WO2002090490A1 - Incubateur de cellules et de structures - Google Patents

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WO2002090490A1
WO2002090490A1 PCT/JP2002/001593 JP0201593W WO02090490A1 WO 2002090490 A1 WO2002090490 A1 WO 2002090490A1 JP 0201593 W JP0201593 W JP 0201593W WO 02090490 A1 WO02090490 A1 WO 02090490A1
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WO
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culture
chamber
cultured
cell
tissue
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Application number
PCT/JP2002/001593
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takao Takagi
Setsuo Watanabe
Original Assignee
Takagi Industrial Co., Ltd.
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Publication date
Application filed by Takagi Industrial Co., Ltd. filed Critical Takagi Industrial Co., Ltd.
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Priority to DE60229121T priority patent/DE60229121D1/de
Priority to EP02700700A priority patent/EP1382670B1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli

Definitions

  • the present invention relates to cells applied tissue engineering (tissue engineering), cells used for tissue culture and the like, and tissue culture apparatus, and more specifically, when culturing cells and tissues of a living body such as a human body in vitro
  • tissue engineering tissue engineering
  • the present invention relates to a cell / tissue culture apparatus that efficiently expresses the metabolic functions of cells and tissues and imparts physical stimuli necessary for cell survival, differentiation, and promotion to a culture object.
  • the temperature, humidity, carbon dioxide concentration and oxygen concentration in an incubator are maintained under appropriate conditions, and the cells are cultured therein.
  • the method is being taken.
  • Cells and tissues are allowed to float in the culture solution or fixed on or in the gel containing the culture solution components to proliferate or grow, matrix or scaffold, scaffold, carrier, template, etc.
  • Cells and tissues are planted, proliferated and grown in a substance called (hereinafter simply referred to as “matrix”).
  • the present invention has as its first object to provide a cell / tissue culture apparatus capable of achieving a desired culture by giving a physical stimulus necessary for growth or growth to cells to be cultured, which are tissues or tissues. There is.
  • the second object of the present invention is to provide a cell / tissue culture apparatus in which a substance to be cultured is protected from contamination such as bacteria. Disclosure of the invention
  • the cell / tissue culture apparatus of the present invention comprises a cylindrically-formed object (matrix 18), and a chamber (culture chamber 8) for containing the object. And a circulation path (first circulation path 32) that is connected to the culture object and circulates a culture fluid to the inside of the culture object.
  • the culture solution is supplied to the inside of the tubular culture medium accommodated in the chamber by the circulation path. Due to the flow of the culture solution, the object to be cultured is given necessary nutrients from the inside as well as shear stress corresponding to the flow of the culture solution (30) as a physical stimulus, and the growth of cells and tissues of the object to be cultured is Prompted. Also, this physical stimulation mimics the physical stimulation of a specific part of the human body, and can form, for example, cells and tissues of blood vessels.
  • the cell / tissue culture apparatus comprises a cylindrically formed object (matrix 18), a chamber for accommodating the object (culture chamber 8), and a culture solution supplied to the chamber or A supply means (third circulation path 5 4) to be circulated, and a circulation path (first circulation) which is connected to the culture object accommodated in the chamber and circulates the culture solution inside the culture object Special feature is the provision of Road 3 2).
  • the culture medium is accommodated in the chamber, and the culture solution is supplied or circulated from the supply means.
  • the supply means may supply the culture solution to the chamber one after another or may be circulated between the culture solution storage tank and the culture solution storage tank.
  • the culture solution flows through the circulation path to the inside of the culture object,
  • the culture solution is supplied to the outside from the supply means.
  • Shear stress due to the flow of the culture solution is applied as a physical stimulus together with the necessary nutrients to the inner and outer surfaces of the culture object. That is, a shear stress is applied to the inner and outer surface layers of the culture medium in response to the flow of the culture medium, and the culture medium is cylindrical in the inner layer of the culture medium.
  • the flow force is regulated in one direction, shear stress corresponding to the flow is applied to the inside of the culture object, and the growth of cells and tissues is promoted. That is, according to the physical stimulation by the flow of the culture solution, physical stimulation of a specific part of the human body can be mimicked, and for example, cells and tissues of blood vessels can be formed.
  • the cell / tissue culture apparatus comprises: a tube-shaped object to be cultured (matrix 18); a chamber for accommodating the object (culture chamber 8); and A first circulation path (32) for circulating the culture fluid (30) inside the culture object, and a second circulation channel (bypass way 40, 4) for circulating the culture fluid outside the culture body 2)
  • a tube-shaped object to be cultured (matrix 18); a chamber for accommodating the object (culture chamber 8); and A first circulation path (32) for circulating the culture fluid (30) inside the culture object, and a second circulation channel (bypass way 40, 4) for circulating the culture fluid outside the culture body 2)
  • the first and second circulation channels supply the culture fluid to the inside of the object to be cultured and the second circulation channel to the outside of the object to be cultured Because they are supplied, they may be in an independent form or may be branched from the common circulation path.
  • the culture fluid flowing from the first circulation path is regulated in a certain direction by the cylindrical object to be cultured
  • the culture fluid flowing from the second circulation path into the chamber is directed in a certain direction. It is not decided.
  • shear stress is applied to the inner layer and the outer layer of the culture corresponding to the difference of these flows, and the growth of cells and tissues of the culture. Are prompted.
  • the physical stimulation by such culture media with different flow can mimic the physical stimulation of a specific part of the human body.
  • the second circulation channel is a bypass channel (40, 42) formed by branching to the first circulation channel. That is, according to such a cell / tissue culture apparatus, the culture solution is allowed to flow through the first circulation path to the inside of the culture object in the chamber, and the culture solution is supplied to the outside through the bypass path. As a result, shear stress due to the flow of the culture solution is applied as physical stimulation along with the necessary nutrients to the inner and outer surfaces of the culture object. In this case, while the flow of the culture fluid flowing from the circulation path is regulated in a certain direction by the cylindrical object to be cultured, the direction of the culture fluid flowing from the bypass into the chamber is not determined. Such two strains of culture fluid flow apply shear stress corresponding to the difference between the flow to the inner and outer surface layers of the culture object, thereby promoting cell and tissue growth.
  • the matrix to be cultured is, for example, sponge-like or cloth-like, and in such a sponge state, culture is freely performed from the inside to the outside of the wall of the matrix to be cultured or from the outside to the inside.
  • the fluid flows through.
  • the matrix gap is filled with extracellular matrix, limiting the flow of culture fluid between the walls of the cylindrical object to be cultured. It will be done. At this time, it is difficult to flow the fresh culture solution to the inner surface side of the culture in the case where the culture solution flows only in the first circulation path, so the fresh culture solution can be supplied from another route. It will be necessary.
  • a bypass channel branched from the first circulation channel fresh culture fluid supplied in the chamber can be taken in and circulated to the culture object through the first circulation channel. Cultures can be supplied with fresh culture fluid.
  • this bypass makes it possible to eliminate the pressure difference between the inside and the outside of the culture object being cultured, and to maintain the pressure between the inside and the outside of the culture object at substantially the same pressure. The inconvenience due to the difference can be avoided.
  • flow distribution of the culture fluid of the first circulation path and the bypass path is made different, and the outer side and the inner side of the object to be cultured are different. It is characterized by applying the following shear stress. That is, while the culture fluid flowing from the first circulation path is regulated in a fixed direction of flow force by the cylindrical object to be cultured, the culture fluid flowing from the bypass channel into the chamber is not fixed in direction.
  • shear stress can be applied to the inner and outer surface layers of the culture according to the flow rate and the flow rate. For example, a large shear stress can be applied to the inside of the culture, and a slight shear stress can be applied to the outside.
  • the cell / tissue culture apparatus of the present invention is characterized in that a pump (tube pump 36) capable of changing the pumping state while pumping the culture fluid to be flowed to the object to be cultured is provided. That is, it is necessary to pump the culture solution, and by changing the pumping state, it is possible to impart a desired shear stress to the culture object.
