WO2002086503A1 - Adsorbants de bacteriotoxines et procede de criblage desdits adsorbants - Google Patents

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Koichi Fukase
Hans Peter Nestler
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Japan Science And Technology Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening and preparing an endotoxin (bacterial endotoxin) adsorbent and an adsorbent having a specific structure found by the method.
  • Landscape technology bacterial endotoxin
  • Lipopolysaccharide (LPS, endotoxin, endotoxin) is a major component of the cell surface of gram-negative bacteria such as Escherichia coli and Salmonella, and acts as a signal for bacterial invasion and serves as a signal for cytokines and prostasin. It activates the immune system by producing various mediators, such as lipids such as glandin and PAF, and NO.
  • lipids such as glandin and PAF, and NO.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned situation, and has a novel lipopolysaccharide adsorbent (bacterial endotoxin) which is easy to synthesize, can easily adjust various related structures, and can be used for adsorption of various lipopolysaccharides.
  • Adsorbent and a screening method therefor. You.
  • a binding experiment is performed with a peptide library using a lipid A radiolabeled product in which a radioactive element is introduced into a biosynthetic precursor lipid A or a phosphonoxethyl derivative of Escherichia coli lipid A.
  • the present invention provides a solid support having a functional group, wherein a compound having a functional group capable of binding to the functional group and having at least two other functional groups is bound, and an oligopeptide is further added thereto.
  • the present invention relates to a peptide library obtained by binding.
  • the present invention provides a solid support having a functional group, wherein a compound having a functional group capable of binding to the functional group and having two or more other functional groups is bound, and
  • the present invention relates to a peptide library obtained by binding a compound having a functional group capable of binding to a functional group and having two or more other functional groups, and then further binding an oligopeptide thereto.
  • the present invention relates to a radiolabeled lipid A obtained by introducing a radioactive element into a synthetic precursor type lipid A or a phosphonoxityl derivative of Escherichia coli type lipid A.
  • a radiolabeled lipid A obtained by introducing a radioactive element into a synthetic precursor type lipid A or a phosphonoxityl derivative of Escherichia coli type lipid A.
  • the 1-dalicosylphosphate group of natural lipid A is chemically unstable, but the PE analog in which this is replaced by a phosphonoxityl (PE) group is chemically stable. It has been shown to show activity equivalent to that of the natural form.
  • the present inventors have previously developed and reported an efficient method for synthesizing PE analogs (Bull. Chem. Soc.
  • FIG. 1 shows the results of examining the binding ability of the peptidola and ibrary of the present invention (using a polyethylene glycol-polystyrene resin, TentaGel as a solid support) to lipid A, lipid A analogs, and lipopolysaccharide. Is shown.
  • (a) is a phosphonoxityl derivative of Escherichia coli type lipid A (PE506)
  • (b) is Escherichia coli type lipid A (506)
  • (c) is a product of Escherichia coli type lipid A (506).
  • (e) with liposome of Escherichia coli R e mutant shows the results of binding experiments with polysaccharide (Re LPS) and Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS), respectively.
  • FIG. 2 shows the results of examining the binding ability of the peptide library of the present invention (using the hydrophilic vinyl polymer TOYOP EARL as a solid support) to lipid A, lipid A analogs, and lipopolysaccharide.
  • FIG. 2 shows E. coli type lipid A (506), (b) shows E. coli Re mutant lipopolysaccharide (R e LPS), and (c) shows E. coli lipopolysaccharide (R e LPS).
  • the results of the binding experiment with LPS) are shown below.
  • radioactive elements used in the present invention, as the radioactive elements that put the biosynthesis precursor type lipid A or radiolabeled lipid A analogs in phospho Nookishechiru derivative of E. coli type lipid A was introduced radioactive elements, for example, include tritium (3 H) is Can be
  • the radiolabeled lipid A analog obtained by introducing a radioactive element into a phosphonoxityl derivative of Escherichia coli type lipid A used in the present invention includes, for example,
  • radiolabeled lipid A analog in which a radioactive element is introduced into a phosphonoxityl derivative of biosynthetic precursor lipid A used in the present invention for example, those represented by the following structural formula [5] No.
  • the peptide library used in the present invention includes, for example, a compound having a functional group capable of binding to the functional group and having at least two other functional groups on a solid support or a soluble carrier having a functional group.
  • a compound having a functional group capable of binding to the functional group and having at least two other functional groups on a solid support or a soluble carrier having a functional group is an example.
  • a compound having a functional group capable of binding to the functional group and having at least two other functional groups is bound to a solid support or a soluble carrier having a functional group, and Has a functional group that can bind to a group, and has two or more other functional groups
  • Peptide libraries prepared by binding a compound and then further binding an oligopeptide thereto are also preferred.
  • solid or soluble carrier having a functional group examples include a solid or soluble carrier having an amino group.
  • the solid phase carrier having a functional group or the soluble carrier is a solid phase carrier having an amino group or a soluble carrier, it has a functional group capable of binding to the amino group and has at least two other functional groups.
  • the compound for example, the formula: HOO C (NH 2) CH (CH 2) nN H 2 (. wherein, n represents an integer of 1 to 4) and basic amino acids represented by, de Okishikoru acid, Ke Examples thereof include carboxylic acids having two or more hydroxyl groups such as nodoxycholic acid.
  • amino acids include, for example, lysine, ordinine and the like.
  • a solid phase carrier having a functional group or a soluble carrier is a solid phase carrier having an amino group or a soluble carrier, and a compound having a functional group capable of binding to the amino group and having two or more other functional groups is included.
  • an amino acid represented by the formula: HOO C (NH 2 ) CH (CH 2 ) n NH 2 (wherein n represents an integer of 1 to 4) it can bind to the other functional group.
  • Examples of the compound having a functional group and having two or more other functional groups include a compound represented by the following formula: HO 0 C (NH 2 ) CH (CH 2 ) n NH 2 (where n is an integer of 1 to 4) And a basic amino acid represented by).
  • amino acids include, for example, lysine, ordinine and the like.
  • a solid support having a functional group or a soluble carrier has a functional group capable of binding to the functional group and a compound having two or more other functional groups, or A compound having a functional group capable of binding to the functional group and having at least two other functional groups is bound to a solid-phase carrier or a soluble carrier having a functional group.
  • Oligopeptides to be bound via a compound having a functional group capable of binding to a group and having at least two other functional groups bound thereto include, for example, 2 to 20 amino acid residues, Preferably 3 to 10 oligopeptides are used, more preferably 4 to 8 oligopeptides. There are no particular restrictions on the type of amino acid residue. For example, Gly, D, L-VaDL-Phe, D, L-ProD, L—Ser, D, L-G1n, D , L-G1u, D, L-Lys, etc. 'are preferred.
  • peptide library according to the present invention include, for example, a compound represented by the following general formula [1], [2] or [3].
  • the globular portion represents a solid phase carrier or a soluble carrier, and AA LAA 2 AA i and AA 4 each independently represent an amino acid residue.
  • ⁇ ⁇ AA 2, AA and AA 4 each independently represents a amino acid residue.
  • amino acid residues represented by AA AA 2 , AA 3 and AA 4 amino acid residues represented by AA AA 2 , AA 3 and AA 4 .
  • Amino acid residues may be used, but preferred are, for example, Gly, D, L-VaD, L-Phe, DuPro, D, L-SerD, L-GinD, L — Glu, D, L-Lys and the like.
  • the bacterial endotoxin adsorbent of the present invention is searched and extracted by performing a binding assay with the above-mentioned peptide library using the above-mentioned radioactive substance of lipid A.
  • Specific examples of the bacterial endotoxin adsorbent of the present invention include, for example, in the above general formula [1], AAh AA 2 , AA 3 and AA 4 are any of the combinations shown in Table 1 below,
  • the solid support or the soluble support having a functional group used in the present invention include a resin having a functional group such as an amino group, a propyloxyl group, a hydroxyl group or the like, or a polyethylene glycol, preferably a bead-like resin.
  • a resin having a functional group such as an amino group, a propyloxyl group, a hydroxyl group or the like, or a polyethylene glycol, preferably a bead-like resin.
  • Specific examples of such a resin include, for example, polyethylene glycol having a functional group as described above.
  • Polystyrene resin [Specific trade names include, for example, Tenta Ge 1S—NH (R app Polymere), Amino meth thyl Nova Ge 1 HL (Novabiochem), and the like. Can be ] And a hydrophilic vinyl polymer [Specific trade names include, for example, TSK gel AF-Amino TOY OP EARL 65 OS (Tosoichi Co., Ltd.) and the like. ] And the like.
  • the outline of the binding experiment between the radiolabeled lipid A analog and the molecular tweezers library (peptide library) is described below. Preparation of molecular tweezers library
  • an encoded molecular tweezers library (peptide library 1) was prepared by split synthesis.
  • a tetrabeptide library attached to the two hydroxyl groups via a Gly residue (diarm L1), and two amino groups of L-Lys, respectively.
  • Tetrapeptide library (diarm L 2), and L-Lys with L-Lys bound to each amino group, and tetrapeptide library bound to a total of four amino groups (tetraarm L 2) 3).
  • the solid phase carrier is to be used in water, when using L1 made of water-swellable polyethylene glycol-polystyrene resin, TentaGel, as the core structure, deoxycholic acid must first be solidified.
  • Lysine (L2) and trilysine (L3) cores were prepared by conventional peptide solid phase synthesis.
  • 15 kinds of amino acids Gly and D and L-Va1, Phe, Ser, Gin, G1u, Lys and Pro
  • Radiolabeled Li lipid A analog represented by the structural formula [4] (hereinafter, referred to as [3 H] PE 5 0 6 .), Or radiolabelled Li lipid A analog represented by the structural formula [5]
  • a binding experiment (binding atssay) with a molecular tweezers library was performed using the body (hereinafter abbreviated as [ 3 H] PE 406).
  • Nestl'er has already established a binding experiment with a molecular tweezers library using radioactive compounds, and followed the procedure (Nestler HP; Wennemersmers ⁇ ; Sherlock R .; Dong DL- Y. Bioorg. Med. Chem Lett., 6, 1327 (1996).).
  • the resin to which the molecular tweezers recognizing [ 3 H] PE 506 is bound becomes radioactive because it adsorbs [ 3 H] PE 506.
  • Kodak autoradiographic emulsion is applied to this, the area around the radioactive resin is sensitized. After fixing, the excess resin is removed and the radioactive resin is dyed black. This was taken out and the peptide sequence on the resin was determined by the encoding method described later.
  • R e LPS E. coli Re mutant lipopolysaccharide
  • E. coli lipopolysaccharide E. coli 0111: B4 LPS (Sigma)
  • I went.
  • R e LPS has a structure in which two sugars called K do are bonded to the lipid A portion, and lacks most of the core polysaccharide portion and the 0-specific polysaccharide portion.
  • Limulus activity test is a method for colorimetric determination of endotoxin activity using the reaction of lipopolysaccharide to activate the blood cell extract component LAL (Limulus Amebocyte Lysate) clotting enzyme of horseshoe crab (such as Limulus polyphemus). .
  • LAL Limulus Amebocyte Lysate
  • TentaGel is a polyethylene glycol-polystyrene graft polymer that swells in water but is highly hydrophobic.
  • Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) has a long sugar chain, and it is thought that the hydrophilic sugar chain part is preventing the penetration into the resin.
  • TSK gel AF-Amino TOYO PE ARL 65S (Tosoichi Co., Ltd.), which is more hydrophilic, as a carrier
  • molecular tweezers 6, 11 1, 12, 16 and 17 6-Toyopearl, 11-Toyopearl, 12-Toyopea rl, 16-Toyopearl, and 17-Toyopear 1 were synthesized, and 506, Re LPS, and E. coli lipopolysaccharide (E. coli) were synthesized.
  • 01 11 A binding experiment with B4 LPS (Sigma) was performed, and the binding ability was evaluated by Limulus activity.
  • the Toyopearl-based resin adsorbed all of these efficiently, with a few exceptions (see Figure 2).
