WO2002039111A1 - Supports d'hybridation et procede d'immobilisation d'hybrides - Google Patents

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gdna
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Hiroshi Okamura
Michifumi Tanga
Kaoru Yamakawa
Mitsuyoshi Ohba
Kenichi Takagi
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Toyo Kohan Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for immobilizing a hybrid, which is useful in the fields of molecular biology and genetic engineering, and is composed of a hybrid-forming carrier capable of immobilizing a nucleic acid, an oligonucleotide, cDNA, or gDNA.
  • a hybrid-forming carrier capable of immobilizing a nucleic acid, an oligonucleotide, cDNA, or gDNA.
  • Gene analysis is useful in the fields of molecular biology and genetic engineering, and has recently been used in the medical field, such as disease discovery.
  • DNA chips have recently been developed and the analysis speed has been significantly increased.
  • a conventional DNA chip is a method in which a polymer such as polylysine is applied to the surface of a slide glass or a silicon substrate, and then the DNA is fixed.
  • a method of synthesizing oligonucleotides on a glass substrate using a semiconductor technique such as photolithography has been used.
  • the immobilized state of DNA is unstable, and DNA is immobilized in a hybrid formation process or a washing process. Peeling causes problems.
  • a DNA chip using semiconductor technology has a problem that it is very expensive due to complicated manufacturing steps.
  • the present invention provides a carrier for immobilizing nucleotides that can efficiently perform DNA analysis without damaging the terminal portion of DNA as described above, and that is useful in the field of molecular biology, genetic engineering, and the like. It is intended to be offered. Disclosure of the invention
  • the present inventors fixed the hybridized nucleotide onto the solidified carrier chemically modified, so that the oligonucleotide was solidified in the direction perpendicular to the surface of the carrier for immobilization, and the single base was fixed.
  • the DNA information of the polymorphism can be easily read.
  • the present invention described in claim 1 provides a carrier for forming a hybrid, wherein a hybridized oligonucleotide, cDNA or gDNA is immobilized. It is desirable that the hybridized oligonucleotide, cDNA or gDNA contains two or more consecutive nucleotides having primary amine.
  • the nucleotide having a primary amine is desirably deoxyadenylic acid, deoxycytidylic acid, or deoxyguanylic acid. Further, the nucleotide having a primary amine is preferably present on the 5 'end side. Preferably, the oligonucleotide has a 5, protruding end.
  • the cDNA may be synthesized using as a primer an oligonucleotide containing a nucleotide having a primary amine at two or more consecutive 5′-ends. It is characterized in that the gDNA is cleaved by a restriction element that cleaves to include a nucleotide having a primary amine at two or more consecutive 5 terminal ends. It is characterized in that the gDNA is cleaved by a restriction element that cleaves so that two or more nucleotides having a primary amine are continuously contained on the 5 ′ protruding end side. Furthermore, deoxyadenylic acid, deoxycitylic acid or deoxyguarlic acid is immobilized on the support for hybrid formation. Is desirable. Desirably, the hybridized oligonucleotide, cDNA or gDNA has 1 to 10 nucleotides having a primary amine at the fixed end.
  • the invention according to claim 11 is characterized in that the carrier for hybridization is chemically modified and the oligonucleotide, cDNA or gDNA hybridized thereto is immobilized thereon, and then the complementary oligonucleotide, cDNA or cDNA not immobilized on the carrier.
  • a method for immobilizing a hybrid comprising an oligonucleotide, cDNA or gDNA, comprising dehybridizing gDNA.
  • the carrier for hybridization is chemically modified by performing chlorination, amination, and carboxylation on the surface of the carrier in this order.
  • the carrier for forming a hybrid of the present invention is a carrier on which oligonucleotides, cDNAs or gDNAs hybridized by chemical modification are immobilized, and the oligonucleotides, cDNAs or gDNAs are perpendicular to the carriers. It is characterized by being fixed. Therefore, it is possible to easily read information on the single nucleotide polymorphism of the cDNA.
  • the hybridized oligonucleotide dehybridizes the complementary oligonucleotide and reads the information on the oligonucleotide remaining on the carrier.