  • a pump tube pump 36
  • the cell / tissue culture apparatus of the present invention is characterized in that it comprises control means (control device 60) for controlling the pumping power of the pump in an arbitrary pattern. That is, the culture solution can be pumped to the circulation path according to the pump rotational speed, and the pumping state can be controlled according to the rotary pattern, and shear stress is applied to the culture as a desired physical stimulus. can do. Also, it is possible to give variations to physical stimulation.
  • the culture unit (2) in which the chamber is formed is sealed, and the culture unit is removable. . That is, since it is possible to move the object to be cultured in units of culture units and to easily seal the object, the object to be cultured can be protected from contamination such as bacteria.
  • the cell / tissue culture apparatus of the present invention is characterized by comprising a photographing means (C C D camera 8 6) for photographing the object in the chamber. That is, photographing the culture object in the chamber and obtaining the video data are important data on the growth and growth of the culture object.
  • a photographing unit is provided together with a culture unit partially or entirely clarified, and the object to be cultured is housed and cultured in the chamber formed in the culture unit.
  • the photographing of the culture object from the outside of the chamber It is special to be able to shoot by means. That is, without disturbing the culture environment in the chamber, the object to be cultured can be photographed from the outside and the image data can be obtained.
  • FIG. 1 is a plan view showing an embodiment of the cell / tissue culture apparatus of the present invention.
  • FIG. 2 is a horizontal sectional view showing a culture unit.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of the culture unit of FIG. 2 taken along the line I I I-I I I.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the culture unit of FIG. 2 taken along line IV-IV.
  • FIG. 5 is a block diagram showing a controller connected to a culture unit.
  • FIG. 6 is a view showing a culture panel installed in a culture chamber.
  • FIG. 7 is a flowchart showing the first half of the control program.
  • FIG. 8 is a chart showing the second half of the control program shown in FIG.
  • FIG. 9 is a timing chart showing a rotation control operation.
  • FIG. 10 is a diagram showing the shear stress generated in the matrix by the flow of the culture solution.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view showing the attachment and detachment of the culture unit.
  • FIG. 1 to 6 show an embodiment of the cell / tissue culture apparatus of the present invention
  • FIG. 1 shows a culture unit on a culture circuit, etc.
  • FIG. 2 shows an internal structure of the culture cell
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the culture bundle shown in the figure, taken along line III-III
  • FIG. 4 is a cross-sectional view taken along line IV-IV in FIG.
  • FIG. 5 shows the culture circuit and controller
  • FIG. 6 shows the culture circuit and controller.
  • This cell 'tissue culture apparatus is provided with a culture unit 2 for culturing an object to be cultured which is a cell or tissue of a living body such as a human being, and this culture unit 2 is highly heat resistant so as to adversely affect the living body.
  • Resin and metal materials that do not elute various substances, such as fluorocarbon resin, P Made of EEK, high heat resistance grade polypropylene, silicone, stainless steel, etc.
  • the culture unit 2 is configured of a container 4 and a removable lid 6, and a culture chamber 8 is formed in the inside thereof as a blocked culture space.
  • the lid 6 is detachably fixed to the container 4 by a plurality of fixing bolts 10, and a 0 ring 12 is interposed between the container 4 and the lid 6.
  • the culture chamber 8 is kept sufficiently airtight.
  • the culture chamber 8 is composed of an inner circular portion 14 and a rectangular portion 16 on the opening side.
  • a matrix 18 which is a cylindrical object to be cultured is accommodated. That is, the matrix 18 is a cylindrical body, and in this example, it is molded as a wedge of the blood vessel to be formed as a means for proliferating the blood vessel, and the cells of human blood vessels are not seen.
  • a pair of culture port portions 2.0 and 22 are provided as supporting means of the matrix 18, and each culture port portion 20 and 2 is a rectangular portion 16 of the container portion 4 from the outer surface side thereof. It penetrates and is fixed.
  • each culture port portion 20, 22 protrudes by a predetermined length and is opposed, and by fitting the open end of the through hole 19 to the projection, the matrix 18 is cultured. It is held on the side of rectangular portion 16 of chamber 8.
  • the force at which the end of the matrix 18 is in contact with the inner wall portion of the culture chamber 8 may be kept out of contact with the culture chamber 8.
  • the culture chamber 8 is designed in a shape and size corresponding to the size of the matrix 18 to be cultured.
  • each culture port portion 20, 22 is formed with a flange 26 at the middle of the pipe 24, and the pipe 24 is formed on the rectangular portion 16 side of the culture chamber 8. It is fixed to penetrate through 8 and integrated with the culture unit 2.
  • the flange 26 functions as positioning means or the like for limiting the projection length of the culture port portion 20, 22 into the rectangular portion 16.
  • the culture port unit 20, 22 is configured as a separate body from the culture unit 2 with force, but may be molded by a member constituting the culture unit 2.
  • the culture solution 30 is circulated in the through holes 19 of the matrix 18 in each culture point portion 20, 22.
  • a first circulation passage 32 is formed, and the circulation passage 32 is constituted by a circulation tube 34.
  • a tube pump 36 is attached to the circulation path 32 as a pumping means of the culture solution 30, and this tube pump 36 is driven by a motor 38 which is a driving means.
  • a rotational force is applied, and a flow similar to the bloodstream of the human body is formed by its rotation control.
  • the circulation passage 32 is provided with bypass passages 40, 42 as a second circulation passage for circulating the culture solution 30 to the outside of the matrix 18, ie, the outer wall side.
  • the respective bypass passages 40 and 42 are connected to bypass port portions 44 and 46 opened in the container portion 4 of the culture unit 2.
  • the bypass ports 44 and 46 are provided on the outer surface of the container 4 of the culture unit 2 and have through holes 48 formed therein. Therefore, the culture solution 30 in the circulation path 32 flows in the matrix 18 as indicated by arrows A and B, and as indicated by arrows C and D, each bypass path 40 or 42 and each bypass port portion It flows into the culture chamber 8 through 4 4, 4 6.
  • the tube diameters of the culture port sections 20 and 22 and the bypass port sections 44 and 46 can be set arbitrarily, in this embodiment, the bypass port sections 44 and 46 side The flow rate of the culture solution 30 flowing through the bypass ports 44 and 46 is restricted.
  • the culture medium 30 supplied to the culture chamber 8 can be taken into the bypass passages 40 and 42, and the culture thereof is carried out.
  • the liquid 30 can be circulated in the circuit 32 and can be circulated inside the matrix 18. That is, if fresh culture fluid 30 is supplied to the culture chamber 8, the culture fluid 30 can be circulated to the circulation channel 32 and the matrix 18 through the bypass channels 40 and 42. .
  • circulation port portions 50, 52 are formed in a direction orthogonal to the matrix 18 in the culture chamber 8, and these circulation port portions 50 are formed.
  • the third circulation passage 54 is formed as a supply means for supplying the culture solution 30 to 5.
  • Each of the circulation port portions 50, 52 is provided on the outer surface of the container portion 4 of the culture unit 2, and a through hole 56 is formed in the inside, and each circulation port portion 50 is formed.
  • the circulation path 54 is constituted by the circulation tube 58 attached to the 52.
  • And means for supplying a culture solution eg, culture solution bag 9 4
  • Fresh culture solution 30 is supplied.
  • Arrows E and F indicate the culture fluid 30 flowing into the culture chamber 8 through the circulation path 54 and the flow direction thereof.
  • the culture fluid 30 on the circulation channel 32 side is supplied to the inside of the matrix 18, it is supplied to the outside of the matrix 18 through the culture fluid 30 pressure culture chamber 8 on the circulation channel 5 4 side. Since it is supplied to the inside of the circulation path 32 and the matrix 18 through the bypass paths 40 and 42, the fresh culture solution 30 can be circulated to the inside of the matrix 18 without pressure. Become.
  • the culture unit 2 is provided with a control device 60 as means for controlling rotation of the motor 38, proliferation, monitoring of growth, and the like.
  • this control device 60 is provided with a control unit 62 for performing rotation control such as supplying a drive current to a motor 38, and program control for setting a rotation pattern etc. Is executed.
  • the motor 38 is provided with a rotation sensor 64 for detecting its rotation and a temperature sensor 66 for detecting the motor temperature, and detection signals are applied to the control unit 62 as control inputs.
