WO2003000926A2 - Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierung mit hoher sensitivität - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for
  • Detection of cytosine methylation in DNA samples is used in particular to detect the presence or absence of cytosine methylation in the DNA to be examined in samples of an individual in which there is background DNA of the same individual which is not to be examined and which only differs in methylation status from the DNA to be examined.
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, in genetic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, a PCR amplification goes the epigenetic information which the 5-methylcytosins carry is completely lost.
  • the bisulfite technique has so far been used with a few exceptions (e.g. Zeschnigk M, Lieh C, Buiting K, Dörfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Geet. 1997 Mar-Apr; 5 (2): 94-8) only used in research. However, short, specific pieces of a known gene are always amplified after bisulfite treatment and either completely sequenced (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet.
  • COBRA a sensitive and quantitative DNA methylation as- say. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12): 2532-4). Detection by hybridization has also been described (Olek et al., WO 99 28498).
  • Urea improves the efficiency of bisulfite treatment before the sequencing of 5-methylcytosine in genomic DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequencing of 5'-methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26 (21): 5009-10).
  • Other publications dealing with the use of the bisulfite technique for methylation detection in individual genes are: Grigg G, Clark S. sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun.; 16 (6): 31-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Dörfler W.
  • Imprinted segments in the human genome different DNA methylation patterns in the Prader- Willi / Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6 (3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic sequencing. Nuclear Acids Res. 1994 Feb. 25; 22 (4): 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5 'region of the pS2 gene andin its expression in human breast cancer cell lines. Genes. 1995 May 19; 157 (1-2): 261-4; WO97 / 46705, W095 / 15373 and WO97 / 45560.
  • methylation-sensitive PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG Islands. Proc Natl Acad Be US A. Sep 3; 93 (18): 9821-6).
  • primers are used which either hybridize only to a sequence which arises from the bisulfite treatment of a DNA which is unmethylated at the position in question, or vice versa primers which binds only to a nucleic acid which is caused by the bisulfite treatment a DNA that is unmethylated at the position in question is formed. With these primers it is therefore possible to generate amplificates, the detection of which in turn indicates the presence of a methylated or non-methylated provide methylated position in the sample to which the primers bind.
  • a newer method is also the detection of cytosine methylation by means of a Taqman PCR, which has become known as MethylLight (WO00 / 70090). With this method it is possible to detect the methylation status of individual or fewer positions directly in the course of the PCR, so that a subsequent analysis of the products is not necessary.
  • fluorescent-labeled probes For the scanning of an immobilized DNA array, fluorescent-labeled probes have been used in many cases.
  • the simple attachment of Cy3 and Cy5 dyes to the 5 'OH of the respective probe is particularly suitable for fluorescent labels.
  • the fluorescence of the hybridized probes is detected, for example, using a confocal microscope.
  • the dyes Cy3 and Cy5, among many others, are commercially available.
  • Mass spectrometry is a very powerful development for the analysis of biomolecules (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with olecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct. 15; 60 (20): 2299-301).
  • An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. Through a After a short laser pulse, the matrix is evaporated and the analyte molecule is thus transported unfragmented into the gas phase. The ionization of the analyte is achieved by collisions with matrix molecules.
  • An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, ions are accelerated to different extents. Smaller ions reach the detector earlier than larger ones.
  • MALDI-TOF spectroscopy is excellently suited for the analysis of peptides and proteins.
  • the analysis of nucleic acids is somewhat more difficult (Gut, IG and Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectro etry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147-157.)
  • the sensitivity for nucleic acids is about 100 times worse than for peptides and decreases disproportionately with increasing fragment size. For nucleic acids that have a backbone that is often negatively charged, the ionization process through the matrix is much more inefficient.
  • MALDI-TOF spectroscopy the choice of the matrix plays an eminently important role.
  • Genomic DNA is obtained by standard methods from DNA from cell, tissue or other test samples. This standard methodology can be found in references such as Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • PCR multiplexing of the PCR
  • nested PCR which is used, among other things, to detect particularly small amounts of DNA.
  • This type of PCR consists of two successive amplifications, the primers of the second amplification lying within the first amplification and not identical to the primers of the first amplification. This achieves a special specificity, since the primers of the second amplification only work if the intended fragment was generated in the first amplification. In contrast, the multiplication of possible by-products of the first amplification in the second is almost impossible.
  • the present invention is intended to solve the problem that the current methods are not able to DNA or the serum to be examined can be specifically amplified if other, sequence-homologous DNA sections of other origin are present at the same time.
  • One way of differentiating these DNAs is through the different methylation patterns.
  • a common method is the methylation-sensitive PCR, MSP for short (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG is- lands. Proc Natl Acad Sci US A. Sep 3; 93 (18): 9821-6).
  • This process consists of several steps. First of all, a bisulfite treatment corresponding to the prior art is carried out, which in turn leads to all cytosine bases being converted to uracil, while the methylated cytosine bases (5-
  • Methylcytosine remain unchanged.
  • the state of the art is again a method developed by Epigenomics, which amplifies the DNA to be examined and background DNA after bisulfite treatment in the same way and then examines the former CpG positions contained in the fragment by hybridization techniques, alternatively using mini-sequencing or other common methods.
  • This has the advantage that a quantitative picture is obtained regarding the methylation positions examined, ie Mung the degree of methylation of a variety of positions, which, for. B. allows a very precise classification for solid tumors.
  • the disadvantage of this method is that it cannot give a precise statement in cases where the background DNA predominates strongly, since this is amplified exactly like the DNA to be examined and both are analyzed in a mixture. This problem does not exist in the analysis of solid tumors, where the material to be examined can be specifically selected, but it can make analysis of, for example, serum DNA difficult.
  • the aim of the present invention is now to overcome the disadvantages of the prior art and to combine the advantages of both methods for the detection of methylation patterns in body fluids and serum. As mentioned above, this is particularly important for the detection of different methylation patterns in tumors, which can be detected in this way from, for example, serum.
  • the object is achieved in that a method for the detection of cytosine methylation in DNA samples is created by carrying out the following steps:
  • the chemically treated DNA sample is amplified using preferably at least 2 primer oligonucleotides by means of a polymerase reaction, the DNA is cut enzymatically selectively at positions which have a methylation status in the DNA sample which is not characteristic of the DNA to be examined further, but not of background DNA; the DNA that has not been enzymatically cut is amplified in a further polymerase action, thereby enriching the DNA to be examined against any background DNA;
  • the certificate is examined for its sequence properties and the methylation status in the DNA to be examined in the genomic DNA sample is deduced therefrom.
  • the DNA samples are obtained from serum or other body fluids of an individual.
  • the primers used in the amplifications particularly preferably do not amplify fragments of genomic DNA not treated with bisulfite (or only to a negligible extent), so that they are specific for the DNA converted with bisulfite. This protects against erroneous results in the event of an incomplete conversion reaction with, for example, sodium bisulfite.
  • the enzymatic cut of the background DNA is particularly preferably carried out using a restriction endonuclease or several different restriction enzymes. If several restriction endonucleases n are used, it depends on the respective buffers whether they are used sequentially or simultaneously. The skilled worker is familiar with the use of restriction enzymes in accordance with the protocols supplied by the manufacturers.
  • restriction enzymes cut because after the bisulfite conversion they differentiate between TG and CG or on the opposite strand between CG and CA dinucleotides must, all sequences that contain one of these motifs.
  • restriction endonucleases cut particularly preferably either at positions before the bisulfite
  • Conversion and amplification corresponded to an essentially methylated CpG position in the DNA to be examined, while the background DNA at this position was essentially unmethylated and / or the restriction endonucleases cut at positions which essentially corresponded to the prior to bisulfite conversion and amplification unmethylated CpG position in the DNA to be examined corresponded, while the background DNA was essentially methylated at this position.
  • At least 90% of all fragments generated in the previous amplification are cut in the restriction step. Given the completeness of this enzymatic step, this is especially the case when the DNA to be examined makes up less than 10% of the total DNA. However, this is particularly preferred, since then the advantages of the method presented here have a particular advantage over conventional techniques, the high specificity due to the two different amplifications together with the high selectivity for the DNA to be examined.
  • the second amplification step it is therefore particularly preferred in the second amplification step to additionally or exclusively use primers which hybridize to the amplificates of the first step but do not hybridize to the primers of the first amplification step or are essentially homologous to them in essential sections.
  • a nested PCR is thus carried out in this method, the fragments of the enzymes being encoded between the amplification steps. cut mathematically, which you assign to the background DNA. These fragments can then no longer serve as templates for a PCR in the subsequent amplification, and consequently only the DNA to be examined is amplified.
  • the restriction sites lie within the sequence section which is also to be increased in the second amplification. Nevertheless, a variant of the method is preferred, in which the same set of primers is used in both amplification steps. This is particularly advantageous if highly multiplexed PCR is carried out, since the establishment of these reactions is complex and in this way the double establishment of an associated primer set with the corresponding reaction conditions is saved. This then affects the specificity of these amplifications.
  • the first amplification step is carried out as a multiplex PCR. It is also particularly preferred to carry out both amplification steps as multiplex PCR.
  • Restriction endonuclease (s) cleavage sites overlap.
  • the hybridization of the primers to the cut amplicons is prevented from the outset in this step, which again promotes the specific amplification of the fragments resulting from the DNA to be examined.
  • the background DNA is present in a 100-fold concentration in comparison to the DNA to be examined. It is further preferred that the background DNA is in 1000 times the concentration compared to the DNA to be examined.
  • the analysis is carried out by means of hybridization on oligomer arrays, where oligomers can be nucleic acids or their hybridization properties can be molecules similar to PNAs.
  • the oligomers hybridize over a 12-22 base long section to the DNA to be analyzed and that they comprise a CG, TG or CA dinucleotide.
  • methylation status of more than 10 methylation positions of the DNA to be analyzed is detected in an experiment.
  • methylation status of more than 60 methylation positions of the DNA to be analyzed is detected in an experiment.
  • the analysis is carried out by measuring the length of the amplified DNA to be examined, methods for measuring the length comprising gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, chromatography (e.g. HPLC), mass spectrometry and other suitable methods.
  • methods for sequencing include the Sanger method, Maxam-Gilbert method and other methods such as Sequencing by Hybridization (SBH).
  • a method according to the invention is also preferred, in which the sequencing for each or a small group of CpG positions, each with a separate primer oli executes gonucleotide and the extension of the primers is only one or a few bases, and the type of primer extension is used to infer the methylation status of the positions in question in the DNA to be examined.
