JPWO2002038771A1 - 薬剤耐性ｈｉｖインテグラーゼ - Google Patents
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Abstract
以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有するＨＩＶインテグラーゼを見出した；（ａ）６３番目のアミノ酸がバリン；（ｂ）６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニン；（ｃ）７０番目のアミノ酸がアルギニン；（ｄ）７２番目のアミノ酸がアラニン；（ｅ）７４番目のアミノ酸がメチオニン；（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミン等。
Description
技術分野
本発明は、ＨＩＶインテグラーゼ，詳しくは、耐性変異を有するＨＩＶインテグラーゼ、該ＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド、それらを含有するＨＩＶ、それらを検出する検出法、およびそれらを使用するアッセイ法に関する。
背景技術
ヒト免疫不全ウイルス（以下、ＨＩＶという。）は、薬剤に対し、比較的容易に薬剤耐性を獲得することが知られている。薬剤耐性ウイルスが出現すると、その薬剤の有効性は低下し、もはやその薬剤ではＨＩＶ感染症を有効に治療することができない。従って、ＨＩＶ感染症の治療においては、薬剤耐性ウイルスの出現後は、投与薬剤を変更する等の処置をすることが望ましい。また、次世代の薬剤として、上記薬剤耐性ウイルスにも有効な薬剤を探索する必要がある。
現在までに、各種の逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤が研究、開発され、その結果、多数の逆転写酵素阻害剤耐性ＨＩＶ、プロテアーゼ阻害剤耐性ＨＩＶが報告されている。
しかし、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤耐性ＨＩＶについては、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤自身が少ないため、その報告は少ない。
ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤耐性ＨＩＶインテグラーゼとしては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｖｏｌ．２８７，ｐ６４６−６５０に、野性株（ＨＸＢ２株：配列表の配列番号４記載のＨＩＶインテグラーゼを含有するＨＩＶ、アクセション番号：ＡＦ０３３８１９）の６６番目のアミノ酸がトレオニンからイソロイシンに、１５３番目のアミノ酸がセリンからチロシンに、および／または１５４番目のアミノ酸がメチオニンからイソロイシンに変異したＨＩＶインテグラーゼ阻害剤耐性ＨＩＶインテグラーゼが開示されている。具体的には、配列表の配列番号８〜１２のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼである。
また、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤存在下で耐性を獲得したＨＩＶのインテグラーゼではないが、６６番目のアミノ酸がアラニンであり、７４番目のアミノ酸がメチオニンであるＨＩＶインテグラーゼが知られている。具体的には、配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＪ２３９０８３）を有するＨＩＶインテグラーゼである。
なお、ＨＩＶインテグラーゼに関し、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に、以下のＨＩＶインテグラーゼが登録されている。
６３番目のアミノ酸がイソロイシンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１３および１４記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＪ２５１０５６、ＡＪ２７６５９５）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。６３番目のアミノ酸がイソロイシンであり、７４番目のアミノ酸がイソロイシンであり、１５３番目のセリンがアラニンであり、１６０番目のリジンがセリンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列番号１５記載のアミノ酸配列（アクセション番号：Ｌ２０５８７）が登録されている。６３番目のアミノ酸がメチオニンであり、７４番目のアミノ酸がイソロイシンであり、１５３番目のセリンがアラニンであり、１６０番目のリジンがセリンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列（アクセション番号：Ｌ２０５７１）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。６６番目のアミノ酸がプロリンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号２０または２１記載のアミノ酸配列（順にアクセション番号：Ｕ６９５８８、Ｕ６９５８４）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。１４５番目のアミノ酸がロイシンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１９記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＦ０４０３１９）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。１５３番目のアミノ酸がプロリンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１７記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＦ０４０３２７）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。１５５番目のアミノ酸がアスパラギン酸であるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１８記載のアミノ酸配列（アクセション番号：Ｕ７１１８２）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。１３８番目のアミノ酸がリジンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号２２記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＦ０８６８１７）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。
なお、本明細書中のアクセション番号は、各タンパクをコードする核酸のＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のアクセション番号を表わす。
また、ＨＩＶインテグラーゼの全長ではなく一部の配列に過ぎないが、９２番目のアミノ酸がバリンで置換された配列、１１８番目のアミノ酸がアルギニンで置換された配列、１２１番目のアミノ酸がロイシンで置換された配列、１３８番目のアミノ酸がセリン、バリンまたはトレオニンで置換された配列、１４６番目のアミノ酸がヒスチジンで置換された配列、１４８番目のアミノ酸がロイシンで置換された配列、１６０番目のアミノ酸がアスパラギンで置換された配列が登録されている。
ＨＩＶインテグラーゼについては、その野性株のアミノ酸配列が知られている。なお、ＨＩＶは薬剤非存在下でも変異するため、多数の野性株が存在し、そのアミノ酸配列はそれぞれ異なる。
以下に本発明で見出した変異部位について、ＧｅｎＢａｎｋで調べた結果、野性株であると思われるアミノ酸を記載する。６３番目のアミノ酸はロイシンであり、６６番目のアミノ酸はトレオニンであり、７０番目のアミノ酸はグリシンまたはグルタミン酸であり、７２番目のアミノ酸はバリン、イソロイシンまたはグリシンであり、７４番目のアミノ酸はロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンであり、９２番目のアミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、１１８番目のアミノ酸はグリシンであり、１２１番目のアミノ酸はフェニルアラニンであり、１３８番目のアミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、１４０番目のアミノ酸はグリシンであり、１４５番目のアミノ酸はプロリンであり、１４６番目のアミノ酸はグルタミンであり、１４８番目のアミノ酸はグルタミンであり、１５１番目のアミノ酸はバリンまたはイソロイシンであり、１５３番目のアミノ酸はセリンまたはアラニンであり、１５５番目のアミノ酸はアスパラギンであり、１６０番目のアミノ酸はリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸であり、２４９番目のアミノ酸はバリンまたはロイシンであり、２５０番目のアミノ酸はバリン、ロイシンまたはアラニンである。
発明の開示
ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対し耐性を獲得したＨＩＶを見い出し、それらの検出法およびそれらを使用するアッセイ法を提供する。
本発明者は、上記課題を解決するため、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対し耐性を獲得したＨＩＶの核酸配列を決定し、以下の発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１） ６４番目および１１６番目のアミノ酸がアスパラギン酸であり、１５２番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有するＨＩＶインテグラーゼ；
（ａ）６３番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸である；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸である；
（ｅ）７４番目がロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸である；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｇ）１１８番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｊ）１３８番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸である；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸である；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がセリンおよびアラニン以外のアミノ酸である；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸である；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がバリンおよびロイシン以外のアミノ酸である；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸である；
ただし、配列表の配列番号７〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＨＩＶインテグラーゼは除く。
（２） 以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有する上記（１）記載のＨＩＶインテグラーゼ；
（ａ）６３番目のアミノ酸がバリンである；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンである；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がアラニンである；
（ｅ）７４番目のアミノ酸がメチオニンである；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミンである；
（ｇ）１１８番目のアミノ酸がセリンである；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｉ）１３８番目のアミノ酸がリジンである；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がセリンである；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がセリンである；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンである；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がロイシンである；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンである；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がアスパラギンである；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がイソロイシンである；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がイソロイシンである、