  • the control unit 62 is provided with a CPU as processing means, an ROM and an RAM as memories, etc., and program settings such as rotation conditions are performed from an input device 68 connected externally.
  • the control unit 62 also stores various data in addition to the display unit 70, the operation switch 74 for giving an operation command, as an operation display means, for example, the display lamp 76, and the alarm buzzer 78 as alarm means.
  • An external storage unit 80, a database 82, and the like are provided as means for performing this operation.
  • a transparent wall 84 is provided on the side of the lid 6 ′ so that the inside of the culture chamber 8 can be seen through in part or all of the culture unit 2.
  • the culture chamber 8 is The CCD camera 86 as a photographing means for photographing the matrix 18 in the inside is installed, the image obtained by the CCD camera 86 is applied to the image processing device 88 and processed, and displayed on the image display device 90. And is added to the judgment device 92 as judgment information.
  • the determination device 92 the proliferation or growth state is determined based on the color change or the shape of the matrix 18 based on the image, and the determination result is added to the control unit 62. That is, if the situation of the matrix 18 in the culture chamber 8 is captured as image information and observed through the image information, it is possible to accurately grasp the growth, growth situation and growth stage of the matrix 18 visually, according to the situation Take proper measures Can.
  • this cell / tissue culture apparatus is housed, for example, in a culture chamber 93 configured as shown in FIG. 6 to form an optimum culture environment.
  • a culture solution bag 94 for storing the culture solution 30; a gas absorption tube 96 for absorbing the gas into the circulation passage 54; a fluid delivery valve 98 for circulating the culture solution 30;
  • a pressure control valve 100 is provided in the circulation passage 54.
  • the fluid feed valve 98 is provided with a piston 104 which is advanced and retracted by a bistone drive unit 102. When the piston 104 is advanced, the valve 106 is opened and the valve 108 is closed.
  • the pressure regulating valve 100 is provided with an on-off valve 1 1 2 that is advanced and retracted by the valve opening and closing device 1 1 0.
  • the pressure regulating valve 1 0 0 is closed.
  • the pressure control valve 100 is opened, and the pressure control of the culture solution 30 in the circulation path 54 is performed.
  • the culture chamber 93 is provided with a heater 114 as a heating means, a fan 116 as an air blowing means, a humidifying device 118 as a means for setting a desired humidity, a temperature sensor 120, and an N 2 supply.
  • Device 1 2 2 to N 2 , 0 2 feeding device 1 2 4 to 0 2 , C 0 2 feeding device 1 2 6 to C 0 2 are supplied, and a culture environment optimum for growth and growth of cells and tissues is formed. .
  • FIGS. 7 and 8 a, b and c indicate connectors between the flowcharts.
  • Step S 1 the control device 6 0 is set to the operating state, performs input OPERATION program through the input device 6 8, the rotation period of the motor 3 8, T 2, T 3, the duration T 12, T 22, T Set conditions such as 32 mag. After setting the conditions like this, when the operation switch 7 4 power is input in step S 2, the process shifts to step S 3, the operation display is performed on the display unit 70, and the display lamp 76 lights up. .
  • step S4 the motor 38 is rotated, and variable driving is performed between the maximum speed RXK 1 and the minimum speed RXKi xCi in a cycle, and the process shifts to step S5. It is judged from the detection output of the rotation sensor 64 or the temperature sensor 66 whether or not it has occurred, and if there is no abnormality, the process proceeds to step S6.
  • Step S 6 video data is taken in from the video processing device 88, stored in the memory in the control unit 62, and in the external storage device 80, and registered in the database 82.
  • step S 7 duration T 12 in has elapsed is determined, until the duration T 12 elapses, the processing of step S 4 ⁇ S 6 is continuously performed.
  • step S 8 the process proceeds to step S 8 where the motor 38 is variably driven between the maximum speed RXK 2 and the minimum speed RXK 2 XC 2 in cycle ⁇ 2 and the process proceeds to step S 9 for rotation duration Similarly, it is determined from the detection outputs of the rotation sensor 64 and the temperature sensor 66 whether or not an abnormal force is generated in the motor rotation, and if there is no abnormality, the process proceeds to step S10. Similarly, in step S 1.0, video data is taken in from the video processing device 88, stored in the memory in the control unit 62, stored in the external storage device 80, and registered in the database 82.
  • Step S 1 1 In the duration T 22 mosquito, until the duration T 22 elapses, the processing of step S 8 ⁇ S 1 0 is continuously performed. After time T 22 elapses, the process proceeds to step S12, and after performing variable drive of motor 38 between maximum speed R and minimum speed RXC in cycle ⁇ 3 , the process proceeds to step S 13 and rotation is performed. Similarly, whether or not an abnormality occurs in the motor rotation is determined from the detection outputs of the rotation sensor 64 and the temperature sensor 66 during the continuation, and if there is no abnormality, the process proceeds to step S14. Similarly, in step S14, video data is acquired from the video processing device 88, stored in the memory in the control unit 62, and stored in the external storage device 80, and registered in the database 82.
  • step S 1 in 5 duration T 32 is performed processing power continually in Step S 1 2 ⁇ S 1 4.
  • step S16 is performed processing power continually in Step S 1 2 ⁇ S 1 4.
  • step S17 it is determined whether or not the driving switch 74 has been turned OFF.
  • steps S 12 to S 16 are performed until the process shifts to When the operation switch 74 becomes OF F, the process proceeds to step S18, in which the motor rotation is stopped, the operation display and the end display are canceled, and the culture program is completed. If the motor rotation is found to be abnormal in step S5, step S9, .. step S13, the process proceeds to step S19, and the motor rotation is stopped. It shifts to tap S20, displays a notification that an abnormality has occurred as a warning display on the display unit 70, and sounds an alarm buzzer 78.
  • A, B, C and D in Fig. 9 show this culture program operation, A shows ON of operation display, OF F. B shows ON of end display, OFF, C shows video judgment output V! , V 2 , V 3 , and D indicate the speed of the motor 38.
  • I indicates the process of step S 4
  • 1 indicates the process of step S 8
  • 2 indicates the process of step S 8
  • III indicates the step The final stage which shows the process of S12 is shown.
  • the coefficients id, K 2 and (::, C 2 and C 3 used in the processing of steps S 4, S 8 and S 12 are stored in the memory of the control unit 62. Although it is a set value, it may be arbitrarily input and changed from the input device 68. Further, in the embodiment, although the circulation direction of the culture solution 30 is set to one direction, it is described. The direction may be reversed or reversed.
  • the matrix 18 on which cells and tissues are planted is removed from the lid 6 and housed in the culture chamber 8, and then placed in the culture chamber 93.
  • the culture cabinet 93 After setting the temperature, humidity, concentration of oxygen dioxide, oxygen concentration, etc. in the culture cabinet 93 under appropriate conditions, supply culture medium 30 at an optimal flow rate to cells and tissues to matrix 18 Therefore, run the culture program.
  • the shear stress applied to the matrix 18 will be described.
  • the viscosity coefficient of the culture solution 30 is ⁇
  • the flow velocity of the flow of the culture solution 30 is u
  • the change of the flow velocity u Assuming that du is the distance between different flow velocities is dz, the shear stress ⁇ acting on the surface layer of the matrix 18 which is a blood vessel is
  • the matrix 18 is cylindrical, the flow direction is regulated, and the flow rate of the culture solution 30 is high, and the shear stress IN increases with the flow rate of the culture solution.
  • the flow velocity at 30 is slow and non-directional, shear stress and OUT decrease.
  • the inside of the matrix 18 receives a large shear stress and the outside receives only a small shear stress.
  • the cells or tissues grown in the cylindrical matrix 18 are subjected to high shear stress due to the fluid flow on the inner side, and are grown with almost no shear stress due to the fluid flow on the outer side. Will grow on the vascular endothelial tissue and on the outside on the vascular coat tissue. Since the blood vessel tissue of the human body differs between the inside and the outside, the tissue on the matrix 18 obtained by such culture will form a tissue close to the blood vessel of the human body.
  • the flow rate of the culture solution 30 to be flowed by the tube pump 36 is controlled in accordance with a program that changes the flow rate to an optimal flow rate with the passage of culture time, the same flow as the human blood flow is obtained. can get. In this case, it is effective to control the flow rate and the flow rate to the inside to the optimum values according to the growth process of the cells into the tissue.
