WO2002038771A1 - Integrases du hiv tolerantes aux medicaments - Google Patents

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WO2002038771A1
WO2002038771A1 PCT/JP2001/009615 JP0109615W WO0238771A1 WO 2002038771 A1 WO2002038771 A1 WO 2002038771A1 JP 0109615 W JP0109615 W JP 0109615W WO 0238771 A1 WO0238771 A1 WO 0238771A1
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WO
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amino acid
sequence encoding
acid sequence
nucleic acid
mutation
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Application number
PCT/JP2001/009615
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English (en)
French (fr)
Inventor
Akihiko Sato
Tomokazu Yoshinaga
Original Assignee
Shionogi & Co., Ltd.
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Publication date
Application filed by Shionogi & Co., Ltd. filed Critical Shionogi & Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the present invention relates to an HIV integrase, specifically, an HIV integrase having a resistance mutation, a polynucleotide encoding the HIV integrase, an HIV containing them, a detection method for detecting them, and an Atsey method using them.
  • an HIV integrase specifically, an HIV integrase having a resistance mutation, a polynucleotide encoding the HIV integrase, an HIV containing them, a detection method for detecting them, and an Atsey method using them.
  • HIV Human immunodeficiency virus
  • HIV integrase inhibitor-resistant HIV because HIV integrase inhibitors themselves are few.
  • HIV integrase inhibitor-resistant HIV integrase is described in Science, 1999, Vol. 287, p646-650, as a wild-type strain (HXB2 strain: HIV containing HIV integrase represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing).
  • HXB2 strain HIV containing HIV integrase represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • No. AF033819 HIV integrase inhibition in which amino acid at position 6 has been mutated from threonine to isoleucine, amino acid at position 153 has been changed from serine to tyrosine, and / or amino acid at position 154 has been mutated from methionine to isoleucine.
  • Drug resistant HIV integrase has been disclosed. Specifically, it is HIV integrase described in any one of SEQ ID NOs: 8 to 12 in the sequence listing.
  • HIV integrase which is not an HIV integrase that acquired resistance in the presence of an HIV integrase inhibitor, is known to have alanine at the 6th amino acid and methionine at the 74th amino acid. I have. Specifically, it is an HIV integrase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing (accession number: AJ239083).
  • HIV integrase the following HIV integrase is registered in GenBank (NCBI; National Center for Biotechnology Information) ( 6)
  • GenBank National Center for Biotechnology Information
  • the HIV integrase whose third amino acid is isoloisin is represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
  • HIV integrase having the amino acid sequences described in (14) and (14) (AJ251056, AJ276595) are registered.
  • the third amino acid is isoleucine
  • the fourth amino acid is isoleucine
  • 15 The amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 (accession number: L20587) is registered as an HIV integase in which the third serine is alanine and the lysine at position 160 is serine.
  • the amino acid is methionine, the amino acid at position 4 is isoleucine, the serine at position 15 is alanine, the amino acid at position 160
  • An HIV integrase having the amino acid sequence (accession number: L20571) described in SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing is registered as an HIV integrase in which lysine is serine.6 HIV in which the sixth amino acid is proline
  • an HIV integrase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 20 or 21 in the sequence listing (accession numbers: U69588, U69584, in that order) is registered.
  • An HIV integrase having an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 19 (accession number: AF040319) in the Sequence Listing has been registered as an integase.15
  • An HIV integrase having the third amino acid as proline has been registered.
  • An HIV integrase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17 in the column list (accession number: AF040327) has been registered.
  • An HIV integrase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 (accession number: U71182) has been registered as an HIV integrase whose aspartic acid is aspartic acid.
  • An HIV integrase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 22 (accession number: AF086817) has been registered as an HIV integrase in which the amino acid at position 13 is lysine.
  • accession numbers in the present specification represent the accession numbers of GenBank (NCBI; National Center for Biotechnology Iniormation) of the nucleic acid encoding each protein.
  • a sequence in which the 2nd amino acid is substituted with valine, a sequence in which the 18th amino acid is substituted with arginine, 121 A sequence in which the amino acid at position 13 is replaced with leucine, a sequence in which the amino acid at position 13 is replaced with serine, norin or threonine, a sequence in which the amino acid at position 14 is substituted with histidine, A sequence in which the amino acid has been replaced with leucine and a sequence in which the 160th amino acid has been replaced with asparagine have been registered.
  • the amino acid which is considered to be a wild strain as a result of examining the mutation site found in the present invention by GenBank is described below. 6
  • the third amino acid is leucine
  • the sixth amino acid is threonine
  • the 70th amino acid is glycine or glucomic acid
  • the 72nd amino acid is valine, isoleucine or glycine
  • the 4th amino acid is leucine, isoleucine, norin or proline
  • the 2nd amino acid is glutamic acid or aspartic acid
  • the 8th amino acid is glycine, 1 2 1
  • the amino acid at position 13 is glutamic acid or aspartic acid;
  • the amino acid at position 140 is glycine;
  • the amino acid at position 45 is proline;
  • the amino acid at position 146 is glutamine;
  • the amino acid at position 148 is glutamine ';
  • the amino acid at position 1 is valine or isoleucine;
  • the present inventors have determined the nucleic acid sequence of HIV that has acquired resistance to an HIV integrase inhibitor in order to solve the above problems, and have completed the following invention.
  • an HIV integrator having the amino acids at positions 4 and 116 being aspartic acid, the amino acid at position 152 being glutamic acid, and having at least one mutation arbitrarily selected from the following group: Ize;
  • the third amino acid is an amino acid other than leucine
  • 6th amino acid is an amino acid other than threonine
  • the amino acid at position 70 is an amino acid other than glycine and glutamic acid;
  • the second amino acid is an amino acid other than valine, isoleucine and glycine;
  • (e) 74 is an amino acid other than leucine, isoleucine, valine and proline;
  • the second amino acid is an amino acid other than glutamic acid and aspartic acid
  • the amino acid at position 8 is other than glycine;
  • 1st 1st amino acid is an amino acid other than phenylylalanine;
  • 1st amino acid is an amino acid other than glycine;
  • amino acid at position 13 is an amino acid other than glutamic acid and aspartic acid;
  • amino acid at position 146 is an amino acid other than glutamine
  • the first amino acid is an amino acid other than valine and isoleucine
  • amino acid at position 153 is an amino acid other than serine and alanine
  • amino acid at position 155 is an amino acid other than asparagine
  • the amino acid at position 160 is an amino acid other than lysine, glutamine, threonine and glutamic acid;
  • the 249th amino acid is an amino acid other than valine and leucine
  • (s) 250 the amino acid at position 50 is an amino acid other than valine, leucine and alanine;
  • HIV-integrase having the amino acid sequence of any one of (1) to (22) is excluded.
  • the sixth amino acid is isoleucine or alanine
  • the ninth amino acid is glutamine;
  • the amino acid at position 118 is serine;
  • the sixth amino acid is arginine
  • amino acid at position 15 is serine, isoleucine, threonine or histidine;
  • an AIDS therapeutic agent comprising the HIV integrase inhibitor according to (20) above as an active ingredient;
  • Cells eg, human T cells are infected with a wild-type strain of HIV in the presence of an HIV integrase inhibitor, subcultured, and a few days later, the HIV-infected cells are homogenized, and the HIV provirus is detected using PCR. By sequencing the DNA base sequence, the nucleic acid sequence encoding the HIV integrase was examined.
  • HIV integrase inhibitor compounds described in WO 00/39086 or Science, 1999, Vol. 287, p646-650 can be used.
  • Compound A 4- (tribenzenesulfonyl-5-chloroindole-3-yl) -2-hydroxy-4-oxo-2-2-butyl Formic acid (hereinafter referred to as Compound A), 1- [5- (4-Fluorobenzyl) furan-2-yl] -3_hydroxy-3- (5-chloro-1--1,2,4-tol Lyazol-3-yl) probenone (hereinafter referred to as i-conjugated compound B), tri- [5- (4-fluoropentyl) furan-2-yl] -3-hydroxy-3-1, 2,4-triazol-3-yl) propenone (hereinafter referred to as Compound C), 4- [1- (4-fluorobenzyl) -1-pipial-2-yl]- 2-Hyd
  • compound D 1- [5- (4-fluorophenylthio) furan-2-yl] -3-hydroxy-3- (1-1,2,4-triazole- 3-yl) propenone (hereinafter referred to as Compound E), 4- [3,5- (bisbenzyloxy) phenyl] -2-hydroxy-4-oxo-2-butenoic acid ( Hereinafter, compound F) can be used.
  • compound E 1- [5- (4-fluorophenylthio) furan-2-yl] -3-hydroxy-3- (1-1,2,4-triazole- 3-yl) propenone
  • compound F 4- [3,5- (bisbenzyloxy) phenyl] -2-hydroxy-4-oxo-2-butenoic acid
  • NL43 integlase portion of the HIV molecular clone
  • a polynucleotide for example, DNA
  • the virus was cloned into cells (eg, human T cells) to produce an HIV virus clone having an HIV integrase having the desired mutation.
  • 70th amino acid is arginine
  • HIV-integrase of the present invention has an active-centered amino acid in which a mutation site arbitrarily selected from the above-mentioned resistance mutation sites has been substituted with one or more arbitrary amino acids as compared to the HIV wild-type strain.
  • Means HIV Integral Generally, HIV integrase is a polypeptide consisting of 288 amino acids, but the HIV protease of the present invention is not limited to a polypeptide consisting of 288 amino acids.
  • HIV integrase consisting of 298 amino acids extended by 10 amino acids at the C-terminus, such as the HIV integrase described in SEQ ID NOS: 15 and 16 in the sequence listing (the amino acid at the active center).
  • the amino acids at positions 6 and 11 Laginic acid and the 15th second amino acid is glumic acid.
  • the HIV integrase of the present invention has an active center amino acid conserved and has HIV integrase activity.
  • HIV integrase in which amino acids at positions 156 and 159 are conserved is preferred.
  • the 156th and 159th amino acids are lysine. It is also preferred that the Zn finger motif (the amino acids at positions 12 and 16 be histidine and the amino acids at positions 40 and 43 be cysteine) is also conserved.
  • the present invention has found a site where mutation of HIV integrase easily occurs in the presence of a compound (eg, an HIV integrase inhibitor), and does not particularly limit the type of amino acid at the mutation site . That is, the amino acid at the mutation site may be any amino acid other than an amino acid known as a wild-type strain.
  • the HIV integrase of the present invention means an HIV integrase having at least one mutation arbitrarily selected from the following group.
  • the third amino acid is an amino acid other than leucine
  • 6th amino acid is an amino acid other than threonine
  • the 70th amino acid is an amino acid other than glycine and glumic acid
  • the second amino acid is an amino acid other than valine, isoleucine and glycine;
  • (e) 74th is an amino acid other than leucine, isoleucine, norin and proline;
  • the second amino acid is an amino acid other than glutamate and aspartate
  • amino acid at position 118 is other than glycine
  • the first amino acid is an amino acid other than phenylalanine
  • the amino acid at position 13 is an amino acid other than glumic acid and aspartic acid;
  • the amino acid at position 140 is an amino acid other than glycine;
  • the amino acid at position 145 is an amino acid other than proline;
  • amino acid at position 146 is an amino acid other than glumin
  • the first amino acid is an amino acid other than valine and isoleucine
  • the amino acid at position 153 is an amino acid other than serine and alanine;
  • the amino acid at position 155 is an amino acid other than asparagine;
  • the 160th amino acid is an amino acid other than lysine, glutamine, threonine and glutamic acid;
  • the 249th amino acid is an amino acid other than valine and leucine
  • the (s) 250th amino acid is an amino acid other than valine, leucine and alanine.
  • amino acids from the viewpoint acquired resistance to HIV Integral Ichize inhibitors, c also HIV Integuraze is important 6 6 amino acid is an amino acid other than threonine, the present invention is to be substituted in the mutation site of the Was also found.
  • an HIV integrase having at least one mutation arbitrarily selected from the following groups can be mentioned.
  • the sixth amino acid is isoleucine or alanine
  • the 146th amino acid is arginine
  • the (s) 250th amino acid is isoleucine.
  • HIV integrase whose amino acid at position 66 is isoloisin or alanine is important from the viewpoint of acquiring resistance to HIV integrase inhibitors. Since the HIV integrase of the present invention conserves the amino acid at the active center, amino acids other than the active center and the mutation site are not impaired as long as the function of HIV integrase is not impaired. It may be any amino acid as long as it has activity. For example, it may be an amino acid selected by searching in a database or the like, or may be an amino acid of a wild strain or a clinical isolate.
  • HIV integrase activity means not only a case having HIV integrase activity in an enzyme-based experiment but also an HIV capable of forming a proliferable HIV when converted to HIV. I just need.
  • HIV integrase of the HIV wild type strain SEQ ID NO: 1: HIV-1 pNL43 subclone4-20 Integrase, accession number: U26942; SEQ ID NO: 2: HIV-1 IIIB Integrase; SEQ ID NO: 3: HIV-1 IIIB (shionogi clone) Integrase; SEQ ID NO: 4: IIIB / LAI clone HXB2 Integrase, accession number: AF033819
  • a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted with an arbitrarily selected amino acid is mentioned.
  • the HIV integrase of the present invention has deletions and substitutions of aspartic acid at positions 64 and 116, glutamic acid at position 152 and one or more amino acids other than the amino acid at the mutation site selected above. Alternatively, added HIV integrase is also within the scope of the present invention.
  • An HIV integrase in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added is, for example, an amino acid sequence having at least 70%, preferably 80% or more homology to the amino acid sequence of a reference HIV integrase.
  • a polypeptide having an amino acid sequence having at least 80% homology to a control amino acid sequence selected from the group consisting of amino acids in the sequence listing is defined as a polypeptide having the sequence of the reference amino acid sequence It means that the amino acid sequence of the polypeptide and the control sequence are identical, except that up to 20 amino acid changes can be included for every 100 amino acids.
  • a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 80% homologous to the reference amino acid sequence will have up to 20% of the amino acids in the reference sequence deleted or replaced with another amino acid. Or up to 20% of the total number of amino acids in the control sequence may be introduced into the control sequence.
  • the HIV integrase of the present invention is preferably an HIV integrase that can constitute a proliferable HIV. Whether or not an HIV integrase capable of constituting a proliferable HIV can be determined by preparing an HIV-integrase containing the HIV integrase of the present invention, infecting the cells, and examining the proliferation ability in the cells.
  • the HIV integrase of the present invention includes all of HIV integrase produced by gene recombination technology, naturally occurring HIV integrase, and organically synthesized HIV integrase. Preferably, it is an HIV-integrase produced by a genetic engineering technique.
  • an amino acid means a naturally occurring amino acid, and is glycine, alanine, norin, leucine, isoleucine, fenylalanine, tyrosine, triptofan, serine, threonine, cysteine. , Methionine, proline, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine and the like.
  • the HIV integase of the present invention is obtained by introducing a polynucleotide (eg, a DNA fragment) encoding them into a commercially available vector or plasmid using a restriction enzyme and a DNA ligase, and then introducing the host cell (eg, The protein can be produced by expressing a large amount of the protein using E. coli, etc., and collecting and isolating and producing the expression product.
  • the cells can be cultured in a conventional medium modified so as to be suitable for promoter activation, transformant selection or gene amplification. Culture conditions such as temperature and pH depend on the host cell used, but can be easily set by those skilled in the art.
  • the HIV integrase can be purified directly from the medium.
  • the HIV integrase can be isolated from a cell lysate or recovered from a cell membrane fraction.
  • Recovery, isolation and purification methods include ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation. , Acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity mouth chromatography, hydroxyapatite chromatography, lectin chromatography and the like. Finally, high quality liquid high performance chromatography may be used.
  • polypeptide of the present invention can be obtained synthetically using a peptide synthesizer.
  • restriction enzymes Ndel, Bam HI and the like can be used.
  • DNA ligase T4 DNA ligase and the like can be used.
  • the following vectors can be used.
  • a pET15b vector from Nova Agen can be used.
  • the expression vector pET15b (E.coli BL21 (DE3)) S pBR322 (E. coli), P ACYC177 (E. coli), bacteriophage one di person (E. coli), P KT230 (Gram-negative cells), pGV1106 (Gram-negative cells), pLAFRI (Gram-negative cells), pME290 (Non-E. coli Gram-negative cells), pHV14 (E.
  • the polynucleotide of the present invention refers to a polynucleotide encoding the HIV integrase of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention means a polynucleotide encoding an HIV integrase characterized by the amino acid sequence of the HIV integrase of the present invention or a deletion, substitution or addition thereof.
  • the polynucleotide of the present invention is a part contained in the RNA genome of HIV. And may be part of the DNA genome of a persistently infected cell.
  • the polynucleotide of the present invention may be in the form of RNA or in the form of DNA including, for example, cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • the DNA may be double-stranded or single-stranded, and if single-stranded, may be the coding strand or the non-coding strand (antisense strand).
  • the coding sequence encoding the HIV integrase of the present invention is not particularly limited to a specific nucleic acid sequence as long as it is a polynucleotide encoding HIV integrase. That is, all nucleic acid sequences are included if they are nucleic acid sequences encoding the same amino acid sequence.
  • 187th C is G
  • 196th A is G
  • 197th C is T
  • 220th ⁇ is ⁇
  • 3 5 2nd G is ⁇
  • 4 3 3rd ⁇ is 1 ⁇ 43 7th ⁇ is G
  • 442nd C is A
  • 45 1st A is T
  • 458 8th C is ⁇
  • a polynucleotide having a nucleic acid sequence in which the 46th G is ⁇ , the 464th ⁇ is G or C, and / or the 745th G is A.
