WO2002074318A1

WO2002074318A1 - Agents de regulation d'expression d'il-12

Info

Publication number: WO2002074318A1
Application number: PCT/JP2002/002433
Authority: WO
Inventors: Akira Asari; Hitoshi Kurihara
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 2001-03-15
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2002-09-26
Also published as: ATE417617T1; JP4234439B2; JPWO2002074318A1; EP1369119A1; CA2440744A1; EP1369119A4; EP1369119B1; CA2440744C; US20040097465A1; DE60230388D1

Description

明細書

I L一 1 2発現調節剤技術分野

本発明は、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、インターロイキン 1 2 ( I L— 1 2) 発現調節剤に関する。

また本発明は、重量平均分子量 60万〜 300万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、インターロイキン 1 2 (I L- 1 2) 発現抑制剤に関する。

また本発明は、重量平均分子量 5万〜 40万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、経口投与用のインターロイキン 1 2 ( I L— 1 2) 発現増強剤に関する。

また本発明は、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、経口投与用のインターロイキン 1 2 ( I L— 1 2) 発現調節剤に関する。背景技術

I L一 1 2は、 3 5 kD (p 3 5) および 40 kD (p 40) の二つのポリぺプチド鎖が結合してなる 70 kDの糖タンパク質（p 70) からなるサイトカインであり、生体の免疫機能の調節において中心的役割を果たしていることが知られている（笠倉新平編、「サイト力イン」、第 2版改訂新版、第 207〜225頁、株式会社 B本医学館発行、 1997年 6月 29曰）。

I L一 1 2は、ヘルパー T細胞の Tヘルパー 1細胞サブセット（Th 1) の分化誘導に働くため、 Th 1の活性化が関連する自己免疫疾患では、病態の進行に促進的に働くことが知られている。

J. Immunol. 165(4), pl863 - 1870 (2000)には、ヒアルロン酸のオリゴ糖は樹状細胞（dendritic cell)の I L一 1 2産生を増加させるが、分子量 80， 000〜200， 000 や分子量 1, 000,000〜600, 000 のヒアルロン酸にはこのような作用がないことが記載されている。しかし、ヒアルロン酸が I L— 1 2の産生を抑制することについては記載も示唆もない。

一方、 I L一 1 2は、ヘルパー T細胞の Tヘルパー 1細胞サブセット（T h 1 ) の分化誘導等に関与するサイトカインとして、微生物感染に対して防御的役割を果たしたり、抗腫瘍効果を有していることが知られている。

J. Immunol. 159 (5) , p2492 - 2500 (1997)には、分子量約 2 8万のヒアルロン酸が、イン■ ビトロ（in vitro)でマク口ファージの IL- 12産生を誘導したことが記载されている。

これに対し、 J. Immunol. 165 (4) , pl863 - 1870 (2000)には、ヒアルロン酸のォリゴ糖（4糖〜1 4糖程度）は樹状細胞（dendritic cell)の I L一 1 2産生を増加させるが、分子量 80, 000〜200，000や分子量 1，000, 000〜600, 000のヒアノレ口ン酸にはこのような作用がないことが記載されている。

このように、ヒアルロン酸による I L _ 1 2産生の促進に関して種々のイン · ビトロの実験が行われてきているが、如何なる分子量のヒアルロン酸が I L— 1 2産生を促進するのかという知見については文献によってまちまちであり、未だ結論をみない。また、いずれの文献もイン ' ビトロでのアプローチであり、実際に医薬、特に投与が最も簡便な「経口投与用の医薬」としての応用を見据えたァプローチはなされていない。

本発明は、ヒアルロン酸を有効成分とする I L一 1 2発現調節剤、 I L— 1 2 発現抑制剤、経口投与用の I L一 1 2発現増強剤、及ぴ経口投与用の I L一 1 2 発現調節剤を提供することを目的とする。発明の開示

