch abgewendet wird. Zudem treten bei entarteten (Krebs-) Zellen Resistenzen gegen die angewandten Mittel auf, die derzeitigen Medikamente wirken dann nicht mehr zytostatisch, wohl aber toxisch infolge der Nebenwirkungen. Zudem hat sich gezeigt, daß eine kombinierte bzw. sequentielle Anwendung von Zytostatika die Wirksamkeit eines einzelnen Zytostatikums (Monotherapie) übertrifft und dadurch möglich ist, daß sich die erheblichen Nebeneffekte bei der Polychemotherapie nicht addieren. Aus all diesen Gründen werden neue Chemotherapeutika dringend benötigt und deshalb weltweit gesucht. Das Wachstum von Tumoren setzt eine ausreichende Versorgung des Tumors mit Sauerstoff voraus, die nur durch eine ausreichende Durchblutung (Vaskularisierung) des Tumors gewährleistet ist. Tumore sind nicht zur Bildung neuer Blutgefäße (=Angiogenese) fähig sondern müssen das sie umgebende Bindegewebe zur Angiogenese veranlassen.
Die Bildung neuer Blutgefäße ausgehend von einem schon existierenden Gefäßsystem ist für die embryonale Entwicklung und die Organentwicklung von zentraler Bedeutung. Eine abnormal gesteigerte Angiogenese wird u.a. bei rheumatoider Arthritis, diabetischer Retinopathie und beim Tumorwachstum beobachtet (Folkman, 1995, Nat. Med., 1 , 27-31). Die Angiogenese ist ein komplexer, mehrstufiger Prozeß, der Aktivierung, Migration, Proliferation und Überleben endothelialer Zellen einschließt. In Verbindung mit anderen Endothel-spezifischen Signalsystemen übertragen die sogenannten vascular endothelial growth factors (VEGFRs) Signale für die endotheliale Zellmigration, Proliferation und das Überleben der Zellen. Die VEGFR- Familie schließt die Subtypen VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR) und VEGFR-3 (Fit-4) ein. Während VEGFR-1 und VEGFR-2 als universelle Regulatoren von endothelialen Zellen fungieren, kontrolliert VEGFR-3 hauptsächlich das Wachstum des lymphatischen Gefäßsystems. VEGFRs spielen eine Schlüsselrolle in sämtlichen Stadien des angiogenetischen Prozesses.
Extensive Studien auf dem Feld der Tumorangiogenese in den letzten 20 Jahren haben eine große Anzahl an potentiellen therapeutischen Targets beschrieben, z.B. Kinasen, Proteasen und Integrine. Dies zog die Entdeckung vieler neuer anti- angiogenetischer Agentien nach sich, von denen sich einige bereits in der klinischen Prüfung befinden (Jekunen et al., 1997, Cancer Treatment Rev., 23, 263-286). Angiogenese-Inhibitoren könnten sowohl zur Monotherapie, wie auch in Kombinationstherapie mit anderen Zytostatika im Rahmen einer chemotherapeutischen Tumorbehandlung verwendet werden. Darüber hinaus ist ein Einsatz zur Prävention denkbar um erneutes Wachstum eines Tumors nach erfolgter Therapie zu verhindern. Die Inhibierung bzw. Regulierung von VEGFR-2 (KDR) ist ein Reaktionsmechanismus, der einen neuartigen Ansatz für die Behandlung einer Vielzahl von soliden Tumoren bietet. So ist die Aktivierung dieses Tyrosinkinase-Rezeptors entscheidend für endotheliales Zellwachstum und Gefäßneubildung bei der Angiogenese und hat somit Einfluß auf das Tumorwachstum und die Bildung von Metastasen. Darüber hinaus gibt es neue Hinweise darauf, daß die Expression von VEGF zum Überleben von Tumorzellen nach einer Strahlen- oder Chemotherapie beiträgt (Lee C. G., Heijn M. et al., 2000, Cancer Research, 60 (19), 5565-70). Dies unterstreicht die Bedeutung einer möglichen synergistischen Wirkung von KDR- Inhibitoren mit den bisher bekannten Zytostatika.
