WO2002080966A2 - Verfahren zur herstellung eines autologen antikörpers enthaltenden impfstoffes - Google Patents

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WO2002080966A2
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Hans Loibner
Helmut Eckert
Otto Doblhoff-Dier
Ralf Kircheis
Manfred Schuster
Erich Wasserbauer
Günter Waxenecker
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Definitions

  • non-immunogenic antigens are so-called "self-antigens", ie structures that the immune system recognizes as the body's own substances. Immunization with such antigens usually does not result in a specific immune response. In the case of tumor-associated antigens, the fact that these antigens are actually "self-antigens" is one of the greatest difficulties in developing a potent vaccine.
  • Active immunization is also used to protect against toxic substances (e.g. bacterial toxins). If the toxins are to be used as a vaccine, they must first be weakened or inactivated. Such inactivation can affect the effectiveness of the immune response. Anti-idiotypic antibodies as vaccines that mimic toxins have been proposed (Int J Clin Lab Res (1992) 22:28; Clin Exp Immunol. (1992) 89: 378; Immunopharmacology (1993) 26: 225).
  • Active immunization for modulation can currently be performed with certain antigens, which may either be too toxic or potentially infectious, or may be non-immunogenic.
  • a partial solution to this problem is the use of anti-idiotypic antibodies for immunization.
  • efficient treatment strategies for autoimmune diseases, allergies and similar complaints are to be created.
  • B evorzugt the antibody-containing body fluids, of course, blood, serum, lymphatic fluid, Cere- are brospinalfactkeit, colostrum, mucosal body fluids such as vaginal or nasal discharge, malignant effusions, feces or urine, but it can just as well autologous cells or tissue preparations obtained by biopsy can be processed with a variety of methods known per se for liquids containing antibodies to be used according to the invention. Above all those body fluids with a particularly high antibody content are used according to the invention as starting materials, with human serum or plasma being of course particularly preferred.
  • ligands can be selected which recognize a certain group of antibody fragments or chains, for example at least parts of the lambda or kappa chains, Fc or Fab fragments. Likewise suitable ligands selectively bind not only antibodies but also corresponding isotypes or paraglobulins.
  • Autologous vaccines produced according to the invention which contain antibodies which occur in connection with B-cell lymphoma contain in particular only certain subclasses or fractions of the serum fraction containing IgG in order to ensure the targeted immune response.
  • antibodies or antibody fragments such as e.g. Fc or Fab fragments can be used.
  • ligands can also be other substances to which immunoglobulins can bind, for example ligands for the chromatographic purification of immunoglobulins, affinity peptides, affinity polypeptides, proteins such as protein A or protein G, or ionic structures which are also used, for example, for ion exchange chromatography.
  • the suitable immobilized ligands care is usually taken to ensure that undesired bleeding of the ligands or of ligand-antibody complexes into the isolated antibody fraction obtained is avoided.
  • serial cleaning of the antibodies may also be appropriate in order to separate any contaminants from the immobilized ligands. Bleeding out of the material can also be advantageous if certain ligand-antibody complexes are desired in the preparation.
  • a storage-stable embodiment of the autologous vaccine produced according to the invention is particularly desirable if the patient is to be immunized several times with the same preparation at intervals.
  • the administration of freshly produced vaccines can have the advantage that changes in the immune system are taken into account and the occurrence of escape mutants, for example of antibody-producing cells or infectious agents, can be largely prevented.
  • the simple processing of the antibodies obtained into a vaccine is suitable for this, which in the best case can be done on site.
  • the vaccine produced according to the invention can be used immediately after taking blood within one working day, or even during patient treatment.
  • Another embodiment of the method according to the invention relates to the depletion of components of the body fluid that are undesirable in the vaccine.
  • ligands can be chosen which do not selectively bind certain antibodies, but which do, however, have accompanying substances in order to then obtain the specific antibodies from the unbound fraction.
  • individuals are understood to mean individual human or animal organisms which have body fluids or tissues which contain antibodies.
  • the production according to the invention is of course preferably used in vertebrates, particularly preferably mammals, in particular humans.
  • the agent b) comprises substances or solutions of substances for washing or cleaning or desorbing the antibodies. These include wash buffers and / or elution buffers.
  • a formulation agent including a possible adjuvant is also provided in the set according to the invention, provided that this is not already included as b) in the agent for obtaining the antibodies.
  • antibodies can be adsorbed on a sparingly soluble aluminum compound, whereupon they can be washed in a simple manner and in a single device, re-buffered and packaged into a finished vaccine which already contains the aluminum compound as an adjuvant. Then namely only a single means for obtaining the antibodies and processing the vaccine instead of separate components b) and c) in the set according to the invention needed. Otherwise, additional aids, such as washing and buffering substances, can be provided in the set.
  • Suitable ligands can also be attached to magnetic beads, which can be easily located or oriented or positioned using a magnet.
  • a specific ligand is bound to ferromagnetic particles, for example, and placed in a sterile container to hold the body fluid. If a magnetic transport part or rod is also stored in the container, the particles on which the antibodies are bound from the body fluid can be collected on the transport part by switching the magnet on and off, for example by means of electrical pulses for actuating an electromagnet. The particles can then be separated, preferably while maintaining the magnetic field. The magnetic field can be removed again during a washing process or antibody desorption. Afterwards, immobilization of the particles on the magnets is again expedient in order to separate or obtain the washing solution or the desorbed antibodies.
  • the first container comprises the ligands required for the adsorption of the antibodies, bound to ferromagnetic particles (“beads”).
  • Beads include activated porous glass beads such as Prosep (Millipore, Durham, UK), Dynabeads (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg, Germany) and the same material from Miltenyi (Bergisch Gladbach, Germany).
  • An adsorption buffer is also placed in this container or separately. Human serum is introduced via a septum.
  • the antibodies can be eluted in a separate elution vessel with elution buffer, into which the loaded beads are placed. After elution of the antibodies, the "beads" are separated by immobilization on the transport part and removal of the same from the solution. Then a formulation agent is added through a septum. The formulated solution is introduced into a syringe and is ready for use on the patient.
  • the individual containers are each equipped with one or more septa for the transfer of solutions or suspensions, as well as frits for phase separation.
  • the set is made available as a container which contains the ligands and the agents b) and c).
  • this agent may be advantageous to use this agent together with the ligands in a formulation.
  • a carrier of ligands can be selected that is also used for the production of antibodies and has an adjuvant effect.
  • a carrier is a poorly soluble aluminum compound such as AluGel or aluminum hydroxide.
  • Antibodies from the liquids of individuals to the ligands can be bound in a mixed bed ("batchwise") or in a flow-through method. Immunoaffinity cleaning can be carried out automatically on a chromatography apparatus or by means of a manual process; however, it is also conceivable that the method is carried out manually, automatically or semi-automatically using a simple device which contains the immobilized ligands.
  • the desired antibodies can essentially be separated from the body from undesired other substances. It is conceivable that this task can be accomplished by separation processes other than immunoaffinity purification, such as described above, can be solved, such as by reacting ligands with the antibodies and then separating the specific immune complexes from the substances not complexed with the ligands.
  • the antibodies can also be bound to or obtained from the ligands in the liquid phase, colloidal solution, emulsion or by so-called "immune affinity partitioning".
  • the present invention also relates to a method for producing an autologous antibody-containing vaccine, characterized by the following steps:
  • the preparation of xenografting is another area of application to prevent possible intolerance reactions due to the graft.
  • High titers of natural antibodies against the well-known ⁇ -gal epitope / as found in serum in humans are partly responsible for acute A bommeungsre force against xenografts or allografts.
  • These natural anti- ⁇ -Gal antibodies are formulated with the aid of the method according to the invention into a vaccine and administered to the patient who is being prepared for the transplantation of tissue, bone marrow or stem cells.
  • the downregulation of the anti-Gal activity should help to avoid rejection reactions.
  • Lowering the titer of the circulating anti- ⁇ -Gal antibodies by immunization with autologous anti- ⁇ -Gal antibodies should allow a significant increase in the survival time of xenografts.
  • toxin-specific antibodies can be used as ligands.
  • such antibodies are available as monoclonal.
  • two or more ligands with different specificity can of course also be immobilized on the solid support with the present method and in this way antibodies can be obtained in preparations with specificities which are enriched or depleted in terms of several binding properties (antibodies with different specificity).
  • the serial connection of several immunoadsorption steps with different specificities is preferred in the production of multi-specific vaccines according to the present invention.
  • Particularly preferred ligands according to the present invention are autoantigens such as e.g. double-stranded DNA to treat patient-specific antibodies against ds-DNA from patients with systemic lupus erythematosus (SLE).
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • Factor VIII or parts thereof can be used as a ligand to isolate strongly factor VIII-binding antibodies from an individual and to down-regulate the pathogenic anti-factor VIII reactivity of a patient with the vaccine formulated therefrom (Semin. Thromb. Hemost. (2000) 26: 151)
  • Individual antibodies can be purified from patients with myasthenia gravis by immunoaffinity purification with acetylcholine receptor or parts thereof (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 8747), which according to the invention can be vaccinated back to the same patient as an autologous vaccine.
  • Insulin as a ligand can be used in the production of an autologous vaccine against autoimmune diabetes (type insulin-dependent diabetes mellitus) (Diabetes Metab. Res. Rev. (2000): 16: 338).
  • Myelin basic protein (MBP) or parts thereof can be used as a ligand in the production of an autologous vaccine for multiple sclerosis patients or patients with other immunologically related neurological disorders (J. Neuroimmunol. (2001) 113: 163).
  • gangliosides can be used as a ligand (in patients with Guillain-Barre syndrome (Intern. Med. (1997) 36: 599) and other neuropathies.
  • Another preferred ligand according to the present invention is an anti-human IgE antibody with which very specific IgE fractions can be purified and which in turn can be administered to the patient in a suitable, immunogenic form in order to inhibit specific gE-producing cells in the patient , Nature- parts of specific anti-IgE antibodies, provided that they still have the desired specificity, can also be used as a ligand.
  • Antibody derivatives that can be produced according to known chemical or biochemical methods, e.g. Antibodies amidated with fatty acids on free amino functions in order to increase the lipophiles for incorporation into liposomes.
  • the term also includes products that can be produced by chemically coupling antibodies or antibody fragments with molecules that can enhance the immune response, such as e.g. Tetanus toxoid, Pseudomonas exotoxin, derivatives of Lipid A, GM-CSF, IL-2, IL-12, C3d.
  • working up the antibody eluates accordingly includes adding a substance selected from the group of adjuvants, in particular aluminum-containing adjuvants, lipopolysaccharide derivatives, Bacillus Calmette Guerin, liposomes or QS-21 ( further preferred adjuvants are described, inter alia, in Singh et al., Nat. Biotechnol. 17 (1999), pages 1075-1081), immunostimulating cells, in particular dendritic cells or other antigen-presenting cells, active agents, preferably cytokines, in particular granulocyte-macrophage-stimulating factor, formulation auxiliaries, in particular buffer substances, stabilizers or solubilizers, or mixtures of these substances.
  • adjuvants in particular aluminum-containing adjuvants, lipopolysaccharide derivatives, Bacillus Calmette Guerin, liposomes or QS-21 ( further preferred adjuvants are described, inter alia, in Singh et al., Nat. Biotechnol. 17 (19
  • physico-chemical parameters such as ionic strength, ion composition, pH, type and amount of the active surface in the mixture are responsible for the denaturation of a protein.
  • Conditions are known and can easily be optimized by the person skilled in the art for any eluate in which the antibodies are not or not completely denatured and / or other effects, such as weaker desorption from the surface of the adjuvant, can be used.