（３） １２番目および１６番目のアミノ酸がヒスチジンであり、４０番目および４３番目のアミノ酸がシステインであり、かつ１５６番目および１５９番目のアミノ酸がリジンである上記（１）または（２）記載のＨＩＶインテグラーゼ、
（４） 配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１以上の上記（１）または（２）記載のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼ、
（５） 上記（１）〜（４）のいずれかに記載のインテグラーゼにおいて、６４番目および１１６番目のアスパラギン酸、１５２番目のグルタミン酸、および任意に選択された変異部位のアミノ酸以外の１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたＨＩＶインテグラーゼ；
ただし、配列表の配列番号７〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＨＩＶインテグラーゼは除く、
（６） 増殖可能なＨＩＶを構成することができる（１）〜（５）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼ、
（７） 上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド、
（８） 配列表の配列番号５または６記載の核酸配列において、１８７番目のＣがＧ、１９６番目のＡがＧ、１９７番目のＣがＴ、２２０番目のＴがＡ、３５２番目のＧがＡ、４３３番目のＣがＴ、４３７番目のＡがＧ、４４２番目のＣがＡ、４５１番目のＡがＴ、４５８番目のＣがＡ、４６２番目のＧがＡ、４６４番目のＡがＧまたはＣ、および／または７４５番目のＧがＡに置換された核酸配列を有する上記（７）記載のポリヌクレオチド、
（９） 増殖可能なＨＩＶを構成することができる上記（７）または（８）記載のポリヌクレオチド、
（１０） 上記（７）または（８）記載のポリヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミド、
（１１） 上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼまたは上記（７）または（８）記載のポリヌクレオチドを含有するＨＩＶ、
（１２） 上記（１１）記載のＨＩＶが持続感染した細胞、
（１３） 上記（７）または（８）記載のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得るプローブまたはプライマー、
（１４） 上記（１３）記載のプローブまたはプライマーを使用したＨＩＶの検出法、
（１５） 以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とする上記（１４）記載のＨＩＶの検出法；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からトレオニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からフェニルアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からセリンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からアスパラギン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異、
（１６） 以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とする上記（１４）または（１５）記載のＨＩＶの検出法；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からバリンをコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からイソロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からメチオニンをコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミンをコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からリジンをコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からリジンまたはアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からロイシンをコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンをコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアスパラギンをコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異、
（１７） 上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼを使用した抗ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法、
（１８） 上記（１１）記載のＨＩＶを使用した抗ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法、
（１９） 上記（１２）記載のＨＩＶが持続感染した細胞を使用した抗ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法、
（２０） 分子量が１５〜１０００であり、水素、リチウム、ホウ素、炭素、窒素、酸素、フッ素、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、硫黄、塩素、カリウム、カルシウム、鉄、バリウム、臭素および沃素からなる群から選択された任意の原子により構成され、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−または−ＮＨ−で示される基を持ち、窒素、酸素および硫黄の中から任意に選択される原子を１〜３個有するヘテロ環を有する、上記（１７）〜（１９）のいずれかに記載のスクリーニング法により得られた化合物を有効成分として含有するＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、
（２１） 上記（２０）記載のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗ＨＩＶ剤、
（２２） 上記（２０）記載のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤を有効成分として含有するエイズ治療剤、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤の存在下でＨＩＶの野性株を細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に感染させ、継代培養し、数日後、ＨＩＶ感染細胞をホモジネートし、ＰＣＲ法を用いてＨＩＶ ｐｒｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡの塩基配列をシークエンスすることにより、そのＨＩＶインテグラーゼをコードする核酸配列を調べた。
ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤としては、ＷＯ００／３９０８６またはＳｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｖｏｌ．２８７，ｐ６４６−６５０に記載の化合物を使用することができる。例えば、４−（１−ベンゼンスルホニル−５−クロロインドール−３−イル）−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（以下、化合物Ａとする。）、１−［５−（４−フルオロベンジル）フラン−２−イル］−３−ヒドロキシ−３−（５−クロロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）プロペノン（以下、化合物Ｂとする）、１−［５−（４−フルオロベンジル）フラン−２−イル］−３−ヒドロキシ−３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）プロペノン（以下、化合物Ｃとする）、４−［１−（４−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（以下、化合物Ｄとする）、１−［５−（４−フルオロフェニルチオ）フラン−２−イル］−３−ヒドロキシ−３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）プロペノン（以下、化合物Ｅとする）、４−［３，５−（ビスベンジルオキシ）フェニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（以下、化合物Ｆとする）などを使用することができる。
次に、得られたシークエンスに基づき、各変異部位についてのモレキュラークローンを作製し、該変異がＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対する耐性獲得のために必要な変異部位であるか否かを調べた。
すなわち、ＨＩＶのモレキュラークローン（ＮＬ４３）のインテグラーゼ部分の配列のみを、上記シークエンスに基づき作製されたＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）で置換し、プラスミドｐＮＬ４３を作製し、細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に取り込ませ、目的の変異を持つＨＩＶインテグラーゼを有するＨＩＶのウイルスクローンを作製した。
このようにして得られたＨＩＶのウイルスクローンが、使用されたＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対して耐性を獲得しているか否かを、野性株に対する阻害活性と比較することにより調べた。
その結果、化合物Ａに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・６６番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・７４番目のアミノ酸がメチオニンとなる変異
・１４５番目のアミノ酸がセリンとなる変異
・２４９番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・２５０番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
化合物Ｂに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・７０番目のアミノ酸がアルギニンとなる変異
・１１８番目のアミノ酸がセリンとなる変異
・１３８番目のアミノ酸がリジンとなる変異
・１４６番目のアミノ酸がアルギニンとなる変異
・１４８番目のアミノ酸がリジンとなる変異
・１５１番目のアミノ酸がロイシンとなる変異
・１５５番目のアミノ酸がセリンまたはイソロイシンとなる変異
・１６７番目のアミノ酸がアスパラギン酸となる変異
化合物Ｃに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・６３番目のアミノ酸がバリンとなる変異
・６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンとなる変異
・７４番目のアミノ酸がメチオニンとなる変異
・９２番目のアミノ酸がグルタミンとなる変異
・１２４番目のアミノ酸がアスパラギンとなる変異
・１３８番目のアミノ酸がリジンとなる変異
・１４０番目のアミノ酸がセリンとなる変異
・１４６番目のアミノ酸がアルギニンとなる変異
・１４８番目のアミノ酸がリジンとなる変異
・１５１番目のアミノ酸がロイシンとなる変異
・１５３番目のアミノ酸がアラニンとなる変異
・１５５番目のアミノ酸がセリン、トレオニンまたはヒスチジンとなる変異
・１６０番目のアミノ酸がアスパラギンとなる変異
化合物Ｄに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・７２番目のアミノ酸がアラニンとなる変異
・７４番目のアミノ酸がメチオニンとなる変異
・１４８番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンとなる変異
・１５１番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・１５５番目のアミノ酸がセリンとなる変異
化合物Ｅに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンとなる変異
・１４８番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンとなる変異
・１５３番目のアミノ酸がチロシンとなる変異
化合物Ｆに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・６６番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・７４番目のアミノ酸がメチオニンとなる変異
・１２１番目のアミノ酸がチロシンとなる変異
・１５１番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・１５３番目のアミノ酸がチロシンとなる変異
