WO2002074972A1

WO2002074972A1 - Methode de dosage d'anticoagulant lupique et reactif de dosage

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Publication number: WO2002074972A1
Application number: PCT/JP2002/002599
Authority: WO
Inventors: Tatsuya Atsumi; Takao Koike
Original assignee: Eisai C0. Ltd.
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2002-09-26
Also published as: EP1380653B1; US20040110242A1; EP1380653A1; DE60222878D1; EP1380653A4; JP4134300B2; ATE375398T1; US7244574B2; JPWO2002074972A1

Description

明細書

ループスアンチコアグラントの測定法及び測定試薬技術分野

本発明の分野は、抗リン脂質抗体症候群に付随して出現するループスアンチコァグラント（以下 LAと称す）の測定法及び測定試薬に関する。背景技術

抗リン脂質抗体症候群（以下 APSと称す）は、動 ·静脈血栓症、流 ·死産を臨床症状として、血中に抗リン脂質抗体とよばれる自己抗体が証明される自己免疫疾患である。 APSの定義上、診断には抗リン脂質抗体（以下 aPLと称す）の証明は必須であるが、 aPLは極めて多彩な自己抗体群であり、その検出は必ずしも容易ではない。 1999年に APSの改訂分類基準案が作成され、その中で検査の項目に関し、

1 ) . IgGまたは IgM型 ^ ₂グリコプロテイン I依存性の抗カルジォリピン抗体が中等度以上高値、

2) . LAが陽性、

と記載された。

しかし、 LA検査は臨床医及び臨床検査者のいずれにとっても難しい検査のひとつといわれ、検査法、試薬の種類、検体の状態によって大きく結果が異なることが知られている。

LAは「in vitroのリン脂質依存性凝固反応（活性化部分トロンボプラスチン時間 (Triplett LA. Lupus 7 (Supple2)₅ S18-22, 1998；以下 aPTTとも称す）、力ォリン凝固時間 (Triplett LA. Lupus 7 (Supple2)₃ S18 - 22， 1998；以下 KCTとも称す）、希釈ラヅセル蛇毒時間 (Triplett LA. Lupus 7 (Supple2) , S18-22, 1998；以下 dRVVTとも称す）の反応）を阻害する免疫グロプリン」と定義され、 1 995年の国際血栓止血学会の抗リン脂質抗体標準化委員会によって検査の指針がしめされている。

各施設で感度および特異度を上げるために種々の工夫がなされているが、単一の方法で LAの存在を決定することは困難であり、通常はいくつかの方法を組み合わせて行われる。すなわち、

1 ) . aPTT、 KCTs dRVVTでリン脂質依存性凝固時間が延長していることをスクリーニングする、

2) .ミキシングテスト（正常血漿の添加）でこの凝固時間延長が患者血漿中にィンヒビ夕一が存在するためであることを示す、

3) .障害血小板やリン脂質による吸収中和試験でこのインヒビ夕一が抗リン脂質抗体であることを確証する、

のステップである。

LAはリン脂質依存性反応を抑制するので、 LAを感度よく検出するにはリン脂質濃度を低くすることが条件である。しかし、これらの条件によっても試薬の選択や調製、標準値の設定は各施設でおこなわなければならず、結果の施設間差が依然として大きいことが問題点である。このため、 LAの定量的測定は一般に行われていない。

LAと関連する指標に関しては、 Atsimi T et al .， Arthritis Rheum 43 : 1982- 93， 2000で患者血中のホスファチジルセリンと複合体を形成しているプロトロンビン（以下 PS/PTとも称す）とのみ反応する、ホスファチジルセリン依存性抗プロトロンビン抗体（以下 aPS/PTと称す）が LAと強い相関を示すことが報告されている。しかしながら、 LAには、 aPS/PT以外の血液凝固因子/リン脂質複合体に対する抗体の関与も否定できず、これら複合体とは結合しないモノクローナル抗体 aPT/PSが、血液凝固を阻害するか、あるいは LAの標準として用いることができるかは不明であった。発明の開示

