WO2002042331A1 - Factor de crecimiento fibroblastico basico con un dominio de union especifico a colageno - Google Patents

Factor de crecimiento fibroblastico basico con un dominio de union especifico a colageno Download PDF

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WO2002042331A1
WO2002042331A1 PCT/ES2001/000449 ES0100449W WO0242331A1 WO 2002042331 A1 WO2002042331 A1 WO 2002042331A1 ES 0100449 W ES0100449 W ES 0100449W WO 0242331 A1 WO0242331 A1 WO 0242331A1
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rhbfgf
collagen
protein
growth factor
binding domain
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PCT/ES2001/000449
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José Antonio ANDRADES GOMEZ
José BECERRA RATIA
Frederick L. Hall
Marcel E. Nimni
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Universidad De Malaga
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention has its application within the biomedical industry dedicated to the manufacture of agents that are involved in tissue repair in general and, more specifically, in wound healing processes.
  • Fibroblastic growth factors were first isolated in the 1970s from bovine brain extracts, based on their mitogenic and angiogenic character. Subsequent studies established that FGFs constitute a family of twenty structurally related monomeric proteins (molecular weight between 16,000 and 18,000), with various activities, and are produced at some time during the development of tissues such as epithelium, muscle, connective and nerve tissue. Because the FGFs have lost the signal peptide sequence, which determines in other growth factors their extracellular secretion via rough endoplasic reticulum / Golgi apparatus, it has been suggested that their release outside the cell can occur following a 'route independent exocytic (see . Mignatti P. et al., J.
  • FGFs belong to the growth factor group
  • FGFs are released through the action of heparinases (see Saskela O. et al., J. Cell Biol. (1990), 110: 767-775).
  • FGFs regulate survival, apoptosis, adhesion, motility and cell differentiation. These effects of FGFs on cellular functions depend on the biochemical state and environment of their target cells.
  • bFGF human bFGF
  • isoforms of the factor (18, 22, 23 and 24 kDa) can be expressed from a single mRNA transcriptionist (see Florkiewicz RZ et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. (1989), 86: 3978 -3981). These isoforms of bFGF appear in different places in the nucleus (the 22, 23 and 24 kDa), the cytoplasm or the cell surface (the 18 kDa).
  • bFGF degrades rapidly when injected or ingested, losing up to 99% of its mitogenic activity in a short time.
  • the preservation and stabilization of bFGF is achieved when the factor is bound to heparin-sepharose spheres. This allows its prolonged storage, repeated manipulations, as well as its slow and controlled release (see Edelman ER et al., Biomaterials (1991), 12: 619-626).
  • the FGF family is a large group of cytokines that exert a profound influence on the physiology of wound healing. Its mode of action in wound healing includes the modulation of stem cell populations, as well as the expression of specific genes that code for matrix proteins, cell receptors, matrix proteinases and protease inhibitors.
  • the genetic design and large-scale expression of a human recovering bFGF in the Escherichia coli bacteria has been carried out, as well as its purification and renaturation until reaching its maximum biological activity.
  • the advantage of this factor is that it has incorporated a modified amino acid auxiliary domain, with high specific binding affinity to collagen, which gives it unique and exclusive properties.
  • this growth factor called rhbFGF-F2
  • rhbFGF-F2 can be stored for a long time and directed to specific places where its action is required (for example wound repair / healing), controlling its release and preserving its biostability, accentuating thus its potential as a possible therapeutic agent due to its role in wound healing and other tissue repair processes.
  • the present invention is useful for generating large amounts of biologically active hbFGF from prokaryotic microorganisms.
  • This system unlike the one developed in eukaryotic cells from the RNA, 'where material availability is the limiting factor, provides a virtually inexhaustible source for the expression, synthesis and secretion of proteins, only dependent cell volume (bacterial) with which the cultivation begins.
  • bFGF itself, have developed a method that especially • performance increases as the amount of native protein obtained purified, fidelity in the process of protein renaturation, efficiency and shortening of the dialysis procedure, and the achievement of the maximum rate of biological activity.
  • the present invention is also useful for manufacturing hbFGF under the conditions described above and incorporating an auxiliary amino acid molecular domain into its primary structure (corresponding to the modified domain of von Willebrand factor, specific binding to type I collagen).
  • This modification seeks to deliver the resulting fusion protein, rhbFGF-F2, to specific cell-tissue targets, so that it exerts the desired function there. Given the recognized role that the FGF plays in the early stages of the tissue repair process
  • the present invention provides a rhbFGF-F2 that significantly accelerates the healing of cutaneous wounds of total or partial incision.
  • the utility of this patent in this aspect is further reinforced when the FGF produced is applied ectopically mixed with a type I collagen gel, causing a faster wound healing rate.
  • the present invention has a clinical utility in that it develops a rhbFGF-F2 which, combined with a type I collagen gel and applied ectopically on total or partial wounds, reduces the healing time in diabetic animals until it is taken to terms comparable to normal animals.
  • Figure 1 is the representation of the design of (A) TA cloning vector and expression vector pET28b; (B) fusion proteins: rhbFGF-F2, which incorporates the WREPSFMALS amino acid sequence of von Willebrand factor (vWF), and rhbFGF-Fl lacking said sequence.
  • Figure 2 is the SDS gel for expression and purification of fusion proteins.
  • Lane 1 indicates the molecular weight of the marker.
  • Lanes 2- and 5 show the rhbFGF-Fl and -F2 proteins respectively, before induction.
  • Lanes 3 and 6 correspond to the rhbFGF-Fl and -F2 proteins, respectively, after induction.
  • Lanes 4 and 7 show the proteins in their purest form. The Slight lag of the band in lane 7 with respect to the lane of lane 4 corresponds to the greater molecular weight of rhbFGF-F2, introduced by the amino acid sequence corresponding to von Willebrand factor.
  • Figure 3 shows (A) an SDS gel indicating the different oxide-reduction conditions tested in protein renaturation, and the one that offers the highest yield in obtaining protein, and (B) shows how said redox condition It is the one that offers the greatest biological activity to each protein.
  • Figure 4 represents the biological activity, in terms of cell proliferation, of rhbFGF-F2 under the different dialysis conditions tested. Buffer A with 250 mM NaCl and 20% sucrose favors the maximum biological activity of the protein.
  • Figure 5 shows how the biological activity, in terms of cell proliferation, of rhbFGF-Fl (open circle) and rhbFGF-F2 (closed circle), obtained under the condition of optimal dialysis, is comparable to the biological activity of commercial protein (triangle).
  • Figure 6 represents the binding force of fusion proteins to type I collagen.
  • Figure 7 shows (A) a dose-binding kinetics dependent on 3 H-rhbFGF-Fl and 3 H-rhbFGF-F2 to type I collagen, after digestion of the collagen with 0.5 ml of collagenase (100 ü / ml). Collagen binding affinity shown by rhbFGF-Fl is due to non-specific interactions.
  • (B) it is observed that both fusion proteins continue to maintain their biological activity, in terms of cell proliferation, after they are released from type I collagen.
  • Figure 8 is a bar graph corresponding to the results of the macroscopic examination on the speed of wound healing, both in normal and affected rats of diabetes. Ectopic treatment of wounds is indicated in each case.
  • Cytoplasmic RNA was obtained from human umbilical endothelial cells, and was transcribed into a single chain of cytoplasmic DNA (cDNA) using antiseritide primers corresponding to the region encoding bFGF.
  • cDNA cytoplasmic DNA
  • the bands that were obtained were purified from the agarose gel by means of the Geneclean kit (Bio 101) and introduced into a vector following the cloning strategy TA (Invitrogen). Clones selected by color were isolated and analyzed by restriction mapping, followed by a nucleotide sequence determination.
  • the first one we used for the construction of bFGF was one of 50 nucleotides of sequence 5'-CAT ATG TGG CGC GAA CCG AGC TTC ATG GCT CTG AGC GGT GCT AGC ATG GCA G-3 ', designed to include two parts: 7 nucleotides corresponding to the sequencing of bFGF linked to 30 nucleotides encoding a peptide modified with collagen binding capacity (see Tuan TL et al., Connect. Tissue Res. (1996), 3_4: 1-9).
  • the resulting construct is introduced into the expression vector pET28b (Novagen), which has a histidine purification sequence at its amino terminal.
  • the pET-hbFGF-Fl and pET-hbFGF-F2 constructs were transformed into the BL21 (DE3) chain of E. coli.