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒアルロン酸が I L一 1 2の発現を調節すること、具体的には特定の重量平均分子量のヒアルロン酸が I L— 1 2の発現を抑制する作用を有し、これを使用することにより I L — 1 2発現抑制剤を提供し得ることを見出した。また本発明者は、ヒアルロン酸を経口投与することによつても上記効果を得られることを見出した。さらに本発明者は、特定の重量平均分子量のヒアルロン酸が I L— 1 2の発現を増強する作用を有すること、さらにこの作用は経口投与によっても発揮されることを見出し、これにより経口投与用の I L一 1 2発現増強剤を提供し得ることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成されたものである。

すなわち本発明は、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、 I L一 1 2発現調節剤（以下、本発明調節剤という）を提供する。本発明調節剤は、 I L _ 1 2の発現を抑制し、または増強することができる。

また本発明は、重量平均分子量 6 0万〜 3 0 0万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、 I L一 1 2発現抑制剤（以下、本発明抑制剤という）を提供する。

本発明抑制剤に用いられるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は 6 0万〜 3 0 0万の範囲内のものであるが、好ましくは 6 0万〜 1 2 0万、より好ましくは 7 0万〜 1 2 0万、より好ましくは 7 0万〜 1 1 0万、さらに好ましくは 8 0万〜 1 1 0万、特に好ましくは 8 0万〜 1 0 0万、非常に好ましくは 8 0万〜 9 5万の範囲内のものであり、 8 0万〜 9 0万の範囲内のものが極めて好ましい。

本発明抑制剤は、 I L一 1 2の産生を抑制することが望まれるあらゆる用途に利用することができる。例えば、細胞や組織の I L— 1 2発現抑制用の試薬、生体内の I L - 1 2の発現抑制が望まれる疾患に対する医薬 ·食品等として利用することもできる。

本発明抑制剤は、経口投与用であることが好ましい。

また本発明は、重量平均分子量 5万〜 4 0万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、経口投与用の I L一 1 2発現増強剤（以下、本発明増強剤という）を提供する。

本発明増強剤に用いられるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は 5万〜 4 0万の範囲内のものであるが、 1 0万〜 3 0万の範囲内のものが好ましい。

本発明増強剤は、生体内の I L一 1 2の発現増強が望まれる疾患に対する経口投与用の医薬や、食品等として利用することもできる。

また本発明はヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、経口投与用の I L一 1 2発現調節剤（以下、本発明経口剤という）を提供する。本発明経口剤は、 I L一 1 2の発現を、経口投与によって抑制し、または増強することができる。図面の簡単な説明

図 1は、 H Aの経口投与による、血清 I L— 1 2の減少を示す図である。

図 2は、 H Aの経口投与による、血清 I L一 1 2の増加を示す図である。発明を実施するための最良の形態

< 1 >ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩

本発明において用いるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の由来は特に限定されず、鶏冠、臍帯、ヒアルロン酸を産生する微生物等から分離、精製されたヒアルロン酸を用いることができる。特に、高純度に精製され、医薬や食品として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。

ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリゥム塩、リチウム塩、力リゥム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニゥム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロへキシルァミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩を用いることができる。なかでもヒアルロン酸ナトリゥムであることが好ましい。

本発明調節剤を、 I L— 1 2発現の抑制のために用いる場合については、以下の本発明抑制剤における説明と同様である。また、 I L— 1 2発現の増強のために用いる場合については、以下の本発明増強剤の説明と同様である。したがって、本発明調節剤を I L一 1 2発現抑制のために用いる場合には以下の本発明抑制剤の説明を、また、本発明調節剤を I L一 1 2発現の増強のために用いる場合には、以下の本発明増強剤の説明を、それぞれ参照されたい。

また本発明経口剤を、 I L _ l 2発現の抑制のために用いる場合については、以下の本発明抑制剤における説明（経口投与に関する説明の部分）と同様である。また、 I L— 1 2発現の増強のために用いる場合については、以下の本発明増強剤の説明（経口投与に関する説明の部分）と同様である。したがって、本発明経口剤を I L— 1 2発現抑制のために用いる場合には以下の本発明抑制剤の説明 (経口投与に関する部分）を、また、本発明調節剤を I L一 1 2発現の増強のために用いる場合には、以下の本発明増強剤の説明（経口投与に関する部分）を、それぞれ参照されたい。