  • the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is a nucleic acid sequence encoding an integrase site of a wild-type strain (NL43), and the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 6 is restricted without changing the amino acid sequence of the wild-type strain. It is a nucleic acid sequence into which enzyme sites (Xbal and Clal) have been introduced.
  • the above is a specific example, and may be polynucleotides having different nucleic acid sequences as a result of the degeneracy of the genetic code.
  • the polynucleotide of the present invention may have a coding sequence that is a naturally occurring allelic variant of the coding sequence characterized by the DNA sequence disclosed herein.
  • an allelic variant is another form of a polynucleotide sequence in which one or more nucleotides may be substituted, deleted or added, and the encoded polypeptide Function does not substantially change.
  • the polynucleotide encoding the mature polypeptide may include only the coding sequence of the mature polypeptide, or may include the coding sequence of the mature polypeptide and a leader or secretory sequence or May contain additional coding sequences, such as a proprotein sequence. That is, the polynucleotides of the present invention include polynucleotides that include only the coding sequence of the polypeptide, as well as polynucleotides that include additional coding and / or non-coding sequences.
  • the present invention relates to a method wherein the coding sequence of a mature polypeptide is a polynucleotide sequence that promotes expression and secretion of the polypeptide from a host cell (eg, a secretory sequence that controls the transport of the polypeptide from the cell). A functional leader sequence).
  • a polypeptide having a leader sequence is a preprotein that is cleaved by the host cell to produce a polypeptide proprotein.
  • a polynucleotide may encode a proprotein, which comprises a mature protein and additional N-terminal amino acid residues. When the mature protein having the mouth sequence is cleaved, the active mature protein remains.
  • the polynucleotide of the invention may encode a mature protein, or may encode a protein having a prosequence or a protein having both a prosequence and a presequence (leader sequence).
  • the polynucleotide of the present invention may have a coding sequence fused in frame to a marker sequence enabling purification of the polypeptide of the present invention at either the 5 ′ or 3 ′ end of the gene.
  • the marker sequence may be a hex-histidine tag provided by the PET series vector (commercially available from Novagen), which tag is a polypeptide fused to a marker in the case of a bacterial host. Enables purification.
  • the polynucleotide of the present invention can be replicated in large quantities by using an RT-PCR method using the HIV RNA genome as a type II, a PCR method using a cDNA as a type II, or the like.
  • the polynucleotide of the present invention can constitute a proliferable HIV Polynucleotides are preferred. Whether or not a polynucleotide capable of constituting a proliferable HIV can be determined by preparing a plasmid containing the polynucleotide of the present invention, introducing the plasmid into a cell to produce a virus, and infecting the cell with the virus to infect the cell. Proliferation ability should be examined.
  • the vector or plasmid of the present invention refers to a vector or plasmid containing the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide or plasmid of the present invention can be obtained by using a restriction enzyme or DNA ligase to obtain a commercially available vector (for example, plasmid or cosmid). , Phage, etc.).
  • restriction enzymes Ndel, Bam HI and the like can be used.
  • DNA ligase T4 DNA ligase and the like can be used.
  • a vector refers to a vector derived from a combination of bacterial plasmid, phage DNA, baculovirus, yeast plasmid, plasmid, and phage DNA, but other than the above as long as they can replicate in the host cell. Vectors may be used.
  • vectors include, as bacterial vectors, pET15b vector, pET3 vector, pQE70, pQE60 s pQE-9 N pbs ⁇ pD10, phage script, psiXl74, pbluescript SE :, pdsks, pNH8A ⁇ pNHl6al pNH18A ⁇ pNH46A, ptrc99a , pKK233-3, pDR540, pRIT5 and examples Kuta one base eukaryotic cells, pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44s pXTl, pSG s pSVK3, p'BPV, pMSG, include pSVL.
  • the pET15b vector from Novagen is preferred.
  • a polynucleotide is inserted into an appropriate restriction end nuclease site of a vector.
  • the polynucleotide in the vector is operably linked to a suitable promoter that directs mRNA synthesis.
  • suitable promoter include a T7 promoter, LTR or SV40 promoter, lac or trp of E. coli, Pt promoter of lambda phage, prokaryotic cell, eukaryotic cell, and the like.
  • Other promoters known to control gene expression in viruses One evening.
  • the vector may contain a ribosome binding site for translation initiation, a transcription terminator, and an appropriate nucleic acid sequence for expression amplification.
  • Vectors may contain one or more selectable markers that confer a phenotype for the selection of transformed host cells.
  • the dihydrofolate reductase gene or neomycin resistance gene can be used, and in Escherichia coli, the tetracycline resistance gene or ampicillin resistance gene can be used. can do.
  • the HIV of the present invention means an HIV containing the HIV integer of the present invention or the polynucleotide of the present invention.
  • the HIV of the present invention can be prepared as follows: Only the sequence of the integrase portion of the molecular clone pNL43 is replaced by a polynucleotide (for example, DNA) encoding HIV integrase prepared based on the above sequence. Plasmid may be prepared and incorporated into cells (eg, human T cells) to generate an HIV virus clone having an HIV integrase having the desired mutation.
  • the cell persistently infected with the HIV of the present invention means a cell persistently infected with the HIV of the present invention.
  • Cells that have been persistently infected with the HIV of the present invention can be prepared by adding the vector or plasmid of the present invention together with a plasmid DNA containing a polynucleotide encoding other enzymes necessary for HIV formation to a cell (for example, human). T cells). In addition, it can also be produced by infecting cells with the HIV of the present invention. As the cells, human T cells and the like can be used.
  • the probe or primer of the present invention means a probe or primer that specifically hybridizes to the polynucleotide of the present invention.
  • the probe or primer used for detecting or replicating the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a probe or primer specifically binding to the polynucleotide of the present invention. . That is, any probe or primer that hybridizes to the nucleic acid sequence of the polynucleotide of the present invention under stringent conditions may be used. When used for detection of a mutation site, a probe or primer complementary to a polynucleotide encoding 7 to 20 amino acids including the mutation site is preferable.
  • a probe or primer that hybridizes under stringent conditions refers to a polynucleotide that hybridizes when the identity between the sequences is at least 95%, preferably at least 97%.
  • the probe or primer that specifically binds to the polynucleotide of the present invention means a probe or primer that does not bind to a wild-type strain and binds to a mutant (resistant mutant).
  • the HIV of the present invention can be detected using the probe or the primer of the present invention.
  • a method of detecting a wild-type strain and a mutant strain separately is preferable.
  • HIV is characterized by detecting a mutation in a nucleic acid sequence encoding at least one amino acid arbitrarily selected from the following group. Is preferable;
  • (n) 15 a mutation from a nucleic acid sequence encoding the first valine or isoloisin to a nucleic acid sequence encoding an amino acid other than valine or isoloisin;
  • the detection method of the present invention not only detects HIV obtained from a patient to whom an HIV integrase inhibitor containing Compounds A to F described above has been administered but also to a patient to whom another HIV integrase inhibitor has been administered, or not yet. It can also be used as a method for detecting HIV obtained from patients receiving the drug.
  • a hybridization method using DNA or RNA having the sequence of the resistance mutation or DNA or RNA having the sequence immediately before or immediately after the DNA without the resistance mutation site as the probe type I Poligonucleotide ligation method and their applications RT-PCR or PCR using DNA or RNA having a sequence of a resistance mutation as a primer, having a sequence immediately 5 'to the site of a resistance mutation It can be detected by a method that applies extension reaction using DNA and RNA as primers (1Nakamura Yusuke. (2000) SNP: Its Importance and Analysis. Experimental Medicine. Vol.18, p587- 1594. 2Toshihide Nishimura, Sankiya Suda. (2000) Present and Future of SNP Typing Technology. Experimental Medicine.
  • Vol.18, pl894- 1900. is, c first, HIV or persistent infection fine from HIV infected individuals include the following detection method Then, the sensitivity to the integrase inhibitor (compounds A to F) is measured in vitro, and the extent to which growth is inhibited by the integrase inhibitor is compared with that in the absence of the drug. If the sensitivity to the integrase inhibitor is reduced, it can be said that the HIV has acquired drug resistance. That is, by this detection method, it can be concluded that the HIV has the mutation identified in the present invention (for example, the mutation described in Table 1). The HIV of the present invention and the cells persistently infected with the HIV of the present invention can be used for the assay.
  • a cell eg, a human T cell
  • a cell eg, a human T cell
  • a cell eg, a human T cell
  • the effective compound should be selected by comparing the EC 50 value (concentration of the compound that suppresses cell damage caused by the virus by 50%) and the CC 50 value (the concentration of the compound at which the compound has 50% cytotoxicity). Can be.
  • the usefulness of the compound or drug can be further examined by simultaneously measuring the activity against a wild-type HIV strain and comparing it with the activity against a resistant strain.
  • the assay may be performed by the following method. In other words, it is known that by incorporating an integrase that expresses only integrase as a separate molecule into an mv lacking the integration activity, the integration activity is complemented and virus infection is established. (Virology, Vol. 255, 1999, p77-85, A novel vpr peptide interactor fused to integrase (IN) restore integration activity to IN-defective HIV-1 virions. J. Kulkosky, M. BouHamdan, A.
  • the HIV integrase of the present invention can also be used in an assay for searching for an HIV integrase inhibitor (or activator), like the HIV of the present invention and the cells persistently infected with the HIV of the present invention. That is, it is only necessary to determine whether the test compound binds or interacts with HIV integrase and inhibits (or activates) HIV integrase activity.
  • This method involves contacting a test compound with HIV integrase under conditions that allow the test compound to bind or interact with HIV integrase. It can be performed by measuring the change in HIV integrase activity due to the binding or interaction of the test compound with HIV integrase and evaluating whether or not HIV integrase is inhibited. For example, using the substrate DNA and evening gate DNA, the binding or interaction of the test compound with HIV integrase can be used to reduce the incorporation of substrate DNA into evening gate DNA by HIV integrase. You only need to measure it.
  • Atsie method examples include the Atsey method described in WO 00/39086.
  • the HIV integrase having the resistance mutation of the present invention can be used for the assay in exactly the same manner by simply adding the HIV integrase to a normal reaction buffer instead of the wild-type integrase described in WO 00/39086. . With such an approach, it is possible to find compounds and drugs that are effective against existing drug-resistant HIV. In addition, the activity of wild-type integrase is measured at the same time, and the activity of the compound or drug can be examined by comparing the activity with integrase having a resistance mutation.
  • the compounds selected as a result of these assays mean, for example, organic compounds having a molecular weight of 15 to 100,000, and the constituent atoms thereof are hydrogen, lithium, boron, carbon, nitrogen, oxygen, and fluorine. , Sodium, magnesium, aluminum, sulfur, chlorine, potassium, calcium, iron, barium, bromine, iodine and the like.
  • a compound having a hetero ring having 1 to 3 atoms arbitrarily selected from nitrogen, oxygen and sulfur is preferable.
  • the present invention also includes an HIV integrase inhibitor containing the above compound as an active ingredient, and an anti-HIV agent and an AIDS therapeutic agent containing the HIV integrase inhibitor.
  • the compounds can be administered orally or parenterally.
  • oral administration the above compounds can be used in usual preparations such as tablets, powders, granules, capsules, etc. Solid preparations; solutions; oily suspensions; or liquid forms such as mouthwashes or elixirs can be used in any form.
  • parenteral administration the above compound can be used as an aqueous or oily suspension for injection or nasal drops.
  • conventional excipients, binders, lubricants, aqueous solvents, oily solvents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, stabilizers and the like can be optionally used.
  • the formulations of the present invention are prepared by combining (eg, mixing) a therapeutically effective amount of the above compound with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the formulations of the above compounds are prepared by known methods using well-known, readily available ingredients. '
  • the active component may be mixed with or diluted with a carrier or placed in a carrier in the form of a capsule, sash, paper, or other container.
  • the carrier acts as a diluent
  • the carrier is a solid, semi-solid, or liquid material that acts as a vehicle, which can be tablets, pills, powders, lozenges, elixirs, suspensions, emulsions, solutions.
  • Preparations, syrups, aerosols (solids in liquid medium), ointments may contain, for example, up to 10% of active compound.
  • the compound of the present invention is preferably formulated before administration.
  • the carrier is a solid, liquid, or mixture of a solid and a liquid.
  • the compound of the present invention is dissolved in a 4% dextroth / 0.5% aqueous sodium citrate solution to a concentration of 2 mg Z ml.
  • Solid formulations include powders, tablets and capsules.
  • a solid carrier is one or more substances that also serve as ingredients for flavoring, lubricants, dissolving agents, suspending agents, binders, tablet disintegrants, and capsules.
  • Tablets for oral administration include calcium carbonate, sodium carbonate and disintegrants such as corn starch and alginic acid, and / or binders such as gelatin and acacia, and lubricants such as magnesium stearate, stearic acid and talc. , Lactose, calcium phosphate and the like.
  • the carrier is mixed with the finely ground active ingredient, finely ground It is solid.
  • the active component is mixed with the carrier having the necessary binding properties in suitable proportions and compacted in the shape and size desired.
  • Powders and tablets contain from about 1 to about 99% by weight of the active ingredient, a novel compound of the present invention.
  • Suitable solid carriers are magnesium carbonate, magnesium stearate, talc, sugar, lactose, pectin, dextrin, starch, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, low melting wax, cocoa It is a butterfly.
  • Liquid preparations include suspensions, emulsions, syrups, and elixirs.
  • the active ingredient can be dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable carrier, such as sterile water, sterile organic solvent, or a mixture of both.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as sterile water, sterile organic solvent, or a mixture of both.
  • the active ingredient can often be dissolved in a suitable organic solvent, for example, aqueous propylene glycol.
  • Other compositions can be prepared by dispersing the finely divided active component in aqueous starch, sodium carboxymethyl cellulose solution, or a suitable oil.
  • the dose of the above compound varies depending on the administration method, the age, body weight, condition and type of disease of the patient, but usually, in the case of oral administration, about 0.05 mg to 300 mg per adult per day, preferably Is about 0.1 mg ⁇ : LOO Omg can be administered in divided doses if necessary. In the case of parenteral administration, about 0.01 mg to 1000 mg, preferably about 0.05 mg to 500 mg per day for an adult is administered.
  • IIIB / Molt-4 cells (approximately lxl0 5 / ml) and MT-2 cells (approximately 3xl0 5 / ml), which are HIV-1 ⁇ persistently infected cells, are mixed (cell ratio: about 1: 3).
  • C0 3 days were cultured in 2 incubator one (set to 37 ° C, C0 2 concentration of 5%). Three days after mixing, the infected cells in which HIV had proliferated and giant cells had appeared were used as viruses for isolation of resistant viruses.
  • provirus genomic DNA was extracted using a DNA extraction kit. PCR was performed using the two primers on both sides of the integase region, and the amplified DNA was sequenced.
  • the following table shows the drugs used and the mutation sites.
  • T66I indicates that the amino acid at position 66, T (threonine), is changed to I (isoleucine).
  • T66I / L74M means that two mutations, T66I and L74M, are made. The same applies to the symbol of.
  • a molecular clone pNL432 was used as a clone.
  • Xbal was prepared at the first position of the integrase of pNL432 to facilitate the introduction of a mutation into integrase (hereinafter referred to as NL432 Xba).
  • PCR was performed using the following primers-INT-Xba and vpr-Eco with the template T6I mutant virus DNA obtained from the compound C resistant virus (NL432) as a template.
  • the resulting fragment was cut with Xbal / EcoRI and replaced with the same region of NL432 Xba.
  • BamHI / EcoRI BaEcl48K
  • the XbBal48K: and BaEcl48K fragments were ligated, and then cloned into Xbal / EcoRI of pUC18. This plasmid was cut with Xbal / EcoRI and the fragment was replaced with the same region of PNL432 Xba.
  • PCR was performed with primer-155S Sac (+) and vpr-Eco using pNL432 as a template, and the resulting fragment was cut with SacI / EcoRI (two SaEcl55S).
  • SacI / EcoRI two SaEcl55S
  • ligating the XbSal55S and SaEcl55S fragments they were cloned into Xbal / EcoRI of pUC1S. This plasmid was cut with Xbal / EcoRI, and the fragment was replaced with the same region of pNL432 Xba.
  • Nde I 5 ′
  • Bam HI 3 ′
  • 5'-ggC AgC CAT ATg TTT TTA gAT ggA ATA gAT AAg gCC C-3 '(SEQ ID NO: 31) and 5'-gCAgCCggATCCTTAATCCTCATCCTgTCTACT TgC CAC-3' (SEQ ID NO: 32) and purchased from Toyobo Using KOD dash polymerase, a DNA fragment encoding the integrase having the mutation of the present invention was amplified.
  • the reaction conditions are 10 X KOD buffer (composition of 10 ⁇ 1: 1.2 M Tris-HCl ( ⁇ 8.0 ), 100 mM KC1, 60 mM (NH 4) 2 S0 4, 1% Triton X-100, 25 mM MgCl 2 ), 16 1 dNTP mixed solution (2 mM each), 1 ⁇ l of each primer (100 pmol / l), 5 ng of type I DNA, and finally 1.5 ml of KOD dash polymerase (2.5 units / ⁇ l) ⁇ 1 Put 100 ⁇ 1 Cycles of 94 ° C, 30sec., 52 ° C, 30sec., 74 ° C, 30sec. Were performed 30 times.
  • the DNA fragment encoding the integrase containing the mutation of the present invention amplified in the previous example was digested with restriction enzymes Ndel and BamHI, and then electrophoresed on a 1% agarose gel. Was detected and cut out and purified.
  • pET15b vector from NovAgen was similarly digested with restriction enzymes Nde I and Bam HI, and then electrophoresed on agarose gel to remove extra DNA fragments.
  • a DNA fragment encoding these resistance integrase and a pET15b vector were ligated using T4 DNA ligase to construct an expression vector.
