CN109628307A - 一种模拟体内流体力学环境的实验设备及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种模拟体内流体力学环境的实验设备及方法，属于生物医学领域。所述设备的组件包括平板流动小室装置、定时开关、蠕动泵、真空泵、加热垫圈、储液瓶和水浴锅。本发明提供的一种模拟体内流体力学环境的实验设备及方法，不需要额外的二氧化碳供给来维持生理pH值，且可实现稳定的用于对细胞等培养物加载流体切应力刺激，整个装置无需放置于培养箱操作，一方面大大降低了操作难度，另一方面很好解决了气瓶供气的不稳定性，整个实验可重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种模拟体内流体力学环境的实验设备及方法，属于生物医学领域。
背景技术
流体切应力对血管内皮细胞的影响在心血管领域具有较大的研究进展。血管内皮细胞处于持续流动的血流中，因而受到血液流动所产生的流体切应力作用。有研究发现流体切应力可影响血管内皮细胞的排列、形状、基因表达、细胞表面粘附分子的表达；其他领域的研究也引入了平行板流动小室。Michael J. Mitchell研究发现生理范畴的流体切应力还可以调控受体介导的肿瘤细胞的凋亡。AnkenyRF 认为流体切应力可能是诱导内皮祖细胞向内皮细胞分化的因素。同理，眼部一些组织也暴露在液体流中，从而受到流体切应力作用，有研究显示流体切应力能够影响睫状体上皮细胞分泌房水的作用。
细胞生物力学是组织工程领域内的一个重要组成部分，而细胞力学实验技术则是细胞力学研究的基础。目前已有多种模拟体内流体切应力的实验装置被发明，最常见的为平板流动腔的层流装置，在此基础上根据研究的需要已出现多种平行板流动腔，例如，为实现细胞施加剪切力和电刺激的流动腔装置，特别是能施加多个方向电刺激的装置，重庆大学吕永钢等人提出了一种可实施多方向电刺激的平板流动腔，包括三层平板和两层垫片，上平板设置有流体进出口，上垫片设置有导流槽，中平板设置矩形狭缝，下垫片设置有流动小室(吕永钢;邹杨;，可实施多方向电刺激的平板流动腔，中国发明专利，申请号：201110431771.2)。为了解决常规平行平板实验腔，更换培养片时尺寸的误差导致的流体切应力实际大小的理论误差问题，上海泉众机电科技有限公司顾宇灵、魏萍等人提出了一种可以重复高温灭菌的平行平板流动小室装置，利用弹性垫反作用力使得培养片与层流流道紧密贴合，把输入有可控的液体流转变成可控的液体层流，并且在更换培养片的时候，对控制液体层流的控制精度的影响有很大的降低，并可以在培养片的压边以外的面积上实现细胞培养，与其它方案相比，在相同的培养片下，可获得更大的培养面积或更好的流体切应力控制的重复性培养效果(顾宇灵;魏萍; 一种平行平板流动小室装置，中国发明专利，申请号：201610093387.9)。为了研究各种细胞在三维培养状态下，对可控的流体切应力的反应，四川大学班宇等人提出了一种仿生三维流体切应力细胞培养装置及其切应力加载方法(班宇;耿宁;宫苹;刘晓光;伍颖颖;李凤; 仿生三维流体切应力细胞培养装置及其切应力加载方法，中国发明专利，申请号：201110053704.1)。
但是，以上流体切应力装置都需要放置在培养箱内，给予细胞生长所需的CO2培养环境，不仅大大增加了实验操作的难度，同时大大增加了细胞的污染率。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，提供一种模拟体内流体力学环境的实验设备及方法，不需要额外的二氧化碳供给来维持细胞生理pH值，且可实现稳定的用于对细胞等培养物加载流体切应力刺激。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种模拟体内流体力学环境的实验设备，所述实验设备的组件包括平板流动小室装置、储液瓶和蠕动泵，所述实验设备的组件还包括定时开关、加热垫圈和水浴锅；