  • the degree of methylation at the various CpG positions examined indicates the presence of a disease or another medical condition of the patient.
  • the amplified products are provided with a detectable label even for the detection.
  • These labels are preferably introduced into the generated fragments either by labeling the primers or the nucleotides during the amplification.
  • the markings are fluorescent markings and / or that the markings are radionuclides or / and that the markings are detachable mass markings that are detected in a mass spectrometer.
  • one of the primers is bound to a solid phase during the amplification.
  • solid phases can be, for example, functionalized polymers, metals, glass or semiconductors such as silicon.
  • the primers are preferably bound via binfunctional linker molecules which are bound to a silanized surface or, for example, via thioates in the primer to bromoacetyl-derivatized surfaces or gold.
  • the amplificates are detected overall in the mass spectrometer and are therefore clearly characterized by their mass. It is also particularly preferred to observe the formation of specific fragments during the amplification using reporter oligonucleotides, which change their fluorescence properties through specific interaction with the respective amplicon and other oligonucleotides, the primers and / or the polymerase.
  • reporter oligonucleotide in addition to the reporter oligonucleotide, another oligomer labeled with a fluorescent dye is used, which hybridizes immediately adjacent to the reporter oligonucleotide and this hybridization can be demonstrated by means of fluorescence resonance energy transfer. It is also advantageous that a Taqman assay is carried out. It is also preferred that a light cycler assay is carried out. It is further preferred that the reporter oligonucleotides carry at least one fluorescent label. It is also preferred that the reporter molecules indicate the amplification either by an increase or a decrease in the fluorescence. It is particularly advantageous that the increase or decrease in fluorescence is also used directly for the analysis and a conclusion is drawn from the fluorescence signal that the DNA to be analyzed is in a methylated state.
  • Another object of the present invention is the use of a method according to the invention for the diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals, these adverse events belonging to at least one of the following categories: undesirable drug effects; Cancers; CNS malfunction, damage or illness; Symptoms of aggression or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain damage; psychotic disorders and personality disorders gene; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular disease, malfunction and damage; Malfunction, damage or disease of the gastrointestinal tract; Malfunction, damage or disease of the respiratory system; Injury, inflammation, infection, immunity and / or convalescence; Malfunction, damage or illness of the body as a deviation in the development process; Malfunction, damage or disease of the skin, muscles, connective tissue or bones; endocrine and metabolic dysfunction, injury or illness; Headache or sexual malfunction.
  • the present invention also relates to a kit consisting of a reagent containing bisulfite, primers for producing the amplificates, and optionally instructions for carrying out an assay according to the invention.
  • the present invention thus describes a method for the detection of the methylation state of genomic DNA samples.
  • the degree of methylation of a set of CpG positions in a selected subset of DNA fragments is e.g. B. determined in serum, so that an analysis is possible even in the presence of an excess of diagnostically irrelevant background DNA.
  • the fragments obtained in the second amplification step are analyzed for their methylation signature and the degree of methylation preferably of several former CpG positions in the amplificates is determined. From the degree of methylation at the various CpG positions examined, preference is given to the presence of a disease or another patient's medical condition.
  • qualifier positions serve to distinguish between the two amplification steps, in the case of enzymatic cleavage, between the DNA to be analyzed and the background DNA.
  • this can be done in different ways.
  • the classifying positions serve to extract the information of importance for the diagnosis from the amplified product, generated predominantly from the DNA to be examined, about the respective degree of methylation.
  • classifier positions can be used for an analysis, for example the analysis is carried out on oligo arrays, even if this is often not necessary. In this case, however, it is not so much the emergence of a particular amplificate that is important for the examination result, but rather the analysis of the CpG positions in the same amplificate. This distinguishes the method described here fundamentally from other otherwise known methods used for methylation analysis, such as MSP. In some cases, however, it is certainly possible and sensible to include the information derived from the creation of an amplificate in the analysis. In this case, some positions are classifiers and qualifiers at the same time. A particularly preferred possible procedure is described below.
  • the first step of the process is preferably carried out by removing body fluids such as. B. Sputu or serum, but it is obvious that the method can be carried out with a variety of samples from different sources.
  • the DNA is purified or concentrated before the bisulfite treatment in order to prevent the bisulfite reaction and / or the subsequent PCR from being disturbed by an excessive level of impurities.
  • a PCR can be carried out from tissue after treatment, for example with Proteinase K, without further purification, and this also applies mutatis mutandis to the bisulfite treatment and subsequent PCR.
  • a bisulfite hydrogen sulfide, disulfite
  • sodium bisulfite ammonium bisulfite is less suitable.
  • the reaction is carried out according to a published variant, the embedding of the DNA in agarose is preferred in order to keep the DNA in a single-stranded state during the treatment, or else according to a new variant by treatment in the presence of a radical scavenger and a denaturing reagent, preferably one Oligeothylene glycol dialkyl ether or, for example, dioxane.
  • the reagents are either removed by washing in the case of the agarose method or a DNA purification method (prior art, precipitation or binding to a solid phase, membrane) or simply brought into a concentration range by dilution which PCR no longer significantly affected.
  • the qualifier positions are selected and a suitable restriction enzyme is selected that allows selective cleavage of the background DNA that is not to be analyzed.
  • the positions are selected on the premise that they should differ as much as possible between the background DNA and the DNA to be investigated with regard to their methylation, and a suitable enzyme must also be available for the corresponding sequence context.
  • the restriction enzyme must also be selected so that there are no cuts, for example in other desired amplicons.
  • the methylation profiles of the relevant sections of a gene are determined both for the tumors to be examined and for the background DNA from healthy individuals. Those positions that have the greatest differences between tumor DNA and background DNA (for example in serum) are selected as qualifier positions. Such positions are already known for a large number of genes, for example for GSTpi, for HIC-1 and MGMT (from Wronski MA, Harris LC, Tano K, Mitra S, Bigner DD, Brent TP. (1992) Cytosine methylation and suppression of 06-methylguanine-DNA methyltransferase expression in human rhabdomyosarcoma cell lines and xenografts.
  • the chemically treated DNA is apli- multiplexing is possible.
  • qualifier positions but preferably also one or more classifier positions, within the DNA section delimited by the two primers. The order of these positions is irrelevant for setting up the assay described here.
  • digestion with one or more restriction enzymes is carried out, depending on the number of qualifier positions.
  • the primers, enzymes and possibly nukeotides that are still present are either removed by a purification step (for example, ethanol precipitation can be carried out or a commercially available purification kit is used for PCR products) or the solution is PCR Buffer diluted so significantly for the second amplification that the above-mentioned components are of no importance in this reaction.
  • a purification step for example, ethanol precipitation can be carried out or a commercially available purification kit is used for PCR products
  • the solution is PCR Buffer diluted so significantly for the second amplification that the above-mentioned components are of no importance in this reaction.
  • a plurality of qualifier positions and therefore accordingly a plurality of restriction enzymes specific for a methylation status present in the background DNA and thus after bisulfite conversion for a specific sequence can be used in such a method.
  • the primers of the second amplification are preferably within the fragment generated in the first amplification in such a way that they neither significantly overlap nor hybridize with the primers previously used. A nested PCR is therefore carried out. For the procedure to work, it must be ensured that the qualifier positions are within the second amplificate. It is possible for the primers of the second amplification to overlap with the qualifier position. borrowed. If this is so close to the 3 'end of the primer that no amplification can take place in the case of cut DNA.
  • the methylation status of several classifier positions can now preferably be determined, according to methods known per se.
  • the advantage here is that, due to the different G and C content of the two DNA strands, a forward primer can never function as a reverse primer, which facilitates multiplexing.
  • the fragments formed are now detected without obtaining any individual information about the degree of methylation of the former CpG positions present in them.
  • all possible known molecular biological methods come into question, such as gel electrophoresis, sequencing, liquid chromatography or hybridizations, without the classifier positions being analyzed separately. This would also be conceivable for quality control of the preceding process steps. As stated above, however, the subsequent analysis of the degree of methylation of the classifier positions is particularly preferred.
  • Hybridization to oligomer arrays can be used without further modification of protocols compared to the closest prior art (Olek A, Olek S, Walter J; W0-
  • Patent 99284908 it is preferred to hybridize the amplificates to an array of oligomers, which consists of pairs of oligonucleotides immobilized on a solid phase, one of which in each case very preferably hybridizes to a DNA section containing an originally unmethylated CpG (classifier position) and the other in turn very preferably to the corresponding section, in which a methylated CpG was originally contained, in each case before the bisulfite treatment and amplification.
  • an array of oligomers which consists of pairs of oligonucleotides immobilized on a solid phase, one of which in each case very preferably hybridizes to a DNA section containing an originally unmethylated CpG (classifier position) and the other in turn very preferably to the corresponding section, in which a methylated CpG was originally contained, in each case before the bisulfite treatment and amplification.
  • the amplified product or the amplified products is particularly preferably fluorescent or radioactive or labeled with detachable mass tags so that after the hybridization, the fragments bound to the two oligonucleotides of a pair can be detected and quantified using this label.
  • the array also contains qualifying position-detecting oligomers to control the experiment, since in this way the ratio of the DNA to be examined to the background DNA to be examined can be determined.
  • Primer extension reactions can also be carried out on oligonucleotides immobilized on a solid phase. Although not absolutely necessary, the immobilization of these primers is preferred since, as a rule, a large number of classifier positions from several amplicons are to be examined and this is significantly easier on a solid phase, ie on an oligomer array, and can be carried out in one experiment. It is particularly preferred that the primers are located directly next to a classifier position and that the extension takes place only by one nucleotide. It is particularly preferred that only dideoxythymidine and dideoxycytidine are added as nucleotides and that these are each labeled with a different fluorescent dye, although other, distinguishable labels such as mass tags are also conceivable and preferred.
  • the former methylated CG is now available as a CG and unmethylated CG as a TG.
  • the primer extension reaction therefore leads either to incorporate a dideoxycytidine or dideoxythymidine.
  • the degree of methylation of the respective position can be inferred from the ratio of the fluorescent markings detected in each case for these two terminators. It is also possible and preferred in this case to carry out the primer extension with deoxycytidine and de-soxythymidine if no guanine derivative is added and consequently the primer extension ends anyway after a base in the case of a TG or CG sequence.