  • the 19 types of molecular tweezers (peptide library) shown in Table 4 and the 32 types of molecular tweezers (peptide library 1) shown in Table 5 were all used as bacterial endotoxin adsorbents. It is highly expected that it can be used more effectively.
  • the adsorbent of the present invention has a great advantage in that natural products (natural amino acids) are used as compared with existing adsorbents.
  • 15 4 X 3 15 18 7 5 selected from 15 amino acids.
  • a library consisting of 0 and 2900 was obtained, and 51 effective adsorbents were obtained therefrom.
  • LH-20 was purchased from Pharmacia Biotech, Sweden.
  • Anhydrous CH 2 C 1 and CHC 1 were prepared by distillation using calcium hydride as a dehydrating agent.
  • Anhydrous tetrahydrofuran (THF) and anhydrous benzene were purchased from Kanto Chemical Co., Ltd.
  • 0 1 - 1) were purchased from Amersham Life Science.
  • an imaging plate BAS-TR204S (Fuji Film Co., Ltd.) is used, and for detection, a bio-imaging analyzer BAS-150 MAC (Fuji Film Co., Ltd.) is used. Using.
  • the encod molecular tweezers library was prepared by a split-mix synthesis method. 15 g of Tenta Gel S-NH 2 (R app P o 1 111 666, particle size 90 ⁇ 111, 0.29 mmo 1 / gof NH 2 ) was used as the solid support. . The peptide chain was extended using g2pFmoc / Boc (Fluorenylmethoxycarbony 1 / Butyloxycarbonyl) peptide solid phase synthesis method.
  • Fmoc—G1y was bound by the action of ceramine and 0.06 equivalents of dimethylaminopyridine.
  • Lysine (L 2) and trilysine (L 3) cores were prepared by conventional solid phase peptide synthesis.
  • L 3 The amino acids y, D and L-Val, Phe, Ser, Gin, G1u, Lys and Pro) were used.
  • the protecting groups on the library were removed using 20% piperidine / DMF and 95% TFA / 2.5% water / 2.5% thioazole and stored at 4.
  • TSK gel AF -Am ino TOYO PEAR L 6.50S (0.1 mm o 1 Zm 1) (lml, 0.1 mm o 1) in 10% diisopropylethylamine (DI EA) / DMF (4 .0 ml), shaken for 30 seconds, and vortexed. After washing the resin twice with DMF (404 ml), Boc-L-Lys (Boc) -OH (104 mg, 0
  • the resin was washed four times with DMF (4.0 ml).
  • the Boc group was removed in the same manner as in (2) above.
  • the Fmoc group was removed in the same manner as in the above (4).
  • the Fmoc group was removed in the same manner as in (4) above. ,
  • the Fmoc group was removed in the same manner as in the above (4).
  • the side chain protecting group was removed in the same manner as in the above operation (2) for removing the B 0 c group.
  • PE506 (0.06 mg) was dissolved in water (0.80 ml). Molecular tweezers 6 to 17 TentaGel (about 20 mg) was suspended in water (100i1), and a PE506 solution (251) was added. The suspension was gently shaken at room temperature overnight. The resin was precipitated by centrifugation, and the supernatant was used for TLC analysis and Limulus activity measurement. A binding experiment was similarly performed using 506 (0.56 mg), PE 406 (0.7 mg), 406 (0.7 mg), Re LPS (0.85 mg), and LPS (1 mg). The obtained supernatant was used for Limulus activity measurement (in the case of 506, it was also used for TLC analysis). The results of TLC analysis are as shown in Table 6.
  • a solution of 506 (0.56 mg) in water (0.80 ml) was further diluted 3-fold.
  • Each Toyopearl (about 20 mg) of the molecular tweezers was suspended in water (100 ⁇ 1), and a 506 solution (251) was added. The suspension was shaken gently overnight at room temperature. The resin was precipitated by centrifugation, and the supernatant was used for Limulus activity measurement.
  • Each sample (PE506, 506, PE406, 406, ReLPS and Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS)) was dissolved in water to prepare a 1 mg / ml solution.
  • the sample was diluted to an appropriate concentration on a 96-well microplate using distilled water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the present invention relates to a method for screening and producing an endotoxin (bacterial endotoxin) adsorbent and an adsorbent having a specific structure found by the method, which is easy to synthesize and can easily adjust various related structures. It can be used for the adsorption of various bacterial endotoxins. It has the effect of providing a new bacterial endotoxin adsorbent (endoxin adsorbent). Further, the adsorbent of the present invention has a great advantage in that a natural product (natural amino acid) is used as compared with the existing adsorbent.

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Description

明 細 書 細菌内毒素吸着剤及びそのスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 エンド ドキシン （細菌内毒素） 吸着剤のスクリーニング · 作製方法 及びその方法により見出された特定構造の吸着剤に関する。 景技術
高等動物はパクテリァが体内に侵入すると自 らの免疫系を活性化する
を有しており、 このシステムは自然免疫（i nna t e i nnnun i ty)として注目を集めてい る。 リポ多糖（L i popo l ys ac char i de： L P S、 内毒素、 エンド トキシン）は大腸菌 やサルモネラ菌などのグラム陰性菌の細胞表層の主成分であり、 バクテリァ侵入 のシグナルとして働いてサイ トカイン、 プロスタグランジンや P A Fなどの脂質、 N Oなど様々なメディエーターを生産させることで免疫系を活性化する。 適量の リポ多糖が作用した場合は有益な免疫応答が起こるが、 感染症などにより リポ多 糖が過剰に作用すると免疫系が暴走し、 高熱や全身的な血液凝固などが起こり致 死的なショ ックが引き起こされる。 一方で人工透析液中のリボ多糖の混入も透析 中に体内にリポ多糖が入ることにより、 サイ トカインを誘導して種々の合併症を 引き起こす可能性がある。 また生物学的製剤へのリポ多糖の混入も大きな問題で ある。 そこでリポ多糖を除去するためのリポ多糖吸着剤の開発が望まれてきた。 しかしながら、 現在までのところ、 リポ多糖の吸着剤として開発され実用化され ているのは、 エンド トキシン吸着療法に用いられている、 抗生物質ポリミキシン Bをファイバーに固定したトレミキシン （東レ （株） 商品名） ぐらいしかない。 発明の開示
本発明は上記した如き現状に鑑みなされたもので、 合成が容易で、 様々な類縁 構造も容易に調整でき、 種々のリポ多糖の吸着に使用し得る、 新しいリポ多糖吸 着剤 （細菌内毒素吸着剤） とそのスクリーニング方法を提供することを目的とす る。 本発明は、 生合成前駆体型リ ピ ド A又は大腸菌型リ ピド Aのホスホノォキシェ チル誘導体に放射性元素を導入したリ ピド A放射性標識体を用いて、 ペプチドラ イブラリーとのバインディ ングアツセィ （結合実験） を行うことを特徴とする細 菌内毒素吸着剤のスクリーニング方法、 及び該スクリーニング方法により見出さ れた細菌内毒素吸着剤に関する。
また、 本発明は、 官能基を有する固相担体に、 該官能基と結合し得る官能基を 有し、 且つ他の官能基を 2以上有する化合物を結合させ、 更にこれにオリゴぺプ チドを結合させてなるペプチドライブラリ一に関する。
更に、 本発明は、 官能基を有する固相担体に、 該官能基と結合し得る官能基を 有し、 且つ他の官能基を 2以上有する化合物を結合させ、 更にこれに、 該他の官 能基と結合し得る官能基を有し、 且つこれ以外の官能基を 2以上有する化合物を 結合させ、 然る後、 更にこれにオリゴペプチドを結合させてなるペプチドライブ ラリーに関する。