  • a single clone was inoculated in primary culture that was diluted to obtain a final volume of 500 ml with 2YT medium, which contained kanamycin (100 ⁇ g / ml). After 2-3 hours of growth and culture reached an adequate level of growth (optical density A600 0.7 to 1.0) proteins were induced in the presence of ImM IPTG for '5 hours at 37 ° C.
  • the bacterial decants were obtained by centrifugation at 5000 g for 10 minutes, washed with buffer A (20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0.05% NP-40, pH 8.0) and used with 0.4 mg / ml lysozine, 5 ng / ml DNase, 0.8 mM PMSF and 10 mM ⁇ -mercaptoethanol in 1/10 of the original volume of the cell suspension. Lysis was facilitated by sonication and homogenization with a Brinkmann Polytron at 25K for 2 cycles of 30 seconds each, followed by centrifugation at 10,000 g for 20 minutes at 4 ° C, to obtain bacterial inclusion bodies by decantation.
  • the inclusion bodies were solubilized in 6 M guanidine-HCl, 0.1 M phosphate buffer, pH 8.0, at room temperature in 1/10 of the original cell volume, allowing it to decant at room temperature for 1.5 hours with sporadic agitation.
  • the solubilized fusion proteins were separated from insoluble impurities by centrifugation at 20,000 g.
  • the samples were diluted to obtain a concentration of 0.20 mg / ml in 8 M urea, pH 8.0.
  • the oxide-reduction buffer A with 2 mM reduced glutathione (GSH), 0.2 mM oxidized glutathione (GSSG) and 1 mM DTT was used for renaturation. It was cooled on ice for 30 minutes and slowly added to the purified fusion proteins until the urea was diluted to 1.3 M (6X dilution factor) and oxidative renaturation began. After stirring with intensity, the fusion proteins were allowed to stand at 4 ° C overnight to allow them to reach their thermodynamically stable structures.
  • the samples were dialyzed overnight in S buffer (250 mM NaCl, 20 M Tris-HCl, 20% sucrose, pH 8.0). A centrifugation was performed at 10,000 g for 20 minutes at 4 ° C, the optical density was measured to calculate the final protein concentration, the preparations were lyophilized and reconstituted in 0.1% BSA / 4 mM HC1 before freezing.
  • HVEC human vein endothelial cells
  • DMEM Dulbecco Eagles Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM fetal calf serum
  • the inclusion bodies containing the rhbFGF-Fl and rhbFGF-F2 constructs were isolated by centrifugation and radioactively labeled by a method developed in our laboratory (see Cheung DT et al., Anal. Bioche. (1981), 116 : 69-74). Briefly, the inclusion bodies were dehydrated with DMF (Sigma) in glass test tubes, which were then added
  • the growth factors and their saline diluent were also applied to wounds mixed in a type I collagen gel from rat tail tendon (Collaborative Research).
  • the collagen is dissolved in 0.1 M acetic acid, the pH neutralized to 7.2, and the resulting solution mixed with DMEM to obtain a final concentration of 0.35 mg / ml.
  • the mixture of the bFGFs or the saline diluent and the type I collagen solution are incubated at 37 ° C for 15 minutes to obtain a fine collagen gel matrix.
  • Daily applications are performed under anesthesia for three days, then follow up macroscopic healing. Other animals are sacrificed by means of a dose of 75 mg / kg of Nembutal 10 or 21 days after the realization of the wounds.
  • Pieces of the skin under treatment are taken and processed histologically, stained with hematoxylin-eosin, and immunocytochemically with anti-collagen type IV, anti-fibronectin and anti-laminin antibodies developed in rabbit (Chemicon International), in order to determine The evolution of the healing process.
  • hbFGF fusion proteins As shown in Figure 1, by RT-PCR techniques and recombinant DNA technology, we have developed two hbFGF fusion proteins. One of them incorporates a high-affinity molecular domain of type I collagen binding. It is the incorporation into the protein of a decapeptide from von Willebrand factor (vWF), responsible for the recognition of collagen sequences in blood vessels, and at that the original cysteine has been replaced by a methionine, in order to facilitate the renaturation process. Thus, the incorporated decapeptide is the one corresponding to the WREPSFMALS sequence, and the resulting fusion protein, rhbFGF-F2, develops a special ability to specifically bind type I collagen.
  • vWF von Willebrand factor
  • the rhbFGFs fusion proteins have been expressed at high levels in transformed bacteria (strain BL21-DE3) that carry the T7 polymerase system. In the presence of 1 mM of IPTG, the expression levels of rhbFGFs reached 50% of the total cellular protein, as determined by SDS-PAGE gel electrophoresis ( Figure 2). Proteins were isolated from inclusion bodies collected after bacterial cell lysis. To prevent co-sedimentation of cells and cell debris, the initial lysis was improved with combination of an attic treatment with lysozyme (0.4 • mg / ml), homogenization and sonication. Because proteins originating in inclusion bodies contain varying amounts of disulfite type intercatenary junctions, 10 mM ⁇ -mercaptoethanol was added to the lysis buffer in order to break up such junctions.
  • the samples attached to the column were washed with 8M urea, pH 8.0, followed by a more intense wash with 8 M urea, pH 6.5, followed by a final elution of the 8 M urea purified proteins at pH 4.0.
  • the yield was 6 mg of rhbFGF-Fl and 8 mg of purified rhbFGF-F2, from 100 ml of bacterial culture.
  • the rhbFGF-Fl and rhbFGF-F2 proteins were lyophilized. Reconstitution of the protein lyophilisate for later use was done with a 4M HC1 solution and 0.1% BSA. However, under these conditions we detect a loss of biological activity of two units with respect to the newly dialyzed samples. The problem is solved when the dialyzed samples are simply frozen at -20 ° C.
  • Verification of the affinity of the rhbFGF-F2 fusion protein to type I collagen was addressed by two strategies.
  • 100 ng of the newly dialyzed protein was loaded on a Collagen coated Sephadex G15 column.
  • all loaded protein was attached to the column, according to an immediate protein analysis performed on the eluent. Attempts to elute the protein from the column using a gradient of 2M NaCl or urea, solutions usually employed in the elution of proteins under these conditions, were useless, suggesting that rhbFGF-F2 is strongly bound to the column.
  • rhbFGF-F2 was loaded on a Ni-NTA column, to subsequently pass a type I H-collagen solution. Most of the loaded radioactive collagen was retained in the column, according to an immediate protein analysis performed. to the eluent. The column was washed with a linear NaCl gradient from 0.15 to 2 M, without achieving any elution of radioactive collagen, which showed the strong binding to rhbFGF-F2. As shown in Figure 6, only the application of a linear gradient of urea from 0 to 4
  • hbFGF-F2 a fusion protein that incorporates a molecular domain of ten amino acids, which gives the factor the ability to bind with very high affinity to type I collagen.
  • This fusion protein which we have called rhbFGF-F2
  • rhbFGF-F2 can be led to the MEC directly or mixed with implantable collagen matrices (in the form of gels or solids).
  • the amino acid domain used in this construction has been the WREPSFMALS decapeptide, which corresponds to a modification of von Willebrand's ' factor, which has a high specific affinity for binding to collagen or gelatin (see Takagi J. et al., Biochem.
  • rhbFGF-F2 also does not show any loss in its renaturation process, when compared to rhbFGF-Fl (lacks the amino acid domain), maintaining a biological activity comparable to commercial hbFGF, when measures proliferation rate in HVEC cultures.
  • BFGF is a multifunctional growth factor whose biological properties suggest a major role in wound healing. This is a complex process that begins with an inflammatory phase and the release of blood components to the wound, which activate a clot-forming cascade and provide a matrix for the influx of inflammatory cells. The incarnation tissue is then started to form a dense population of fibroblasts and macrophages embedded in a loose matrix of collagen, fibronectin and hyaluronic acid, ie the ECM. Endothelial cells proliferate in the wound and new blood vessels (angiogenesis) are formed to deliver nutrients and oxygen to the injured area, essential contribution to the synthesis, deposition and organization of the ECM (see Satoh H. et al., Jpn. J.
  • bFGF is a pleiotropic agent that stimulates, inhibits and modulates cellular processes in a time- and dose-dependent manner, it is essential to control its release to the desired place and its bioavailability while its action as a therapeutic agent is needed.