  • the culture unit 2 is, for example, as shown in FIG. 11, a circulation tube 54 of the circulation passage 54 connected to the circulation port unit 50, 52.
  • a circulation tube 54 of the circulation passage 54 connected to the circulation port unit 50, 52.
  • the culture unit 2 can be separated from the circulation path 54, and the culture chamber 8 can be kept in a closed state, without leaking the culture solution 30.
  • the circulation path 32 may be detached from the tube pump 36, and the circulation tube 34 may be removed and moved together with the culture unit 2 c.
  • the culture unit 2 is an autoclave
  • the inside can be maintained aseptic for a long period of time if it is sterilized by sterilization methods such as UV light, ultraviolet ray sterilization, and single line sterilization.
  • other closing means may be used as the means for closing the circulation tube 58 by using the pinch cocks 1 2 8 and the cock valve 1 30.
  • the circulation tube 34 on the circulation passage 32 side may be similarly closed using another closing means such as a pinch cock or a cock valve.
  • bypass passages 40 and 42 are branched from the first circulation passage 32 and configured as a second circulation passage independent of the first circulation passage 32.
  • separate openings may be provided in the side wall portions of the culture port portions 20 and 22 to provide bypass passages.
  • bypass passages 40 and 42 are configured as independent second circulation passages
  • supply means for supplying fresh culture fluid to the first circulation passage 32 or bypass passages 40 and 42 are provided. If so, fresh culture fluid can be supplied to the inside of the matrix 18 through the first circulation path 32 together with the necessary physical stress such as shear stress.
  • the tube pump 36 is used as the pumping means, but for example, a plunger type pump may be used.
  • the culture medium can be supplied with fresh culture fluid from the first circulation path through the second circulation path or bypass path.
  • d Shear stress can be applied by the flow of culture solution according to the growth stage.
  • the culture unit containing the object to be cultured can be separated, detached and moved independently from the culture circuit, and the object to be cultured can be protected from contamination such as bacteria.
  • a desired physical stimulus can be applied to the object to be cultured, and culture can be promoted along with the realization of the physical stimulus corresponding to the site on the living body.
  • You can accurately grasp the growth stage of cells and tissues with images.
  • the cell / tissue culture apparatus of the present invention is useful as a tissue culture technology applied to tissue engineering (tissue engineering) cells, and in particular, is used for extracorporeal culture of cell tissue of a living body such as a human body.
  • tissue engineering tissue engineering
  • it is suitable for the efficient expression of cell and tissue metabolic functions, and the application of a physical stimulus necessary for prolongation, differentiation, and promotion of cells.

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Description

明 細 書 細胞 ·組織培養装置 技術分野
本発明は、 ティッシュエンジニアリング （組織工学） を応用した細胞、 組織培 養等に用いられる細胞 ·組織培養装置に係り、 より詳細に述べれば、 人体等の生 体の細胞、 組織を体外培養する際に細胞や組織の代謝機能を効率的に発現させ、 細胞の延命、 分化、 促進に必要な物理刺激を被培養物に付与する細胞 ·組織培養 装置に関する。 背景技術
従来、 人体等の生体の細胞、 組織を体外培養する方法には、 インキュベータ (培養庫） 内の温度、 湿度、 二酸化炭素濃度、 酸素濃度を適切な条件に維持し、 その中で細胞を培養するという方法が取られている。 細胞、 組織は培養液中に浮 遊状態に置かれるか、 その培養液成分の入ったゲルの中又は表面に固定して増殖、 成長させるか、 マトリクス又はスキヤホールド、 足場、 担体、 铸型等と呼ばれる 物質 （以下単に 「マトリクス」 と称する） 内に細胞、 組織を植え付けて増殖、 成 長させている。