  • An expression vector was then constructed to Konbiten Toseru BL21 purchased Ri by Novuajiwen Inc. (DE3) performs a transformation, 100 / ig / ml of ampicillin including LB pre-1 ⁇ ⁇ door, $ ⁇ : 10 mg / ml Bacto-trypton, 5 mg / ml feast-extract, 5 mg / ml NaCl) and cultured overnight at 37 ° C.
  • the collected bacteria are dissolved in a lysis buffer (composition: 0.15 M NaCl, 20 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM 2-mercaptoethanol, 5 mM imidazole), and lysozyme is added to a final concentration of 0.3 mg / ml. Incubation was performed on ice for 30 minutes. After crushing with a dounce type homogenizer, ultracentrifugation (conditions: 4 ° C, 60 minutes, 40,000 g) was performed.
  • a lysis buffer composition: 0.15 M NaCl, 20 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM 2-mercaptoethanol, 5 mM imidazole
  • Solubilization buffer containing 5 mM imidazole Composition: 20 mM MOPS (pH 7.2), 400 mM potassium glutamete, 1 mM EDTA, 0.1% NP-40, 20% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 4M urea ), Passed through a 0.22- ⁇ M filter, and applied to Nickel Chelate Affinity Gel (Amersham Pharmacia Biotech).
  • Each of the synthesized MAs in Table 2 was dissolved in a TE buffer (composition: 1 mM EDTA, 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6)) to prepare a primer solution (10 pmol / zl).
  • a TE buffer composition: 1 mM EDTA, 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6)
  • RWT-2 (5'-GAA TAT GGC AGC TAG ATT GTA C-3 '(SEQ ID NO: 33)
  • R-1 (5'-CTA GGT CAG GGT CTA CTT GTG T & C -3 '(SEQ ID NO: 34)
  • EM-2 (3, -G GAA TAT GGC AGC TAG ATT CAA T-5' (SEQ ID NO: 35) for detection of resistant mutants )
  • MW-1 primers were used at 0.5 ⁇ 1 each.
  • Molecular type D-n pNL432 was used as wild type virus DNA type II (Adachi, ⁇ ⁇ , Gendelman, HE, Koenig, S., Folks, T., Willey, R., Robson, A., Martin, MA (1986) Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.J. Virol., Vol.59, p284- 291.).
  • molecular clone pTYI-302 having mutations of T66I and L74M (ACA ⁇ ATA, TTG ATG) only in the amino acid sequence of the integrase portion of pNL432 was used.
  • the reaction solution 51 after the PCR reaction was electrophoresed on a 1% agarose gel, and the results were determined by detecting bands while irradiating UV from below.
  • detection was possible only when PNL432 at a concentration of 0.0002 ng / 30 il or more was used as a mirror type, and was not detected when pTYI-302 was used as a type II.
  • detection of the resistant mutant detection was possible only when pTYI-302 at a concentration of 0.0002 ng / 30 ⁇ 1 or more was used as type I, and was not detected when PNL432 was used as type I.
  • Example 6 Atsushi Using Mutant HIV Integrase
  • the following DNA synthesized by Amersham Pharmacia was dissolved in KTE buffer solution (composition: 100 mM KC1, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6)) to give a substrate.
  • KTE buffer solution composition: 100 mM KC1, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6)
  • a DNA solution (2 pmol / ⁇ l) and an evening gate MA solution (5 pmol / 1) were prepared. Each solution was used after boiling once and then slowly lowering the temperature to anneal the complementary strands.
  • each Ueru phosphate buffer (composition: 13.7 mM NaCl, 0.27 mMKCl, 0.43 mM Na 2 HP0 4, 0.14 mM KH 2 P0 4) was washed twice with phosphate buffer containing 1% skim milk - 300 ⁇ 1 added Blocked for 30 minutes. Further, after washing each well twice with a phosphate buffer, 50 ⁇ l of a substrate DNA solution (Zpmol / l) is added, and the mixture is adsorbed at room temperature for 30 minutes with shaking, then twice with a phosphate buffer and then with distilled water. Washed once.
  • buffer composition: 150 mM M0PS (pH 7.2), 75 mM MnCl 2 , 50 mM 2-mercaptoethanol, 25% glycerol, 500 jug / ml bovine serum albumin -fraction V
  • 12 1, 1 il of target DNA (5 pmol /, ⁇ ) and 32 l of distilled water prepared from 32 l of distilled water were added.
  • DMS0 solution of test compound (6-1) to each well, and add DMS06-1 to the positive control (PC) well.
  • PC positive control
  • NC negative control
  • a diluent composition: 20 mM M0PS (pH 7.2), 400 mM potassium glutamete, 1 mM EDTA, 0.1% NP-40, 20% glycerol, 1 mM DTT, 4 M urea
  • alkaline phosphatase color buffer composition: 10 mM para-ditrophenyl phosphate (manufactured by Vector Laboratories), 5 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 9.5)
  • concentration 10 mM para-ditrophenyl phosphate (manufactured by Vector Laboratories), 5 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 9.5)
  • Inhibition rate (%) 100 [1- ⁇ (G abs.-NC abs.) / (PC abs.-NC abs.) ⁇ ] C abs.;
  • IC 50 (U g / ml) x- ⁇ (X-50) (x-y) / (XY) ⁇ .
  • the HIV mutant persistently infected human T cell line Molt-4clone8 was cultured in R PMI-1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum, and the supernatant was filtered to measure the virus titer. Saved at On the other hand, the test compound is diluted to a predetermined concentration with the above culture medium, and dispensed into a 96-well microplate at 100 ⁇ 1 each. Next, the MT-4 cell suspension was dispensed at 50 ⁇ 1 (2.5 ⁇ 10 4 cells) at a time, and the HIV-containing supernatant was diluted with the above culture medium to 50 ⁇ 1 (600 pfu). (plaque forming unit)).
  • the HIV or HIV integrase of the present invention can be used in an assay for inhibiting drug-resistant HIV and is useful.
  • a probe or a primer complementary to a nucleic acid encoding the HIV integrase of the present invention or a nucleic acid sequence containing the same can be used for a method for detecting drug-resistant HIV and is useful.

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Description

明細書 薬剤耐性 HIVインテグラーゼ 技術分野
本発明は、 HIVインテグラーゼ， 詳しくは、 耐性変異を有する HIVインテグラ —ゼ、 該 HIVインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド、 それらを含有する HIV、 それらを検出する検出法、 およびそれらを使用するアツセィ法に関する。 背景技術
ヒ ト免疫不全ウィルス （以下、 HIV という。 ） は、 薬剤に対し、 比較的容易に 薬剤耐性を獲得することが知られている。 薬剤耐性ウィルスが出現すると、 その 薬剤の有効性は低下し、 もはやその薬剤では HIV感染症を有効に治療することが できない。 従って、 HIV感染症の治療においては、 薬剤耐性ウィルスの出現後は、 投与薬剤を変更する等の処置をすることが望ましい。 また、 次世代の薬剤として、 上記薬剤耐性ウィルスにも有効な薬剤を探索する必要がある。
現在までに、 各種の逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤が研究、 開発 され、その結果、多数の逆転写酵素阻害剤耐性 HIV、 プロテアーゼ阻害剤耐性 HIV が報告されている。
しかし、 HIVィンテグラーゼ阻害剤耐性 HIVについては、 HIVィンテグラーゼ 阻害剤自身が少ないため、 その報告は少ない。
HIVインテグラーゼ阻害剤耐性 HIVインテグラ一ゼとしては、 Science, 1999， Vol. 287， p646-650に、 野性株 （ H X B 2株 ：配列表の配列番号 4記載の HIVィ ンテグラーゼを含有する HIV、 ァクセション番号： AF033819) の 6 6番目のアミ ノ酸がトレォニンからイソロイシンに、 1 5 3番目のアミノ酸がセリンからチロ シンに、 および/または 1 5 4番目のアミノ酸がメチォニンからイソロイシンに 変異した HIVィンテグラーゼ阻害剤耐性 HIVィンテグラーゼが開示されている。 具体的には、 配列表の配列番号 8〜 1 2のいずれかに記載の HIVインテグラ一ゼ である。
また、 HIVィンテグラーゼ阻害剤存在下で耐性を獲得した HIVのィンテグラ一 ゼではないが、 6 6番目のアミノ酸がァラニンであり、 7 4番目のアミノ酸がメ チォニンである HIVインテグラ一ゼが知られている。 具体的には、 配列表の配列 番号 7記載のアミノ酸配列 （ァクセシヨン番号 ： AJ239083) を有する HIV イン テク"ラーゼである。
なお、 HIVインテグラーゼに関し、 GenBank ( NCBI; National Center for Biotechnology Information) に、 以下の H I Vインテグラーゼが登録されている ( 6 3番目のアミノ酸がィソロイシンである HIVィンテグラーゼとして、 配列表 の配列番号 1 3および 1 4記載のアミノ酸配列 （ァクセション番号： AJ251056、 AJ276595) を有する HIV インテグラ一ゼが登録されている。 6 3番目のァミノ 酸がイソロイシンであり、 7 4番目のアミノ酸がイソロイシンであり、 1 5 3番 目のセリンがァラニンであり、 1 6 0番目のリジンがセリンである HIVィンテグ ラ一ゼとして、 配列番号 1 5記載のアミノ酸配列 （ァクセシヨン番号 ： L20587) が登録されている。 6 3番目のアミノ酸がメチォニンであり、 7 4番目のァミノ 酸がイソロイシンであり、 1 5 3番目のセリンがァラニンであり、 1 6 0番目の リジンがセリンである HIVィンテグラ一ゼとして、 配列表の配列番号 1 6記載の アミノ酸配列 （ァクセシヨン番号 ： L20571) を有する HIVインテグラーゼが登 録されている。 6 6番目のアミノ酸がプロリンである HIVインテグラーゼとして、 配列表の配列番号 2 0または 2 1記載のアミノ酸配列 （順にァクセション番号 ： U69588、 U69584) を有する HIV インテグラーゼが登録されている。 1 4 5番 目のアミノ酸がロイシンである HIVィンテグラ一ゼとして、 配列表の配列番号 1 9記載のアミノ酸配列 （ァクセシヨン番号 ： AF040319) を有する HIVインテグ ラーゼが登録されている。 1 5 3番目のアミノ酸がプロリンである HIVイ ンテグ ラーゼとして、 配列表の配列番号 1 7記載のアミノ酸配列 （ァクセシヨン番号 ： AF040327) を有する HIVインテグラ一ゼが登録されている。 1 5 5番目のアミ ノ酸がァスパラギン酸である HIVインテグラーゼとして、 配列表の配列番号 1 8 記載のアミノ酸配列 （ァクセシヨン番号 ： U71182) を有する HIVインテグラー ゼが登録されている。 1 3 8番目のアミノ酸がリジンである HIVイ ンテグラ一ゼ として、配列表の配列番号 2 2記載のアミノ酸配列（ァクセション番号： AF086817) を有する HIVインテグラ一ゼが登録されている。
なお、 本明細書中のァクセシヨン番号は、 各タンパクをコードする核酸の GenBank (NCBI; National Center for Biotechnology Iniormation) のァクセン ョン番号を表わす。
また、 HIVインテグラ一ゼの全長ではなく一部の配列に過ぎないが、 9 2番目 のアミノ酸がバリンで置換された配列、 1 1 8番目のアミノ酸がアルギニンで置 換された配列、 1 2 1番目のアミノ酸がロイシンで置換された配列、 1 3 8番目 のァミノ酸がセリン、 ノ リンまたはトレオニンで置換された配列、 1 4 6番目の アミノ酸がヒスチジンで置換された配列、 1 4 8番目のアミノ酸がロイシンで置 換された配列、 1 6 0番目のアミノ酸がァスパラギンで置換された配列が登録さ れている。
HIVィンテグラ一ゼについては、 その野性株のアミノ酸配列が知られている。 なお、 HIVは薬剤非存在下でも変異するため、 多数の野性株が存在し、 そのアミ ノ酸配列はそれぞれ異なる。
以下に本発明で見出した変異部位について、 GenBankで調べた結果、 野性株で あると思われるアミノ酸を記載する。 6 3番目のアミノ酸はロイシンであり、 6 6番目のアミノ酸はトレオニンであり、 7 0番目のアミノ酸はグリシンまたはグ ル夕ミン酸であり、 7 2番目のアミノ酸はバリン、 イソロイシンまたはグリシン であり、 7 4番目のアミノ酸はロイシン、 イソロイシン、 ノ リンまたはプロリン であり、 9 2番目のアミノ酸はグルタミン酸またはァスパラギン酸であり、 1 1 8番目のアミノ酸はグリシンであり、 1 2 1番目のアミノ酸はフエ二ルァラニン であり、 1 3 8番目のアミノ酸はグルタミン酸またはァスパラギン酸であり、 1 4 0番目のアミノ酸はグリシンであり、 1 4 5番目のアミノ酸はプロリンであり、 1 4 6番目のアミノ酸はグルタミンであり、 1 4 8番目のアミノ酸はグルタミン' であり、 1 5 1番目のアミノ酸はバリンまたはイソロイシンであり、 1 5 3番目 のアミノ酸はセリンまたはァラニンであり、 1 5 5番目のアミノ酸はァスパラギ ンであり、 1 6 0番目のアミノ酸はリジン、 グルタミン、 トレオニンまたはグル 夕ミン酸であり、 2 4 9番目のアミノ酸はバリンまたはロイシンであり、 2 5 0 番目のアミノ酸はバリン、 ロイシンまたはァラニンである。 発明の開示
HIVィンテグラ一ゼ阻害剤に対し耐性を獲得した HIVを見い出し、 それらの検 出法およびそれらを使用するアツセィ法を提供する。