・１５４番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
すなわち、化合物存在下でＨＩＶインテグラーゼの変異が容易に起こる部位（以下、変異部位という。）を見い出し、特にその変異部位において置換されるアミノ酸を特定し、それらの事実に基づき、本発明を完成した。
本発明であるＨＩＶインテグラーゼは、ＨＩＶ野性株に比較して、上記耐性変異部位から任意に選択される変異部位が任意のアミノ酸で１以上置換された、活性中心のアミノ酸が保存されたＨＩＶインテグラーゼを意味する。一般的にはＨＩＶインテグラーゼは２８８個のアミノ酸からなるポリペプチドであるが、本発明のＨＩＶインテグラーゼは、２８８個のアミノ酸からなるポリペプチドに限定されるものではない。数個〜数十個のアミノ酸が欠失、付加していてもよい。例えば、配列表の配列番号１５及び１６記載のＨＩＶインテグラーゼのように、Ｃ末端に１０アミノ酸伸びた２９８個のアミノ酸からなるＨＩＶインテグラーゼ等も存在する。
なお、活性中心のアミノ酸は、６４番目および１１６番目のアミノ酸がアスパラギン酸であり、１５２番目のアミノ酸がグルタミン酸である。本発明のＨＩＶインテグラーゼは活性中心のアミノ酸が保存されており、ＨＩＶインテグラーゼ活性を有する。さらには、１５６番目および１５９番目のアミノ酸が保存されているＨＩＶインテグラーゼが好ましい。なお、１５６番目および１５９番目のアミノ酸はリジンである。また、Ｚｎフィンガーモチーフ（１２番目および１６番目のアミノ酸がヒスチジンであり、４０番目および４３番目のアミノ酸がシステインである）も保存されていることが好ましい。
本発明は、化合物（例えば、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤）存在下でＨＩＶインテグラーゼの変異が容易に起こる部位を見出したものであり、特に変異部位のアミノ酸の種類を限定するものではない。すなわち、変異部位のアミノ酸は、野性株として知られているアミノ酸以外の任意のアミノ酸であればよい。具体的には、本発明のＨＩＶインテグラーゼは、以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有するＨＩＶインテグラーゼを意味する。
（ａ）６３番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸である；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸である；
（ｅ）７４番目がロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸である；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｇ）１１８番目がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である；
（ｉ）１３８番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸である；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸である；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がセリンおよびアラニン以外のアミノ酸である；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸である；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がバリンおよびロイシン以外のアミノ酸である；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸である。
特に、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対する耐性獲得という点からは、６６番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸であるＨＩＶインテグラーゼが重要である。
また、本発明は、上記の変異部位において置換されるアミノ酸も見い出したものである。具体的には、以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有するＨＩＶインテグラーゼが挙げられる。
（ａ）６３番目のアミノ酸がバリンである；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンである；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がアラニンである；
（ｅ）７４番目のアミノ酸がメチオニンである；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミンである；
（ｇ）１１８番目のアミノ酸がセリンである；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｉ）１３８番目のアミノ酸がリジンである；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がセリンである；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がセリンである；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンである；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がロイシンである；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンである；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がアスパラギンである；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がイソロイシンである；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がイソロイシンである。
特に、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対する耐性獲得という点からは、６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンであるＨＩＶインテグラーゼが重要である。
なお、本発明のＨＩＶインテグラーゼは活性中心のアミノ酸が保存されているので、活性中心及び上記変異部位以外のアミノ酸は、ＨＩＶインテグラーゼの機能を損わない限り、すなわちＨＩＶインテグラーゼ活性を有する限り、任意のアミノ酸であってよい。例えば、データベース等で検索して選択したアミノ酸でもいいし、野性株、臨床分離株のアミノ酸でもよい。なお、「ＨＩＶインテグラーゼ活性を有する」とは、酵素系の実験でＨＩＶインテグラーゼ活性を有する場合のみならず、ＨＩＶとした場合に増殖可能なＨＩＶを構成することができるものであればよい。
具体的には、ＨＩＶ野性株のＨＩＶインテグラーゼとして知られている配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列（配列番号１：ＨＩＶ−１ ｐＮＬ４３ ｓｕｂｃｌｏｎｅ４−２０ Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、アクセション番号：Ｕ２６９４２；配列番号２：ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ；配列番号３：ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ（ｓｈｉｏｎｏｇｉ ｃｌｏｎｅ）Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ；配列番号４：ＩＩＩＢ／ＬＡＩ ｃｌｏｎｅ ＨＸＢ２ Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、アクセション番号：ＡＦ０３３８１９）において１以上のアミノ酸が、任意に選択された上述のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
本発明のＨＩＶインテグラーゼの６４番目および１１６番目のアスパラギン酸、１５２番目のグルタミン酸、および上記選択された変異部位のアミノ酸以外の１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたＨＩＶインテグラーゼも本発明の範囲内である。
１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたＨＩＶインテグラーゼとは、例えば、基準となるＨＩＶインテグラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＨＩＶインテグラーゼを意味する。
例えば、配列表のアミノ酸からなる群より選択される対照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチドの配列が対照アミノ酸配列のアミノ酸１００個ごとに２０個までのアミノ酸の変化を含みうることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列と対照配列が同一である場合を意味する。言い換えると、対照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、対照配列中のアミノ酸の２０％までが欠失または他のアミノ酸と置換していてもよく、あるいは対照配列中の全アミノ酸数のうち２０％までのアミノ酸が対照配列に挿入されたものであってもよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に存在してもよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存在してもよく、対照配列中に散在していてもよく、あるいは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなしていてもよい。
また、本発明のＨＩＶインテグラーゼは、増殖可能なＨＩＶを構成することができるＨＩＶインテグラーゼが好ましい。増殖可能なＨＩＶを構成することができるＨＩＶインテグラーゼか否かは、本発明のＨＩＶインテグラーゼを含有するＨＩＶを作製し、細胞に感染させ、細胞での増殖能を調べればよい。
なお、本発明のＨＩＶインテグラーゼは、遺伝子組み換え技術により生産されたＨＩＶインテグラーゼ、天然に存在するＨＩＶインテグラーゼ、または有機合成されたＨＩＶインテグラーゼのすべてを包含する。好ましくは、遺伝子組み換え技術により生産されたＨＩＶインテグラーゼである。
なお、本明細書中、アミノ酸とは、天然型アミノ酸を意味し、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられる。
本発明であるＨＩＶインテグラーゼは、それらをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ断片）を制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、市販のベクターまたはプラスミド等に導入し、宿主細胞（例えば大腸菌等）を用いて大量にタンパク質を発現させ、発現生成物を回収し単離生成することにより作製することができる。なお、細胞の培養は、プロモーター活性化、形質転換体選択または遺伝子増幅に適するように修飾された慣用的な培地中で行なうことができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、使用された宿主細胞に依存するが、当業者であれば容易に設定することができる。
上記発現系がＨＩＶインテグラーゼを増殖培地中に分泌する場合、該ＨＩＶインテグラーゼを培地から直接精製することができる。また、ＨＩＶインテグラーゼが分泌されない場合、該ＨＩＶインテグラーゼを細胞溶解物から単離するか、あるいは細胞膜フラクションから回収することができる。
回収、単離および精製法としては、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー等が挙げられる。最後に高品質液体高速クロマトグラフィーを使用してもよい。
また、別法として、本発明のポリペプチドをペプチド合成装置により合成的に得ることもできる。
制限酵素としては、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩなど使用することができる。ＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどを使用することができる。
ベクターまたはプラスミドとしては、下記に記載のベクターを使用することができる。例えば、ノヴァジェン社のｐＥＴ１５ｂベクターなどを使用することができる。