ところで、 細胞、 組織の増殖、 成長には、 温度、 湿度、 二酸化炭素濃度、 酸素 濃度等の環境条件に加え、 培養すべき細胞、 組織に物理刺激を与えることが重要 である。 このような物理刺激は細胞や組織の分化及び成長を促進させるとともに、 より生体内の細胞や組織に近 、細胞や組織に成長させるために不可欠な要素であ る。 細胞、 組織の増殖、 成長に物理刺激を付与する技術として、 例えば、 特表 2 0 0 1— 5 0 4 6 9 7号 「軟骨細胞への剪断流れ応力の印加」 、 米国特許 6 1 2 1 0 4 2号 「Apparatus and method for simulating in vivo condi tions wh i le seeding and cul turing three-dimensional tissue constructs 」 等がある。 そして、 細胞、 組織の増殖、 成長には、 温度、 湿度、 二酸化炭素濃度、 酸素濃 度等の培養環境という静的条件に、 物理刺激という動的条件を加重することが必 要であるが、 静的条件とともに動的条件を制御することは、 制御形態が複雑化す るとともに、 雑菌の侵入等の原因要素を増加させるおそれがある。 雑菌汚染から 被培養物を防護することは重要な課題である。
そこで、 本発明は、 培養する細胞や組織である被培養物に増殖や成長に必要な 物理刺激を付与して所望の培養を実現できる細胞 ·組織培養装置を提供すること を第 1の課題としている。
また、 本発明は、 雑菌等の汚染から被培養物を防護した細胞 ·組織培養装置を 提供することを第 2の課題としている。 発明の開示
本発明の細胞 ·組織培養装置は、 第 1の課題を解決するため、 筒状に形成され た被培養物 （マトリクス 1 8 ) と、 この被培養物を収容するチャンバ （培養チヤ ンバ 8 ) と、 前記被培養物に連結されて前記被培養物の内側に培養液を循環させ る循環路 （第 1の循環路 3 2 ) とを備えたことを特徵とする。
このような細胞 ·組織培養装置によれば、 チヤンバ内に収容された筒状の被培 養物の内部には、 循環路により培養液が供給される。 この培養液の通流により、 被培養物にはその内側から必要な養分とともに物理刺激として培養液 （3 0 ) の 流れに応じたせん断応力が付与され、 被培養物の細胞や組織の成長が促される。 また、 この物理刺激は人体の特定部位の物理刺激を模倣することになり、 例えば、 血管の細胞や組織を形成することができる。
本発明の細胞 ·組織培養装置は、 筒状に形成された被培養物 （マトリクス 1 8 ) と、 この被培養物を収容するチャンバ （培養チャンバ 8 ) と、 このチャンバ に培養液を供給し又は循環させる供給手段 （第 3の循環路 5 4 ) と、 前記チャン バに収容された前記被培養物に連結され、 前記被培養物の内側に培養液を循環さ せる循環路 （第 1の循環路 3 2 ) とを備えたことを特徵とする。
このような細胞 ·組織培養装置によれば、 チャンバ内には被培養物が収容され るとともに、 供給手段から培養液が供給され、 又は循環する。 この場合、 供給手 段はチャンバに培養液を次々に供給するか、 或いは培養液の貯蔵タンクとの間で 循環させる態様がある。 また、 被培養物の内側には循環路を通じて培養液が流れ、 その外側には供給手段から培養液が供給される。 被培養物の内外面に必要な養分 とともに物理刺激として培養液の流れによるせん断応力が付与される。 即ち、 培 養液の流れに対応して被培養物の内外の表面層にせん断応力が付与される力 被 培養物の内面層には被培養物が筒状であること力、ら、 培養液の流れ力一方向に規 制されているので、 その流れに応じたせん断応力が被培養物の内側に付与され、 その細胞や組織の成長が促される。 即ち、 このような培養液の流れによる物理剌 激によれば、 人体の特定部位の物理刺激を模倣でき、 例えば、 血管の細胞や組織 を形成することができる。
本発明の細胞 ·組織培養装置は、 筒状に形成された被培養物 （マトリクス 1 8 ) と、 この被培養物を収容するチャンバ （培養チャンバ 8 ) と、 前記被培養物 に連結されて前記被培養物の内側に培養液 （3 0 ) を循環させる第 1の循環路 ( 3 2 ) と、 前記被培養物の外側に培養液を循環させる第 2の循環路 （バイパス 路 4 0、 4 2 ) とを備えたことを特徵とする。
この細胞 ·組織培養装置において、 第 1及び第 2の循環路は、 第 1の循環路が 被培養物の内側に培養液を供給し、 第 2の循環路が被培養物の外側に培養液を供 給するものであるから、 両者は独立した形態でもよく、 また、 共通の循環路から 分岐して形成してもよい。 この場合、 第 1の循環路から流れる培養液は、 筒状の 被培養物によりその流れが一定方向に規制されるのに対し、 第 2の循環路からチ ャンバ内に流れる培養液は方向が定まらない。 このような 2系統及び形態の異な る培養液の流れにより、 被培養物の内面層及び外面層にはこれらの流れの相違に 対応したせん断応力が付与され、 被培養物の細胞や組織の成長が促される。 この ような流れの異なる培養液による物理刺激によって人体の特定部位の物理刺激が 模倣できる。
そして、 第 1及び第 2の循環路が共通の循環路を分岐した形態では、 第 2の循 環路側がチャンバ内に開放されているので、 チャンバ内に例えば、 前記供給手段 から新鮮な培養液が供給される場合には、 第 2の循環路を通じて第 1の循環路側 に新鮮な培養液を取り込み、 物理刺激と相俟つて培養に必要な養分等が供給され、 被培養物の代謝が促進される。 この場合、 第 1及び第 2の循環路が独立した形態 では、 第 1又は第 2の循環路に新鮮な培養液を供給又は交換するようにしても同 様の作用を営むことができる。
本発明の細胞 ·組織培養装置において、 前記第 2の循環路は、 前記第 1の循環 路に分岐して形成されたバイパス路 （4 0、 4 2 ) であることを特徵とする。 即 ち、 このような細胞 ·組織培養装置によれば、 チャンバ内の被培養物の内側に第 1の循環路を通じて培養液を流し、 その外側にバイパス路を通じて培養液が供給 される。 この結果、 被培養物の内外面に必要な養分とともに物理刺激として培養 液の流れによるせん断応力が付与される。 この場合、 循環路から流れる培養液は、 筒状の被培養物によりその流れが一定方向に規制されるのに対し、 バイパス路か らチャンバ内に流れる培養液はその方向が定まらない。 このような 2系統の培養 液の流れにより、 被培養物の内面層及び外面層にはこれらの流れの相違に対応し たせん断応力が付与され、 細胞や組織の成長が促進される。
ところで、 培養初期においては、 被培養物であるマトリクスには少量の細胞が 付いているだけであり、 そのため、 その細胞が生み出す物質 （即ち、 細胞外マト リクスと言われる） の付着は少ない。 被培養物であるマトリクスは、 例えば、 ス ポンジ状や布状であり、 このような海綿状態では、 筒状の被培養物であるマトリ クスの壁面の内側から外側、 外側から内側に自由に培養液が通流する。 しかし、 細胞が増加して組織力形成されてくる培養中期以降では、 マトリクスの隙間は細 胞外マトリクスで埋め尽くされるので、 筒状の被培養物の壁面間での培養液の往 来は制限されることになる。 このとき、 第 1の循環路だけの培養液の流通では、 被培養物の内面側に新鮮な培養液を通流することが困難となるので、 別のルート からの新鮮な培養液の供給が必要となる。
そこで、 第 1の循環路から分岐されたバイパス路を用いれば、 チャンバ内に供 給されている新鮮な培養液を取り込んで第 1の循環路を通じて被培養物に循環さ せることができ、 被培養物に新鮮な培養液を供給することができる。 また、 この バイパス路が設けられていることで、 培養している被培養物の内外の圧力差を解 消させることができ、 被培養物の内外間をほぼ同一圧力に保つことができ、 圧力 差による不都合を回避することができる。
本発明の細胞 ·組織培養装置において、 前記第 1の循環路と前記バイパス路と の前記培養液の流量配分を異ならせ、 前記被培養物の前記外側と前記内側とに異 なるせん断応力を付与することを特徴とする。 即ち、 第 1の循環路から流れる培 養液は、 筒状の被培養物によりその流れ力一定方向に規制されるのに対し、 バイ パス路からチャンバ内に流れる培養液は方向が定まらないことに加え、 流量配分 を異ならせることで、 被培養物の内面層及び外面層にその流速や流量に応じたせ ん断応力を作用させることができる。 例えば、 被培養物の内側には大きなせん断 応力、 その外側には微少なせん断応力を付与することができる。
本発明の細胞 ·組織培養装置において、 前記被培養物に流す前記培養液を圧送 するとともに、 その圧送状態が可変可能なポンプ （チューブポンプ 3 6 ) を備え ることを特徵とする。 即ち、 培養液を圧送することが必要であるとともに、 その 圧送状態を可変することで、 被培養物に対して所望のせん断応力を付与すること ができる。
本発明の細胞 ·組織培養装置において、 前記ポンプの圧送力を任意のパターン に制御する制御手段 （制御装置 6 0 ) を備えたことを特徵とする。 即ち、 ポンプ 回転数に応じて培養液を循環路に圧送することができ、 その圧送状態は回転バタ —ンに応じて制御することができ、 所望の物理刺激としてせん断応力を被培養物 に付与することができる。 また、 物理刺激にバリエーションを持たせることがで さる。