所述平板流动小室装置的部件包括上腔体、硅胶垫圈和培养皿，所述硅胶垫圈（1）为上腔体及培养皿的联合部件，所述上腔体扣合在培养皿上部；所述硅胶垫圈的中部为矩形空腔；所述上腔体上部设置有进液口和出液口，所述进液口通过进液管与储液瓶连接，在进液管上设置有定时开关和蠕动泵，所述出液口通过出液管与储液瓶连接；
其优点在于，利用所述的定时开关， 可体外模拟动脉血流的特点，可拆卸，既能研究连续流体对细胞的影响，也能研究间断流体对细胞的影响。蠕动泵可调节不同大小的流体剪切力，进行实验，根据需要打开或关闭定时开关，将结合后的流动小室（上腔室-垫圈-培养皿）放置显微镜下，动态观察。所述的蠕动泵可以调节液体流速，可研究多个大小流体剪应力对细胞影响。
所述储液瓶设置在水浴锅内，平板流动小室装置的底部设置有加热垫圈。
其优点在于，采用可控温的加热垫圈及水浴锅联合控温，加热垫圈维持圆形流动小室的温度，水浴锅维持储液瓶及连接管的温度，使得整个装置控温稳定。
作为进一步的改进，所述实验设备的组件还包括真空泵，所述真空泵通过真空管与设置在所述平板流动小室装置上腔体上的真空口连接，以利用真空泵的吸力作用将上腔体、硅胶垫圈和培养皿贴合在一起。
其优点在于，对平板流动小室装置的这种设置，使得整个装置的密闭性、有效的流体面积更大，操作更方便。
作为进一步的改进，所述上腔体上还设置有两个连接孔，所述硅胶垫圈设置有与两个连接孔相配合的凸台。
其优点在于，可以把上腔体和硅胶垫圈一起从培养皿上取出，也可以单独将上腔体从培养皿上取出。
作为进一步的改进，所述上腔体上设置的两个定位孔的直径为2mm，深度为1mm。
作为进一步的改进，所述进液管与进液口和储液瓶连接的接头、所述出液管与出液口和储液瓶连接的接头、所述真空管与真空口和真空泵连接的接头种类包括直形接头、L形接头和Y形连接头。
作为进一步的改进，所述实验设备包括平板流动小室装置的上腔体、蠕动泵、真空泵、储液瓶、水浴锅、进液管、出液管和真空管在内的组件至少其内腔由高分子材料制备。
其优点在于，所述设备除培养皿以外的组件均由高分子材料制备，能进行高温消毒灭菌。
作为进一步的改进，所述平板流动小室装置为圆形，直径为6cm，所述硅胶垫圈中部矩形空腔的规格为长4cm×宽2cm，硅胶垫圈的厚度为1mm。
其优点在于，所述的培养皿为直径为6cm的培养皿，与圆形上腔体大小匹配，有利于真空环境的维持。
本发明还提供了一种利用上述的模拟体内流体力学环境的实验设备对细胞进行观察研究的方法，所述方法包括如下步骤：
1）利用所述平板流动小室装置进行细胞培养
在培养皿内底部标记与硅胶垫圈的矩形空腔对应的方框，用质量分数为0.5%明胶包被培养皿，明胶的用量为0.1mL/cm2，包被后的12小时-24小时后吸去多余的明胶，用培养基润洗上述明胶包被的部分，然后将培养皿（13）置于超净工作台风干，待用；
其优点在于，所述的培养皿的包被使用的是0.5%的明胶，可促进贴壁细胞的黏附，使用前用培养基润洗，包被液对细胞生长不会造成影响。优点为，所述的培养皿的包被有利于细胞更好地粘附于培养皿底，在流体作用下不易脱落。
将细胞均匀种到培养皿方框内，并向其中补充培养基，之后每隔一天换一次培养基，直至细胞达到90%融合时，进行流体力学实验；
其优点在于，细胞铺板范围与硅胶垫圈大小及位置匹配，保证培养皿上的细胞全部都有液体流动，而没有液体流动的区域无细胞生长，避免了后期收样品时杂细胞污染问题。所述细胞达到90%融合时开始实验，保证每次实验的细胞数大致相同。
2）利用培养的细胞进行流体力学实验