  • the treatment of wounds with rhbFGF-F2 accelerated the healing process for both normal and diabetic rats, obtaining maximum significance when the fusion protein was applied to the wound combined with type I collagen gel.
  • This dressing not only managed to accelerate the closure of the wound in normal rats compared to commercial hbFGF, but also canceled out the delay that occurred in the healing response in diabetic animals (complete healing at 13 days, approximately the same time that normal rat wounds need to heal when treated with saline alone).

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Abstract

Factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF)con un dominio de unión específico a colágeno, obtenido mediante tecnología de ADN recombinante, que incluye un fragmento de 10 aminoácidos que corresponde al dominio de unión a colágeno modificado del factor von Willebrand (vWF). El nuevo factor de liberación controlada, se utiliza como agente terapéutico en la cicatrización de heridas y en otros procesos de reparación tisular.

Description

Titulo
Factor de crecimiento fibroblástico básico con un dominio de unión especifico a colágeno.
Sector de la técnica
La presente invención tiene su aplicación dentro de la industria biomédica dedicada a la fabricación de agentes que intervienen en la reparación de tejidos en general y, más concretamente, en los procesos de cicatrización de heridas .
Estado de la técnica
Los factores de crecimiento fibroblástico (FGFs) fueron aislados por primera vez en los años 1970 a partir de extractos de cerebro bovino, basándose en su carácter mitogénico y angiogénico. Posteriores estudios establecieron que los FGFs constituyen una familia de veinte proteínas monoméricas estructuralmente relacionadas (peso molecular entre 16000 y 18000) , con diversas actividades, y son producidos en algún momento durante el desarrollo de tejidos tales como epitelio, músculo, conectivo y tejido nervioso. Debido a que los FGFs han perdido la secuencia del péptido señal, el cual determina en otros factores de crecimiento su secreción extracelular via retículo endoplás ico rugoso/aparato de Golgi, se ha sugerido que su liberación fuera de la célula puede darse siguiendo una' ruta exocitica independiente (véase. Mignatti P. y colaboradores, J. Cell Biochem. (1991), 7_: 201-207). Las lesiones por heridas provocan una importante liberación de FGFs, ya que la membrana plasmática de las células dañadas se .vuelve permeable a moléculas grandes, permitiendo una difusión libre- hacia -el espacio extracelular (véase Mutsu rishnan L. y colaboradores, J. Cell Physiol. (1991), 148: 1-16).
Los FGFs pertenecen al grupo de factores de crecimiento
•con afinidad de unión a la heparina, y es por ello que se encuentran unidos a proteoglucanos heparán sulfato de la membrana basal, donde se almacenan. De tales uniones, los
FGFs son liberados por medio de la acción de heparinasas (véase Saskela O. y colaboradores, J. Cell Biol. (1990), 110: 767-775) .
Técnicas inmuncitoquimicas en aorta de rata revelan que un FGF, el FGF básico (bFGF ó FGF-2), se almacena en el citoplasma de células endoteliales y de músculo liso (véase Villaschi S. y colaboradores, Am. J. Pathol . (1993) , 143: 181-190) . Estudios realizados en heridas de aorta de rata muestran que se produce una liberación de bFGF desde los lugares donde está almacenado. De hecho, los niveles de bFGF en células endoteliales vasculares en cultivo, son los más elevados durante los primeros dias, disminuyendo gradualmente hasta llegar a ser indetectables cuando los microvasos dejan de crecer. El tratamiento de los cultivos con anticuerpos anti-bFGF causan el 40% de la inhibición de la respuesta angiogénica.
Además de los primeros efectos observados sobre replicación celular y angiogénesis, los FGFs regulan la supervivencia, apoptosis, adhesión, motilidad y la diferenciación celular. Estos efectos de los FGFs sobre las funciones celulares dependen del estado bioquímico y del ambiente de sus células diana. Se ha demostrado que el bFGF desempeña un papel importante en los primeros estadios del proceso de reparación tisular (véase Pierce G.F. y colaboradores, Aπ J. PatholV (1992), 140: 1375- 1388) y es un buen mitógeno para condrocitos y osteoblastos, estimulando la proliferación celular dentro del callo de fractura, asi como el crecimiento y desarrollo de tejido ' óseo en el interior de hidroxiapatita sintética (véase Wang J-S. y colaboradores, J. Orthop. Res. (1996), 14_: 316-323; y Clin. Ortohop. Reí. Res. (1996), 333: 252-260).
La biología del bFGF humano es compleja. Varias isofórmas del factor (de 18, 22, 23 y 24 kDa) pueden ser expresadas a partir de un transcriptor de ARNm sencillo (véase Florkiewicz R.Z. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. (1989), 86: 3978-3981). Estas isoformas del bFGF aparecen en distintos lugares del núcleo (la de 22, 23 y 24 kDa) , del citoplasma o de la superficie celular (la de 18 kDa) . La estructura tridimensional del bFGF humano, determinada por cristalografía de rayos-X, sugiere una conformación globular que muestra dominios separados de unión a su receptor y a la heparina (véase Nimni M.E., Biomaterials (1997), 18: 1201-1225).
A pesar de su gran potencia angiogénica y mitogénica, el bFGF se degrada rápidamente cuando se inyecta o es ingerido, llegándose a perder hasta un 99% de su actividad mitogénica en poco tiempo. La preservación y estabilización del bFGF se consigue cuando se une el factor a esferas de heparina-sefarosa . Ello permite su almacenaje prolongado, repetidas manipulaciones, asi como su liberación lenta y controlada (véase Edelman E.R. y colaboradores, Biomaterials (1991), 12: 619-626). • La familia de los FGFs es un gran grupo de citoquinas que ejercen una profunda influencia en la fisiología de la cicatrización de las heridas. Su modo de acción en la cicatrización de las heridas incluye la modulación de poblaciones de células madre, asi como de la expresión de genes específicos que codifican para las proteínas de matriz, receptores celulares, proteinasas de matriz e inhibidores de proteasas.
Numerosos estudios en animales han demostrado la eficacia del FGF exógeno en favorecer la cicatrización de las heridas, lo que ha llevado también a su utilización clínica, para ser empleado en las heridas que se producen como consecuencia de la cirugía, para la reparación ósea, asi como para el tratamiento de úlceras (pie, gástricas) y quemaduras en pacientes diabéticos. La aplicación sistémica de una dosis de bFGF en el momento de provocar la herida, ha demostrado la capacidad de acelerar la reparación del tejido, sugiriendo que una dosis única puede aumentar la tasa de recuperación de la herida.
Los estudios clínicos realizados hasta ahora, usando el bFGF como agente terapéutico, no han llegado muy lejos debido a la disponibilidad limitada de este factor en las cantidades que se necesitan. Se requieren disponibilidades de grandes cantidades de bFGF de grado farmacéutico, libre de contaminantes de fácil transmisión, omnipresentes en productos extraídos de animales y, en particular, de fuentes humanas. Por lo tanto, es muy deseable desarrollar mecanismos para preparar grandes cantidades de bFGF maduro sintético, donde además se elimina cualquier posibilidad de presencia de material contamínate peligroso en el producto final. Finalmente, la proteina biológicamente activa debe ser diseñada para que alcance específicamente los lugares de la herida donde se pretende su cicatrización.
Explicación de la invención
En la presente invención se ha llevado a cabo el diseño genético y la expresión a gran escala de un bFGF reco binante humano en la bacteria Escherichia coli , asi como su purificación y renaturalización hasta alcanzar su máxima actividad biológica. La ventaja que presenta dicho factor es que se le ha incorporado un dominio auxiliar aminoacidico modificado, de alta afinidad de unión especifica al colágeno, que le confiere propiedades únicas y exclusivas. De esta forma, este factor de crecimiento, llamado rhbFGF-F2, puede ser almacenado por tiempos prolongados y dirigido a lugares específicos donde se precise de su actuación (por ejemplo reparación/cicatrización de heridas), controlando su liberación y preservando su bioestabilidad, acentuando asi su potencial como posible agente terapéutico por su papel en la cicatrización de heridas y en otros procesos de reparación tisular.