Es ist überraschend gefunden worden, daß der Mikroorganismus Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) einen Wirkstoff zu bilden vermag, der eine ausgeprägte inhibierenden Wirkung auf die KDR-Kinase aufweist und somit einen wirksamen Angiogenese-Inhibitor darstellt. Die neue Verbindung wird im folgenden Eurotinon genannt und ist, zusammen mit Eurotinon-Derivaten, Gegenstand der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher Verbindungen der allgemeinen Formel I
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worin
R(1), R(2), R(3) und R(4) unabhängig voneinander, jeweils Wasserstoff oder einen Alkylrest bedeutet, in allen ihren stereochemischen Formen und Gemische dieser Formen in jedem Verhältnis, sowie deren physiologisch verträgliche Salze. Ein Alkylrest in Formel I kann z.B. (C-rC^-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl, (C2-C6)-Alkinyl; C3- Ce-Cycloalkyl oder (C1-C3)-Alkyl-(C3-C6 ) Cycloalkyl sein. Cι-C6-Alkyl kann ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 C-Atomen, wie z.B. Methyl, Ethyl, i-Propyl, tert.Butyl und Hexyl;
C2-C6-Alkenyl ein geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2 bis 6 C-Atomen, wie z.B. Allyl, Crotyl und Pentenyl; C2-C6- Alkinyl ein geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2 bis 6 C-Atomen, wie z.B. Propinyl, Butinyl und Pentinyl, bedeuten.
Beispiele für (C3-Cβ )-Cycloalkyl sind Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl.
Die obengenannten Alkylreste können mit einem oder mehreren Resten substituiert sein. Diese können beispielsweise Halogen, wie Chlor, Brom, Fluor; Hydroxy; Alkoxy mit 1-4 C-Atomen, insbesondere Methoxy und/oder Trifluormethyl sein.
Bevorzugt bedeuten R(1) - R(4) in der Formel I jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder (C C6)-Alkyl.
Bevorzugt sind insbesonderere Verbindungen der Formel I, in denen a) R(1 )-R(4) Wasserstoff (= Eurotinon); b) R(1)-R(3) Wasserstoff und R(4) (Cι-C6)-Alky1, insbesonderer Methyl; oder c) R(1 ), R(2) Waserstoff und R(3), R(4) (Cι-C6)-Al yl, insbesonderer Methyl bedeutet; in allen ihren stereochemischen Formen und Gemische dieser Formen in jedem Verhältnis, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
Die Erfindung betrifft somit insbesondere das Eurotinon der Formel
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sowie deren physiologisch verträgliche Salze. Die Erfindung betrifft weiterhin das 2,12-Dimethyleurotinon der Formel
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und das 2-Methyleurotinon der Formel
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sowie deren physiologisch verträgliche Salze.
Erfindungsgemäß sind die Verbindungen der Formel I erhältlich durch Fermentation des Mikroorganismus Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) oder dessen Varianten oder Mutanten unter geeigneten Bedingungen. Durch anschließende Isolierung der Verbindungen und gegebenenfalls Umwandlung in chemische Derivate, sowie deren physiologisch verträglichen Salze werden die Eurotinone gewonnen.
Die Erfindung betrifft daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) oder dessen Varianten oder Mutanten unter geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium fermentiert wird, bis sich das Eurotinon im Kulturmedium oder im Mikroorganismus anhäuft und anschließend aus dem Kulturmedium oder Mikroorganismus isoliert und gegebenenfalls in chemische Derivate und /oder physiologisch verträglichen Salze umgewandelt wird.
In der Literatur sind viele Reaktionen zur Alkylierung von Phenolen beschrieben worden. Die Alkylierung der phenolischen OH-Gruppen der vorliegenden Verbindungen kann daher mit an sich bekannten chemischen Reaktionen durchgeführt werden. Eine Derivatisierung zu den alkylierten Derivaten des Eurotinons kann zum Beispiel durch Umsetzung mit Alkylhalogeniden wie Alkylbromiden oder Alkyljodiden, Alkylsulfonsäureestern wie Mesylaten, Tosylaten oder Triflaten sowie Diazoalkanen wie Diazomethylen oder Trimethylsilyl-diazomethan erfolgen.
Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen.
Die erfindungsgemäßen Eurotinone werden durch den Pilz Eurotium echinulatum, bevorzugt durch Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 produziert.
Der Pilz Eurotium besitzt ein gelb/braunes Substratmycel und wenig Luftmycel. Er bildet in Kultur die für Eur tium charakteristischen Fruchtkörper, die Kleistothecien. Die Ascosporen sind abgeflachte sphärische Kugeln. Sie haben einen typischen equatorialen Kamm. Der Pilz ist ubiquitär und bevorzugt trockene Habitate. Als Synonym wird auch noch die Bezeichnung Aspergillus echinulatus gebraucht.
Ein Isolat von Eurotium echinulatum Delacroix, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, Deutschland nach den Regeln des Budapester Vertrages am 15.11.2000 unter der folgenden Nummer hinterlegt: DSM 13872.