  • Another advantage of such a formulation is the possible increased immunogenicity of the antibodies, since the heating can cause the antibodies to be at least partially denatured.
  • This increased antigenicity can increase the immunogenicity in particular in the case of proteins which the immune system would recognize as their own proteins.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing antibodies obtained from animal body fluids containing antibodies by immunoaffinity purification for use as autologous vaccines.
  • This example is intended to illustrate that it is possible to boost the immune system against any protein (in this case Bovines Serum albumin, BSA) to be specifically modulated.
  • BSA Bovines Serum albumin
  • the autologous vaccine for the first group was prepared by purifying rabbit serum immunoglobulin on an affinity chromatography column (rabbit anti-BSA immobilized on Sepharose).
  • the autologous vaccine for the second group was prepared by purifying rabbit serum immunoglobulin over another affinity chromatography column (Sepharose without specific ligands).
  • Serum samples were serially diluted (in 2% dry milk / PBS). The sample dilutions (100 ⁇ l / well) were incubated for 1 hour at 37 ° C. cubed. A dilution series of the polyclonal rabbit anti-BSA serum, which had been used for affinity purification, served as positive control and as standard for a quantitative evaluation of the ELISA. After washing, the enzyme conjugate (Anti rabbit Ig HRP (Nordic Immunology, # 4694)) was applied in an appropriate dilution (1: 1000 dilution buffer) (100 ⁇ l / well). After an incubation of 30 min.
  • Blocking buffer A 5% fetal calf serum (heat inactivated) in PBS
  • the antibody fraction thus obtained was tested in an ELISA for binding to antibody HE2 (which was used as a ligand for affinity purification): 100 ⁇ l aliquots of the mouse IgG2a antibody used for affinity purification (antibody HE2; solution with 10 ⁇ g / l in binding buffer) incubated in the wells of a micro titer plate for 1 hour at 37 ° C. After washing the plate six times with washing buffer A, 200 ⁇ l of blocking buffer A were added in each case and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines autologen Antikörper enthaltenden Impfstoffes, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: -Bereitstellen einer Antikörper enthaltenden Flüssigkeit aus ener autologen Antikörper enthaltenden Körperflüssigkeit oder aus autologen Zell-oder Gewebepräparaten, -Behandeln der antikörper enthaltenden Flüssigkeit mit einem festen Träger, auf dem Liganden immobilisiert sind, die Bindungen zu einer bestimmten Gruppe der Antikörper eingehen, mit der Massgabe, dass als Liganden keine Antikörper oder deren Fragmente mit gleichem Idiotpy verwendet werden, die gegen Tumor-assoziierte Antigene gerichtet sind, -Gewinnen der Antikörper, die eine Bindung zu den Liganden eingehen, und -Aufarbeiten der gewonnenen Antikörper zu einem autologen Impfstoff, der eine effiziente Menge von einigen Mikrogramm bis ein Gramm Antikörper enthält.

Description

Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes.
Höhere Organismen sind durch ein Immunsystem ausgezeichnet, das es vor potentiell gefährlichen Substanzen oder Mikroorganismen schützt. Wenn eine Substanz ( ntigen) in den Körper eindringt, wird es als "fremd" erkannt und mit Hilfe des Immunsystems eliminiert. Auch "entartete" körpereigene Zellen werden vom Immunsystem üblicherweise erkannt und aus dem Verkehr gezogen.
Das "adaptive Immunsystem des Menschen besteht aus zwei wesentlichen Komponenten, der humoralen und der zellulären Immunität. Die adaptive Immunantwort beruht aμf der klonalen Selektion von B- und T- ymphozyten und erlaubt im Prinzip die Erkennung jedes beliebigen Antigens sowie den Aufbau eines immunologischen Gedächtnisses. Diese Merkmale des adaptiven Immunsystems werden generell bei Impfungen nutzbringend angesprochen.
Jede B-Zelle produziert einen Antikörper mit bestimmter Bindungs- spezifität. Dieser. Antikörper befindet sich als spezifischer Rezeptor auch in der Membran der ihn produzierenden B-Zelle. Die humorale Immunantwort gegen als fremd erkannte Antigene beruht auf der selektiven Aktivierung derjenigen B-Zellen, die solche Antikörper produzieren, die an Epitope des jeweiligen Antigens binden können. Für die Antikörpervielfalt spielen DNA-Rearrange- ments im Verlauf der B-Zelldifferenzierung eine entscheidende Rolle.
Im menschlichen Serum befinden sich in großer Menge Antikörper verschiedenster Spezifitäten, Isotypen und Subklassen. Die Gesamtkonzentration aller Immunglobuline im Serum beträgt 15 - 20 mg/ml;' d.h., dass ca. 100 g Immunglobuline verschiedenster Spezi- fitäten dauernd im Blut zirkulieren. Es ist nicht möglich, die genaue Anzahl aller Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität anzugeben, das Repertoir von unterschiedlichen B-Zell-Klonen in einem Menschen liegt bei etwa 109. Ein bestimmter Antikörper kann im Allgemeinen verschiedene, einander ähnliche Antigene binden, wenn auch mit unterschiedlicher Affinität und Avidität. Das Immunsystem muss mit Hilfe endogener Regulationsmechanismen eine Homöostase bezüglich der Verteilung und Gewichtung dieser verschiedenen Spezifitäten aufrecht erhalten. Ein wesentlicher Mechanismus dafür ist das "idiotypische Netzwerk" (Ann. Immuno1. 125C: 373-89 (1974)). Gegen jeden Idiotyp eines Antikörpers, welcher seine Bindungsspezifität bestimmt, gibt es anti-idiotypische Antikörper, die also an den Idiotyp des ersten Antikörpers im Sinne einer Antigenerkennung binden. Nach diesem Erklärungsmodell sind die Wechselwirkungen zwischen den Idiotyp-spezifischen Rezeptoren auf Lymphozyten für die Regulation des Immunsystems verantwortlich. Diese Wechselwirkungen finden offensichtlich tatsächlich statt, da gezeigt worden ist, dass im Zuge einer Immunantwort auch anti-idiotypische Antikörper gegen die durch die Immunantwort primär induzierten Antikörper entstehen. Da es gegen jeden Antikörper anti-idiotypische Antikörper gibt, sind Lymphozyten gegenüber Idiotypen von Antikörpern grundsätzlich nicht tolerant.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, in das Immunsystem einzugreifen.
1. Passive Antikörpertherapie :
Für therapeutische Zwecke ist es möglich, Antikörper, die notwendig sind, um eine bestimmte Funktion innerhalb eines Organismus zu erfüllen, diesem Organismus zuzuführen. Diese Art der Anwendung wird passive Immuntherapie genannt und kann bei verschiedenen medizinischen Indikationen eingesetzt werden, z.B. bei Krebs- Immuntherapie (Immunol. Today (2000), 21:403), Vergiftungen (To- xicon (1998), 36:823; Therapie (1994), 49:41), Infektionen (Clin. Infect. Dis. (1995), 21:150). In diesen Fällen können Antikörper eingesetzt werden, die entweder aus entsprechend immunisierten Tieren stammen oder über Immortalisierung von Immunglobulin-Genen durch verschiedene biologische oder molekularbiologische Techniken aus Zellen gewonnen werden können (z.B. Hybridoma-Technik, Phage-Display-Technik, etc.).
Die passive Antikörpergabe hat den Nachteil, dass sie nicht langanhaltend wirkt, da die Wirkung mit dem natürlichen Abbau der verabreichten Antikörper im EmpfängerOrganismus abnimmt. 2. Aktive Immunisierung:
Zur Modulation des Immunsystems kann man mit Antigenen immunisieren. Antigene sind Moleküle, Molekül-Komplexe oder ganze Organismen, an welche Antikörper binden können.
Nicht alle Antigene rufen eine Immunantwort hervor, d.h. nicht alle Antigene sind immunogen. Bestimmte kleine Moleküle werden vom Immunsystem nicht registriert (Haptene) , solche kleinere Moleküle kann man dem Immunsystem in geeigneter Form präsentieren und sie dadurch immunogen machen. Eine derartige Methode ist die Kopplung des Haptens an ein immunogenes Molekül, ein sogenanntes "Trägermolekül" .
Andere nicht-immunogene Antigene sind sogenannte, "Selbst-Antige- ne", also Strukturen, die vom Immunsystem als körpereigene Substanzen erkannt werden. Immunisierung mit derartigen Antigenen führt üblicherweise zu keiner spezifischen Immunreaktion. Im Fall von Tumor-assoziierten Antigenen ist die Tatsache, dass diese Antigene eigentlich "Selbst-Antigene" sind, eine der größten Schwierigkeiten bei der Entwicklung eines potenten Impfstoffes .
Eine aktive Immunisierung gegen Krankheitserreger wie Viren oder Bakterien mittels kompletter Antigene ist nur möglich, wenn die Krankheitserreger abgeschwächt oder abgetötet werden. Bei abgeschwächten Krankheitserregern besteht die Gefahr, dass es zur Reversion kommt, d.h., dass die abgeschwächten Krankheitserreger wieder zu virulenten Formen werden können. Eine Lösung eines derartigen Problems könnte die Verwendung von anti-idiotypischen Antikörpern als Surrogat-Antigen zur Immunisierung sein (Int. Arch. Allergy Immuno1. (1994), 105:211).
Aktive Immunisierung mit anti-idiotypischen Antikörpern wurde auch zur Behandlung von Allergien vorgeschlagen (Int. Arch. Allergy I unol. (1999), 118:119).
Antikörper gegen körpereigene Antigene sind allerdings im Serum eines jeden Menschen vorhanden und werden als "natürliche Autoantikörper" bezeichnet. Anti-idiotypische Antikörper von solchen' natürlichen Autoantikörpern sind an der Regulation dieser Autoantikörper beteiligt (Immunol. Reviews (1989), 110:135; Eur. J. Immuno1. (1993), 23:783) .
Eine unzureichende idiotypische Regulation scheint bei einer Reihe von Autoimmunerkrankungen eine Rolle zu spielen:
- Systemischer Lupus erythematosus (Autoimmunity (1994), 17:149);
- Autoimmun Thyroiditis (Eur. J. Immunol. (1993), 23:2945);
- Systemische Vaskulitis (J. Autoimmunity (1993), 6:221);
- Guillain-Barre-Syndrom (Clin. Immunol. Immunopathol . (1993), 67:192) ;
- anti-Faktor VII :C-Autoimmunerkrankung (Proc. Natl . Acad. Sei., USA (1987) , 84:828) .
Immunisierung mit idiotypischen Antikörpern, die Autoantigene nachahmen, wurde bei Autoimmunerkrankungen schon durchgeführt (J. Rheumatol . (1999), 26:2602). Auch Peptide zur Induktion von anti- idiotypischen Antikörpern (Proc. Natl. Acad. Sei., USA (1993), 90:8747; Immunology (1999), 96:333) wurden schon beschrieben.
Immunisierung bei Autoimmunerkrankungen, beruhend auf T-Zell-Re- zeptoren (J. Immunol. (1990), 144:2167; US-PS 6,090,387; US-PS 6,007,815) wurde ebenfalls schon vorgeschlagen.
Aktive Immunisierung wird auch zum Schutz vor giftigen Substanzen (z.B. bakteriellen Toxinen) verwendet. Wenn dabei die Toxine als Impfstoff verwendet werden sollen, müssen Sie vorher abgeschwächt, bzw. inaktiviert werden. Eine derartige Inaktivierung kann aber die Wirksamkeit der Immunantwort beeinflussen. Anti- idiotypische Antikörper als Impfstoffe, die Toxine nachahmen, wurden vorgeschlagen (Int J Clin Lab Res (1992)22:28; Clin Exp Immunol. (1992)89:378; Immunopharmacology (1993)26:225).