本発明抑制剤において用いるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、 60万以上、 300万以下である限りにおいて特に限定されない。後述の実施例に示すように、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は重量平均分子量 84万〜 85万付近において I L一 1 2産生に対して優れた作用を示し、上記のような特定の重量平均分子量の範囲において効果を発揮するものである。本発明抑制剤に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量の下限は 60万、好ましくは 70万、より好ましくは 8 0万であり、その上限は 300万、好ましくは 120万、より好ましくは 1 1 0 万、より好ましくは 1 00万、さらに好ましくは 9 5万、特に好ましくは 90万である。本発明抑制剤に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、さらに好ましくは 84万〜 90万程度である。

本発明抑制剤において用いる前記のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、約 1 1. 5〜44 d lZg、好ましくは約 1 1. 5〜20 d l/g、より好ましくは約 1 3. 0 ~ 20 d 1 Z g、より好ましくは約 1 3. 0〜 1 8. 5 d 1 Zg、さらに好ましくは約 14. 5〜18. 5 d 1 Zg、特に好ましくは約 14. 5〜1 7. 5 d l /g、さらに好ましくは約 14. 5〜1 6. 5 d l /g、非常に好ましくは約 14. 5〜16 d lZg、極めて好ましくは約 1 5〜16 d 1 Zg程度の極限粘度を有するものである。なかでも 1 5 d 1/g付近の極限粘度を有するものが好ましい。

上記のようなヒアル口ン酸またはその薬学的に許容される塩を用いることにより、優れた作用を有する I L— 1 2発現抑制剤とすることができる。一方、本発明増強剤において用いるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、 5万以上、 4 0万以下である限りにおいて特に限定されない。後述の実施例に示すように、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は重量平均分子量 1 0万〜 3 0万の範囲において I L— 1 2産生に対して優れた作用を示し、上記のような特定の重量平均分子量の範囲において効果を発揮するものである。

本発明増強剤に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量の下限は 5万、好ましくは 1 0万であり、その上限は 4 0万、好ましくは 3 0万である。

本発明増強剤において用いる前記のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、約 2〜 8 . 5 d 1 / g、好ましくは約 5〜 7 d 1 / g程度の極限粘度を有するものである。

上記のようなヒアル口ン酸またはその薬学的に許容される塩を用いることにより、優れた作用を有する経口投与用の I L— 1 2発現増強剤とすることができる。なお、本発明抑制剤又は本発明増強剤に使用されるヒアル口ン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、第十三改正日本薬局方：一般試験法 · 第 3 6項粘度測定法に従って極限粘度を測定し、 Laurent らの式（Biochim. Biophys. Acta, 42, 476 (1960) ) によって算出できる。

また、本発明抑制剤及び増強剤に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩中のェンドトキシン濃度の上限値は、本発明抑制剤及び本発明増強剤の具体的用途等に応じて適宜設定することができる。例えば、エンドトキシン非存在下で行うべき実験に用いるための試薬や、血管内に直接投与する医薬等として利用する場合には、溶液形態の剤とした場合において 0 . 3 E UZm L以下であることが好ましい。また、本発明増強剤のように経口投与する場合には、経口投与に問題がない程度として適宜設定することができる。この場合、例えば溶液形態の剤とした場合においては 0 . 3 E U/m L以下であることが好ましい。ェンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のェンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガ- ·ァメボサイト ■ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なお E U (エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（j i s K 8 0 0 8 ) に従って測定 ·算出できる。また、鉄含量は 2 0 p p m以下であることが好ましい。