発現用ベクターとしてはｐＥＴ１５ｂ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３））、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バクテリオファージλ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細胞）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性細胞）、ｐＬＡＦＲＩ（グラム陰性細胞）、ｐＭＥ２９０（非Ｅ．ｃｏｌｉグラム陰性細胞）、ｐＨＶ１４（Ｅ．ｃｏｌｉおよびバチルス・ズブチリス）、ｐＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプトミセス）、ｐＵＣ６（ストレプトミセス）、Ｙｉｐ５（サッカロミセス）、バキュロウイルス昆虫細胞系、Ｙｃｐ１９（サッカロミスス）などが挙げられる。特に、ベクターとしてはｐＥＴ１５ｂ、宿主細胞としてはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の組合わせが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを意味する。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のＨＩＶインテグラーゼまたはその欠失体、置換体、付加体のアミノ酸配列により特徴づけられるＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを意味する。
また、本発明のポリヌクレオチドは、ＨＩＶのＲＮＡゲノム中に含まれる一部であってもよく、ＨＩＶ持続感染細胞のＤＮＡゲノムの中の一部であってもよい。
なお、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態、または例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖のいずれであってもよく、一本鎖の場合、コーディング鎖または非コーディング鎖（アンチセンス鎖）であってよい。
本発明のＨＩＶインテグラーゼをコードするコーディング配列は、ＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチドであれば、特に特定の核酸配列に限定されるものではない。すなわち、同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列であれば、すべての核酸配列が含まれる。
例えば、配列表の配列番号５または６記載の核酸配列において、１８７番目のＣがＧ、１９６番目のＡがＧ、１９７番目のＣがＴ、２２０番目のＴがＡ、３５２番目のＧがＡ、４３３番目のＣがＴ、４３７番目のＡがＧ、４４２番目のＣがＡ、４５１番目のＡがＴ、４５８番目のＣがＡ、４６２番目のＧがＡ、４６４番目のＡがＧまたはＣ、および／または７４５番目のＧがＡに置換された核酸配列を有するポリヌクレオチドが例示される。なお、配列表の配列番号５記載の核酸配列は野性株（ＮＬ４３）のインテグラーゼ部位をコードする核酸配列であり、配列番号６記載の核酸配列は野性株のアミノ酸配列を変化させずに制限酵素部位（ＸｂａＩとＣｌａＩ）を導入した核酸配列である。
なお、上記は具体例であり、遺伝暗号の縮重の結果、異なる核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
なお、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書開示のＤＮＡ配列により特徴づけられるコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変種であるコーディング配列を有していてもよい。当該分野において知られているように、対立遺伝子変種は、１個またはそれ以上のヌクレオチドが置換、欠失または付加されていてもよいポリヌクレオチド配列の別形態であり、コードされているポリペプチドの機能を実質的に変化させないものである。
また、本発明のＨＩＶインテグラーゼを細胞に発現させる場合、以下の配列を含んでいてもよい。すなわち、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコーディング配列のみを含むものであってもよく、あるいは成熟ポリペプチドのコーディング配列ならびにリーダー配列または分泌配列またはプロ蛋白配列のごときさらなるコーディング配列を含むものであってもよい。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコーディング配列および／または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
それゆえ、本発明は、成熟ポリペプチドのコーディング配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を促進するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列）にフレーム中で融合していてもよいポリヌクレオチドを包含する。
リーダー配列を有するポリペプチドはプレ蛋白であり、宿主細胞により開裂されてポリペプチドのプロ蛋白を生じる。ポリヌクレオチドはプロ蛋白をコードしていてもよく、プロ蛋白は成熟蛋白とさらなるＮ末アミノ酸残基とからなる。プロ配列を有する成熟蛋白が開裂されると活性成熟蛋白が残る。
よって、例えば、本発明ポリヌクレオチドは成熟蛋白をコードしていてもよく、あるいはプロ配列を有する蛋白またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有する蛋白をコードしていてもよい。
本発明ポリヌクレオチドは、遺伝子の５’または３’末端のいずれかにおいて、本発明ポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にフレーム中で融合したコーディング配列を有していてもよい。マーカー配列は、ｐＥＴシリーズのベクター（ノヴァジェン社により市販）により提供されるヘキサ−ヒスチジンタグであってもよく、該タグは細菌宿主の場合にマーカーに融合したポリペプチドの精製を可能にする。
本発明のポリヌクレオチドは、ＨＩＶのＲＮＡゲノムを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ法またはｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法等を用いて大量に複製することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、増殖可能なＨＩＶを構成することができるポリヌクレオチドが好ましい。増殖可能なＨＩＶを構成することができるポリヌクレオチドか否かは、本発明のポリヌクレオチドを含有するプラスミドを作製し、細胞に導入してウイルスを産生させ、そのウイルスを細胞に感染させてその増殖能を調べればよい。
本発明のベクターまたはプラスミドは、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを意味し、本発明のポリヌクレオチドを制限酵素、ＤＮＡリガーゼを用いて、市販のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージなど）に導入することにより作製することができる。
制限酵素としては、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩなどを使用することができる。ＤＮＡリガ、ーゼとしては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどを使用することができる。
ベクターとしては、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド、及びファージＤＮＡの組合わせに由来するベクターを意味するが、宿主細胞中で複製可能ある限り、上記以外のベクターを使用してもよい。ベクターとしては、例えば、細菌ベクターとして、ｐＥＴ１５ｂベクター、ｐＥＴ３ベクター、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅ ｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｄｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられ、真核細胞ベクターとして、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬが挙げられる。特に、ノヴァジェン社のｐＥＴ１５ｂベクターが好ましい。
ポリヌクレオチドのベクターへの挿入は、様々の方法が知られているが、例えば、ポリヌクレオチドをベクターの適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター中のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ合成を指令する適当なプロモーターに作動可能に連結される。プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃまたはｔｒｐ、ラムダファージのＰｔプロモーター、原核細胞、真核細胞、またはそれらのウイルスにおいて遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。
さらにベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、転写ターミネーター、発現増幅のための適当な核酸配列を含んでいてもよい。
ベクターは、形質転換宿主細胞の選択のための表現型を付与する１またはそれ以上の選択可能マーカーを含んでいてもよい。マーカーとしては、例えば、真核培養細胞においてはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子を使用することができ、大腸菌においてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子を使用することができる。
本発明のＨＩＶは、本発明のＨＩＶインテグラーゼまたは本発明のポリヌクレオチドを含有するＨＩＶを意味する。
本発明のＨＩＶは、以下のように作製できる、すなわち、モレキュラークローンｐＮＬ４３のインテグラーゼ部分の配列のみを上記シークエンスに基づき作製されたＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）で置換したプラスミドを作製し、細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に取り込ませ、目的の変異を持つＨＩＶインテグラーゼを有するＨＩＶのウイルスクローンを作製すればよい。
本発明のＨＩＶが持続感染した細胞は、本発明のＨＩＶが持続感染した細胞を意味する。
本発明のＨＩＶが持続感染した細胞は、本発明のベクターまたはプラスミドを、ＨＩＶ形成に必要な他の酵素等をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドＤＮＡと共に、細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に取り込ませることにより作製することができる。また、細胞に本発明のＨＩＶを感染させることによっても作製することができる。細胞としては、ヒトＴ細胞等を用いることができる。
本発明のプローブまたはプライマーは、本発明のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーを意味する。
本発明のポリヌクレオチドを検出または複製するために使用されるプローブまたはプライマーであり、本発明のポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブまたはプライマーであれば、特に限定するものではない。すなわち、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドの核酸配列にハイブリダイズするプローブまたはプライマーであればよい。また、変異部位の検出に使用する場合は、変異部位を含む７〜２０アミノ酸をコードするポリヌクレオチドに相補的なプローブまたはプライマーが好ましい。
ストリンジェントな条件でハイブリダズするプローブまたはプライマーとは、配列間の同一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％である場合にハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。例えば、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトワウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものなどが挙げられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）、とりわけその第１１章に実例が示されている。
本発明のポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブまたはプライマーとは、野性株に結合せず、変異株（耐性変異株）に結合するプローブまたはプライマーを意味する。
また、本発明のプローブまたはプライマーを使用して、本発明のＨＩＶを検出することができる。特に、野性株と変異株を区別して検出する方法が好ましく、例えば、以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とするＨＩＶの検出法が好ましい；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からトレオニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からフェニルアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からセリンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からアスパラギン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異。