Es wurde auch vorgeschlagen, anti-idiotypische Antikörper zum erstmaligen Immunisieren zu verwenden, um dann mit einem Impfstoff, der allein zu schwach wäre, einen höheren spezifischen Immunisierungseffekt zu erzielen (Virology (1984)136:247). 3. Entzug von Antikörpern und Immunkomplexen aus dem Blut:
Eine Möglichkeit, Antikörper aus dem Blut zu entfernen, ist die Verwendung von Perfusionssystemen (US-PS 5,122,112), die vor allem bei Autoimmunerkrankungen angewendet wurde (The Lancet (20.10.1979), 824). Derartige extrakorporale Immunadsorptionen stellen jedoch eine große Belastung und ein hohes Behandlungsrisiko für Patienten dar, so dass sich diese Methode nicht zur breiten klinischen Therapie eignet.
Aktive Immunisierung zur Modulation kann derzeit mit bestimmten Antigenen durchgeführt werden, die entweder zu toxisch oder potentiell infektiös sein können oder aber nicht-immunogen sind. Eine teilweise Lösung dieses Problems ist die Verwendung von anti-idiotypischen Antikörpern zur Immunisierung. Allerdings ist es notwendig, derartige Antikörper entweder in Zellkultur bzw. in vitro herzustellen oder aber in bestimmten Organismen zu induzieren und dann einem anderen Organismus zu verabreichen.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und Behandlungsmaterialien und Verfahren für eine Vielzahl von Erkrankungen unter Ausnutzung des Immunsystems eines Patienten zur Verfügung zu stellen. Insbesondere sollen dabei effiziente BehandlungsStrategien für Autoimmunerkrankungen, Allergien und ähnliche Beschwerden geschaffen werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines autologen, Antikörper enthaltenden Impfstoffes, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:
Bereitstellen einer Antikörper enthaltenden Flüssigkeit aus einer autologen Antikörper enthaltenden Körperflüssigkeit oder aus autologen Zeil- oder Gewebepräparaten,
Behandeln der Antikörper enthaltenden Flüssigkeit mit einem festen Träger, auf dem Liganden immobilisiert sind, die Bindungen zu einer bestimmten Gruppe der Antikörper eingehen, mit der Maßgabe, dass als Liganden keine Antikörper oder deren Fragmente mit gleichem Idiotyp verwendet werden, die gegen Tumor-assoziierte Antigene gerichtet sind,
Gewinnen der Antikörper, die eine Bindung zu den Liganden eingehen, und
Aufarbeiten der gewonnenen Antikörper zu einem autologen Impfstoff, der eine immunogene Menge von mehr als einem Mikrogramm Antikörper enthält.
Der so erhaltene Impfstoff kann nun dem Patienten in geeigneter Weise verabreicht werden. Das erfindungsgemäß hergestellte Verfahren löst die eingangs geschilderten Probleme dadurch, dass zur Induktion von Antikörpern gegen einen "target" Antikörper in einem Organismus eben diese "target" Antikörper aus demselben Organismus verwendet werden. Daher ist weder eine in vitro- Kultivierung von Zellen zur Herstellung der Antikörper notwendig, noch eine Herstellung in einem fremden SpenderOrganismus . Die "target" Antikörper sind etwa abl-Antikörper mit einer Spezifität für ein Antigen gegebenenfalls zur Induktion von antiidiotypi- schen Antikörpern, oder ab2-Antikörper, also antiidiotypische Antikörper, zur Erzeugung einer Immunantwort gegebenenfalls gerichtet gegen den Antiidiotypen, also gleichermaßen gegen das Antigen.
Gleichwohl ist es auch nicht mehr erforderlich, die erfindungs- gemäß erhaltenen Antikörper aus einem Pool oder Plasmapool zu erhalten (vgl. Zouali et al . , J. Immunol. 135 (2) (1985), Seiten 1091-1096) . Im Gegensatz zu derartigen Antikörperpräparationen aus Pools, bei welchen Antikörper aus verschiedenen Individuen gesammelt werden, können mit den Antikörperpräparationen gemäß der vorliegenden Erfindung 100%ig autologe Antikörper enthaltende Impfstoffe hergestellt werden, deren Wirkung im idiotypischen Netzwerk des zu. behandelnden Individuums völlig spezifisch ist und dadurch effektiver sein kann.
Damit wird eine individuell spezifische Modulation des Immunsystems zielgerichtet auf den jeweils gewünschten Zweck ermöglicht. Durch die Verschiebung des immunologischen Gleichgewichts durch Verabreichung einer autologen Impfung mit einem erfindungsgemäß hergestellten Impfstoff wird eine selektive Stimulierung derjenigen B-Zellen gewährleistet, die Antikörper mit einer bestimmten Spezifität produzieren. Die Spezifität kann durch die Art der Isolierung der Antikörper (durch die Wahl der Liganden) aus einem Individuum festgelegt werden. Bevorzugterweise sind die Antikörper enthaltenden Körperflüssigkeiten selbstverständlich Blut, Serum, Lymph-Flüssigkeit, Cere- brospinalflüssigkeit, Colostrum, mucosale Körperflüssigkeiten, wie Vaginalsekret oder Nasalsekret, maligne Ergüsse, Faeces oder Urin, es können aber genauso gut autologe Zellen oder Gewebepräparate, welche durch Biopsie gewonnen werden können, mit einer Vielzahl von an s.ich bekannten Methoden zu erfindungsgemäß zu verwendenden Antikörper enthaltenden Flüssigkeiten aufgearbeitet werden. Es werden vor allem diejenigen Körperflüssigkeiten mit besonders hohem Antikörpergehalt erfindungsgemäß als Ausgangsmaterialien verwendet, wobei natürlich menschliches Serum oder Plasma besonders bevorzugt sind.
Entscheidend für die Spezifität der erfindungsgemäß erhaltenen Impfstoffe bei der Beeinflussung des idiotypischen Netzwerkes ist selbstverständlich jeweils die Wahl des Liganden bei der vorliegenden Immunaffinitätsreinigung. Zur Gewinnung von spezifischen « Antikörperfraktionen können spezifische monoklonale oder polyklo- nale Antikörper oder Antigene verwendet werden. Monoklonale Antikörper oder Derivate davon können nach an sich bekannten Methoden, wie z.B. Hybridomtechnologie, Phagendisplay-Technologie oder Rekombination hergestellt werden. (Immunology Today, 2000, 21: gesamtes Heft 8) . Es können aber auch Idiotyp-unabhängige Liganden, die bestimmte spezifische Subklassen oder Subtypen von Immunglobulin binden können, wie z.B. eine oder mehrere von IgGl, IgG2, IgG3 oder IgG4 bzw. IgA, IgG, IgM, IgE oder IgD. Weiter können Liganden ausgewählt werden, die eine bestimmte Gruppe von Antikörper-Fragmenten oder -Ketten, etwa zumindest Teile der lambda- oder kappa-Ketten, Fc- oder Fab-Frag ente erkennen. Ebenso geeignete Liganden binden etwa selektiv nicht nur Antikörper sondern auch entsprechende Isotypen oder Paraglobuline.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter noch mit einem gleichen Verfahren zur Herstellung eines autologen Impfstoffes kombiniert werden, wobei als Liganden auch Antikörper oder deren Fragmente mit dem gleichen Idiotyp verwendet werden, die gegen Tumorassoziierte Antigene und/oder Antikörper gerichtet sind. Dabei ist für ein einfaches Verfahren bevorzugt, dass die entsprechenden Liganden als Gemisch eingesetzt werden. Aufwendigere Verfah- ren umfassen die konsekutive oder parallele Behandlung der Körperflüssigkeit mit den verschiedenen Liganden. Dadurch kann beispielsweise eine bestimmte Antikörperfraktion aus Serum gewonnen werden, mit einer Spezifität für zelluläre Adhäsionsproteine und/oder Lewis Y-KohlenhydratStrukturen, oder mit einer Spezifität für B-cell Lymphom, welche dann unmittelbar als autologe Impfstoff-Formulierung zur Verfügung gestellt wird.
Erfindungsgemäß hergestellte autologe Impfstoffe, die Antikörper enthalten, welche in Zusammenhang mit dem B-cell Lymphom auftreten, enthalten insbesondere nur bestimmte Subklassen oder Fraktionen der IgG enthaltenden Serumfraktion, um die gezielte Immunantwort zu gewährleisten.
Zur erfindungsgemäßen Isolierung können etwa Antikörper oder Antikörper-Fragmente, wie z.B. Fc- oder Fab-Fragmente verwendet werden. Liganden können aber auch andere Substanzen sein, an die Immunglobuline binden können, beispielsweise Liganden zur chromatographischen Reinigung von Immunglobulinen, Affinitätspeptide, Affinitätspolypeptide, Proteine wie Protein A oder Protein G, oder ionische Strukturen, die etwa auch zur Ionenaustauschchroma- tographie verwendet werden.
Bei der Auswahl der geeigneten, immobilisierten Liganden wird üblicherweise beachtet, dass ein unerwünschtes Ausbluten "leakage" der Liganden oder von Liganden-Antikörper Komplexen in die erhaltene isolierte Antikörper-Fraktion vermieden wird. In einigen Fällen kann auch eine serielle Reinigung der Antikörper angebracht sein, um eventuell vorhandene Verunreinigungen durch die immobilisierten Liganden abzutrennen. Ein Ausbluten .des Materials kann aber auch von Vorteil sein, wenn bestimmte Liganden- Antikörper-Komplexe in 'der Präparation erwünscht sind.
Die Herstellung eines qualitativ besonders hochwertigen Impfstoffes kann die weitere Reinigung der gewonnenen Antikörper bekannte Methoden, wie die Chromatographie, Gelpermeation, Präzipitation, Separation an einer flüssigen oder festen Phase, insbesondere an ferromagnetischen Teilchen, oder Ultra-/Diafiltration umfassen.
Im Zuge der Aufarbeitung kann es auch erforderlich sein, die For- mulierung als haltbare Lösung herzustellen, etwa durch Zusatz von Konservierungsmitteln oder komplexierenden Substanzen bzw. Adju- vantien. Eine lagerstabile Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten autologen Impfstoffes ist vor allem dann wünschenswert, wenn der Patient in zeitlichen Abständen mehrmals mit dem gleichen Präparat immunisiert werden soll.
Andererseits kann die Verabreichung von jeweils frisch hergestellten Impfstoffen den Vorteil bringen, dass Veränderungen des Immunsystems jeweils berücksichtigt werden, und das Auftreten von Escape-Mutanten, etwa von Antikörper produzierenden Zellen oder infektiösen Agentien, weitgehend unterbunden werden kann. Dafür eignet sich das einfache Aufarbeiten der gewonnenen Antikörper zu einem Impfstoff, welches im besten Fall vor Ort erfolgen kann. So kann etwa der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff unmittelbar nach Blutabnahme innerhalb eines Arbeitstages, oder sogar noch während der Patientenbehandlung zur Anwendung kommen.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bezieht sich auf die Depletion von Bestandteilen der Körperflüssigkeit, die in dem Impfstoff unerwünscht sind. So können Liganden gewählt werden, die bestimmte Antikörper selektiv nicht binden, jedoch aber Begleitsubstanzen, um dann die bestimmten Antikörper aus der ungebundenen Fraktion zu gewinnen.