Auf einem festen oder flüssigen Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produziert Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 das erfindungsgemäße Eurotinon. Anstelle des Stammes Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden, die ebenfalls die erfindungsgemäßen Eurotinone synthetisieren.
Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), 2-Hydroxy-4- methoxy-benzophenon (MOB) oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) oder unter Anwendung gentechnischer Methoden erzeugt werden.
Die im folgenden beschriebenen Fermentationsbedingungen gelten für Eurotium echinulatum, das hinterlegte Isolat Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 sowie Mutanten und Varianten von diesen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die Fermentation im Labormaßstab (Milliliter- bis Literbereich) und im industriellen Maßstab (Kubikmetermaßstab) eingesetzt werden. Alle Prozentangaben beziehen sich, wenn nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht. Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Kultivierung von Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, seiner Mutanten und/oder Varianten unter aeroben Bedingungen in einem eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, anorganischen Salze und gegebenenfalls Spurenelemente enthaltenden Kulturmedium. Der Stamm Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872 bildet auf Glukose-, Stärke- Haferflocken- oder Glycerinhaltigen Nährlösungen das Eurotinon.
Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose, Saccharose oder D-Mannit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z.B. Malzextrakt oder Hefextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Casein, Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, Hefeextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate, insbesondere aber auch synthetisch bzw. biosynthetisch gewonnene Peptide. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.
Die Bildung des erfindungsgemäßen Eurotinon verläuft besonders gut z.B. in einer Nährlösung, die etwa 0,05 bis 5%, bevorzugt 1 bis 2% Malzextrakt, die etwa 0,05 bis 3%, bevorzugt 0.05 bis 1 % Hefeextrakt und 0,2 bis 5%, bevorzugt 0,5 bis 2% Glucose, 0,5 bis 3%, bevorzugt 1.5 bis 3% Haferflocken enthält. Die Angaben in Prozent sind jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.
Die Kultivierung des Mikroorganismus erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern oder auf Festmedium, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Sie kann in einem Temperaturbereich von etwa 15 bis 35°C, vorzugsweise bei etwa 20 bis 35°C, insbesondere bei 25 bis 30°C durchgeführt werden. Der pH-Bereich sollte zwischen 3 und 10 liegen, vorzugsweise zwischen 6.5 und 7.5. Man kultiviert den
Mikroorganismus unter diesen Bedingungen im allgemeinen über einen Zeitraum von 48 bis 720 Stunden, vorzugsweise 72 bis 720 Stunden. Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 :10-1 :100, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man z. B., indem man das Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 20 bis 120 Stunden, bevorzugt 48 bis 72 Stunden, wachsen läßt. Das Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 1 bis 40 Tage, bevorzugt 15 bis 20 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-Agar, Haferflocken-Agar oder Kartoffeldextrose-Agar, wachsen läßt. Der Pilz Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872 kann die Verbindung Eurotinon in einer Oberflächen- oder Standkultur auf festen Nährböden bilden. Feste Nährböden werden durch Zugabe zum Beispiel von Agar oder Gelatine zu wäßrigen Nährmedien hergestellt. Es ist aber auch möglich das Eurotinon durch Fermentation des Pilzes Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872 im Submersverfahren, d. h. in wäßriger Aufschlämmung zu gewinnen. Das Eurotinon kann sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat vorkommen, gewöhnlich befindet sich die Hauptmenge im Kulturfiltrat. Handelt es sich um eine Flüssigkultur so wird zunächst das Mycel von der Kulturbrühe nach den üblichen Verfahren abgetrennt und anschließend wird das Eurotinon von der Zellmasse mit einem gegebenenfalls mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Die organische Lösungsmittelphase enthält den erfindungsgemäßen Naturstoff, sie wird gegebenenfalls im Vakuum konzentriert und wie unten beschrieben weiter aufgereinigt.
Das Kulturfiltrat wird gegebenenfalls mit dem Konzentrat des Mycel-Extraktes vereinigt und mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbarem organischen Lösungsmittel, zum Beispiel mit n-Butanol, extrahiert. Die anschließend abgetrennte organische Phase wird ggf. im Vakuum konzentriert. Bevorzugt wird das Kulturfiltrat direkt chromatographisch aufgetrennt wie unten beschrieben.
Die Oberflächenkultur wird zweckmäßiger Weise erst gefriergetrocknet und anschließend mit Methanol oder 2-Propanol extrahiert, es können aber auch andere Lösungsmittel verwendet werden. Der erhaltene Extrakt wird anschliessend lyophilisiert.