さらに詳しくは、以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とするＨＩＶの検出法が好ましい；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からバリンをコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からイソロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からメチオニンをコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミンをコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からリジンをコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からリジンまたはアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からロイシンをコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンをコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアスパラギンをコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異。
本発明の検出法は、上記化合物Ａ〜Ｆを含有するＨＩＶインテグラーゼ阻害剤の投薬患者から得られたＨＩＶの検出のみならず、他のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤の投薬患者、あるいは全く未投与の患者から得られたＨＩＶの検出法としても使用できる。
具体的には、耐性変異の配列を内部に持ったＤＮＡやＲＮＡ、または耐性変異部位は含まず、その直前または直後の配列を持つＤＮＡやＲＮＡをプローブや鋳型に用いたハイブリダイゼーション法やオリゴヌクレオチドライゲイション法とそれらの応用法、耐性変異の配列を持ったＤＮＡやＲＮＡをプライマーに用いたＲＴ−ＰＣＲ法またはＰＣＲ法、耐性変異部位の５’側直前の配列を持つＤＮＡやＲＮＡをプライマーにした伸長反応を応用した方法などにより検出することができる（▲１▼中村祐輔．（２０００）ＳＮＰ：その重要性と解析法．実験医学．ｖｏｌ．１８，ｐ１５８７−１５９４．▲２▼西村俊秀、須田三記也．（２０００）ＳＮＰタイピング技術の現状と将来．実験医学．ｖｏｌ．１８，ｐ１８９４−１９００．）。
また、上記とは別の薬剤耐性ＨＩＶ検出法としては、以下の検出法が挙げられる。まず、ＨＩＶ感染者からＨＩＶまたは持続感染細胞を得、次にインテグラーゼ阻害剤（化合物Ａ〜Ｆ）に対する感受性をインビトロで測定し、そのインテグラーゼ阻害剤によってどの程度増殖が阻止されているかを薬剤非存在下と比較し、そのインテグラーゼ阻害剤に対する感受性が低下していれば、該ＨＩＶは薬剤耐性を獲得しているといえる。すなわち、この検出法により、該ＨＩＶが、本発明において明らかになった変異（例えば、表１に記載の変異）を有していると結論できる。
本発明のＨＩＶおよび本発明のＨＩＶが持続感染した細胞は、アッセイに用いることができる。すなわち、本発明のＨＩＶを細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に感染させ、または本発明のＨＩＶが持続感染した細胞（例えば、ヒトＴ細胞）を使用し、当業者に広く知られているＭＴＴアッセイを行えばよい。このようなアッセイにより、本発明のＨＩＶであるＨＩＶインテグラーゼ阻害剤耐性ＨＩＶに対しても有効な化合物や薬剤を見い出すことができる。この際、ＥＣ５０値（ウイルスによる細胞障害を５０％抑制する化合物濃度）とＣＣ５０値（化合物による細胞毒性が５０％である化合物濃度）を比較することにより、有効な化合物を選択することができる。また、ＨＩＶの野性株に対しても同時に活性を測定し、耐性株に対する活性と比較することにより、その化合物や薬剤の有用性をさらに検討することができる。また、耐性株そのものを用いる以外に以下のような方法でアッセイを行っても良い。すなわち、インテグレーション活性が欠損しているＨＩＶに、インテグラーゼのみを別の分子として発現させたものを取り込ませることによりインテグレーション活性が相補されてウイルスの感染が成立することが知られている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２５５，１９９９，ｐ７７−８５，Ａ ｎｏｖｅｌ Ｖｐｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｔｅｇｒａｓｅ（ＩＮ）ｒｅｓｔｏｒｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＩＮ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＨＩＶ−１ ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｊ．Ｋｕｌｋｏｓｋｙ，Ｍ．ＢｏｕＨａｍｄａｎ，Ａ．Ｇｅｉｓｉｔ，Ｒ．Ｊ．Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ）。ただし、ウイルス粒子にインテグラーゼを取り込ませるために、インテグラーゼのＮ末端にたとえばＶｐｒが融合された形で発現させるなどの工夫が必要である。この方法を用いれば耐性株を用いなくともインテグラーゼに対する耐性変異の影響を簡単に調べることができる。
また、本発明のＨＩＶインテグラーゼも、本発明のＨＩＶ、本発明のＨＩＶが持続感染した細胞同様、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤（または活性化剤）探索のためのアッセイに使用することができる。すなわち、被験化合物がＨＩＶインテグラーゼと結合または相互作用し、ＨＩＶインテグラーゼ活性を阻害（または活性化）するか否かを測定すればよい。本アッセイ法は、被験化合物とＨＩＶインテグラーゼとの結合または相互作用が可能な条件下で、被験化合物とＨＩＶインテグラーゼを接触させ、被験化合物とＨＩＶインテグラーゼの結合または相互作用によるＨＩＶインテグラーゼ活性の変化を測定し、ＨＩＶインテグラーゼを阻害するか否かを評価することにより行うことができる。例えば、基質ＤＮＡとターゲットＤＮＡを使用し、被験化合物とＨＩＶインテグラーゼの結合または相互作用により、ＨＩＶインテグラーゼによる基質ＤＮＡのターゲットＤＮＡへの組み込みの減少を測定すればよい。
このようなアッセイ法としては、具体的には、ＷＯ００／３９０８６に記載のアッセイ法が挙げられる。本発明の耐性変異を持つＨＩＶインテグラーゼを、ＷＯ００／３９０８６に記載の野生型のインテグラーゼの代わりに通常の反応バッファーに添加するだけで全く同じ方法でアッセイに用いることができる。このようなアッセイにより、既存の薬剤耐性ＨＩＶに対しても有効な化合物や薬剤を見出すことができる。また、野性型インテグラーゼに対しても同時に活性を測定し、耐性変異をもつインテグラーゼに対する活性と比較することにより、その化合物や薬剤の有用性を検討することができる。
なお、これらのアッセイの結果選択される化合物は、例えば、分子量１５〜１０００の有機化合物を意味し、構成原子としては、水素、リチウム、ホウ素、炭素、窒素、酸素、フッ素、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、硫黄、塩素、カリウム、カルシウム、鉄、バリウム、臭素、沃素等が挙げられる。特に、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−または−ＮＨ−で示される基を持つ化合物が好ましい。また、窒素、酸素および硫黄の中から任意に選択される原子を１〜３個有するヘテロ環を有する化合物が好ましい。
上記化合物を有効成分として含有するＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、および該ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤を含有する抗ＨＩＶ剤、エイズ治療剤も本発明に包含される。
上記化合物は、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与による場合、上記化合物は通常の製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤若しくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合、上記化合物は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。その調製に際しては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等を任意に用いることができる。
本発明の製剤は、治療有効量の上記化合物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに組み合わせる（例えば混合する）ことによって製造される。上記化合物の製剤は、周知の、容易に入手できる成分を用いて既知の方法により製造される。
上記化合物の医薬組成物を製造する際、活性成分は担体と混合されるかまたは担体で希釈されるか、カプセル、サッシェー、紙、あるいは他の容器の形態をしている担体中に入れられる。担体が希釈剤として働く時、担体は媒体として働く固体、半固体、または液体の材料であり、それらは錠剤、丸剤、粉末剤、口中剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（液体媒質中の固体）、軟膏にすることができ、例えば、１０％までの活性化合物を含む。本発明化合物は投与に先立ち、製剤化するのが好ましい。
当業者には公知の適当な担体はいずれもこの製剤のために使用できる。このような製剤では担体は、固体、液体、または固体と液体の混合物である。例えば、静脈注射のために本発明化合物を２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、４％デキストロース／０．５％クエン酸ナトリウム水溶液中に溶解する。固形の製剤は粉末、錠剤およびカプセルを包含する。固形担体は、香料、滑沢剤、溶解剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤、カプセル剤にする材料としても役立つ１またはそれ以上の物質である。経口投与のための錠剤は、トウモロコシデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、および／またはゼラチン、アカシアなどの結合剤、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、滑石などの滑沢剤とともに炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムなどの適当な賦形剤を含む。
粉末剤では担体は細かく粉砕された活性成分と混合された、細かく粉砕された固体である。錠剤では活性成分は、適当な比率で、必要な結合性を持った担体と混合されており、所望の形と大きさに固められている。粉末剤および錠剤は約１〜約９９重量％の本発明の新規化合物である活性成分を含んでいる。適当な固形担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、ココアバターである。
液体製剤は懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む。活性成分は、滅菌水、滅菌有機溶媒、または両者の混合物などの製薬上許容し得る担体中に溶解または懸濁することができる。活性成分はしばしば適切な有機溶媒、例えばプロピレングリコール水溶液中に溶解することができる。水性デンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液、または適切な油中に細かく砕いた活性成分を散布することによってその他の組成物を製造することもできる。
上記化合物の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、状態及び疾患の種類によっても異なるが、通常、経口投与の場合、成人１日あたり約０．０５ｍｇ〜３０００ｍｇ、好ましくは、約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇを、要すれば分割して投与すればよい。また、非経口投与の場合、成人１日あたり約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜５００ｍｇを投与する。
実施例
実施例１ ＨＩＶインテグラーゼをコードする遺伝子の変異部位の確認
１．ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ持続感染細胞である、ＩＩＩＢ／Ｍｏｌｔ−４細胞（約１ｘ１０５／ｍｌ）とＭＴ−２細胞を（約３ｘ１０５／ｍｌ）を混合し（細胞比 約１：３）、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％に設定）で３日間培養した。混合３日後の、ＨＩＶが増殖し巨細胞が出現している状態の感染細胞を耐性ウイルス分離用のウイルスとした。
２．ＭＴ−２細胞を培養液で約３ｘ１０５／ｍｌに分散し、２４ｗｅｌｌプレートに１ｍｌずつ分注した。同様に、巨細胞出現後の感染細胞（上記参照）を適度に希釈し、０．５ｍｌづつ分注した。希釈した被験試料を添加してプレートミキサーで混和後、ＣＯ２インキュベーターで培養した。
３．感染３−４日目に感染細胞中のＨＩＶによる巨細胞形成の有無を確認した。培養上清１ｍｌを新たなプレートに分注し、新たなＭＴ−２細胞（約２ｘ１０５／ｗｅｌｌ）、培養液、薬剤を添加した。３−４日おきに細胞を観察し、このウイルスの継代操作を繰り返した。この時、強度の巨細胞形成が出現していた時は培養上清０．５ｍｌ、その他の場合は感染細胞０．５ｍｌを継代に用いた。細胞を継代する場合、ＭＴ−２細胞の添加量は適宜調節した。各ｗｅｌｌの培養液量は、約１．５−２．０ｍｌで行った。