本発明の目的は、標準となる抗体を用いた半定量的 LA測定法を確立することにより、従来各施設間で結果の差が大きかった LAの測定を、精度よく実施できるようにすることにある。

本発明者らは、多様な血液凝固因子/リン脂質複合体に対する自己抗体を含む患者血清の、血液凝固に対する阻害活性は、モノクローナル aPS/PTを代表として測定できるという仮説をたて、マウスモノクローナル aPS/PTを作製し、これを標準として凝固活性を測定すれば、各施設間で結果の差が大きかった LAの測定を、精度よく実施できるのではないかと考えた。そして、本発明者らは、プロトロンビン（以下 PTとも称す）とは反応せず、 PS/PTとのみ反応するマウスモノクロ一ナル aPS/PTを作製することに成功し、該モノクローナル抗体が血液凝固反応を阻害すること、該モノクローナル抗体が、 LA測定における標準抗体として使用可能であること、更に該モノクローナル抗体を標準として用いることで精度よくしかも半定量的に LAの測定を実施できることを明らかにした。

本発明者らは、作製したハイプリドーマを 231D細胞、産生される抗体を 231D抗体と命名した。

すなわち本発明は、

1 . ホスファチジルセリンと複合体を形成したプロトロンビンと反応し、ホスファチジルセリンと複合体を形成していないプロトロンビンとは反応しない、血液凝固反応に対する阻害活性を有するモノクローナル抗体。

2 . モノクローナル抗体がマウス由来である、 1に記載のモノクローナル抗体。

3 . モノクローナル抗体が 231D細胞（FEM BP- 7936) が産生する抗体である、 1 に記載のモノクローナル抗体。

4 . (1 ) .被検血漿の血液凝固反応に対する阻害活性、及び、 1〜3のいずれかに記載の抗体の血液凝固反応に対する阻害活性を測定し、

(2) . 被検血漿の阻害活性と 1〜3のいずれかに記載の抗体の阻害活性を比較する

工程を含んでなる、被検血漿の血液凝固反応を阻害する活性を測定する方法。

5 . 4に記載の方法により阻害活性を測定し、阻害活性を指標としてループスァンチコアグラント量を決定することを含む、被検血漿中のループスアンチコアグラントを測定する方法。

6 . 血液凝固反応に対する阻害活性を測定する方法が、活性化部分トロンポプラスチン時間の延長の測定、カオリン凝固時間の延長の測定、希釈ラッセル蛇毒時間の延長の測定のいずれか、あるいはその組み合わせである、 4に記載の方法。. 7 . 1〜 3のいずれかに記載のモノクロ一ナル抗体を構成試薬として含むことを特徴とする、ループスアンチコアグラントを測定する試藥。

8 . ( 1) , ホスファチジルセリンと複合体を形成したプロトロンビンと反応するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を選択し、

(2) . 更にホスファチジルセリンと複合体を形成していないプロトロンビンとは反応しないモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を選択する

工程を含む選択方法により選択された抗体産生細胞が産生するモノクロ一ナル抗体を採取することを含む、 1又は 2に記載のモノクローナル抗体を作製する方法。図面の簡単な説明

図 1は、 231D抗体を標準とした aPTTにおける凝固時間の標準曲線を示す。

図 2は、 231D抗体を標準として測定した、 APS群及び非 APS群における ACUの分布を示す。図中、点線は ACUの基準値（健常人 30人の平均 +2SD) を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の抗体は、ホスファチジルセリンと複合体を形成したプロトロンビン（P S/PT)と反応し、ホスファチジルセリンと複合体を形成していないプロトロンビン（PT)とは反応しない、血液凝固反応に対する阻害活性を有するモノクローナル ίϊ ί本でめる ο