Unter Individuen werden gemäß der vorliegenden Erfindung einzelne menschliche oder tierische Organismen verstanden, die Körperflüssigkeiten oder Gewebe besitzen, welche Antikörper enthalten. Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Herstellung selbstverständlich in Vertebraten, besonders bevorzugt Säugetiere, insbesondere Men- schen, verwendet .
Die Isolierung der Antikörper aus tierischen Körperflüssigkeiten, die Antikörper enthalten (z.B. menschliches Serum) mittels Immun- affinitätsreinigung kann dabei nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen (Clin. Chem. (1999), 45:593; J. Che . Technol . Bio- technol. 48 (1990), 105). Besonders bevorzugt ist eine Festphasen-Immunaffinitätreinigung. Dabei wird ein spezifischer Ligand oder ein Gemisch von verschiedenen Liganden an einer Festphase immobilisiert. Die Festphase kann dabei eine Membran, ein Gel, ein Chromatographiematerial oder ähnliches Material sein, an das Liganden ohne wesentlichen Verlust der spezifischen Bindungsei- genschaften dieser Liganden gekoppelt werden kann (Mol. Biotechnol. (1994) 1:59).
Zur erfindungsgemäßen unmittelbaren Herstellung des Impfstoffes kann auch ein fertiges Set zur Verfügung gestellt werden. Dieses Set enthält die folgenden Komponenten: a) eine Vorrichtung mit Liganden zur Bindung einer bestimmten Gruppe von Antikörpern aus einer Antikörper enthaltenden Flüssigkeit eines Individuums, b) ein Mittel zum Gewinnen der Antikörper, die eine Bindung zu den Liganden eingehen, und c) ein Mittel zum Aufarbeiten der gewonnenen Antikörper zu einem autologen Impfstoff.
Die Vorrichtung a) ist insbesondere ein Behälter, ein Gerät oder ein Automat zur manuellen oder automatischen Betätigung. Die Vorrichtung a) enthält die vorgelegten Liganden, welche gegebenenfalls an einem festen Träger immobilisiert sind. Ebenso kann ein Puffer enthalten sein, der die Adsorption der Antikörper nach Aufnahme der Körperflüssigkeit in die Vorrichtung unter kontrollierten Bedingungen ermöglicht.
Das Mittel b) umfasst Substanzen oder Lösungen von Substanzen zum Waschen oder Reinigen bzw. Desorbieren der Antikörper. Darunter finden sich Waschpuffer und/oder Elutionspuffer. Daneben wird in dem erfindungsgemäßen Set auch ein Formulierungsmittel inklusive einem möglichen Adjuvans zur Verfügung gestellt, sofern dieses nicht schon als b) in dem Mittel zum Gewinnen der Antikörper enthalten ist.
Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass Antikörper an einer schwerlöslichen Aluminiumverbindung adsorbiert werden können, worauf diese in einfacher Weise und in einer einzigen Vorrichtung gewaschen, umgepuffert und zu einem fertigen Impfstoff konfektioniert werden können, der bereit die Aluminiumverbindung als Adjuvans enthält. Dann nämlich wird nur ein einziges Mittel zum Gewinnen der Antikörper und Aufarbeiten des Impfstoffes anstelle separierter Komponenten b) und c) in dem erfindungsgemäßen Set benötigt. Gegenenfalls können in dem Set noch zusätzliche Hilfsmittel, wie Wasch- und Puffersubstanzen, vorgesehen werden.
Geeignete Liganden können auch an magnetischen Kügelchen gebunden sein, die unter Verwendung eines Magneten in einfacher Weise lokalisiert bzw. orientiert oder positioniert werden können. Ein bestimmter Ligand wird beispielsweise an ferromagnetische Teilchen gebunden und in einem sterilen Behältnis zur Aufnahme der Körperflüssigkeit vorgelegt. Wenn in dem Behältnis auch ein magnetischer Transportteil oder -stab gelagert wird, können durch Ein- und Ausschalten des Magneten, etwa durch elektrische Impulse zur Betätigung eines Elektromagnetes, die Teilchen, an denen die Antikörper aus der Körperflüssigkeit gebunden sind, am Transportteil gesammelt werden. Danach können die Teilchen separiert werden, vorzugsweise unter Beibehaltung des Magnetfeldes. Während eines Waschvorganges oder der Antikörper-Desorption kann das Magnetfeld wieder aufgehoben werden. Danach ist eine Immobilisierung der Teilchen an den Magneten wieder zweckmäßig, um die Waschlösung bzw. die desorbierten Antikörper abzutrennen bzw. zu gewinnen.
Eine besondere Ausführungsform eines Sets zur Herstellung einer autologen Vakzine umfasst sterile, Endotoxin-freie Behälter, vorzugsweise "single-use" Behälter, die für die einmalige Verwendung vorgesehen sind, wie Spritzen, die gegebenenfalls miteinander verbunden sind und mit einem Septu ausgestattet sind (s. dazu Fig. 4) .
Beispielsweise umfasst das erste Behältnis die zur Adsorption der Antikörper benötigten Liganden, gebunden an ferromagnetische Teilchen ("beads"). Käuflich erhältliche "beads" sind etwa aktivierte poröse Glaskügelchen, etwa Prosep (Millipore, Durham, UK) , Dynabeads (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg, Deutschland) sowie gleiches Material von Miltenyi (Bergisch Gladbach, Deutschland) . Weiter wird in diesem Behältnis oder separat noch ein Adsorptionspuffer vorgelegt. Über ein Septum wird humanes Serum eingebracht. Ferner befindet sich in oder an diesem Gefäß ein geeigneter Magnet zur Immobilisierung der "beads" nach Adsorption, eventuellem Waschen und Desorption. Über ein Septum wird eine definierte Menge Waschpuffer eingebracht. Durch eine Fritte wird dann die Waschlösung wieder ausgebracht. Die Elution der Antikörper kann in einem separaten Elutionsgefäß mit Elutionspuffer vorgenommen werden, in die die beladenen "beads" gebracht werden. Nach Elution der Antikörper werden die "beads" durch Immobilisierung am Transportteil und Entfernen desselben aus der Lösung separiert. Danach wird ein Formulierungsmittel durch ein Septum zugegeben. Die formulierte Lösung wird in eine Spritze eingebracht und ist fertig zur Anwendung am Patienten. Die einzelnen Behälter sind jeweils mit einem oder mehreren Septa zum Transfer von Lösungen bzw. Suspensionen, sowie Fritten zur Phasentrennung ausgestattet.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird das Set als Behältnis zur Verfügung gestellt, welches die Liganden sowie die Mittel b) und c) enthält. Im Fall eines eizigen Mittels anstelle von zwei verschiedenen Mitteln b) und c) kann es vorteilhaft sein eben dieses Mittel auch gemeinsam mit den Liganden in einer Formulierung zur Anwendung zu bringen. So kann etwa ein Träger von Liganden ausgewählt werden, der auch zur Gewinnung von Antikörpern eingesetzt wird und AdjuvansWirkung hat. Ein solcher Träger ist etwa eine schwerlösliche Aluminiumverbindung, wie AluGel oder Aluminiumhydroxid. Zwar sind dann diese Liganden gemeinsam mit den gewonnenen Antikörpern in der pharmazeutischen Präparation enthalten, dies ist aber im Fall eines Antikörper-Liganden, der selbst als Impfantigen wirkt, durchaus erwünscht.
Die Bindung von Antikörpern aus Flüssigkeiten von Individuen an die Liganden kann im Mischbett ( "batchwise" ) oder im Durchflussverfahren erfolgen. Die Immunaffinitätsreinigung kann an einer Chromatographie-Apparatur automatisch oder mittels eines manuellen Verfahrens erfolgen; es ist aber auch denkbar, dass das Verfahren mittels einer einfachen Vorrichtung, die die immobilisierten Liganden enthält, manuell, automatisch oder halbautomatisch durchgeführt wird.
Letztlich ist für die erfindungsgemäße Isolierung von Antikörpern aus einem Individuum nur notwendig, dass die erwünschten Antikörper im Wesentlichen von unerwünschten anderen Stoffen aus dem Körper getrennt werden können. Es ist denkbar, dass diese Aufgabe durch andere Trennverfahren als Immunaffinitätsreinigung, wie oben beschrieben, gelöst werden kann, wie etwa durch Reaktion von Liganden mit den Antikörpern und anschließender Abtrennung der spezifischen Immunkomplexe von den nicht mit den Liganden ko ple- xierten Substanzen. Die Antikörper können auch durch in flüssiger Phase, kolloidaler Lösung, Emulsion oder durch das sogenannte "Immune Affinity Partitioning" an die Liganden gebunden bzw. gewonnen werden.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines autologen Antikörper enthaltenden Impfstoffes, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
Bereitstellen von Antikörper enthaltender Flüssigkeit aus einem Individuum,
Behandeln der Flüssigkeit mit Liganden, die Bindungen zu einer bestimmten Gruppe der Antikörper eingehen, mit der Maßgabe, dass als Liganden keine Antikörper oder deren Fragmente mit gleichem Idiotyp verwendet werden, die gegen Tumor-assoziierte Antigene gerichtet sind,
Abtrennung aller Stoffe, die keine Bindung zu den Liganden eingehen,
Behandeln der an die Liganden gebundenen Antikörper mit einem Elutionsmittel, so dass die zu den Liganden gebundenen Antikörper eluiert werden,
Gewinnen der Antikörper, die eine Bindung zu den Liganden eingehen, in einem Eluat, und
Aufarbeiten des erhaltenen Eluates zu einem autologen Impfstoff, der eine immunogene Menge von mehr als einem Mikrogramm Antikörper enthält.
Im Wesentlichen werden durch den erfindungsgemäßen Impfstoff unerwünschte Antikörper-Aktivitäten niederreguliert. Inhibierende Antikörper sind beispielsweise ein "target" und können erfindungsgemäß zu einem Impfstoff gegen diese unerwünschten inhibierenden Antikörper isoliert und formuliert werden. Im Wesentlichen wird der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff für die prophylaktische und/oder therapeutische Anwendung bei Krankheitsbildern eingesetzt, die in Zusammenhang mit Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Allergien oder Infektionserkrankungen stehen. Unerwünschte Immunreaktionen, die im Zuge von Transplantationen auftreten können, sind ein weiteres Indikationsgebiet. So können etwa Patientinnen behandelt werden, die Antikörper gegen Sperma ausbilden und daher eine erworbene Sterilität aufweisen. Wenn diese autologen Antikörper aus einer Körperflüssigkeit, wie Vaginalsekret, entnommen werden und erfindungsgemäß zur Herstellung eines Impfstoffes herangezogen werden, kann dieser Impfstoff unmittelbar zur Behandlung der Patientin eingesetzt werden, um die unerwünschten Antikörper zu unterdrücken. Die erhaltene Impfstoffpräparation enthält insbesondere IgA-Antikörper, die vor allem wieder über die Mucosa aufgenommen werden können. Die bevorzugte Verabreichung erfolgt daher nasal bzw. vaginal .
Mit Hilfe eines erfindungsgemäß hergestellten Antikörper-Impfstoffes kann auch die Rhesusfaktor-Unverträglichkeitsreaktion von Patientinnen behandelt werden. Frauen, die Rhesusfaktor-negativ sind und mit Blut bzw. Gewebe von Rhesusfaktor positiven Personen in Kontakt gebracht wurden, entwickeln Antikörper gegen diesen Rhesusfaktor. So kann beispielsweise eine Rhesusfaktor-negative Patientin, die mit einem Rhesusfaktor-positiven Fötus schwanger war, Antikörper gegen den Rhesusfaktor entwickeln. Diese gilt es zu unterdrücken, um Unverträglichkeitsreaktionen während einer zweiten Schwangerschaft mit einem Rhesusfaktor-positiven Kind zu vermeiden. Daher werden Antikörper gegen den Rhesusfaktor etwa aus Serum erfindungsgemäß gewonnen und zu einem immunogenen Impfstoff formuliert. Die aktive Immunisierung erfolgt vorzugsweise als Prophylaxe vor einer geplanten Schwangerschaft.