４．細胞の継代時に、その薬剤の濃度において明らかな強度の巨細胞形成が繰り返して出現した時は、継代時に薬剤濃度を５倍量に上げ、再度培養を続けた。この操作を繰り返し、薬剤濃度を徐々に上げていった。最終的に薬剤濃度４，０００−１０，０００ｎｇ／ｍｌにおいてＨＩＶが増殖可能となるまで続けた。この間、約１週間おきに培養液、感染細胞をサンプリングした。
５．採取した感染細胞について、ＤＮＡ抽出キットを用いてプロウイルスゲノムＤＮＡを抽出した。インテグラーゼ領域の両側の２本のプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡに関してシークエンスを行った。
以下の表に使用した薬剤と変異部位を示す。
実施例２ ＨＩＶ変異株のｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅの作製法
下記に、代表的なｍｕｔａｎｔの作製法を示す。クローンは、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅであるｐＮＬ４３２を用いた。予め、インテグラーゼに変異を導入しやすいように、ｐＮＬ４３２のインテグレースの最初の位置にＸｂａＩを作製したものを用いた（以降、ＮＬ４３２ Ｘｂａとする）。
１．Ｔ６６Ｉ ｍｕｔａｎｔの作製法
化合物Ｃ耐性ウイルス（ＮＬ４３２）より得られたインテグレースＴ６６ＩのｍｕｔａｎｔウイルスＤＮＡをテンプレートにして、下記に示すプライマ−ＩＮＴ−Ｘｂａ、ｖｐｒ−ＥｃｏでＰＣＲを行った。これで得られた断片をＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩでカットし、ＮＬ４３２ Ｘｂａの同領域と置き換えた。
２．Ｔ１２４Ａ ｍｕｔａｎｔの作製法
ｐＮＬ４３２をテンプレートにして、下記のプライマ−ＩＮＴ−Ｘｂａ、１２４Ａ Ｂａｍ（−）でＰＣＲを行い、これで得られた断片をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩでカットした（＝ＸｂＢａ１２４Ａ）。またｐＮＬ４３２をテンプレートにして、下記のプライマ−１２４Ａ Ｂａｍ（＋）、ｖｐｒ−ＥｃｏでＰＣＲを行い、これで得られた断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでカットした（＝ＢａＥｃ１２４Ａ）。続いてＸｂＢａ１２４Ａ、ＢａＥｃ１２４Ａ断片をライゲーションさせた後に、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩへクローニングした。このプラスミドをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩでカットし、その断片をｐＮＬ４３２ Ｘｂａの同領域と置き換えた。
３．Ｅ１４８Ｋ ｍｕｔａｎｔの作製法
ｐＮＬ４３２をテンプレートにして、下記のプライマ−ＩＮＴ−Ｘｂａ、１４８Ｋ Ｂａｍ（−）でＰＣＲを行い、これで得られた断片をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩでカットした（＝ＸｂＢａ１４８Ｋ）。また、ｐＮＬ４３２をテンプレートにしてプライマ−１４８Ｋ Ｂａｍ（＋）、ｖｐｒ−ＥｃｏでＰＣＲを行い、これで得られた断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでカットした（＝ＢａＥｃ１４８Ｋ）。続いてＸｂＢａ１４８Ｋ、ＢａＥｃ１４８Ｋ断片をライゲーションさせた後、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩへクローニングした。このプラスミドを、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩでカットし、その断片をｐＮＬ４３２ Ｘｂａの同領域と置き換えた。
４．Ｎ１５５Ｓ ｍｕｔａｎｔの作製法
ｐＮＬ４３２をテンプレートにして、下記のプライマ−ＩＮＴ−Ｘｂａ、１５５Ｓ Ｓａｃ（−）でＰＣＲを行い、これで得られた断片をＸｂａＩ／ＳａｃＩでカットした（＝ＸｂＳａ１５５Ｓ）。また、ｐＮＬ４３２をテンプレートにしてプライマ−１５５Ｓ Ｓａｃ（＋）、ｖｐｒ−ＥｃｏでＰＣＲを行い、これで得られた断片をＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩでカットした（＝ＳａＥｃ１５５Ｓ）。続いてＸｂＳａ１５５Ｓ、ＳａＥｃ１５５Ｓ断片をライゲーションさせた後、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩへクローニングした。このプラスミドを、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩでカットし、その断片をｐＮＬ４３２ Ｘｂａの同領域と置き換えた。
他のＨＩＶについても、上記同様に作製することができる。
実施例３ ＨＩＶインテグラーゼをコードする核酸の作製法
本発明の変異を持つ耐性ウイルスのモレキュラークローンＤＮＡ５ｎｇを鋳型にして、制限酵素部位ＮｄｅＩ（５’側）とＢａｍＨＩ（３’側）を付加できるように設計されたプライマー（５’−ｇｇＣ ＡｇＣ ＣＡＴ ＡＴｇ ＴＴＴ ＴＴＡ ｇＡＴ ｇｇＡ ＡＴＡ ｇＡＴ ＡＡｇ ｇＣＣ Ｃ−３’（配列番号：３１）と５’−ｇＣＡ ｇＣＣ ｇｇＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＴｇ ＴＣＴ ＡＣＴ ＴｇＣ ＣＡＣ−３’（配列番号：３２））と東洋紡社より購入したＫＯＤ ｄａｓｈ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて本発明の変異を持つインテグラーゼをコードするＤＮＡ断片を増幅した。反応条件は１０μｌの１０ｘＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ（組成：１．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ ＫＣｌ，６０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、１６μｌのｄＮＴＰ混合液（各々２ｍＭ）、プライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ１μｌづつ、鋳型ＤＮＡを５ｎｇ分、最後にＫＯＤ ｄａｓｈ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕｎｉｔｓ／μｌ）を１．５μｌ入れて１００μｌのスケールで９４℃、３０ｓｅｃ．、５２℃、３０ｓｅｃ．、７４℃、３０ｓｅｃ．のサイクルを３０回行った。
実施例４ 変異ＨＩＶインテグラーゼの作製法
前項の実施例で増幅した本発明の変異を含むインテグラーゼをコードするＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断してから１％アガロースゲルに電気泳動を行い、イルミネーター上でバンドを検出して切り出し精製した。他方ノヴァジェン社のｐＥＴ１５ｂベクターも同様に制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲルに電気泳動することにより余分なＤＮＡ断片を取り除いた。これらの耐性インテグラーゼをコードするＤＮＡ断片とｐＥＴ１５ｂベクターをＴ４ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いてライゲーションを行い、発現ベクターを構築した。
次に構築した発現ベクターをノヴァジェン社より購入したコンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションを行い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（組成：１０ｍｇ／ｍｌ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ，５ｍｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ，５ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ）にまいて３７℃で終夜培養した。翌日プレートに生えたコロニーを集めて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地（組成：１２ｍｇ／ｍｌ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ，２４ｍｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ，４μｌ／ｍｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２．３１ｍｇ／ｍｌ ＫＨ２ＰＯ４，１２．５４ｍｇ／ｍｌ Ｋ２ＨＰＯ４）中で３０℃で培養を行った。６００ｎｍにおける吸光度が０．８に達した時点で終濃度が０．４ｍＭになるようＩＰＴＧを添加してインテグラーゼの発現を誘導した。発現誘導後は３７℃で３時間培養を行った後に集菌した。集めた菌を溶解バッファー（組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）に溶解して終濃度０．３ｍｇ／ｍｌになるようにライソザイムを加えて氷上で３０分間インキュベーションを行った。ダウンス型ホモジュナイザーで破砕後、超遠心（条件：４℃、６０分、４００００ ｘ ｇ）を行った。沈殿物を５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む可溶化バッファー（組成：２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２），４００ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｅｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＮＰ−４０，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，４Ｍ ｕｒｅａ）に溶解して０．２２−μＭのフイルターに通した後にニッケルキレートアフィニティーゲル（アマシャムファルマシアバイオテック）にアプライした。洗浄バッファー（組成：４０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２），４００ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｅｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＮＰ−４０，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，４Ｍ ｕｒｅａ）でカラムを洗浄後、３００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む可溶化バッファーで溶出した。溶出されたフラクションを１０００倍量の１０ｍＭ ＤＴＴを含む可溶化バッファーに対して２回透析し、インテグレーション活性を調べた。
実施例５ 変異ＨＩＶウイルス検出法
本発明の耐性ウイルス検出例（Ｔ６６Ｉの場合）を以下に示す方法に基づき実施した。
（１）プロウイルスＤＮＡを用いた検出法
合成した表２の各ＤＮＡをＴＥバッファー（組成：１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．６））に溶解させ、プライマー溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を調製した。野生型を検出する場合はＲＷＴ−２（５’−ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＧＴＡ Ｃ−３’（配列番号：３３））とＲＲＷ−１（５’−ＣＴＡ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＴＡ ＣＴＴ ＧＴＧ ＴＧＣ−３’（配列番号：３４））のプライマーを、耐性変異型を検出する場合はＲＭ−２（３’−Ｇ ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＣＡＡ Ｔ−５’（配列番号：３５））とＲＲＷ−１のプライマーを各々０．５μｌ用いた。０．５ｕｎｉｔｓのＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭと３μｌの添付バッファー（組成：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）とｄＮＴＰ混合液（各々２．５ｍＭ）を混ぜて２８μｌの反応液を作製し、様々な濃度の鋳型ＤＮＡを含む溶液２μｌを加えた。ミネラルオイルを一滴ずつ加えてからシータス社の機械を用いて、野生型を検出する場合は９４℃、１ｍｉｎ．、５７℃、３０ｓｅｃ．、７２℃、３０ｓｅｃ．のサイクルを３０回の条件で、耐性変異型を検出する場合は９４℃、１ｍｉｎ．、６０℃、３０ｓｅｃ．、７２℃、３０ｓｅｃ．のサイクルを２７回繰り返す反応条件でＰＣＲ反応を行った。野生型ウイルスＤＮＡの鋳型としてはモレキュラークローンｐＮＬ４３２を用いた（Ａｄａｃｈｉ，Ａ．，Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｋｏｅｎｉｇ，Ｓ．，Ｆｏｌｋｓ，Ｔ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｒ．，Ｒｏｂｓｏｎ，Ａ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ａ．（１９８６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．５９，ｐ２８４−２９１．）。耐性ウイルスＤＮＡの鋳型としてはｐＮＬ４３２のインテグラーゼ部分のアミノ酸配列にのみＴ６６Ｉ、Ｌ７４Ｍ（ＡＣＡ→ＡＴＡ、ＴＴＧ→ＡＴＧ）の変異を持つモレキュラークローンｐＴＹＩ−３０２を用いた。ＰＣＲ反応後の反応液５μｌを１％アガロースゲルに電気泳動し、下方よりＵＶを照射しながらバンドを検出することにより結果を判定した。その結果、野生型検出の場合は０．０００２ｎｇ／３０μｌ以上の濃度のｐＮＬ４３２を鋳型として用いた場合のみ検出でき、ｐＴＹＩ−３０２を鋳型とした場合は検出されなかった。逆に耐性変異型検出の場合は０．０００２ｎｇ／３０μｌ以上の濃度のｐＴＹＩ−３０２を鋳型として用いた場合のみ検出でき、ｐＮＬ４３２を鋳型として用いた場合は検出されなかった。