Die weitere Aufreinigung des erfindungsgemäßen Eurotinons erfolgt durch Chromatographie an geeigneten Materialien, z.B. an Molekularsieben, an Normal- Phasenträger, wie z. B. Kieselgel, Aluminiumoxid, an Ionenaustauschern, bevorzugt aber an Adsorberharzen und an Umkehr-Phasen (reversed phase, RP). Mit Hilfe dieser Chromatographie wird das Eurotinon isoliert. Die Chromatographie erfolgt mit gepufferten wässrigen Lösungen oder Gemischen von wässrigen und organischen Lösungen. Unter Gemischen von wässrigen oder organischen Lösungen versteht man alle mit Wasser mischbaren organischen Lösemittel, vorzugsweise Methanol, 2-Propanol und Acetonitril, in einer Konzentration von 10 bis 80% Lösemittel, vorzugsweise 15 bis 55 % Lösemittel oder auch alle gepufferten wässrigen Lösungen, die mit organischen Lösemitteln mischbar sind.
Unter gepufferten oder angesäuerten wäßrigen Lösungen versteht man z.B. Wasser, Phosphatpuffer, Ammoniumacetat, Citratpuffer in einer Konzentration von 1 mM bis 0,5 M sowie Ameisensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure oder allen handelsüblichen, dem Fachmann bekannten Säuren, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 3%, insbesondere 0,1 %.
Chromatographiert wird mit einem Gradienten, der mit 100% wäßrigem Puffer beginnt und mit 100% Lösemittel, vorzugsweise 2-Propanol oder Acetonitril, endet. Zur Aufreinigung der erfindungsgemäßen Eurotinone wird vorzugsweise wird ein linearer Gradient von 10 bis 60% Acetonitril in gepufferter wässriger Lösung gefahren.
Das Eurotinon und abgeleitete chemische Derivate der Formel I können nach dem Fachmann bekannten Methoden in die entsprechenden physiologisch verträglichen Salzen übergeführt werden.
Unter physiologisch verträglichen Salzen von Verbindungen der Formel I und II versteht man sowohl deren organische als auch anorganische Salze, wie sie in Remington's Pharmaceutical Sciences (17. Auflage, Seite 1418 (1985)) be- schrieben sind. Aufgrund der physikalischen und chemischen Stabilität und der Löslichkeit sind für saure Gruppen unter anderem Natrium-, Kalium-, Calcium- und Ammoniumsalze bevorzugt; für basische Gruppen sind unter anderem Salze der Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder von Carbonsäuren oder Sulfonsäuren, wie z.B. Essigsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure und p-Toluolsulfonsäure bevorzugt. Die vorliegende Erfindung umfaßt allen stereoisomeren Formen der Verbindungen der Formel l. In den Verbindungen der Formel I enthaltene Asymmetriezentren können alle unabhängig voneinander die S-Konfiguration oder die R-Konfiguration aufweisen. Zur Erfindung gehören alle möglichen Enantiomeren und Diastereomeren, ebenso Mischungen von zwei oder mehr stereoisomeren Formen, zum Beispiel Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren, in allen Verhältnissen. Enantiomere sind also in enantiomerenreiner Form, sowohl als linksdrehende als auch als rechtsdrehende Antipoden, R- und S-Konfigurationen, in Form von Racematen und in Form von Mischungen der beiden Enantiomeren in allen Verhältnissen Gegenstand der Erfindung. Bei Vorliegen einer cis/trans-lsomerie sind sowohl die cis-Form als auch die trans-Form und Gemische dieser Formen in allen Verhältnissen Gegenstand der Erfindung.
Tests zur Ermittlung der biologischen Aktivitäten der Eurotinone:
Der Tyrosin-Kinase-Rezeptor KDR stellt das Testtarget dar. KDR spielt beim Wachstum von Endothel und bei der Angiogenese eine Schlüsselrolle und ist somit auch an der Entstehung von Tumoren beteiligt. KDR ist somit ein wichtiges therapeutisches Zielmolekül für Krebserkrankungen und andere proliferative Erkrankungen. Im Test wird anhand der Phosphorylierung eines spezifischen Peptid- Substrates die Aktivität der KDR-Kinase gemessen. Neben der inhibierenden Aktivität auf die genannten Kinasen, werden auch weitere Kinasen, die ebenfalls an der Krebsentstehung bzw. in der Entzündungskaskade beteiligt sind, durch die Eurotinone gehemmt.