Die Transplantation von allogenem Material, wie Knochenmark oder Stammzellen, kann durch einen erfindungsgemäß hergestellten Impfstoff ebenso unterstützt werden. Eventuelle Abstoßungsreaktionen durch HLA-Antigenstrukturen können durch Verabreichung eines Impfstoffes, der die autologen Antikörper gegen die fremden HLA enthält, unterdrückt werden.
Die Vorbereitung von Xenotransplantationen ist ein weiteres Anwendungsgebiet, um mögliche Unverträglichkeitsreaktionen aufgrund des Transplantates zu verhindern. Hohe Titer an natürlichen Antikörpern gegen das bekannte α-Gal-Epitop/ wie sie beim Menschen im Serum gefunden werden, sind mitverantwortlich für akute Abstoßungsreaktionen gegen Xenotransplantate oder allogene Transplantate. Diese natürlichen anti-α-Gal-Antikörper werden mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zu einem Impfstoff formuliert und dem Patienten verabreicht, der zur Transplantation von Gewebe, Knochenmark oder Stammzellen vorbereitet wird. Die Niederregulierung der anti- -Gal-Aktivität soll die Abstoßungsreak- tionen vermeiden helfen. Die Senkung des Titers der zirkulierenden anti-α-Gal-Antikörpern durch die Immunisierung mit autologen anti-α-Gal-Antikörpern sollte eine signifikante Verlängerung der Überlebenszeit von Xenotransplantaten ermöglichen.
Die Auswahl der Liganden zur erfindungsgemäßen Isolierung von Antikörpern hängt mit von der entsprechenden Anwendung ab. Im Folgenden sind einige Anwendungen beispielhaft erwähnt:
• Anwendung bei Autoimmunerkrankungen:
Auto-Antigene als Liganden können beispielsweise zur Isolierung von autoimmunspezifischen Antikörpern aus einem Individuum verwendet werden. Derartig gewonnene Antikörper können nach erfindungsgemäßer Anwendung eine Immunantwort in einem Individuum hervorrufen, die besonders die Produktion der spezifischen AutoAntikörper durch idiotypische Interaktionen herunterreguliert.
Bei vielen Autoimmunerkrankungen ist die genaue Spezifität der autoreaktiven Antikörper nicht bekannt. Es ist aber nicht unbedingt notwendig, dass Autoantigene als Ligand zur Isolierung autoimmunspezifischer Antikörper nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bei einer Autoimmunerkrankung kann eine Anti- körperspezifität extrem überproportional vorhanden sein, so dass durch eine Reinigung der Gesamt-Immunglobulinfraktion (nach bekannten biochemischen Methoden) aus einem Individuum und anschließender Formulierung als Impfstoff mit darauffolgender Applikation an das Spenderindividuum vor allem anti-idiotypische Antikörper gegen die überproportional vertretene Antikörper-Spezifität hervorgerufen werden.
Beispielhaft werden Patienten mit Krankheitszuständen, die in Zusammenhang mit inhibierenden Antikörpern gegen Gerinnungsfaktoren, Insulin oder auch Rheumafaktoren stehen, mit einem erfindungsgemäß hergestellten Impfstoff behandelt. Die dafür ein¬ gesetzten Impfstoffe enthalten die Antikörper gegen die inhibierenden Antikörper oder die Rheumafaktoren.
• Anwendung bei Allergien:
Zur Herstellung einer Patienten-spezifischen Antikörper-Vakzine gegen Allergien sind als Ligand z.B. anti-IgE-Antikörper oder Teile von solchen Antikörpern mit gleicher Spezifität denkbar. Es sind aber auch Allergene, oder Teile von Allergenen als Ligand denkbar .
• Anwendung bei toxischen Substanzen:
Zur Reinigung aus einem Individuum von Antikörpern, die eine to- xinspezifische Immunantwort auslösen können, können toxinspezifi- sche Antikörper als Liganden verwendet werden. Solche Antikörper stehen in vielen Fällen als monoklonale zur Verfügung. Es ist aber auch denkbar, dass nicht Antikörper, sondern andere Moleküle, die ganz spezifische bestimmte Toxine (beispielsweise bakterielle Toxine oder niedermolekulare Gifte) binden können, als Ligand für die Reinigung verwendet werden.
Anstelle nur einer Ligandenspezies können selbstverständlich mit dem vorliegenden Verfahren auch zwei oder mehrere Liganden mit verschiedener Spezifität auf dem festen Träger immobilisiert werden und auf diese Art Antikörper bei Präparationen mit Spezifitä- ten erhalten werden, die hinsichtlich mehrerer Bindungseigenschaften an- bzw. abgereichert sind (Antikörper mit verschiedener Spezifität) . Analog ist auch die serielle Schaltung von mehreren Immunadsorptionsschritten mit jeweils verschiedenen Spezifitäten bevorzugt bei der Herstellung von multispezifischen Impfstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Es ist auch möglich, einen festen Träger mit mehreren verschiedenen Liganden zu versehen, die alle auf eine gleiche oder ähnliche Zielsubstanz gerichtet sind (im einfachsten Fall ein polyklonales Antikörpergemisch gegen eine bestimmte Antikörperklasse) . Gleichwohl können aber auch z.B. verschiedene monoklonale Antikörper gegen ein und dieselbe Zielstruktur auf dem festen Träger vorge- sehen werden.
Besonders bevorzugte Liganden sind gemäß der vorliegenden Erfindung sind Autoantigene wie z.B. doppelsträngige DNA, um Patienten-spezifische Antikörper gegen ds-DNA von Patienten mit sys- temi schem Lupus erythematosus (SLE) zu behandeln. Faktor VIII oder Teile davon können als Ligand verwendet werden, um stark Faktor VIII bindende Antikörper aus einem Individuum zu Isolieren und mit dem daraus formulierten Impfstoff die pathogene antiFaktor VIII Reaktivität eines Patienten herunterzuregulieren (Semin. Thromb. Hemost. (2000) 26:151). Aus Patienten mit Myasthenia gravis können individuelle Antikörper durch Immunaffi- nitätsreinigung mit Acetylcholinrezeptor oder Teilen davon (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90:8747) gereinigt werden, die erfindungsgemäß formuliert als autologer Impfstoff denselben Patienten wieder zurückgeimpft werden können.
Insulin als Ligand kann bei der Herstellung eines autologen Impfstoffes gegen Autoimmun Diabetes (Typl insulin-dependent diabetes mellitus) verwendet werden (Diabetes Metab. Res . Rev. (2000): 16:338).
Myelin basic protein (MBP) oder Teile davon können als Ligand bei der Herstellung eines autologen Impfstoffes für Multiple Sklerose Patienten oder Patienten mit anderen immunologisch bedingten neurologischen Störungen verwendet werden (J. Neuroimmunol . (2001) 113:163) .
Verschiedene Ganglioside können als Ligand verwendet werden (bei Patienten mit Guillain-Barre-Syndrom (Intern. Med. (1997) 36:599) und anderen Neuropathien.
Der Vorteil dieser autologen Art der Immunisierung liegt in der inhärenten Berücksichtigung der Patienten-spezifischen Idiotypen.
Ein weiterer bevorzugter Ligand gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein anti-human IgE-Antikörper, mit dem ganz spezifische IgE- Fraktionen gereinigt werden können und die wiederum dem Patienten in geeigneter, immunogener Form verbreicht werden können, um spezifische gE produzierende Zellen im Patienten zu hemmen. Natur- lieh können Teile von spezifischen Anti-IgE-Antikörpern, sofern sie die erwünschte Spezifität noch besitzen, ebenfalls als Ligand verwendet werden.
Im Bereich der Allergie ist es denkbar, ganz spezifische Allergene bzw. Teile davon oder anti-idiotypische Antikörper, bzw. andere Moleküle, die Allergene nachahmen, als Ligand einzusetzen.
Da die durch Vakzinierung mit autologen Antikörpern induzierte Immunantwort durch die Bindungsregion dieser Antikörper, d.h. durch ihren Idiotyp, determiniert wird, können im Prinzip statt intakter Antikörperfraktionen auch Fragmente oder Derivate dieser Antikörper zur Immunisierung eingesetzt werden, solange diese den Idiotyp der jeweiligen Ausgangs-Antikörper beinhalten. Der Begriff "Antikörper" umfasst daher auch Fragmente oder Derivate solcher Antikörper mit der gleichen Bindungs-Spezifität. Als Beispiele, jedoch nicht auf diese eingeschränkt, seien erwähnt: F (ab) 2 '-Fragmente, F (ab) ' -Fragmente, die z.B. nach an sich bekannten biochemischen Methoden (beispielsweise durch enzymatische Spaltung) hergestellt werden können. Der Begriff "Derivat" umfasst dabei z.B. Antikörperderivate, die nach an sich bekannten chemischen oder biochemischen Methoden hergestellt werden können, wie z.B. mit Fettsäuren an freien Aminofunktionen amidierte Antikörper zwecks Erhöhung der Lipophile zur Inkorporation in Liposo- men. Insbesondere umfasst der Begriff auch Produkte, die erzeugt werden können durch chemische Kopplung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Molekülen, die die Immunantwort verstärken können, wie z.B. Tetanus-Toxoid, Pseudomonas-Exotoxin, Derivate von Lipid A, GM-CSF, IL-2 , IL-12 , C3d.
Die durch eine erste Impfung hervorgerufene Verschiebung des immunologischen Gleichgewichts kann durch Wiederholungen dieses Vorganges weiter verstärkt werden, z.B. kann einige Wochen nach Gewinnung der ersten autologen Vakzine durch Immunaffinitätsreinigung erneut Körperflüssigkeit, z.B. Blut, abgenommen und erneut eine autologe Vakzine präpariert und verabreicht werden. Dadurch wird auch gewährleistet, dass der jeweilige Status des immunologischen Gleichgewichts in der individuellen Vakzine immer berücksichtigt ist. Dieser Vorgang kann in geeigneten Abständen immer wieder durchgeführt werden (beispielsweise zunächst alle 4-8 Wo- chen, in weiterer Folge alle 6 Monate) , entsprechend einer Verlaufskontrolle des Immunstatus des jeweiligen Patienten durch entsprechende spezifische Testung. Die hier beschriebene neue Zusammensetzung und Methode zur Impfung mit autologen Antikörpern eignet sich grundsätzlich sowohl für therapeutische als auch für prophylaktische Zwecke.
Ein genereller Vorzug der hier beschriebenen Strategie der individuellen autologen Impfung liegt in der Tatsache, dass .der immunologische Status des jeweiligen Individuums bezüglich des idiotypischen Netzwerkes berücksichtigt wird, da der entsprechende Impfstoff jeweils aus der individuellen Körperflüssigkeit, z.B. Serum, hergestellt wird. Desweiteren kommt das immunisierte Individuum dabei mit keinen Fremdantigenen in Berührung, sondern wird in geeigneter Form nur mit körpereigenen Bestandteilen behandelt, die eine Modulation des immunologischen Gleichgewichts bewirken.