実施例６ 変異ＨＩＶインテグラーゼを使用したアッセイ
本発明の耐性変異を持つインテグラーゼを用いて以下に示す野生型の場合と同じアッセイ法に基づき種々の化合物の阻害活性を調べた。
（１）ＤＮＡ溶液の調製
アマシャムファルマシア社により合成された以下の各ＤＮＡを、ＫＴＥバッファー液（組成：１００ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．６））に溶解させることにより、基質ＤＮＡ溶液（２ｐｍｏｌ／μｌ）およびターゲットＤＮＡ溶液（５ｐｍｏｌ／μｌ）を調製した。各溶液は、一旦煮沸後、ゆるやかに温度を下げて相補鎖同士をアニーリングさせてから用いた。
（基質ＤＮＡ配列）
（ターゲットＤＮＡ配列）
（２）阻害率（ＩＣ５０値）の測定
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を０．１Ｍ炭酸バッファー液（組成：９０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３，１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３）に溶かし、濃度を４０μｇ／ｍｌにした。この溶液、各５０μｌをイムノプレート（ＮＵＮＣ社製）のウエルに加え、４℃で一夜静置、吸着させる。次に各ウエルを燐酸バッファー（組成：１３．７ｍＭ ＮａＣｌ，０．２７ｍＭ ＫＣｌ，０．４３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．１４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で２回洗浄後、１％スキムミルクを含む燐酸バッファー３００μｌを加え、３０分間ブロッキングした。さらに各ウエルを燐酸バッファーで２回洗浄後、基質ＤＮＡ溶液（２ｐｍｏｌ／μｌ）５０μｌを加え、振盪下、室温で３０分間吸着させた後、燐酸バッファーで２回、次いで蒸留水で１回洗浄した。
次に上記方法で調製した各ウエルに、バッファー（組成：１５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２），７５ｍＭ ＭｎＣｌ２，５０ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，２５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，５００μｇ／ｍｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ−ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）１２μｌ、ターゲットＤＮＡ（５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌおよび蒸留水３２μｌから調製した反応溶液４５μｌを加えた。さらに各ウエルに被検化合物のＤＭＳＯ溶液６μｌを加え、ポジティブコントロール（ＰＣ）としてのウエルには、ＤＭＳＯ ６μｌを加える。次に耐性インテグラーゼ溶液（３０ｐｍｏｌ）９μｌを加え、良く混合した。ネガティブコントロール（ＮＣ）としてのウエルには，希釈液（組成：２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２），４００ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｅｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＮＰ−４０，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，４Ｍ ｕｒｅａ）９μｌを加えた。
各プレートを３０℃で１時間インキュベート後、反応液を捨て、燐酸バッファーで２回洗浄した。次にアルカリフォスファターゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗体（ヒツジＦａｂフラグメント：ベーリンガー社製）を１００μｌ加え、３０℃で１時間結合させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む燐酸バッファーで２回、燐酸バッファーで１回、順次洗浄した。次に、アルカリフォスファターゼ呈色バッファー（組成：１０ｍＭパラニトロフェニルホスフェート（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製），５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ９．５））を１５０μｌ加えて３０℃で２時間反応させ、１Ｎ ＮａＯＨ溶液５０μｌを加え反応を止めた後、各ウエルの吸光度（ＯＤ４０５ｎｍ）を測定し、以下の計算式に従い阻害率を求めた。
阻害率（％）＝１００［１−｛（Ｃ ａｂｓ．−ＮＣ ａｂｓ．）／（ＰＣ ａｂｓ．−ＮＣ ａｂｓ．）｝］
Ｃ ａｂｓ．；化合物のウエルの吸光度
ＮＣ ａｂｓ．：ＮＣの吸光度
ＰＣ ａｂｓ．：ＰＣの吸光度
なお、ＩＣ５０値は、上記の阻害率を用いて以下の計算式で求められる。すなわち阻害率５０％をはさむ２点の濃度において、ｘμｇ／ｍｌの濃度で阻害率Ｘ％、ｙμｇ／ｍｌの濃度で阻害率Ｙ％をそれぞれ示す時、ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）＝ｘ−｛（Ｘ−５０）（ｘ−ｙ）／（Ｘ−Ｙ）｝となる。
実施例７ ＨＩＶ変異株を使用したアッセイ
（１） ＨＩＶ変異株持続感染ヒトＴ細胞株Ｍｏｌｔ−４ｃｌｏｎｅ８を１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、上清を濾過してウイルスの力価を測定し、−８０℃で保存した。他方、被検化合物を上記の培養培地で所定の濃度になるように希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ分注する。次にＭＴ−４細胞浮遊液を５０μｌ（２．５×１０４細胞）ずつを分注し、更に上記ＨＩＶ含有上清を上記の培養培地で希釈したものを５０μｌ（６００ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ））ずつ加えた。
（２） 炭酸ガス培養器内で３７℃で５日間培養した後、全てのウエルにＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）５ｍｇ／ｍｌ，ＰＢＳ）を３０μｌずつ加え、更に１時間培養した。このとき、生存する細胞はＭＴＴを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を１５０μｌずつ取り除き、代わりに１５０μｌの溶解液（１０％トリトンＸ−１００及び０．４％（Ｖ／Ｖ）ＨＣｌ添加イソプロパノール）を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをＯＤ５６０ｎｍで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞障害を５０％抑制する化合物濃度をＥＣ５０とした。
（３） 上記（１）において、ＨＩＶ含有上清（ウイルス液）の代わりに各ウェルに培養培地５０μｌずつ加え、（２）と同様に処理し化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が５０％である化合物濃度をＣＣ５０とした。
産業上の利用可能性
本発明のＨＩＶまたはＨＩＶインテグラーゼは、薬剤耐性ＨＩＶに対する阻害剤のアッセイ法に使用することができ、有用である。また、本発明のＨＩＶインテグラーゼをコードする核酸またはそれらを含む核酸配列に相補的なプローブまたはプライマーは、薬剤耐性ＨＩＶ検出法に使用することができ、有用である。
【配列表】
本発明は、ＨＩＶインテグラーゼ，詳しくは、耐性変異を有するＨＩＶインテグラーゼ、該ＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド、それらを含有するＨＩＶ、それらを検出する検出法、およびそれらを使用するアッセイ法に関する。
背景技術
ヒト免疫不全ウイルス（以下、ＨＩＶという。）は、薬剤に対し、比較的容易に薬剤耐性を獲得することが知られている。薬剤耐性ウイルスが出現すると、その薬剤の有効性は低下し、もはやその薬剤ではＨＩＶ感染症を有効に治療することができない。従って、ＨＩＶ感染症の治療においては、薬剤耐性ウイルスの出現後は、投与薬剤を変更する等の処置をすることが望ましい。また、次世代の薬剤として、上記薬剤耐性ウイルスにも有効な薬剤を探索する必要がある。
現在までに、各種の逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤が研究、開発され、その結果、多数の逆転写酵素阻害剤耐性ＨＩＶ、プロテアーゼ阻害剤耐性ＨＩＶが報告されている。
しかし、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤耐性ＨＩＶについては、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤自身が少ないため、その報告は少ない。
ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤耐性ＨＩＶインテグラーゼとしては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｖｏｌ．２８７，ｐ６４６−６５０に、野性株（ＨＸＢ２株：配列表の配列番号４記載のＨＩＶインテグラーゼを含有するＨＩＶ、アクセション番号：ＡＦ０３３８１９）の６６番目のアミノ酸がトレオニンからイソロイシンに、１５３番目のアミノ酸がセリンからチロシンに、および／または１５４番目のアミノ酸がメチオニンからイソロイシンに変異したＨＩＶインテグラーゼ阻害剤耐性ＨＩＶインテグラーゼが開示されている。具体的には、配列表の配列番号８〜１２のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼである。
また、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤存在下で耐性を獲得したＨＩＶのインテグラーゼではないが、６６番目のアミノ酸がアラニンであり、７４番目のアミノ酸がメチオニンであるＨＩＶインテグラーゼが知られている。具体的には、配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＪ２３９０８３）を有するＨＩＶインテグラーゼである。
なお、ＨＩＶインテグラーゼに関し、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に、以下のＨＩＶインテグラーゼが登録されている。
６３番目のアミノ酸がイソロイシンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１３および１４記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＪ２５１０５６、ＡＪ２７６５９５）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。６３番目のアミノ酸がイソロイシンであり、７４番目のアミノ酸がイソロイシンであり、１５３番目のセリンがアラニンであり、１６０番目のリジンがセリンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列番号１５記載のアミノ酸配列（アクセション番号：Ｌ２０５８７）が登録されている。６３番目のアミノ酸がメチオニンであり、７４番目のアミノ酸がイソロイシンであり、１５３番目のセリンがアラニンであり、１６０番目のリジンがセリンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１６記載のアミノ酸配列（アクセション番号：Ｌ２０５７１）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。６６番目のアミノ酸がプロリンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号２０または２１記載のアミノ酸配列（順にアクセション番号：Ｕ６９５８８、Ｕ６９５８４）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。１４５番目のアミノ酸がロイシンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１９記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＦ０４０３１９）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。１５３番目のアミノ酸がプロリンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１７記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＦ０４０３２７）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。１５５番目のアミノ酸がアスパラギン酸であるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号１８記載のアミノ酸配列（アクセション番号：Ｕ７１１８２）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。１３８番目のアミノ酸がリジンであるＨＩＶインテグラーゼとして、配列表の配列番号２２記載のアミノ酸配列（アクセション番号：ＡＦ０８６８１７）を有するＨＩＶインテグラーゼが登録されている。