本発明の細胞 ·組織培養装置において、 第 2の課題を解決するため、 前記チヤ ンバが形成された培養ュニット （2 ) を密閉状態とし、 この培養ュニッ卜が着脱 可能であることを特徴とする。 即ち、 培養ュニットを単位として被培養物の移動 が可能であるとともに、 その密閉化が容易になるので、 雑菌等の汚染から被培養 物を防護することができる。
本発明の細胞 ·組織培養装置において、 前記チャンバ内の前記被培養物を撮影 する撮影手段 （C C Dカメラ 8 6 ) を備えたことを特徴とする。 即ち、 チャンバ 内の被培養物を撮影すること、 映像データを得ることは、 被培養物の増殖や成長 の重要な資料となる。
本発明の細胞 ·組織培養装置において、 一部又は全部を透明化した培養ュニッ トとともに、 撮影手段を備え、 前記培養ュニット内に形成された前記チャンバ内 に前記被培養物を収容して培養し、 その被培養物を前記チャンバ外から前記撮影 手段で撮影可能にしたことを特徵とする。 即ち、 チャンバ内の培養環境を乱すこ となく、 その外部から被培養物を撮影でき、 その映像データを得ることができる なお、 本発明の目的、 特色、 利益等は、 発明の実施の形態における説明、 図面 に示した実施例の参酌によつてより明確になるであろう。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の細胞 ·組織培養装置の実施例を示す平面図である。
第 2図は、 培養ュニットを示す水平断面図である。
第 3図は、 第 2図の培養ュニットの I I I - I I I 線断面図である。
第 4図は、 第 2図の培養ュニットの IV— IV線断面図である。
第 5図は、 培養ュニットに接続された制御装置を示すブロック図である。 第 6図は、 培養庫に設置された培養ュニッ 卜を示す図である。
第 7図は、 制御プログラムの前半部分を示すフローチヤ一トである。
第 8図は、 第 7図に示した制御プログラムの後半部分を示すフ口一チャートで ある。
第 9図は、 回転制御動作を示すタイミングチヤ一トである。
第 1 0図は、 培養液の流動によってマトリクスに発生するせん断応力を示す図 である。
第 1 1図は、 培養ュニッ卜の着脱を示す断面図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明及びその実施の形態を図面に示した実施例を参照して詳細に説明する。 第 1図ないし第 6図は本発明の細胞 ·組織培養装置の実施例を示し、 第 1図は 培養回路上の培養ュニット等、 第 2図は培養ュニッ卜の内部構造、 第 3図は第 2 図に示す培養ュニッ 卜の I I I —I I I線断面、 第 4図は第 2図の IV— IV線断面、 第
5図は培養回路及び制御装置、 第 6図は培養回路及び制御装置を示している。 この細胞 '組織培養装置には、 人等の生体の細胞や組織である被培養物を培養 する培養ュニット 2が設けられ、 この培養ュニット 2は、 高耐熱性で生体に悪影 響を及ぼすような物質が溶出しない樹脂材料や金属材料、 例えば、 弗素樹脂、 P E E K、 高耐熱グレードポリプロピレン、 シリコーン、 ステンレススチール等で ネ冓成 れる。
この培養ュニッ ト 2は容器部 4と着脱可能な蓋部 6とを以て構成され、 その内 部には閉塞された培養空間として培養チャンバ 8が形成されている。 この実施例 の場合、 蓋部 6は複数の固定ボルト 1 0によって容器部 4に着脱可能に固定され ているとともに、 容器部 4と蓋部 6との間には 0リング 1 2が介揷され、 培養チ ャンバ 8には十分な気密性が保持されている。
培養チャンバ 8は、 内側の円形部 1 4と、 開口側の矩形部 1 6とで構成され、 矩形部 1 6側には筒状の被培養物であるマトリクス 1 8が収容されている。 即ち、 マトリクス 1 8は筒状体であって、 この実施例にあっては、 血管を増殖する手段 として形成すべき血管の铸型として成型されており、 人の血管の細胞が蒔かれて い
このマトリクス 1 8の支持手段として一対の培養ポ一ト部 2 .0、 2 2が設けら れており、 各培養ポート部 2 0、 2 は容器部 4の矩形部 1 6にその外面側から 貫通させて固定されている。 培養チャンバ 8内には各培養ポート部 2 0、 2 2が 所定長だけ突出して対向しており、 その突出部に貫通孔 1 9の開口端を嵌合させ ることにより、 マトリクス 1 8が培養チャンバ 8の矩形部 1 6側に保持されてい る。 この実施例にあっては、 マトリクス 1 8の端部が培養チャンバ 8の内壁部分 に当接している力、 培養チャンバ 8と非接触状態に維持してもよい。 また、 培養 チャンバ 8は培養すべきマトリクス 1 8の大きさに対応した形状及び大きさに設 疋される。
この実施例では、 各培養ポート部 2 0、 2 2はパイプ 2 4の中途部にフランジ 2 6が形成され、 そのパイプ 2 4を培養チャンバ 8の矩形部 1 6側に形成された 各透孔 2 8に貫通させて固定されて培養ュニット 2と一体化されている。 フラン ジ 2 6は、 矩形部 1 6内への培養ポート部 2 0、 2 2の突出長を制限する位置決 め手段等として機能している。 この実施例では、 培養ポート部 2 0、 2 2力く培養 ユニット 2と別体として構成されているが、 培養ュニット 2を構成する部材でー 体成形してもよい。
各培養ポ一ト部 2 0、 2 2にはマトリクス 1 8の貫通孔 1 9に培養液 3 0を循 環させる第 1の循環路 3 2が形成され、 この循環路 3 2は循環チューブ 3 4で構 成されている。 そして、 マトリクス 1 8の増殖、 成長を促すため、 循環路 3 2に は培養液 3 0の圧送手段としてチューブポンプ 3 6が取り付けられ、 このチュー ブポンプ 3 6は駆動手段であるモータ 3 8によ て回転力が付与されており、 人 体の血流と同様の液流がその回転制御によつて形成される。
また、 この実施例にあっては、 循環路 3 2にはマトリクス 1 8の外側即ち、 外 壁側に培養液 3 0を循環させる第 2の循環路としてバイパス路 4 0、 4 2力分岐 されており、 各バイパス路 4 0、 4 2が培養ュニット 2の容器部 4に開口された バイパスポート部 4 4、 4 6に連結されている。 各バイパスポート部 4 4、 4 6 は、 培養ュニット 2の容器部 4の外面部に突設され、 その内部に貫通孔 4 8を形 成したものである。 したがって、 循環路 3 2の培養液 3 0は矢印 A、 Bで示すよ うに、 マトリクス 1 8に流れるとともに、 矢印 C、 Dで示すように、 各バイパス 路 4 0、 4 2及び各バイパスポート部 4 4、 4 6を通じて培養チャンバ 8内に流 れる。 なお、 各培養ポート部 2 0、 2 2及びバイパスポート部 4 4、 4 6の管径 は任意に設定することができるが、 この実施例にあっては、 バイパスポート部 4 4、 4 6側が細く設定され、 バイパスポート部 4 4、 4 6を通じて流れる培養液 3 0の流量が制限されている。
ところで、 バイパス路 4 0、 4 2は培養チャンバ 8に開放されているので、 バ ィパス路 4 0、 4 2には培養チャンバ 8に供給されている培養液 3 0を取り込む ことができ、 その培養液 3 0を循環路 3 2に循環させ、 マトリクス 1 8の内側に 循環させることができる。 即ち、 培養チャンバ 8に新鮮な培養液 3 0が供給され るものとすれば、 その培養液 3 0をバイパス路 4 0、 4 2を通じて循環路 3 2及 びマトリクス 1 8に循環させることができる。
また、 培養チャンバ 8の円形部 1 4側には、 培養チヤンバ 8内のマトリクス 1 8と直交方向に循環用ポート部 5 0、 5 2が形成されており、 これら循環用ポ一 ト部 5 0、 5 には培養液 3 0を供給する供給手段として第 3の循環路 5 4が形 成されている。 各循環用ポ一ト部 5 0、 5 2は、 培養ュニット 2の容器部 4の外 面部に突設され、 その内部に貫通孔 5 6を形成したものであり、 各循環用ポート 部 5 0、 5 2に装着された循環チューブ 5 8によって循環路 5 4が構成されてお り、 培養液の供給手段 （例えば、 培養液バッグ 9 4 ) 力、ら新鮮な培養液 3 0が供 給されている。 矢印 E、 Fは循環路 5 4を通じて培養チャンバ 8に流れる培養液 3 0及びその流れ方向を示している。 即ち、 循環路 3 2側の培養液 3 0がマトリ クス 1 8の内側に供給されるが、 循環路 5 4側の培養液 3 0力培養チャンバ 8を 通じてマトリクス 1 8の外側に供給されるとともに、 バイパス路 4 0、 4 2を通 じて循環路 3 2及びマトリクス 1 8の内側に供給されるので、 新鮮な培養液 3 0 力铯えずマトリクス 1 8の内側に循環することになる。