将贴合后的平板流动小室装置放置显微镜下，进行动态观察；通过蠕动泵对模拟的流体剪切力大小进行调节；采用加热垫圈的二和水浴锅联合控制实验温度；通过时开关控制流体流动的通断时间
作为进一步的改进，所述的培养基为含有Hank’s平衡盐的MEM培养基，且添加有浓度为10%胎牛血清。
其优点在于，本发明选择Hank’s平衡盐的MEM培养基+10%FBS为加载于细胞的流体，此最小必需培养基(Minimum Essential Medium, MEM)是所有细胞培养基中最常用的一种，可用于多种悬浮和粘附的哺乳动物细胞培养，MEM不含蛋白质、脂类或生长因子，需要补充10%胎牛血清(FBS)。因培养基中含有Hank’s缓冲液，不需要额外的二氧化碳供给来维持生理pH值。
作为进一步的改进，所述的定时开关打开8s，关闭3s，可模拟动脉血流的特点，既能研究连续流体对细胞的影响，也能研究间断流体对细胞的影响。
本发明的有益效果：本发明提供的一种模拟体内流体力学环境的实验设备及方法，不需要额外的二氧化碳供给来维持生理pH值，且可实现稳定的用于对细胞等培养物加载流体切应力刺激，整个装置无需放置于培养箱中操作，一方面大大降低了操作难度，另一方面很好解决了气瓶供气的不稳定性，整个实验可重复性好 。
附图说明
图1为本发明的平板流动小室装置细节图；
图2为本发明的模拟体内流体力学环境的实验设备的示意图。
图中，1-平板流动小室装置；11-上腔体；111-进液口；112-出液口；113-真空口；114-定位孔；12-硅胶垫圈；121-凸台；122-矩形空腔；13-培养皿；2-定时开关；3-蠕动泵；4-真空泵；5-加热垫圈；6-储液瓶；7-水浴锅。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明提供了一种模拟体内流体力学环境的实验设备，所述实验设备的组件包括平板流动小室装置1、储液瓶6和蠕动泵3，所述实验设备的组件还包括定时开关2、加热垫圈5和水浴锅7；
所述平板流动小室装置1的部件包括上腔体11、硅胶垫圈12和培养皿13，所述硅胶垫圈12设置在培养皿内，所述上腔体11扣合在培养皿上部；所述硅胶垫圈12的中部为矩形空腔122；所述上腔体11上部设置有进液口111和出液口112，所述进液口111通过进液管与储液瓶6连接，在进液管上设置有定时开关2和蠕动泵3，所述出液口112通过出液管与储液瓶6连接；
其优点在于，利用所述的定时开关， 可体外模拟动脉血流得特点，可拆卸，既能研究连续流体对细胞的影响，也能研究间断流体对细胞的影响。蠕动泵调节不同大小得流体剪切力，进行实验，根据需要打开或关闭定时开关，将贴合后的流动小室上腔室-垫圈-培养皿放置显微镜下，动态观察。所述的蠕动泵可以调节液体流速，可研究多个大小流体剪应力对细胞影响。
所述储液瓶6设置在水浴锅7内，平板流动小室装置1的底部设置有加热垫圈5。
其优点在于，采用可控温的加热垫圈及水浴锅联合控温，加热垫圈维持圆形流动小室的温度，水浴锅维持储液瓶及连接管的温度，使得整个装置控温稳定。
作为进一步的改进，所述实验设备的组件还包括真空泵4，所述真空泵4通过真空管与设置在所述平板流动小室装置1上腔体11上的真空口113连接，以利用真空泵4的吸力作用将上腔体11、硅胶垫圈12和培养皿13贴合在一起。
其优点在于，对平板流动小室装置的这种设置，使得整个装置的密闭性、有效的流体面积更大，操作更方便。
作为进一步的改进，所述上腔体11上还设置有两个连接孔114，所述硅胶垫圈12设置有与两个连接孔114相配合的凸台121。
其优点在于，可以把上腔体和硅胶垫圈一起从培养皿上取出，也可以单独将上腔体从培养皿上取出。
作为进一步的改进，所述上腔体11上设置的两个连接孔114的直径为2mm，深度为1mm。