  • a particularly preferred variant of the method is the simultaneous detection of qualifier positions and classifier positions in an experiment, which can be achieved by using Taqman or light cycler technology variants (real time PCR).
  • the second amplification is carried out as real time PCR with corresponding reporter oligonucleotides which can bind to different classifier positions. Pairs of such reporter oligonucleotides are preferably used, one oligonucleotide preferably binding to the sequence which corresponds to a methylated position before the bisulfite treatment, and the other to the sequence resulting from a correspondingly unmethylated position.
  • oligonucleotides that ensure amplification of the DNA to be examined, further fluorescence-labeled oligonucleotides are added, and the change in fluorescence during the PCR reaction is measured. Because the DNA to be examined is amplified, information about the methylation status of various classifier CpG positions is also obtained directly from this change in fluorescence. Since different oligonucleotides are preferably each provided with different fluorescent dyes, it is also possible to differentiate the change in fluorescence during the PCR separately for different positions.
  • oligonucleotide probes can be used which specifically bind either to a sequence which has been produced by chemical treatment from a DNA unmethylated at the corresponding position, or correspondingly to a sequence which has been chemically treated from a corresponding one Position methylated DNA has emerged.
  • These probes are particularly preferably provided with two fluorescent dyes, a quencher dye and a fluorescent dye serving as a marker. Both are linked to the same oligonucleotide probe. If a PCR reaction now takes place with the DNA to be examined as a template, the PCR reaction is blocked this time by the fluorescently labeled oligomer probe.
  • a cross-test with a probe that would bind to the classifier position in the other methylation state is therefore expedient and preferred.
  • Different fluorescent dyes with different emission wavelengths are preferably used on a plurality of probes together with the quencher in order to be able to differentiate the probes and thus multiplexing.
  • two competing probes with different dyes can preferably also be used, one again preferred in the case of an unmethylated position in the DNA to be examined, the other vice versa in the case of a methylated position binds.
  • the ratio of the increase in fluorescence for the two dyes can then be used to infer the degree of methylation of the investigated position.
  • a fundamentally different method, in which, however, a change in fluorescence also takes place during the PCR, is currently known as LightCyclertm technology. This takes advantage of the fact that fluorescence resonance energy transfer (FRET) can only take place between two dyes if they are in the immediate vicinity, ie 1-5 nucleotides apart. Only then can the second dye be excited by the emission of the first dye and then in turn emit light of a different wavelength, which is then detected.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a fluorescence-labeled probe is hybridized to the chemically treated DNA in question at a classifying position, and the binding of this probe in turn depends on whether the DNA to be examined was methylated or unmethylated at this position.
  • another probe binds with another fluorescent dye. This binding is in turn preferably sequence-dependent and therefore methylation-dependent if there is a further methylatable position in the relevant sequence section (always in each case after bisulfite treatment).
  • the DNA is now amplified during the amplification, which is why more and more fluorescence-labeled probes bind adjacent to the position in question, provided that this had the required methylation state before the bisulfite treatment, and therefore an increasing FRET is measured.
  • multiplexing is preferably carried out with a plurality of differently fluorescence-labeled probes.
  • the DNA isolated from serum is treated using bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) in such a way that all cytosines that are not methylated at the 5-position of the base are converted to uracil, while the cytosines methylated in the 5-position remain unchanged.
  • bisulfite hydrogen sulfite, disulfite
  • the agarose method known in the prior art and described above is used for this reaction.
  • the first amplification of a defined fragment with a length of 530 bp from the promoter region of the ELK-1 gene is now carried out using two primer oligonucleotides ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT (SEQ ID: 1) and
  • TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT SEQ ID: 2.
  • the amplified product is first isolated by ethanol precipitation and then incubated with Mae II according to the manufacturer's instructions (Röche Molecular Biochemicals). After the digestion has taken place, the solution is diluted 1: 10,000 with PCR buffer and a second amplification is carried out with the primer oligonucleotides TTTATTTTTATATAAGTTTTGTTT (SEQ-ID: 3) and CCCTTCCCTACAAAACTATAC (SEQ-ID: 4). These primer oligonucleotides are labeled with the fluorescent dye Cy5, which is why the fragment obtained in the PCR is also labeled.
  • Example 2
  • the amplificate produced in Example 1 is hybridized on a DNA chip.
  • Oligonucleotides have previously been immobilized on the chip.
  • the oligonucleotide sequences are derived from the amplified fragment of the ELK-1 gene mentioned in Example 1 and represented the CG dinucleotides, including the immediate surroundings.
  • the length of the oligonucleotides is 14-22 nucleotides, the position of the CG dinucleotide within the oligonucleotides is variable.
  • the DNA chip is measured on a fluorescence scanner (Genepix 4000A) and the hybridization signals are evaluated numerically.
  • FIG. 1 shows a DNA chip after hybridization with the promoter fragment.
  • the false color image is shown as it is generated after scanning. Contrary to the black and white illustration shown here, the scanner generates a colored image.
  • the intensity of the different colors represents the degree of hybridization, the degree of hybridization decreasing from red (shown in FIG. 1 as bright spots) to blue (shown in FIG. 1 as dark spots).
  • FIG. 2 schematically shows the basic procedure of the method according to the invention.
  • the background DNA not to be analyzed On the left side is the background DNA not to be analyzed, which is partially methylated in this example, and on the right side correspondingly unmethylated DNA to be analyzed.
  • the first step (A) one finds Bisulfite conversion takes place
  • the second step (B) the first amplification takes place.
  • the third step (C) the background DNA that is not to be analyzed is cleaved, the remaining DNA is then (D) amplified again.
  • Their sequence properties subsequently allow conclusions to be drawn about the methylation congestion of the DNA to be examined, in principle at all positions which are in the amplified region.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben, welches die Analyse zu untersuchender DNA bei Anwesenheit grösserer Mengen Hintergrund DNA des gleichen Individuums gestattet. Im ersten Schritt wird eine genomische DNA Probe chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit), derart behandelt, dass Cytosin in eine vom Basenpaarungsverhalten in der DNA-Duplex her unterschiedliche Base umgewandelt wird, während 5-Methylcytosin unverändert bleibt. Anschliessend werden Abschnitte der Proben-DNA mittels einer Polymerasereaktion amplifiziert. Die Amplifikate werden enzymatisch selektiv an solchen Positionen geschnitten, die in der DNA Probe einen Methylierungsstatus aufwiesen, welcher fuer die weiter zu untersuchende DNA nicht charakteristisch ist, nicht aber für Hintergrund-DNA. Die nicht enzymatisch geschnittene DNA wird nun in einer weiteren Polymeraseraktion amplifiziert, und dabei die zu untersuchende DNA gegenüber etwa vorhandener Hintergrund DNA angereichert. Das Amplifikat wird zuletzt hinsichtlich seiner Sequenzeigenschaften untersucht und daraus auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA in der genomischen DNA-Probe geschlossen.

Description

Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung mit hoher
Sensitivi ät
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum
Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben. Das Verfahren dient insbesondere zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Cytosin-Methylierung in zu untersuchender DNA in Proben eines Individuums, in denen nicht zu untersuchende Hintergrund DNA des gleichen Individuums vorliegt, die sich nur hinsichtlich des Methylierungsstatus von der zu untersuchenden DNA unterscheidet.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Ge- ne in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar . Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methyl- cytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-A plifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcyto- sine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten an- gewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methyl- cytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcyto- sin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällung- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and im- proved method for bisulphate based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24 (24 ): 5064-6) . Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Al- lerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa
3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylie- rungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus gerin- gen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren. Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü- bersichtsartikel entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modi- fications in DNA genomes. Nucleic Acids Res. 1998 May 15;26(10) :2255-64.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lieh C, Buiting K, Dörfler W, Hor- sthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus . Eur J Hum Ge- net . 1997 Mar-Apr; 5 (2) : 94-8) nur in der Forschung ange- wendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet . 1997 Nov. ; 17 (3) : 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) . Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12 ): 2529-31, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW.
COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation as- say. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12 ): 2532-4 ) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al . , WO 99 28498).
Harnstoff verbessert die Effizienz der Bisulfit- Behandlung vor der Sequenzierung von 5-Methylcytosin in genomischer DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequenc- ing of 5 ' -methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26 (21) : 5009-10) . Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun. ; 16 ( 6) : 31-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Dörfler W. Imprinted segments in the human genome : different DNA methylation patterns in the Prader- Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet . 1997 Mar;6(3) :387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic sequencing. Nu- cleic Acids Res. 1994 Feb. 25; 22 (4) : 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethyla- tion in the 5' region of the pS2 gene andin its expres- sion in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157 (1-2) :261-4; WO97/46705, W095/15373 und WO97/45560.
Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die sogenannte me- thylierungssensitive PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG Islands. Proc Natl Acad Sei U S A. Sep 3; 93 (18) : 9821-6) . Für dieses Verfahren werden Primer verwendet, die entweder nur an eine Sequenz hybridisieren, die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position un- methylierten DNA entsteht, oder aber umgekehrt Primer, welche nur an eine Nukleinsäure bindet, die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position un- methylierten DNA entsteht. Mit diesen Primer können demnach Amplifikate erzeugt werden, deren Detektion wiederum Hinweise auf das Vorliegen einer methylierten oder un- methylierten Position in der Probe liefern, an welche die Primer binden.
Ein neueres Verfahren ist auch der Nachweis von Cytosin- Methylierung mittels einer Taqman PCR, das als Methyl- Light bekannt geworden ist (WO00/70090) . Mit diesem Verfahren ist es möglich, den Methylierungsstatus einzelner oder weniger Positionen direkt im Verlauf der PCR nachzuweisen, so dass sich eine nachfolgende Analyse der Pro- dukte erübrigt.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung lässt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Ge- netics Supplement, Volume 21, January 1999) , der dort zitierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden zur Herstellung von festen Trägern für Zielmoleküle wie Oligonucleotide bei vermindertem nichtspezifischen Hintergrundsignal entnehmen.
Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoresziert markierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5 ' -OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-
Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Ka- ras M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of pro- teins with olecular masses exceeding 10,000 daltons . A- nal Chem. 1988 Oct . 15; 60 (20) : 2299-301) . Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch ei- nen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleu- nigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektroskopie eignet sich ausgezeichnet zur A- nalyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995) , DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ioniza- tion Mass Spectro etry . Molecular Biology: Current Inno- vations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektroskopie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnuklein- säuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedu- re for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die
Kopplung eines „Charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „Charge tagging"" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Nach der Erfindung der PCR sind in den folgenden Jahren zahlreiche Varianten bekannt geworden, die diese Technik zur Amplifikation der DNA verfeinern. Insbesondere ist hier die Multiplexierung der PCR (Multiplex-PCR) zu erwähnen, wobei man mehr als 2 spezifische Primer einsetzt und dabei in einem Reaktionsgefäß eine Vielzahl von verschiedenen, spezifische n Amplifikation erzeugen kann. Besonders interessant ist auch die sogenannte Nested PCR, welche unter anderem zum Nachweis besonders geringer DNA Mengen verwendet wird. Diese Art der PCR besteht aus zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationen, wobei die Primer der zweiten Amplifikation innerhalb des ersten A plifika- tes liegen und nicht mit den Primern der ersten Amplifikation identisch sind. Dadurch wird eine besondere Spezi- fität erreicht, da die Primer der zweiten Amplifikation nur dann funktionieren, wenn in der ersten Amplifikation das beabsichtigte Fragment erzeugt wurde. Dagegen ist die die Vermehrung etwaiger Nebenprodukte der ersten Amplifikation in der zweiten so gut wie ausgeschlossen.
Es sind demnach bislang vielerlei Verfahren zur Methylie- rungsanalyse Stand der Technik. Die vorliegende Erfindung soll jedoch das Problem lösen, dass die gängigen Verfahren nicht in der Lage sind, eine in einer Körperflüssig- keit oder Serum befindliche zu untersuchende DNA gezielt zu amplifizieren, wenn zugleich andere, sequenzhomologe DNA-Abschnitte anderen Ursprungs zugegen sind.
Dies wäre aber besonders vorteilhaft, da beispielsweise im Serum sich freie DNA aus unterschiedlichsten Quellen befinden kann. Da DNA aus unterschiedlichen Quellen in einem Individuum sich normalerweise nicht in der Sequenz, jedoch durchaus im Methylierungsgmuster unterscheidet (wenn man mal von etwa vorhandener viraler oder bakterieller DNA absieht) , besteht der Bedarf nach einem Verfahren, welches die DNA bevorzugt anreichert und da mit der genauen Methylierungsanalyse zugänglich macht, welche aus einer ganz bestimmten Quelle stammt. Dies ist besonders bedeutsam für den Nachweis abweichender Methylierungs- muster in Tumoren, die auf diese Art aus beispielsweise Serum nachgeweisen werden können.
Die zu untersuchende DNA sowie die ansonsten vorhandenen, im folgenden Hintergrund-DNA genannten Nukleinsäuren, werden in aller Regel gleichermaßen amplifiziert, da die verwendeten Primer auch nicht in der Lage sind, zwischen zu untersuchender DNA und Hintergrund-DNA zu unterscheiden. Eine Möglichkeit zur Unterscheidung dieser DNAs er- gibt sich jedoch durch das unterschiedliche Methylie- rungsmuster. Ein gängiges Verfahren ist die methylie- rungssensitive PCR, kurz MSP (Herman JG, Graff JR, Myoha- nen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG is- lands. Proc Natl Acad Sei U S A. Sep 3; 93 (18) : 9821-6) .
Dieses Verfahren besteht aus mehreren Teilschritten. Zunächst wird eine dem Stand der Technik entsprechende Bisulfit-Behandlung durchgeführt, welche wiederum dazu führt, dass alle Cytosinbasen in Uracil umgewandelt wer- den, während die methylierten Cytosinbasen (5-
Methylcytosin) unverändert bleiben. Im nächsten Schritt verwendet man nun Primer, welche vollständig komplementär zu einer methylierten, mit Bisulfit umgewandelten DNA sind, nicht jedoch zu einer entsprechenden DNA welche ursprünglich nicht methyliert vorlag. Das führt bei der Durchführung einer PCR mit einem solchen Primer dazu, dass ausschließlich die ursprünglich methylierte DNA amplifiziert wird. Entsprechend ist es möglich, einen Primer zu verwenden, der im Gegenzug nur die unmethylier- te DNA amplifiziert. Auf diese Art und Weise können, wenn zu analysierende DNA sowie Hintergrund DNA zugegen sind, ausschließlich die zu untersuchenden DNA Fragmente selektiv erzeugt werden, sofern sich diese hinsichtlich ihres Methylierungsstatus in einer CpG Position von der Hintergrund DNA unterscheiden.
Stand der Technik ist es nun, aus dem Nachweis eines solchen zu untersuchenden DNA-Moleküls auf den Methylie- rungszustand oder das Vorliegen einer zu untersuchenden DNA rückzuschließen, was wiederum eine Diagnose bei- spielsweise einer Tumorerkrankung in Patienten prinzipiell erlaubt, da es bekannt ist, das beispielsweise die Serum DNA-Konzentration sich in Tumorpatienten zum Teil drastisch erhöht. Nur die von den Tumoren stammende DNA soll dann neben der Hintergrund-DNA nachgewiesen werden. Prinzipiell vergleichbar ist die Analyse von DNA in anderen Körperflüssigkeiten.
Stand der Technik ist wiederum ein von Epigenomics entwickeltes Verfahren, welches zu untersuchende DNA und Hin- tergrund-DNA nach Bisulfit-Behandlung gleichermaßen amplifiziert und dann die im Fragment enthaltenen ehemaligen CpG Positionen durch Hybridisierungstechniken untersucht, alternativ mittels MiniSequenzierung oder anderen gängigen Verfahren. Dies hat den Vorteil, dass man ein quantitatives Bild bezüglich der untersuchten Methy- lierungspositionen erhält, d. h. es erfolgt die Besti - mung des Methylierungsgrades einer Vielzahl von Positionen, was z. B. bei soliden Tumoren eine sehr genau Klassifizierung ermöglicht. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass sie in den Fällen, in denen die Hintergrund- DNA stark überwiegt, keine genau Aussage liefern kann, da diese ja genau wie die zu untersuchende DNA amplifiziert wird und beide im Gemisch analysiert werden. Dieses Problem existiert nicht bei der Analyse von soliden Tumoren, wo man das zu untersuchende Material gezielt auswählen kann, es kann jedoch die Analyse von beispielsweise Serum-DNA erschweren.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es nun, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und die Vorteile beider Verfahren für die Detektion von Methylierungs- mustern in Körperflüssigkeiten und Serum zu kombinieren. Wie oben erwähnt ist dies besonders bedeutsam für den Nachweis abweichender Methylierungsmuster in Tumoren, die auf diese Art aus beispielsweise Serum nachgeweisen wer- den können.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben geschaffen wird bei dem dass man die folgenden Schritte aus- führt:
man behandelt eine genomische DNA-Probe, welche zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA umfasst, chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit (=Disulfit ,' Hydrogensulfit) , derart, dass alle nicht methylierten Cytosinbasen in Ura- cil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen unverändert bleiben; man amplifiziert die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von bevorzugt mindestens 2 Primeroligonukleo- tiden mittels einer Polymerasereaktion, die DNA wird enzymatisch selektiv an solchen Positionen geschnitten, die in der DNA Probe einen Methylierungsstatus aufwiesen, welcher fuer die weiter zu untersuchende DNA nicht charakteristisch ist, nicht aber für Hinter- grund-DNA; die nicht enzymatisch geschnittene DNA wird in einer weiteren Polymeraseraktion amplifiziert, dadurch wird die zu untersuchende DNA gegenüber etwa vorhandener Hintergrund DNA angereichert; das A plifikat wird hinsichtlich seiner Sequenzeigenschaften untersucht und daraus auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA in der genomischen DNA- Probe geschlossen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums gewinnt .
Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Proben DNA aus Zellinien, Blut, Sputu , Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbet- tetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Augen, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombina- tionen hiervon gewinnt.
Es ist ganz besonders erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt. Bevorzugt ist es auch, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agaro- se erfolgt. Es ist auch und weiterhin bevorzugt, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.
Besonders bevorzugt ist es auch, die Amplifikationen mehrerer unterschiedlicher Fragmente mit mehr als 2 ver- schiedenen Primern in einem Reaktionsgefäß durchzuführen und damit die Amplifikationsschritte als Multiplex-PCR auszuführen. Es ist generell besonders bevorzugt, die Amplifikationen als Polymerasekettenreaktion auszuführen.
Die in den Amplifikationen verwendeten Primer amplifizie- ren besonders bevorzugt keine Fragmente aus nicht mit Bisulfit behandelter genomischer DNA (oder nur in vernachlässigbarem Ausmaß) , so dass sie für die mit Bisulfit um- gewandelte DNA spezifisch sind. Dies schützt vor fehlerhaften Ergebnissen im Falle einer unvollständigen Umwandlungsreaktion mit beispielsweise Natriumbisulfit .
Der enzymatische Schnitt der Hintergrund-DNA wird beson- ders bevorzugt mit einer Restriktionsendonuklease oder mehreren unterschiedlichen Restriktionsenzymen ausgeführt. Werden mehrere Restriktionsendonuklease n verwendet, so hängt es von den jeweiligen Puffern ab, ob diese nacheinander oder gleichzeitig zum Einsatz kommen. Dem Fachmann ist die Anwendung von Restriktionsenzymen gemäß den von den Herstellern mitgelieferten Protokollen bekannt. Die hier im folgenden als bevorzugt aufgelisteten Restriktionsenzyme, welche kommerziell erhältlich sind, erheben nicht den Anspruch auf Vollständigkeit: Mae II, Psp 1406 I, Ast II, Ssp 5230 I, Bbr P I, Bsa AI, Sna B I, Cfo I, Hin Pl I, Eco 47 III, NAR I, Ehe I, Kas I, Bbe I, Hae II, Acy I, Ban I, Hgi CI, Aos I, Avi II, Hpa II, Msp I, Pin AI, Age I, Eco 56 I, Nae I, CfrlOI, SgrAI, Fse I, XmaCI, Sma I, Srf I, Ava I, Bse AI, Mro I, Taq I, Cla I, Sal I, Hind II, Acc 1, Xho I, Sfu I, BstBI, Hinf I, Sau 96 I, Dra II, Pssl, Ita I, Dsa V, Scr F I, Mae III, Bst E II, Dde I, Cel II, Esp I oder Aoc I.