Eine spezielle Anwendung findet sich in der Behandlung von Patienten, die aufgrund einer Immunisierung spezifische Antikörper ausgebildet haben. Das sogenannte Hyperimmunserum wird dann zur Herstellung einer autologen Vakzine herangezogen, um eine Immunantwort gegen die autologen Antikörper zu gegebener Zeit zu provozieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäß die durch Immunaffinitätsreinigung erhaltenen Antikörper mit einem geeigneten Vakzineadjuvans formuliert.
Wie bei Impfstoffen üblich, können die autologen Antikörperfraktionen oder deren Fragmente und Derivate mit Vakzine- djuvantien gemeinsam formuliert werden. Durch solche Adjuvantien wird die Immunantwort verstärkt. Als Beispiele für Adjuvantien, jedoch nicht auf diese eingeschränkt, seien erwähnt: Aluminium-hältige Adjuvantien, insbesondere Aluminiumhydroxid (z.B. Alu-Gel), Derivate von Lipopolysaccharid, Bacillus Calmette Guerin (BCG) , Sapo- nine und Derivate davon (z.B. QS-21) , Liposomenbereitungen, Formulierungen mit zusätzlichen Antigenen, gegen die das Immunsystem bereits eine starke Immunantwort gemacht hat, wie z.B. Tetanus- Toxoid oder Bestandteile von Influenza-Viren, gegebenenfalls in einer Liposomenbereitung. Die ImpfStoffbereitung kann zur Verstärkung der Immunantwort auch mit entsprechenden, vorzugsweise humanen Zytokinen, die den Aufbau einer Immunantwort unterstützen, verabreicht werden. Hier ist insbesondere, wenn auch nicht ausschließlich, Granulozyten-Makro- phagen-stimulierender Faktor (GM-CSF) zu erwähnen. Di.eses Zytokin stimuliert durch Aktivierung von Antigen-prozessierenden Zellen (z.B. dendritische Zellen) eine effiziente Immunantwort.
Gegebenenfalls können die autologen Antikörperfraktionen auch nach an sich bekannten und publizierten Methoden mit autologen, , ex vivo-kultivierten dendritischen Zellen inkubiert' werden. Die so gepulsten dendritischen Zellen werden anschließend dem jeweiligen Individuum wieder verabreicht. Auf diese Weise kann eine besonders effiziente Immunantwort erreicht werden.
In einem bevorzugten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet demgemäß das Aufarbeiten der Antikörper-Eluate die Zugabe eines Stoffes, ausgewählt aus der Gruppe der Adjuvantien, insbesondere Aluminium-hältige Adjuvantien, Lipopolysaccharid-De- rivate, Bacillus Calmette Guerin, Liposome oder QS-21 (weitere bevorzugte Adjuvantien sind u.a. in Singh et al . , Nat. Biotech- nol . 17 (1999), Seiten 1075-1081 beschrieben), immunstimulierende Zellen, insbesondere dendritische Zellen oder andere Antigen-prä- sentierende Zellen, aktive Agentien, vorzugsweise Zytokine, insbesondere Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor, Formulierhilfsstoffe, insbesondere Puffersubstanzen, Stabilisatoren oder Lösungsvermittler, oder Mischungen dieser Substanzen, umfasst .
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die in der Zusammensetzung enthaltenen Antikörper mit einem Adjuvans gemischt und anschließend einer Hitzebehandlung, vorzugsweise bei einer Temperatur von über 80°C, insbesondere zwischen 90°C und 130°C, unterzogen. Das verwendete Adjuvans ist vorzugsweise ein Aluminium-hältiges Adjuvans. Es ist möglich, dass eine derartige Hitzebehandlung das Proteinantigen zwar denaturiert, die immunogenen Teile des Proteins aber durch die Bindung an das Adjuvans dem Immunsystem in der richtigen Form präsentiert werden kann. Es ist aber nicht unbedingt notwendig, die Proteine zu denaturieren, um die Vorteile einer Hitzebehandlung zu erhalten. Es ist bekannt, dass die thermische Denaturierung von Proteinen nicht nur von der Temperatur, sondern auch von der Zeit, der das Protein dieser Temperatur ausgesetzt ist, abhängt. Darüber hinaus sind noch weitere physikalisch chemische Parameter, wie z.B. Ionenstärke, Ionenzusammensetzung, pH-Wert, Art und Menge der aktiven Oberfläche im Gemisch für die Denaturierung eines Proteins verantwortlich. Es sind Bedingungen bekannt und für beliebige Eluate für den Fachmann leicht optimierbar, bei denen die Antikörper nicht oder nicht vollständig denaturiert werden und/oder andere Effekte, wie z.B. schwächere Desorption von der Oberfläche des Adjuvans, genützt werden können.
Ein weiterer Vorteil einer derartigen Herstellungsweise einer Impfstoffformulierung mit einem Adjuvans und der darauf folgenden Hitzebehandlung ist, dass in der gesamten Formulierung infektiöse Erreger abgeschwächt bzw. inaktiviert werden könnten. Dieser Vorteil kann sowohl in der Herstellung als auch bei der Lagerung und Distribution der Impfstoffformulierung eine Rolle spielen. Es ist damit eine größere Sicherheit in Bezug auf bekannte und unbekannte Erreger von übertragbaren Krankheiten gegeben. Darüber hinaus ist, bei entsprechender Verpackung eine Abfüllung ohne Konservierungsstoffe möglich, da die mikrobielle Konservierung des Impfstoffes durch Hitze erfolgt ist.
Ein weiterer Vorteil einer derartigen Formulierung ist die mögliche erhöhte Immunogenität der Antikörper, da die Erhitzung eine zumindest teilweise Denaturierung der Antikörper bewirken kann. Diese erhöhte Antigenität kann im Besonderen bei Proteinen, die vom Immunsystem als eigene Proteine erkannt werden würden, die Immunogenität erhöhen.
Ein weiterer Vorteil liegt in der zusätzlichen Stabilisierung des Antikörper-Adjuvans-Komplexes durch die Hitzeinaktivierung, d.h. die Desorption des Protein-Antigens erfolgt nicht mehr schnell wie in Antigen-Adjuvans-Formulierungen, die nicht hitzebehandelt worden sind. Dieser Vorteil erlaubt auch einen größeren zeitlichen Abstand zwischen den einzelnen Immunisierungen.
Demgemäß betrifft eine besondere Aus ührungsform des erfindungs- gemäßen Verfahrens ein Verfahren, bei welchem ein Protein-Denatu- rierungsschritt, insbesondere eine Hitzebehandlung, vorgenommen wird, bei welchem die in den Eluaten enthaltenen Proteine zumindest teilweise in ihrer dreidimensionalen Struktur verändert werden, wobei sich vorzugsweise ihre immunogenen Eigenschaften verstärken.
Die erfindungsgemäß hergestellte Zusammensetzung kann nach gängigen Methoden verabreicht werden, z.B. als Impfstoff durch subkutane, intramuskuläre, oder intradermale Injektion. Eine weitere Art der Verabreichung funktioniert über den mucosalen Weg, etwa die Vakzinierung durch nasale oder perorale Verabreichung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend Antikörper, die aus tierischen Körperflüssigkeiten, die Antikörper enthalten, durch Immunaffinitätsreinigung gewonnen wurden zur Verwendung als autologe Impfstoffe.
Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahrens zur therapeutischen oder prophylaktischen Impfung gegen Autoimmunerkrankungen, Infektionskrankheiten, verschiedene Intoxikationen und Allergien.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch einen autologen Impfstoff, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Individuen, bei welchen ein erfindungsgemäß hergestelltes Präparat in einer effizienten Menge, vorzugsweise einige Mikrogramm bis zehn Gramm, an das Individuum, bei dem die Körperflüssigkeit entnommen worden ist, verabreicht wird. Die Effizienz ist vor allem hinsichtlich der Immunogenität zu werten. Es hat sich bewährt, mindestens ein Mikrogramm Antikörper in einer Impf- stoffdosis einzusetzen, der in fertigen Dosiseinheiten von 0,01 bis zu 1 ml verabreicht werden kann, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 0,5 ml. Die bevorzugte Menge richtet sich vor allem nach der unterstützenden Wirkung von Adjuvantien und liegt im Bereich von 3 Mikrogramm bis 1 Gramm, besonders bevorzugt 10 Mikrogramm bis 750 Mikrogramm, am meisten bevorzugt 250 Mikrogramm bis 500 Mikrogramm.
Dieses Behandlungsverfahren ist vor allem auch bei Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Systemischer Lupus erythematosus , Autoimmun Thyroiditis, Systemischer Vaskulitis, Guillain-Barre-Syn- drom und anti-Faktor VII :C-Autoimmunerkrankung, bei Allergien, bei Tumorerkrankungen bzw. bei der Prophylaxe von Unverträglichkeitsreaktionen im Rahmen von Transplantationen sowie bei Vergiftungen (wie z.B. mit bakteriellen Toxinen) besonders wirksam.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer autologen Antikörperpräparation zur Herstellung eines Mittels zur Immunmodulation.
Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht eingeschränkt sein soll, näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1: Schema der Gewinnung des Impfstoffes.
Fig. 2: Veränderung der spezifischen Antikörper-Reaktivitäten nach Immunisierung mit autologem Impfstoff, hergestellt über anti-bovines Serumalbumin als Ligand, bzw. Sepharose.
Fig. 3: Veränderung der spezifischen Antikörper-Reaktivität nach Immunisierung mit autologem Impfstoff, hergestellt über Maus- IgG2a als Ligand.
Fig. 4: Gefäßsystem zur Herstellung des autologen Impfstoffes unter Verwendung von magnetischen Teilchen
B e i s p i e l e :
Beispiel 1 :
Dieses Beispiel soll veranschaulichen, dass es möglich ist, das Immunsystem gegen ein beliebiges Protein (in diesem Fall Bovines Serumalbumin, BSA) spezifisch zu modulieren.
Es wurden zwei Gruppen von jeweils 3 Kaninchen mit einer erfindungsgemäß hergestellten Vakzineformulierung immunisiert.
Der autologe Impfstoff für die erste Gruppe wurde durch Reinigen von Immunglobulin aus dem Serum der Kaninchen über eine Affinitätschromatographie-Säule (Kaninchen anti-BSA immobilisiert auf Sepharose) hergestellt. Der autologe Impfstoff für die zweite Gruppe wurde durch Reinigen von Immunglobulin aus dem Serum von Kaninchen über eine andere Affinitätschromatographie-Säule (Sepharose ohne spezifische Liganden) hergestellt.
Die so erhaltenen Immunglobuline wurden als Impfstoff durch Adsorption auf Aluminiumhydroxid-Gel formuliert und den jeweiligen Kaninchen subkutan verabreicht .
Blutabnahme- und Impf-Schema:
Tag -21: Serumgewinnung Tag -14 : Serumgewinnung Tag -7 : Serumgewinnung
Aus dem Pool der Seren der Tage -21, -14 und -7 wurde der Impfstoff gereinigt
Tag 0 : Serumgewinnung
Tag 0: Immunisierung, subkutan
Tag 14 : Serumgewinnung Tag 21: Serumgewinnung
Herstellung der Affinitätsmatrix:
In einem ersten Schritt wurde das anti-BSA-Serum von Kaninchen gereinigt :
Dazu wurden die polyklonalen Kaninchen-anti-BSA-Antikörper (in 0,1M Glycin/HCl-Puffer, pH:2,9; Volumen= 4 ml) gegen Dialysepuffer (0,1 M NaHC03 + 0,5 M NaCl pH=8,0) dialysiert (Slide-A- LyzerÖ 10K; Pierce/USA) . Methode :
• Dialysiert wurde in einem 800 ml Becherglas mit MagnetrührStäbchen am Magnetrührer bei 4°C, wobei der Dialysepuffer viermal erneuert wurde .