作为进一步的改进，所述进液管与进液口111和储液瓶6连接的接头、所述出液管与出液口112和储液瓶6连接的接头、所述真空管与真空口113和真空泵4连接的接头种类包括直形接头、L形接头和Y形连接头。
作为进一步的改进，所述实验设备包括平板流动小室装置1的上腔体11、蠕动泵3、真空泵4、储液瓶6、水浴锅7、进液管、出液管和真空管在内的组件至少其内腔由高分子材料制备。
作为进一步的改进，所述实验设备包括平板流动小室装置的上腔体、蠕动泵、真空泵、储液瓶、水浴锅、进液管、出液管和真空管在内的组件至少其内腔由高分子材料制备。
作为进一步的改进，所述平板流动小室装置1为圆形，直径为6cm，所述硅胶垫圈12中部矩形空腔122的规格为长4cm×宽2cm，硅胶垫圈12的厚度为1mm。
其优点在于，所述的培养皿为直径为6cm的培养皿，与圆形上腔体大小匹配，有利于真空环境的维持。
另外，本发明还提供了一种利用上所述模拟体内流体力学环境的实验设备对细胞进行观察研究的方法，所述方法包括如下步骤：
1）利用所述平板流动小室装置进行细胞培养
在培养皿13内底部标记与硅胶垫圈12的矩形空腔122对应的方框，用质量分数为0.5%明胶包被培养皿13，明胶的用量为0.1mL/cm2，包被后的12小时-24小时后吸去多余的明胶，用培养基润洗上述明胶包被的部分（13），然后将培养皿（13）置于超净工作台风干，待用；其优点在于，所述的培养皿的包被使用的是0.5%的明胶，可促进贴壁细胞的黏附，使用前用培养基润洗，包被液对细胞生长不会造成影响。优点为，所述的培养皿的包被有利于细胞更好地粘附于培养皿底，在流体作用下不易脱落。
将细胞均匀种到培养皿13方框内，并向其中补充培养基，之后每隔一天换一次培养基，直至细胞达到90%融合时，进行流体力学实验；
其优点在于，细胞铺板范围与硅胶垫圈大小及位置匹配，保证培养皿上的细胞全部都有液体流动，而没有液体流动的区域无细胞生长，避免了后期收样品时杂细胞污染问题。所述的细胞达到90%融合时开始实验，保证每次实验的细胞数大致相同。
2）利用培养的细胞进行流体力学实验
将贴合后的平板流动小室装置1放置显微镜下，进行动态观察；通过蠕动泵3对模拟的流体剪切力大小进行调节；采用加热垫圈5的二和水浴锅7联合控制实验温度；通过定时开关2控制流体流动的通断时间。
作为进一步的改进，所述的培养基为含有Hank’s平衡盐的MEM培养基，且添加有浓度为10%胎牛血清。
其优点在于，本发明选择Hank’s平衡盐的MEM培养基+10%FBS为加载于细胞的流体，此最小必需培养基(Minimum Essential Medium, MEM)是所有细胞培养基中最常用的一种，可用于多种悬浮和粘附的哺乳动物细胞培养，MEM不含蛋白质、脂类或生长因子，需要补充10%胎牛血清(FBS)。因培养基中含有Hank’s缓冲液，不需要额外的二氧化碳供给来维持生理pH值。
作为进一步的改进，所述的定时开关2打开8s，关闭3s，可模拟动脉血流的特点，既可研究连续流体对细胞的影响，也可研究间断流体对细胞的影响。
本发明提供的一种模拟体内流体力学环境的实验设备及方法，不需要额外的二氧化碳供给来维持生理pH值，且可实现稳定的用于对细胞等培养物加载流体切应力刺激，整个装置无需放置于培养箱中操作，一方面大大降低了操作难度，另一方面很好解决了气瓶供气的不稳定性，整个实验可重复性好 。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种模拟体内流体力学环境的实验设备，所述实验设备的组件包括平板流动小室装置(1)、储液瓶(6)和蠕动泵(3)，其特征在于：所述实验设备的组件还包括定时开关(2)、加热垫圈(5)和水浴锅(7)；