Die Restriktionsenzyme schneiden, da sie nach der Bisul- fit Umwandlung zwischen TG und CG bzw. auf dem Gegenstrang zwischen CG und CA Dinukleotiden unterscheiden müssen, allesamt Sequenzen die eines dieser Motive beinhalten.
Demnach schneiden die Restriktionsendonukleasen besonders bevorzugt entweder an Positionen, die vor der Bisulfit
Umwandlung und Amplifikation einer im wesentlichen methylierten CpG Position in der zu untersuchenden DNA entsprachen, während die Hintergrund-DNA an dieser Position im wesentlichen unmethyliert vorlag und/oder die Restrik- tionsendonukleasen schneiden an Positionen, die die vor der Bisulfit Umwandlung und Amplifikation einer im wesentlichen unmethylierten CpG Position in der zu untersuchenden DNA entsprachen, während die Hintergrund-DNA an dieser Position im wesentlichen methyliert vorlag.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden in dem Restriktionsschritt mindestens 90% aller in der vorherigen Amplifikation erzeugten Fragmente geschnitten. Dies ist bei entsprechender Vollständigkeit dieses enzy atischen Schrittes vor allem dann der Fall, wenn die zu untersuchende DNA weniger als 10% der Gesamt- DNA ausmacht. Dies ist jedoch besonders bevorzugt, da dann die Vorteile der hier vorgestellten Methode gegenüber herkömmlichen Techniken besonders zu Tragen kommen, die hohe Spezifität aufgrund der zwei unterschiedlichen Amplifikationen zusammen mit der hohen Selektivität für die zu untersuchende DNA.
Besonders bevorzugt werden daher in dem zweiten mplifi- kationsschritt zusätzlich oder ausschliesslich Primer verwendet, die an die Amplifikate des ersten Schrittes hybridisieren, nicht aber mit den Primern des ersten Amplifikationsschrittes hybridisieren oder zu ihnen in wesentlichen Abschnitten sequenzhomolog sind. Damit wird in diesem Verfahren eine nested PCR durchgeführt, wobei zwischen den Amplifikationsschritten die Fragmente enzy- matisch geschnitten werden, die man der Hintergrund-DNA zuordnet. Diese Fragmente können dann in der folgenden Amplifikation nicht mehr als Template für eine PCR dienen und demzufolge wird ausschliesslich die zu untersuchende DNA amplifiziert. Besonders bevorzugt, damit dies der
Fall ist, liegen daher die Restriktionsschnittstellen innerhalb der auch in dem zweiten Amplifikation zu vermehrenden Sequenzabschnitt. Dennoch ist auch eine Variante des Verfahrens bevorzugt, in der der gleiche Satz von Primern in beiden Amplifikationsschritten verwendet wird. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn hochgradig multiplexierte PCR durchgeführt wird, da die Etablierung dieser Reaktionen aufwendig ist und man sich auf diese Art die zweifache Etablierung eines dazugehörigen Primer- satztes mit den entsprechenden Reaktionsbedingungen spart. Dies geht dann zu Lasten der Spezifität dieser Amplifikationen .
Es ist besonders bevorzugt, dass der erste Amplifikati- onsschritt als Multiplex-PCR ausgeführt wird. Besonders bevorzugt ist auch die Ausführung beider Amplifikati- onsschritte als Multiplex-PCR.
Besonders bevorzugt ist auch eine Variante, in der die Primer des zweiten Amplifikationsschrittes mit den
Schnittstellen der Restriktionsendonuklease (n) überlappen. In diesem Fall wird die Hybridisation der Primer in diesem Schritt an die geschittenen Amplifikate von vorne- herein verhindert was erneut die spezifische Amplifikati- on der aus der zu untersuchenden DNA hervorgegangenen Fragmente fördert .
Bevorzugt ist es erfindungsgemäß ferner, dass die Hintergrund-DNA in 100 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersuchenden DNA vorliegt. Weiterhin ist bevorzugt, dass die Hintergrund-DNA in 1000 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersuchenden DNA vorliegt.
Bevorzugt ist es ferner, dass die Analyse, oder gegebe- nenfalls die weitere Analyse mittels Hybridisierung an Oligomer-Arrays erfolgt, wobei Oligomere Nukleinsäuren oder in ihren Hybridisierungseigenschaften ähnliche Moleküle wie PNAs sein können.
Vorteilhaft ist es erfindungsgemäß auch, dass die Oligomere über einen 12-22 Basen langen Abschnitt an die zu analysierende DNA hybridisieren und sie ein CG, TG oder CA Dinukleotid umfassen.
Es ist bevorzugt, dass der Methylierungsstatus von mehr als 10 Methylierungspositionen der zu analysierenden DNA in einem Experiment nachgewiesen wird.
Weiterhin ist bevorzugt, dass der Methylierungsstatus von mehr als 60 Methylierungspositionen der zu analysierenden DNA in einem Experiment nachgewiesen wird.
Auch ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Analyse, oder gegebenenfalls die weitere Analyse durch Längenmes- sung der amplifizierten zu untersuchenden DNA erfolgt, wobei Methoden zur Längenmessung Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Chromatographie (z.B. HPLC) , Massenspektrometrie und andere geeignete Methoden umfassen. Vorteilhaft ist es dabei auch, dass Methoden zur Se- quenzierung die Sanger-Methode, Maxam-Gilbert-Methode und andere Methoden wie Sequencing by Hybridisation (SBH) umfassen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch ein Verfahren, wobei man die Sequenzierung für jede oder eine kleine Gruppe von CpG Positionen mit jeweils einem separaten Primeroli- gonukleotid ausführt und die Verlängerung der Primer nur eine oder einige wenige Basen ausmacht, und man aus der Art der Primerverlängerung auf den Methylierungsstatus der betreffenden Positionen in der zu untersuchenden DNA schließt.
Weiterhin ist bevorzugt, dass man aus dem Methylie- rungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt.
Vorteilhaft ist es, dass die Amplifikate selbst für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind. Bevorzugt werden diese Markierungen entweder durch eine Markierung der Primer oder der Nukleotide während der Amplifikation in die erzeugten Fragmente eingebracht.
Weiterhin vorteilhaft ist es, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind, oder/und dass die Markierungen Radionuklide sind oder/und dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrome- ter nachgewiesen werden.
Bevorzugt ist ferner, dass bei der Amplifikation einer der Primer an eine Festphase gebunden ist. Bei diesen Festphasen kann es sich beispielsweise um funktionali- sierte Polymere, Metalle, Glas oder Halbleiter wie Sili- cium handeln. Das Anbinden der Primer erfolgt bevorzugt über binfunktionale Linkermoleküle, welche an eine sila- nisierte Oberfläche gebunden werden oder aber beispielsweise über Thioate in den Primer an Bromacetyl- derivatisierte Oberflächen oder Gold.
Erfindungsgemäß ist es auch, dass die Amplifikate insge- samt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind. Besonders bevorzugt ist es auch, die Bildung spezifischer Fragmente während der Amplifikation unter Verwednung von Reporteroligonukleotiden zu beobachten, welche ihre Fluo- reszenzeigenschaften durch spezifische Interaktion mit dem jeweiligen Amplflikat und anderen Oligonukleotiden, den Primern und/oder der Polymerase ändern.
Dabei ist es vorteilhaft, dass man zusätzlich zu dem Re- porteroligonukleotid ein weiteres mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes Oligomer verwendet, welches unmittelbar benachbart zu dem Reporteroligonukleotid hybridisiert und sich diese Hybridisierung mittels Fluoreszenz Resonanz Energietransfer nachweisen lässt. Weiterhin vor- teilhaft ist es, dass ein Taqman-Assay durchgeführt wird. Bevorzugt ist es auch, dass ein Lightcycler Assay durchgeführt wird. Weiterhin ist bevorzugt, dass die Reporte- roligonukleotide mindestens eine Fluoreszenzmarkierung tragen. Ferner ist auch bevorzugt, dass die Reportermole- küle die Amplifikation entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme der Fluoreszenz anzeigen. Dabei ist es besonders vorteilhaft, dass man die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz auch direkt zur Analyse verwendet und aus dem Fluorenzenzsignal auf einen Methylierungszustand der zu analysierenden DNA schließt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörun- gen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssys- tems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungspro- zess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
Vorteilhaft ist dabei die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, Primern zur Herstellung der Amplifikate, sowie optional einer An- leitung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Assays.
Die vorliegende Erfindung beschreibt somit ein Verfahren zur Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA Proben. Im Gegensatz zu bislang bekannten Verfahren wird der Methylierungsgrad eines Satzes von CpG Positionen in einer ausgewählten Untergruppe von DNA-Fragmenten z. B. in Serum bestimmt, so dass eine Analyse auch in Gegenwart eines Überschusses an diagnostisch nicht relevanter Hintergrund-DNA möglich ist.
Die im zweiten Amplifikationsschritt erhaltenen Fragmente werden auf ihre Methlylierungssignatur hin analysiert und der Methylierungsgrad bevorzugt mehrerer ehemaliger CpG Positionen in den Amplifikaten bestimmt. Bevorzugt wird aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten geschlossen.
Das Wesen der vorliegenden Erfindung ist es nun, dass zwei Arten von CpG Positionen eine Rolle spielen und gleichermaßen zur Analyse beitragen und die nachfolgend als "Qualifier"-Positionen und "Classifier"-Positionen benannt werden sollen. Die Qualifier-Positionen dienen dazu, zwischen den beiden Amplifikationsschritten, bei der enzymatischen Spaltung, zwischen der zu analysierende DNA und der Hintergrund-DNA zu unterscheiden. Dies kann technisch auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen. Eigenschaft dieser Positionen ist es jedoch, dass ihr Methylierungsgrad in zu untersuchender DNA möglichst ver- schieden ist von dem in der Hintergrund-DNA. Die Classi- fier-Positionen dienen im Gegensatz dazu, aus dem Ampli- fikat, erzeugt überwiegend aus der zu untersuchenden DNA, über den jeweiligen Methylierungsgrad die für die Diagnose bedeutende Information zu extrahieren. Es können bis zu einigen 100 solcher Classifier Positionen für eine A- nalyse verwendet werden, erfolgt die Analyse beipielswei- se auf Oligo er-Arrays, auch wenn dies oftmals nicht erforderlich sein wird. Es ist jedoch in diesem Fall weniger das Entstehen eines bestimmten Amplifikates, das für das Untersuchungsergebnis von Bedeutung ist, sondern vielmehr die Analyse der CpG-Positionen in selbigem Amplifikat. Dies unterscheidet die hier beschriebene Methode grundlegend von anderen sonst bekannten, für die Methylierungsanalyse genutzten Methoden wie MSP. In eini- gen Fällen ist es jedoch sicher möglich und sinnvoll, die aus dem Entstehen eines Amplifikates abzuleitende Information in die Analyse mit einzubeziehen, in diesem Fall sind einige Positionen dann zugleich Classifier und Qualifier. Ein besonders bevozugtes mögliches Vorgehen ist im folgenden beschrieben.