更にまた、 本発明は、 合成前駆体型リ ピド A又は大腸菌型リ ピ ド Aのホスホノ ォキシェチル誘導体に放射性元素を導入したリ ピド A放射性標識体に関する。 即ち、 天然型リ ピド Aの 1位ダリ コシルリ ン酸基は化学的に不安定であるが、 これをホスホノォキシェチル （P E ) 基に置き換えた P E類縁体は化学的に安定 であり、 天然型のものと同等の活性を示すことが明らかにされている。 本発明者 らは、 先に P E類縁体の効率的な合成法を開発し報告している （B u l l . C h e m . S o c . J p n . , 7 2 , 1 3 7 7 ( 1 9 9 9 ) ) が、 今回、 更に P E類 縁体合成においてアルデヒ ド中間体の還元に Na B 3 H 4を用いることによって、 大 腸菌リ ピド A トリチウム標識 P E類縁体の合成に成功し、 これらの放射性標識体 を用いて特定のペプチドライブラリ一とのバインディ ングアツセィ （結合実験） を行う ことにより効果的な細菌内毒素吸着剤のスクリ一エングが実施できること を見出し本発明を完成するに到った。 図面の簡単な説明 第 1図は、 リピド A、 リピド A類縁体、 リポ多糖に対する本発明のペプチドラ， イブラリー （固相担体としてポリエチレングリコール一ポリスチレン樹脂である T e n t a G e l を使用したもの） の結合能力を調べた結果を示す。
第 1図中、 （ a) は大腸菌型リピド Aのホスホノォキシェチル誘導体 （P E 5 0 6) との、 （b) は大腸菌型リピド A ( 5 0 6 ) との、 （c) は生合成前駆体 型リピド Aのホスホノォキシェチル誘導体 （P E 4 0 6 ) との、 （d) は生合成 前駆体型リピド A ( 40 6 ) との、 （ e ) は大腸菌 R e変異株のリポ多糖 （R e L P S) との、 （ f ) は大腸菌リポ多糖 （ L P S) との結合実験の結果をそれぞ れ示す。
第 2図は、 リピド A、 リピド A類縁体、 リポ多糖に対する本発明のペプチドラ イブラリー （固相担体として親水性ビニルポリマーの TOYOP EARLを使用 したもの） の結合能力を調べた結果を示す。
第 2図中、 （ a) は大腸菌型リピド A ( 5 0 6 ) との、 （b) は大腸菌 R e変 異株のリポ多糖 （R e L P S) との、 （c ) は大腸菌リポ多糖 （ L P S) との結 合実験の結果をそれぞれ示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる、 生合成前駆体型リピド A又は大腸菌型リピド Aのホスホ ノォキシェチル誘導体に放射性元素を導入した放射線標識リピド A類縁体におけ る放射性元素としては、 例えば、 トリチウム （3H) が挙げられる。
本発明で用いられる、 大腸菌型リピド Aのホスホノォキシェチル誘導体に放射 性元素を導入した放射線標識リピド A類縁体としては、 例えば、 下記構造式
[ 4 ] で示されるものが挙げられる。
Figure imgf000005_0001
また、 本発明で用いられる、 生合成前駆体型リピド Aのホスホノォキシェチル 誘導体に放射性元素を導入した放射線標識リピド A類縁体としては、 例えば、 下 記構造式 [ 5 ] で示されるものが挙げられる。
Figure imgf000005_0002
上記放射線標識リピド Α類縁体の製造方法は、 後記実施例の項で詳細に述べる とおりである。 '
本発明で用いられるペプチドライブラリ一としては、 例えば、 -官能基を有する 固相担体あるいは可溶性担体に、 該官能基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の 官能基を 2以上有する化合物を結合させ、 更にこれにオリゴぺプチドを結合させ て作製したぺプチドライブラリ一が挙げられる。
また、' 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体に、 該官能基と結合し得る 官能基を有し、 且つ他の官能基を 2以上有する化合物を結合させ、 更にこれに、 該他の官能基と結合し得る官能基を有し、 且つこれ以外の官能基を 2以上有する 化合物を結合させ、 然る後、 更にこれにオリゴペプチドを結合させて作製したぺ プチドライブラリーも好ましいものとして挙げられる。
官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体としては、 例えば、 アミノ基を有 する固相担体あるいは可溶性担体が挙げられる。
官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体がアミノ基を有する固相担体ある いは可溶性担体である場合、 該ァミノ基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官 能基を 2以上有する化合物としては、 例えば、 式： HOO C (NH2) CH ( CH 2) nN H 2 (式中、 nは 1〜4の整数を表す。 ） で示される塩基性アミノ酸や、 デ ォキシコール酸、 ケノデォキシコール酸等の水酸基を 2以上有するカルボン酸等 が挙げられる。
上記アミノ酸の具体例としては、 例えば、 リジン、 オル二チン等が好ましいも のとして挙げられる。
官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体がアミノ基を有する固相担体ある いは可溶性担体であり、 該ァミノ基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官能基 を 2以上有する化合物が、 式： HOO C (NH2) CH (CH2) nNH2 (式中、 nは 1〜4の整数を表す。 ） で示されるアミノ酸である場合、 該他の官能基と結 合し得る官能基を有し、 且つこれ以外の官能基を 2以上有する化合物としては、 例えば、 式 ： HO 0 C (NH2) C H (C H2) nNH2 (式中、 nは 1〜 4の整数 を表す。 ） で示される塩基性アミノ酸が挙げられる。
上記アミノ酸の具体例としては、 例えば、 リジン、 オル二チン等が好ましいも のとして挙げられる。
本発明で用いられるペプチドライブラリ一において、 官能基を有する固相担体 あるいは可溶性担体に、 該官能基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官能基を 2以上有する化合物を介して、 或いは、 官能基を有する固相担体あるいは可溶性 担体に、 該官能基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官能基を 2以上有する化 合物を結合させ、 更にこれに、 該他の官能基と結合し得る官能基を有し、 且つこ れ以外の官能基を 2以上有する化合物を結合させたもの介して、 結合させるオリ ゴペプチドとしては、 例えば、 ァミノ酸残基が 2から 2 0、 好ましくは 3から 1 0、 より好ましくは 4から 8のオリゴペプチドが挙げられる。 アミノ酸残基の種類に特に制約はないが、 例えば、 G l y、 D, L - V a D L一 P h e、 D , L - P r o D， L— S e r、 D , L - G 1 n , D , L - G 1 u , D, L - L y s等'が好ましいものとして挙げられる。
本発明に係るペプチドライブラリーの具体例としては'、 例えば、 下記一般式 [ 1 ] 、 [ 2 ] 又は [ 3 ] で示される化合物が挙げられる。
Figure imgf000007_0001
(式中、 球状の部分は固相担体あるいは可溶性担体を表し、 ΑΑ AA2、 A A ；及び A Α4はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。 ）
[ 2]
Figure imgf000007_0002
(式中、' 球状の部分は固相担体あるいは可溶性担体を表し、 AA L A A 2 A A i及び A A4はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。 ）
Figure imgf000008_0001
(式中、 球状の部分は固相担体あるいは可溶性担体を表し、 ΑΑ^ AA2、 A A 及び AA4はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。 ）
上記一般式 [ 1 ] 、 [ 2 ] 又は [ 3] で示されるペプチドライブラリーにおい て、 AA AA2、 AA3及び AA4で表されるアミノ酸残基の種類に特に制約は' なく、 何れのアミノ酸残基でも良いが、 好ましいものとしては、 例えば、 G l y、 D, L - V a D， L— P h e、 Dユー P r o、 D , L - S e r D, L - G i n D， L— G l u、 D， L一 L y s等が挙げられる。
本発明の細菌内毒素吸着剤は、 前記リピド A放射性標識体を用いて、 上記ぺプ チドライブラリ一とのバインディングアツセィを行うことにより検索、 抽出され るが、 そのようにして得られた本発明の細菌内毒素吸着剤の具体例としては、 例 えば、 上記一般式 [ 1 ] において、 AAh AA2、 A A3及び A A4が下記表 1に 記載の何れかの組み合わせからなるもの、
表 1
AA 1 A A 2 A A 3 A A 4
D - P h e D - V a 1 L - G 1 n D - P h e
L - L y s D - S e r D— V a 1 D - G 1 n
D - P r o D - P e L - P h e L - V a 1 D - G 1 n D - G 1 n L - P h e D - L y s D - V a 1 L - P r o D - S e r D - S e r 上記一般式 [ 2 ] において、 A A i , A A 2、 A A 3及び A A »が下記表 2に の何れかの組み合わせからなるもの、
A A 1 A A 2 A A 3 A A 4
D - P r o L - G 1 u D - G 1 u L - V a 1
D - V a 1 D - P r o D - L y s L - G 1 n
D - V a 1 L - G 1 u L - V a 1 D - G 1 u
L - V a 1 D - P r o D - V a 1 D - S e r
L - V a 1 D - P r o L - P h e G 1 y
D - L y s L - G 1 u D - G 1 u L - G 1 n
L— L y s D - L y s L y s JJ 6 Γ
L - P h e L - L y s G 1 y L - S e r
D - G 1 n D - G 1 u D - S e r L - G 1 u 及び、 上記一般式 [ 3 ] において、 A A i , A A 2、 A A 3及び A A 4が下記 に記載の何れかの組み合わせからなるもの、
表 3
AA1 AA2 AA3 AA4 AA1 AA2 AA3 AA4 D-Lys D-Ser D-Lys L-Ser D-Val L-Glu L-Val L-Lys L-Gln D-Lys L-Glu L-Gln D-Pro L-Ser D-Glu L-Lys D-Ser L-Phe D-Gln L-Lys D-Ser L-Ser L-Lys D-Lys L-Phe D-Lys L-Gln L-Lys L-Lys L-Lys D-Lys D-Lys L-Lys L-Lys L-Gln L-Lys L-Gln L-Glu L-Lys D-Lys L-Val L-Val L-Lys L-Lys L-Lys L-Gln L-Gln D-Glu L - Gin D-Lys Gly L-Lys L-Lys L-Ser L-Lys L-Glu L-Glu D-Gln D-Phe L-Lys D-Gln D-Val D-Lys L-Glu D-Gln D-Glu L-Phe L-Lys D-Lys L-Lys D-Glu L-Glu L-Ser D-Ser L-Phe D-Val L-Lys D-Val L-Glu D-Glu D-Pro L-Ser L-Pro L-Val L-Lys L-Ser L-Val Gly D - Pro L-Pro D-Ser L-Phe L-Lys D-Gln L-Gln L-Lys L-Pro L-Pro L-Ser L-Val D-Val L-Pro L-Phe L-Lys L-Pro L-Val L-Gln D-Gln L-Pro D-Pro D-Phe L-Lys Gly D-Val L-Lys Gly L-Pro L-Glu L-Ser L-Lys L-Phe L-Val L-Glu D-Ser L-Phe D-Val D-Glu L-Lys L-Phe L-Gln L-Lys L-ser L-Gln D-Gln L-Gln D-Lys D-Lys L-Gln L-Pro D-Phe L-Pro L-Pro L-Ser D-Lys D-Lys D-Lys D-Val D-Gln 等が挙げられる。