本発明において、抗体が反応するとは、免疫学的に反応することを意味する。また、ホスファチジルセリン（PS)とプロトロンビン（ΡΤ)との複合体とは、生理学的条件に近い条件下（例えば、 pH 7.5、 PS:PS = 3 : 1(重量比）) で PSと ΡΤとが形成する複合体を意味する。血液凝固反応に対する阻害活性は、モノクローナル抗体が反応系に存在するときの、血液凝固反応の指標として用いられる値における変化に基づいて測定することができる。このような値としては、 aPTT、 dRWT、 K CTなどが挙げられる。

本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、マウス由来である。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒトプロトロンビンを免疫した動物（ヒトプ口トロンビンに対する自己抗体を持っているヒトであっても許される）からリンパ球を採取し、不死化した後、 PS/PTとは反応するが PTとは反応しない抗体を産生するクローン（抗体産生細胞）を選択して、そのクローンが産生する抗体を採取することによって作製される。

不死化の方法は特に限定されず、ウィルス（ヒト細胞であれば EBV) を感染させる、あるいは細胞融合させる等の方法により行うことができる。

抗体産生細胞の選択方法は、 PS/PTとは反応するが、 PTとは反応しない抗体が選択される限り、特に限定されないが、抗体産生細胞は、（1) . PS/PTと反応するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を選択し、（2) . 更に PTとは反応しないモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程を含む選択方法により選択されることが好ましい。

PS/PTとは反応するが、 PTとは反応しない抗体は、通常、血液凝固反応に対する阻害活性を有しているが、必要に応じて確認する。

抗体産生細胞が産生する抗体の採取の方法も特に限定されず、細胞培養による方法、マウスの腹水として作製する方法などによりモノクローナル抗体を生産させ、生産されたモノクローナル抗体を、抗体の精製に通常に使用される方法により精製すればよい。

以下に、例としてマウスモノクローナル aPS/PTの作製法について具体的に記載するが、本発明はこれに限られない。

精製あるいは部分精製したヒトプロトロンビン、またはヒト血漿を、必要に応じて免疫原性を高める適当な処理、例えばフロイントコンプリートアジュバンドあるいはフロイントインコンプリートアジュバンドと共にェマルジョンを作る等の処理を施した後、マウスの皮下、腹腔、フットパット等に投与して免疫する。必要であれば、適当な間隔をあけて複数回免疫を繰り返す。

免疫したマウスから、脾臓、リンパ節等の抗体産生細胞を含む臓器を取り出し、そこからメッシュを通してリンパ球を分離する。分離したリンパ球とミエローマ細胞、例えば P3U1細胞の細胞融合を以下の方法で行うが、細胞融合の方法はこれに限られるものではない。

リンパ球と P3U1細胞を 2回 RPMI-1640培地で洗浄し、 5 : 1〜： 10 : 1の割合で混合して HPMI-1640培地に懸濁し、 1500 rpmで 5分間遠心する。細胞塊をほく、した後、 3 7°Cで暖めておいた 50%PEG溶液（ベ一リンガー社製） 1 mlを 2分間かけて徐々に加え、続けて 37°Cに暖めておいた RPMI- 1640培地 20 mlを 3分間かけて徐々に加える。 1000 rpmで 5分間遠心した後、 5分間放置する。

上清を除いた後、リンパ球細胞が 1 X 10⁶/mlになるように 10% FCS/RPMI-1640 培地に懸濁し、 1ゥヱルあたり 100 1ずつ 96ゥエルプレートに分注する。翌日に 10% FCS/2x HAT (Lifetech社製) /RPMI- 1640培地を 1ゥヱルあたり 100〃1ずつ加えハイプリド一マの HAT選択を行って、融合細胞を選択する。ハイプリドーマの増殖を助けるため、同系マウスの胸腺細胞と共に培養を行うか、例えば 1/10量の ORIGEN HCF ( ICGS社製）を加えて培養することが好ましい。適当な日数、好ましくは 1週間から 2週間培養を続け、その培養上清を抗体のアツセィに供する。得られたクローンから、 PS/PTとは反応するが、 PTとは反応しない抗体を産生するクローンを選択する。 PS/PTあるいは PTとの反応は液相で行うことも許されるが、手技が容易な固相で行う場合について以下に説明する。