Der erste Schritt des Verfahrens, die Gewinnung von Pro- ben, erfolgt bevorzugt durch Entnahme von Köperflüssigkeiten wie z. B. Sputu oder aber Serum, jedoch ist es offenkundig dass das Verfahren mit vielerlei Proben aus unterschiedlichen Quellen durchführbar ist.
Es erfolgt in einigen Fällen vor der Bisulfit-Behandlung eine Aufreinigung oder Auf onzentration der DNA, um eine Störung der Bisulfit-Reaktion und/oder der nachfolgenden PCR durch ein zu hohes Maß an Verunreinigungen zu vermeiden. Es ist jedoch bekannt, dass beipielsweise eine PCR aus Gewebe nach Behandlung beispielsweise mit Proteinase K ohne weitere Aufreinigung erfolgen kann, und dies gilt sinngemäß auch für die Bisulfit-Behandlung und nachfolgende PCR.
Die chemische Behandlung wird bevorzugt durch Behandlung mit einem Bisulfit (=Hydrogensul t, Disulfit) , wiederum bevorzugt Natriumbisulfit (weniger geeignet ist Ammoniumbisulfit) durchgeführt. Entweder erfolgt die Reaktion nach einer publizierten Variante, bevorzugt ist hier die Einbettung der DNA in Agarose, um die DNA während der Behandlung in einzelsträngigen Zustand zu halten, oder aber nach einer neuen Variante durch Behandlung in Gegenwart eines Radikalfängers und eines denaturierenden Reagenzes, bevorzugt ein Oligeothylenglykoldialkylether oder bei- pielsweise Dioxan. Vor der PCR Reaktion werden die Reagenzien entweder durch Waschen im Falle der Agarosemetho- de oder einem DNA-Aufreinigungsverfahren (Stand der Technik, Fällung oder Bindung an eine Festphase, Membran) entfernt oder aber einfach durch Verdünnung in einen Kon- zentrationsbereich gebracht, der die PCR nicht mehr signifikant beeinflusst. Wesentlich für den nächsten Schritt ist es nun, dass die Qualifier Positionen ausgewählt werden und ein geeignetes Restriktionsenzym gewählt wird, das selektive Spaltung der nicht zu analysierenden Hintergrund-DNA erlaubt. Die Auswahl der Positionen erfolgt nach der Prämisse, dass sie sich zwischen Hintergrund-DNA und zu untersuchender DNA hinsichtlich ihrer Methylierung so sehr wie möglich unterscheiden sollten, zudem muss für den entsprechenden Sequenzkontext ein geeignetes Enzym verfügbar sein. Das Restriktionsenzym muss zudem so ausgewählt werden, dass sich keine Schnitte etwa in anderen gewünschten Amplifi- katen ergeben. Zunächst werden also die Methylierungsprofile der jeweils in Frage kommenden Abschnitte eines Gens sowohl für die zu untersuchenden Tumore als auch für die Hintergrund-DNA aus gesunden Individuen bestimmt. Diejenigen Positionen, die die größten Unterschiede zwischen Tumor DNA und Hintergrund-DNA (beispielsweise im Serum) aufweisen, werden als Qualifier Positionen ausgewählt. Solche Positionen sind für eine Vielzahl von Genen bereits bekannt, bei- pielsweise für GSTpi, für HIC-1 und MGMT (von Wronski MA, Harris LC, Tano K, Mitra S, Bigner DD, Brent TP. (1992) Cytosine methylation and suppression of 06-methylguanine- DNA methyltransferase expression in human rhabdomyosar- coma cell lines and xenografts. Oncol Res .; 4 (4-5) : 167-74 ; Esteller M, Toyota M, Sanchez-Cespedes M, Capeila G, Pei- nado MA, Watkins DN, Issa JP, Sidransky D, Baylin SB, Herman JG. (2000) , Inactivation of the DNA repair gene 06-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hyper- methylation is associated with G to A mutations in K-ras in colorectal tumorigenesis . Cancer Res. May 1;60(9) :2368-71) .
Die chemisch behandelte DNA wird im Prinzip, wie es Stand der Technik ist, mittels mindestens zweier Primer a pli- fiziert, eine Multiplexierung ist möglich. Innerhalb des von den beiden Primern eingegrenzten DNA-Abschnittes befinden sich eine oder mehrere Qualifier-Positionen, aber bevorzugt auch eine oder mehrere Classifier-Positionen. Die Reihenfolge dieser Positionen ist für das Aufsetzen des hier beschriebenen Assays unerheblich.
Wie oben aufgeführt, wird nach der ersten Amplifikation ein Verdau mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, je nach Anzahl der Qualifier-Positionen, durchgeführt.
Nach dem Verdau werden die noch vorhandenen Primer, Enzyme und eventuell Nukeotide entweder durch einen Aufreini- gungsschritt entfernt (beipielsweise kann eine Ethanol- Präzipitierung durchgeführt werden, oder es wird ein han- delsüblicher Aufreinigungskit für PCR Produkte verwendet) oder aber die Lösung wird mit PCR-Puffer für die zweite Amplifikation so erheblich verdünnt, dass die oben genannten Bestandteile in dieser Reaktion nicht ins Gewicht fallen.
Wie oben angesprochen, können mehrere Qualifier- Positionen und auch demnach mehrere, jeweils für einen in der Hintergrund-DNA vorliegenden Methylierungsstatus und damit nach Bisulfit-Umwandlung für eine bestimmte Sequenz spezifische Restriktionsenzyme in einem solchen Verfahren verwendet werden.
Die Primer der zweiten Amplifikation liegen bevorzugt innerhalb des in der ersten Amplifikation erzeugten Frag- mentes und zwar derart, dass sie mit den zuvor verwendeten Primern weder signifikant überlappen noch mit ihnen hybridisieren. Es wird also eine nested PCR durchgführt. Damit das Verfahren funktioniert, ist darauf zu achten, dass die Qualifier Positionen innerhalb des zweiten Amplifikates liegen. Eine Überlappung der Primer der zweiten Amplifikation mit der Qualifier-Position ist mög- lieh. Wenn diese sich so nahe am 3 '-Ende des Primers befindet, dass im Falle geschnittener DNA keine Amplifikation mehr stattfinden kann.
Nach der selektiven, zweiten Amplifikation der zu untersuchenden DNA können nun bevorzugt, nach an sich bekannten Verfahren, der Methylierungsstatus mehrerer Classi- fier-Positionen bestimmt werden.
Es ist offensichtlich, dass auch in diesem Fall das Entstehen eines PCR Fragmentes selbst im Einzelfall von hinreichender Aussagekraft sein kann, sofern man, wie auch bei der MSP, die Situation vorliegen hat, dass die Quali- fier-Position praktisch zu 100% beispielsweise in der Hintergrund-DNA un ethyliert vorliegt, jedoch in der zu untersuchenden DNA aufmethyliert vorliegt. Verwendet man nun in der PCR ein Oligonukleotid, das bevorzugt an die Sequenz bindet, welche in der Bisulfit-Behandlung aus nicht methylierter Hintergrund-DNA entsteht, so entsteht in der PCR nur dann ein Produkt, wenn wenigstens eine geringe Menge an zu untersuchender DNA überhaupt vorhanden ist. Dies kann im Einzelfall bereits hinreichend für eine Diagnose sein, und es würde sich hierbei um ein Verfahren handeln, dass ein ähnliches Anwendungspotential aufweist wie MSP. Obgleich eine solche Durchführung nicht direkt bevorzugt ist, ist ein solches Verfahren bislang nicht bekannt und wird demzufolge ebenfalls als zugehörig zum Gegenstand dieser Erfindung betrachtet.
Bevorzugt ist es, dass in einer PCR-Reaktion mehrere Fragmente gleichzeitig erzeugt werden, d.h. dass eine Multiplex-PCR durchgeführt wird. Bei bisulfit-behandelter DNA hat amn dabei den Vorteil, dass aufgrund des unterschiedlichen G und C-Gehaltes der beiden DNA-Stränge ein Forward-Primer niemals auch als Reverse-Primer fungieren kann, was die Multiplexierung erleichtert. Im einfachsten Fall werden nun die entstandenen Fragmente nachgewiesen, ohne Einzelinformation über den Methylierungsgrad der in ihnen vorhanden ehemaligen CpG Positio- nen zu erhalten. Dazu kommen alle möglichen bekannten molekularbiologischen Verfahren in Frage, wie Gelelektrophorese, Sequenzierung, Flüssigchromatographie oder Hybridisierungen, ohne dass dabei die Classifier Positionen separat analysiert werden. Dies wäre auch zur Quali- tätskontrolle der vorangehenden Verfahrensschritte denkbar. Wie oben ausgeführt, ist jedoch die nachfolgende A- nalyse des Methylierungsgrades der Classifier-Positionen besonders bevorzugt.
Es gibt zahlreiche Möglichkeiten die bevorzugte Amplifikation der zu untersuchenden DNA im zweiten Amplifikati- onsschritt vorteilhaft mit Detektionstechniken für die Classifier-Oligonukleotide zu kombinieren.