本発明者は、 上記課題を解決するため、 HIVインテグラ一ゼ阻害剤に対し耐性 を獲得した HIVの核酸配列を決定し、 以下の発明を完成した。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 6 4番目および 1 1 6番目のアミノ酸がァスパラギン酸であり、 1 5 2番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、 かつ以下に示す群から任意に選択さ れる少なく とも 1つの変異を有する HIVインテグラ一ゼ ；
( a ) 6 3番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である ；
( b ) 6 6番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸である ；
( c ) 7 0番目のァミノ酸がグリシンおよびグル夕 ミ ン酸以外のアミノ酸であ る ；
( d ) 7 2番目のアミノ酸がバリン、 イソロイシンおよびグリシン以外のァミノ 酸である ；
( e ) 7 4番目がロイシン、 イソロイシン、 バリンおよびプロリン以外のァミノ 酸である ；
( f ) 9 2番目のアミノ酸がグルタミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ酸 である ；
( ) 1 1 8番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である ； ( ) 1 2 1番目のアミノ酸がフヱニルァラニン以外のアミノ酸である ； ( j ) 140番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である ；
( j ) 1 3 8番目のアミノ酸がグルタミン酸およびァスパラギン酸以外のァミノ 酸である ；
(k) 145番目のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸である ；
( 1 ) 146番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である ；
(m) 148番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である ；
( n ) 1 5 1番目のアミ ノ酸がバリ ンおよびイソロイシン以外のァミ ノ酸であ る ；
( o ) 1 53番目のアミノ酸がセリンおよびァラニン以外のアミノ酸である ； (p) 1 55番目のアミノ酸がァスパラギン以外のアミソ酸である ；
(q ) 1 6 0番目のアミノ酸がリジン、 グルタミン、 トレオニンおよびグルタミ ン酸以外のアミノ酸である ；
( r ) 249番目のアミノ酸がバリンおよびロイシン以外のアミノ酸である ； お よび
( s ) 2 50番目のアミノ酸がバリン、 ロイシンおよびァラニン以外のアミノ酸 である ；
ただし、 配列表の配列番号？〜 2 2のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する HIVィンテグラ一ゼは除く。
( 2) 以下に示す群から任意に選択される少なく とも 1つの変異を有する 上記 （ 1 ) 記載の HIVインテグラーゼ ；
(a) 63番目のアミノ酸がバリンである ；
(b) 6 6番目のアミノ酸がイソロイシンまたはァラニンである ；
( c ) 70番目のアミノ酸がアルギニンである ；
( d ) 7 2番目のアミノ酸がァラニンである ；
( e ) 74番目のアミノ酸がメチォニンである ；
(f ) 92番目のアミノ酸がグルタミンである ； ( g) 1 1 8番目のアミノ酸がセリンである ；
(h) 1 2 1番目のアミノ酸がチロシンである ；
( i ) 1 3 8番目のアミノ酸がリジンである
( j ) 140番目のアミノ酸がセリンである
(k) 145番目のアミノ酸がセリンである
( 1 ) 14 6番目のアミノ酸がアルギニンである ；
(m) 148番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンである ；
( n) 1 5 1番目のアミノ酸がロイシンである ；
( o ) 1 5 3番目のアミノ酸がチロシンである ；
(p) 1 5 5番目のアミノ酸がセリン、 イソロイシン、 トレオニンまたはヒスチ ジンである ；
(q ) 1 6 0番目のアミノ酸がァスパラギンである ；
( r ) 24 9番目のアミノ酸がイソロイシンである ； および
( s ) 2 5 0番目のアミノ酸がイソロイシンである、
(3 ) 1 2番目および 1 6番目のアミノ酸がヒスチジンであり、 40番目 および 43番目のアミノ酸がシスティンであり、 かつ 1 5 6番目および 1 5 9番 目のアミノ酸がリジンである上記 （ 1 ) または （ 2 ) 記載の HIVインテグラーゼ、
( 4 ) 配列表の配列番号 1〜 4のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1以上の上記 （ 1 ) または （ 2 ) 記載のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有す る上記 （ 1 ) 〜 （ 3) のいずれかに記載の HIVインテグラーゼ、
( 5 ) 上記 （ 1 ) 〜 （4) のいずれかに記載のインテグラ一ゼにおいて、 64番目および 1 1 6番目のァスパラギン酸、 1 5 2番目のグルタミン酸、 およ び任意に選択された変異部位のアミノ酸以外の 1以上のアミノ酸が欠失、 置換も しくは付加された HIVィンテグラ一ゼ ；
ただし、 配列表の配列番号？〜 2 2のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する HIVィンテグラーゼは除く、
( 6) 増殖可能な HIVを構成することができる （ 1 ) 〜 （5) のいずれか に記載の HIVィンテグラーゼ、
( 7 ) 上記 （ 1 ) ~ ( 6) のいずれかに記載の HIVインテグラーゼをコ一 ドするポリヌクレオチド、
(8) 配列表の配列番号 5または 6記載の核酸配列において、 1 87番目 の Cが G、 1 9 6番目の Aが G、 1 9 7番目の Cが T、 2 2 0番目の Τが Α、 3 5 2番目の0が八、 433番目の0が1\ 43 7番目の Αが G、 442番目の C が A、 45 1番目の Aが T、 458番目の Cが Α、 462番目の Gが Α、 4 64 番目の Αが Gまたは C、 およびノまたは 74 5番目の Gが Aに置換された核酸配 列を有する上記 （7) 記載のポリヌクレオチド、
(9) 増殖可能な HIVを構成することができる上記 （7) または （8) 記 載のポリヌクレオチド、
( 1 0 ) 上記 （ 7 ) または （ 8 ) 記載のポリヌクレオチドを含有するべク 夕一またはプラスミ ド、
( 1 1 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれかに記載の HIVィンテグラ一ゼまた は上記 （ 7 ) または （ 8 ) 記載のポリヌクレオチドを含有する HIV、
( 1 2 ) 上記 （ 1 1) 記載の HIVが持続感染した細胞、
( 1 3 ) 上記 （ 7 ) または （ 8 ) 記載のポリヌクレオチドと特異的にハイ プリダイズし得るプローブまたはプライマ一、
( 14) 上記 （ 1 3) 記載のプローブまたはプライマ一を使用した HIVの 検出法、
( 1 5 ) 以下に示す群から任意に選択される少なく とも 1つのアミノ酸を コードする核酸配列の変異を検出することを特徴とする上記 （ 1 4) 記載の HIV の検出法；
(a) 6 3番目の口イシンをコードする核酸配列からロイシン以外のアミノ酸を コードする核酸配列への変異；
( b ) 6 6番目のトレオニンをコ一ドする核酸配列から トレオニン以外のアミノ 酸をコ一ドする核酸配列への変異； ( c ) 7 0番目のグリシンまたはグル夕ミン酸をコ一ドする核酸配列からグリシ ンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異 ；
( d ) 7 2番目のパリン、 イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列か らノ リン、 イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列へ の変異；
( e ) 7 4番目のロイシン、 イソロイシン、 ノ リンまたはプロリンをコードする 核酸配列からロイシン、 イソロイシン、 バリンおよびプロリン以外のアミノ酸を コードする核酸配列への変異；
( f ) 9 2番目のグルタミン酸またはァスパラギン酸をコードする核酸配列から グル夕ミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変 異 ί
( g ) 1 1 8番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸 をコードする核酸配列への変異；
( h ) 1 2 1番目のフエ二ルァラニンをコードする核酸配列からフエ二ルァラ二 ン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
( i ) 1 3 8番目のグル夕ミン酸またはァスパラギン酸をコードする核酸配列か らグル夕 ミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ酸以外のアミノ酸をコードす る核酸配列への変異 ；
( j ) 1 4 0番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸 をコードする核酸配列への変異 ；
( k ) 1 4 5番目のプロリンをコードする核酸配列からプロリン以外のアミノ酸 をコードする核酸配列への変異；
( 1 ) 1 4 6番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタ ミン以外のアミ ノ酸をコ一ドする核酸配列への変異 ；
( m ) 1 4 8番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミ ノ酸をコードする核酸配列への変異；
( n ) 1 5 1番目のバリンまたはィソロイシンをコードする核酸配列からバリン およびィソロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
( 0 ) 1 5 3番目のセリンまたはァラニンをコ一ドする核酸配列からセリンおよ びァラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
( ρ ) 1 5 5番目のァスパラギンをコ一ドする核酸配列からァスパラギン以外の アミノ酸をコードする核酸配列への変異 ；
( q ) 1 6 0番目のリジン、 グルタミン、 トレオニンまたはグルタミン酸をコ一 ドする核酸配列からリジン、 グルタミン、 トレオニンおよびグルタミン酸以外の アミノ酸をコ一ドする核酸配列への変異 ；
( r ) 2 4 9番目のバリ ンまたはロイシンをコードする核酸配列からバリンおよ びロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異 ； および
( s ) 2 5 0番目のパリン、 ロイシンまたはァラニンをコードする核酸配列から バリン、 ロイシンおよびァラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異、 ( 1 6 ) 以下に示す群から任意に選択される少なく とも 1つのアミノ酸を コードする核酸配列の変異を検出することを特徴とする上記 （ 1 4 ) または （ 1 5 ) 記載の HIVの検出法；
( a ) 6 3番目のロイシンをコ一ドする核酸配列からバリンをコ一ドする核酸配 列への変異；
( b ) 6 6番目の トレォニンをコードする核酸配列からイソロイシンまたはァラ ニンをコードする核酸配列への変異；
( c ) 7 0番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアルギ ニンをコ一ドする核酸配列への変異；
( d ) 7 2番目のバリン、 イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列か らァラニンをコードする核酸配列への変異；
( e ) 7 4番目のロイシン、 イソロイシン、 ノ リンまたはプロリンをコードする 核酸配列からメチォニンをコードする核酸配列への変異；
( f ) 9 2番目のグル夕ミン酸またはァスパラギン酸をコードする核酸配列から グル夕ミ ンをコードする核酸配列への変異； (g) 1 1 8番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸 配列への変異 ；
(h) 1 2 1番目のフエ二ルァラニンをコードする核酸配列からチロシンをコー ドする核酸配列への変異 ；
( i ) 1 3 8番目のグルタミン酸またはァスパラギン酸をコードする核酸配列か らリジンをコ一ドする核酸配列への変異；
( j ) 1 40番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸 配列への変異 ；
(k) 145番目のプロ リンをコードする核酸配列からセリンをコ一ドする核酸 配列への変異 ；
( 1 ) 14 6番目のグルタミンをコ一ドする核酸配列からアルギニンをコードす る核酸配列への変異；
(m) 148番目のグルタミンをコードする核酸配列から リジンまたはアルギニ ンをコ一ドする核酸配列への変異；
( n ) 1 5 1番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列から口イシ ンをコ一ドする核酸配列への変異 ；
( 0 ) 1 5 3番目のセリ ンまたはァラニンをコードする核酸配列からチロシンを コードする核酸配列への変異；
(P) 1 5 5番目のァスパラギンをコードする核酸配列からセリ ン、 イソ口イシ ン、 トレオニンまたはヒスチジンをコードする核酸配列への変異 ；
( q ) 1 6 0番目のリジン、 グルタミン、 トレオニンまたはグルタミン酸をコー ドする核酸配列からァスパラギンをコードする核酸配列への変異 ；
( r ) 24 9番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からイソ口イシ ンをコ一ドする核酸配列への変異； および
( s ) 25 0番目のバリン、 ロイシンまたはァラニンをコードする核酸配列から ィソロイシンをコードする核酸配列への変異、
( 17 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれかに記載の HIVィンテグラ一ゼを使 用した抗 HIVィンテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法、
( 1 8) 上記 （ 1 1 ) 記載の HIVを使用した抗 HIVィンテグラ一ゼ阻害 剤のスクリーニング法、
( 1 9) 上記 （ 1 2) 記載の HIV が持続感染した細胞を使用した抗 HIV ィンテグラーゼ阻害剤のスクリ一二ング法、
( 20) 分子量が 1 5〜 1 000であり、 水素、 リチウム、 ホウ素、 炭素、 窒素、 酸素、 フッ素、 ナト リウム、 マグネシウム、 アルミニウム、 硫黄、 塩素、 カリウム、 カルシウム、 鉄、 バリウム、 臭素および沃素からなる群から選択され た任意の原子により構成され、 一 C (=0) 一、 - C (= S ) 一または— NH— で示される基を持ち、 窒素、 酸素および硫黄の中から任意に選択される原子を 1 ~ 3個有するヘテロ環を有する、 上記 （ 1 7 ) 〜 ( 1 9 ) のいずれかに記載のス クリ一二ング法により得られた化合物を有効成分として含有する HIVィンテグラ ーゼ阻害剤、
(2 1 ) 上記 （ 20 ) 記載の mvィンテグラーゼ阻害剤を有効成分として 含有する抗 HIV剤、
( 22) 上記 （20) 記載の HIVィンテグラーゼ阻害剤を有効成分として 含有するエイズ治療剤、
に関する。 発明を実施するための最良の形態
HIVィンテグラーゼ阻害剤の存在下で HIVの野性株を細胞（例えば、 ヒ ト T細 胞） に感染させ、 継代培養し、 数日後、 HIV感染細胞をホモジネートし、 P CR 法を用いて HIV provirus DNAの塩基配列をシークェンスすることにより、 その HIVインテグラーゼをコードする核酸配列を調べた。
HIV インテグラ一ゼ阻害剤としては、 WO 0 0/3 9 0 8 6または Science, 1999, Vol.287, p646-650に記載の化合物を使用することができる。例えば、 4- (卜 ベンゼンスルホニル- 5-クロロイン ドール- 3-ィル）- 2-ヒ ドロキシ- 4-ォキソ -2 -ブ テン酸（以下、化合物 Aとする。）、 1- [5- (4-フルォロベンジル）フラン -2-ィル ] - 3_ ヒ ドロキシ- 3 -（5-クロロ- 1 - 1，2, 4-ト リァゾ一ル- 3-ィル）プロべノン （以下、 ィ匕 合物 Bとする） 、 卜 [5- (4-フルォロペンジル）フラン- 2-ィル] -3-ヒ ドロキシ- 3- 1，2, 4-ト リアゾ一ル- 3-ィル）プロぺノン （以下、 化合物 Cとする）、 4- [ 1- (4 - フルォロベンジル） -1 -ピ口ール- 2-ィル] - 2-ヒ ド口キシ- 4-ォキソ -2-ブテン酸酸
(以下、 化合物 Dとする） 、 1- [5- (4-フルオロフェニルチオ）フラン- 2-ィル] -3- ヒ ドロキシ- 3- ( 1 - 1 , 2, 4-ト リァゾ一ル- 3-ィル）プロぺノン （以下、 化合物 Eとす る） 、 4- [3, 5- (ビスベンジルォキシ）フエ二ル] - 2-ヒ ドロキシ- 4-ォキソ -2-ブテン 酸 （以下、 化合物 Fとする） などを使用することができる。 次に、 得られたシークェンスに基づき、 各変異部位についてのモレキュラーク ローンを作製し、 該変異が HIVインテグラ一ゼ阻害剤に対する耐性獲得のために 必要な変異部位であるか否かを調べた。
すなわち、 HIVのモレキュラークローン （NL43) のィンテグラ一ゼ部分の配列 のみを、 上記シークェンスに基づき作製された HIVィンテグラ一ゼをコードする ポリヌクレオチド （例えば D N A ) で置換し、 プラスミ ド pNL43を作製し、 細胞 (例えば、 ヒ ト T細胞） に取り込ませ、 目的の変異を持つ HIVインテグラーゼを 有する HIVのウィルスクローンを作製した。
このようにして得られた HIVのウィルスクローンが、 使用された HIVィンテ グラーゼ阻害剤に対して耐性を獲得しているか否かを、 野性株に対する阻害活性 と比較することにより調べた。 · その結果、 化合物 Aに対する耐性変異として、 以下の変異を確認した。
• 6 6番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
• 7 4番目のアミノ酸がメチォニンとなる変異
• 1 4 5番目のアミノ酸がセリンとなる変異
• 2 4 9番目のァミノ酸がィソロイシンとなる変異 2 5 0番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
化合物 Bに対する耐性変異として、 以下の変異を確認した。
7 0番目のアミノ酸がアルギニンとなる変異
1 1 8番目のアミノ酸がセリンとなる変異
1 3 8番目のアミノ酸がリジンとなる変異
1 4 6番目のアミノ酸がアルギニンとなる変異
1 4 8番目のアミノ酸がリジンとなる変異
1 5 1番目のアミノ酸がロイシンとなる変異
1 5 5番目のアミノ酸がセリンまたはイソロイシンとなる変異
1 6 7番目のアミノ酸がァスパラギン酸となる変異
化合物 Cに対する耐性変異として、 以下の変異を確認した。
6 3番目のアミノ酸がパリンとなる変異
6 6番目のアミノ酸がイソロイシンまたはァラニンとなる変異
7 4番目のアミノ酸がメチォニンとなる変異
9 2番目のアミノ酸がグルタミンとなる変異
1 2 4番目のアミノ酸がァスパラギンとなる変異
1 3 8番目のアミノ酸がリジンとなる変異
1 4 0番目のアミノ酸がセリンとなる変異
1 4 6番目のアミノ酸がアルギニンとなる変異
1 8番目のアミノ酸がリジンとなる変異
1 5 1番目のアミノ酸がロイシンとなる変異
1 5 3番目のアミノ酸がァラニンとなる変異
1 5 5番目のアミノ酸がセリン、 トレオニンまたはヒスチジンとなる変異
1 6 0番目のアミノ酸がァスパラギンとなる変異
化合物 Dに対する耐性変異として、 以下の変異を確認した。