最初に PS/PTを固相上に形成させ、 PS/PTと反応するクローンを同定する方法を述べる。ホスファチジルセリンを適当な濃度、例えば 50 ig/mlに溶媒例えばメタノールノクロ口ホルムに溶かして ELISAプレート（住友べ一クライト社製）に加えた後、溶媒を蒸発させる。その後、抗体が非特異的に ELISAプレートへ吸着することを防止するために、アルブミン 'カゼイン（スキムミルク） 'ゼラチン等の蛋白質、及び適当な濃度例えば 5 mMの Ca^{2 +}を含む緩衝液（ブロッキング溶液）を ELISAプレートに加え、プロッキングを行う。

洗浄後、ヒトプロトロンビンを適当な濃度、例えば 10 /g/mlになるようにプロヅキング溶液に加えたプロトロンビン溶液を、 ELISAプレートに加える。加えられたヒトプロトロンビンは Ca^{2 +}存在下で、 gla領域を介してホスファチジルセリンと結合し、立体構造が変化した PS/PTが形成される。対照としてヒトプロトロンビンを加えないブロッキング溶液を加えたゥエルも作製する。

採取したハイプリドーマ培養上清を、 PS/PTが形成された ELISAプレートに加え、反応させる。洗浄後、適当な標識、例えばアルカリホスファタ一ゼ 'パーォキシダ一ゼ等の酵素標識、蛍光標識、放射性標識された抗マウス Ig抗体を加えて反応させる。洗浄後、標識に応じた方法、酵素標識であれば酵素の基質を加えて発色させ、蛍光標識であれば蛍光を測定し、放射性標識であれば放射能を測定する。ヒトプロトロンビンを加えなかったゥエルと比較して、ヒトプロトロンビンをカロえたゥエルでより多くの標識が観測されたゥエルに対応するクロ一ンを、 PS/PT と反応する抗体を産生しているクローンとして同定する。

洗浄に用いる緩衝液は適当な濃度、例えば 5 mMの Ca^{2 +}、及び適当な界面活性剤、例えば 0.05% Tween 20を含むことが好ましい。

続いて、 PTと反応しない抗体を産生するクローンを選択する方法を述べる。 EL ISAプレートに、適当な濃度、例えば 10〃g/mlのヒトプロトロンビンを加え、洗浄した後、抗体が非特異的に ELISAプレートへ吸着することを防止するために、アルブミン 'カゼイン（スキムミルク） 'ゼラチン等の蛋白質を含む緩衝液を EL ISAプレートに加え、ブロッキングを行う。

PS/PTと反応したハイプリドーマ培養上清を、 EUSAプレート加え反応させる。洗浄後、適当な標識、例えばアルカリホスファタ一ゼ ·パーォキシダ一ゼ等の酵素標識、蛍光標識、放射性標識された抗マウス Ig抗体を加えて反応さる。洗浄後、標識に応じた方法、酵素標識であれば酵素の基質を加えて発色させ、蛍光標識であれば蛍光を測定し、放射性標識であれば放射能を測定する。標識が観測されなかったゥヱルに対応するクローンを、 PTと反応しない抗体を産生しているクローンとして同定する。

以上に述べた、哺乳類動物の免疫、抗血清の取得、ハイプリドーマの作製、酵素 ί亢体、法 {3文献、 f列 _ ίま Ed Harlow, David Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)に記載の方法により行うことができる。

得られたクローンの細胞を培養した培養上清、あるいはクローンの細胞を接種したマウス腹水より、好ましくはプロテイン Aカラム等により抗体を精製し、精製した抗体が凝固阻害活性を有することを、 aPTT、 dRVVT、 KCTを測定して検討する。