La presente invención es útil para generar grandes cantidades de hbFGF biológicamente activo a partir de microorganismos procariotas. Este sistema, a diferencia del desarrollado en células eucariotas a partir del ARN , 'donde la disponibilidad de material es el factor limitante, ofrece una fuente prácticamente inagotable para la expresión, síntesis y secreción de proteínas, únicamente dependiente del volumen celular (bacteriano) con el que se comience el cultivo. En el transcurso de la tecnología de fabricación del bFGF en si, hemos desarrollado un método que, especialmente, • aumenta el rendimiento en cuanto a la cantidad de proteina nativa purificada obtenida, la fidelidad en el proceso de renaturación proteica, la eficacia y el acortamiento del procedimiento de diálisis, y la consecución de la máxima tasa de actividad biológica.
La presente invención es, asimismo, útil para fabricar hbFGF en las condiciones descritas anteriormente e incorporarle un dominio molecular aminoacidico auxiliar en su estructura primaria (correspondiente al dominio modificado del factor de von Willebrand, de unión especifica al colágeno tipo I) . Esta modificación persigue hacer llegar la proteina de fusión resultante, rhbFGF-F2, a dianas celulares-tisulares especificas, para que alli ejerza la función deseada. Dado el reconocido papel que el FGF desempeña en los primeros estadios del proceso de reparación tisular
(véase Pierce G.F. y colaboradores, A . J. Pathol .
(1992), 140: 1375-1388), como se ha indicado en reparaciones óseas (véase Wang J-S . y colaboradores, J.
Orthop. Res. (1996), 14: 316-323; y Clin. Ortohop. Reí. Res. (1996), 333 : 252-260), y con especial atención a la velocidad de cicatrización de las heridas, la presente invención aporta un rhbFGF-F2 que acelera significativamente la cicatrización de heridas cutáneas de incisión total o parcial. La utilidad de esta patente en este aspecto, se ve reforzada aún más cuando el FGF producido se aplica ectópicamente mezclado con un gel de colágeno tipo I, provocando una mayor velocidad de cicatrización de heridas. Por otra parte, se ha descrito que el bFGF regula la síntesis y depósito de varios componentes de, la matriz extracelular (MEC) (véase, por ejemplo, la solicitud de patente ES 2 132 082 T3) , y es sabido que en individuos diabéticos el proceso de cicatrización de heridas se encuentra reprimido, primero, en su estadio de reacción inflamatoria y, segundo, en un estadio posterior de remodelación de la MEC (véase Gospodarowicz D. y colaboradores, Endocr. Rev. (1987), 8_: 95-114). En este sentido, la presente invención presenta una utilidad clínica en cuanto a que desarrolla un rhbFGF-F2 que, combinado con un gel de colágeno tipo I y aplicado ectópicamente sobre heridas totales o parciales, reduce el tiempo de cicatrización en animales diabéticos hasta llevarlo a términos comparables a los animales normales.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es la representación del diseño de (A) vector de clonación TA y vector de expresión pET28b; (B) las proteínas de fusión: rhbFGF-F2, que incorpora la secuencia aminoacidica WREPSFMALS del factor de von Willebrand (vWF) , y rhbFGF-Fl que carece de dicha secuencia.
La Figura 2 es el gel SDS de expresión y purificación de las proteínas de fusión. La calle 1 indica el peso molecular del marcador. Las calles 2- y 5 muestran las proteínas rhbFGF-Fl y -F2 respectivamente, antes de la inducción. Las calles 3 y 6 corresponden a las proteínas rhbFGF-Fl y -F2 respectivamente, tras la inducción. Las calles 4 y 7 muestran las proteínas en estado puro. El ligero retraso de la banda en la calle 7 respecto a la banda de la calle 4 corresponde al mayor peso molecular del rhbFGF-F2, introducido por la secuencia aminoacidica correspondiente al factor de von Willebrand.
La Figura 3 muestra (A) un gel de SDS indicando las diferentes condiciones de óxido-reducción ensayadas en la renaturación de la proteina, y la que ofrece mayor rendimiento en cuanto a obtención de proteina, y (B) muestra cómo dicha condición de redox es la que mayor actividad biológica ofrece a cada proteina.
La Figura 4 representa la actividad biológica, en términos de proliferación celular, de la rhbFGF-F2 bajo las diferentes condiciones de diálisis ensayadas. El tampón A con 250 mM de NaCl y 20% de sacarosa favorece la máxima actividad biológica de la proteina.
La Figura 5 muestra como la actividad biológica, en términos de proliferación celular, de la rhbFGF-Fl (circulo abierto) y de la rhbFGF-F2 (circulo cerrado) , obtenidas bajo la condición de diálisis óptima, es comparable a la actividad biológica de la proteina comercial (triángulo) .
La Figura 6 representa la fuerza de unión de las proteínas de fusión al colágeno tipo I. Mientras que el
^H-colágeno unido al rhbFGF-Fl es eluido por completo y rápidamente, el -^-colágeno unido al rhbFGF-F2 requiere un fuerte gradiente de urea para ser eluido.
La Figura 7 muestra (A) una cinética de unión dosis- dependiente del 3H-rhbFGF-Fl y 3H-rhbFGF-F2 al colágeno tipo I, tras la digestión del colágeno con 0.5 mi de colagenasa (100 ü/ml) . La afinidad de unión al colágeno que muestra el rhbFGF-Fl obedece a interacciones no especificas. En (B) se observa que ambas proteínas de fusión siguen manteniendo su actividad biológica, en términos de proliferación celular, tras se liberadas del colágeno tipo I.
La Figura 8 es un gráfico de barras correspondiente a los resultados del examen macroscópico en la velocidad de cicatrización de las heridas, tanto en ratas normales como afectadas de diabetes. El tratamiento ectópico de las heridas se indica en cada caso.
Descripción detallada de la invención
El procedimiento seguido en la presente invención para la preparación del factor de crecimiento fibroblástico básico, con un dominio de unión especifico a colágeno, objeto de la presente invención y la evaluación de su aplicabilidad, consta básicamente de las siguientes etapas :
- Construcción genéti ca del bFGF.
- Expresión proteica de los FGFs .
- Sol ubili zación y purifica ción de los FGFs .
- Rena tura ción de los FGFs . - Actividad biológi ca de las formas protei cas soluble y unida a colágeno .
- Análisis de la unión específi ca a colágeno del rhbFGF- F2 . - Aplicabilidad en la cicatrización de heridas .
A continuación se detallan, como una forma de realización preferida de la invención, los métodos y procedimientos seguidos en estas etapas básicas, asi como los resultados obtenidos y las conclusiones más relevantes que se derivan de los mismos.
Métodos y procedimientos
Construcción genética del bFGF
Se obtuvo ARN citoplásmico (ARNc) de células endoteliales umbilicales humanas, y fue transcrito a una cadena sencilla de ADN citoplásmico (ADNc) usando primers antiseritido correspondientes a la región que codifica para el bFGF. Realizamos amplificación por PCR sobre el ADNc y los productos resultantes se separaron por electroforesis en agarosa. Las bandas que se obtuvieron se purificaron del gel de agarosa mediante el kit Geneclean (Bio 101) y se introdujeron en un vector siguiendo la estrategia de clonación TA (Invitrogen) . Los clones seleccionados por el color fueron aislados y analizados mediante mapeo de restricción, seguido de una determinación de la secuencia nucleotidica . Concretamente, el primer que utilizamos para la construcción del bFGF, la proteina de fusión a la que incorporamos el dominio de unión de alta afinidad al colágeno, fue uno de 50 nucleótidos de secuencia 5' -CAT ATG TGG CGC GAA CCG AGC TTC ATG GCT CTG AGC GGT GCT AGC ATG GCA G- 3', diseñado para incluir dos partes: 7 nucleótidos correspondientes a la sequencia del bFGF unida a 30 nucleótidos que codifican para un péptido modificado con capacidad de unión al colágeno (véase Tuan T.L. y colaboradores, Connect. Tissue Res. (1996), 3_4: 1- 9) . La construcción resultante se introduce en el vector de expresión pET28b (Novagen) , el cual posee una secuencia histidinica de purificación en su terminal amino .
Además de la construcción que incorpora el dominio de unión especifica a colágeno, pET-hbFGF-F2, hemos desarrollado también la que no incluye dicho dominio (secuencia "standard"), pET-hbFGF-Fl, a fin de que pueda servir en todo momento como control del protocolo de diseño, expresión, purificación y comprobación de actividad biológica del factor de fusión. Ambas construcciones, Fl y F2, se mantuvieron en una cepa de Escherichia coli marcada con azul XL (Figura 1) . La orientación y lectura de la secuencia de cada insert se confirmó mediante análisis de secuenciación nucleotidica manual de ADN, por el método de terminación de cadena dideóxida modificado (USB) .