7 2番目のアミノ酸がァラニンとなる変異
7 4番目のアミノ酸がメチォニンとなる変異 • 1 4 8番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンとなる変異
• 1 5 1番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
• 1 5 5番目のアミノ酸がセリンとなる変異
化合物 Eに対する耐性変異として、 以下の変異を確認した。
• 6 6番目のアミノ酸がィソロイシンまたはァラニンとなる変異
• 1 4 8番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンとなる変異
• 1 5 3番目のアミノ酸がチロシンとなる変異
化合物 Fに対する耐性変異として、 以下の変異を確認した。
6 6番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
· 7 4番目のアミノ酸がメチォニンとなる変異
1 2 1番目のアミノ酸がチロシンとなる変異
1 5 1番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
1 5 3番目のアミノ酸がチロシンとなる変異
1 5 4番目のアミノ酸がィソロイシンとなる変異
すなわち、 化合物存在下で HIVインテグラーゼの変異が容易に起こる部位 （以 下、 変異部位という。 ） を見い出し、 特にその変異部位において置換されるアミ ノ酸を特定し、 それらの事実に基づき、 本発明を完成した。 本発明である HIVインテグラーゼは、 HIV野性株に比較して、 上記耐性変異部 位から任意に選択される変異部位が任意のアミノ酸で 1以上置換された、 活性中 心のアミノ酸が保存された HIVィンテグラ一ゼを意味する。 一般的には HIVィ ンテグラーゼは 2 8 8個のァミノ酸からなるポリぺプチドであるが、 本発明の HIVィンテグラ一ゼは、 2 8 8個のアミノ酸からなるポリぺプチドに限定される ものではない。 数個〜数十個のアミノ酸が欠失、 付加していてもよい。 例えば、 配列表の配列番号 1 5及び 1 6記載の HIVインテグラーゼのように、 C末端に 1 0アミノ酸伸びた 2 9 8個のアミノ酸からなる HIVィンテグラーゼ等も存在する ( なお、 活性中心のアミノ酸は、 6 4番目および 1 1 6番目のアミノ酸がァスパ ラギン酸であり、 1 5 2番目のアミノ酸がグル夕ミン酸である。 本発明の HIVィ ンテグラ一ゼは活性中心のアミノ酸が保存されており、 HIVィンテグラ一ゼ活性 を有する。 さらには、 1 5 6番目および 1 5 9番目のアミノ酸が保存されている HIV ィンテグラーゼが好ましい。 なお、 1 5 6番目および 1 5 9番目のアミノ酸 はリジンである。 また、 Z nフィンガーモチーフ ( 1 2番目および 1 6番目のァ ミノ酸がヒスチジンであり、 4 0番目および 4 3番目のアミノ酸がシスティンで ある） も保存されていることが好ましい。
本発明は、 化合物 （例えば、 HIVインテグラ一ゼ阻害剤） 存在下で HIVインテ グラーゼの変異が容易に起こる部位を見出したものであり、 特に変異部位のアミ ノ酸の種類を限定するものではない。 すなわち、 変異部位のアミノ酸は、 野性株 として知られているアミノ酸以外の任意のアミノ酸であればよい。 具体的には、 本発明の HIVィンテグラ一ゼは、 以下に示す群から任意に選択される少なくとも 1つの変異を有する HIVィンテグラ一ゼを意味する。
( a ) 6 3番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である ；
( b ) 6 6番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸である ；
( c ) 7 0番目のアミノ酸がグリシンおよびグル夕 ミ ン酸以外のアミノ酸であ る ；
( d ) 7 2番目のアミノ酸がバリン、 イソロイシンおよびグリシン以外のァミノ 酸である ；
( e ) 7 4番目がロイシン、 イソロイシン、 ノ リンおよびプロリン以外のァミノ 酸である ；
( f ) 9 2番目のアミノ酸がグル夕ミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ酸 である ；
( g ) 1 1 8番目がグリシン以外のアミノ酸である ；
( h ) 1 2 1番目のアミノ酸がフエ二ルァラニン以外のアミノ酸である ；
( i ) 1 3 8番目のアミノ酸がグル夕ミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ 酸である ； ( j ) 140番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である ； (k) 145番目のァミノ酸がプロリン以外のアミノ酸である ；
( 1 ) 146番目のアミノ酸がグル夕ミン以外のアミノ酸である ；
(m) 148番目のアミノ酸がグル夕ミン以外のアミノ酸である ；
( n ) 1 5 1番目のアミノ酸がバリ ンおよびイソロイシン以外のアミノ酸であ る ；
( o ) 1 53番目のアミノ酸がセリンおよびァラニン以外のァミノ酸である ； ( ) 1 5 5番目のアミノ酸がァスパラギン以外のアミノ酸である ；
( q ) 1 6 0番目のアミノ酸がリジン、 グルタミン、 トレォニンおよびグルタミ ン酸以外のアミノ酸である ；
( r ) 249番目のアミノ酸がバリンおよびロイシン以外のァミノ酸である ； お よび
( s ) 2 5 0番目のアミノ酸がバリン、 ロイシンおよびァラニン以外のアミノ酸 である。
特に、 HIVインテグラ一ゼ阻害剤に対する耐性獲得という点からは、 6 6番目 のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸である HIVィンテグラーゼが重要である c また、 本発明は、 上記の変異部位において置換されるアミノ酸も見い出したも のである。 具体的には、 以下に示す群から任意に選択される少なく とも 1つの変 異を有する HIVインテグラーゼが挙げられる。
(a) 63番目のアミノ酸がバリンである ；
( b ) 6 6番目のアミノ酸がイソロイシンまたはァラニンである ；
( c ) 7 0番目のアミノ酸がアルギニンである ；
(d) 72番目のアミノ酸がァラニンである ；
( e ) 74番目のアミノ酸がメチォニンである ；
(f ) 9 2番目のアミノ酸がグルタミンである ； '
( g) 1 1 8番目のアミノ酸がセリンである ； ( h ) 1 2 1番目のアミノ酸がチロシンである ；
( i ) 1 3 8番目のアミノ酸がリジンである
( j ) 1 4 0番目のアミノ酸がセリンである
( k ) 1 4 5番目のアミノ酸がセリンである
( 1 ) 1 4 6番目のアミノ酸がアルギニンである ；
( m ) 1 4 8番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンである ；
( n ) 1 5 1番目のアミノ酸がロイシンである ；
( o ) 1 5 3番目のアミノ酸がチロシンである ；
( p ) 1 5 5番目のアミノ酸がセリン、 イソロイシン、 トレオニンまたはヒスチ ジンである ；
( q ) 1 6 0番目のアミノ酸がァスパラギンである ；
( r ) 2 4 9番目のアミノ酸がイソロイシンである ；および
( s ) 2 5 0番目のアミノ酸がイソロイシンである。
特に、 HIVインテグラ一ゼ阻害剤に対する耐性獲得という点からは、 6 6番目 のァミノ酸がィソロイシンまたはァラニンである HIVィンテグラーゼが重要であ る。 なお、 本発明の HIVィンテグラ一ゼは活性中心のアミノ酸が保存されているの で、 活性中心及び上記変異部位以外のアミノ酸は、 HIV インテグラ一ゼの機能を 損わない限り、 すなわち HIVインテグラ一ゼ活性を有する限り、 任意のアミノ酸 であってよい。 例えば、 データベース等で検索して選択したアミノ酸でもいいし、 野性株、 臨床分離株のアミノ酸でもよい。 なお、 「HIVインテグラ一ゼ活性を有 する」 とは、 酵素系の実験で HIVインテグラ一ゼ活性を有する場合のみならず、 HIVとした場合に増殖可能な HIVを構成することができるものであればよい。 具体的には、 HIV野性株の HIVィンテグラ一ゼとして知られている配列表の配 列番号 1〜 4のいずれかに記載のアミノ酸配列 （配列番号 1 ： HIV-1 pNL43 subclone4-20 Integrase, ァクセション番号 ： U26942；配列番号 2 ： HIV-1 IIIB Integrase；配列番号 3 ： HIV-1 IIIB (shionogi clone) Integrase；配列番号 4 ： IIIB/LAI clone HXB2 Integrase、 ァクセション番号 ： AF033819) において 1以 上のアミノ酸が、 任意に選択された上述のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を 有するタンパク質が挙げられる。 本発明の HIVィンテグラ一ゼの 6 4番目および 1 1 6番目のァスパラギン酸、 1 5 2番目のグルタ ミ ン酸、 および上記選択された変異部位のアミノ酸以外の 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加された HIVィンテグラーゼも本発明の 範囲内である。
1以上のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加された HIVィンテグラーゼとは、 例えば、 基準となる H I Vィンテグラーゼのアミノ酸配列に対して少なく とも 7 0 %、 好ましくは 8 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する HIVィンテ グラ一ゼを意味する。
例えば、 配列表のアミノ酸からなる群より選択される対照アミノ酸配列に対し て少なく とも 8 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリベプチドと は、 そのポリべプチドの配列が対照ァミノ酸配列のアミノ酸 1 0 0個ごとに 2 0 個までのァミノ酸の変化を含みうることを除き、 そのポリペプチドのァミノ酸配 列と対照配列が同一である場合を意味する。 言い換えると、 対照アミノ酸配列に 対して少なく とも 8 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリぺプチ ドは、 対照配列中のアミノ酸の 2 0 %までが欠失または他のアミノ酸と置換して いてもよく、 あるいは対照配列中の全ァミノ酸数のうち 2 0 %までのァミノ酸が 対照配列に揷入されたものであってもよい。 対照配列におけるこれらの変化は、 対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に存在してもよく、 あるい はそれらの末端間のいずれかの位置に存在してもよく、 対照配列中に散在してい てもよく、 あるいは対照配列内で 1個またはそれ以上の一連の群をなしていても よい。 また、 本発明の HIV インテグラーゼは、 増殖可能な HIVを構成することがで きる HIVィンテグラ一ゼが好ましい。 増殖可能な HIVを構成することができる HIVィンテグラーゼか否かは、 本発明の HIVィンテグラーゼを含有する HIVを 作製し、 細胞に感染させ、 細胞での増殖能を調べればよい。
なお、 本発明の HIVインテグラーゼは、 遺伝子組み換え技術により生産された HIVインテグラ一ゼ、 天然に存在する HIVインテグラーゼ、 または有機合成され た HIVインテグラ一ゼのすベてを包含する。 好ましくは、 遺伝子組み換え技術に より生産された HIVィンテグラ一ゼである。
なお、 本明細書中、 アミノ酸とは、 天然型アミノ酸を意味し、 グリシン、 ァラ ニン、 ノ リン、 ロイ シン、 イソロイシン、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 ト リプ トフアン、 セリ ン、 ト レオニン、 システィ ン、 メチォニン、 プロ リ ン、 ァスパラ ギン、 グルタミ ン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リジン、 アルギニン、 ヒス チジン等が挙げられる。
本発明である HIVィンテグラ一ゼは、それらをコードするポリヌクレオチド（例 えば、 D N A断片） を制限酵素および D N Aリガ一ゼを用いて、 市販のベクター またはプラスミ ド等に導入し、 宿主細胞 （例えば大腸菌等） を用いて大量にタン パク質を発現させ、 発現生成物を回収し単離生成することにより作製することが できる。 なお、 細胞の培養は、 プロモータ一活性化、 形質転換体選択または遺伝 子増幅に適するように修飾された慣用的な培地中で行なうことができる。 温度、 p H等の培養条件は、 使用された宿主細胞に依存するが、 当業者であれば容易に 設定することができる。
上記発現系が HIVィンテグラーゼを増殖培地中に分泌する場合、 該 HIVィン テグラーゼを培地から直接精製することができる。 また、 HIVインテグラーゼが 分泌されない場合、 該 HIVインテグラ一ゼを細胞溶解物から単離するか、 あるい は細胞膜フラクシヨンから回収することができる。
回収、 単離および精製法としては、 硫酸アンモニゥム沈殿またはエタノール沈 殿、 酸抽出、 ァニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、 ホスホセルロ一 スクロマトグラフィー、 疎水性相互作用クロマトグラフィー、 ァフィ二ティーク 口マトグラフィー、 ヒ ドロキシルアパタイ トクロマトグラフィー、 レクチンクロ マトグラフィ一等が挙げられる。 最後に高品質液体高速クロマトグラフィーを使 用してもよい。
また、 別法として、 本発明のポリペプチドをペプチド合成装置により合成的に 得ることもできる。
制限酵素としては、 Nde l、 Bam HIなど使用することができる。 D N Aリガ一 ゼとしては、 T4 DNA リガ一ゼなどを使用することができる。
ベクタ一またはプラスミ ドとしては、 下記に記載のベクターを使用することが できる。 例えば、 ノヴアジェン社の pET15b ベクターなどを使用することができ る。
発現用ベクターとしては pET15b (E.coli BL21(DE3))S pBR322 ( E. coli) 、 PACYC177 (E. coli) 、 バクテリオファ一ジ人 （E. coli) 、 PKT230 (グラム陰性 細胞） 、 pGV1106 (グラム陰性細胞） 、 pLAFRI (グラム陰性細胞） 、 pME290 (非 Ε· coliグラム陰性細胞） 、 pHV14 ( E. coliおよびバチルス ' ズプチリス） 、 pBD9 (バチルス） 、 pIJ61 (ス ト レプト ミセス） 、 pUC6 (ス トレプト ミセス） 、 Yip 5 (サヅカロミセス） 、 バキュロウィルス昆虫細胞系、 Ycp l9 (サッカロミス ス）などが挙げられる。特に、ベクタ一としては pET15b、宿主細胞としては E.coli BL21(DE3)の組合わせが好ましい。 本発明のポリヌクレオチドは、 本発明の HIVィンテグラーゼをコ一ドするポリ ヌクレオチドを意味する。
すなわち、 本発明のポリヌクレオチドは、 本発明の HIVインテグラーゼまたは その欠失体、 置換体、 付加体のアミノ酸配列により特徴づけられる HIVインテグ ラ一ゼをコードするポリヌクレオチドを意味する。
また、 本発明のポリヌクレオチドは、 HIV の RNA ゲノム中に含まれる一部で あってもよく、 HIV持続感染細胞の DNAゲノムの中の一部であってもよい。 なお、 本発明のポリヌクレオチドは RN Aの形態、 または例えば c DNA、 ゲ ノム DNA、 および合成 DNAを含む DNAの形態であってもよい。 DNAは二 本鎖または一本鎖のいずれであってもよく、 一本鎖の場合、 コーディ ング鎖また は非コ一ディ ング鎖（アンチセンス鎖）であってよい。
本発明の HIVィンテグラ一ゼをコ一ドするコ一ディング配列は、 HIVィンテグ ラーゼをコードするポリヌクレオチドであれば、 特に特定の核酸配列に限定され るものではない。 すなわち、 同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列であれば、 すべての核酸配列が含まれる。
例えば、 配列表の配列番号 5または 6記載の核酸配列において、 1 8 7番目の Cが G、 1 9 6番目の Aが G、 1 9 7番目の Cが T、 22 0番目の Τが Α、 3 5 2番目の Gが Α、 4 3 3番目の〇が1\ 43 7番目の Αが G、 442番目の Cが A、 45 1番目の Aが T、 4 5 8番目の Cが Α、 4 6 2番目の Gが Α、 464番 目の Αが Gまたは C、 および/または 745番目の Gが Aに置換された核酸配列 を有するポリヌクレオチドが例示される。 なお、 配列表の配列番号 5記載の核酸 配列は野性株 （NL 43 ) のインテグラーゼ部位をコードする核酸配列であり、 配列番号 6記載の核酸配列は野性株のアミノ酸配列を変化させずに制限酵素部位 (Xbalと Clal) を導入した核酸配列である。
なお、 上記は具体例であり、 遺伝暗号の縮重の結果、 異なる核酸配列を有する ポリヌクレオチドであってもよい。
なお、 本発明のポリヌクレオチドは、 本明細書開示の D N A配列により特徴づ けられるコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変種であるコーディング 配列を有していてもよい。 当該分野において知られているように、 対立遺伝子変 種は、 1個またはそれ以上のヌクレオチドが置換、 欠失または付加されていても よいポリヌクレオチド配列の別形態であり、 コードされているポリペプチドの機 能を実質的に変化させないものである。
また、 本発明の HIVインテグラーゼを細胞に発現させる場合、 以下の配列を含 んでいてもよい。 すなわち、 成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 成熟ポリべプチドのコ一ディング配列のみを含むものであってもよく、 あるいは 成熟ポリペプチドのコ一ディング配列ならびにリ一ダ一配列または分泌配列また はプロ蛋白配列のごときさらなるコーディング配列を含むものであってもよい。 すなわち、 本発明のポリヌクレオチドは、 ポリペプチドのコーディ ング配列の みを含むポリヌクレオチド、 ならびにさらなるコーディ ング配列および/または 非コ一ディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
それゆえ、 本発明は、 成熟ポリペプチドのコーディ ング配列が、 宿主細胞から のポリペプチドの発現および分泌を促進するポリヌクレオチド配列 （例えば、 細 胞からのポリぺプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列） にフレーム中で融合していてもよいポリヌクレオチドを包含する。
リーダー配列を有するポリぺプチドはプレ蛋白であり、 宿主細胞により開裂さ れてポリペプチドのプロ蛋白を生じる。 ポリヌクレオチドはプロ蛋白をコードし ていてもよく、 プロ蛋白は成熟蛋白とさらなる N末アミノ酸残基とからなる。 プ 口配列を有する成熟蛋白が開裂されると活性成熟蛋白が残る。
よって、 例えば、 本発明ポリヌクレオチドは成熟蛋白をコードしていてもよく、 あるいはプロ配列を有する蛋白またはプロ配列およびプレ配列 （リーダー配列） の両方を有する蛋白をコードしていてもよい。
本発明ポリヌクレオチドは、 遺伝子の 5 ' または 3 ' 末端のいずれかにおいて、 本発明ポリべプチドの精製を可能にするマーカ一配列にフレーム中で融合したコ ーデイ ング配列を有していてもよい。 マーカ一配列は、 p E Tシリーズのベクタ ― (ノヴァジェン社により市販） により提供されるへキサ一ヒスチジンタグであ つてもよく、 該タグは細菌宿主の場合にマ一カーに融合したポリぺプチドの精製 を可能にする。
本発明のポリヌクレオチドは、 HIVの RNAゲノムを錶型とした RT-PCR法ま たは cDNAを鎳型とした PCR法等を用いて大量に複製することができる。