測定は、 aPTT であれば例えば PTT- LA (Diagnostica Stago社）、 dRVVT であれば例えば dRVVT (グラディポア LA、 MBL) 試薬 1、 KCTであれば例えばカオリン（ベ一リンガー）により行う。 PTT-LAと dRVVTは添付文書に従って凝固時間を測定する。また、 KCTはスタンダードあるいはサンプルとカオリン試薬を 50〃1づっ混合して 2分間 37度でインキュベート後、 0. 025 M CaCl ₂を 50 z l追加して凝固時間を測定する。

得られた抗体が、用量依存的に凝固時間を延長することを確認する。

本発明の一態様である 231D抗体は、 231D細胞から得ることができる。 231D細胞は、 2001年 3月 9日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一 (旧名称：産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所、あて名：郵便番号 305- 8 566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番地 1 中央第 6 ) に受託番号 FERM P- 182 47として寄託され、 2002年 3月 5日に、ブタペスト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号 ίΈ BP- 7936が付与されている。

本発明の抗体は、 LAの測定に際し、標準として使用できる。従って、本発明は、本発明の抗体を標準として用いる LAの測定法を提供する。

本発明の LAの測定法は、被検血漿の血液凝固反応を阻害する活性を測定する方法であって、（1 ) .被検血漿の血液凝固反応に対する阻害活性、及び、本発明の抗体の血液凝固反応に対する阻害活性を測定し、

(2) . 被検血漿の阻害活性と本発明の抗体の阻害活性を比較する

工程を含んでなる。

血液凝固反応に対する阻害活性の測定方法は、特に限定されず、血液凝固反応を測定するための反応液に、阻害活性を測定しょうとする物質を加えて血液凝固反応を行い、該物質の血液凝固反応に対する影響を測定することにより阻害活性を測定することができる。

血液凝固反応に対する阻害活性を測定する方法は、好ましくは、活性化部分トロンボプラスチン時間の延長の測定、カオリン凝固時間の延長の測定、希釈ラッセル蛇毒時間の延長の測定のいずれか、あるいはその組み合わせである。

阻害活性の比較は、例えば、血液凝固反応に対する阻害活性を凝固時間の延長の測定により測定する場合には、種々の濃度の本発明の抗体を含む標準試料を調製し、標準試料の凝固時間を Y軸に、本発明の抗体の濃度を X軸にプロットして標準曲線を作成し、被検血漿の凝固時間を標準曲線にのせることによって行うことができる。

また、上記方法により測定された阻害活性を指標としてループスアンチコアグラント量を決定することにより、被検血漿中のル一ブスアンチコアグラントを測定することができる。

以下に、例としてマウスモノクローナル aPS/PTを標準とした LAの測定法について具体的に記載するが、本発明はこれに限られない。

正常血漿を 0.22 /mのフィル夕一を通して血小板を除去し、血小板を除去した血漿に、精製した 231D抗体を適当な段階希釈列、例えば 50〜1. 3 g/mlの 2倍希釈列、及び 0 g/mlとなるように加え標準試料とする。

患者血漿を同様に 0.22 mのフィル夕一を通して血小板を除去し、血小板を除去した患者血漿と、同じく血小板を除去した正常血漿とを、適当な比率、例えば患者血漿：正常血漿 =20 :80 (容量比）で混合して被検血漿とする。

標準試料及び被検血漿の凝固時間を測定する。試薬は aPTTは例えば PTT- LA (Di agnostica Stago社）、 dRWTは例えば dRVVT (グラディポア LA、 MBL) 試薬 1、 KC Tは例えばカオリン（ベ一リンガー）を使用する。 PTT-LAと dRVVTは添付文書に従つて凝固時間を測定する。 KCTはスタンダードあるいはサンプルとカオリン試薬を 50〃1づっ混合して 2分間 37°Cでインキュベート後、 0.025 M CaCl ₂を 50〃1追加して凝固時間を測定する。

各試薬毎に、標準試料の凝固時間を Y軸に、 231D抗体の濃度を X軸にプロットして標準曲線を作成する。被検血漿の凝固時間を標準曲線にのせて、被検血漿の抗凝固活性が 231D抗体の何〃 g/mlに相当するか読み取り、それを被検血漿の ACU (Anticoagulant Unit,抗凝固単位）として表す。また、各試薬で健常人数十名の ACU をしらべて、平均 +2SDで基準値を設定する。