Expresión proteica de los FGFs
Para la expresión de las proteínas recombinantes, las construcciones pET-hbFGF-Fl y pET-hbFGF-F2 fueron transformadas en la cadena BL21 (DE3) de E. coli . Se inoculó un clon sencillo en cultivo primario que se diluyó para obtener un volumen final de 500 mi con medio 2YT, el cual contenia kanamicina (100 μg/ml) . Tras 2-3 horas de crecimiento del cultivo y alcanzado un nivel de crecimiento adecuado (densidad óptica A600 de 0.7 a 1.0), las proteínas fueron inducidas en presencia de ImM de IPTG durante '5 horas a 37 °C. Los decantados bacterianos se obtuvieron por centrifugación a 5000 g durante 10 minutos, se lavaron con tampón A (20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0.05% NP-40, pH 8.0) y se Usaron con 0.4 mg/ml de lisozina, 5 ng/ml de ADNasa, 0.8 mM PMSF y 10 mM de β- mercaptoetanol en 1/10 del volumen original de la suspensión celular. La lisis se facilitó realizando sonicación y homogeneización con un Brinkmann Polytron a 25K durante 2 ciclos de 30 segundos cada uno, seguido por una centrifugación a 10000 g durante 20 minutos a 4°C, para obtener por decantación los cuerpos de inclusión bacterianos .
Por electroforesis en gel SDS-PAGE (Figura 2) se determinó que, en presencia de 1 M de IPTG, los niveles de expresión de rhbFGFs alcanzaron el 50% de la proteina total celular.
Solubilización y purificación de los FGFs
Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en 6 M de guanidina-HCl, 0.1 M tampón fosfato, pH 8.0, a temperatura ambiente en 1/10 del volumen original de células, dejándolo decantar a temperatura ambiente durante 1.5 horas con esporádicas agitaciones. Las proteínas de fusión solubilizadas se separaron de las impurezas insolubles por centrifugación a 20000 g.
La purificación de la proteina de fusión solubilizada se llevó a cabo por cromatografía de Ni-NTA (Qiagen) : tras cargar la columna con el solubilizado y dejar reposar las bolitas de sefarosa durante 30 minutos, se realizaron lavados de la columna con 2 volúmenes de urea 8 M en tampón A, pH 8.0, seguido por 2 volúmenes de urea 8 M en tampón A, pH 6.5. Las proteínas recombinantes (Fϊ y F2) se eluyeron con 8 M de urea en tampón A, pH 4.0. La concentración proteica se - determinó por el método de Bradford (BioRad) utilizando un estándar de albúmina bovina (BSA) . =
Rena turación de los FGFs
Tras la purificación de las proteínas por cromatografía de afinidad, las muestras se diluyeron para obtener una concentración de 0.20 mg/ml en 8 M de urea, pH 8.0. El tampón de óxido-reducción A con 2 mM de glutation reducido (GSH) , 0.2 mM de glutation oxidado (GSSG) y 1 mM de DTT se utilizó para la renaturación. Se enfrió en hielo durante 30 minutos y se fue añadiendo lentamente a las proteínas de fusión purificadas hasta diluir la urea a 1.3 M (factor de dilución 6X) y comenzar la renaturación oxidativa. Tras agitar con intensidad, se dejaron reposar las proteínas de fusión a 4 °C durante toda la noche para permitirles alcanzar sus estructuras termodinámicamente estables. Las muestras se mantuvieron dializando toda la noche en tampón S (250 mM NaCl, 20 M Tris-HCl, 20% sacarosa, pH 8.0). Se realizó una centrifugación a 10000 g durante 20 minutos a 4 °C, se midió la densidad óptica para calcular la concentración final de proteina, se liofilizaron los preparados y reconstituyeron en 0.1% de BSA/4 mM HC1 antes de congelar.
Actividad biológica de las formas proteicas soluble y unida a colágeno
La actividad biológica de las formas solubles Fl y F2 se determinó en células endoteliales de vena humana (HVEC) a través de una serie de ensayos de proliferación. Las HVEC se cultivaron en medio de cultivo Dulbecco Eagles (DMEM) (GIBCo) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS) (GIBCo) , a' 37 °C y 5% de CO2. Una vez alcanzada la confluencia del cultivo en monocapa, las células fueron tripsinizadas y luego sembradas en placas de 24 pocilios (Costar) a una densidad de 5xl03 células/pocilio. Una vez que las células alcanzaron el -50-60% de confluencia, el DMEM fue sustituido por DMEM al 0.5% de FBS y las células cultivadas durante 24 horas en estas condiciones de ayuno. Diluciones seriadas de las proteínas de fusión rhbFGF recién renaturadas se fueron añadiendo a los pocilios e incubadas durante 16 horas, seguidas de la adición de timidina tritiada (^H-timidina) (lμCi/pocillo, con actividad especifica de 2 Ci/milimol, 74 GBq/milimol) (ICN) y una incubación adicional de 4 horas. El rhbFGF comercial (R&D Systems) fue utilizado como control estándar. Tras la incubación, las células fueron .lavadas tres veces con tampón fosfato salino (PBS) , y Usadas con 150 μl/pocillo de tampón de lisis (Solvable, ICN) a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los extractos celulares resultantes correspondientes a ADN fueron analizados en un equipo de centelleo (Beckman 2000). Para el caso concreto del rhbFGF-F2 se realizó una segunda medición de actividad biológica. Se tomaron 500 μl de colágeno tipo I (3.0 mg/ml, pH 7.0) procedente de una extración con pepsina realizada en tendón bovino
(véase Nimni, M.E., Biorheology (1980), l_7_:51-82), se dejó secar hasta que las moléculas de colágeno se agregaron en fibras sobre la base de cada pocilio de una placa de cultivo de 24 y luego se cubrió con 0.2% de BSA. Las fracciones renaturadas de rhbFGF-F2 en PBS se añadieron a los pocilios recubiertos de colágeno, se incubaron a 37 °C durante 2 horas y luego se lavaron los pocilios tres veces con DMEM. Las HVEC (1.5xl03 por pocilio en 0.5% FBS/DMEM) se sembraron e incubaron durante 20 horas a 37 °C antes de la adición de 3H- timidina para determinar la síntesis de ADN como medida de proliferación (según se ha descrito anteriormente) .
Análisis de la unión específica a colágeno del rhbFGF-F2
Se utilizaron dos procedimientos diferentes para comprobar la afinidad de la proteina de fusión rhbFGF-F2 al colágeno. En el primer método, la proteina de fusión recombinante fue primeramente inmobilizada en una columna de Ni-NTA para luego hacer pasar colágeno tipo I
(biosintéticamente marcado con 3H-prolina) a través de la columna, y posteriormente eluido con un gradiente de concentración lineal de tampón fosfato (de 0.15 a 2 M) o urea (de 0 a 4 M) .
En el segundo método, los cuerpos de inclusión conteniendo las construcciones del rhbFGF-Fl y rhbFGF-F2 fueron aislados por centrifugación y marcados radioactivamente por un método desarrollado en nuestro laboratorio (véase Cheung D.T. y colaboradores, Anal. Bioche . (1981) , 116: 69-74) . Brevemente, los cuerpos de inclusión fueron deshidratados con DMF (Sigma) en tubos de ensayo de vidrio, a los que a continuación se anadia
0.5 mi de solución 3H-NaBH4 (100 mCi, Amersha ) /DMF. Esta suspensión se agita inmediatamente y se deja reposar durante 1 hora a temperatura ambiente. Los decantados se lavan tres veces con DMF y luego PBS. Tras realizar la purificación y renaturación de las proteínas de fusión como ' se ha descrito anteriormente, se determina la bioactividad.' En placas de cultivo de 24 pocilios, se incuban 200 μl de colágeno tipo I (3.0 mg/ml) durante 30 minutos a 37 °C hasta formar una estructura fibrilar. A continuación se añaden 20 μl de 3H-rhbFGF-Fl y 3H-rhbFGF- F2 en diluciones seriadas sobre los geles de colágeno fibrilar dejando reposar durante 1 hora a 37 °C. Los geles se lavan con 2.0 mi de PBS tres veces, 30 minutos cada una. Se añade 0.5 mi de colagenasa A (100 U/ml, Boehringer Mannheim) y se incuba durante 1 hora a 37 °C. Se toman 20 μl de la solución resultante y se mide en el contador de centelleo.