また、 本発明のポリヌクレオチドは、 増殖可能な HIVを構成することができる ポリヌクレオチドが好ましい。 増殖可能な HIVを構成することができるポリヌク レオチドか否かは、 本発明のポリヌクレオチドを含有するプラスミ ドを作製し、 細胞に導入してウィルスを産生させ、 そのウィルスを細胞に感染させてその増殖 能を調べればよい。 本発明のベクターまたはプラスミ ドは、 本発明のポリヌクレオチドを含有する ベクターまたはプラスミ ドを意味し、 本発明のポリヌクレオチドを制限酵素、 D N Aリガーゼを用いて、 市販のベクター （例えば、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファ —ジなど） に導入することにより作製することができる。
制限酵素としては、 Nde l、 Bam HIなどを使用することができる。 D N Aリガ —ゼとしては、 T4 DNA リガーゼなどを使用することができる。
ベクタ一としては、 細菌プラスミ ド、 ファージ D N A、 バキュロウィルス、 酵 母プラスミ ド、 プラスミ ド、 及びファージ D N Aの組合わせに由来するベクター を意味するが、 宿主細胞中で複製可能ある限り、 上記以外のベクターを使用して もよい。 ベクターとしては、 例えば、 細菌べクタ一として、 pET15b ベクター、 pET3ベクター、 pQE70、 pQE60s pQE-9N pbsヽ pD10、 phage script, psiXl74, pbluescript SE：、 pdsks、 pNH8Aヽ pNHl6aヽ pNH18Aヽ pNH46A、 ptrc99a、 pKK233-3、 pDR540、 pRIT5が挙げられ、 真核細胞べクタ一として、 pBlueBacIII、 pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44s pXTl、 pSGs pSVK3、 p'BPV、 pMSG、 pSVLが挙げられる。 特に、 ノヴァジェン社の pET15bベクターが好ましい。
ポリヌクレオチドのベクターへの挿入は、 様々の方法が知られているが、 例え ば、 ポリヌクレオチドをべクタ一の適当な制限ェン ドヌクレアーゼ部位に揷入す る。 ベクター中のポリヌクレオチドは、 m R N A合成を指令する適当なプロモー ターに作動可能に連結される。 プロモータ一としては、 例えば、 T 7プロモータ 一、 L T Rまたは S V 4 0プロモーター、 大腸菌 （E . c o l i ) の l a cまた は t r p、 ラムダファージの P tプロモーター、 原核細胞、 真核細胞、 またはそ れらのウィルスにおいて遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモー 夕一が挙げられる。
さらにベクターは、 翻訳開始のためのリボソーム結合部位、 転写ターミネ一夕 一、 発現増幅のための適当な核酸配列を含んでいてもよい。
ベクターは、 形質転換宿主細胞の選択のための表現型を付与する 1またはそれ 以上の選択可能マーカーを含んでいてもよい。 マ一力一としては、 例えば、 真核 培養細胞においてはジヒ ドロ葉酸レダクタ一ゼ遺伝子またはネオマイシン耐性遺 伝子を使用することができ、 大腸菌においてはテトラサイク リン耐性遺伝子また はアンピシリ ン耐性遺伝子を使用することができる。 本発明の HIVは、 本発明の HIVィンテグラ一ゼまたは本発明のポリヌクレオ チドを含有する HIVを意味する。
本発明の HIVは、 以下のように作製できる、 すなわち、 モレキュラークローン pNL43のィンテグラ一ゼ部分の配列のみを上記シークェンスに基づき作製された HIVインテグラ一ゼをコードするポリヌクレオチド （例えば D N A ) で置換した プラスミ ドを作製し、 細胞 （例えば、 ヒ ト T細胞） に取り込ませ、 目的の変異を 持つ HIVィンテグラ一ゼを有する HIVのウィルスクローンを作製すればよい。 本発明の HIVが持続感染した細胞は、 本発明の HIVが持続感染した細胞を意 味する。
本発明の HIVが持続感染した細胞は、 本発明のベクタ一またはプラスミ ドを、 HIV形成に必要な他の酵素等をコ一ドするポリヌクレオチドを含有するプラスミ ド DNAと共に、 細胞 （例えば、 ヒ ト T細胞） に取り込ませることにより作製する ことができる。 また、 細胞に本発明の HIVを感染させることによつても作製する ことができる。 細胞としては、 ヒ ト T細胞等を用いることができる。 本発明のプローブまたはプライマーは、 本発明のポリヌクレオチドに特異的に ハイプリダイズするプローブまたはプライマーを意味する。 本発明のポリヌクレオチドを検出または複製するために使用されるプローブま たはプライマ一であり、 本発明の.ポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブ またはプライマ一であれば、 特に限定するものではない。 すなわち、 ス ト リンジ ェン トな条件下で本発明のポリヌクレオチドの核酸配列にハイプリダイズするプ ローブまたはプライマ一であればよい。 また、 変異部位の検出に使用する場合は、 変異部位を含む 7 ~ 2 0アミノ酸をコードするポリヌクレオチドに相補的なプロ —ブまたはプライマーが好ましい。
ス ト リンジェン トな条件でハイプリダズするプローブまたはプライマーとは、 配列間の同一性が少なく とも 9 5 %、 好ましくは少なく とも 9 7 %である場合に ハイブリダィズするポリヌクレオチドを意味する。 例えば、 50 %ホルムアミ ド、 5 x S S C ( 1 5 0mM Na C l、 1 5 mMクェン酸三ナトリウム） 、 50mM リン酸ナト リウム （p H 7.6 )、 5 Xデンハーツ溶液、 1 0 %硫酸デキス トラン、 および 20 g/m 1の変性し、 剪断されたサケ精子 D N Aを含有する溶液中、 42 °Cでー晚ィンキュベ一シヨンし、 続いて約 6 5 °Cで 0.1 X S S C中でフィル 夕一を洗浄するものなどが挙げられる。 ハイブリダィゼ一シヨンおよび洗浄条件 は周知であり、 Sambrookら、 Molecular Cloning'A Laboratory Manual、第 2版； コールド ' スプリング · ハーバ一、 ニューヨーク （1989) 、 とりわけその第 1 1 章に実例が示されている。
本発明のポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブまたはプライマーとは、 野性株に結合せず、 変異株 （耐性変異株） に結合するプローブまたはプライマ一 を意味する。 また、 本発明のプローブまたはプライマ一を使用して、 本発明の HIVを検出す ることができる。 特に、 野性株と変異株を区別して検出する方法が好ましく、 例 えば、 以下に示す群から任意に選択される少なくとも 1つのアミノ酸をコードす る核酸配列の変異を検出することを特徴とする HIVの検出法が好ましい ；
(a) 63番目のロイシンをコードする核酸配列からロイシン以外のアミノ酸を コードする核酸配列への変異；
( b ) 6 6番目のトレオニンをコードする核酸配列から トレオニン以外のァミノ 酸をコードする核酸配列への変異；
( c ) 7 0番目のグリシンまたはグル夕ミン酸をコードする核酸配列からグリシ ンおよびグル夕ミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異 ；
( d ) 7 2番目のバリン、 イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列か らバリン、 イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列へ の変異 ；
( e ) 7 4番目のロイシン、 イソロイシン、 ノ リンまたはプロリンをコードする 核酸配列からロイシン、 イソロイシン、 ノ リ ンおよびプロリン以外のアミノ酸を コードする核酸配列への変異 ；
( f ) 9 2番目のグルタミン酸またはァスパラギン酸をコードする核酸配列から グル夕ミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変 異
( g ) 1 1 8番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸 をコードする核酸配列への変異 ；
( h ) 1 2 1番目のフエ二ルァラニンをコ一ドする核酸配列からフエ二ルァラ二 ン以外のアミノ酸をコ一ドする核酸配列への変異；
( i ) 1 3 8番目のグル夕ミン酸またはァスパラギン酸をコードする核酸配列か らグルタミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ酸以外のアミノ酸をコ一ドす る核酸配列への変異；
( j ) 1 4 0番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン.以外のァミノ酸 をコードする核酸配列への変異；
( k ) 1 4 5番目のプロ リンをコードする核酸配列からプロリン以外のアミノ酸 をコードする核酸配列への変異 ；
( 1 ) 1 4 6番目のグル夕ミンをコ一ドする核酸配列からグルタミン以外のアミ ノ酸をコ一ドする核酸配列への変異； ( m ) 1 4 8番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミ ノ酸をコードする核酸配列への変異；
( n ) 1 5 1番目のバリンまたはィソロイシンをコ一ドする核酸配列からバリン およびィソロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
( o ) 1 5 3番目のセリンまたはァラニンをコードする核酸配列からセリンおよ びァラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
( ) 1 5 5番目のァスパラギンをコードする核酸配列からァスパラギン以外の アミノ酸をコードする核酸配列への変異；
( q ) 1 6 0番目のリジン、 グルタミン、 トレオニンまたはグルタミン酸をコー ドする核酸配列からリジン、 グルタミン、 トレオニンおよびグルタミン酸以外の アミノ酸をコードする核酸配列への変異；
( r ) 2 4 9番目のバリ ンまたはロイシンをコードする核酸配列からバリンおよ びロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；および
( s ) 2 5 0番目のバリ ン、 ロイシンまたはァラニンをコードする核酸配列から バリン、 ロイシンおよびァラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異。 さらに詳しくは、 以下に示す群から任意に選択される少なく とも 1つのアミノ 酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とする HIVの検出法が好ま しい ；
( a ) 6 3番目のロイシンをコードする核酸配列からパリンをコードする核酸配 列への変異；
( b ) 6 6番目のトレオニンをコードする核酸配列からイソロイシンまたはァラ ニンをコ一ドする核酸配列への変異 ；
( c ) 7 0番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアルギ ニンをコードする核酸配列への変異；
( d ) 7 2番目のパリン、 イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列か らァラニンをコ一ドする核酸配列への変異； ( e ) 74番目のロイシン、 イソロイシン、 パリンまたはプロリンをコードする 核酸配列からメチォニンをコードする核酸配列への変異 ；
(f ) 9 2番目のグル夕ミン酸またはァスパラギン酸をコ一ドする核酸配列から グルタミンをコードする核酸配列への変異；
( g) 1 1 8番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸 配列への変異 ；
(h) 1 2 1番目のフエ二ルァラニンをコードする核酸配列からチロシンをコ一 ドする核酸配列への変異 ；
( i ) 1 3 8番目のグルタミン酸またはァスパラギン酸をコ一ドする核酸配列か らリジンをコードする核酸配列への変異；
( j ) 1 40番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸 配列への変異；
(k) 1 45番目のプロリンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸 配列への変異 ；
( 1 ) 1 46番目のグルタミンをコードする核酸配列からアルギニンをコードす る核酸配列への変異；
(m) 1 48番目のグルタミンをコードする核酸配列からリジンまたはアルギニ ンをコ一ドする核酸配列への変異；
( n ) 1 5 1番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列から口イシ ンをコードする核酸配列への変異；
( o ) 1 53番目のセリンまたはァラニンをコードする核酸配列からチロシンを コードする核酸配列への変異；
(P) 1 5 5番目のァスパラギンをコードする核酸配列からセリン、 イソ口イシ ン、 トレオニンまたはヒスチジンをコードする核酸配列への変異 ；
(q ) 1 60番目のリジン、 グルタミン、 トレオニンまたはグルタミン酸をコー ドする核酸配列からァスパラギンをコ一ドする核酸配列への変異 ；
( r ) 249番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からイソ口イシ ンをコ一ドする核酸配列への変異；および
( s ) 2 5 0番目のパリン、 ロイシンまたはァラニンをコードする核酸配列から イソロイシンをコ一ドする核酸配列への変異。 本発明の検出法は、 上記化合物 A〜： Fを含有する HIVインテグラ一ゼ阻害剤の 投薬患者から得られた HIVの検出のみならず、 他の HIVインテグラーゼ阻害剤 の投薬患者、 あるいは全く未投与の患者から得られた HIVの検出法としても使用 できる。 具体的には、 耐性変異の配列を内部に持った DNAや RNA、 または耐性変異部 位は含まず、 その直前または直後の配列を持つ DNAや RNAをプローブゃ錡型に 用いたハイブリダイゼ一ション法ゃォリゴヌクレオチドライゲイシヨン法とそれ らの応用法、 耐性変異の配列を持った DNAや RNAをプライマーに用いた RT— PCR法または PCR法、 耐性変異部位の 5'側直前の配列を持つ DNAや RNAをプ ライマ一にした伸長反応を応用した方法などにより検出することができる （①中 村祐輔. （2000) SNP: その重要性と解析法. 実験医学. vol.18, p l587- 1594. ②西 村俊秀、 須田三記也.（2000) SNPタイピング技術の現状と将来. 実験医学 . vol.18, p l894- 1900.) o また、 上記とは別の薬剤耐性 HIV検出法としては、 以下の検出法が挙げられる c まず、 HIV感染者から HIVまたは持続感染細胞を得、 次にインテグラ一ゼ阻害剤 (化合物 A ~ F ) に対する感受性をインビトロで測定し、 そのインテグラ一ゼ阻 害剤によってどの程度増殖が阻止されているかを薬剤非存在下と比較し、 そのィ ンテグラーゼ阻害剤に対する感受性が低下していれば、 該 HIVは薬剤耐性を獲得 しているといえる。 すなわち、 この検出法により、 該 H I Vが、 本発明において 明らかになった変異 （例えば、 表 1に記載の変異） を有していると結論できる。 本発明の HIVおよび本発明の HIVが持続感染した細胞は、 ァヅセィに用いる ことができる。 すなわち、 本発明の HIVを細胞 （例えば、 ヒト T細胞） に感染さ せ、 または本発明の HIVが持続感染した細胞 （例えば、 ヒ ト T細胞） を使用し、 当業者に広く知られている MTTァヅセィを行えばよい。このようなァヅセィによ り、 本発明の HIVである HIVインテグラ一ゼ阻害剤耐性 HIVに対しても有効な 化合物や薬剤を見い出すことができる。 この際、 EC50値 （ウィルスによる細胞障 害を 50%抑制する化合物濃度） と CC50値 （化合物による細胞毒性が 50%である 化合物濃度） を比較することにより、 有効な化合物を選択することができる。 ま た、 HIV の野性株に対しても同時に活性を測定し、 耐性株に対する活性と比較す ることにより、 その化合物や薬剤の有用性をさらに検討することができる。 また、 耐性株そのものを用いる以外に以下のような方法でァヅセィを行っても良い。 す なわち、 インテグレーション活性が欠損している mvに、 インテグラーゼのみを 別の分子として発現させたものを取り込ませることによりインテグレーション活 性が相補されてウィルスの感染が成立するこ とが知られている （ Virology, Vol.255, 1999, p77-85, A novel vpr peptide interactor fused to integrase (IN) restore integration activity to IN-defective HIV-1 virions. J. Kulkosky, M. BouHamdan, A. Geisit, E. J. Pomerantz) 。 ただし、 ウィルス粒子にイ ンテグラ —ゼを取り込ませるために、 インテグラーゼの N末端にたとえば Vprが融合され た形で発現させるなどの工夫が必要である。 この方法を用いれば耐性株を用いな く ともィンテグラーゼに対する耐性変異の影響を簡単に調べることができる。 また、 本発明の HIVインテグラーゼも、 本発明の HIV、 本発明の HIVが持続 感染した細胞同様、 HIV インテグラーゼ阻害剤 （または活性化剤） 探索のための アツセィに使用することができる。 すなわち、 被験化合物が HIVインテグラ一ゼ と結合または相互作用し、 HIVインテグラ一ゼ活性を阻害 （または活性化） する か否かを測定すればよい。 本ァヅセィ法は、 被験化合物と HIVインテグラーゼと の結合または相互作用が可能な条件下で、 被験化合物と HIVィ ンテグラーゼを接 触させ、 被験化合物と HIVインテグラ一ゼの結合または相互作用による HIVィ ンテグラーゼ活性の変化を測定し、 HIVインテグラ一ゼを阻害するか否かを評価 することによ り行うことができる。 例えば、 基質 DN Aと夕一ゲヅ ト DNAを使 用し、 被験化合物と HIVインテグラ一ゼの結合または相互作用により、 HIVイン テグラーゼによる基質 D N Aの夕一ゲヅ ト D N Aへの組み込みの減少を測定すれ ばよい。
このようなアツセィ法としては、 具体的には、 WO 00/3 9 0 8 6に記載の ァヅセィ法が挙げられる。 本発明の耐性変異を持つ HIVインテグラーゼを、 W〇 00/39 0 86に記載の野生型のィンテグラーゼの代わりに通常の反応バヅフ ァ一に添加するだけで全く同じ方法でアツセィに用いることができる。 このよう なアツセィにより、 既存の薬剤耐性 HIVに対しても有効な化合物や薬剤を見出す ことができる。 また、 野性型インテグラ一ゼに対しても同時に活性を測定し、 耐 性変異をもつィンテグラーゼに対する活性と比較することにより、 その化合物や 薬剤の有用性を検討することができる。 なお、 これらのアツセィの結果選択される化合物は、 例えば、 分子量 1 5〜 1 00 0の有機化合物を意味し、 構成原子としては、 水素、 リチウム、 ホウ素、 炭 素、 窒素、 酸素、 フ ヅ素、 ナト リウム、 マグネシウム、 アルミニウム、 硫黄、 塩 素、 カリウム、 カルシウム、 鉄、 バリウム、 臭素、 沃素等が挙げられる。 特に、 - C (=0) —、 一 C (= S ) 一または— NH—で示される基を持つ化合物が好 ましい。 また、 窒素、 酸素および硫黄の中から任意に選択される原子を 1〜 3個 有するヘテロ環を有する化合物が好ましい。
上記化合物を有効成分として含有する HIV インテグラーゼ阻害剤、 および該 HIVィンテグラ一ゼ阻害剤を含有する抗 HIV剤、 エイズ治療剤も本発明に包含さ れる。
上記化合物は、 経口的又は非経口的に投与することができる。 絰ロ投与による 場合、 上記化合物は通常の製剤、 例えば、 錠剤、 散剤、 顆粒剤、 カプセル剤等の 固形剤 ；水剤 ； 油性懸濁剤 ； 又はシ口ップ剤若しくはェリキシル剤等の液剤のい ずれかの剤形としても用いることができる。 非経口投与による場合、 上記化合物 は、 水性又は油性懸濁注射剤、 点鼻液として用いることができる。 その調製に際 しては、 慣用の賦形剤、 結合剤、 滑沢剤、 水性溶剤、 油性溶剤、 乳化剤、 懸濁化 剤、 保存剤、 安定剤等を任意に用いることができる。