Aufgrund ihrer wertvollen pharmakologischen Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur speziellen Anwendung als Arzneimittel in der Human- und/oder Tiermedizin. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können bei Krebserkrankungen verwendet werden, insbesondere als Chemotherapeutika. Aufgrund ihrer antioangiogenetischen Eigenschaften und der damit verbundenen
Antitumor-Aktivität können sie insbesondere als Mittel gegen maligne Entartungen bei Tieren sowie beim Menschen eingesetzt' werden. Darüber hinaus ist ein Einsatz zur Prävention denkbar um erneutes Wachstum eines Tumors nach erfolgter Therapie zu verhindern. Die erfindungsgemäßen Eurotinone der Formel I können sowohl zur Monotherapie, wie auch in Kombinationstherapie mit anderen Zytostatika im Rahmen einer chemotherapeutischen Tumorbehandlung verwendet werden. Aufgrund der unterschiedlichen Angriffspunkte von Zytostatika und Angiogenese-Inhibitoren kann die Kombinationstherapie zu einer synergistischen Wirkung von KDR-Inhibitoren mit den bisher bekannten Zytostatika führen.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen, die ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Eurotinone der Formel I sowie gegebenenfalls zusätzlich ein Zytostatikum als weiteren Wirkstoff enthalten. Bevorzugt ist die Verwendung in Mischung mit geeigneten Hilfsstoffen oder Trägermaterial. Als Trägermaterial können beim Menschen alle pharmakologisch verträglichen Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und gegebenenfalls weiteren geeigneten Wirk, Zusatz- oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral, lokal oder parenteral verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-)Kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Her-stellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig verwendete Träger- oder Hilfsstoffe seien z.B. Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere'Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cellulose und ihre Derivate, tierische oder pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Glycerin und mehrwertige Alkohole genannt.
Gegebenenfalls können die Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung mikroverkapselt werden, um die Abgabe zu verzögern oder über einen längeren Zeitraum auszudehnen, wie beispielsweise durch Überziehen oder Einbetten des Wirkstoffs in Teilchenform in geeignete Polymere, Wachse oder dergleichen.
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis einer oder mehrerer Verbindungen der erfindungsgemäßen Eurotinone der Formel I enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln und Suppositorien kann diese Dosis bis zu etwa 500 mg, bevorzugt jedoch etwa 0,1 bis 200 mg, und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu etwa 500 mg, vorzugsweise aber etwa 0,1 bis 100 mg, pro Tag betragen.
Die zu verabreichende Tagesdosis ist abhängig vom Körpergewicht, Alter, Geschlecht und Zustand des Patienten. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber in mehreren kleineren Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.
In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht. Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden. Beispiele
Beispiel 1
Herstellung einer Glycerinkultur von Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872
30 ml Nährlösung (Malzextrakt 2,0%, Hefeextrakt 0,2%, Glucose 1 ,0% (NH4)2 HP04 0,05%, pH 6,0) in einem sterilen 100 ml Erienmeyerkolben werden mit dem Stamm Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, beimpft und 6 Tage bei 25° C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. 1 ,5 ml dieser Kultur werden anschließend mit 2,5 ml 80%igem Glycerin verdünnt und bei -135°C gelagert.
Beispiel 2
Herstellung einer Vorkultur im Erienmeyerkolben von Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872
100 ml Nährlösung (Malzextrakt 2,0%, Hefeextract 0,2%, Glucose 1,0% (NH4)2 HP04 0,05%, pH 6,0) in einem sterilen 300 ml Erienmeyerkolben werden mit dem Stamm Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, beimpft und 7 Tage bei 25° C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. 2 ml dieser Vorkultur werden anschließend für die Herstellung der Hauptkulturen verwendet.
Beispiel 3 Herstellung einer Hauptkultur Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872 auf Festmedium Platten.
30 sterile 25 x 25 cm Platten werden mit 200 ml der folgenden Nährlösung 20 g/L Malzextrakt, 20 g/L Haferflocken, 2% Agar und pH 7.0 gegossen. Diese Platten werden mit 2 ml einer Vorkultur beimpft und bei 25° C inkubiert. Die maximale Produktion des erfindungsgemäßen Eurotinon ist nach ca. 360 Stunden erreicht. Beispiel 4
Herstellung einer flüssigen Hauptkultur von Eurotium echinulatum Delacroix, DSM
13872.