そして、 この培養ュニット 2には、 モータ 3 8の回転制御や増殖、 成長の監視 等を行う手段として制御装置 6 0が設けられている。 この制御装置 6 0は、 例え ば、 第 5図に示すように、 モータ 3 8に駆動電流を流す等、 回転制御を行う制御 部 6 2が設けられ、 回転パターン等を設定するためのプログラム制御が実行され る。 モータ 3 8にはその回転を検出する回転センサ 6 4、 モータ温度を検知する 温度センサ 6 6が設けられ、 各検出信号が制御部 6 2に制御入力として加えられ ている。 制御部 6 2には、 処理手段としての C P U、 メモリとしての R O M及び R AM等が備えられ、 外部に接続した入力装置 6 8から回転条件等のプログラム 設定が行われる。 また、 制御部 6 2には表示部 7 0、 運転指令を付与する運転ス イッチ 7 4、 運転表示手段として例えば、 表示ランプ 7 6、 警報手段である警報 ブザー 7 8の他、 各種データを記憶する手段として外部記憶装置 8 0、 データべ —ス 8 2等が設けられている。
また、 この実施例では、 培養ュニット 2の一部又は全部に培養チャンバ 8内を 透視できる透明壁部 8 4が蓋部 6 '側に設けられ、 この透明壁部 8 4の近傍に培養 チャンバ 8内のマトリクス 1 8を撮影する撮影手段としての C C Dカメラ 8 6が 設置され、 この C C Dカメラ 8 6で得られる映像が映像処理装置 8 8に加えられ て処理され、 映像表示装置 9 0に表示されるとともに、 判定装置 9 2に判定情報 として加えられている。 判定装置 9 2では、 その映像からマトリクス 1 8の変色 や形状等により増殖、 成長状態の判定が行われ、 その判定結果が制御部 6 2に加 えられている。 即ち、 培養チャンバ 8内のマトリクス 1 8の状況を映像情報とし て捉え、 その映像情報を通じて観測すれば、 マトリクス 1 8の増殖、 成長状況や 成長段階を視覚を以て的確に把握でき、 その状況に応じた的確な処置を取ること ができる。
また、 この細胞 ·組織培養装置は、 例えば、 第 6図に示すように構成されて最 適な培養環境を形成する培養庫 9 3に収容される。 循環路 5 4には、 培養液 3 0 を溜める培養液バッグ 9 4、 ガスを循環路 5 4へ吸収させるガス吸収チューブ 9 6、 培養液 3 0の循環を行うための送液バルブ 9 8、 圧力調整弁 1 0 0が設けら れている。 送液バルブ 9 8には、 ビストン駆動装置 1 0 2で進退するピストン 1 0 4が設けられており、 ピストン 1 0 4が進出したとき、 弁 1 0 6が開、 弁 1 0 8が閉、 ピストン 1 0 4が後退したとき、 弁 1 0 6が閉、 弁 1 0 8が開となり、 心臓と同様に所定量の培養液 3 0の送出が行われる。 また、 圧力調整弁 1 0 0で は、 弁開閉装置 1 1 0によって進退する開閉弁 1 1 2が設けられ、 開閉弁 1 1 2 の進出時は圧力調整弁 1 0 0が閉、 開閉弁 1 1 2の後退時には圧力調整弁 1 0 0 が開となり、 循環路 54内の培養液 3 0の圧力調整が行われる。
そして、 培養庫 9 3は、 加熱手段としてヒータ 1 1 4、 送風手段としてファン 1 1 6、 所望の湿度を設定する手段として加湿装置 1 1 8、 温度センサ 1 2 0を 備えるとともに、 N2 供給装置 1 2 2から N2 、 02 供給装置 1 2 4から 02 、 C02 供給装置 1 2 6から C02 が供給され、 細胞や組織の増殖及び成長に最適 な培養環境が形成されている。
次に、 この細胞 ·組織培養装置を用いた培養処理を第 7図及び第 8図に示すフ 口一チャートを参照して説明する。 第 7図及び第 8図において、 a、 b及び cは フローチャート間の連結子を示している。
ステップ S 1では制御装置 6 0を動作状態に設定し、 入力装置 6 8を通して運 転プログラムの入力を行い、 モータ 3 8の回転周期 、 T2 、 Τ3 、 継続時間 Τ12、 Τ22、 Τ32等の条件設定を行う。 このような条件設定の後、 ステップ S 2 で運転スィッチ 7 4力投入されると、 ステップ S 3に移行し、 表示部 7 0には運 転表示が行われるとともに、 表示ランプ 7 6が点灯する。
そして、 ステップ S 4ではモータ 3 8を回転させ、 周期 で最大速度 RXK 1 、最小速度 RXKi xCi の間で可変駆動を行ってステップ S 5に移行し、 モ 一夕 3 8の回転中、 異常が生じたか否かを回転センサ 6 4や温度センサ 6 6の検 出出力から判定し、 異常がない場合にはステップ S 6に移行する。 ステップ S 6 では、 映像処理装置 8 8から映像データを取り込み、 制御部 6 2内のメモリ、 外 部記憶装置 8 0に記憶、 データべ一ス 8 2に登録する。
ステップ S 7では継続時間 T12が経過したか否かが判定され、 継続時間 Τ12が 経過するまで、 ステップ S 4〜S 6の処理が継続的に行われる。
時間 T12が経過すると、 ステップ S 8に移行し、 モータ 3 8を周期 Τ2 で最大 速度 RXK2 、 最小速度 RXK2 XC2 の間で可変駆動を行い、 ステップ S 9に 移行し、 回転持続中、 同様にモータ回転に異常力生じたか否かを回転センサ 6 4 や温度センサ 6 6の検出出力から判定し、 異常がない場合にはステップ S 1 0に 移行する。 ステップ S 1.0では、 同様に、 映像処理装置 8 8から映像データを取 り込み、 制御部 6 2内のメモリ、 外部記憶装置 8 0に記憶、 データベース 8 2に 登録する。
そして、 ステップ S 1 1では継続時間 T 22カ経過したか否かが判定され、 継続 時間 T 22が経過するまで、 ステップ S 8〜S 1 0の処理が継続的に行われる。 時間 T22が経過すると、 ステップ S 1 2に移行し、 モータ 3 8を周期 Τ3 で最 大速度 R、 最小速度 R X C の間で可変駆動を行った後、 ステップ S 1 3に移行 し、 回転持続中、 同様にモータ回転に異常が生じたか否かを回転センサ 6 4や温 度センサ 6 6の検出出力から判定し、 異常がない場合にはステップ S 1 4に移行 する。 ステップ S 1 4では、 同様に、 映像処理装置 8 8から映像データを取り込 み、 制御部 6 2内のメモリ、 外部記憶装置 8 0に記憶、 データべ一ス 8 2に登録 する。
そして、 ステップ S 1 5では継続時間 T32が経過したか否かが判定され、 継続 時間 Τ32が経過するまで、 ステップ S 1 2〜S 1 4の処理力継続的に行われる。 そして、 時間 T32が経過すると、 ステップ S 1 6に移行し、 終了表示が行われ た後、 ステップ S 1 7に移行し、 運転スィッチ 7 4が OFFになったか否かを判 定し、 OFFに移行するまで、 ステップ S 1 2〜S 1 6の処理が行われる。 運転スィッチ 7 4が OF Fになると、 ステップ S 1 8に移行し、 モータ回転の 停止、 運転表示及び終了表示の解除が行われ、 培養プログラムが完了する。 また、 ステップ S 5、 ステップ S 9、.ステップ S 1 3でモータ回転に異常が判 明した場合には、 ステップ S 1 9に移行し、 モータ回転を停止するとともに、 ス テツプ S 2 0に移行し、 警告表示として異常が生じた旨の告知を表示部 7 0に表 示するとともに、 警報ブザー 7 8を鳴動させる。
そして、 第 9図の A、 B、 C及び Dはこの培養プログラム動作を示しており、 Aは運転表示の O N、 O F F. Bは終了表示の O N、 O F F, Cは映像判断出力 V！ 、 V 2 、 V 3 、 Dはモータ 3 8のスピードを示し、 Dにおいて、 Iはステツ プ S 4の処理を示す第 1段階、 I Iはステップ S 8の処理を示す第 2段階、 I I I は ステップ S 1 2の処理を示す最終段階を示している。
なお、 この実施例では、 ステップ S 4、 S 8、 S 1 2の処理で用いた係数 id 、 K 2 、 （：！ 、 C 2 、 C 3 は、 制御部 6 2のメモリに記憶されている設定値であ るが、 入力装置 6 8から任意に入力して変更してもよい。 また、 実施例では、 培 養液 3 0の循環方向を一方向に設定して説明しているが、 逆方向又は交互に方向 変換してもよい。
そして、 実際の培養に当たっては、 細胞や組織を植えつけたマトリクス 1 8を 蓋部 6を外して培養チャンバ 8に収容した後、 培養庫 9 3に設置する。 培養庫 9 3内の温度、 湿度、 二酸化酸素濃度、 酸素濃度等を適切な条件に設定した後、 マ トリクス 1 8に対して細胞、 組織に最適な流量の培養液 3 0を供給することによ り、 培養プログラムを実行する。