Detektionstechniken, die sich besonders eignen, sind die Hybridisierung an Oligomerarrays und beispielsweise Pri- mer-Extension (MiniSequenzierung) Reaktionen. Die Hybridisierung an Oligomerarrays kann ohne weitere Veränderung von Protokollen gegenüber dem nächstliegenden Stand der Technik verwendet werden (Olek A, Olek S, Walter J; W0-
Patent 9928498) . Jedoch ist es bevorzugt, die Amplifikate an einen Array von Oligomeren zu hybridisieren, der aus Paaren von an einer Festphase immobilisierten Oligonukle- otiden besteht, von denen eines jeweils stark bevorzugt an einen ein ursprünglich unmethyliertes CpG (Classifier- Position) enthaltenden DNA-Abschnitt hybridisiert und das andere wiederum stark bevorzugt an den entsprechenden Abschnitt, in dem ursprünglich ein methyliertes CpG enthalten war, jeweils vor der Bisulfit-Behandlung und Amplifi- kation. Besonders bevorzugt ist in diesem Fall das Ampli- fikat oder die Amplifikate fluoreszent oder radioaktiv oder mit ablösbaren Massentags markiert, so dass sich nach der Hybridisierung die an die beiden Oligonukleotide eines Paares gebundenen Fragmente anhand dieser Markierung nachweisen und quantifizieren lassen. Man erhält ein Intensitätsverhältnis, aus dem man beispielsweise nach
Eichung des Experimentes mit vollständig methylierter und unmethylierter DNA den Methylierungsgrad an der jeweiligen Classifier-Position bestimmen kann. Auf einem solchen Oligomer-Array (Fig. 1) lassen sich eine Vielzahl von Fragmenten und Classifier-Positionen gleichzeitig nachweisen.
Es ist sinnvoll und bevorzugt, dass der Array auch Quali- fier-Positionen detektierende Oligomere zur Kontrolle des Experimentes enthält, da so das Verhältnis der in die A- nalyse eingehenden zu untersuchenden DNA zur Hintergrund- DNA bestimmt werden kann.
Primerextensionsreaktionen können ebenfalls an auf einer Festphase immobilisierten Oligonukleotide ausgeführt wer- den. Obgleich nicht zwingend erforderlich, ist die Immobilisierung dieser Primer bevorzugt, da in der Regel eine Vielzahl von Classifier-Positionen aus mehreren Amplifi- katen untersucht werden soll und dies auf einer Festphase, also an einem Oligomerarrays, bedeutend leichter und in einem Experiment durchführbar ist. Es ist besonders bevorzugt, dass die Primer sich unmittelbar neben einer Classifier-Position befinden und dass die Verlängerung nur um ein Nukleotid erfolgt. Es ist besonders bevorzugt, dass lediglich Didesoxythymidin und Didesoxycytidin als Nukleotide zugesetzt werden und dass diese jeweils mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, wobei allerdings auch andere, unterscheidbare Markierungen wie Massentags denkbar und bevorzugt sind. Nach einer Bisulfit-Behandlung und Amplifikation liegen ehema- lige methylierte CG als CG und nicht methylierte CG nunmehr als TG vor. Die Primerextensionsreaktion führt daher entweder zum Einbau eines Didesoxycytidins oder Dideso- xythymidins . Aus dem Verhältnis der für diese beiden Terminatoren jeweils detektierten Fluoreszenzmarkierungen lässt sich auf den Methylierungsgrad der jeweiligen Posi- tion schließen. Es ist auch möglich und bevorzugt, in diesem Fall die Primerextension mit Desoxycytidin und De- soxythymidin durchzuführen, wenn man kein Guaninderivat zugibt und demzufolge bei einer TG oder CG Sequenz bereits nach einer Base die Primerextension ohnehin endet. Zudem ist es ebenfalls bevorzugt, die Analyse auf dem Gegenstrang durch Unterscheidung von CA und CG analog durchzuführen, dann entsprechend mit Didesoxy-ATP und Di- desoxy-GTP oder deren Derivaten.
Eine besonders bevorzugte Variante des Verfahrens ist jedoch die gleichzeitige Detektion von Qualifier-Positionen und Classifier-Positionen in einem Experiment, was sich durch Verwendung von Taqman oder Lightcycler- Technologievarianten (Real time PCR) erzielen lässt. In diesem Sonderfall des vorliegenden Verfahrens wird die zweite Amplifikation als Real time PCR mit entsprechenden Reporteroligonukleotiden durchgeführt, die an verschieden Classifier Positionen binden können. Dabei werden bevorzugt Paare solcher Reporteroligonukleotide verwendet, wo- bei das eine Oligonukleotide bevorzugt an die Sequenz bindet, die einer methylierten Position vor der Bisulfit- Behandlung entspricht, und das andere an die Sequenz enstehend aus einer entsprechend unmethylierten Position. Dabei werden zusätzlich zu den Oligonukleotiden, die für eine Amplifikation der zu untersuchenden DNA sorgen, weitere fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide zugesetzt, und die Änderung der Fluoreszenz während der PCR-Reaktion gemessen. Dabei erhält man überwiegend, weil ja die zu untersuchende DNA amplifiziert wird, auch aus dieser Fluo- reszenzänderung unmittelbar Information über den Methylierungsstatus verschiedener Classifier CpG Positionen. Da verschiedene Oligonukleotide bevorzugt jeweils mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen versehen werden, ist auch eine Unterscheidung der Fluoreszenzänderung wäh- red der PCR getrennt für verschiedene Positionen möglich.
Diese vom Methylierungsstatus abhängige Fluoreszenzänderung kann durch zahlreiche Methoden erzielt werden, von denen hier beispielhaft zwei aufgeführt werden sollen.
Zum einen können Oligonukleotid Sonden verwendet werden, die spezifisch -entweder an eine Sequenz binden, die durch chemische Behandlung aus einer an der entsprechenden Position unmethylierten DNA hervorgegangen ist, oder aber entsprechend an einer Sequenz, die durch chemische Be- handlung aus einer an der entsprechenden Position methylierten DNA hervorgegangen ist. Diese Sonden sind besonders bevorzugt mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen versehen, einem Quencherfarbstoff und einem als Marker dienenden Fluoreszenzfarbstoff. Beide sind mit der gleichen Oligo- nukleotidsonde verknüpft. Findet nun eine PCR-Reaktion mit der zu untersuchenden DNA als Templat statt, so wird die PCR Reaktion diesmal durch die fluoreszent markierte Oligomersonde blockiert. Da diese jedoch nicht gegen die Nukleaseaktivität der Polymerase resistent ist, findet ein Abbau der an die Templat-DNA gebundenen Sonde während der PCR-Reaktion statt, der mit der Bindungseffizienz der Sonde an das Templat korreliert, da die nicht gebundene Sonde von der Polymerase nicht abgebaut wird. Der Abbau der Sonde wird nun dadurch, dass dabei der Quencher- farbstoff und der als Marker dienende Fluoreszenzfarbstoff voneinander getrennt werden, durch eine Zunahme der Fluoreszenz des Markerfarbstoffs unmittelbar sichtbar. Im Prinzip handelt es sich hierbei um eine Variante des sogenannten Taqman Assays. Was man demnach misst, ist das Entstehen eines PCR Produktes aus der zu untersuchenden DNA, jedoch nur dann wenn die untersuchte Classifier-Position auch in dem Me- thylierungszustand vorliegt, den die Sonde durch Hybridi- sieren an die chemisch behandelte DNA detektieren kann. Eine Gegenprobe mit einer Sonde, die entsprechend an die Classifier Position im anderen Methylierungszustand binden würde, ist daher zweckmäßig und bevorzugt. Es kann prinzipiell auch nur mit einer Sonde gearbeitet werden, welche noch nicht einmal unbedingt an eine Classifier Position binden muss, und aus dem Enstehen des PCR Produktes unmittelbar nur auf das Vorliegen eines bestimmten Methylierungsstatus in der Qualifier Position geschlossen werden.
Bevorzugt werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen an mehreren Sonden zusammen mit dem Quencher eingesetzt, um eine Unter- scheidbarkeit der Sonden und damit eine Multiplexierung zu erreichen.
Bevorzugt ist es auch, dass mit einer Sonde mehrere Positionen gleichzeitig auf ihren Methylierungsgrad untersucht werden können.
Ist eine genauere Quantifizierung des Methylierungsgrades der Classifier-Positionen wünschenswert, so können bevorzugt auch zwei mit einander konkurrierende Sonden mit unterschiedlichen Farbstoffen eingesetzt werden, wobei eine wiederum im Fall einer unmethylierten Position in der zu untersuchenden DNA, die andere umgekehrt im Falle einer methylierten Position bevorzugt bindet. Aus dem Verhältnis der Fluoreszenzzunahmen für die beiden Farbstoffe lässt sich dann wiederum auf den Methylierungsgrad der untersuchten Position schließen. Ein grundsätzlich anderes Verfahren, bei dem jedoch auch während der PCR eine Fluoreszenzänderung erfolgt, ist gegenwärtig als LightCyclertm Technologie bekannt. Dabei wird ausgenutzt, das ein Fluoreszenz Resonanz Energie- transfer (FRET) zwischen zwei Farbstoffen nur erfolgen kann, wenn diese sich in unmmittelbarer Nähe, das heißt 1-5 Nukleotide voneinander entfernt befinden. Nur dann kann der zweite Farbstoff von der Emission des ersten Farbstoffes angeregt werden und dann seinerseits Licht einer anderen Wellenlänge emittieren, das dann detektiert wird.
Im vorliegenden Fall der Methylierungsanalyse erfolgt eine Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten Sonde an die betreffende chemisch behandelte DNA an einer Classi- fier-Position, und die Bindung dieser Sonde hängt wiederum davon ab, ob die zu untersuchende DNA an dieser Position methyliert oder unmethyliert vorlag. Unmittelbar benachbart zu dieser Sonde bindet eine weitere Sonde mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff. Diese Bindung erfolgt bevorzugt wiederum Sequenz- und damit methylierungsabhän- gig, wenn in dem betreffenden Sequenzabschnitt eine weitere methylierbare Position vorliegt (immer jeweils nach Bisulfit-Behandlung) . Während der Amplifikation wird nun die DNA vermehrt, weshalb immer mehr fluoreszenzmarkierte Sonden benachbart an die betreffende Position binden, sofern diese vor der Bisulfit-Behandlung den dafür erforderlichen Methylierungszustand aufwies, und daher ein zunehmender FRET gemessen wird.
Auch bei diesem Verfahren erfolgt bevorzugt eine Mul- tiplexierung mit mehreren verschieden fluoreszenzmarkierten Sonden.