Ein steriler 300 ml Erienmeyerkolben mit 100 ml der folgende Nährlösung Malzextrakt 2,0%, Hefeextrakt 0,2%, Glucose 1 ,0% (NH4)2 HP0 0,05%, pH 6 wird mit einer auf einem Schrägröhrchen (gleiche Nährlösung, jedoch mit 2% Agar) gewachsenen Kultur oder mit 2 ml einer Vorkultur (s. Beispiel 2) beimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25° C inkubiert. Die maximale Produktion des erfindungsgemäßen Eurotinons ist nach ca. 360 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 10 bis 200 L
Fermentern genügt eine 96 bis 144 Std. alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 10%) aus der gleichen Nährlösung. Die Bedingungen für diese Fermenter sind: Temperatur 25° C Rührergeschwindigkeit: 200 UpM Belüftung 15 I Min"1 ■
Durch wiederholte Zugabe von ethanolischer Polyollösung kann die Schaumbildung unterdrückt werden. Das Produktionsmaximum wird nach ca. 96 bis 144 Stunden erreicht.
Beispiel 5
Isolierung des Eurotinons aus einer Fermentation auf Festmedium
150 nach Beispiel 3 inkubierte Festmedium Platten wurden lyophilisiert und das Lyophilisat anschliessend mit Methanol (20-30 L) extrahiert. Der Methanolextrakt wurde am Vakuum auf 10 L reduziert und mit Wasser auf einen Methanolgehalt von 10% verdünnt. Der verdünnte Extrakt wurde anschliessend auf eine vorbereitete Glassäule (BPG 100, 4L Innenvolumen, Fa. Pharmacia Biotech) aufgetragen , die mit ca. 2 Liter MCI-Gel® CHP-20P Material (Adsorberharz der Fa. Mitsubishi Chemicals, Japan) gefüllt war. Eluiert wurde mit einem Gradienten von 100% Wasser nach 100% Isopropylalkohol. Der Säulendurchfluß (1 L / 6min) wurde fraktioniert aufgefangen (je 1 L). Sämtliche Fraktionen wurden im KDR-Assay getestet und die aktiven Fraktionen (Fr. 6-14) zusammengefasst. Diese wurden am Vakuum auf ca. 10 L reduziert und diese Lösung erneut mit Wasser auf einen Gehalt von 10% der Ausgangslösung verdünnt. Die entstehende Lösung wurde nochmals auf eine Säule (s.o.) aufgetragen, die mit ca. 1 ,5 Liter MCI-Gel® CHP-20P Material gefüllt war. Eluiert wurde mit einem Gradienten von 100% Wasser nach 100 % Acetonitril. Der Säulendurchfluß (1 L / 6min) wurde fraktioniert aufgefangen (je 1 L) und die im Test aktiven Fraktionen (Fr. 4-11 ) erneut zusammengefasst. Konzentrieren am Vakuum und anschliessende Lyophilisierung ergaben ca. 16 g braunes Pulver.
Beispiel 6
Reinigung des Eurotinons mittels Chromatographie
Ca. 2 g des nach Beispiel 5 gewonnen Pulvers wurden auf einer LUNA® 10 μ C18 (2) Säule (Größe: 50 mm x 250 mm, Fa. Phenomenex, Deutschland) mit Vorsäule LUNA® 10 μ C18 (2) (Größe: 21.2 mm x 60 mm) aufgetragen und mit einem Gradienten von 10 % bis 40 % Acetonitril in 0,1 % Ammoniumacetat/Wasser über 40 Minuten chromatographiert. Der Durchfluß des Elutionsmittels betrug 125 ml/min, die Fraktionsgröße 125 ml. In den Fraktionen 14 und 15 befand sich das Eurotinon. Die Lyophilisierung der genannten Fraktionen ergab ca. 320 mg angereichertes Eurotinon. Ein weiterer Aufreinigungsschritt mittels HPLC an der gleichen RP-18 Säule wie oben erfolgte mit einem Gradienten von 20 % nach 30 % in 30 Minuten. Die Eurotinonhaltigen Fraktionen wurden vereinigt, entsalzt und gefriergetrocknet. Dabei erhielt man 210 mg Eurotinon (Verbindung 1 ) (Reinheit > 95 %). Auch hier wurden alle Fraktionen der einzelnen Trennschritte im Biotest untersucht.
Beispiel 7
Methylierung von Eurotinon
35 mg ( = 0,12 mmol) des gemäß Beispiel 6 gewonnen Eurotinons wurden in MeOH (5 ml) gelöst und mit Trimethylsilyldiazomethan im 6-fachen molaren Überschuß versetzt. Die Reaktionsmischung wurde "30 min. bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zur Trockene eingeengt. Das erhaltene Gemisch wurde an einer LUNA® 5 μ C18 (2) Säule (Größe: 10 mm x 250 mm) chromatographisch aufgetrennt. Eluiert wurde mit einem Gradienten von 20 % nach 60 % Acetonitril in Wasser mit Zusatz von 0,1 % Ammoniumacetat über 50 min mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6,5 ml/min. Der Säulendurchfluß wurde fraktioniert aufgefangen (je 6,5 ml Fraktionen). Die Fraktionen 19 - 22 enthielten 7,5 mg des Dimethylderivats 2,12-Dimethyleurotinon (Verbindung 2), die Fraktionen 23-25 enthielten 6 mg des Monomethylderivats 2- Methyleurotinon (Verbindung 3).