本発明の製剤は、 治療有効量の上記化合物を製薬上許容される担体または希釈 剤とともに組み合わせる （例えば混合する） ことによって製造される。 上記化合 物の製剤は、 周知の、 容易に入手できる成分を用いて既知の方法により製造され る。 '
上記化合物の医薬組成物を製造する際、 活性成分は担体と混合されるかまたは 担体で希釈されるか、 カプセル、 サッシヱ一、 紙、 あるいは他の容器の形態をし ている担体中に入れられる。 担体が希釈剤として働く時、 担体は媒体として働く 固体、 半固体、 または液体の材料であり、 それらは錠剤、 丸剤、 粉未剤、 口中剤、 エリキシル剤、 懸濁剤、 ェマルジヨン剤、 溶液剤、 シロップ剤、 エアロゾル剤 （液 体媒質中の固体） 、 軟膏にすることができ、 例えば、 1 0 %までの活性化合物を 含む。 本発明化合物は投与に先立ち、 製剤化するのが好ましい。
当業者には公知の適当な担体はいずれもこの製剤のために使用できる。 このよ うな製剤では担体は、 固体、 液体、 または固体と液体の混合物である。 例えば、 静脈注射のために本発明化合物を 2 m g Z m lの濃度になるよう、 4 %デキス ト ロース / 0 . 5 %クェン酸ナト リウム水溶液中に溶解する。 固形の製剤は粉末、 錠剤およびカプセルを包含する。 固形担体は、 香料、 滑沢剤、 溶解剤、 懸濁剤、 結合剤、 錠剤崩壊剤、 カプセル剤にする材料としても役立つ 1 またはそれ以上の 物質である。 経口投与のための錠剤は、 トウモロコシデンプン、 アルギン酸など の崩壊剤、 および/またはゼラチン、 アカシアなどの結合剤、 およびステアリン 酸マグネシウム、 ステアリン酸、 滑石などの滑沢剤とともに炭酸カルシウム、 炭 酸ナト リウム、 ラク トース、 リン酸カルシウムなどの適当な賦形剤を含む。
粉未剤では担体は細かく粉砕された活性成分と混合された、 細かく粉砕された 固体である。 錠剤では活性成分は、 適当な比率で、 必要な結合性を持った担体と 混合されており、 所望の形と大きさに固められている。 粉末剤および錠剤は約 1 〜約 9 9重量％の本発明の新規化合物である活性成分を含んでいる。 適当な固形 担体は、 炭酸マグネシウム、 ステアリン酸マグネシウム、 滑石、 砂糖、 ラク トー ス、 ぺクチン、 デキス ト リン、 デンプン、 ゼラチン、 トラガカントゴム、 メチル セル口一ス、 ナト リウムカルボキシメチルセルロース、 低融点ワックス、 ココア バタ—である。 液体製剤は懸濁剤、 ェマルジヨン剤、 シロップ剤、 およびエリキシル剤を含む。 活性成分は、 滅菌水、 滅菌有機溶媒、 または両者の混合物などの製薬上許容し得 る担体中に溶解または懸濁することができる。 活性成分はしばしば適切な有機溶 媒、 例えばプロピレングリコール水溶液中に溶解することができる。 水性デンプ ン、 ナト リウムカルボキシメチルセルロース溶液、 または適切な油中に細かく碎 いた活性成分を散布することによってその他の組成物を製造することもできる。 上記化合物の投与量は、 投与方法、 患者の年齢、 体重、 状態及び疾患の種類に よっても異なるが、 通常、 経口投与の場合、 成人 1日あたり約 0. 0 5mg~3 00 0 mg、 好ましくは、 約 0. l mg〜： L O O Omgを、 要すれば分割して投 与すればよい。 また、 非経口投与の場合、 成人 1日あたり約 0. 0 1 mg〜 1 0 00mg、 好ましくは、 約 0. 0 5mg〜5 00m gを投与する。
実施例
実施例 1 HIVィンテグラーゼをコ一ドする遺伝子の変異部位の確認
1. HIV-1 ΠΙΒ持続感染細胞である、 IIIB/Molt-4細胞 （約 lxl05/ml) と MT-2 細胞を （約 3xl05/ml) を混合し （細胞比 約 1:3)、 C02インキュベータ一 （37°C、 C02濃度 5 %に設定） で 3日間培養した。 混合 3日後の、 HIVが増殖し巨細胞が 出現している状態の感染細胞を耐性ウィルス分離用のウィルスとした。
2. MT-2細胞を培養液で約 3xl05/mlに分散し、 24 wellプレートに 1 mlずつ分注 した。 同様に、 巨細胞出現後の感染細胞 （上記参照） を適度に希釈し、 0.5 mlづっ 分注した。希釈した被験試料を添加してブレートミキサーで混和後、 co2インキュぺ —夕一で培養した。
3. 感染 3-4日目に感染細胞中の HIVによる巨細胞形成の有無を確認した。 培養上 清 l mlを新たなプレートに分注し、 新たな MT-2細胞 （約 2xl05/well)、 培養液、 薬 剤を添加した。 3-4日おきに細胞を観察し、 このウィルスの継代操作を繰り返した。 この時、 強度の巨細胞形成が出現していた時は培養上清 0.5 ml, その他の場合は感 染細胞 0.5 mlを継代に用いた。 細胞を継代する場合、 MT-2細胞の添加量は適宜調 節した。 各 wellの培養液量は、 約 1.5-2.0 mlで行った。
4. 細胞の継代時に、 その薬剤の濃度において明らかな強度の巨細胞形成が繰り返 して出現した時は、 継代時に薬剤濃度を 5倍量に上げ、 再度培養を続けた。 この操作 を繰り返し、薬剤濃度を徐々に上げていった。最終的に薬剤濃度 4，000-10，000 ng/ml において HIVが増殖可能となるまで続けた。 この間、 約 1週間おきに培養液、 感染 細胞をサンプリングした。
5. 採取した感染細胞について、 DNA 抽出キヅ トを用いてプロウィルスゲノム DNAを抽出した。 ィンテグラ一ゼ領域の両側の 2本のプライマ一を用いて PCRを 行い、 増幅された DNAに関してシークェンスを行った。 以下の表に使用した薬剤と変異部位を示す。
表 1
Figure imgf000036_0001
(表中、 T66Iは、 6 6番目のアミノ酸である T (トレオニン） から I (イソロイシン） に変 異することを表わす。 T66I/L74Mは、 T66Iと L74Mの 2箇所変異することを意味する。 他 の記号についても、 同様の意味を表わす。 ） 実施例 2 HIV変異株の molecular cloneの作製法
下記に、 代表的な mutantの作製法を示す。 クローンは、 molecular cloneであ る pNL432を用いた。予め、ィンテグラーゼに変異を導入しやすいように、 pNL432 のインテグレースの最初の位置に Xbal を作製したものを用いた （以降、 NL432 Xbaとする） 。
T66I mutantの作製法
化合物 C耐性ウィルス （NL432 ) より得られたインテグレ―ス T66Iの mutant ウィルス DNAをテンプレートにして、 下記に示すプライマ- INT-Xb a、 vpr-Eco で PCR を行った。 これで得られた断片を Xbal/EcoRI でカツ トし、 NL432 Xba の同領域と置き換えた。
INT-Xba CTATTTGTAfiATGGAATCGATAAGGC C CAAG (配列番号 ： 2 3 )
vpr-Eco ACACCCAATTCTGAAATGGA (配列番号 ： 2 4 )
2. T124A mutantの作製法
pNL432をテンプレー トにして、 下記のプライマ- INT-Xba、 124A Bam (- ) で PCRを行い、 これで得られた断片を Xbal/BamHIでカッ トした（= XbBal24A)。 ■ また pNL432をテンプレートにして、 下記のプライマ- 124A Bam( + ) 、 vpr-Eco で PCRを行い、これで得られた断片を BamHI/EcoRIでカツ ト した（= BaEcl24A)c 続いて XbBal24A、 BaEcl24A 断片をライゲーシヨンさせた後に、 pUCl8 の Xbal/EcoRIへクローニングした。 このプラスミ ドを Xbal/EcoRIでカッ トし、 そ の断片を pNL432 Xbaの同領域と置き換えた。
124A Bam (—） CGCGfiATCfiATTGTCTGTATGTACTGTTTT (配列番号 ： 2 5 )
124A Bam (+ ) CGCGGATCCAATTTCACCAGTGCTACAGTT (配列番号 ： 2 6 )
3. E148K mutantの作製法
pNL432をテンプレー トにして、 下記のプライマ- INT-Xba、 148K Bam(— ) で PCRを行い、 これで得られた断片を Xbal/BamHIでカヅ トした（= XbBal48K：)。 また、 pNL432 をテンプレートにしてプライマ- 148K Bam( + )、 vpr-Ecoで PCR を行い、 これで得られた断片を BamHI/EcoRIでカツ トした（= BaEcl48K)。 続い て XbBal48K：、 BaEcl48K断片をライゲーションさせた後、 pUCl8の Xbal/EcoRI へクローニングした。 このプラスミ ドを、 Xbal/EcoRI でカッ ト し、 その断片を PNL432 Xbaの同領域と置き換えた。
148K Bam (- ) CGCOGATCGCAAATTCCTGCTTGATCCCCGC (配列番号： 2 7 )
148K Bam (+ ) CGCfifiAT^CTACAATCCCCAAAGTAAAGGAG (配列番号 ： 28 )
4. N155S mutantの作製法
pNL432をテンプレー トにして、 下記のプライマ- INT-Xba、 155S Sac (—） で PCRを行い、 これで得られた断片を Xbal/Saclでカッ トした（ = XbSal55S )。 ま た、 pNL432をテンプレ一トにしてプライマ- 155S Sac( + )、 vpr-Ecoで PCRを 行い、 これで得られた断片を SacI/EcoRI でカヅ ト した（二 SaEcl55S)。 続いて XbSal55S、 SaEcl55S断片をライゲーシヨンさせた後、 pUClSの Xbal/EcoRI へクローニングした。 このプラスミ ドを、 Xbal/EcoRI でカッ ト し、 その断片を pNL432 Xbaの同領域と置き換えた。
155S Sac (—） CCCGAOCi TTTACTCATAGATTCTATTACTCC (配列番 号： 2 9 )
155S Sac (+) CCCfiAGCmAAGAAAATTATAGGACAGG (配列番号 ： 3
0)
他の HIVについても、 上記同様に作製することができる。 実施例 3 HIVインテグラ一ゼをコードする核酸の作製法
本発明の変異を持つ耐性ウィルスのモレキュラークローン DNA 5 n を錡型に して、 制限酵素部位 Nde I (5'側） と Bam HI (3'側） を付加できるように設計さ れたプライマ一 （ 5'- ggC AgC CAT ATg TTT TTA gAT ggA ATA gAT AAg gCC C -3' (配列番号： 3 1 )と 5'-gCAgCCggATCCTTAATCCTCATCCTgTCTACT TgC CAC -3' (配列番号： 32) ) と東洋紡社より購入した KOD dash polymerase を用いて本発明の変異を持つインテグラーゼをコードする DNA断片を増幅した。 反応条件は 10〃1の 10 X KOD buffer (組成 ： 1.2 M Tris-HCl (ρΗ8.0) , 100 mM KC1, 60 mM (NH4)2S04, 1% Triton X-100, 25 mM MgCl2) 、 16 1の dNTP混合 液（各々 2mM)、プライマ一（lOOpmol/ l)をそれそれ 1〃1づっ、錶型 DNAを 5 ng 分、 最後に KOD dash polymerase (2.5 units/〃l)を 1.5〃1入れて 100〃1のスケ —ルで 94°C、 30sec.、 52°C、 30sec.、 74°C、 30sec.のサイクルを 30回行った。 実施例 4 変異 HIVインテグラーゼの作製法
前項の実施例で増幅した本発明の変異を含むイ ンテグラーゼをコー ドする DNA断片を制限酵素 Nde lと Bam HIで切断してから 1 %ァガロースゲルに電気 泳動を行い、 イルミネ一夕一上でバン ドを検出して切り出し精製した。 他方ノヴ アジェン社の pET15bベクタ一も同様に制限酵素 Nde Iと Bam HIで切断後、 ァ ガロースゲルに電気泳動することにより余分な DNA断片を取り除いた。これらの 耐性ィ ンテグラーゼをコ一ドする DNA断片と pET15bベクタ一を T4 DNA ligase を用いてライゲーシヨンを行い、 発現ベクターを構築した。
次に構築した発現ベクターをノヴアジヱン社よ り購入したコンビテン トセル BL21(DE3)に トランスフォーメーションを行い、 100/i g/ml のアンピシリンを含 む LBプレ1 ~~ト 、$且成： 10 mg/ml Bacto-trypton, 5 mg/ml feast-extract, 5 mg/ml NaCl)にまいて 37°Cで終夜培養した。翌日プレ一トに生えたコロニーを集めて 100 J g/mlのアンピシリ ンを含む SB培地（組成： 12 mg/ml Bacto-trypton, 24 mg/ml Yeast-extract, 4 l/ml glycerol, 2.31 mg/ml KH2P04, 12.54 mg/ml K2HP04) 中 で 30°Cで培養を行った。 600 nmにおける吸光度が 0.8 に達した時点で終濃度が 0.4 mMになるよう IPTGを添加してィンテグラ一ゼの発現を誘導した。発現誘導 後は 37°Cで 3時間培養を行った後に集菌した。集めた菌を溶解バッファー（組成 ： 0.15 M NaCl, 20 mM HEPES (pH7.5), 2 mM 2-mercaptoethanol, 5 mM imidazole) に溶解して終濃度 0.3 mg/mlになるようにライソザィムを加えて氷上 で 30分間ィンキュベーションを行った。ダウンス型ホモジュナイザーで破砕後、 超遠心 （条件 ： 4°C、 60分、 40000 g ) を行った。 沈殿物を 5 mM imidazole を含む可溶化バッファー （組成 ： 20 mM MOPS (pH7.2), 400 mM potassium glutamete, 1 mM EDTA, 0.1% NP-40, 20% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 4M urea) に溶解して 0.22-〃Mのフィルターに通した後にニッケルキレートァフ ィニティ一ゲル （アマシャムフアルマシアバイオテック） にアプライ した。 洗浄 ノ ヅファー（組成： 40 mM imidazole, 20 mM MOPS (pH7.2), 400 mM potassium glutamete, 1 mM EDTA, 0.1% NP-40, 20% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 4M urea) でカラムを洗浄後、 300 mM imidazoleを含む可溶化バッファ一で溶出 した。溶出されたフラクションを 1000倍量の 10 mM DTTを含む可溶化バヅファ 一に対して 2回透析し、 インテグレーション活性を調べた。 実施例 5 変異 HIVウィルス検出法
本発明の耐性ウィルス検出例 （T66I の場合） を以下に示す方法に基づき実施し た 。
( 1 ) プロウィルス MAを用いた検出法
合成した表 2の各 MAを TEバッファー（組成： 1 mM EDTA， 10 mM Tris-塩酸 （pH 7.6)) に溶解させ、 プライマー溶液 （10 pmol/z l) を調製した。 野生型を検出す る場合は RWT-2 (5'- GAA TAT GGC AGC TAG ATT GTA C -3' (配列番号 ： 3 3 ) ) と R - 1 (5'- CTA GGT CAG GGT CTA CTT GTG T&C -3' (配列番号 ： 3 4 ) ) のプラ ィマーを、 耐性変異型を検出する場合は EM- 2 (3，- G GAA TAT GGC AGC TAG ATT CAA T- 5' (配列番号 ： 3 5 ) ) と MW- 1のプライマーを各々 0.5〃1用いた。 0.5units の TaKaRa Ex Taq ヒ 3〃1の添付バッファー （組成： 100 mM Tris- HC1 , pH8.3, 500 mM KC1, 15 iM MgCl2) と dNTP混合液（各々 2.5 mM)を混ぜて 28〃 1 の反応液を作 製し、 様々な濃度の錶型 DNAを含む溶液 2 1を加えた。 ミネラルオイルを一滴ず つ加えてからシータス社の機械を用いて、 野生型を検出する場合は 94°C、 lmin.、 57°C、 30se 、 72V, 30se のサイクルを 30回の条件で、 耐性変異型を検出する 場合は 94°C、 lmin.、 60°C、 30sec.、 72°C、 30sec.のサイクルを 27回繰り返す反 応条件で PCR反応を行った。 野生型ウィルス DNAの鎢型としてはモレキュラーク D—ン pNL432を用いた （Adachi, Α·， Gendelman, H.E., Koenig, S., Folks, T., Willey, R., Robson, A., Martin, M.A. (1986) Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J. Virol., vol.59, p284- 291.) 。 耐性ウィルス MAの錶型としては pNL432のィンテグラ一ゼ部分のアミノ 酸配列にのみ T66I、 L74M(ACA→ATA, TTG ATG)の変異を持つモレキュラークロー ン pTYI- 302を用いた。 PCR反応後の反応液 5 1 を 1%ァガロースゲルに電気泳動 し、 下方より UVを照射しながらバンドを検出することにより結果を判定した。 そ の結果、 野生型検出の場合は 0.0002 ng/30 i l以上の濃度の PNL432を鏡型として 用いた場合のみ検出でき、 pTYI- 302 を錶型とした場合は検出されなかった。 逆に 耐性変異型検出の場合は 0.0002 ng/30^ 1以上の濃度の pTYI-302を鐯型として用 いた場合のみ検出でき、 PNL432を鐯型として用いた場合は検出されなかった。 実施例 6 変異 HIVインテグラ一ゼを使用したアツセィ
本発明の耐性変異を持つィンテグラーゼを用いて以下に示す野生型の場合と同 じアツセィ法に基づき種々の化合物の阻害活性を調べた。
( 1 ) D N Α溶液の調製
アマシャムフアルマシア社により合成された以下の各 DNAを、 KTEバヅファ一液 (組成 ： 100 mM KC 1 , 1 mM EDTA, 10 mM Tris-塩酸 （pH 7. 6 ) ) に溶解させること により、 基質 DNA溶液 （2 pmol/〃l ) および夕一ゲヅ ト MA溶液（5 pmol/ 1 )を 調製した。 各溶液は、 一旦煮沸後、 ゆるやかに温度を下げて相補鎖同士をァニー リングさせてから用いた。
(基質 MA配列)
5'- B iot in-ACC CTT TTA GTC AGT GTG GAA AAT GTC TAG CAG T- 3' (配列番号 ：
3 6 )
3'- GAA AAT GAG TCA CAC CTT TTA GAG ATC GTC Α-5' (配列番号 ：
3 7 )
(夕一ゲヅ ト DNA配列）
5'- TGA CCA AGG GCT AAT TCA CT-Dig-3' (配列番号 ： 3 8 )
3'-Dig-ACT GGT TCC CGA TTA AGT GA -5， （配列番号 ： 3 9 )
( 2 ) 阻害率 （IC5G値） の測定 Streptavidin (Vector Laboratories社製） を 0.1 M炭酸バッファー液 （組成 ： 90 mM Na2C03, 10 mM NaHC03 ) に溶かし、 濃度を 40〃g/mlにした。 この溶液、 各 50〃1をィムノプレート （NUNC社製） のゥエルに加え、 4°Cで一夜静置、 吸着させ る。 次に各ゥエルを燐酸バッファー （組成 ： 13.7 mM NaCl, 0.27 mMKCl, 0.43 mM Na2HP04, 0.14 mM KH2P04) で 2回洗浄後、 1 % スキムミルクを含む燐酸バッファ ― 300^1 を加え、 30分間ブロッキングした。 さらに各ゥエルを燐酸バヅファー で 2回洗浄後、 基質 DNA溶液 （Zpmol/ l) 50〃 1 を加え、 振盪下、 室温で 30分 間吸着させた後、 燐酸バッファ一で 2回、 次いで蒸留水で 1回洗浄した。