  • an oligonucleotide is necessarily a double-stranded nucleic acid such as DNA.
  • Oligonucleotides include naturally occurring oligonucleotides such as higher animals, molds, bacterium, viruses, etc., artificially modified structures of these, and synthesized oligonucleotides.They can be easily synthesized by the methods described below. Is preferred because
  • the number of bases of the oligonucleotide is preferably 10 to 50.
  • the carrier for forming a hybrid of the present invention can be easily prepared by the following method. (1) Chemical modification of the hybridization support
  • such an oligonucleotide is immobilized on a chemically modified carrier for hybrid formation.
  • Examples of a carrier for forming a hybrid include metals such as glass, diamond, gold, silver, copper, aluminum, tungsten, and molybdenum; a laminate of the above glass, diamond, metal and ceramics; and plastics such as polycarbonate and fluororesin. No.
  • Other materials can be used as long as they are chemically stable, such as graphite and diamond-like carbon. Further, a mixture or a laminate of the above materials may be used. For example, a glass slide coated with diamond-like carbon on the surface may be used. .
  • diamond or diamond dry carbon is preferable because the immobilization density of DNA is extremely high.
  • any of synthetic diamond, high pressure forming diamond and natural diamond can be used. Further, their structure may be either a single crystal or a polycrystal. From the viewpoint of productivity, it is preferable to use diamond produced by a gas phase synthesis method such as a microphone mouth-wave plasma CVD method.
  • Diamond or diamond-like carbon can be formed by a known method.
  • a microwave plasma CVD method for example, a ECR CVD method, an IPC method, a DC sputtering method, an ECR sputtering method, an ion plating method, an arc ion plating method, an EB evaporation method, a resistance heating evaporation method, and the like can be given.
  • metal powder and ceramic powder there is also a material obtained by sintering a raw material obtained by pressing a raw material using a press molding machine at a high temperature.
  • the surface of the carrier is intentionally roughened. Such a roughened surface is convenient for fixing a large amount of DNA and the like by increasing the surface area of the substrate. It is.
  • the shape of the substrate is not particularly limited, such as a flat plate, a thread, a sphere, a polygon, a powder, and the like.
  • the carrier for forming a hybrid made of diamond or diamond-like carbon is a composite of diamond or diamond-like carbon and another substance. It may be a body (eg, a two-phase body).
  • the chemical modification is performed by replacing the surface of the solid support with a hydrocarbon group having a polar group at its terminal, for example, a hydroxyl group, a carboxyl group, an epoxy group, an amino group, or the like, so that the polynucleotide can be bound.
  • the hydrocarbon portion of such a hydrocarbon group preferably has 0 to 12 carbon atoms, particularly preferably 0 to 6 carbon atoms.
  • Examples of such compounds include monocarboxylic acids such as formic acid, acetic acid, and propionic acid; dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, and fumaric acid; and polycarboxylic acids such as trimellitic acid. Of these, oxalic acid and succinic acid are preferred.
  • hydrocarbon group be amide-bonded to the surface of the solid support. This is because chemical modification can be easily and firmly performed by amide bond.
  • Such chemical modification is performed by chlorinating the surface of the support for hybrid formation by irradiating it with ultraviolet light, aminating it by irradiating it with ultraviolet light in ammonia gas, and then using an appropriate acid chloride or polycarboxylic anhydride. To achieve carboxylation.
  • oligonucleotide H the oligonucleotide hybridized to the chemically modified portion
  • a solution containing the oligonucleotide H (see SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) is spotted on a hybridization support, and the primary amine contained on the 5 ′ end side of the oligonucleotide is bound.
  • the terminal of the chemically modified hydrocarbon group be activated with a dehydration condensing agent before fixing, since fixing becomes easy.
  • the surface of the oligonucleotide-immobilized carrier is chlorinated and aminated (without carboxylation), and the formed primary amino group is added to the surface with N-hydroxysuccinimide. It can also be formed by dehydrating and condensing one ester group of an activated diester in which a dicarboxylic acid has been activated in advance.