• Die Proben wurden danach ankonzentriert durch Zentrifugieren (mit Centricon 10K (Amicon) ) , Endvolumen: 0,4-0,6 ml.
Immobilisierung an aktivierte CH-Sepharose:
Materialien:
• Activated CH-Sepharose 4B; Pharmacia Biotech (Code No. : 17- 0490-01)
• Ligand: polyklonaler anti-BSA-Antikörper ( 6 , 6 mg/ml, in Kupplungspuffer)
• Kupplungspuffer: 0,1 M NaHC03 + 0,5 M NaCl, pH=8,0
• 1 mM HCl-
• 1 M Ethanolaminlösung
■ 0,1 M Tris-HCl (Tris (hydroxymethyl) -aminomethan) -Puffer, pH=8,0
• 0,1 M Tris-HCl-Puffer + 0,5 M NaCl, pH=8,0
• 0,1 M Acetat-Puffer + 0,5 M NaCl, pH=4,0
Kopplungs-Methode:
0,25 g freeze-dried CH-Sepharose 4B wurde in ca. 20 ml ImM HCl suspendiert, mit 50 ml 1 mM HCl gewaschen, danach mit 50 ml Kupplungspuffer gewaschen. Die Sepharose wird in ein 50 ml Falcon- Röhrchen überführt und die Antikörper-Lösung zugegeben. Ein Verhältnis von Gel: Puffer=l:2 ergibt eine passende Suspension für die Kupplung. Die Suspension wurde ca. 1 Stunde lang geschüttelt. Überschüssiger Antikörper wurde durch Waschen mit 3 x 10 ml Kupplungspuffer entfernt. Verbliebene aktive Bindungssteilen wurden mittels einstündiger Inkubation am Schüttler mit 1 M Ethanolamin blockiert. Danach folgte eine einstündige Inkubation der Sepharose mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH=8,0) am Schüttler und folgender Waschzyklus: zuerst Waschen mit 0,1 M Acetat-Puffer (pH=4,0) + 0,5 M NaCl, dann mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH*=8,0) + 0,5 M NaCl. Der Waschzyklus wurde 3 mal durchgeführt . Herstellung der Affinitätsmatrix für die zweite Gruppe von Kaninchen:
Die Affinitätsmatrix für die zweite Gruppe (Kontrollgruppe) wurde nach der gleichen Prozedur wie oben beschrieben hergestellt. Es wurde anstatt der Antikörperlösung nur Puffer verwendet. Aktivierte Sepharose is damit ausschließlich mit Ethanolamin blockiert:
Herstellung der autologen Impfstoffe:
Es wurden jeweils 10 ml Serum der entsprechenden Kaninchen (Pool der Tage -21, -14, und -7) mit den jeweiligen Affinitätsmatrices (0,5 ml Säulenvolumen) aufgereinigt .
Materialien:
Auftragepuffer: PBS + 0,2 M NaCl, pH=7,2 Elutionspuffer : 0 , IM Glycin/HCl-Puffer, pH=2 , 9
Methode:
Auftragen auf die Säule erfolgte mit einer Inkubationszeit von 30 Min. bei +4°C. Das Waschen erfolgte mit Auftragepuffer (1 Waschschritt = 5 ml; 5 Waschschritte) . Die Elution erfolgte mit mit 1 ml Elutionspuffer.
Das Eluat wurde mit Carbonatlösung (0,5M NaHC03) neutralisiert, die so gereinigten Proteine wurden mittels Größentrennungs-Chro- matographie analysiert.
Größentrennungschromatographie:
Die Chromatographie wurde mit einer ZORBAX GF-250 Säule auf einem DIONEX-HPLC-System durchgeführt. Als quantitative Standards wurden folgende Immunglobuline verwendet :
- human IgG-Standard (20 mg/ml; Sandoglobulin, 3.590.009.0)
- human IgM-Standard (1,1 mg/ml; SIGMA, cat.1-8260) Säule: ZORBAX GF 250 (PN: 884973.901)
Laufpuffer: 220 Mol NaP0-Puffer, pH=7 , 0 + 10% Acetonitrile Flussrate: 1,000 ml/min Wellenlänge: 214 nm Bandweite: 5 nm I jektionsvolumen: 50 μl
Formulierung mit Aluminiumhydroxid:
Die Formulierung der gereinigten, neutralisierten Immunglobuline als Impfstoff erfolgte nach folgender Prozedur:
Für jeden Impfstoff wurde ein Centricon Ultrafiltrationseinheit (Centricon 10K von Amicon, USA) verwendet. Zuerst wurde die Ultrafiltrationseinheit gewaschen (durchzentrifugieren von 1 mM Na-Phosphatpuffer, 0,86 % NaCl, pH 6 (NBK) ) . Danach wurden 400 μl Puffer und Alhydrogel (27 μl (für 400 μl), Superfos, Dänemark) vorgelegt, das neutralisierte Eluat zugefügt, zentrifugiert und gewaschen (mit 5 ml Puffer) , so dass das Endvolumen ca. 300 μl betrug. Danach folgte Resuspendieren der Vakzine und Auffüllen mit Puffer auf 396 μl, Zusatz von 4 μl Thimerosalstammlösung (10 mg/ml, Sigma) , 350 μl davon wurden steril abgefüllt. Die Proteinkonzentrationen der einzelnen Impfstoffe betrug jeweils 40-50 μg.
BSA-EL SA:
Es wurden folgende Proben im ELISA analysiert: Tag 0, sowie ein Pool von Tag 14 und Tag 21. ELISA-Platten (NUNC, Maxisorp (F=96) ; Dänemark) wurden mit 100 μl BSA-Lösung (pro Näpfchen) beschichtet. (BSA-Lösung: BSA (Fa. SIGMA Kat.No A-7638) ; 10 μg/ml in Be- schichtungspuffer) . Es wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen wurde mit 5 % Trockenmilch in PBS blockiert (200 μl/ Näpfchen) . Inkubation: 30 Min bei 37°C.
Wasch-Schema:
- Nach Beschichten, Blockieren und Probeninkubation: 6 mal mit Waschpuffer, nach 4. Mal eine Minute inkubiert.
- nach Konjugat: 4 mal mit Waschpuffer, 2 mal mit Färbepuffer.
Serumproben wurden seriell verdünnt (in 2% Trockenmilch/PBS) . Die Probenverdünnungen (100 μl/Näpfchen) wurden 1 Stunde bei 37°C in- kubiert. Als Positivkontrolle und als Standard für eine quantitative Auswertung der ELISA diente eine Verdünnungsreihe des poly- klonalen Kaninchen-anti-BSA-Serums, das für die Affinitätsreinigung verwendet worden war. Nach dem Waschen wurde das Enzymkon- jugat (Anti rabbit Ig HRP (Nordic Immunology, #4694)) in entsprechender Verdünnung (1:1000 Verdünnungs-Puffer) aufgetragen (100 μl/Näpfchen) . Nach einer Inkubation von 30 Min. bei 37°C wurde erneut gewaschen, Substrat zugegeben (pro Näpfchen: 100 μl TMB Microwelll (BioFX, Cat-No:TMBW-0100-01, #0034302)), und nach entsprechender Färbung die Reaktion gestoppt (mit 30%iger H2S04 50 μl/Näpfchen) , danach im Photometer die Färbung gemessen (450 nm) . Der Titer bei der halbmaximalen Adsorption von jeder Verdünnungsreihe wurde ermittelt. Die relative Titerveränderung zum Nullserum (Tag 0; = Zeitpunkt der Immunisierung) für die einzelnen Ka ninchen ist in Figur 2 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die Kaninchen, die einen autologen Impfstoff, der mittels einer anti-BSA-AffinitätsChromatographie hergestellt wurde, eine deutliche Titerverschiebung im BSA-ELISA zeigen.
Beispiel 2 :
Dieses Beispiel soll zeigen, dass es möglich ist, eine bereits vorhandene Immunantwort in einem Individuum spezifisch zu senken. Dazu wurde ein Rhesusaffe, der mit einem monoklonalen Antikörper (HE2, Maus-IgG2a) immunisiert worden war, und eine starke IgG- Immunantwort gegen Maus-IgG2a entwickelt hat, verwendet. Das Serum dieses Affen wurde an einer Immunaffinitäts-Säule, an* der Maus-IgG2a (HE2) als Ligand immobilisiert war, gereinigt. Die derart gereinigten Immunglobuline wurden als Impfstoff auf Aluminiumhydroxid formuliert und dem Spenderaffen subkutan verimpft. Zum Immunisierungszeitpunkt (vor der Vakzinierung) , sowie 2 Wochen danach wurde Blut abgenommen, um die spezifische Immunantwort gegen Maus-IgG2a zu bestimmen.
Material und Methoden:
Mikrotiterplatten für ELISA: Immuno Plate F96 MaxiSorp (Nunc)
Kopplungspuffer: 0,1 M NaHC03
0,5 M NaCl pH-Wert 8,0
Reinigungspuffer A: PBS + 0,2 M NaCl
Reinigungspuffer B: 0,1 M Glycin / HCl
0,2 M NaCl pH-Wert 2,9
Bindungspuffer : 15 mM Na2C03 35 mM NaHC03 3 mM NaN3 pH-Wert : 9,6
PBS: 138 mM NaCl
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2,7 mM KC1 6 , 5 mM NaHP04 pH-Wert : 7,2
Waschpuffer A: 2% NaCl
0,2% Triton X-100 in PBS
Waschpuffer B: 0,05 % Tween 20 in PBS
Blockierungspuffer A: 5 % foetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) in PBS
Blockierungspuffer B: 1 % Rinderserumalbumin
0,1 % NaN3 in PBS
Verdünnungspuffer A: 2% foetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) in PBS
Verdünnungspuffer B: PBS
Färbepuffer: 24.3 mM Zitronensäure
51.4 mM Na2HP04 pH-Wert : 5,0 Substrat: 40 mg o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid
100 ml Färbepuffer 20 μl H202 (30%)
Stopplösung: 4 N H2SO4
Formulierungspuffer: 10 % PBS, pH = 5 , 5
90 % physiologische NaCl-Lösung
Durchführung:
Die hier beschriebene Methode zur autologen Impfung wurde an einem Rhesusaffen erprobt, der eine starke Immunantwort gegen Maus- IgG2a machte (0,5 mg Maus IgG2a (HE2) absorbiert auf 1,67 mg Alu- minumhydroxid in 0,5 mL 1 mM Phosphat-Puffer, pH 6,0/155 mM NaCl) wurde jeweils an den Tagen 1, 15, 29 und 57 subkutan an einen Rhesusaffen verimpft. Die Seren von verschiedenen Zeitpunkten wurden mittels ELISA auf Maus-IgG2a-spezifische Antikörper getestet (siehe unten) . Die Antikörper waren am Ende des ImpfSchemas vor allem vom IgG-Typ. Es wurden diesem Rhesusaffen 10 ml peri- pheres Blut abgenommen und daraus Serum gewonnen. Zur Immunaffi- nitätsreinigung der Antikörperfraktion aus dem Serum dieses Rhesusaffen wurde zunächst eine Immunaffinitätsmatrix nach folgender Vorschrift hergestellt.