< 2 >本発明抑制剤又は本発明増強剤の剤型等

本発明抑制剤の、 I L一 1 2産生の抑制が望まれている細胞や組織への適用方法も、本発明抑制剤による I L一 1 2発現抑制効果が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明抑制剤の具体的用途等に応じて適宜選択することができる。例えば、細胞や組織の実験用試薬として用いる場合には、培養液等に本発明抑制剤を添加してこれを用いて細胞や組織を培養してもよいし、細胞ゃ組織に本発明抑制剤を直接添加してもよい。

本発明抑制剤を医薬等として用いる場合には、例えば注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等の方法により投与することができる。このような投与方法に応じて、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等として製剤化することができる。

本発明抑制剤中のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の濃度も特に限定されないが、 0 . 5〜1 0 % (w/v)とするのが好ましい。特に本発明抑制剤を注射剤として提供する場合には、 l〜5 % (w/v)程度とするのが好ましく、 1〜 3 % (w/v)程度とするのがより好ましく、 1〜 2 % (w/v)程度とするのがさらに好ましい。また本発明抑制剤を経口投与用の製剤、例えば液剤とする場合には、 0 . l °/o (w/v)以上とすることが好ましく、 0 . l〜l % (w/v)程度とすることがより好ましい。

一方、本発明増強剤は、 I L一 1 2産生の増強が望まれている動物に適用するために経口投与されるものである。本発明増強剤は、経口投与の目的や対象等に応じて、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、吸入散剤等として製剤化することができる。本発明増強剤中のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の濃度も特に限定されないが、 0 . 5〜1 0 °/₀ (w/v)とするのが好ましい。例えば本発明増強剤を経口投与用の液剤とする場合には、 0 . 5 % (w/v)以上とすることが好ましく、 0 . 5〜 2 % (w/v)程度とすることがより好ましい。

本発明抑制剤及び本発明増強剤の製剤化は、公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壌剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。

< 3 >本発明抑制剤又は本発明増強剤を医療用途に用いる場合の投与対象等本発明抑制剤が投与される動物は、脊椎動物、特に哺乳動物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。本発明抑制剤は、これらの動物における I L— 1 2産生の抑制を目的とした医薬として投与することができる。 I L— 1 2の産生の抑制を目的とする限りにおいて適用可能な疾患は限定されず、例えば、 I L— 1 2がその病勢の進行に促進的に働く T h 1の活性化が病因となる疾患が例示される。このような疾患として具体的には、接触性皮膚炎、自己免疫性プドウ膜網膜炎、ァレルギ一性脳脊髄膜炎、インスリン依存性糖尿病、糖尿病、橋本氏病、多発性硬化症、リゥマチ性関節炎、シニーグレン症候群、クローン病、サルコィドーシス、乾癬、リポ多糖誘発肝壌死、半月体形成性腎炎、全身性エリテマトーデスなどが挙げられる。従って本発明抑制剤は、これらの疾患の処置剤としての思想をも包含する。本発明抑制剤を医薬として用いる場合、その投与は純然とした治療目的のみならず、疾患の予防、進行抑制（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的とすることもできる。

本発明抑制剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の配合量、 1回あたりの投与量、投与間隔等は、本発明抑制剤の投与方法、投与形態、使用目的等、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり特に限定されないが、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の臨床量として、注射による非経口投与の場合、成人 1人 1回当り 5〜2 5 mg、 1日当り 1 0〜 5 O rag、経口投与の場合、成人 1人 1回当り 5 0〜2 5 O mg、 1 日当り 1 0 0〜5 0 O mg程度の投与量が例示される。また本発明抑制剤の投与間隔は、 1日 1回程度でもよく、 1日 2〜 3回に分けて投与することもできる。また 1 S〜3日に 1回程度投与してもよい。