  • the immobilized side should have 1 to 10 bases of primary amines such as deoxyadenylic acid, deoxycytidylic acid, and deoxyguarlic acid. Is desirable. Since the oligonucleotide H is immobilized in a direction perpendicular to the surface of the hybridization support, the DNA information can be easily read.
  • 1 to 20 bases on the fixed side (5 'end) are desoxyadenylic acid, deoxycytidylic acid, or desoxycytidylic acid.
  • the substrate for forming a hybrid in which the oligonucleotide is immobilized, is immersed in warm water at about 96 ° C, and then dehybridized by washing with water.
  • the surface of the diamond chip is chlorinated by irradiating the diamond chip with ultraviolet light in chlorine gas and then aminated by irradiating it with ultraviolet light in ammonia gas. Then, it is immersed in 1,4-dioxane containing 10% by weight of acid chloride and carboxylated. Then, a chemically modified chip was obtained.
  • the chemically-modified chip obtained in (1) was converted into an activated ester with hydrogen cyanamide and N-hydroxysuccinimide, and a 1-concentration aqueous solution of the previously obtained phage 2 lkbp fragment was obtained. GDN A was fixed in the glass.
  • the chip obtained in (2) was immersed in warm water at 96 ° C, washed with water, and dehybridized.
  • 2 lkbp of the phage obtained in (2) was labeled with Cy3 using Label IT TM (PanVera) to obtain a 1 g / ⁇ 1 aqueous solution. This solution was heated at 96 ° C for 5 minutes. The double strand was converted to a single strand, the chip dehybridized in (3) was immersed and hybridized, and the fluorescence intensity was measured with a fluorescence scanner. ⁇ phage 21 kb p had been 2 immobilized 30 f mo 1 / mm.
  • the surface is chlorinated by irradiating ultraviolet rays to a slide glass coated with soft diamond in chlorine gas, and then aminated by irradiating ultraviolet rays in ammonia gas, and then containing 1,0-dioxane containing 10% by weight of acid chloride. It was immersed in the carboxyl to obtain a chemically modified chip.
  • Oligonucleotide solutions ⁇ and ⁇ ⁇ adjusted to a concentration of 10 pmol / ⁇ 1 were immobilized on the hybridization support obtained in (1) using a spotter.