ォリゴぺプチド構造と細菌内毒素吸着剤としての有効性との相関関係は、 未だ 十分には解明されていないが、 AA4にリジンがあるのがより有効のようである。 本発明で用いられる官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体としては、 例 えば、 アミノ基、 力ルポキシル基、 水酸基等の官能基を有する樹脂あるいはポリ エチレングリコール、 好ましくはビーズ状樹脂が挙げられる。 そのような樹脂の 具体例としては、 例えば、 上記した如き官能基を有するポリエチレングリコール 一ポリスチレン樹脂 [具体的な商品名としては、 例えば、 T e n t a G e 1 S— N H (R a p p P o l yme r e社） 、 Am i n ome t h y l N o v a G e 1 H L (N o v a b i o c h e m社） 等が挙げられる。 ] や、 親水性ビニルポリ マー [具体的な商品名としては、 例えば、 T S K g e l AF -Am i n o TOY OP EARL 6 5 O S (東ソ一 （株） ） 等が挙げられる。 ] 等が挙げられる。 以下に、 放射線標識リ ピド A類縁体と分子ピンセッ トライブラリー （ペプチド ライプラリー） との結合実験の概略について述べる。 分子ピンセッ トライブラリーの調製
先ず、 スプリ ッ ト合成によってエンコード分子ピンセッ トライブラリー （ぺプ チドライブラリ一） を調製した。
即ち、 ケノデォキシコール酸をテンプレートとし、 その 2つの水酸基に G l y 残基を介してテトラベプチドライブラリ一を結合したもの （diarm L 1 ) 、 L— L y sの 2つのアミノ基にそれぞれテトラペプチドライブラリ一を結合したもの (diarm L 2 ) 、 及び L一 L y sのそれぞれのアミノ基に L一 L y sを結合させ、 計 4つのアミノ基にテトラペプチドライブラリーを結合したもの （tetraarm L 3) である。 固相担体としては水中でアツセィを行う ことを考慮して、 水に膨潤 性のポリエチレングリ コール-ポリスチレン樹脂である T e n t a G e l を用いた L 1をコア構造として用いる場合はまずデォキシコール酸を固相担体に導入 した後、 2つの水酸基に対して Fm 0 c— G 1 yを結合させた。 リジン （L 2) と トリ リジン （L 3) コアは通常のペプチド固相合成法により調製した。 ライブ ラリ一調製には 1 5種類 （G l yと D及び L一 V a 1 , P h e , S e r， G i n, G 1 u , L y s及び P r o) のアミノ酸を用いた。 4段階のスプリ ッ トカツプリ ングサイクルを行つて、 3 X 1 54= 1 5 1 , 8 7 5種類のペプチドを含むライブ ラリ一を構築した。 放射線標識リ ピド A類縁体と分子ピンセッ トライブラリーの結合実験
上記構造式 [4] で示される放射線標識リ ピド A類縁体 （以下、 [3H] P E 5 0 6と略記する。 ） 、 又は上記構造式 [ 5] で示される放射線標識リ ピド A類縁 体 （以下、 [3H] P E 4 0 6と略記する。 ) を用いて、 分子ピンセットライブラ リーとの結合実験 （バインディングアツセィ） を行った。 なお放射線化合物を用 いた分子ピンセッ トライブラリ一との結合実験については N e s t l 'e rがすで に確立しており、 その手法に従った （Nestler H.P. ;Wennemers Η· ;Sherlock R.； Dong D.L.-Y.Bioorg.Med.Chem Lett. , 6, 1327 (1996).) 。
[3H] P E 5 0 6を用いた結合実験についてはライブラリ一 （ 1 5.7 mg， 約 1 9 0 0 0個のビーズ状樹脂を含む。 ) を [3H] P E 5 0 6の存在下で 4でで 4 1時間振盪した。 この操作により [3H] P E 5 0 6を認識する分子ピンセット が結合した樹脂は [3H] P E 5 0 6を吸着するので放射能を帯びる。 これに Kod ak autoradiographic emul s i onを作用させると、 放射能を帯びた樹脂の回りが感 光される。 定着した後、 余分なェマルジヨンを除去すると放射能を帯びた樹脂は 黒く染まる。 これを取り出し、 後に述べるエンコード法で樹脂上のペプチド配列 を決定した。 その結果、 [3H] P E 5 0 6 と結合する 1 9種類の分子ピンセッ ト が見出された （表 4) 。 '
表 4
(kskS)L3 (6) (OkEQ)L3 (sFqK)L3 ,(FkQKL3 (KKQK)L3 (VVKKfLil (QkG )L3 (Eqf )L3 (11) (qeFK)L3 (vEVK)L3 (pSeK)L3 (sSKk)L3 (7) (KKkk)L3 (8) (QEKk)L3 (9) (KQQe)L3 (KSKE)L3 (10) (qvkE)L3 ― (pEeV)L2 (fvQf)Ll
小文字は D-アミノ酸を大文字は L-アミノ酸を表す。 表 4から明らかなように、 1 9種類の分子ピンセッ 卜のうち 1 7種類までもが L 3の構造を有していた。 また各 a r mの C—未端に L—リジン （K) 残基を有 するもの （K一 L 3構造） が 9種類、 D—リジン (k) を有するもの （k— L 3 構造） が 3種類見出された。 ライブラリ一全体には 1 5 1 , 8 7 5個の分子ピンセ ッ トが含まれているのに、 実際のアツセィに用いたビーズ状樹脂の数は約 1 9 , 0 0 0個であり、 アツセィで調べた分子ピンセットの数は 2 0 %に満たない。 従 つ.て今回見つかったペプチド配列以外にも [3H] P E 5 0 6と結合するものは数 多く存在するものと予測される。
[3H] P E 40 6を用いた結合実験についてはライブラリー （24.2mg， 約 2 9 0 0 0個のビーズ状樹脂を含む。 ） を用いて同様の結合実験を行った。 そ の結果 3 2種類の分子ピンセッ トが見出された （表 5 ) 。
表 5
(SsFv)L3 (12) (pSPV)L3 (pPsF)L3 (PPSV)L3 (PVQq)L3 (GvKG)L3 (FVEs)L3 (13) (FQKS)L3 (kQPf)L3 (kkvq)L3 (kKeE)L3 (14) •(KvEe)L3 (15) (KSVG)L3 (KqQ華 3 (vPFK S (Ppf )L"3 (PESK)L3 (16) (FveKL3 (QqQk)L3 (PPSk)L3 (17) (vpkQ)L2 (vEVq)L2 (Vpvs)L2 (VpFG)L2 (qesE)L2 (kEeQ)L2 (Kkks)L2 (FKGS)L2 (Ksvq)Ll (qqFk)Ll ipfFV]Ll XvPssiLl
小文字は D-アミノ酸を大文字はレアミノ酸を表す。 . ' 表 5から明らかなように、 3 2種類中 2 0種類が L 3構造を有しており、 その うち 5種類のみにテトラべプチドの C未端に L—リジン残基が存在していた。 こ の部分がコンセンサス配列であることに変わりないが、 [3H] P E 4 0 6では配 座の運動性が増加したため、 様々な分子ピンセッ 卜が結合できるものと考えられ る。 リ ピド A類縁体認識分子ピンセッ トの再合成―
上記のようにして見出された分子ピンセッ トが天然型リ ピド Aやリポ多糖に結 合するかどうかを確かめるために、 上記の分子ピンセッ トから適当に選んで分子 ピンセッ トの結合した樹脂 6〜 1 Ίを調製した。
[3H] P E 5 0 6 との結合実験で見出された分子ピンセッ ト
( k-s-k-S) 4L 3 -TentaGel (6 -TentaGel) , (s-S-K-k) 4L 3 -TentaGel (7 - Tent aGel), (K-K-k-k) 4 L 3 -TentaGel (8 -TentaGel)， (Q-E-K-k) 4L 3 -Tenta-gel (9 -TentaGel), (K-S-K-E)4L 3 -TentaGel ( 1 0 -TentaGel), (E-q-f-K)4L 3 -Tenta Gel ( 1 1 -TentaGel)
[3H] P E 4 0 6 との結合実験で見出された分子ピンセッ ト
(一 S-s - F - v)4L 3 -TentaGel (1 2 -TentaGel), (F-V-E-s) 4L 3 -TentaGel ( 1 3 - T entaGel), (k-K-e-B) 4L 3 -TentaGel ( 1 4 - TentaGel), (K-v-E-e) 4L 3 -TentaGe 1(1 5 TentaGel)， (P - E-S - K)4L 3 -TentaGel ( 1 6 -TentaGel), (P-P-S-k) 4L 3 -TentaGel ( 1 7 -TentaGel) 再合成した分子ピンセッ トを用いた結合実験 ' 次に再合成した分子ピンセッ トを用いて、 大腸菌型リピド Aのホスホノォキシ ェチル誘導体 （以下、 P E 5 0 6と略記する。 ） 、 大腸'菌型リピド A (以下、 5 ◦ 6 と略記する。 ） 、 生合成前駆体型リピド Aのホスホノォキシェチル誘導体 (以下、 P E 40 6と略記する。 ） 、 生合成前駆体型リ ピド A (以下、 4 0 6と 略記する。 ） 、 大腸菌 R e変異株のリポ多糖 （R e L P S) 、 及び大腸菌リポ多 糖 （E. c o l i 01 1 1 ： B 4 L P S (S i gm a社） ） との結合実験を行つ た。 R e L P Sはリピド A部に K d oと呼ばれる糖が 2残基結合した構造を有し ており、 コア多糖部の殆どの部分と 0—特異多糖部を欠いている。
参考ま ·でに R e L P Sの構造式を以下に示す。
Figure imgf000014_0001
まず分子ピンセッ ト樹脂 6〜 1 7 - TentaGelのトリフルォロ酢酸塩を用いて P E 5 0 6及び 5 0 6との結合実験を行った。 樹脂への結合はアツセィ後の溶液 TL C分析耷行って確認した。 結果を表 6に示す。 表 e
PE-506 506 PE-506 506
(k - s-k- S)4L3- Tenta gel (6) +++ ++ (S-s-F-v)4L3- Tenta gel (12) - -
(s-S-K-k)4L3-Tenta gel (7) +++ ++ (F-V-E-s)4L3-Tenta gel (13) - -
(K- -k-k)4L3-Tenta gel (8) +++ +++ (k-K-e-E)4L3-Tenta gel (14) + -
(Q-E-K-k)4L3-Tenta-gel (9) +++ + (K-v-E-e)4L3-Tenta gel (15) - -
(K-S-K-E)4L3- Tenta gel (10) +++ ++ (P-E-S-K)4L3- Tenta gel (16) +++ +++
(E-q-f-K)4L3- Tenta gel (11) . +++ + (P-P-S-k)4L3 -Tenta gel (17) +++ +++
+++ 全て吸着 （TLC上で 4, 1 は確認されない）、 ++ (大部分が吸着）、 + (一部吸着）、 (明確な 吸着は認められない）
次に樹脂 6 - TentaGel、 1 1 -TentaGeK 1 2 -TentaGeK 1 6 -TentaGeK 1 7 - Tent aGelの吸着能をアツセィ後の溶液のリムルス活性を測定することによって確 認した。 リムルス活性試験とは、 リポ多糖がカブトガニ （Limulus polyphemusな ど） の血球抽出成分 L AL (Limulus Amebocyte Lysate)凝固酵素を活性化する反 応を利用し、 内毒素活性を比色定量する方法である。
P E 5 0 6、 5 0 6、 P E 4 0 6、 40 6、 R e L P S、 及び大腸菌リポ多糖 (E. c o l i 01 1 1 ： B 4 L P S (S i gm a社） ） を用いて、 それぞれ上 記と同様に 6 - TentaGel、 1 1 -TentaGeK 1 2 -TentaGeK 1 6 -TentaGeK 1 7 - TentaGelとの結合実験を行い、 上清についてリムルス活性を測定した。 これらの 内毒素が樹脂に吸着されると観測される吸光度は低下する。 なお、 ここではアツ セィを行う前に各々の樹脂を水で洗浄したため、 樹脂上の大部分のアミノ基は遊 離となっているものと考えられる。 そのため酸性複合糖質であるリポ多糖ゃリピ ド Aに対する樹脂の吸着能は水で洗浄する前よりも向上している。 実際、 上記の トリフルォロ酢酸塩を用いた場合は 1 2 -Tent aGelは P E 5 0 6、 50 6を吸着し ないが、 水で洗浄後の 1 2-TentaGelはどちらもよく吸着している。 樹脂 1 1 - Te ntaGelは 4 0 6に対して吸着力が弱い。 全ての榭脂が天然の R e L P Sに対して も強い吸着能を示したが、 大腸菌リポ多糖 （E. c o l i 01 1 1 ： B 4 L P S (S i gm a社） ） に対しては殆ど吸着能を示さなかった （第 1図参照） 。
TentaGelはポリエチレングリコール—ポリスチレングラフトポリマ一であり、 水には膨潤するものの疎水性の高い樹脂である。 大腸菌リポ多糖 （L P S) は長 い糖鎖を有しており、 親水性の糖鎖部が樹脂への浸透を妨害しているものと考え られた。 そこでより親水性の高い、 T S K g e l A F - Am i n o TOYO P E ARL 6 5 0 S (東ソ一 （株） ） を担体として用いて、 分子ピンセッ ト 6， 1 1 : 1 2， 1 6及び 1 7を結合させた 6 - Toyopearl, 1 1 -Toyopearl, 1 2 -Toyopea rl, 1 6 -Toyopearl, 及び 1 7 - Toyopear 1を合成し、 5 0 6、 R e L P S、 及び 大腸菌リポ多糖 （E. c o l i 01 1 1 ： B 4 L P S (S i gma社） ） との結 合実験を行い、 結合能をリムルス活性により評価した。 その結果、 期待したとお り、 T o y o p e a r l をべ一スにした樹脂はわずかな例外を除いてこれら全て を効率的に吸着した （第 2図参照） 。 以上のことから、 表 4に記載の 1 9種類の分子ピンセッ ト （ペプチドライブラ リー） 及び表 5に記載の 3 2種類の分子ピンセッ ト （ペプチドライブラリ一） は、 何れも細菌内毒素吸着剤としてより効果的に使用し得るものと大いに期待される。 本発明の吸着剤は、 既存の吸着剤と比べて、 天然物 （天然アミノ酸） を使用し ている点が大きな利点である。