Aplicabilidad en la cicatrización de heridas
Para determinar la aplicabilidad del rhbFGF-Fl y la posible mejora introducida por el rhbFGF-F2 en la cicatrización de heridas, se han usado 24 ratas Wistar macho, de un peso entre 300 y 350 gramos. Como es conocido, los animales diabéticos suponen un excelente modelo experimental para el estudio de procesos de cicatrización de heridas, puesto que en estos animales dicho proceso se encuentra retrasado e incluso impedido en algunos casos. Por ello, utilizamos 12 ratas diabéticas inducidas en nuestro laboratorio por inyección intramuscular de 45 mg/kg de estreptozotocina (Sigma) . Esta dosis resulta en un 100% de hiperglucemia y 0% de mortalidad. A los animales se les midió el contenido de glucosa en sangre diariamente y se consideró que hablan desarrollado la diabetes cuando, durante tres dias consecutivos, presentaron 350 mg/dl o más de glucosa en suero. Bajo anestesia con pentobarbital sódico, a los animales se les afeitó el .dorso, se esterilizó la piel con etanol al 70%, y se les practicaron ocho heridas de 5 mm2 cada una con profundidad hasta el panículo carnoso. Cada herida estaba separada de la otra por al menos 1.5 cm. Dos heridas por animal (normal y diabético) fueron tratadas con solución salina (0.05 M acetato sódico, 0.001 M EDTA, 0.001 M CaCl, 0.09 M NaCl, pH 6.0), 100 μl ('1 μg/μl) de hbFGF comercial (Chemicon International) , o la misma dosis de rhbFGF-Fl o rhbFGF-F2. Los factores de crecimiento y su diluyente salino también fueron aplicados a las heridas mezclados en un gel de colágeno tipo I procedente de tendón de cola de rata (Collaborative Research) . El colágeno es disuelto en ácido acético 0.1 M, el pH neutralizado a 7.2, y la solución resultante mezclada con DMEM para obtener una concentración final de 0.35 mg/ml. La mezcla de los bFGFs o del diluyente salino y la solución de colágeno tipo I se incuban a 37 °C durante 15 minutos para conseguir una fina matriz de gel de colágeno. Se efectúan aplicaciones diarias bajo anestesia durante tres dias, para luego realizar un seguimiento macroscópico de la cicatrización. Otros animales son sacrificados por medio de una dosis de 75 mg/kg de Nembutal a los 10 o 21 dias desde la realización de las heridas. Se toman piezas de la piel sometida a tratamiento y se procesan histológicamente, se tiñen con hematoxilina-eosina, e inmunocitoquimicamente con anticuerpos anti-colágeno tipo IV, anti-fibronectina y anti-laminina desarrollados en conejo (Chemicon International) , a fin de determinar la evolución del proceso de cicatrización. Resultados
Construcción recombinante de las proteínas de fusión hbFGF- Fl y -F2
Según se muestra en la Figura 1, por técnicas de RT-PCR y tecnología de ADN recombiante, hemos desarrollado dos proteínas de fusión hbFGF. Una de ellas incorpora un dominio molecular de alta afinidad de unión al colágeno tipo I. Se trata de la incorporación a la proteina de un decapéptido procedente del factor von Willebrand (vWF) , responsable del reconocimiento de secuencias colagénicas en los vasos sanguíneos, y al que se le ha sustituido la cisteina original por una metionina, con el objeto de facilitar el proceso de renaturación. De esta forma, el decapéptido incorporado es el correspondiente a la secuencia WREPSFMALS, y la proteina de fusión resultante, rhbFGF-F2, desarrolla una capacidad especial de unirse específicamente al colágeno tipo I.
Expresión , solubilización y purificación de las proteínas de fusión
Las proteínas de fusión rhbFGFs han sido expresadas a altos niveles en bacterias transformadas (la cepa BL21- DE3) que portan el sistema T7 polimerasa. En presencia de 1 mM de IPTG, los niveles de expresión de rhbFGFs alcanzaron el 50% de la proteina total celular, como se determinó por electroforesis en gel SDS-PAGE (Figura 2) . Las proteínas fueron aisladas de los cuerpos de inclusión recolectados tras una lisis celular bacteriana. Para prevenir la co-sedimentación de las células y restos celulares, la lisis inicial fue mejorada con la combinación de un tratamiento enzi ático con lisozima (0.4 •mg/ml) , homogeneización y sonicación. Debido a que las proteínas con origen en cuerpos de inclusión contienen cantidades variables de uniones intercatenarias tipo disulfito, se añadió 10 mM de β-mercaptoetanol al tampón de lisis a fin de romper tales uniones.
A pesar de que denaturantes fuertes tales como guanidina- HC1 6 M y urea 8 M son bastante efectivos en la solubilización de proteínas del tipo de las FGFs procedentes de cuerpos de inclusión, la guanidina 6 M fue la que mostró un mejor rendimiento. Tras la solubilización y antes de la renaturación, se abordó el proceso de purificación, con idea de eliminar primero otros tipos de proteínas solubles que pudieran llegar a ofrecer interacciones indeseables con las bFGFs, asi como evitar degradaciones por el contacto con proteinasas solubles renaturadas presentes en la misma mezcla. La purificación de rhbFGF-Fl . y -F2 se llevó a cabo por cromatografía Ni-NTA realizada bajo condiciones denaturantes en presencia de guanidina 6 M. Para preparar las proteínas para los siguientes pasos de renaturación, las muestras unidas a la columna fueron lavadas con urea 8 M, pH 8.0, seguido de un lavado más intenso con urea 8 M, pH 6.5, seguido por una elución final de las proteínas purificadas con urea 8 M a pH 4.0. Aproximadamente, el rendimiento fue de 6 mg de rhbFGF-Fl y 8 mg de rhbFGF-F2 purificadas, a partir de 100 mi de cultivo bacteriano.
Rena turaciórí de las proteínas de fusión rhbFGF
Puesto que el control de las condiciones de óxido- reducción es un factor clave en la correcta renaturación de proteínas de fusión, nosotros hemos probado varias concentraciones de GSH y GSSG a fin de incrementar la tasa y rendimiento de Fl y F2 correctamente renaturadas. Como se muestra en las Figuras 3A y 3B respectivamente, un sistema redox compuesto por 2.0 mM/0.2 mM de GSG/GSSG proporciona el máximo rendimiento de ambas proteínas, asi como la máxima actividad biológica relativa especifica, cuando se midió proliferación utilizando cultivos de HVEC.
Concentración de las proteínas de fusión rhbFGF
Asociado con la propia cinética y termodinámica de la renaturación de monómeros proteicos, la formación de agregados (provenientes de interacciones entre precursores proteicos a medio camino de la renaturación) compite extraordinariamente con la renaturación de proteínas del tipo de bFGF. En consecuencia, y puesto que la agregración conlleva una disminución en la concentración de proteina resultante, en cada ensayo de renaturación establecimos un limite de concentración, que fue de 20 μg/ml para rhbFGF-Fl y algo más bajo, 18 μg/ml, para rhbFGF-F2, debido al aumento de interacciones hidrofóbicas asociado a la secuencia decapeptidica de vWF.
Aunque la eliminación de los agentes solubilizantes y los componentes del proceso de renaturación se eliminan por simple diálisis, parámetros tales como el tampón de diálisis, el pH, las fuerzas iónicas y agentes estabilizantes de la estructura proteica, son de especial importancia para prevenir la precipitación de la proteina recién renaturada. El mayor rendimiento en términos de proteina soluble activa tras la diálisis se obtuvo con el ampón A suplementado con 20% de sacarosa a pH 8.0. A pH 6.5 se producía precipitación y a pH 11.0, aunque no ocurría precipitación alguna, se perdía totalmente la actividad biológica especifica. El resultado en cuanto a valores de actividad biológica especifica varió según las diferentes condiciones de diálisis que ensayamos, como muestra la Figura 4 para la proteina rhbFGF-F2. En ningún caso se añadieron solventes orgánicos al tampón de diálisis para prevenir la agregación, lo que habla en favor de la idoneidad de las mezclas de diálisis ensayadas .
Una vez se determinó la concentración proteica final, las proteínas rhbFGF-Fl y rhbFGF-F2 se liofilizaron. La reconstitución del liofilizado proteico para su posterior uso se hizo con una solución 4 M HC1 y 0.1% de BSA. Sin embargo, en estas condiciones detectamos una pérdida de actividad biológica de dos unidades respecto a las muestras recién dializadas. El problema se soluciona cuando las muestras dializadas simplemente se congelan a -20 °C.