  • Oligonucleotide A (see SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) is oligonucleotide A '(see SEQ ID NO: 2 in the sequence listing), and oligonucleotide B (see SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) is oligonucleotide B' (see SEQ ID NO: 3).
  • the carrier for hybrid formation on which the oligonucleotide obtained in (2) is immobilized, is placed in boiling water at 96, and the oligonucleotide solution ⁇ (not hybridized) adjusted to a concentration of lpmol / ⁇ 1 is placed thereon. After covering with a cover glass, hybridization was performed at 5 ° C for 12 hours.
  • the hybridized carrier of the present invention has hybridized oligonucleotides fixed in a vertical direction, information such as DNA can be easily and accurately read. Also, the information is more accurate because it is dehypedized before reading.

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Description

明 細 書 ハイプリッド形成用担体及びハイプリットの固定化方法 技術分野
本発明は、 分子生物学分野、 遺伝子工学関連分野において有用な、 核酸を固定 化可能なハイブリット形成用担体、 オリゴヌクレオチド、 cDNAあるいは gD N Aからなるハイブリットの固定化方法に関するものである。 背景技術
遺伝子解析は分子生物学、 遺伝子工学分野で有用であり、 近年では病気の発見 等医療分野でも利用されている。
遺伝子解析において、 近年 DNAチップが開発され解析速度が著しく速くなつ た。 しかし従来の DNAチップはスライドガラス或いはシリコン基板表面にポリ リジン等の高分子を塗布し、 その後に DNAを固定する方法である。 また、 フォ トリソグラフ等の半導体技術を用いてガラス基板上にオリゴヌクレオチドを合成 する方法が用いられている。
しかし、 スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗 布して DN Aを固定する方法では、 DN Aの固定化状態が不安定であり、 ハイブ リッド形成工程や洗浄工程において、 DNAが剥離するといつた問題が生じる。 また、 半導体技術を用いた DNAチップは、 製造工程の煩雑さから非常に高価で あるという問題がある。
このような問題点を解決するためには、 固体支持体表面に DNAを高密度で且 つ強固に固定化する必要がある。
また、 従来、 固体支持体の表面を化学修飾した基体が知られている。 しかし、 化学修飾部分にアミド結合で直接所望の DN Aを結合させると、 化学結合の際の 処理等により DNAの末端部分が破損するおそれがあるため、 改良が望まれてい た。
本発明は、 上記のように DN Aの末端部分を破損させることなく、 DNAの解 明を効率的に行うことができ、 分子生物学分野、 遺伝子工学分野等において有用 なヌクレオチド固定化用担体を提供しようとすることを目的とするものである。 発明の開示
本発明者らは、 固体化用担体を化学修飾したものに、 ハイプリタイズしたオリ ゴヌクレオチドを固定することにより、 オリゴヌクレオチドが固定化用担体の表 面に対して垂直方向に固体化し、 一塩基多型の DN A情報を容易に読みとること ができる。