なお、 本発明の特定の吸着体を得る為に、 上記の如く、 1 5のアミノ酸から選 んで 1 54X 3 = 1 5 1 8 7 5ケとし、 更に、 実際には、 1 9 0 0 0 と 2 9 0 0 0 からなるライブラリ一を得て、 これから有効な吸着体 5 1ケを得た。
このとき、 1 5のアミノ酸の選択、 1 5 1 8 7 5からの 1 9 0 0 0 と 2 9 0 0 0への絞り込みは、 疎水性、 親水性、 酸 ·塩基性などの点を考慮して行った。 実施例
以下、 実施例により本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例に より何ら限定されるものではない。 実施例 1 放射性標識リ ピド A類縁体の合成
下記の合成スキームに従って、 2種類の放射性標識リ ピド A類縁体を合成した。
Figure imgf000018_0001
19, 23 20， 24
1) テトラゾール， cc NEt2 iPr 2) mCPBA
0。
Figure imgf000018_0002
22*, 26*
19, 20, 21*, 22* 23, 24, 25*, 26*
F^CO = RlCO = R2CO = R3CO
R2CO =
P3CO=ベ
なお、 シリカゲルカラムクロマトグラフィ一には K i e s e l g e l 6 0 (E . Me r c k社 0.040— 0. 0 6 3 mm) を用いた。 また、 S e p h a d e x
LH— 2 0は P h a rma c i a B i o t e c h, S w e d e n力、ら購入した。 無水 CH2C 1 と CHC 1 は水素化カルシウムを脱水剤に用いて蒸留して調製し た。 無水テトラヒ ドロフラン （THF) と無水ベンゼンは関東化学 （株） より購 入した。 N a B3H4 ( s p e c i f i c a c t i v i t y 2 2 2 G B q mm
0 1 - 1) はアマシャムライフサイエンスより購入した。 オートラジオグラフィ一 にはイメージングプレート BA S— TR 2 04 0 S (富士フィルム （株） ） を用 い、 検出にはバイオ · イメージングアナライザ一 B A S— 1 5 0 0 MAC (富士 フィルム （株） ） を用いた。
( 1 ) 2- (ホスホノォキシ） [2- 3H ェチル 2-デォキシ- 6- -デォキシ- 2- [( - 3 -（ドデカノィルォキシ）テトラデカノィルアミノ] - 4 - 0 -ホスホノ- 3 - 0- [( -3 -（テトラデカノィルォキシ）テトラデカノィル] - /3 - D -ダルコピラノシル] - 3-0 - [(め- 3-ヒドロキシテトラデカノィル] - 2 - [(め - 3 -ヒ ドロキシテトラデカノィルァ ミノ]— Qi-D -ダルコピラノシド （ [3H] P E 5 0 6 ： 4 * ) の合成
( 1 一 1 ) ホルミルメチル 4-0-ベンジル- 6-0- [6-0-ベンジル- 2-デォキシ -4-0- (1， 5-ジヒ ドロ- 3-ォキソ -3λ 5-3iJ-2, 4, 3-ベンゾジォキサホスフェピン -3-ィル） -
2 - [( - 3 -（ドデカノィルォキシ）テトラデカノィルアミノ] - 3 - 0 - [(]?)- 3 -（テトラデ カノィルォキシ）テトラデカノィル]- -D -ダルコピラノシル] -3 - 0-[ ( - 3 -（ベン ジルォキシ） テトラデカノィル] - 2-[( - 3- (ベンジルォキシ）テトラデカノィルァ ミノ ]-2 -デォキシ-ひ- D -ダルコピラノシド (化合物 2 0 ) の合成
化合物 1 9 ( 4 5 0 m g , 2 0 2 mm o 1 ) の THFノ tーブタノール/水 ( 1 0 : 1 0 : 1， 1 2 mL) 溶液に激しく撹拌下、 4一メチルモルフォリン N ーォキシド （NMO) (94 m g , 0. 8 0 mm o 1 ) と四酸化オスミウム （O s O 4) の水溶液 （2.5 %, 4 0 0 mL , 40 mm o 1 ) を加えた。 6時間後飽和 N a2S 2〇3水溶液 （5 0mL) を加え、 酢酸ェチル （ 5 0mL) で抽出した。 有 機層を N a S 2 O 3水溶液 （ 5 0 mL X 2 ) と飽和食塩水 （2 0 mL) で洗浄した 後、 N a 2S〇4で乾燥し、 減圧濃縮して粗生成物のジオールを得た （4 5 8 m g) 。 ジオールを無水ベンゼン （ 1 0mL) に溶かし、 四酢酸鉛 （P b (OA c ) 4) (純度 9 0 %, 1 1 9 m g , 2 4 2 mm o 1 ) を加え、 3 0分間撹拌した。 反応混合物をシリカゲルカラム （ 3 g) にチャージし、 酢酸ェチルで溶出した。 減圧濃縮後、 残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー （ 2 0 g， トルエン/酢 酸ェチル = 5 : 1 ) で精製し化合物 2 0を無色シラップとして得た （ 3 7 7 m g , 収率 ： 8 4 %) 。
FAB-MS (positive) /z 2244 [(M+Na)+]； LH NMR (500MHz, CDCls) 6=^.37(s, 1H, CH0)。
なお、 化合物 1 9の合成は、 文献 [Liu W-C, Oikawa M, Fukase K, Suda Y， K usumoto S. Bull Chem Soc Jpn 1999; 72:1377-1385. ； Fukase K， Oikawa M, Suda Y, Liu W-C, Fukase Y， Shintaku T， Sekl j ic H, Yoshizaki H, Kusumoto S. / Endotoxin Res 1999; 5: 46-51.]に記載の方法に準じて行った。
( 1 - 2 ) 2 -ヒ ドロキシ - [2 -3 ェチル 4- -ベンジル- 6 - 0- [6- -ベンジル- 2 -デ ォキシ -4-り-（1, 5-ジヒ ド口- 3-ォキソ -3 λ 5-3if-2, 4, 3-ベンゾジォキサホスフェピ ン- 3-ィル） -2 - [(め -3- (ドデカノィルォキシ）テトラデカノィルアミノ] - 3 -り- [( -3 -（テトラデカノィルォキシ）テトラデカノィル] - /3- D -ダルコピラノシル] -3-0 -[( - 3- (ベンジルォキシ) テトラデカノィル] -2- [( -3 -（ベンジルォキシ） テト ラデカノィルァミノ] - 2-デォキシ -ひ-D-ダルコビラノシド （化合物 2 1 *) の 合成
化合物 2 0 ( 1 5 0 m g , 6 2. 4 mm o 1 ) の 2 —プロパノール/メ夕ノール / C H 2 C 1 2 ( 5 ： 1 ： 1 , 3. 5 mL ) 溶液に 0 °Cで N a B 3 H 4 ( 5 9 0 mL , 2 6. 4 mm o 1 /mL , 2 4 0 G B q mm o 1 —つ を加え、 3 0分間撹拌した。 飽和塩化アンモニゥム水溶液を加えて反応を止めた後、 酢酸ェチルで抽出した。 抽出液を N a 2 S 04で乾燥した後、 減圧濃縮し、 化合物 2 1 *の無色シラップを 得た （ 1 4 4m g， 定量的） 。 生成物は精製することなく次の反応に用いた。
( 1 一 3 ) 2-(1， 5-ジヒ ドロ- 3-ォキソ - 3 λ 5-3^-2, 4, 3-ベンゾジォキサホスフェ ピン- 3 -ィルォキシ）- [2- SH!] ェチル 4-0-ベンジル- 6-0- [6-0-ベンジル -2-デォキ シ- 4-0- (1， 5-ジヒ ドロ- 3-ォキソ -3 λ 5- 3ii-2，4，3-ベンゾジォキサホスフエピン- 3 -ィル） - 2- [( - 3- (ドデ力ノィルォキシ）テトラデカノィルアミノ ]- 3_り- [( 一 3- (テトラデカノィルォキシ）テトラデカノィル ]_/3 - D-ダルコピラノシル] - 3-0- [( - 3- (ベンジルォキシ） テトラデカノィル] -2 -[( - 3- (ベンジルォキシ）テトラ デカノィルァミノ] -2-デォキシ -Q!-D -ダルコビラノシド （化合物 2 2 *) の合成 化合物 2 1 * ( 1 4 4 m g , 5 9. 9 mm o 1 ) の CH2C 1 2 ( 1 4 m L ) 溶液 に 0 °Cで AT，iV—ジェチル一 1 , 5—ジヒ ドロ— 3 ίί— 2 , 4， 3 —ベンゾジォキ サフォスフエピン一 3—ァミン （ 8 9 mg, 0. 3 7 mm o 1 ) とテトラゾ一ル
( 2 5 m g, 0. 3 2 mm o l ) を加えた。 反応混合物を室温で 3 0分間撹拌した 後、 一 7 8 °Cに冷却した。 mC P B A ( 7 0 %, 8 1 m g， 0. 3 7 mm o 1 ) を 加えた後、 4 5分間撹拌した。 飽和 N a 2S 203を加えて反応を終了させた後、 C H C 1 3で抽出した。 有機層を飽和 N a HC 03水溶液と飽和食塩水で洗狰し、 N a 2 S 04で乾燥させた。 減圧濃縮後、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一 [ 3. 0 g , トルエン Z酢酸ェチル /へキサフルオロー 2—プロパノール （H F
I P) = 1 0 0 : 5 0 : 1 ] で精製し化合物 2 2 *の無色シラップを得た （ 1 3 4mg， 収率 ： 8 7 %) 。 得られた化合物は T L C上で標品の非標識体 2 2 と一 致した。
[αΐο25 = +17.8 (c 1.00， CHCls)； FAB-MS (positive) m/z 2428 [(M+Na)+]。 Found: C， 69.96; H, 9.21; N， 1.14¾. Calcd for Ci 4 oH218N2026P 2 : C， 69. 85; H, 9.13; N, 1.16%。
( 1 - 4) 2- (ホスホノキシ） [ 3!! ェチル 2-デォキシ- 6-0- [2-デォキシ -2- [( - 3- (ドデカノィルォキシ）テトラデカノィルアミノ]- 4 -り -ホスホノ- 3 - 0 - [ ( -3 -（テトラデカノィルォキシ）テトラデカノィル] - - D -ダルコピラノシル] -3-0 3-ヒドロキシテトラデカノィル] - 2 - [( - 3-ヒ ドロキシテトラデカノィルァ ミノ ]- a- D -ダルコビラノシド （ [3H] P E 5 0 6 ： 4 * ) の合成
化合物 2 2 * ( 5 7 m g , 2 2 mm o 1 ) の TH F ( 8 mL) 溶液に P d— b l a c k ( 1 3 0 m g) を加え、 加圧下 （ 7 k g c m— 2) 室温で 2時間接触還元 を行った。 トリェチルァミンを加えて中和した後、 P d— b 1 a c kを濾過で除 いた。 減圧濃縮して得た残渣を液液分配クロマトグラフィ一 （S e p h a d e x L H - 2 0 ： 2 0 g , C H C 1 3 /メタノール/水/ 2 -プロパノ—ル = 9 ： 9 : 9 : 1 ) (有機層を固定相として水層を移動相として使用） で精製し、 [3H] P E 5 0 6 ( 4 *) を白色粉末として得た （ 2 5 mg， 8 4 1 MB q , 6 2 G B q mm o 1 — 収率 ： 6 3 %) 。 得られた化合物はクロマ トグラフィ一上で標品 の非標識体 4と一致した。
FAB-MS (negative) m/z 1840 [(M- H)- ] ; :H 匪 R (600MHz, CDsOD/CDCl 3 =1 : 1) δ^. 23 (m, 1H), 5.19 (t, / =8.2 Hz, 1H), 5.17 (m，lH), 5.14 (t, / =8.2 Hz，lH)， 4. 82 (d, / =3.0 Hz, 1H), 4.56 (d, / =7.4 Hz, 1H), 4.23 (q, / =8.0Hz, 1H), 4.18 (dd, / =8.9, 3.0Hz, 1H), 4.08-3.93 (m, 5H) , 3.92-3.82 (m, 4H) , 3.80 (dd, / =1 0.3， 4.5Hz, 1H), 3.74 (d， =10. 6 Hz, 1H) , 3.63 (m, 1H), 3.56 (t, / -8.1Hz, 1 H), 3.37 (m, 1H), 2.72 (dd, / =14.0, 6.6Hz, 1H), 2.64 (dd, / =14.0, 4.5Hz, 1H), 2.52-2. 6 (m，2H)， 2.44-2.36 (m, 2H) , 2.36-2.27 (m, 6H) , 1.66-1.39 (m, 12H), 1.38-1.20 (m, 108H), 0.89 (t, / =5.6Hz, 18H)0