本発明増強剤が投与される動物も、脊椎動物、特に哺乳動物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。本発明増強剤は、これらの動物における I L— 1 2産生の増強を目的とした医薬として経口投与することができる。 I L— 1 2の産生の増強を目的とする限りにおいて適用可能な疾患は限定されず、例えば、微生物感染による疾患、ウィルス疾患（例えば、 A I D Sや C型肝炎等）、腫瘍（ガン）、 I L一 1 2の産生低下に起因する疾患などが挙げられる。従って本発明増強剤は、これらの疾患の処置剤としての思想をも包含する。本発明増強剤を医薬として用いる場合、その投与は純然とした治療目的のみならず、疾患の予防、進行抑制（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的とすることもできる。

本発明増強剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の配合量、 1回あたりの投与量、投与間隔等は、本発明増強剤の投与方法、投与形態、使用目的等、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり特に限定されないが、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の臨床量として、注射による非経口投与の場合、成人 1人 1回当り 5〜2 5 mg、 1日当り 1 0〜 5 O mg、経口投与の場合、成人 1人 1回当り 5 0 ~ 2 5 O mg、 1 日当り 1 0 0〜 5 0 O mg程度の投与量が例示される。また本発明増強剤の投与間隔は、 1日 1回程度でもよく、 1日 2〜 3回に分けて投与することもできる。また 1曰〜 3日に 1回程度投与してもよい。

なおヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、医薬品、化粧品、食品等に既に利用されており、安全性が高いことが知られている。実施例

以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。

[実施例 1] I L— 1 2の発現抑制について

< 1〉被験物質

本実施例において用いた被験物質は以下の通りである。

- リン酸緩衝生理食塩水（ P B S )。

■ ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量 84万；極限粘度 15.0dl/_g)。以下、このヒアノレロン酸ナトリウムを HAという。

H Aは、以下の薬効薬理試験に応じて所定の濃度となるように PB Sに溶解して用いた。 PB Sに溶解した後のエンドトキシン濃度はいずれも 0. 3 EU/m L以下であり、また鉄含量はいずれも 20 p pm以下であった。

< 2 >薬効薬理試験

(1) マクロファージにおける I L— 1 2 p 40産生の減少

4週齢の雄性 C 5 7 B L/6マウス（日本チヤ一ルスリパー株式会社）の腹腔に 5〜7m 1の氷冷ハンクス液を注入し、 5分後に回収することにより常在性腹腔細胞を採取した。採取した細胞を、 96穴平底プレートで、 DMEM培地により、 37°C、 5%CO₂ の条件下一晩培養した。培養後、浮遊細胞を除き、付着細胞を腹腔マクロファージとして実験に用いた。

種々の濃度の HAを含む培地に、 I L一 1 2産生を刺激するためにリポ多糖（L P S ) (List Biological Laboratories, Inc. ) を終濃度 1 μ g /mlとなるように添加して、細胞を 24時間処理した。その後、細胞培養上清中の I L一 1 2 (p 40) の濃度を Mo u s e I L - 1 2 (p 40) EL I SAキット（E n d o g e n社）を用いて測定し、 I L一 1 2の産生を評価した。なお実験は 3回行い、その平均値を算出した。結果を以下に示す。無処理 LPS のみ LPS + 10 M g/ml H A LPS 4- 100 g/ml H A

0 . 0 2 6 . 8 2 1 . 3 1 8 . 5

(単位： pg/ml)

この結果から、重量平均分子量 84万程度の高分子量ヒアルロン酸ナトリウムが、 I L— 1 2産生を抑制することが示された。

またこれとは別個に、他の重量平均分子量（60万又は 270万；極限粘度はそれぞれ 11.5dl/g， 40.5dl/g) のヒアルロン酸ナトリウム（1 00 /i g/m l ) を用いて同様に実験を行った。実験は 3回行い、その平均値を算出した。

その結果、細胞培養上清中の I L一 1 2 (p 40) の濃度は、 LP Sのみの場合が 65. 1 pg/ml (4. 6)、 L P S +重量平均分子量 60万のヒアルロン酸ナトリウムの場合が 56. 0 pg/ml (5. 1)、 L P S +重量平均分子量 270万のヒアルロン酸ナトリウムの場合が 60. 0 pg/ml (7. 7) であった。なおカツコ内の数字は標準誤差を示す。