すなわち、 請求項 1記載の本発明は、 ハイブリタイズしたォリゴヌクレオチド 、 c DNAあるいは gDNAが固定化されていることを特徴とするハイプリッド 形成用担体を提供するものである。 ハイプリタイズしたオリゴヌクレオチド、 c DNAあるいは gDNAが 2個以上連続して第 1級ァミンを有するヌクレオチド 含むことが望ましい。 第 1級ァミンを有するヌクレオチドは、 デォキシアデニル 酸、 デォキシシチジル酸あるいはデォキシグァニル酸であることが望ましい。 また、 第 1級ァミンを有するヌクレオチドは、 5' 末端側に存在することが好ま しい。 オリゴヌクレオチドは、 5， 突出末端であることが好ましい。 cDNAが 5' 末端側に 2個以上連続して第 1級ァミンを有するヌクレオチドを含むオリゴ ヌクレオチドをプライマーとして合成されても良い。 gDNAが 5， 末端側に 2 個以上連続して第 1級ァミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制 限要素により切断されることを特徴とする。 gDNAが 5' 突出末端側に 2個以 上連続して第 1級ァミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制限要 素により切断されることを特徴とする。 更に、 デォキシアデニル酸、 デォキシシ チジル酸あるいはデォキシグァ-ル酸がハイプリット形成用担体側に固定化され ていることが望ましい。 ハイプリタイズしたオリゴヌクレオチド、 cDNAある いは g D N Aが固定側の末端に第 1級アミンを有するヌクレオチドを 1〜 10個 有することが望ましい。
請求項 1 1記載の発明は、 ハイブリッド形成用担体を化学修飾し、 これにハイ ブリタイズしたオリゴヌクレオチド、 c DNAあるいは g DNAを固定した後、 担体に固定されてない相補的オリゴヌクレオチド、 c DNAあるいは g DNAを デハイプリタイズすることを特徴とするオリゴヌクレオチド、 c DNAあるいは gDNAからなるハイブリットの固定化方法。 また、 ハイブリッド形成用担体の 化学修飾が、 担体の表面を塩素化、 アミノ化及びカルボキシル化の順に行った方 法が望ましい。 発明を実施するための最良の形態
本発明のハイプリッド形成用担体は、 化学修飾によってハイプリタイズしたォ リゴヌクレオチド、 c DNAあるいは gDNAが固定ィ匕されたされた担体であつ て、 オリゴヌクレオチド、 c DNAあるいは gDNAが担体に対して垂直に固定 化していることを特徴とするものである。 このため、 容易に、 一塩基多型の cD N Aの情報を読みとることができる。
このハイブリタイズしたオリゴヌクレチドは、 相補的なオリゴヌクレチドをデ ハイプリタイズして、 担体に残ったオリゴヌクレチドの情報を読みとる。
このように、 オリゴヌクレオチドは、 必然的に DNAなど二本鎖の核酸である 。 オリゴヌクレオチドは、 高等動物、 カビ類、 パクテリア、 ウィルス等の天然の もののほか、 人為的にこれらの構造改変を加えたもの、 合成したものが挙げられ るが、 後述の方法により簡便に合成することができるので、 好ましい。
なお、 オリゴヌクレオチドの塩基数は 10〜 50個とすることが好ましい。 本発明のハイプリッド形成用担体は、 以下の方法により簡便に作成することが できる。 ( 1 ) ハイブリッド形成用担体の化学修飾
本発明においては、 このようなオリゴヌクレオチドが化学修飾されたハイブリ ッド形成用用担体に固定化されている。
ハイブリッド形成用担体としては、 ガラス、 ダイヤモンド、 金、 銀、 銅、 アル ミニゥム、 タングステン、 モリブデン等の金属；上記ガラス、 ダイヤモンド、 金 属とセラミックスとの積層体；ポリカーボネート、 フッ素樹脂等のプラスチック 等が挙げられる。
その他の材料でも、 化学的に安定な材料であれば使用でき、 例えば、 グラファ イト、 ダイヤモンドライクカーボンが挙げられる。 また、 上記材料の混合体又は 積層体でもよい。 例えば、 ダイヤモンドライクカーボンを表面にコーティングし たスライドガラス等が挙げられる。 。
これらのうち、 D N Aの固定化密度が極めて高い点からダイヤモンド或いはダ ィャモンドライカーボンが好ましい。
ダイヤモンドとしては、 合成ダイヤモンド、 高圧形成ダイヤモンド、 或いは天 然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。 また、 それらの構造が単結晶体或い は多結晶体のいずれでも差し支えない。 生産性の観点よりマイク口波プラズマ C V D法などの気相合成法を用いて製造されたダイヤモンドを用いることが好まし い。
ダイヤモンド或いはダイヤモンドライクカーボンの形成方法は公知の方法で行 うことができる。 例えば、 マイクロ波プラズマ C V D法、 E C R C V D法、 I P C法、 直流スパッタリング法、 E C Rスパッタリング法、 イオンプレーティング 法、 アークイオンプレーティング法、 E B蒸着法、 抵抗加熱蒸着法などが挙げら れる。 また、 金属粉末やセラミック粉末等に関しては、 原料をプレス成形機を用 いて圧粉したものを高温で焼結したものもあげられる。
担体の表面は意図的に粗面化されていることが望ましい。 このような粗面化表 面は基体の表面積が増えて多量の D NA等を固定させることに好都合であるから である。 基体の形状は平板状、 糸状、 球状、 多角形状、 粉末状など特に問わない さらに、 このダイヤモンド或いはダイヤモンドライクカーボンからなるハイブ リッド形成用担体は、 ダイヤモンド或いはダイヤモンドライクカーボンと他の物 質との複合体 （例えば、 2相体） であってもよい。