( 2 ) 2- (ホスホノキシ） [2- 3HJェチル 2-デォキシ- 6-り- [2-デォキシ -2-[(め-3 -ヒ ドロキシテトラデカノィルアミ ノ] - 4-0 -ホスホノ- 3-0- 3 -ヒ ドロキシテト ラデカノィル] - ;3 - D -ダルコピラノシル] -3-0 - [( - 3 -ヒ ドロキシテトラデカノィ ル]- 2 - [( - 3 -ヒ ドロキシテトラデカノィルアミノ]- α-D-ダルコピラノシド
( [3H] P E 4 0 6 ： 5 *) の合成
( 2 - 1 ) ホルミルメチル 4-0-ベンジル -6-0- [6-0-ベンジル- 2-デォキシ -4 - 0 - (1, 5-ジヒ ドロ- 3-ォキソ -3λ 5- 3 - 2， 4， 3-ベンゾジォキサホスフェピン -3-ィル） - 2- [( - 3_ (ベンジルォキシ）テトラデカノィルアミノ]- 3-0- [(め- 3- (ベンジルォキ シ）テトラデカノィル] - /3 - D -ダルコピラノシル] - 3-0 - [( - 3 -（ベンジルォキシ） テトラデカノィル] - 2- [(i - 3 -（ベンジルォキシ）テトラデカノィルアミノ] -2 -デ ォキシ -α-D-ダルコピラノシド （化合物 24) の合成
化合物 2 3 ( 2 3 0 m g , 0. 1 5 mm o 1 ) の TH F/ t —ブ夕ノール/水
( 1 0 : 1 0 : 1 , 9 mL) 溶液に激しく撹拌下、 4一メチルモルフォリ ン N— ォキシド （NMO) (4 0 m g , 0. 4 5 mm o 1 ) と四酸化ォスミゥム （O s 0 4) の水溶液 （ 2. 5 %, 2 3 0 mL , 2 0 mmo l ) を加えた。 6時間後飽和 N a 2 S 203水溶液 （ 5 0 mL) を加え、 酢酸ェチル （ 5 0 mL) で抽出した。 有機 層を N a 2 S 2〇 3水溶液 （ 5 0 mL X 2 ) と飽和食塩水 （2 0 m L ) で洗浄した後、 N a 2S〇4で乾燥し、 減圧濃縮して粗生成物のジオールを得た （ 4 5 8 m g) 。 ジォ一ルを無水ベンゼン （ 1 0 mL) に溶かし、 四酢酸鉛 （P b (0 A c )4) (純度 9 0 %, 6 8 m g , 1 4 0 mm o 1 ) を加え、 3 0分間撹拌した。 反応混 合物をシリカゲルカラム （ 3 g) にチャージし、 酢酸ェチルで溶出した。 減圧濃 縮後、 残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー （6 g， トルエン Z酢酸ェチル = 4 : 1 ) で精製し化合物 2 を無色シラップとして得た （ 1 9 0 mg， 収率： 8 3 %) 。
FAB-MS (positive) /z 2032 [(M他） +] ; NMR (500MHz, CDCls) δ=9.30 (s， 1 H， CH0)。
( 2 - 2 ) 2-ヒ ド口キシ- [2-3HL]ェチル 4-り-ベンジル- 6-り- [6-0-ベンジル -2-デ ォキシ - 4- 0-(1， 5-ジヒドロ- 3-ォキソ -3λ 5 - 3 - 2, 4， 3-ベンゾジォキサホスフエピ ン- 3-ィル）- 2- [( -3- (ベンジルォキシ）テトラデカノィルアミノ] -3-0 - [( - 3- (ベンジルォキシ）テトラデカノィル]- 3 - D-グルコピラノシル] -3-0- [( - 3- (ベ ンジルォキシ） テトラデカノィル] - 2- [( - 3 -（ベンジルォキシ） テトラデカノィ ルァミノ ]-2 -デォキシ - a- D-ダルコピラノシド (化合物 2 5 *) の合成
化合物 2 4 ( 1 0 0 m g， 4 9. 8 m m o 1 ) の 2 プロパノール/メタノール
( 5 : 1， 1. 5 mL) 溶液に 0 °Cで N a B 3H4 (4 7 4mL , 2 6. 3 mm o 1 /mL , 2 4 0 G B q mm o 1 つ を加え、 3 0分間撹拌した。 2 M H C 1水 溶液と飽和食塩水を加えて反応を止めた後、 酢酸ェチルで抽出した。 抽出液を N a 2S 04で乾燥した後、 減圧濃縮し、 化合物 2 5 *の無色シラップを得た （ 1 0 0 m g , 定量的） 。 生成物は精製することなく次の反応に用いた。
( 2 - 3 ) 2- (1，5-ジヒドロ- 3-ォキソ -3λ 5- 3ff-2,4,3-ベンゾジォキサホスフエ ピン -3-ィルォキシ）-
Figure imgf000023_0001
ェチル 4-0-ベンジル- 6-り- [6-0-ベンジル- 2-デォキ シ- 4- 0-(1， 5-ジヒドロ- 3-ォキソ -3λ 5-3 -2, 4, 3-ベンゾジォキサホスフエピン- 3 -ィル） - 2 - [( - 3- (ベンジルォキシ）テトラデカノィルアミノ] - 3 - 0- [ ) - 3 -（ベン ジルォキシ）テトラデカノィル] - i3 -D -ダルコピラノシル] -3-り- [(め- 3 -（ベンジル ォキシ） テトラデカノィル] -2-[0 -3 -（ベンジルォキシ） テトラデカノィルアミ ノ]- 2-デォキシ -α-D -ダルコビラノシド （化合物 2 6 *) の合成
ィ匕合物 2 5 * ( l O O m g , 4 9 . 8 mm o l ) の C H2 C l 2 ( 1 4 mL ) 溶液 に 0 °Cで iV， i —ジェチル— 1， 5 —ジヒ ドロー 3 H— 2， 4 , 3 —べンゾジォキ サフォスフエピン一 3 —ァミン ( 7 0 m g , 0 . 2 9 mm o 1 ) とテトラゾ一ル
( 2 0 m g , 0 . 2 5 mm o 1 ) を加えた。 反応混合物を室温で 3 0分間撹拌した 後、 — 2 0でに冷却した。 mC P B A ( 7 0 % , 6 5 m g , 0 . 2 9 mm o 1 ) を 加えた後、 4 5分間撹拌した。 飽和 N a S 20 を加えて反応を終了させた後、 C H C 1 3で抽出した。 有機層を飽和 N a H C 03水溶液と飽和食塩水で洗浄し、 N a 2 S 04で乾燥させた。 減庄濃縮後、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ ― [ 2 . 3 g , トルエン/酢酸ェチル Zへキサフルオロー 2 —プロパノール （H F
I P) = 1 0 0 : 5 0 : 1 ] で精製し化合物 2 6 *の無色シラップを得た （ 6 3.
9 m g , 収率 ： 5 9 %) 。 得られた化合物はクロマ トグラフィー上で標品の非標 識体 2 6 と一致した。
[a ]D 25 = +16.9 (c 1.00, CHCls)； FAB-MS (positive) m/z 2428 C(M+Na)+]0 Found: C, 69.98; H, 8. 0; N, 1.33%. Calcd for Ci 2 sHi s 2N2024P3 : C, 70.05 ； H, 8.36; N, 1.28%。
( 2 — 4 ) 2- (ホスホノキシ） [2- 3!^]ェチル 2-デォキシ- 6- デォキシ- 2 [(め - 3 -ヒ ドロキシテトラデカノィルアミノ] - 4 - 0-ホスホノ- 3-0 - [( - 3 -ヒドロキ シテトラデカノィル] - i3 - D_ダルコピラノシル] -3 -り [( - 3-ヒ ドロキシテトラデ 力ノィル ]- 2 - 3 -ヒドロキシテトラデカノィルアミノ]- a- D-ダルコピラノシ ド （ 〔3Η] Ρ Ε 4 0 6 : 5 * ) の合成
ィヒ合物 2 6 * ( 1 7 m g , 7. 8 mm o 1 ) の TH F ( 6 mL ) 溶液に P d— b l a c k ( 1 2 0 m g) を加え、 加圧下 （ 7 k g c m"2) 室温で 2時間接触還元 を行った。 トリェチルァミンを加えて中和した後、 P d— b 1 a c kを濾過で除 いた。 減圧濃縮して得た残渣を液液分配ク口マ トグラフィー （S e p h a d e x L H— 2 0 ： 2 0 g , CHC 1 3/メタノール/水 / 2 —プロパノール = 8 ： 8 : 9 : 1 ) (有機層を固定相として水層を移動相として使用） で精製し、 [3H] P E 4 0 6 ( 5 * ) の白色粉末を得た （ 7. 5 mg， 3 3 1 MB q , 6 4 G B q mm o 1 —1， 収率 ： 6 6 %) 。 得られた化合物はクロマトグラフィー上で標品の 非標識体 5 と一致した。
FAB-MS (negative) ια/ζ 1448 [(M-H)— ] ; !H NMR (500MHz, SDS-cf25-D20) = 5. 18(dd， / =9.4, 7.5Hz, 1H), 5.17 (dd， / =9.8， 9.6Hz, 1H)， 4.87 (d， / = 3.8 Hz， 1H)， 4.67 (d， / =7.0Hz， 1H)， 4.12 (dd， / =9.8， 3.8 Hz, 1H), 4.11 (dd, / -15.5, 1.6Hz, 1H)， 4.11 (q, / =7.5, 1H), 4.02 (dd， / =9.4, 7.0Hz, 1H), 3.99 (m， lH)， 3.96 (m, lH), 3.91 (m, 3H) , 3.87 (ddd, / =9.6, 1.6, 2.9Hz, 1H), 3.82 (dd， = 9.8, 8.6Hz, 1H), 3.82 (dd, / =15.5, 2.9Hz, 1H), 3.82 (m, lH)， 3.81 (m, 3H) , 3. 71 (m, 1H), 3.59 (m, 1H), 2.56-2.23 (m, 8H) , 1.54-1.11 (m, 80H), 0.86 (m, 12 H)。 実施例 2 分子ピンセッ トライブラリ一 （ペプチドライブラリ一） の調製
ェンコ一ド分子ピンセッ トライブラリ一はスプリ ッ ト （split- mix)合成法で調 製した。 固相担体としては 1 5 gの T e n t a G e l S -NH2 (R a p p P o 1 111 6 6社， 粒径 9 0 ^ 111， 0. 2 9 mm o 1 / g o f NH2) を用いた。 g2p¾¾ Fm o c /B o c (Fluorenylme t oxycarbony 1/Butyloxycarbonyl) ぺプ チド固相合成法を用いてぺプチド鎖を伸長させた。 ぺプチド縮合法としては HO B t /D I C (Hydroxybenzot r i azo 1 e I Di isopropylcarbodi imide)を用レ た。 ぺ プチド縮合反応の終点はブロモフエノ一ルブル一テス トで青色の発色がなくなる ことで確認した。 カテコール T a gはカルボキシル基を介して H O B t /D I C 法でアミノ基の約 1 %にアミ ド結合形成反応により導入した。 ケノデォキシコー ル酸 （L 1 ) をコア構造として用いる場合はまずデォキシコール酸を固相担体に 導入した後、 2つの水酸基に対し D MF中で 6 当量の Fmo c — G l y— Fと 6 当量のトリエチェルァミン、 0. 0 6当量のジメチルァミノピリジンを作用させて F m o c — G 1 yを結合させた。 リジン （ L 2 ) と トリ リジン （ L 3 ) コアは通 常のペプチド固相合成法により調製した。 ライブラリー調製には 1 5種類 （G 1 yと D及び L一 V a l ， P h e , S e r , G i n , G 1 u , L y s及び P r o ) のアミノ酸を用いた。 4段階のスプリ ッ トカップリ ングサイクルを行って、 3 X 1 5 = 1 5 1 , 8 7 5種類のぺプチドを含むライブラリ一を構築した。 ライブラ リー上の保護基は 2 0 %ピぺリジン/ DM Fと 9 5 % T F A/ 2 . 5 %水 / 2. 5 %チオア二ソ一ルを用いて除去した後 4でで保管した。 実施例 3 分子ピンセッ トライブラリ一 （ペプチドライブラリ一） と放射性標識 リピド A類縁体との結合実験
( 1 ) [3H] P E 5 0 6 との結合実験
[3H] P E 5 0 6 ( 6 2 G B q /mm o 1 , 1 . 4 m g , 4 7 M B q ) を水
( 2 m l ) に溶かした。 分子ピンセッ トライブラリ一 （ 1 5 . 7 m g， 約 1 9 0 0 0ピーズ） を水 （ 2 0 0 1 ) に懸濁し、 [3H] P E 5 0 6溶液 （ 1 0 0 1 ， 2. 4 M B q ) を加えた。 この [3H] P E 5 0 6 ( 1 3 0 β M) と樹脂の懸濁液 を 4 °Cで 4 1時間ゆっく り と振盪した。 遠心して樹脂を沈殿させ、 上清を除く操 作を 3回繰り返した。 ガラスプレートを N a C I 0溶液で処理した後、 十分に水 洗し、 0 . 5ゼラチン溶液に浸してから取り出し、 風乾してゼラチンがコートされ たガラスプレートを調製した。 これに上記の樹脂をのせ、 風乾させた。 これを温 めて溶融 Sせた K o d a k a u t o r a d i o g r a p h y e mu l s i o n で覆い、 十分に固まったことを確認後、 遮光下一 7 8 °Cで 1 2 日間放置した。 ガ ラスプレートを展開液に 1 0分間つけた後、 水で洗浄した。 固定液に 1 5分間つ けた後に水で洗浄した。 放射能を帯びた樹脂の回りはゼラチンに銀が付着して黒 くなる。 これを指標に放射能を帯びた樹脂を取り出し、 樹脂に結合した T a gを 樹脂から切り離し、 電子補足ガスクロマトグラフィー （E C G C) で T a gを検 出、 デコードすることにより 1 9種類の [3H] P E 5 0 6を結合する分子ピンセ ッ トを見出した