そして、 循環路 3 2、 5 4を通じて培養液 3 0を供給すると、 マトリクス 1 8 の内外面に培養液 3 0の流れが作用し、 マトリクス 1 8上の細胞、 組織は、 培養 チャンバ 8の円周方向のせん断応力が付与されながら増殖、 成長することとなる。 ここで、 第 1 0図を参照して、 マトリクス 1 8に加わるせん断応力について説 明すると、 培養液 3 0の粘性係数を〃、 培養液 3 0の液流の流速を u、 流速 uの 変化を d u、 相違する流速間の距離を d zとすると、 血管であるマトリクス 1 8 の表面層に働くせん断応力 τは、
r = ζ · d u / d z · · · ( 1 ) となる。 この場合、 マトリクス 1 8の外壁面の流速 uは殆ど零であり、 この部分 に働くせん断応力て 0UT は非常に小さい力 マトリクス 1 8の内側の表面層には 大きなせん断応力て I Nが働くこととなる。 このようなせん断応力て力物理刺激と なって細胞、 組織の増殖及び成長に寄与するものである。 この場合、 マトリクス 1 8の内側、 即ち、 貫通孔 1 9の内面層に作用するせん 断応力て I N、 マトリクス 1 8の外側の内面層に作用するせん断応力て ουτ につい て、 マトリクス 1 8の内側では、 マトリクス 1 8が筒状であるため、 通流方向が 規制されている上、 培養液 3 0の流速が速く、 せん断応力て I Nは大きくなるのに 対し、 マトリクス 1 8の外側の培養液 3 0の流速はゆるやかで方向性がないため、 せん断応力て O U T は小さくなる。 この結果、 マトリクス 1 8の内側には大きなせ ん断応力を受け、 その外側には小さなせん断応力しか受けないことになる。 即ち、 筒状のマトリクス 1 8で成長する細胞又は組織は、 内側では流体の流れによる大 きなせん断応力を受け、 外側では流体の流れによるせん断応力を殆ど受けずに成 長するので、 その内側は血管内皮組織に、 外側は血管外皮組織に成長することに なる。 人体の血管組織はその内側と外側とでは異なるので、 このような培養によ つて得られたマトリクス 1 8上の組織は人体の血管に近い組織を形成することに なる。
そして、 チューブポンプ 3 6によつて流す培養液 3 0の流量は培養時間の経過 とともに、 最適な流量となるように変ィヒさせるプログラムに従って制御すれば、 人体の血流と同様の液流が得られる。 この場合、 内側に流す流量、 流速は細胞の 組織への成長過程に応じて最適な値に制御することが有効である。
そして、 培養プログラム力終了した後、 培養ュニット 2は、 例えば、 第 1 1図 に示すように、 循環用ポート部 5 0、 5 2に接続されている循環路 5 4の循環チ ュ一ブ 5 8を閉塞し、 この実施例では、 培養ュニッ ト 2を跨がって循環チューブ 5 8に閉止手段としてのピンチコック 1 2 8、 コックバルブ 1 3 0が取り付けら れ、 閉止処理を行えば、 培養ュニット 2を循環路 5 4から分離できるとともに培 養チャンバ 8を密閉状態に保持でき、 培養液 3 0を漏洩させることがない。 この 場合、 循環路 3 2はチューブポンプ 3 6から離脱させ、 かつ、 循環チューブ 3 4 をチューブポンプ 3 6カヽら取り外し、 培養ュニット 2とともに移動させればよい c また、 培養ュニット 2は、 オートクレープ等の殺菌方法や、 紫外線殺菌、 ガン マ一線殺菌等で殺菌しておけば、 内部は長期間にわたって無菌状態を維持するこ とができる。 この実施例では、 循環チューブ 5 8を閉止する手段としてピンチコ ック 1 2 8、 コックバルブ 1 3 0を用いている力、 他の閉止手段を用いてもよい。 この場合、 循環路 3 2側の循環チューブ 3 4も同様にピンチコックやコックバル ブ等の他の閉止手段を用いて閉止させてもよい。
なお、 実施例では、 バイパス路 4 0、 4 2を第 1の循環路 3 2から分岐して形 成した力 第 1の循環路 3 2と別個に独立した第 2の循環路として構成してもよ く、 また、 培養ポート部 2 0、 2 2の側壁部分に別個の開口を設けてバイパス路 としてもよい。
また、 バイパス路 4 0、 4 2を独立した第 2の循環路として構成した場合、 第 1の循環路 3 2又はバイパス路 4 0、 4 2側に新鮮な培養液を供給する供給手段 を設置すれば、 第 1の循環路 3 2を通してマトリクス 1 8の内側に必要なせん断 応力等の物理刺激とともに新鮮な培養液を供給することができる。
また、 実施例では、 圧送手段としてチューブポンプ 3 6を使用したが、 例えば プランジャー式ポンプを用いてもよい。
以上説明したように、 本発明によれば、 次の効果が得られる。
a チヤンバ内の培養すべき被培養物に非接触で培養液の流速によるせん断応 力等の物理刺激を付与することができる。 その結果、 生体上の物理刺激を模倣し たせん断応力を被培養物に付与することができ、 その培養促進に寄与することが できる。
b 筒状の被培養物の内側と外側との培養液の流れの形態を異ならせ、 個別に せん断応力を付与することができる。
c 筒状の被培養物の内側に第 1の循環路を通じて培養液を供給し、 その外側 に第 2の循環路を通じて培養液を供給することにより、 被培養物の内外に個別に せん断応力を付与することができるとともに、 第 2の循環路又はバイパス路を通 じて新鮮な培養液を第 1の循環路から被培養物に供給することができる。
d 成長段階に応じたせん断応力を培養液の流れによって付与することができ る。
e 被培養物を収容する培養ュニットを培養回路から独立して分離、 着脱して 移動させることができ、 雑菌等の汚染から被培養物を防護することができる。
f 被培養物に所望の物理刺激を付与することができ、 生体上の部位に対応し た物理刺激の実現とともに、 培養促進を図ることができる。 g 細胞や組織の成長段階を映像を以て的確に把握できる。
なお、 本発明の実施の形態としての構成、 作用及び効果を図面に示した実施例 を参照して述べたが、 本発明は、 上記の実施の形態や実施例に限定されるもので はなく、 本発明の目的、 実施の形態、 実施例によって推測される各種の構成、 変 形例等、 当業者が予測ないし推測できる全ての構成を包含するものである。 産業上の利用可能性
以上のように、 本発明の細胞 ·組織培養装置は、 ティッシュエンジニアリング (組織工学） を応用した細胞、 組織培養技術として有用であって、 特に、 人体等 の生体の細胞組織を体外培養に用いるのに適しているとともに、 細胞や組織の代 謝機能を効率的に発現させ、 細胞の延命、 分化、 促進に必要な物理刺激を被培養 物の付与に適している。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 筒状に形成された被培養物と、
この被培養物を収容するチャンバと、
前記被培養物に連結されて前記被培養物の内側に培養液を循環させる循環路と、 を備えたことを特徵とする細胞 ·組織培養装置。
2 . 筒状に形成された被培養物と、
この被培養物を収容するチャンバと、
このチャンバに培養液を供給し又は循環させる供給手段と、
前記チャンバに収容された前記被培養物に連結され、 前記被培養物の内側に培 養液を循環させる循環路と、
を備えたことを特徵とする細胞 ·組織培養装置。
3 . 筒状に形成された被培養物と、
この被培養物を収容するチャンバと、
前記被培養物に連結されて前記被培養物の内側に培養液を循環させる第 1の循 環路と、
前記被培養物の外側に培養液を循環させる第 2の循環路と、
を備えたことを特徵とする細胞 ·組織培養装置。 ·
4 . 前記第 2の循環路は、 前記第 1の循環路に分岐して形成されたバイパス路 であることを特徵とする請求項 3記載の細胞 ·組織培養装置。
5 . 前記第 1の循環路と前記バイパス路との前記培養液の流量配分を異ならせ、 前記被培養物の前記外側と前記内側とに異なるせん断応力を付与することを特徵 とする請求項 4記載の細胞 ·組織培養装置。
6 . 前記被培養物に流す前記培養液を圧送するとともに、 その圧送状態が可変 可能なポンプを備えることを特徵とする請求項 1、 2、 3又は 4記載の細胞'組
7 . 前記ポンプの圧送力を任意のパターンに制御する制御手段を備えたことを 特徵とする請求項 6記載の細胞 ·組織培養装置。
8 . 前記チャンバが形成された培養ユニッ トを密閉状態とし、 この培養ュニッ トが着脱可能であることを特徵とする請求項 1、 2、 3又は 4記載の細胞 '組織
9. 前記チャンバ内の前記被培養物を撮影する撮影手段を備えたことを特徴と する請求項 1、 2、 3又は 4記載の細胞'組織培養装置。
1 0 . —部又は全部を透明化した培養ュニットとともに、 撮影手段を備え、 前 記培養ュニッ ト内に形成された前記チャンバ内に前記被培養物を収容して培養し、 その被培養物を前記チャンバ外から前記撮影手段で撮影可能にしたことを特徴と する請求項 1、 2、 3又は 4記載の細胞 ·組織培養装置。
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