この結果から、いずれのヒアルロン酸ナトリゥムも I L一 1 2産生を有意に抑制するものではなかったものの、わずかながら抑制する傾向がみられた。そしてその傾向は分子量 60万の方が若干高かった。

(2) H A投与による血清 I L一 1 2の減少

4週齢の雄性 C 5 7 B LZ 6系マウス（本チヤ一ルスリバ一株式会社）を入手し、 PB S投与群（n= 5) と、 HA投与群（n= 5) に分けた。

HAを 1 OmgZm 1含有する PB S溶液を、 1回あたり 80 mg/kg体重となるように経口投与した。経口投与は、滅菌済の lmlデイスポーザプル注射筒および滅菌済み経口ゾンデを用いて常法により行った。投与は 1日 2回で 2週間、毎曰行った。

投与終了後、眼窩静脈叢から採血し、 I L一 1 2 (p 40) の血漿中濃度を、 Mo u s e I L— 1 2 (p 40) EL I S Aキット（En d o g e n社）を用いて測定し、平均値および標準偏差を算出した。結果を図 1に示す。

この結果から、重量平均分子量 84万程度の高分子量ヒアルロン酸ナトリウムを経口投与することによつても、 I L— 1 2産生を抑制できることが示された。

[実施例 2] I L— 1 2の発現増強について

< 1 >被験物質

本実施例において用いた被験物質は以下の通りである。

• リン酸緩衝生理食塩水（P B S)。

- ヒアル口ン酸ナトリウム（重量平均分子量 10万〜 20万；極限粘度 3 dl/g 〜5dl/g)。以下、このヒアルロン酸ナトリウムを「HA10— 20」という。

，ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量約 30万；極限粘度約 7 dl/g)。以下、このヒアノレロン酸ナトリウムを「HA30J という。

HAは、以下の薬効薬理試験に応じて所定の濃度となるように PB Sに溶解して用いた。 PB Sに溶解した後のエンドトキシン濃度はいずれも 0. 3 EU/m L以下であり、また鉄含量はいずれも 20 p pm以下であった。

< 2 >薬効薬理試験

(1) HA10— 20投与による血清 I L_ 1 2の増加

4週齢の雄性 C 5 7 B L/ 6系マウス（日本チヤ一ルスリバ一株式会社）を入手し、 PB S投与群（n = 5) と、 HA10— 20投与群（n= 5) に分けた。

HA10-20を 1 Omg/m 1含有する P B S溶液を、 1回あたり 80 mg/kg体重となるように経口投与した。経口投与は、滅菌済の lmlデイスポーザプル注射筒および滅菌済み経口ゾンデを用いて常法により行った。投与は 1日 2回で 2週間行った。

投与終了後、眼窩静脈叢から採血し、 I L一 1 2 (p 40) の血漿中濃度を、 Mo u s e I L— 1 2 (p 40) EL I SAキット（En d o g e n社）を用いて測定し、平均値および標準偏差を算出した。結果を図 2に示す。

この結果から、重量平均分子量約 10万〜 20万程度の低分子量ヒアルロン酸ナトリゥムを経口投与することにより、 I L一 1 2産生を増強できることが示された。

(2) HA30投与による血清 I L— 1 2の増加

4週齢の雄性 C 5 7 B L/ 6系マウス（日本チヤ一ルスリバ一株式会社）を入手し、 PB S投与群（ιι= 5) と、 HA30投与群（n = 5) に分けた。

HA30を 100 g /m 1含有する P B S溶液を、 1回あたり 0.5ml (約 2.5mg/kg 体重）経口投与した。経口投与は、前記と同様に常法により行った。投与は 1日 1回で 1 3日間、毎 B行った。

投与終了後、眼窩静脈叢から採血し、 I L一 1 2 (p 40) の血漿中濃度を前記と同様に測定し、平均値および標準誤差を算出した。結果（平均値土標準誤差）を以下に示す。