化学修飾は、 ポリヌクレオチドを結合可能とすべく、 末端に極性基、 例えば、 水酸基、 カルボキシル基、 エポキシ基、 アミノ基等を有する炭化水素基で固体支 持体表面を置換することによる。 このような炭化水素基の炭化水素部分は、 炭素 数 0〜1 2、 中でも 0〜 6であることが好ましい。 このようなものとして、 蟻酸 、 酢酸、 プロピオン酸等のモノカルボン酸、 シユウ酸、 マロン酸、 コハク酸、 マ レイン酸、 フマル酸などのジカルボン酸、 トリメリット酸等の多価カルボン酸等 が挙げられるが、 中でもシユウ酸、 コハク酸が望ましい。
そして、 この炭化水素基は固体支持体表面に対しアミド結合されていることが 望ましい。 アミド結合させることにより、 化学修飾を容易かつ強固なものとでき るからである。
このような化学修飾は、 ハイプリッド形成用担体の表面に紫外線照射してを塩 素化、 アンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化、 次いで適当な酸クロリ ドぁ るいは無水多価カルボン酸を用いてカルボキシル化することにより達成できる。 ( 2 ) ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチドの固定
次に、 化学修飾部分にハイプリタイズしたオリゴヌクレオチド （以下、 オリゴ ヌクレオチド Hという。 ） をアミ ド結合により固定する。 このオリゴヌクレオチ ド H (配列表の配列番号 5参照） を含んだ液をハイブリダイズ形成用担体にスポ ットして、 オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端側に含まれる第 1級ァミンを結合させ る。 固定前に、 化学修飾の炭化水素基末端を脱水縮合剤で活性化しておくと、 固 定が容易となるので望ましい。 特に、 脱水縮合剤としては、 カルポジイミドを用 いることが好ましい。 なお、 このような方法のほか、 オリゴヌクレオチド固定化担体の表面を塩素化 、 ァミノ化した状態 （カルボキシル化しない） とし、 形成された第 1級ァミノ基 に、 N—ヒ ドロキシスクシンイミ ドによりジカルボン酸を予め活性化した活性化 ジエステルの一方のエステル基を脱水縮合させることにより形成することもでき る。
また、 化学修飾したハイブリダイズ形成用担体とのアミ ド結合の容易性を考慮 して、 固定側にデォキシアデニル酸、 デォキシシチジル酸、 デォキシグァ -ル酸 等の第 1級ァミンを 1〜1 0塩基有することが望ましい。 オリゴヌクレオチド H はハイプリダイズ形成用担体の表面に対して垂直方向に固定化されるので、 D N Aの情報を読みとりやすい。
特に望ましくは、 固定側 （5 ' 末端） の 1〜2 0塩基がデォキシアデニル酸、 デ ォキシシチジル酸又はデォキシシチジル酸であることが望ましい。
( 3 ) オリゴヌクレオチド Ήをデハイブリダィズさせる。
9 6 °C位の温水中にォリゴヌクレオチドを固定したハイプリダイズ形成用担 体を浸漬し、 更に水洗することによりデハイプリタイズする。 実施例
実施例 1 c o R Iで切断した g D NAを固定化したハイブリッド形成用担体 )
( 1 ) ハイプリッド形成用担体の化学修飾
塩素ガス中でダイヤモンドチップに紫外線照射して表面を塩素化し、 次いでァ ンモユアガス中で紫外線照射してァミノ化した後、 酸クロリ ドを 1 0重量％含む 1 , 4—ジォキサン中に浸漬してカルボキシルイ匕し、 化学修飾されたチップを得 た。
( 2 ) £ c o R Iによる； Lファージ D NAの切断
λファージ D NAを £ c o R Iにより切断し 2 1 k b pのフラグメントを回収 した。
(1) で得られた化学修飾されたチップを、 ハイドロゲンシァナミ ドと N—ヒ ドロキシスクシンイミ ドにより活性化エステルとし、 先に得られたえファージ 2 l kb pフラグメントの 1濃度の水溶液に浸漬けて gDN Aを固定ィ匕 した。
該フラグメントの 500 b pのセグメントを PC Rによる増幅を確認することに より、 gDNAがチップに対して垂直方向に固定化していることを確認した。
(3) ハイプリタイズした gDNAのデハイプリタイズ
( 2 ) で得られたチップを 96 °Cの温水中に浸漬後、 水洗してデハイプリタイ ズした。
(4) λファージ 21 k b pフラグメントの Cy 3標識
(2) で得られたえファージ 2 l k b pを Label IT™ (PanVera社). を用いて C y 3標識し、 1 g/μ 1の水溶液とした。 この溶液を 96 °Cで 5分間加熱して. 2本鎖を 1本鎖にして、 （3) でデハイブリダィズしたチップを浸漬しでハイブ リダィズさせた後、 蛍光スキャナーで蛍光強度を測定した結果、 λファージ 21 kb pは 30 f mo 1 /mm2固定化されていた。