所述平板流动小室装置(1)的部件包括上腔体(11)、硅胶垫圈(12)和培养皿(13)，，所述硅胶垫圈(12)为上腔体(11)及培养皿(13)的联合部件，所述上腔体(11)扣合在培养皿上部；所述硅胶垫圈(12)的中部为矩形空腔(122)；所述上腔体(11)上部设置有进液口(111)和出液口(112)，所述进液口(111)通过进液管与储液瓶(6)连接，在进液管上设置有定时开关(2)和蠕动泵(3)，所述出液口(112)通过出液管与储液瓶(6)连接；所述储液瓶(6)设置在水浴锅(7)内，平板流动小室装置(1)的底部设置有加热垫圈(5)。
2.根据权利要求1所述的一种模拟体内流体力学环境的实验设备，其特征在于：所述实验设备的组件还包括真空泵(4)，所述真空泵(4)通过真空管与设置在所述平板流动小室装置(1)上腔体(11)上的真空口(113)连接，以利用真空泵(4)的吸力作用将上腔体(11)、硅胶垫圈(12)和培养皿(13)贴合在一起。
3.根据权利要求1所述的一种模拟体内流体力学环境的实验设备，其特征在于：所述上腔体(11)上还设置有两个连接孔(114)，所述硅胶垫圈(12)设置有与两个连接孔(114)相配合的凸台(121)。
4.根据权利要求3所述的一种模拟体内流体力学环境的实验设备，其特征在于：所述上腔体(11)上设置的两个连接孔(114)的直径为2mm，深度为1mm。
5.根据权利要求2所述的一种模拟体内流体力学环境的实验设备，其特征在于：所述进液管与进液口(111)和储液瓶(6)连接的接头、所述出液管与出液口(112)和储液瓶(6)连接的接头、所述真空管与真空口(113)和真空泵(4)连接的接头种类包括直形接头、L形接头和Y形连接头。
6.根据权利要求2所述的一种模拟体内流体力学环境的实验设备，其特征在于：所述实验设备包括平板流动小室装置(1)的上腔体(11)、蠕动泵(3)、真空泵(4)、储液瓶(6)、水浴锅(7)、进液管、出液管和真空管在内的组件至少其内腔由高分子材料制备。
7.根据权利要求1所述的一种模拟体内流体力学环境的实验设备，其特征在于：所述平板流动小室装置(1)为圆形，直径为6cm，所述硅胶垫圈(12)中部矩形空腔(122)的规格为长4cm×宽2cm，硅胶垫圈(12)的厚度为1mm。
8.一种利用权利要求1～7所述的模拟体内流体力学环境的实验设备对细胞进行观察研究的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)利用所述平板流动小室装置进行细胞培养
在培养皿(13)内底部标记与硅胶垫圈(12)的矩形空腔(122)对应的方框，用质量分数为0.5％明胶包被培养皿(13)，明胶的用量为0.1mL/cm2，包被后的12小时-24小时后去多余的明胶，用培养基润洗上述明胶包被的部分(13)，然后将培养皿(13)置于超净工作台风干，待用；
将细胞均匀种到培养皿(13)方框内，并向其中补充培养基，之后每隔一天换一次培养基，直至细胞达到90％融合时，即进行流体力学实验；
2)利用培养的细胞进行流体力学实验
将上腔体(11)、硅胶垫圈(12)、培养皿(13)三者结合的平板流动小室装置(1)放置显微镜下，进行动态观察；通过蠕动泵(3)对模拟的流体剪切力大小进行调节；采用加热垫圈(5)和水浴锅(7)联合控制整个装置温度；通过定时开关(2)控制流体流动的通断时间。
9.根据权利要求6所述的对细胞进行观察研究的方法，其特征在于：所述的培养基为含有Hank’s平衡盐的MEM培养基，且添加有浓度为10％胎牛血清。
10.根据权利要求6所述的对细胞进行观察研究的方法，其特征在于：所述的定时开关(2)打开8s，关闭3s，可模拟动脉血流的特点，既能研究连续流体对细胞的影响，也能研究间断流体对细胞的影响。
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