( 2 ) [3H] P E 4 0 6 との結合実験
[3H] P E 4 0 6 ( 6 4 G B q /mm o l ， 0 . 6 m g , 2 6 MB q ) を水 ( l m l ) に溶かした。 分子ピンセッ トライブラリー （ 2 4. 2 m g， 約 2 9 0 0 0 ピーズ） を水 ( 2 0 0 ^ 1 ) に懸濁し、 [3H] P E 4 0 6の溶液 （ 1 0 0 1 ： 2. 6 M B q ) を加えた。 この [3H] P E 4 0 6 ( 1 3 0 ^ M) と樹脂の懸濁液 を 4T:で 4 8時間ゆっく りと振盪した。 遠心して樹脂を沈殿させ、 上清を除いた。 水 1 1 を加え振盪し、 遠心して樹脂を沈殿させ、 上清を除く操作を 3回繰り返 した。
ゼラチンがコートされたガラスプレートに樹脂をのせ、 風乾させた。 これを温 めて溶鬲 した K o d a k a u t o r a d i o g r a p h y e mu l s i o nで 覆い十分に固まったことを確認後、 遮光下— 7 8 °Cで 7日間放置した。 放射線を 帯びた樹脂を取り出し、 E C G C解析した。 3 2種類の [3H] P E 4 0 6を結合 する分子ピンセッ トを見出した。 実施例 4 分子ピンセットの再合成
固相担体としては T e n t a G e l S -NH2 (R a p p P o l ym e r e社, 粒径 Θ Ο μιη, 0. 2 9 mm o 1 / g o f NH2) 又は T S K g e l A F - Am i n o TOYO P E AR L 6 5 0 S (東ソ一 （株） ， 0. 1 mm o l /m l ) を 用レ た。 標準的な？111 0 (： /8 0 0 (Fluorenylmethoxycarbonyl/Butyoxycarbon yl) ペプチド固相合成法を用いてペプチド鎖を伸長させた。 ペプチド縮合法とし ては HO B t / Ό I C (Hydroxybenzotriazole I Di isopropylcarbodi imide)を用 いた。 ぺプチド縮合反応の終点はブロモフエノールブル一テストで青色の発色が なくなることで確認した。
代表的な例として分子ピンセッ ト 6 -Toyopearl [ (k-s -k-S)4L 3 -Toyop earl] の合成例を示す。
( 1 ) , N ε —ジ一 t —ブトキシカルボニル一 L—リジン （B o c - L-L y s (B o c )-OH) の導入
T S K g e l A F -Am i n o TOYO P EAR L 6 5 0 S ( 0. 1 mm o 1 Zm 1 ) ( l m l , 0. 1 mm o 1 ) に 1 0 %ジイソプロピルェチルアミン （D I EA) /DMF (4. 0 m l ) を加え 3 0秒間振盪した後、 濾渦した。 DMF ( 4 0 m l ) で樹脂を 2回洗浄後、 B o c -L- L y s (B o c )- OH ( 1 0 4 m g , 0
3 0 0 mm o 1 ) の D M F溶液 （ 3 m l ) 、 ジイソプロピルカルポジィミド （D I C) (4 7. 0 1 , 0. 3 0 0 mm o 1 ) の D M F溶液 （ 1 m 1 ) 、 1 —ヒ ド ロキシベンゾトリアゾ一ル （H O B t ) ( 4 0. 5 m g , 0 . 3 0 0 mm o l ) の DM F溶液 （ 1 m l ) を加え、 室温で 2時間振盪した。 濾渦後、 樹脂を D M F
( 4. 0 m l ) で 4回洗浄した。 B o c - L- L y s (B o c )- O Hを用いたぺプチ ド縮合反応をもう一度繰り返した。 無水酢酸一 DM F ( 1 : 1 ) 溶液 （ 2 m l ) とトリエチルアミン— D M F ( 1 ： 1 ) 溶液 （2 m l ) を加え、 室温で 1 5分間 振盪し、 わずかに残る未反応のアミノ基を完全にブロックした。 濾渦後、 樹脂を DM F ( 4 m l ) で 4回洗浄した。
( 2 ) B o c基の除去
2 5 % T F A/DM F ( 4. 0 m l ) を加え、 室温で 3 0分間振盪した。 濾渦後
、 樹脂を D M F ( 4. 0 m l ) で 4回洗浄した。
( 3 ) Ν α—フルォレニルメ トキシカルボ二ルー Ν ε - t—ブトキシカルポニル — L—リジン （Fm o c - L-L y s (B 0 c )- OH) の縮合
Fm o c -L-L y s (B o c )-OH ( 2 8 1 m g , 0. 6 0 0 mm o 1 ) の DM F溶液 （ 3 m l ) 、 D I C ( 9 4. 0 i l , 0 . 6 0 0 mm o 1 ) の D M F溶液 ( l m l ) 、 H O B t ( 8 1 . 1 m g , 0 . 6 0 0 mm o 1 ) の D M F溶液を加え、 室温で 2時間振盪した。 濾渦後、 樹脂を DM F ( 4. 0 m l ) で 4回洗浄した。 F m o c -L- L y s (B o c )- O Hを用いたペプチド縮合反応をもう一度繰り返した, 未反応のアミノ基は無水酢酸を用いて、 同様にブロックした。
( ) Fm o c基の除去
2 0 %ピぺリジン/ D M F ( 4 m l ) を加え室温で 3 0分間振盪して F m o c 基を除去した。 濾渦後、 樹脂を D M F ( 4. 0 m l ) で 3回、 メタノール （4. 0 m l ) で 2回洗浄した。 Fm 0 c基を除去する操作を 2回繰り返した。
( 5 ) B o c基の除去
上記 （ 2 ) と同様にして B o c基を除去した。
( 6 ) N o;—フルォレニルメトキシカルポ二ルー o— t 一プチルー Lーセリン ( Fm o c -L-S e r ( t B u)-O H) の縮合
Fm o c -L-S e r ( t B u)-O H ( 4 6 0 m g , 1 . 2 0 mm o 1 ) の DM F 溶液 （6 m l ) 、 D I C ( 1 8 8 1 , 1 . 2 0 mm o 1 ) の D M F溶液 （ 2 m 1 ) 、 H O B t ( 1 6 2 m g , 1 . 2 0 mm o 1 ) の D M F溶液 （2 m l ) を加え 室温で 2時間振盪した。 濾渦後、 樹脂を DM F (4. 0 m l ) で 4回洗浄した。 ( 7 ) Fm 0 c基の除去
上記 （4) と同様にして Fm o c基を除去した。
(8 ) Fm 0 c - D- L y s (B o c )- OHの縮合
Fmo c -D-L y s (B o c)-OH ( 5 6 2 m g , 1.2 0 mm o 1 ) の DMF 溶液 （6m l ) 、 D I C ( 1 8 8 l , 1.2 0 mm o 1 ) の D M F溶液 （ 2 m 1 ) 、 H O B t ( 1 6 2 m g , 1. 2 0 mm o 1 ) の DM F溶液 （2m l ) を加え. 室温で 2時間振盪した。 濾渦後、 樹脂を DM F (4.0m l ) で洗浄した。
( 9 ) F m o c基の除去
上記 （4) と同様にして Fmo c基を除去した。 ,
( 1 0) Fm o c - D-L y s (B o c )- OHの縮合
Fmo c -D-L y s (B o c)-OH ( 5 6 2 m g , 1.2 0 mm o 1 ) の DMF 溶液 （6 m l ) 、 D I C ( 1 8 8 l , 1.2 0 mm o 1 ) の DMF溶液 （ 2 m 1 ) 、 HO B t ( 1 6 2 mg、 1.2 0 mm o 1 ) の D M F溶液 （2m l ) を加え 室温で 2時間振盪した。 濾渦後、 樹脂を DMF (4.0 m l ) で洗浄した。
( 1 1 ) Fm 0 c基の除去
上記 （4) と同様にして Fm o c基を除去した。
( 1 2) B o c基と t B u基の除去
上記 （2 ) の B 0 c基の除去操作と同様にして側鎖保護基を除去した。
以上、 （ 1 ) 〜 ( 1 2 ) の操作を順次行うことにより、 分子ピンセッ ト [ (k - s -k-S)4L 3 -Toyopearl] が得られた。
他の分子ピンセット樹脂も上記と同様にして合成した。 実施例 5 分子ピンセッ ト 6 - Ten Gel〜17-TeniaGelと、 P E 5 0 6 , 5 0 6 , P E 40 6 , 40 6 , R e L P S及び大腸菌リポ多糖 （L P S)との結合実験
P E 5 0 6 ( 0.0 6 m g ) を水 （0.8 0m l ) に溶かした。 分子ピンセッ ト 6〜 1 7 TentaGel (約 2 0 m g ) を水 （ 1 0 0 i 1 ) に懸濁し、 P E 5 0 6溶液 ( 2 5 1 ) を加えた。 この懸濁液を室温で終夜ゆっく りと振盪した。 遠心して 樹脂を沈殿させ上清を T L C分析、 リムルス活性測定に用いた。 5 0 6 ( 0. 5 6mg) 、 P E 4 0 6 (0.7mg) 、 4 0 6 ( 0.7 m g ) , R e L P S ( 0.8 5 mg) 、 L P S ( 1 mg) を用い同様に結合実験を行い、 得ら れた上清をリムルス活性測定に用いた （ 5 0 6の場合は、 TL C分析にも使用し た。 ) 。 なお、 TL C分析の結果は表 6に示した通りである。 実施例 6 分子ピンセット 6 - Toyopearl, 1 1 -Toyopear 1, 1 2 -Toyopearl, 1 6 -Toyopearl, 及び 1 7 -Toyopear 1と、 5 0 6， R e L P S及び大腸菌リポ多糖 (L P S) との結合実験
5 0 6 ( 0.5 6 mg) を水 （ 0.8 0m l ) に溶かした溶液をさらに 3倍に希 釈した。 分子ピンセッ トの各 Toyopearl (約 2 0 m g ) を水 （ 1 0 0 ^ 1 ) に懸濁 し、 5 0 6溶液 （ 2 5 1 ) を加えた。 この懸濁液を室温で終夜ゆつく りと振盪 した。 遠心して樹脂を沈殿させ上清をリムルス活性測定に用いた。
R e L P S (0.8 5 m g ) 、 大腸菌リポ多糖 （L P S) ( l mg) も同様に上 記溶液を 3倍に希釈した後に、 同様に結合実験を行い、 得られた上清をリムルス 活性測定に用いた。 実施例 7 リムルス活性の測定
エンドスぺ一シー R (生化学工業 （株） 製） を用いてリムルス活性の測定を行 つ T乙
①各試料 （P E 5 0 6 , 5 0 6 , P E 4 0 6 , 40 6， R e L P S及び大腸菌 リポ多糖 （L P S)) を水に溶かし 1 mg/m 1の溶液を調製した。 ②注射用蒸 留水 （大塚製薬株式会社製） を用いて 9 6穴のマイクロプレート上で試料を適当 な濃度に希釈した。
③試料溶液 2 0 1ずつをマイクロプレートに分注し、 氷水浴中で冷却しなが らエンドスぺ一シ一 R E S— 5 0 Mセット L A L試薬 3 0 1 を加え、 3 7 °Cで 2 0分間加温した。
④下記のジァゾ化試薬 A, B, Cを順次 7 5 m 1づっ加えた後、 波長 54 0 n mの吸光度を測定した。 各試料濃度が 1 0— smg/m 1 のときの吸光度を標準に 用いた。 ；試薬）
A 亜硝酸ナトリウム 4 0 m gを濃塩酸 4 m 1 と水 9 6 m 1 に溶かした溶液 B スルファミン酸アンモニゥム 3 0 O m gを水 1 0 O m l に溶かした溶液 C N—ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩 7 O m gを水 1 0 O m l に溶かし た溶液
結合実験で得られた各試料についても全く同様にして希釈し、 それぞれについ てリムルス活性試験を行い、 吸光度を測定した。 上記の各試料の標準の吸光度と 比較して各樹脂の吸着能を見積もった。 結果は、 第 1図及び第 2図に示すとおり である。 産業上の利用可能性
本発明は、 エンドドキシン （細菌内毒素） 吸着剤のスクリーニング，作製方法 及びその方法により見出された特定構造の吸着剤に関するものであり、 合成が容 易で、 様々な類縁構造も容易に調整でき、 種々の細菌内毒素の吸着に使用し得る. 新しい細菌内毒素吸着剤 （エンドドキシン吸着剤） を提供するものである点に効 果を有する。 また、 本発明の吸着剤は、 既存の吸着剤と比べて、 天然物 （天然ァ ミノ酸） を使用している点に大きな利点を有する。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 生合成前駆体型リ ピド A又は大腸菌型リ ピド Aのホスホノォキシェチル誘 導体に放射性元素を導入したリ ピド A放射性標識体を用いて、 ぺプチドライブラ リ一とのバインディ ングアツセィ （結合実験） を行うことを特徴とする細菌内毒 素吸着剤のスクリーニング方法。