Beide Verfahren unterscheiden sich im Ergebnis hauptsächlich darin, dass in einem Fall eine Abnahme, im anderen Fall eine Zunahme .der Fluoreszenz gemessen wird. In beiden Fällen können sowohl Qualifier- als auch Classifier- Positionen gemessen werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1:
Durchführung des Verfahrens am Beispiel des ELK-1 Gens
Die aus Serum isolierte DNA wird unter Verwendung von Bi- sulphit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle an der 5-Position der Base nicht methylierten Cyto- sine in Uracil umgewandelt werden, während die in 5- Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Für diese Reaktion wird die im Stand der Technik bekannte und oben beschriebene Agarose-Methode verwendet. Die erste Amplifikation eines definierten Fragmentes der Länge 530 bp aus der Promotorregion des ELK-1 Gens erfolgt nun mittels zweier Primeroligonukleotiden ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT (SEQ-ID: 1) und
TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT (SEQ-ID: 2 ) . Um alle in der 29. ehemaligen genomischen CpG Position dieses Fragmentes methylierten Amplifikate zu entfernen, wird das Amplifi- kat zunächst durch Ethanol Präzipitation isoliert und an- schliessend mit Mae II nach den Angaben des Herstellers (Röche Molecular Biochemicals) inkubiert. Nach erfolgtem Verdau wird die Lösung 1:10000 mit PCR-Puffer verdünnt und eine zweite Amplifikation mit den Primeroligonukleotiden TTTATTTTTATATAAGTTTTGTTT (SEQ-ID: 3 ) und CCCTTCCCTACAAAACTATAC (SEQ-ID: 4) durchgeführt. Diese Primeroligonukleotide sind mit dem Fluoreszenfarbstoff Cy5 markiert, daher ist auch das bei der PCR erhaltene Fragment markiert . Beispiel 2 :
Durchführung der Hybridisierung und Auswertung eines hybridisierten DNA-"Chip"
Das in Beispiel 1 hergestellte Amplifikat wird auf einen DNA Chip hybridisiert. Auf dem Chip sind zuvor Oligonukleotide immobilisiert worden. Die Oligonukleotidese- quenzen leiten sich von dem in Beispiel 1 genannten amplifizierten Fragment des Gens ELK-1 ab, und repräsen- tierten die CG Dinukleotide, die unmittelbare Umgebung einschließend. Die Länge der Oligonukleotide beträgt 14- 22 Nukleotide, die Position des CG Dinukleotides innerhalb der Oligonukleotide ist variabel. Nach der Hybridisierung (5 h, 38 °C, 5x SSC) wird der DNA Chip auf einem Fluoreszenzscanner (Genepix 4000A) vermessen und die Hybridisierungssignale numerisch ausgewertet.
Die beigefügten Figuren dienen gleichfalls zur Erläuterung der Erfindung.
In Figur 1 ist ein DNA Chip nach Hybridisierung mit dem Promotor Fragment dargestellt. Dargestellt ist das Falschfarben-Bild wie es nach dem Scannen erzeugt wird. Entgegen der hier dargestellten schwarz-weiß Abbildung wird von dem Scanner ein farbiges Bild erzeugt. Die Intensität der verschiedenen Farben repräsentiert den Grad der Hybridisierung, wobei der Hybridisierungsgrad von rot (in Figur 1 als helle Spots zu erkennen) nach blau (in Figur 1 als dunkle Spots zu erkennen) abnimmt.
Figur 2 zeigt schematisch die grundlegende Vorgehensweise des er indungsgemässen Verfahrens. Auf der linken Seite ist die nicht zu analysierende Hintergrund-DNA dargestellt, die in diesem Beispiel partiell methyliert vor- liegt, auf der rechten Seite entsprechend unmethylierte zu analysierende DNA. Im ersten Schritt (A) findet eine Bisulfit-Umwandlung statt, im zweiten Schritt (B) erfolgt die erste Amplifikation. Im dritten Schritt (C) wird die nicht zu analysierende Hintergrund-DNA gespalten, die verbleibende DNA wird anschliessend (D) erneut amplifiziert. Ihre Sequenzeigenschaften erlauben nachfolgend Rückschlüsse auf den Methylierungsstaus der zu untersuchenden DNA an prinzipiell allen Postionen, die sich in dem amplifizierten Bereich befinden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt werden:
eine genomische DNA Probe wird chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) , der- art behandelt, dass Cytosin in eine vom Basenpaarungsverhalten in der DNA-Duplex her unterschiedliche Base umgewandelt wird, während 5-Methylcytosin unverändert bleibt,
Abschnitte der Proben-DNA werden mittels einer Poly- merasereaktion amplifiziert,
die DNA wird enzymatisch selektiv an solchen Positionen geschnitten, die in der DNA Probe einen Methylie- rungsstatus aufwiesen, welcher fuer die weiter zu untersuchende DNA nicht charakteristisch ist, nicht a- ber für Hintergrund-DNA,
die nicht enzymatisch geschnittene DNA wird in einer weiteren Polymeraseraktion amplifiziert, dadurch wird die zu untersuchende DNA gegenueber etwa vorhandener Hintergrund DNA angereichert,
das Amplifikat wird hinsichtlich seiner Sequenz un- tersucht und daraus auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA in der genomischen DNA- Probe geschlossen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Proben DNA aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon gewinnt.
4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mehrerer Fragmente in einem Reaktionsgefäß in Form einer Multiplex-PCR durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Amplifikation eingesetzten Primer die chemisch mit Bisulfit umgewandelte DNA a plifizieren, nicht aber die entsprechende nicht umgewandelte genomische Sequenz.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der enzymatische Schnitt mittels einer Restriktionsendonuklease erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Restriktionsendonuklease um Mae II, Psp 1406 I, Ast II, Ssp 5230 I, Bbr P I, Bsa AI, Sna B I, Cfo I, Hin Pl I, Eco 47 III, NAR I, Ehe I, Kas I, Bbe I, Hae II, Acy I, Ban I, Hgi CI, Aos I, Avi II, Hpa II, Msp I, Pin AI, Age I, Eco 56 I, Nae I, CfrlOI, SgrAI, Fse I, XmaCI, Sma I, Srf I, Ava I, Bse AI, Mro I, Taq I, Cla I, Sal I, Hind II, Acc I, Xho I, Sfu I, BstBI, Hinf I, Sau 96 I, Dra II, Pssl, Ita I, Dsa V, Scr F I, -Mae III, Bst E II, Dde I, Cel II, Esp I oder Aoc I handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Restriktionsendonukleasen zum Einsatz kommen .
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere verschiedene Restriktionsendonukleasen in einem Reaktionsgefäß zu Einsatz kommen.
' 13. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Restriktionsschritt mindestens 90 % aller in der vorherigen Amplifikation erzeugten Fragmente geschnitten werden.
14. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem zweiten Amplifi- kationsschritt die gleichen Primer verwendet werden wie im ersten Amplifikationsschritt .
15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem zweiten Amplifi- kationsschritt zusätzlich oder ausschliesslich Primer verwendet werden, die an die Amplifikate des ersten Schrittes hybridisieren, nicht aber wesentlich mit den Primern des ersten Schrittes identisch sind oder mit ihnen hybridisieren (nested PCR) .
16. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auch der zweite Amplifi- kationsschritt als Multiplex PCR ausgeführt wird.
17. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Primer des zweiten Amplifikationsschrittes mit den Schnittstellen der im vorangehenden Schritt eingesetzten Restriktionsendo- nuklease(n) überlappen.
18. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hintergrund-DNA in 100 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersu- chenden DNA vorliegt.
19. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hintergrund-DNA in 1000 facher Konzentration im Vergleich zur zu unter- suchenden DNA vorliegt.
20. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse der Sequenzeigenschaften der Amplifikate mittels Hybridisierung an Oligomer-Arrays erfolgt, wobei Oligomere Nukleinsäuren oder in ihren Hybridisierungseigenschaften ähnliche Moleküle wie PNAs sein können.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligomere über einen 12-22 Basen langen Ab- schnitt an die zu analysierende DNA hybridisieren und sie ein CG, TG oder CA Dinukleotid umfassen.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 21, da- durch gekennzeichnet, dass der Methylierungsstatus von mehr als 10 Methylierungspositionen der zu analysierenden DNA in einem Experiment nachgewiesen wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 21, da- durch gekennzeichnet, dass der Methylierungsstatus von mehr als 60 Methylierungspositionen der zu analysierenden DNA in einem Experiment nachgewiesen wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse durch Längenmessung der amplifizierten zu untersuchenden DNA erfolgt, wobei Methoden zur Längenmessung Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Chromatographie (z.B. HPLC) , Massenspektrometrie und andere geeignete Methoden um- fassen.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse durch Sequenzierung erfolgt, wobei Methoden zur Sequenzierung die Sanger- Methode, Maxam-Gilbert-Methode und andere Methoden wie Sequencing by Hybridisation (SBH) umfassen.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man die Sequenzierung für jede oder eine kleine Gruppe von CpG Positionen mit jeweils einem separaten Primeroligonukleotid ausführt und die Verlängerung der Primer nur eine oder einige wenige Basen ausmacht, und man aus der Art der Primerverlängerung auf den Methylierungsstatus der betreffenden Positionen in der zu untersuchenden DNA schließt.
27. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt .
28. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate selbst für die Detektion mit mindestens einer nachweisbaren Markierung versehen sind, die bevorzugt entweder durch Markierung der Primer oder aber der Nukleotide während der Amplifikation eingebracht wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind.
30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Radionuklide sind.
31. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
32. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei mindestens einer der Amplifikationen einer der jeweiligen Primer an eine Festphase gebunden ist.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung spezifischer Fragmente während der Amplifikation unter Verwendung von Reporteroligonukleotiden beobachtet wird, welche ihre Fluoreszenzeigenschaften durch Interaktion mit dem Amplifikat und/oder der Polymerase ändern.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass man zusätzlich zu dem Reporteroligonukleotid ein weiteres mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes
Oligomer verwendet, welches unmittelbar benachbart zu dem Reporteroligonukleotid an das Amplifikat hybridisiert und sich diese Hybridisierung mittels Fluoreszenz Resonanz Energietransfer nachweisen lässt.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, dass ein Taqman-Assay durchgeführt wird.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lightcycler Assay durchgeführt wird.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Reporteroligonukleotide mindestens eine Fluoreszenzmarkierung tragen.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Reportermoleküle die Ampli- fikation entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme der Fluoreszenz anzeigen.
40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz di- rekt zur Analyse verwendet und aus dem Fluorenzenz- signal auf einen Methylierungszustand der zu analysierenden DNA schließt.
41. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranste- henden Ansprüche zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS- Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kar- diovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin- testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des AtmungsSystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehl- funktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabo- lische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopf- schmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
42. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Unterscheidung von Zelltypen o- der Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferen- zierung.
43. Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, Primern zur Herstellung der Amplifikate, sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines As- says nach einem der Ansprüche 1-33.
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