基準値より大きい ACUを示した被検血清が、 LA陽性と判定される。

本発明はさらに、本発明の抗体を構成試薬として含むことを特徴とする、ルーブスアンチコアグラントを測定する試薬を提供する。

本発明の試薬は、標準として使用される本発明の抗体を含む他は、通常のルーブスアンチコアグラント測定試薬と同様の構成でよい。本発明の抗体は、試薬として許容できる担体（緩衝液等）と組み合わせて組成物とされていてもよい。実施例

以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。

[実施例 1 ] マウスモノクローナル aPS/PTの作製

(1 ) .ハイプリドーマの作製

Balb/cマウスに精製ヒトプロトロンビン（ェンザィムリサーチ社製） 50 ngl 匹を完全フロイントアジュバンドとともに 1回、更に不完全フロイントアジュバンドとともに 14日後及び 28日後 2回免疫した。ヒトプロトロンビンに対する抗体価が上昇していることを確認し、最終免疫の 42日後に脾臓を取り出した。脾臓を細切後、メッシュを通してリンパ球を分離した。

分離したリンパ球とミエローマ P3U1細胞を、 5: 1〜； 10: 1の割合で混合して RPMI - 1640培地に懸濁し遠心した。細胞塊をほぐした後、 37°Cで暖めておいた 50%PEG溶液（ベーリンガー社製） 1 mlを 2分間かけて徐々に加えた。続けて 37°Cに暖めておいた RPMI- 1640培地 20 mlを 3分間かけて徐々に加えた。 1000 rpmで 5分間遠心した後、 5分間放置して細胞融合を行った。上清を除いた後、リンパ球細胞が 1 X 10^s/mlになるように 10% FCS/RPMI-1640培地に懸濁し、 1ゥエルあたり 100 z l ずつ 96ゥエルプレート 20枚に分注した。翌日に 10% FCS /2χ ίίΑΤ (Lifetech社製） /RPMI- 1640培地を 1ゥヱルあたり 100 1ずつ加えハイプリドーマの選択を開始した。培養開始 1 2曰後に培養上清を採取し、抗体のァヅセィに供した。

(2) . PS/PTと反応する抗体を産生するクローンの選択

ホスファチジルセリン (シグマ社製) を 50 ig/mlにメタノール Zクロ口ホルム溶媒に溶かし、その溶液を ELISAプレート（住友べ一クライト社製）に 30〃1加え、溶媒を蒸発させた後、アルブミン溶液（10 mg/ml BSA (脂肪酸フリー、シグマ社製）、 5 mM CaCl₂、 150 mM NaCl、 10 mM Tris-HCl pH 7.5) 150〃1を加えブロヅキングを行った。洗浄後、プロトロンビン溶液（ 10〃g/mlヒトプロトロンビン (Diagonostica Stago社製）、 10 mg/ml BSAヽ 5 mM CaCl₂、 150 mM NaCl、 10 mM Tris-HCl pH 7.5) 50〃1を加え、 ELISAプレ一ト上で PS/PT複合体を形成させた。また、対照としてヒトプロトロンビンを加えないアルブミン溶液を加えたゥヱルも作製した。

ELISAプレートを洗浄後、 x20〜xl, 000希釈したハイプリドーマ培養上清 50〃1 を加えて、 ELISAプレート上に形成された PS/PT複合体と反応させた。洗浄後、更にアル力リホスファタ一ゼで標識した抗マウス Ig抗体と反応させ、洗浄した後、アル力リホスファタ一ゼの基質を加えて発色させた。アルブミン溶液を入れたゥエルと比較して、精製ヒトプロトロンビン溶液を入れたゥヱルで発色の強いクロ —ンを、 PS/PTと反応する抗体を産生するクローンとして選択した。