2. ペプチドライブラリーが、 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体に、 該官能基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官能基を 2以上有する化合物を結 合させ、 更にこれにオリゴぺプチドを結合させて作製したぺプチドライブラリー である請求の範囲第 1項に記載のスクリーニング方法。
3. ペプチドライブラリ一が、 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体に、 該官能基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官能基を 2以上有する化合物を結 合させ、 更にこれに、 該他の官能基と結合し得る官能基を有し、 且つこれ以外の 官能基を 2以上有する化合物を結合させ、 然る後、 更にこれにオリゴペプチドを 結合させて作製したぺプチドライブラリーである請求の範囲第 1項に記載のスク リ一二ング方法。
4. 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体がアミノ基を有する固相担体 あるいは可溶性担体である請求の範囲第 2項又は第 3項に記載のスクリーニング 方法。
5. 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体がアミノ基を有する固相担体 あるいは可溶性担体であり、 該ァミ ノ基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官 能基を 2以上有する化合物が、 式 ： HOO C (NH2) CH (CH2) „NH2 (式 中、 nは 1 ~4の整数を表す。 ） で示されるアミノ酸である請求の範囲第 2項に 記載のスクリ一二ング方法。
6. 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体がアミノ基を有する固相担体 あるいは可溶性担体であり、 該ァミノ基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官 能基を 2以上有する化合物が、
式 ： HO〇 C (NH2) CH (CH2) nNH2 (式中、 nは 1〜4の整数を表 す。 ） で示されるアミノ酸であり、 更に、 該他の官能基と結合し得る官能基を有 し、 且つこれ以外の官能基を 2'以上有する化合物が、 式 ： HOOC (NH2) CH (CH2) nNH2 (式中、 ηは 1〜4の整数を表す。 ） で示されるアミノ酸である 請求の範囲第 3項に記載のスクリーニング方法。
7. 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体がアミノ基を有する固相担体 あるいは可溶性担体であり、 該ァミノ基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官 能基を 2以上有する化合物が、
リジン又はオル二チンである請求の範囲第 2項に記載のスクリーニング方法。
8. 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体がアミノ基を有する固相担体 あるいは可溶性担体であり、 該ァミノ基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官 能基を 2以上有する化合物が、
リジン又はオル二チンであり、 更に、 該他の官能基と結合し得る官能基を有し、 且つこれ以外の官能基を 2以上有する化合物が、 リジン又はオル二チンである請 求の範囲第 3項に記載のスクリ一ニング方法。
9. 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体がアミノ基を有する固相担体 あるいは可溶性担体であり、 該ァミノ基と結合し得る官能基を有し、 且つ他の官 能基を 2以上有する化合物がデォキシコール酸又はケノデォキシコール酸である 請求の範囲第 2項に記載のスクリ一ニング方法。
1 0. 下記一般式 [ 1 ]
[ 1 ]
Figure imgf000034_0001
(式中、 球状の部分は固相担体あるいは可溶性担体を表し、 ΑΑ^ AA2、 A A 及び A A4はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。 ) で示される化合物をぺプ チドライブラリーとして用いる請求の範囲第 1項に記載のスクリ一ニング方法。
1 1. 下記一般式 [ 2 ]
[2 ]
Figure imgf000034_0002
(一式中、 球状の部分は固相担体あるいは可溶性担体を表し、 AAi、 AA2、 A A 及び A'A4はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。 ) で示される化合物を プ チドライブラリーとして用いる請求の範囲第 1項に記載のスクリ一二ング方法。 1 2 下記一般式 [ 3]
[ 3]
Figure imgf000035_0001
(式中、 球状の部分は固相担体あるいは可溶性担体を表し、 AA 、 AA2、 A A 3及び AA4はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。 ） で示される化合物をぺプ チドライブラリーとして用いる請求の範囲第 1項に記載のスクリーニング方法。
1 3. 固相担体がピーズ状樹脂である請求の範囲第 2項〜第 1 2項の何れかに 記載のスクリーニング方法。
1 4. 放射性元素が、 トリチウム （3H) である請求の範囲第 1項〜第 1 3項の 何れかに記載のスクリーニング方法。
1 5 · 請求の範囲第 1項〜第 1 4項の何れかに記載のスクリ一二ング方法によ り見出された細菌内毒素吸着剤。 .
1 6. 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体に、 該官能基と結合し得る 官能基を有し、 且つ他の官能基を 2以上有する化合物を結合させ、 更にこれにォ リゴぺプチドを結合させてなるぺプチドライブラリー。
7. 下記一般式 [ 1 ]
Figure imgf000036_0001
(式中、 球状の部分は固相担体あるいは可溶性担体を表し、 AAi、 AA2、 A A 及び A A4はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。 ） で示される請求の範囲第 1 6項に記載のペプチドライブラリー。
1 8. —般式 [ 1 ] において、 球状の部分が固相担体である請求の範囲第 1 7 項に記載のぺプチドライブラリー。
1 9. 一般式 [ 1 ] において、 AA AA2、 A A3及び A A4が下記に記載の 何れかの組み合わせからなるものである請求の範囲第 1 8項に記載のぺプチドラ イブラリー。
A A 1 A A 2 A A 3 A A 4
D一 P h e D - V a 1 L一 G 1 n D - P e
L - L y s D一 S e r D - V a 1 D -G i n
D - P r o D - P h e L - P h e L - V a 1
D一 G 1 n D一 G 1 n L - P h e D - L y s
D - V a 1 L - P r o D一 S e r D - S e r
2 0. 下記一般式 [ 2 ]
Figure imgf000037_0001
(式中、 球状の部分は固相担体あるいは可溶性担体を表し、 ΑΑ ΑΑ2 Α.Α 3及び A Α4はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。 ) で示される請求の範囲第 1 6項に記載のペプチドライブラリー。
2 1. —般式 [2 ] において、'球状の部分が固相担体である請求の範囲第 2 0 項に記載のペプチドライブラリー。 .
2 2. 一般式 [ 2 ] において、 AA AA2 A A 3及び A A 4が下記に記載の 何れかの組み合わせからなるものである請求の範囲第 2 1項に記載のペプチドラ イブラリー。
A A 1 A A 2 A A 3 A A 4
D - P r o し一 G 1 D一 G 1 u L - V a 1
D一 V a 1 D - P r o D -L y s L - G 1 n
D一 V a 1 L一 G 1 u L - V a 1 D - G 1 u
L - V a 1 D一 P r o D - V a 1 D - S e r
L - V a 1 D - P r o L - P h e G 1 y
D -L y s L一 G 1 u D一 G 1 u L - G 1 n
L -L y s D -L y s D -L y s D— S e r
L - P h e L -L y s G l y L - S e r
D一 G 1 n D一 G 1 u D一 S e r L - G 1 u
2 3. 官能基を有する固相担体あるいは可溶性担体に、 該官能基と結合し得る 官能基を有し、 且つ他の官能基を 2以上有する化合物を結合させ、 更にこれに、 該他の官能基と結合し得る官能基を有し、 且つこれ以外の官能基を 2以上有する 化合物を結合させ、 然る後、 更にこれにオリゴペプチド'を結合させてなるぺプチ ドライブラリー。
24 下記一般式 [ 3
Figure imgf000038_0001
(式中、 球状の部分は固相担体あるいは可溶性担体を表し、 AA^ AA2、 A A 3及び A A4はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。 ） で示される請求の範囲第 2 3項に記載のペプチドライブラリ一。
2 5. —般式 [ 3] において、 球状の部分が固相担体である請求の範囲第 2 4 項に記載のペプチドライブラリー。
2 6. —般式 [ 3 ] において、 AAい AA2、 A A 3及び A A 4が下記に記載の 何れかの組み合わせからなるものである請求の範囲第 2 5項に記載のペプチドラ イブラリー。 AA1 AA2 AA3 AA4 AA1 AA2 AA3 AA4 D-Lys D-Ser D-Lys L-Ser D-Val L-Glu L-Val L-Lys L-Gln D-Lys L-Glu L-Gln D - Pro L-Ser D-Glu L-Lys D-Ser L-Phe D-Gln L-Lys D-Ser L-Ser L-Lys D-Lys L-P e D-Lys L-Gln L-Lys L-Lys L-Lys D-Lys D-Lys L-Lys L-Lys L-Gln L-Lys い Gin L-Glu L-Lys D-Lys L-Val L-Val L-Lys L-Lys L-Lys L-Gln L-Gln D-Glu L-Gln D-Lys Gly L-Lys L-Lys L-Ser L-Lys L-Glu L-Glu D-Gln D-Phe L-Lys D-Gln D-Val D-Lys L-Glu D - Gin D-Glu L-Phe L-Lys D-Lys L-Lys D-Glu L-Glu L-Ser D-Ser L-Phe D-Val L-Lys D-Val L-Glu D-Glu D - Pro L-Ser L-Pro L-Val L-Lys L-Ser L-Val Gly D - Pro L-Pro D-Ser L-Phe L-Lys D-Gln L-Gln L-Lys L-Pro L-Pro L-Ser L-Val D-Val L-Pro L-Phe L-Lys L-Pro L-Val L-Gln D-Gln L-Pro D-Pro D-Phe L-Lys Gly D-Val L-Lys Gly L-Pro L-Glu L-Ser L-Lys L-Phe L-Val L-Glu D-Ser L-Phe D-Val D-Glu L-Lys L-Phe L-Gln L-Lys L-ser L-Gln D-Gln L-Gln D-Lys D-Lys L-Gln L-Pro D-Phe L-Pro L-Pro L-Ser D-Lys D-Lys D-Lys D-Val D-Gln
2 7. A A4がリジン残基である請求の範囲第 1 7項、 第 1 9項又は第 2 2項の 何れかに記載のぺプチドライブラリ一。
2 8. 請求の範囲第 1 8項に記載のペプチドライブラリーを含んでなる細菌内 毒素吸着剤。
2 9. 請求の範囲第 2 0項に記載のぺプチドライブラリーを含んでなる細菌内 毒素吸着剤。
3 0 . 請求の範囲第 2 3項に記載のぺプチ ドライブラリ一を含んでなる細菌内 毒素吸着剤。
3 1 . 生合成前駆体型リ ピ ド A又は大腸菌型リ ピ ド Aのホスホノォキシェチル 誘導体に放射性元素を導入し リ ピド A放射性標識体。
3 2 生合成前駆体型リ ピド Aのホスホノォキシェチル誘導体に放射性元素を ピド A放射性檩識体が下記構造式 [ 4 ]
Figure imgf000040_0001
で示されるものである請求の範囲第 3 1項に記載のリ ピド A放射性標識体,
3 3 . 大腸菌型リ ピ ド Aのホスホノォキシェチル誘導体に放射性元素を導入し たリピド A放射性標識体が下記構造式 [ 5 ]
Figure imgf000040_0002
で示されるものである請求の範囲第 3 1項に記載のリ ピド A放射性標識体,
- 39 - 訂正された用鉞 (規則 91)
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