次に上記方法で調製した各ゥエルに、 バッファ一 （組成： 150 mMM0PS (pH7.2), 75 mM MnCl2, 50 mM 2-mercaptoethanol, 25% glycerol, 500 ju g/ml bovine serum albumin -fraction V) 12〃 1、 ターゲヅ ト DNA (5 pmol/, ΐ) 1 il および蒸留水 32 lから調製した反応溶液 45 1を加えた。さらに各ゥエルに被検化合物の DMS0 溶液 6〃1 を加え、 ポジティブコントロール（PC)としてのゥエルには、 DMS06〃1 を加える。 次に耐性インテグラ一ゼ溶液 （30 pmol) 9〃1を加え、 良く混合した。 ネガティブコン トロール （NC) としてのゥエルには，希釈液 （組成： 20 mM M0PS (pH7.2), 400 mM potassium glutamete, 1 mM EDTA, 0.1% NP-40, 20¾ glycerol, 1 mM DTT, 4 M urea) 9〃1 を加えた。
各プレートを 30 °Cで 1時間インキュベート後、 反応液を捨て、 燐酸バッファ —で 2回洗浄した。 次にアル力リフォスファターゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗 体 （ヒヅジ Fabフラグメント ： ベーリンガー社製） を 100〃1加え、 30 °Cで 1時 間結合させた後、 0.05 % Tween20 を含む燐酸バッファ一で 2回、 燐酸バッファ —で 1回、 順次洗浄した。 次に、 アルカリフォスファタ一ゼ呈色バッファ一 （組 成： 10 mMパラ二トロフエニルホスフェート（Vector Laboratories社製）， 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 100 mM Tris-塩酸（pH 9.5)) を 150〃 1 加えて 30 °Cで 2時間反応 させ、 1 N NaOH溶液 50〃1 を加え反応を止めた後、 各ゥエルの吸光度 （0D405nm) を測定し、 以下の計算式に従い阻害率を求めた。
阻害率 （％) =100[1-{(G abs.- NC abs.) / (PC abs.- NC abs.)}] C abs . ；化合物のゥエルの吸光度
NC abs . ： NCの吸光度
PC abs . ： PCの吸光度
なお、 IC50値は、 上記の阻害率を用いて以下の計算式で求められる。 すなわち 阻害率 50 %をはさむ 2点の濃度において、 x g/mlの濃度で阻害率 X %、 μ. g/mlの濃度で阻害率 Y %をそれぞれ示す時、 IC50 ( U g/ml) = x-{(X-50)(x- y)/(X-Y)} となる。 実施例 7 HI V変異株を使用したアツセィ
( 1 ) HIV変異株持続感染ヒ ト T細胞株 Molt-4clone8を 10%牛胎児血清添加 R PMI— 1640培地で培養し、 上清を濾過してウィルスの力価を測定し、 —80°Cで保 存した。 他方、 被検化合物を上記の培養培地で所定の濃度になるように希釈し、 9 6穴マイクロプレートに 100〃1ずつ分注する。次に MT-4細胞浮遊液を 50〃1 (2. 5 X 104細胞)ずつを分注し、更に上記 HI V含有上清を上記の培養培地で希釈したも のを 50〃 1 (600pfu (plaque forming unit))ずつ加えた。
( 2 ) 炭酸ガス培養器内で 37°Cで 5日間培養した後、全てのゥヱルに MTT (3 一 (4, 5 -ジメチルチアゾールー 2—ィル）一 2, 5—ジフエ二ルテトラゾリゥムブロマ ィ ド） 5mg/ml， PBS)を 30〃1ずつ加え、 更に 1時間培養した。 このとき、 生存する 細胞は MTTを還元してフオルマザンを析出させる。全てのゥヱルから培養上清を 150〃1ずつ取り除き、 代わりに 150〃1の溶解液 （10%ト リ トン X— 100及び 0.4% (V/V) HC1添加イソプロパノール）を加え、 プレートミキサーで振とう してフオル マザンを溶出した。 フオルマザンを OD560nmで測定し、 結果を被対照と比較し た。 ウィルスによる細胞障害を 50%抑制する化合物濃度を EC50とした。
( 3 ) 上記 （ 1 ) において、 HIV含有上清（ウィルス液）の代わりに各ゥヱルに培 養培地 50〃1ずつ加え、 （ 2 ) と同様に処理し化合物の細胞毒性を調べた。 化合 物による細胞毒性が 50%である化合物濃度を CC5()とした。 産業上の利用可能性
本発明の HIVまたは HIVィンテグラ一ゼは、 薬剤耐性 HIVに対する阻害剤のァ ヅセィ法に使用することができ、 有用である。 また、 本発明の HIVインテグラー ゼをコードする核酸またはそれらを含む核酸配列に相補的なプロ一ブまたはプラ イマ一は、 薬剤耐性 HIV検出法に使用することができ、 有用である。

Claims

請求の範囲
1. 6 4番目および 1 1 6番目のアミノ酸がァスパラギン酸であり、 1 5 2番 目のアミノ酸がグル夕ミン酸であり、 かつ以下に示す群から任意に選択される少 なく とも 1つの変異を有する HIVインテグラーゼ；
(a) 6 3番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である ；
(b) 6 6番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸である ；
( c ) 7 0番目のアミノ酸がグリシンおよびグルタ ミン酸以外のアミノ酸であ る ；
( d ) 7 2番目のアミノ酸がバリン、 イソロイシンおよびグリシン以外のァミノ 酸である ；
( e ) 7 4番目がロイシン、 イソロイシン、 ノ リンおよびプロリン以外のァミノ 酸で る ；
( f ) 9 2番目のアミノ酸がグル夕ミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ酸 である ；
( g) 1 1 8番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である ；
(h) 1 2 1番目のァミノ酸がフエ二ルァラニン以外のアミノ酸である ；
( i ) 1 3 8番目のアミノ酸がグル夕ミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ 酸である ；
( j ) 1 4 0番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である ；
(k) 1 4 5番目のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸である ；
( 1 ) 1 4 6番目のァミノ酸がグル夕ミン以外のアミノ酸である ；
(m) 1 4 8番目のアミノ酸がグル夕ミン以外のアミノ酸である ；
( n ) 1 5 1番目のアミノ酸がバリンおよびイソロイシン以外のァミノ酸であ る ；
( ο ) 1 5 3番目のアミノ酸がセリンおよびァラニン以外のアミノ酸である ； (p) 1 5 5番目のアミノ酸がァスパラギン以外のアミノ酸である ； ( m h k n p b d f oq a e g j c 1 i ) 1 6 0番目のアミノ酸がリジン、 グルタミン、 トレオニンおよびグルタミ ン酸以外のアミノ酸である ；
( r ) 2 4 9番目のアミノ酸がバリンおよびロイシン以外のアミノ酸である ； お よび
( s ) 2 5 0番目のアミノ酸がバリン、 ロイシンおよびァラニン以外のアミノ酸 である ；
ただし、 配列表の配列番号 7〜 2 2のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する HIVィンテグラーゼは除く。
2 . 以下に示す群から任意に選択される少なくとも 1つの変異を有する請求の 範囲第 1項記載の HIVィンテグラ一ゼ ；
6 3番目のアミノ酸がバリンである ；
6 6番目のアミノ酸がイソロイシンまたはァラニンである ；
7 0番目のアミノ酸がアルギニンである ；
7 2番目のアミノ酸がァラニンである ；
7 4番目のアミノ酸がメチォニンである ；
9 2番目のアミノ酸がグルタミンである ；
1 1 8番目のアミノ酸がセリンである ；
1 2 1番目のアミノ酸がチロシンである ；
1 3 8番目のアミノ酸がリジンである ；
1 4 0番目のアミノ酸がセリンである ；
1 4 5番目のアミノ酸がセリンである ；
1 6番目のアミノ酸がアルギニンである ；
1 4 8番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンである ；
1 5 1番目のアミノ酸がロイシンである ；
1 5 3番目のアミノ酸がチロシンである ；
1 5 5番目のアミノ酸がセリン、 イソロイシン、 トレオニンまたはヒスチ ジンである ； ( q ) 1 6 0番目のアミノ酸がァスパラギンである ；
( r ) 2 4 9番目のァミノ酸がィソロイシンである ； および
( s ) 2 5 0番目のアミノ酸がイソロイシンである。
3 . 1 2番目および 1 6番目のアミノ酸がヒスチジンであり、
4 0番目および 4 3番目のアミノ酸がシスティンであり、 かつ 1 5 6番目および 1 5 9番目のァ ミノ酸がリジンである請求の範囲第 1項または第 2項記載の HIVィンテグラーゼ: 4 . 配列表の配列番号 1〜 4のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1以上 の請求の範囲第 1項または第 2項記載のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有す る請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の HIVィンテグラーゼ。
5 . 請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれかに記載のインテグラ一ゼにおいて、 6 4番目および 1 1 6番目のァスパラギン酸、 1 5 2番目のグルタミン酸、 およ び任意に選択された変異部位のアミノ酸以外の 1以上のアミノ酸が欠失、 置換も しくは付加された HIVィンテグラ一ゼ ；
ただし、 配列表の配列番号 7〜 2 2のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する HIVインテグラーゼは除く。
6 . 増殖可能な HIVを構成することができる請求の範囲第 1項〜第 5項のいず れかに記載の HIVィンテグラ一ゼ。
7 . 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに記載の HIVィンテグラ一ゼをコ一 ドするポリヌクレオチド。
8 . 配列表の配列番号 5または 6記載の核酸配列において、 1 8 7番目の Cが G s 1 9 6番目の Aが G、 1 9 7番目の〇が1\ 2 2 0番目の が八、 3 5 2番 目の Gが A、 4 3 3番目の Cが T、 4 3 7番目の Αが G、 4 4 2番目の Cが A、 4 5 1番目の Aが T、 4 5 8番目の Cが Α、 4 6 2番目の Gが Α、 4 6 4番目の Αが Gまたは C、 および/または 7 4 5番目の Gが Aに置換された核酸配列を有 する請求の範囲第 7項記載のポリヌクレオチド。
9 . 増殖可能な HIVを構成することができる請求の範囲第 7項または第 8項項 記載のポリヌクレオチド。
1 0 . 請求の範囲第 7項または第 8項記載のポリヌクレオチドを含有するべク 夕一またはプラスミ ド。
1 1 . 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに項記載の mvィンテグラーゼま たは請求の範囲第 7項または第 8項記載のポリヌクレオチドを含有する HIV。
1 2 . 請求の範囲第 1 1項記載の HIVが持続感染した細胞。
1 3 . 請求の範囲第 7項または第 8項記載のポリヌクレオチドと特異的にハイ プリダイズし得るプローブまたはプライマ一。
1 4 . 請求の範囲第 1 3項記載のプローブまたはプライマ一を使用した HIVの 検出法。
1 5 . 以下に示す群から任意に選択される少なく とも 1つのアミノ酸をコード する核酸配列の変異を検出することを特徴とする請求の範囲第 1 4項記載の HIV の検出法；
( a ) 6 3番目のロイシンをコードする核酸配列からロイシン以外のアミノ酸を コードする核酸配列への変異 ；
( b ) 6 6番目の トレォニンをコードする核酸配列から トレォニン以外のァミノ 酸をコードする核酸配列への変異；
( c ) 7 0番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からグリシ ンおよびグル夕ミン酸以外のアミソ酸をコ一ドする核酸配列への変異；
( d ) 7 2番目のバリン、 イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列か らバリン、 イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列へ の変異 ；
( e ) 7 4番目のロイシン、 イソロイシン、 ノ、リンまたはプロリンをコードする 核酸配列からロイシン、 イソロイシン、 ノ リンおよびプロリン以外のァミノ酸を コードする核酸配列への変異；
( f ) 9 2番目のグルタミン酸またはァスパラギン酸をコードする核酸配列から グル夕 ミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ酸をコ一ドする核酸配列への変 ( g ) 1 1 8番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸 をコ一ドする核酸配列への変異 ；
( h ) 1 2 1番目のフエ二ルァラニンをコードする核酸配列からフエ二ルァラ二 ン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異 ；
( i ) 1 3 8番目のグルタミン酸またはァスパラギン酸をコードする核酸配列か らグルタ ミン酸およびァスパラギン酸以外のアミノ酸以外のアミノ酸をコードす る核酸配列への変異；
( j ) 1 4 0番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸 をコードする核酸配列への変異；
( k ) 1 4 5番目のプロリンをコードする核酸配列からプロリン以外のアミノ酸 をコードする核酸配列への変異；
( 1 ) 1 4 6番目のグル夕ミンをコ一ドする核酸配列からグル夕ミン以外のアミ ノ酸をコードする核酸配列への変異；
( m ) 1 4 8番目のグルタミンをコードする核酸配列からグル夕ミン以外のァミ ノ酸をコードする核酸配列への変異 ；
( n ) 1 5 1番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からバリン およびィソロイシン以外のアミノ酸をコ一ドする核酸配列への変異；
( o ) 1 5 3番目のセリンまたはァラニンをコードする核酸配列からセリンおよ びァラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異 ；
( p ) 1 5 5番目のァスパラギンをコードする核酸配列からァスパラギン以外の アミノ酸をコードする核酸配列への変異；
( q ) 1 6 0番目のリジン、 グルタ ミン、 トレオニンまたはグルタミン酸をコ一 ドする核酸配列からリジン、 グルタミン、 トレオニンおよびグルタミン酸以外の アミノ酸をコードする核酸配列への変異；
( r ) 2 4 9番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からパリンおよ びロイシン以外のアミノ酸をコ一ドする核酸配列への変異； および
( s ) 2 5 0番目のバリ ン、 ロイシンまたはァラニンをコードする核酸配列から バリン、 ロイシンおよびァラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異。
1 6 . 以下に示す群から任意に選択される少なく とも 1つのアミノ酸をコード する核酸配列の変異を検出することを特徴とする請求の範囲第 1 4項または第 1 5項記載の HIVの検出法；
( a ) 6 3番目のロイシンをコードする核酸配列からバリンをコードする核酸配 列への変異 ；
( b ) 6 6番目のトレオニンをコードする核酸配列からイソロイシンまたはァラ ニンをコ一ドする核酸配列への変異；
( c ) 7 ◦番目のグリシンまたはグル夕ミン酸をコ一ドする核酸配列からアルギ ニンをコードする核酸配列への変異；
( d ) 7 2番目のパリン、 イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列か らァラニンをコードする核酸配列への変異 ；
( e ) 7 4番目のロイシン、 イソロイシン、 ノ リンまたはプロリンをコードする 核酸配列からメチォニンをコードする核酸配列への変異；
( f ) 9 2番目のグルタミン酸またはァスパラギン酸をコードする核酸配列から グルタ ミンをコ一ドする核酸配列への変異 ；
( g ) 1 1 8番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸 配列への変異；
( h ) 1 2 1番目のフエ二ルァラニンをコードする核酸配列からチロシンをコー ドする核酸配列への変異；
( i ) 1 3 8番目のグル夕ミン酸またはァスパラギン酸をコ一ドする核酸配列か らリジンをコードする核酸配列への変異 ；
( j ) 1 4 0番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸 配列への変異 ；
( k ) 1 4 5番目のプロリンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸 配列への変異；
( 1 ) 1 4 6番目のグル夕ミンをコ一ドする核酸配列からアルギニンをコードす る核酸配列への変異 ；
( m ) 1 4 8番目のグルタミンをコ一ドする核酸配列からリジンまたはアルギニ ンをコ一ドする核酸配列への変異 ；
( n ) 1 5 1番目のバリンまたはィソロイシンをコ一ドする核酸配列からロイシ ンをコードする核酸配列への変異；
( ο ) 1 5 3番目のセリンまたはァラニンをコードする核酸配列からチロシンを コードする核酸配列への変異；
( P ) 1 5 5番目のァスパラギンをコードする核酸配列からセリン、 イソ口イシ ン、 トレオニンまたはヒスチジンをコ一ドする核酸配列への変異 ；
( q ) 1 6 0番目のリジン、 グルタミン、 トレオニンまたはグルタミン酸をコー ドする核酸配列からァスパラギンをコ一ドする核酸配列への変異 ；
( r ) 2 4 9番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からイソ口イシ ンをコ一ドする核酸配列への変異； および
( s ) 2 5 0番目のバリン、 ロイシンまたはァラニンをコードする核酸配列から イソロイシンをコードする核酸配列への変異。
1 7 . 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに記載の HIVィンテグラーゼを使 用した抗 HIVィンテグラ一ゼ阻害剤のスクリーニング法。
1 8 . 請求の範囲第 1 1項記載の HIVを使用した抗 HIVィンテグラーゼ阻害 剤のスクリーニング法。
1 9 . 請求の範囲第 1 2項記載の HIV が持続感染した細胞を使用した抗 HIV ィンテグラ一ゼ阻害剤のスクリ一ニング法。
2 0 . 分子量が 1 5〜 1 0 0 0であり、 水素、 リチウム、 ホウ素、 炭素、 窒素、 酸素、 フッ素、 ナト リウム、 マグネシウム、 アルミニウム、 硫黄、 塩素、 力リウ ム、 カルシウム、 鉄、 バリウム、 臭素および沃素からなる群から選択された任意 の原子により構成され、 一 C ( = 0 ) ―、 — C (二 S ) —または— N H—で示さ れる基を持ち、 窒素、 酸素および硫黄の中から任意に選択される原子を 1〜 3個 有するヘテロ環を有する、 請求の範囲第 1 7項〜第 1 9項のいずれかに記載のス クリーニング法により得られた化合物を有効成分として含有する HIVィンテグラ ーゼ阻害剤。
1 . 請求の範囲第 2 0項記載の HIVィンテグラーゼ阻害剤を有効成分として 含有する抗 HIV剤。
2 2 . 請求の範囲第 2 0項記載の HIVインテグラーゼ阻害剤を有効成分として 含有するエイズ治療剤。
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