(3) ·ΡΤと反応しない抗体を産生するクローンの選択

ELISAプレートに PBSに溶解した 10〃g/ml精製ヒトプロトロンビン溶液 80〃1を加え、洗浄後、 0.5%ゼラチン溶液を加えブロッキングを行った。

ELISAプレートを洗浄後、（2)で選択されたハイプリドーマ培養上清を x20〜xl, 000希釈して 50 l加え、 ELISAプレート上の PTと反応させた。洗浄後、更にアルカリホスファタ一ゼで標識した抗マウス Ig抗体と反応させた。洗浄した後、アル力リホスファタ一ゼの基質を加えて発色させて、発色しないクローンを PTと反応しない抗体を産生するクローンとして選択した。

PS/PTと反応し、 PTとは反応しない抗体を産生するクローンとして 231D細胞 (FE RM BP-7936 )が選択された。以下 231D細胞が産生する抗体を 231D抗体と称する。

(4) .231D抗体の凝固阻害活性

正常血漿を 0.22 mのフィルターを通して血小板を除去し、血小板を除去した血漿に、精製した 231D抗体を 50, 25, 12.5, 6.3， 3.1, 1.3, O g/mlとなるように加え、それそれの凝固時間を測定した。

試薬は PTT - LA (Diagnostica Stago社) 、續 T (グラディポア LA、 MBL) 試薬 1、カオリン（ベ一リンガー）を使用した。 PTT- LAと dRVVTは添付文書に従って凝固時間を測定した。 KCTはスタンダードあるいはサンプルと力オリン試薬を 50 1づつ混合して 2分間 37°Cでインキュベート後、 0.025 M CaCl ₂を 50〃1追加して凝固時間を測定した。

図 1に代表的な aPPTにおける 231D抗体量と凝固時間の関係を示した。 231D抗体は各凝固系で用量依存的な凝固時間の延長活性を示した。この結果から、 231D抗体が LA測定の標準として使用可能なことが示唆された。

[実施例 2 ] 231D抗体を標準とした LAの測定

( 1 ) . LAの測定法

実施例 1 (4)の結果より、 231D抗体の段階希釈で作成した標準曲線から、 231D 抗体 1 g/mlに相当する被検血漿の抗凝固活性を 1.0 ACU (Anticoagulant Unit, 抗凝固単位）として半定量的測定を行った。具体的には、以下の通り測定を行つた o

正常血漿を 0.22 zmのフィルターを通して血小板を除去し、血小板を除去した血漿に、精製した 231D抗体を 50, 25, 12.5, 6.3， 3.1， 1.3, 0 g/mlとなるように加え標準試料とした。患者血漿を同様に 0.22 / mのフィルタ一を通して血小板を除去し、血小板を除去した患者血漿と、同じく血小板を除去した正常血漿を、患者血漿：正常血漿 = 20 : 80 (容量比）で混合して被検血漿とした。

標準試料及び被検血漿の凝固時間を測定した。試薬は PTT- LA ( Diagnostica Stago社）、 dRVVT (グラディポア LA、 MBL) 試薬 1、カオリン（ベ一リンガー）を使用した。 PTT-LAと dRVVTは添付文書に従って凝固時間を測定した。 KCTはスタンダードあるいはサンプルと力オリン試薬を 50 z lづっ混合して 2分間 37°Cでィンキュべ一ト後、 0. 025 M CaCl ₂を 50〃1追加して凝固時間を測定した。

各試薬毎に、標準試料の凝固時間を Y軸に、 231D抗体の濃度を X軸にプロットして標準曲線を作成した。被検血漿の凝固時間を標準曲線にのせて、被検血漿の抗凝固活性が 231D抗体の何 g/mlに相当するか読み取り、それを被検血漿の ACUとして表した。また、各試薬で健常人数十名の ACUをしらべて、平均 +2SDで基準値を設定した。