Actividad biológica de las proteínas de fusión
La actividad biológica de las proteínas de fusión rhbFGF- Fl y rhbFGF-F2 se comprobó en un ensayo in vitro de proliferación utilizando cultivos celulares de HVEC, donde el rhbFGF comercial sirvió como control positivo. Como muestra la Figura 5, a cultivos celulares privados de suero durante 24 horas, se añadieron fracciones proteicas dializadas desde 5 a 30 μl/ml, en concentraciones comprendidas entre 50 y 200 pg/ml durante 16 horas, tras ' las cuales se obtuvieron actividades proliferativas comparables a las conseguidas con el factor de crecimiento comercial.
Capacidad de unión de rhbFGF-F2 al colágeno tipo I
La comprobación de la afinidad de la proteina de fusión rhbFGF-F2 al colágeno tipo I se abordó por medio de dos estrategias. En primer lugar, se cargaron 100 ng de la proteina recién dializada en una columna de Sephadex G15 recubierta de colágeno. En principio, toda la proteina cargada quedó unida a la columna, según un análisis proteico inmediato realizado al eluyente. Los intentos de eluir la proteina de la columna utilizando un gradiente de NaCl o urea 2 M, soluciones usualmente empleadas en la elución de proteínas en estas condiciones, fueron inútiles, sugiriendo que la rhbFGF-F2 se habla unido fuertemente a la columna.
En una segunda estrategia, la rhbFGF-F2 se cargó en una columna Ni-NTA, para posteriormente hacer pasar una solución de H-colágeno tipo I. La mayor parte del colágeno radioactivo cargado quedó retenido en la columna, según un análisis proteico inmediato realizado al eluyente. La columna se lavó con un gradiente lineal de NaCl desde 0.15 a 2 M, sin conseguir ninguna elución de colágeno radioactivo, lo que daba muestra de la fuerte unión al rhbFGF-F2. Como se muestra en la Figura 6, sólo la aplicación de un gradiente lineal de urea desde 0 a 4
M fue capaz de eluir todo el 3H-colágeno. En cambio, cuando el proceso se repite con la rhbFGF-Fl (carece del dominio aminoacidico vWF) , que, • en este caso, sirvió también como control positivo de la técnica, sólo trazas de 3H-colágeno fue retenido por la columna. Estos resultados demostraron que el dominio aminoacidico de unión especifico a colágeno tipo I es el responsable de la alta interacción especifica desarrollada por el rhbFGF-F2 al colágeno.
La conclusión de estos estudios nos permitieron, además, demostrar dos hechos fundamentales: i) que la unión del rhbFGF-F2 al colágeno tipo I era dosis dependiente, siendo la unión del rhbFGF-Fl de muy baja afinidad y motivada por interacciones no especificas, como se muestra en la Figura 7A; y ii) que cuando el rhbFGF-F2 se libera del colágeno tipo I mediante digestión enzimática con colagenasa, la proteina de fusión mantiene su actividad biológica completa, como se muestra en la Figura 7B.
Este conjunto de experimentos demuestra que el dominio molecular de unión especifica al colágeno tipo I incorporado a la proteina rhbFGF-F2, provoca que la proteina de fusión sea secuestrada por la matriz de colágeno, y que la digestión colagénica especifica de la misma libere la rhbFGF-F2 con su actividad biológica intacta.
Efecto de la aplicación de las proteínas de fusión a la cicatrización de heridas
Hemos ensayado las dos proteínas de fusión obtenidas en la tasa de cicatrización de heridas cutáneas en ratas normales y diabéticas. Como se muestra en la Figura 8, las heridas de animales normales, tratadas ectópicamente sólo con el vehículo de disolución del factor (solución salina) , en aplicaciones de una al dia durante tres dias, comenzando el mismo dia de la lesión, cicatrizaron a los 12 dias. En los animales diabéticos, la cicatrización completa tuvo un retraso de 7 dias respecto a las ratas normales, lo que indicaba que la diabetes afecta negativamente al proceso de cicatrización (p<0.001). Cuando las heridas se trataron con 1 μg de hbFGF comercial, la tasa de cicatrización se aceleró significativamente en 3 dias, tanto en animales normales como diabéticos. Cuando las heridas fueron tratadas con 1 μg de la proteina de fusión con afinidad de unión por el colágeno I, rhbFGF-F2, el' proceso de cicatrización se redujo en 2 dias en ratas normales y en 1 dia en ratas diabéticas, cuando se compara con el tratamiento con el hbFGF comercial. Muy significativo fue el resultado obtenido cuando las heridas fueron tratadas con 1 μg de rhbFGF-F2 mezclado con colágeno I. En estas condiciones se redujo aún más el proceso de cicatrización, especialmente en ratas diabéticas (2 dias comparado con el rhbFGF-F2 solo, y 3 dias comparado con el hbFGF comercial) . El tratamiento de las heridas con el rhbFGF- Fl originó resultados similares a los obtenidos con el hbFGF comercial, tanto en animales normales como diabéticos. El colágeno tipo I solo se comportó de igual forma que la solución salina en términos de cicatrización.
Discusión
Con el fin de dirigir el hbFGF a espacios celulares- tisulares específicos e incrementar la vida media de este potente factor de crecimiento mitogénico, hemos diseñado una proteina de fusión que incorpora un dominio molecular de diez aminoácidos, el cual confiere al factor la capacidad de unirse con muy alta afinidad al colágeno tipo I. Esta proteina de fusión, a la que hemos denominado rhbFGF-F2, puede ser conducida a la MEC directamente o mezclada con matrices colagénicas implantables (en forma de geles o sólidas) . El dominio aminoacidico utilizado en esta construcción ha sido el decapéptido WREPSFMALS, que corresponde a una modificación del factor ' de von Willebrand, el cual presenta una alta afinidad especifica de unión a colágeno o gelatina (véase Takagi J. y colaboradores, Biochem.
(1992), 31: 8530-8534). Hemos demostrado que la sustitución en el decapéptido de la cisteina por la metionina en posición 7 (para mejorar las condiciones de renaturación) no interfiere en dicha afinidad. Con respecto a la proteina de fusión en si, el rhbFGF-F2 tampoco presenta merma alguna en su proceso de renaturación, cuando se compara con el rhbFGF-Fl (carece del dominio aminoacidico) , manteniendo una actividad biológica comparable al hbFGF comercial, cuando se mide tasa de proliferación en cultivos de HVEC.
La renaturación de proteínas agregadas en cuerpos de inclusión bacterianos a conformaciones biológicamente activas, requiere una serie de pasos interdependientes unos de otros: la solubilización, la renaturación oxidativa y la eliminación de denaturantes, cada uno de los cuales representa un desafio para su optimización (véase Handl CE. y colaboradores, Protein Expr. Purif. (1993), 4 : 275-281; y Cardamone M. y colaboradores, Biochem. (1995), 3^: 5773-5794). Nuestros resultados demuestran una notable mejora en cada unos de ellos. 1) Hemos determinado que un denaturante iónico fuerte, guanidina 6 M, fue más efectivo que la urea 8 M en la solubilización de los cuerpos de inclusión. Sin embargo, en el análisis proteico tras cada paso de renaturación con solución de guanidina-HCl, detectamos que la actividad de las proteínas de fusión era notablemente más baja que cuando se empleaba urea. Algunos autores han demostrado que la guanidina-HCl podría interferir negativamente con el proceso de renaturación (véase Carda one M. y colaboradores, Biochem. (1995) , 3_4 : 5773- 5794). Por esta razón, en nuestro estudio hemos utilizado inicialmente guanidina-HCl como denaturante para solubilizar los cuerpos de inclusión y optimizar el rendimiento proteico, para luego ser sustituido por guanidina-HCl con urea 8 M para desarrollar la purificación. 2) La renaturación oxidativa se realizó en urea 1.3 M, pH 8.0. 3) Puesto que la retirada de denaturantes por diálisis simple provoca abundante precipitación proteica, hemos realizado una dilución inicial del denaturante de seis veces (de urea 8 M a urea 1.3 M) en un tampón de óxido-reducción, el cual es capaz de mantener tanto la concentración de urea como las condiciones redox durante un intervalo de 48 horas. El resultado es que, en ese tiempo, las proteínas solubles se rearman en sus conformaciones nativas y la actividad biológica aumenta considerablemente sin precipitación alguna. Las moléculas pequeñas, tales como el glicerol, la sacarosa, el poli-etilenglicol PEG 200- 2000, la albúmina de suero bovina o la L-arginina, se añaden normalmente a los tampones de diálisis para prevenir la precipitación proteica (véase Rudolph R. y Lilie H., FASEB J. (1996) , 10_: 49-56) . También la concentración de sales y el pH son factores claves a tener en cuenta en la diálisis, puesto que la estabilidad proteica depende de los estados de ionización de residuos laterales (véase Schumann J. y colaboradores, Protein Sci. (1993), 2 : 1612-1620). En consecuencia, hemos determinado que las condiciones ideales de diálisis para las proteínas de fusión rhbFGFs son 250 mM NaCl, 20% de sacarosa y pH 8.0. Como se ha descrito (véase Gary A.M. y colaboradores, Science (1990), 247: 1328-1330), la inclusión de dominios moleculares auxiliares puede dificultar el proceso de renaturación. Sin embargo, con las adaptaciones realizadas, tanto moleculares, como niveles de óxido- reducción, pH, concentración de proteínas, adición de moléculas pequeñas y condiciones de diálisis, hemos mejorado el rendimiento de obtención de las proteínas rhbFGF- Fl y -F2 en un 30%.