Beispiel 8
Charakterisierung des Eurotinons (Verbindung 1 )
Die physikalisch-chemischen sowie spektroskopischen Eigenschaften des Eurotinons lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Summenformel: C15H12O6 Strukturfomel:
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Molekulargewicht: 288
UV-Maxima: 200, 262, 330 nm 1H- und 13C-NMR: siehe Tabelle 1
Tab. 1 : NMR-chemische Verschiebungen von Eurotinon, c = 4.5 mg /ml, DMSO-D6 bei 300 K
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Beispiel 9
Charakterisierung des 2,12-Dimethyleurotinons (Verbindung 2)
Die physikalisch-chemischen sowie spektroskopischen Eigenschaften des 2,12-Dimethyleurotinons lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Summenformel: C17H-ι6θ6 Strukturformel:
Figure imgf000020_0001
Molekulargewicht: 316 UV-Maxima: 200, 262, 330 nm 1H- und 13C-NMR: siehe Tabelle 2 Tab. 2 : NMR-chemische Verschiebungen des 2,12- Dimethyleurotinons, c = 2.5 mg /ml, DMSO-D6 bei 300 K
Figure imgf000021_0001
Beispiel 10
Charakterisierung des 2-Methyleurotinons (Verbindung 3)
Die physikalisch-chemischen sowie spektroskopischen Eigenschaften des 2- Methyleurotinons lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Summenformel: Cι6H14θ6 Strukturformel:
Figure imgf000022_0001
Molekulargewicht: 302 UV-Maxima: 200, 262, 330 nm 1H- und 13C-NMR: siehe Tabelle 3
Tab. 3 : NMR-chemische Verschiebungen des 2-Methyleurotinons, c = 2.5 mg /ml, DMSO-D6 bei 300 K
Figure imgf000022_0002
Beispiel 11 :
Untersuchung der KDR-Kinase Aktivität
Zur Bestimmung der KDR- Kinase wird mit gereinigtem Enzym in 384 well Mikrotiterplatten (Coated FlashPlates NEN Life Science) gearbeitet. Die Enzymaktivitäten werden mittels der Phosphorylierung eines spezifischen Peptidsubstrates bestimmt. Eine vorher vorbereitete Verdünnungsreihe der Eurotinone mit Konzentrationen von 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.7813, 0.3906, 0.195, 0.094, 0.047 und 0 μM wird in der entsprechenden Reihenfolge in die Versuchsansätze pipettiert. Anschließend erfolgt die Zugabe des Reaktionsgemisches (radioaktiv markiertes ATP, Pufferlösung pH 7,4 und Enzymlösungen) und Inkubation für 1 h bei RT.
Beschreibung des KDR-Assays: Material und Methoden:
Platten: 384-well FlashPlates von NEN life science.
Reader: Wallac MicroBeta Trilux counter
Reagenzien:
Substrat-Peptid: PLCγl Enzym: KDR-Kinase (VEGF-Rezeptor)
Kinase-Puffer:
50mM MOPS, pH7.4, 10mM MgCI2, 2mM DTT, 2.5mM EDTA,
10mM ß-Glycerolphosphat, 1mM Ortho-vanadat und 1 mM Natriumfluorid.
Lösung zum Beschichten: 20 μg/ml Peptidsubstrat in PBS Puffer (kein Mg++, kein Ca++)
ATP-Lösung: 25μCi/ml 33P-γ-ATP und 12.5 μM kaltes ATP
KDR-Enzymlösung: 3.5μg/ml in Kinase-Puffer
Waschlösung : PBS (kein Mg++, kein Ca++)
384-well FlashPlates werden mit 60 μl (1.2 μg/well) des Peptidsubstrates bei 4°C über Nacht beschichtet und 3 x mit jeweils 80 μl PBS gewaschen. Die so beschichteten Platten können für kürzere Zeit bei 4°C und über einen längeren Zeitraum bei -20°C gelagert werden.