実施例 2 (オリゴヌクレオチドを固定したハイプリダイズ形成用担体による一塩 基変異の検出）
( 1 ) ハイプリッド形成用担体の化学修飾
塩素ガス中で軟ダイヤモンドをコ一ティングしたスライ ドグラスに紫外線照射 して表面を塩素化し、 次いでアンモニアガス中で紫外線照射してァミノ化した後 、 酸クロリ ドを 10重量％含む 1， 4—ジォキサン中に浸漬してカルボキシル化 し、 化学修飾されたチップを得た。
(2) オリゴヌクレオチドの固定
(1) で得られたハイブリッド形成用担体に、 スポッターを用いて、 10 pm o l /μ 1の濃度に調製したオリゴヌクレオチド溶液 Αおよび Βを固定化した。 なお、 オリゴヌクレオチド A (配列表の配列番号 1参照） はォリゴヌクレオチド A' (配列表の配列番号 2参照） と、 オリゴヌクレオチド B (配列表の配列番号 3参照） はオリゴヌクレオチド B' (配列表の配列番号 4参照） と、 4°Cで 5時 間ハイプリダイズさせた後にサンプルとして用いた。
(3) ハイブリダィゼーション
(2) で得られたオリゴヌクレオチドを固定化したハイプリッド形成用担体を 96での熱湯中に入れ、 l pmo l /μ 1の濃度に調製したオリゴヌクレオチド 溶液 Α (ハイプリダイスさせていない） をのせ、 カバーグラスで覆った後に、 5 °Cで 12時間ハイブリダイズした。
(4) 蛍光観察
(3) で得られた基板を洗浄 ·乾燥し、 蛍光スキャナーで観察した結果、 オリ ゴヌクレオチド Aを固定したスポッ トでは蛍光が観察され、 オリゴヌクレオチド Bを固定したスポットからは蛍光が観察されなかった。 産業上の利用可能性
本発明のハイブリッド形成用担体は、 ハイブリタイズしたォリゴヌクレオチド を垂直方向に固定しているので、 DNA等の情報が容易に、 正確に読みとれる。 また、 読みとる前にデハイプリタイズしているので、 情報がより正確になる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、 c DNAあるいは g DNAが固 定化されていることを特徴とするハイプリッド形成用担体。
2. ハイブリタイズしたオリゴヌタレチド、 c DNAあるいは g DNAが 2個 以上連続して第 1級ァミンを有するヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項 1記載のハイブリッド形成用担体。
3. 第 1級ァミンを有するヌクレオチドがデォキシアデニル酸、 デォキシシチ ジル酸あるいはデォキシグァニル酸であることを特徴とする請求項 1又は 2記載 のハイプリッド形成用担体。
4. 第 1級ァミンを有するヌクレオチドが 5， 末端側に存在することを特徴と する請求項 1〜 3記載のハイプリッド形成用担体。
5. オリゴヌクレオチドが 5' 突出末端であることを特徴とする請求項 1乃至 4記載のハイプリッド形成用担体。
6. cDNAが 5， 末端側に 2個以上連続して第 1級ァミンを有するヌクレオ チドを含むォリゴヌクレオチドをプライマーとして合成されることを特徴とする 請求項 1又は 2記載のハイブリッド形成用担体。
7. gDNAが 5， 末端側に 2個以上連続して第 1級ァミンを有するヌクレオ チドが含まれるように切断する制限酵素により切断されることを特徴とする請求 項 1又は 2記載のハイプリッド形成用担体。
8. gDNAが 5' 突出末端側に 2個以上連続して第 1級ァミンを有するヌク レオチドが含まれるように切断する制限酵素により切断されることを特徴する請 求項 1、 2又は 7記載のハイプリッド形成用担体。
9. デォキシアデ-ル酸、 デォキシシチジル酸あるいはデォキシグァニル酸が ハイプリッド形成用担体側に固定化されていることを特徴とする請求項 1乃至 8 記載のハイプリッド形成用担体。
10. ハイプリッド形成用担体に固定するハイプリタイズしたオリゴヌクレオ チド、 c DNAあるいは gDNAが、 固定側の末端に第 1級ァミンを有するヌク レオチドを 1〜10個有することを特徴とする請求項 9記載のハイプリッド形成 用担体。
1 1. ハイプリッド形成用担体を化学修飾し、 これにハイブリタイズしたォリ ゴヌクレオチド、 cDNAあるいは gDNAを固定した後、 担体に固定化されて いない相補的なオリゴヌクレチド、 c DNAあるいは gDNAをデハイブリタイ ズすることを特徴とするハイプリットの固定化方法。
1 2. ハイプリッド形成用担体の化学修飾が、 ハイプリッド形成用担体の表面 の塩素化、 ァミノ化およびカルボキシルイ匕からなる請求項 1 1記載のハイプリッ トの固定化方法。
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