Die ganze Prozedur wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt: 7,5 g CH-Sepharose 4B (Pharmacia) wurden für 15 Minuten in 20 ml 1 mM HCl suspendiert. Das Gel wurde dann mit 1 Liter 1 mM HCl und anschließend mit 200 ml Kopplungspuffer auf einem Sinterglasfil- ter AG3 gewaschen. 100 mg muriner Antikörper HE2 (Maus-IgG2a) wurden gegen 5 Liter Kopplungspuffer dialysiert und mit Kopplungspuffer auf 5 mg/ml eingestellt. Diese Lösung wurde mit der Gelsuspension in einem verschlossenen Gefäß vermischt. Ein Verhältnis von Gel : Puffer von 1 : 2 ergibt eine für die Kopplung geeignete Suspension. Diese Suspension wurde 24 Stunden bei 4°C rotiert. Anschließend wurde der Überschuss des Liganden mit 3 x 30 ml Kopplungspuffer weggewaschen. Überbleibende reaktive Gruppen wurden durch einstündige Inkubation bei 4°C mit 1 M Ethanol- amin geblockt . Dann wurde das Gel für eine Stunde bei Raumtempe- ratur mit einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer rotiert. Letztlich wurde das Gel mit 3 Zyklen von Puffern mit alternierendem pH gewaschen. Jeder Zyklus besteht aus 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4, mit 0,5 M NaCl, und anschließend 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8, mit 0,5 M NaCl. Das Gel wurde bei 4°C aufbewahrt. Die Immunaffinitätsreinigung der Antikörperfraktion aus Serum eines Rhesusaffen erfolgte nach folgender Vorschrift unter sterilen Bedingungen: Die Immunaffinitätsreinigung wurde auf einem FPLC-Syste (Pharmacia) durchgeführt. 1 ml des nach obiger Vorschrift erhaltenen Gels wurde in eine Pharmacia HR5/5 Säule gefüllt. 5 ml Serum wurden 1:10 mit dem Reinigungspuffer A verdünnt. Diese Lösung wurde mit 1 ml/Minute über die Säule gepumpt und mit Reinigungspuffer A nachgewaschen, bis die UV-Basislinie des Detektors wieder erreicht ist (280 nm) . Gebundene Immunglobuline wurden dann mit Reinigungspuffer B eluiert und die Fraktion mit 1 M Na2HP04 unmittelbar nach Desorption neutralisiert. 50 μl der so gereinigten Antikörperfraktion wurden auf einer Größentrennungs- säule (SEC, Zorbax 250 GF) analysiert. Als Laufmittel wurde 220 mM Phosphatpuffer, pH 7 + 10% Acetonitril verwendet. Die Gesamtmenge der Antikörperfraktion betrug ca 40 μg (bestimmt mittels SEC im Vergleich zu einem Standard) . Die so gewonnene Antikörperfraktion wurde in einem ELISA bezüglich der Bindung an Antikörper HE2 (der zur Affinitätsreinigung als Ligand verwendet wurde) getestet: 100 μl Aliquots des für die Affinitätsreinigung eingesetzten Maus IgG2a Antikörpers (Antikörper HE2; Lösung mit 10 μg/ l in Bindungspuffer) wurden in den Näpfchen einer Mikro- titerplatte 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach sechsmaligem Waschen der Platte mit Waschpuffer A wurden je- 200 μl des Blockierungspuffers A zugesetzt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Waschen der Platte wie oben beschrieben wurden je 100 μl Aliquots der zu testenden affinitätsgereinigten Antikörperfraktion sowie normales Humanimmunglobulin in gleicher Konzentration als Negativkontrolle in Verdünnungen von 1:4 bis 1:65 000 in Verdünnungspuffer A, 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Waschen der Platte wie oben beschrieben wurden je 100 μl des Peroxidase-konjugierten Ziegen-anti-Hu an-Ig-Antikörpers (Zymed) in einer Verdünnung von 1:1000 in Verdünnungspuffer A zugesetzt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde viermal mit Waschpuffer A und zweimal mit Färbepuffer gewaschen. Die Antikörperbindung wurde durch Zusatz von je 100 μl des spezifischen Substrats nachgewiesen und die Farbreaktion durch Zugabe von je 50 μl Stopplösung nach ca. 3 Minuten abgebrochen. Die Auswertung erfolgte durch Messen der optischen Dichte (OD) bei 490 nm (Wellenlänge der Referenzmessung ist 620 nm) . Die affinitätsgereinigte Antikörperfraktion zeigt eine deutliche Bindung an den Maus IgG2a-Antikörper, während normales Human-Immunglobulin praktisch nicht bindet.
Die. durch Affinitätsreinigung erhaltene Antikörperfraktion wurde mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans nach folgender Vorschrift formuliert:
3 ml der nach Affinitätschromatographie erhaltenen Antikörperlösung (enthält ca. 40 μg Antikörper) wurden mit 1 mg Aluminiumhydroxid (wässerige Suspension; Alhydrogel, Superfos) versetzt und die Suspension in einem "FILTRON" Zentrifugenröhrchen (Mi- crosep TM, cut-off 10KD) bei 4000 x g 30 Minuten lang zentri- fugiert. Anschließend wurde 2 x mit je 1 ml des Formulierungspuffers aufgeschlämmt und bei 4000 x g 30 Minuten lang zentrifu- giert. Die Suspension wurde mit Formulierungspuffer auf 0,5 ml aufgefüllt und die so erhaltene Suspension steril abgefüllt. Der Rhesusaffe, aus dessen Serum obiger autologer Impfstoff gewonnen wurde, wurde mit diesem Impfstoff subkutan in den Rücken geimpft. Vor dieser ersten Impfung wurden 5 ml Blut zur Serumgewinnung (zur Bestimmung des Ausgangswertes für die Charakterisierung der Immunantwort) abgenommen. Zwei Wochen danach wurden erneut 10 ml Blut zur Serumgewinnung abgenommen.
Es wurde die Bindung des Serumimmunglobu-lins dieses immunisierten Affen an Maus IgG2a wie oben im ELISA bestimmt. Wie in Figur 3 zu sehen ist, sinkt nach der Immunisierung mit dem autologen Impfstoff die Maus IgG2a Reaktivität.

Claims

P a t e n t a n s p rü c h e :
1. Verfahren zur Herstellung eines autologen Antikörper enthaltenden Impfstoffes, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- Bereitstellen einer Antikörper enthaltenden Flüssigkeit aus einer autologen Antikörper enthaltenden Körperflüssigkeit oder aus autologen Zeil- oder Gewebepräparaten,
- Behandeln der Antikörper enthaltenden Flüssigkeit mit einem festen Träger, auf dem Liganden immobilisiert sind, die Bindungen zu einer bestimmten Gruppe der Antikörper eingehen, mit der Maßgabe, dass als Liganden keine Antikörper oder deren Fragmente mit gleichem Idiotyp verwendet werden, die gegen Tu- or-assoziierte Antigene gerichtet sind,
- Gewinnen der Antikörper, die eine Bindung zu den Liganden eingehen, und
- Aufarbeiten der gewonnenen Antikörper zu einem autologen Impfstoff, der eine immunogene Menge von mehr als einem Mikrogramm Antikörper enthält.
2. Verfahren zur Herstellung eines autolόgen Antikörper enthaltenden Impfstoffes, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- Bereitstellen von Antikörper enthaltender Flüssigkeit aus einem Individuum,
- Behandeln der Flüssigkeit mit Liganden, die Bindungen zu einer bestimmten Gruppe der Antikörper eingehen, mit der Maßgabe, dass als Liganden keine Antikörper oder deren Fragmente mit gleichem Idiotyp verwendet werden, die gegen Tumor-assoziierte Antigene gerichtet sind,
- Abtrennung aller Stoffe, die keine Bindung zu den Liganden eingehen,
- Behandeln der an die Liganden gebundenen Antikörper mit einem Elutionsmittel, so dass die zu den Liganden gebundenen Antikörper eluiert werden,
- Gewinnen der Antikörper, die eine Bindung zu den Liganden eingehen, in einem Eluat, und
- Aufarbeiten des erhaltenen Eluates zu einem autologen Impfstoff, der eine immunogene Menge von mehr als einem Mikrogramm Antikörper enthält.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass ein autologer Impfstoff enthaltend eine immunogene Menge an Antikörpern im Bereich von 3 Mikrogramm bis 3 Gramm hergestellt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Liganden ein Mittel zum Binden von Antikörpern gewählt werden, die bei Autoimmunerkrankungen auftreten.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Liganden ein Mittel zum Binden von Antikörpern gewählt werden, die bei allergischen Krankheiten auftreten.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass als* Liganden ein Mittel zum Binden von .Antikörpern gewählt werden, die gegen das α-Gal-Epitop gerichtet sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche' 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Liganden ein Mittel zum Binden von Antikörpern gewählt werden, die gegen menschliches Sperma gerichtet sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass als Liganden ein Mittel zum Binden von Antikörpern gewählt werden, die spezifisch für B-cell-Lymphom-Erkrankungen sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Serum oder Plasma ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Individuum ein Mensch ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden aus mehr als einem Typ gewählt sind, insbesondere Liganden, die Antikörper mit verschiedener Spezifität binden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden eine bestimmte Subklasse von Immun- globulinen binden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 , dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden bestimmte Immunglobulin-Ketten binden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Liganden Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, Antigene, Autoantigene, Haptene, Allergene oder Mischungen davon verwendet werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufarbeiten die Zugabe eines Stoffes, ausgewählt aus der Gruppe der Adjuvantien, insbesondere Aluminium-hältige Adjuvantien, Lipopolysaccharid-Derivate, Bacillus Calmette Guerin, Liposomen, Saponine und Derivate davon, immunstimulierende Zellen, insbesondere dendritische Zellen, aktiven Agentien, vorzugsweise Zytokine, insbesondere Granulocyten-Makrophagen stimulierender Faktor, Formulierhilfsstoffe, insbesondere Puffersubstanzen, Stabilisatoren oder Lösungsvermittler, oder Mischungen dieser Substanzen, umfasst.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Protein-Denaturierungsschritt, insbesondere eine Hitzebehandlung, vorgenommen wird.
17. Autologer Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 erhältlich ist.
18. Verwendung eines autologen Impfstoffes nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Mittels zur Immunmodulation, insbesondere zur Niederregulierung unerwünschter Antikörper-Aktivitäten.
19. Set zur Herstellung eines autologen Impfstoffes enthaltend die Komponenten a) eine Vorrichtung mit Liganden zur Bindung einer bestimmten Gruppe von Antikörpern aus einer Antikörper enthaltenden Flüssigkeit eines Individuums, b) ein Mittel zum Gewinnen der Antikörper, die eine Bindung zu den Liganden eingehen, und c) ein Mittel zum Aufarbeiten der gewonnenen Antikörper zu einem autologen Impfstoff.
20. Set nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente a) einen Behälter zur Aufnahme der Liganden und der Antikörper enthaltenden Flüssigkeit umfasst.
21. Set nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter die Liganden gebunden an einem festen Träger enthält.
22. Set nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter magnetische Kügelchen enthält, und das Set weiter einen Magneten zum Lokalisieren der Kügelchen umfasst.
23. Set nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente b) ein Mittel zur Reinigung der Antikörper umfasst.
24. Set nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente c) ein Adjuvans umfasst.
25. Set nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass als Komponente b) und c) ein einziges Mittel zum Gewinnen und Aufarbeiten der gewonnenen Antikörper und optionale Hilfsmittel enthalten sind.
26. Set nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel eine schwerlösliche Aluminiumverbindung zum Gewinnen und Aufarbeiten der gewonnenen Antikörper enthält.
27. Set nach einem der Ansprüche 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung a) einen Behälter enthaltend die Liganden, das Mittel b) und c) umfasst.
28. Set nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Spritze enthaltend einen Impfstoff und ein Adjuvans umfasst.
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