Reaktion: In einem Endvolumen von 50 μl enthält der Assay
10 μl verdünnte Eurotinonlösung
20 μl Enzymlösung einer Konzentration von 3.5μg/ml (70 ng/well)
20 μl ATP-Lösung (Endkonzentration von 0.5 μCi heißem und 5μM kaltem ATP/well)
Die Reaktionsmischung wird eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Anschließend werden die Platten dreimal mit je 75 μl Waschlösung gewaschen und die Radioaktivität in einem MicroBeta counter (Wallac) 30 Sekunden lang gemessen.
Alle Proben werden doppelt getestet in einer Endkonzentration von 1 :30. Auf jeder Platte werden 16 wells verwendet, um die totale Enzymaktivität zu überprüfen (= Enzym-Kontrolle). Weitere 16 wells werden mit 4 μg/well Casein ohne Substrat beschichtet um die nicht-spezifische Inhibierung zu testen. Die Aktivität der KDR-Kinase wird über den Einbau von radioaktivem Phosphat in das Substrat aus ATP gemessen und daraus die inhibierende Wirkung der Eurotinone (IC50 ) berechnet. Die Inhibierung wird berechnet als:
[1 -(CPM Probe-CPM nicht spez.)/(CPM Enzym-Kontr.-CPM nicht spez.)] x 100 (%).
IC50 Werte [μM]:
Eurotinon (Verbindung 1 ): 22 2, 12-DimethyIeurotinon (Verbindung 2) 155
2-Methyleurotinon (Verbindung 3) 18

Claims

Ansprüche:
1. Verbindung der allgemeinen Formel
Figure imgf000025_0001
worin
R(1), R(2), R(3) und R(4) unabhängig voneinander, Wasserstoff oder einen Alkylrest bedeuten, in allen ihren stereochemischen Formen und Gemische dieser Formen in jedem Verhältnis, sowie deren physiologisch verträglichen Salze.
2. Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1 , worin R(1), R(2), R(3) und R(4) unabhängig voneinander Wasserstoff, (C C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl, (C2-C6)-Alkinyl; C3-C6-Cycloalkyl oder (CvC3)-All yl-(C3-C6 )-Cycloalkyl bedeutet, wobei die obengenannten Alkylreste gegenenfalls mit einem oder mehreren Resten substituiert sein können, in allen ihren stereochemischen Formen und Gemische dieser Formen in jedem Verhältnis, sowie deren physiologisch verträglichen Salze.
3. Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1 oder 2 worin R(1), R(2), R(3) und R(4) unabhängig voneinander Wasserstoff oder
Figure imgf000025_0002
bedeuten, in allen ihren stereochemischen Formen und Gemische dieser Formen in jedem Verhältnis, sowie deren physiologisch verträglichen Salze.
4. Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1 bis 3, worin R(1), R(2), R(3) und R(4) unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl bedeuten, sowie deren physiologisch verträglichen Salze.
5. Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1 bis 4, worin R(1 ), R(2), R(3) und R(4) Wasserstoff bedeuten, sowie deren physiologisch verträglichen Salze.
6. Verbindung der Formel
Figure imgf000026_0001
sowie deren physiologisch verträglichen Salze.
Verbindung der Formel
Figure imgf000026_0002
sowie deren physiologisch verträglichen Salze.
8. Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz davon gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-7, herstellbar indem der Mikroorganismus Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) oder einer seiner Varianten oder Mutanten unter geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium fermentiert wird, bis sich eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel I anhäufen und diese anschließend aus dem Kulturmedium isoliert und gegebenfalls in ein Derivat der Formel I oder in physiologisch verträgliche Salze überführt werden.
9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz davon gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) oder einer seiner Varianten oder Mutanten unter geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium fermentiert wird, bis sich eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel I in dem Kulturmedium anhäufen und anschließend aus dem Kulturmedium isoliert und gegebenenfalls in ein Derivat der Formel I oder in physiologisch verträgliche Salze überführt werden.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 20 und 35 °C und bei einem pH zwischen 6,5 und 7,5 durchgeführt wird.
11. Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872)
12. Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz davon gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 7 zur Verwendung als Arzneimittel.
13. Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz davon gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 7 zur Verwendung als Arzneimittel zur Hemmung der KDR-Kinase.
14. Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz davon gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 7 zur Verwendung als Arzneimittel zur Hemmung der Angiogenese.
15. Pharmazeutische Zubereitung mit einem Gehalt an mindestens einer Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz davon gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 7.
16. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 15 zusätzlich enthaltend ein Zytostatikum.
17. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz davon gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-7 mit geeigneten Hilfs- und/oder Trägerstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.
18. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 15 und 16 zur Verwendung zur Behandlung von malignen Erkrankungen.
19. Verwendung von Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) zur Gewinnung von KDR-Kinase Inhibitoren.
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