El bFGF es un factor de crecimiento multifuncional cuyas propiedades biológicas sugieren un papel principal en la cicatrización de heridas. Éste es un complejo proceso que se inicia con una fase inflamatoria y la liberación de componentes de la sangre a la herida, que activan una cascada de formación de coágulos y proporcionan una matriz para la afluencia de células inflamatorias. Después se inicia el tejido de encarnamiento para formar una población densa de fibroblastos y macrófagos embebidos en una matriz holgada de colágeno, fibronectina y ácido hialurónico, es decir la MEC. Proliferan las células endoteliales en la herida y se forman nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) para suministrar nutrientes y oxigeno a la zona lesionada, aportación esencial para la síntesis, el depósito y la organización de la MEC (véase Satoh H. y colaboradores, Jpn. J. Pharmacol. (1997), 73: 59-71). Se ha demostrado que el bFGF es un mitogénico potente para las células vasculares endoteliales. Además, es producido y liberado en tejidos dañados, contribuyendo a la proliferación de fibroblastos asi como a la inducción a la síntesis de MEC por dichas células (véase Clark R.A.F, Molecular and Cellular Biology of Wound Repair (1996), 3-50).
Puesto que el bFGF es un agente pleiotrópico que estimula, inhibe y modula procesos celulares de manera tiempo- y dosis-dependiente, es esencial controlar su liberación al lugar deseado y su biodisponibilidad mientras se necesite de su acción como agente terapéutico. En nuestro estudio, el tratamiento de las heridas con el rhbFGF-F2 aceleró el proceso de cicatrización tanto eή ratas normales como diabéticas, obteniéndose la máxima significancia cuando la proteina de fusión fue aplicada a la herida combinada con colágeno tipo I en forma de gel. Este aposito, no sólo consiguió acelerar el cierre de la herida en ratas normales comparado con el hbFGF comercial, sino que también anuló el retraso que se producía en la respuesta de cicatrización en los animales diabéticos (cicatrización completa a los 13 dias, aproximadamente el mismo tiempo que necesitan las heridas de ratas normales para cicatrizar cuando se las trata únicamente con la solución salina). Según los resultados, confirmados in vitro, podemos pensar que el dominio molecular de unión especifica a colágeno estarla incorporando a la proteina rhbFGF-F2 la capacidad de unirse específicamente al colágeno tipo I que está sirviendo de carrier . Una vez que este aposito (colágeno + factor) es colocado en la herida fresca, la presencia de enzimas del tipo colagenasa, cuya presencia en los primeros dias de cicatrización ha sido demostrada (véase Edelman E.R. y colaboradores, - Biomaterials (1991), 12: 619-629), estarían ocasionando una lenta liberación del rhbFGF-F2 desde la matriz colagénica a la que está unido hacia el amplio componente celular implicado en la cicatrización (fibroblastos, encargados de sintetizar más matriz de colágeno, células endoteliales, células inflamatorias) , consiguiéndose asi una mayor y mejor disponibilidad del factor por las células diana. En este caso, el colágeno tipo I estarla actuando como modulador fisiológico en la liberación de la proteina hacia los elementos diana. Este hecho ha sido recientemente discutido por los autores de esta patente para un factor de crecimiento rhT.GF-βl
(véase Gordon E.M. y colaboradores, Hum. Gene Ther. (1997), 8: 1385- 1394; y Andrades J.A. y colaboradores, Exp. Cell Res. (1999), 250: 485-498).
Debido a que la actividad mitogénica del bFGF se pierde rápidamente cuando el factor es inyectado, se ha demostrado que cuando la proteina se combina con determinados materiales (por ejemplo, la heparina) se consigue aumentar la estabilidad proteica, asi como preservar su actividad biológica (véase Edelman E.R. y colaboradores, Biomaterials (1991), 12: 619-629). El hecho de .que la máxima tasa de cicatrización, tanto en animales normales como diabéticos, se halla conseguido cuando el rhbFGF-F2 se aplicaba combinado con colágeno tipo I, refuerza la idea de que el dominio aminoacidico WREPSFMALS esté incorporando una mayor y/o más duradera actividad biológica a la proteina de fusión resultante.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Factor de crecimiento 'fibroblástico básico con un dominio de unión especifico a colágeno, obtenido por ingeniería recombinante (rhbFGF-F2) y caracterizado porque incluye un dominio de diez aminoácidos, correspondiente al factor de von Willebrand modificado, que le permite combinarse con el colágeno tipo I en fase de gel o sólida.
2. Factor de crecimiento fibroblástico básico con un dominio de unión especifico a colágeno (rhbFGF-F2), de
' acuerdo con la reivindicación 1 que, en combinación con el colágeno tipo I, sirve para vehiculizar la proteina hacia lugares necesitados de reparación, tales como úlceras, quemaduras de diferente etiología y reparaciones de fracturas óseas.
3. Factor de crecimiento fibroblástico básico con un dominio de unión especifico a colágeno (rhbFGF-F2) , de acuerdo con la reivindicación 1 que, solo o combinado con el colágeno tipo I, tiene aplicación para acelerar la cicatrización de heridas en tejidos blandos, como las heridas cutáneas y dérmicas, tanto de incisión total o parcial.
4. Utilización del factor de crecimiento fibroblástico básico con un dominio de unión especifico a colágeno
(rhbFGF-F2) , de acuerdo con la reivindicación 1, en composiciones de aplicación ectópica para la cicatrización de heridas.
5. Método de preparación por ingeniería recombinante del factor de crecimiento fibroblástico básico con un dominio de unión especifico a colágeno (rhbFGF-F2) de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por la incorporación a un vector de autorreplicación de un fragmento purificado de ADN que incluye:
Una secuencia de ADN que codifica para una señal de purificación del tipo de (His)n, de ribonucleasa S, o de hemaglutinina A.
Una secuencia de ADN que codifica para una proteinasa del grupo de la trombina, plasmina, tripsina, elastasa, pepsina, quimosina o termolisina.
Una secuencia de ADN que codifica para una región de unión a matriz extracelular del tipo de colágeno, fibronectina o de superficie celular. - Una secuencia de ADN que codifica para el fragmento activo del factor de crecimiento fibroblástico básico humano .
6. Método de obtención del factor de crecimiento fibrobástico básico con un dominio de unión especifico a colágeno (rhbFGF-F2), maduro y activo, codificado por un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende las siguientes fases:
- el aislamiento de la fracción proteica que contiene la región madura del rhbFGF-F2;
- la expresión de la proteina en bacterias transformadas que portan el sistema T7 polimerasa, en presencia de IPTG;
- la denaturación de la fracción proteica en un tampón denaturante con urea, Tris-HCl, NaCl y NP-40, a pH 8.0; la purificación de la proteina de fusión por cromatografía de Ni-NTA mediante urea a diferentes pH;
- la dilución del polipéptido maduro rhbFGF-F2. a una concentración óptima de 0.2 mg/ml;
- y la renaturación por diálisis en un tampón de óxido- reducción y DTT, seguido de un tampón con Tris-HCl, NaCl y sacarosa, a pH 8.0.
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