(2 ) . APS患者の LAの測定

動 ·静脈血栓症あるいは流産患者合計 47人（APS群であり Tと略）及び血栓症あるいは流産のない患者合計 116人（非 APS群であり non- Tと略）の合計 163人の自己免疫疾患患者を対象として LAを測定した。 ACUが基準値（健常人 30人の平均 +2SD) を超えたものは、 aPTT単独では Tで 17/4 7(36%)であり、 non-Tでは 12/116(10%)であった。また、 dRVVT単独では Τで 13/47 (28%)であり、 non-Tでは 13/116(11%)であった。また、 KCT単独では Τで 21/47(45%) であり、 ηοη-Τでは 25/116 (22%)であった (図 2) 。

aPTT、 dRVVTおよび KCTの 3種類をあわせたとき、いずれかにおいて ACU基準値 (健常人 30人の平均 +2SD) を越えたものは、 T (APS群）で 47人中 22人であり、 non-T (非 APS群）で基準値を越えたものは 1 16人中 3 1人であり、 APSの患者で有意に多かった。

( 3 ) ·ヮ一ファリンの LA測定に及ぼす影響

現在 LA測定に使われているグラディポア試薬は、ヮ一ファリン使用例で擬陽性例が出ることが知られている。そこで、 231D抗体を標準とした LAの測定法に対するヮーファリンの影響を検討した。

その結果、ヮ一フアリンの投与を受けた患者血漿を用いた場合でも、特に影響は見られなかった（表 1) 。表 1

aPTT (ACU) dRVVT (ACV) KCT (ACU)

1 30 20 30

2 >50 >50 >50

LA陽性 3 35 17 34

4 48 >50 >50

5 30 >50 >50

6 15 14 41

7 <3.1 14 3.3

8 <3.1 12 <3.1

ヮ一ファリン使用 9 <3.1 3.5 <3.1

10 <3.1 3.5 <3.1

11 く 3.1 <3.1 <3.1

12 >50 43 >50

LA陽性かつ

ヮーファリン使用

以上の結果より、 231D抗体を用いれば LAの半定量的測定が可能となり、より的確な LAの判定が行えることが明らかとなった。産業上の利用の可能性

LAの標準となるモノクローナル抗体が作製されたこと、及び、該モノクローナル抗体を標準として用いることにより、各施設間で結果の差が大きかった LAの測定が、精度よく、しかも半定量的に実施できるようになる。

Claims

請求の範囲

1 . ホスファチジルセリンと複合体を形成したプロトロンビンと反応し、ホスファチジルセリンと複合体を形成していないプロトロンビンとは反応しない、血液凝固反応に対する阻害活性を有するモノクロ一ナル抗体。

2 . モノクローナル抗体がマウス由来である、請求項 1に記載のモノクロ一ナル抗体。

3 . モノクローナル抗体が 231D細胞（FERM BP-7936) が産生する抗体である、請求項 1に記載のモノクローナル抗体。

4 . ( 1 ) .被検血漿の血液凝固反応に対する阻害活性、及び、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の抗体の血液凝固反応に対する阻害活性を測定し、

(2) . 被検血漿の阻害活性と請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の抗体の阻害活性を比較する

5 . 請求項 4に記載の方法により阻害活性を測定し、阻害活性を指標としてループスアンチコアグラント量を決定することを含む、被検血漿中のループスァンチコアグラントを測定する方法。

6 . 血液凝固反応に対する阻害活性を測定する方法が、活性化部分トロンボプラスチン時間の延長の測定、カオリン凝固時間の延長の測定、希釈ラッセル蛇毒時間の延長の測定のいずれか、あるいはその組み合わせである、請求項 4に記載の方法。

7 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体を構成試薬として含むことを特徴とする、ループスアンチコアグラントを測定する試薬。

8 . ( 1 ) . ホスファチジルセリンと複合体を形成したプロトロンビンと反応するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を選択し、

工程を含んでなる選択方法により選択された抗体産生細胞が産生するモノクロ一ナル抗体を採取することを含む、請求項 1又は 2に記載のモノクローナル抗体を作製する方法。