P B S投与群： 151.5±18.4 (pg/ml)

HA30投与群： 212.8±23.6 (pg/ral)

またスチューデントの T検定（Student' s T_test)により、この結果は pく 0.05で有意であった。

以上の結果から、重量平均分子量 30万程度の低分子量ヒアルロン酸ナトリウムを経口投与することにより、 I L— 1 2産生を有意に増強できることが示された。以上より、 I L— 1 2の産生に関して分子量 60万のヒアルロン酸は若干抑制する傾向がみられ、分子量 84万のヒアルロン酸では顕著な抑制がみられ、分子量 270万では極めてわずかながらも抑制する傾向がみられた。一方、分子量 1 0万〜 30万程度のヒアルロン酸ナトリゥムは逆に I L— 1 2の産生を増強した。これらの結果を総合的に勘案すると、ヒアルロン酸は分子量 84万付近を中心に前後 30万程度（分子量 60万〜 1 20万）の範囲内で、 I L— 1 2の発現抑制作用を発揮すると考えられる。本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとつて明らかである。

本出願は、 2001年 3月 15 日出願の日本特許出願（特願 2001— 074077)、 2001 年 3月 15 日出願の日本特許出願（特願 2001— 074078) に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。産業上の利用可能性

ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする本発明調節剤は、 I L一 1 2の発現の調節（発現の抑制や増強）が望まれている細胞や組織の処置に極めて有用である。

特定の重量平均分子量の高分子量ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする本発明抑制剤は、前記薬効薬理試験の結果からも明らかな通り、 I L一 1 2の産生を抑制する効果を発揮することから、 I L— 1 2産生の抑制が望まれている細胞や組織の処置に極めて有用である。

特に、本発明抑制剤は経口投与によっても I L一 1 2発現抑制作用を発揮でき、さらに天然物由来の物質を素材としていることからその安全性も高く、有用性が極めて高い。

一方、特定の重量平均分子量の低分子量ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする本発明増強剤は、前記薬効薬理試験の結果からも明らかな通り、経口投与により I L一 1 2の産生を増強する効果を発揮することから、 I L— 1 2産生の増強が望まれている動物の処置に極めて有用である。

特に本発明増強剤は、天然物由来の物質を素材としていることからその安全性も高く、有用性が極めて高い。

また本発明経口剤は、経口投与により患者に簡便に投与できることから、極めて有用である。

Claims

請求の範囲

1 . ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ィンターロイキン 1 2発現調節剤。

2 . 重量平均分子量 6 0万〜 3 0 0万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、インターロイキン 1 2発現抑制剤。

3 . ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が 6 0万〜 1 2 0万の範囲にある、請求の範囲第 2項に記載の抑制剤。

4 . ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が Ί 0万〜 1 2 0万の範囲にある、請求の範囲第 2項に記載の抑制剤。

5 . ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が 7 0万〜 1 1 0万の範囲にある、請求の範囲第 2項に記載の抑制剤。

6 . ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が 8 0万〜 1 1 0万の範囲にある、請求の範囲第 2項又は第 3項に記載の抑制剤。

7 . ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が 8 0万〜 1 0 0万の範囲にある、請求の範囲第 2項又は第 3項に記載の抑制剤。

8 . ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が 8 0万〜 9 5万の範囲にある、請求の範囲第 2項又は第 3項に記載の抑制剤。

9 . ヒアル口ン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が 8 0万〜 9 0万の範囲にある、請求の範囲第 2項又は第 3項に記載の抑制剤。

1 0 . 経口投与用である、請求の範囲第 2項〜第 9項のいずれか 1項に記載の抑制剤。

1 1 . 重量平均分子量 5万〜 4 0万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、経口投与用のインターロイキン 1 2発現増強剤。

1 2 . ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が 1 0万〜 3 0万の範囲にある、請求の範囲第 1 1項に記載の増強剤。

1 3 . ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、経口投与用のインターロイキン 1 2発現調節剤。