なお、本明細書中のアクセション番号は、各タンパクをコードする核酸のＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のアクセション番号を表わす。
また、ＨＩＶインテグラーゼの全長ではなく一部の配列に過ぎないが、９２番目のアミノ酸がバリンで置換された配列、１１８番目のアミノ酸がアルギニンで置換された配列、１２１番目のアミノ酸がロイシンで置換された配列、１３８番目のアミノ酸がセリン、バリンまたはトレオニンで置換された配列、１４６番目のアミノ酸がヒスチジンで置換された配列、１４８番目のアミノ酸がロイシンで置換された配列、１６０番目のアミノ酸がアスパラギンで置換された配列が登録されている。
ＨＩＶインテグラーゼについては、その野性株のアミノ酸配列が知られている。なお、ＨＩＶは薬剤非存在下でも変異するため、多数の野性株が存在し、そのアミノ酸配列はそれぞれ異なる。
以下に本発明で見出した変異部位について、ＧｅｎＢａｎｋで調べた結果、野性株であると思われるアミノ酸を記載する。６３番目のアミノ酸はロイシンであり、６６番目のアミノ酸はトレオニンであり、７０番目のアミノ酸はグリシンまたはグルタミン酸であり、７２番目のアミノ酸はバリン、イソロイシンまたはグリシンであり、７４番目のアミノ酸はロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンであり、９２番目のアミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、１１８番目のアミノ酸はグリシンであり、１２１番目のアミノ酸はフェニルアラニンであり、１３８番目のアミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、１４０番目のアミノ酸はグリシンであり、１４５番目のアミノ酸はプロリンであり、１４６番目のアミノ酸はグルタミンであり、１４８番目のアミノ酸はグルタミンであり、１５１番目のアミノ酸はバリンまたはイソロイシンであり、１５３番目のアミノ酸はセリンまたはアラニンであり、１５５番目のアミノ酸はアスパラギンであり、１６０番目のアミノ酸はリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸であり、２４９番目のアミノ酸はバリンまたはロイシンであり、２５０番目のアミノ酸はバリン、ロイシンまたはアラニンである。
発明の開示
ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対し耐性を獲得したＨＩＶを見い出し、それらの検出法およびそれらを使用するアッセイ法を提供する。
本発明者は、上記課題を解決するため、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対し耐性を獲得したＨＩＶの核酸配列を決定し、以下の発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１） ６４番目および１１６番目のアミノ酸がアスパラギン酸であり、１５２番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有するＨＩＶインテグラーゼ；
（ａ）６３番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸である；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸である；
（ｅ）７４番目がロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸である；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｇ）１１８番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｊ）１３８番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸である；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸である；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がセリンおよびアラニン以外のアミノ酸である；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸である；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がバリンおよびロイシン以外のアミノ酸である；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸である；
ただし、配列表の配列番号７〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＨＩＶインテグラーゼは除く。
（２） 以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有する上記（１）記載のＨＩＶインテグラーゼ；
（ａ）６３番目のアミノ酸がバリンである；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンである；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がアラニンである；
（ｅ）７４番目のアミノ酸がメチオニンである；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミンである；
（ｇ）１１８番目のアミノ酸がセリンである；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｉ）１３８番目のアミノ酸がリジンである；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がセリンである；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がセリンである；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンである；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がロイシンである；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンである；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がアスパラギンである；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がイソロイシンである；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がイソロイシンである、
（３） １２番目および１６番目のアミノ酸がヒスチジンであり、４０番目および４３番目のアミノ酸がシステインであり、かつ１５６番目および１５９番目のアミノ酸がリジンである上記（１）または（２）記載のＨＩＶインテグラーゼ、
（４） 配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１以上の上記（１）または（２）記載のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼ、
（５） 上記（１）〜（４）のいずれかに記載のインテグラーゼにおいて、６４番目および１１６番目のアスパラギン酸、１５２番目のグルタミン酸、および任意に選択された変異部位のアミノ酸以外の１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたＨＩＶインテグラーゼ；
ただし、配列表の配列番号７〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＨＩＶインテグラーゼは除く、
（６） 増殖可能なＨＩＶを構成することができる（１）〜（５）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼ、
（７） 上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド、
（８） 配列表の配列番号５または６記載の核酸配列において、１８７番目のＣがＧ、１９６番目のＡがＧ、１９７番目のＣがＴ、２２０番目のＴがＡ、３５２番目のＧがＡ、４３３番目のＣがＴ、４３７番目のＡがＧ、４４２番目のＣがＡ、４５１番目のＡがＴ、４５８番目のＣがＡ、４６２番目のＧがＡ、４６４番目のＡがＧまたはＣ、および／または７４５番目のＧがＡに置換された核酸配列を有する上記（７）記載のポリヌクレオチド、
（９） 増殖可能なＨＩＶを構成することができる上記（７）または（８）記載のポリヌクレオチド、
（１０） 上記（７）または（８）記載のポリヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミド、
（１１） 上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼまたは上記（７）または（８）記載のポリヌクレオチドを含有するＨＩＶ、
（１２） 上記（１１）記載のＨＩＶが持続感染した細胞、
（１３） 上記（７）または（８）記載のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得るプローブまたはプライマー、
（１４） 上記（１３）記載のプローブまたはプライマーを使用したＨＩＶの検出法、
（１５） 以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とする上記（１４）記載のＨＩＶの検出法；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からトレオニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からフェニルアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からセリンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からアスパラギン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異、
（１６） 以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とする上記（１４）または（１５）記載のＨＩＶの検出法；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からバリンをコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からイソロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からメチオニンをコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミンをコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からリジンをコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からリジンまたはアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からロイシンをコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンをコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアスパラギンをコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異、
（１７） 上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼを使用した抗ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法、
（１８） 上記（１１）記載のＨＩＶを使用した抗ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法、
（１９） 上記（１２）記載のＨＩＶが持続感染した細胞を使用した抗ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法、
（２０） 分子量が１５〜１０００であり、水素、リチウム、ホウ素、炭素、窒素、酸素、フッ素、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、硫黄、塩素、カリウム、カルシウム、鉄、バリウム、臭素および沃素からなる群から選択された任意の原子により構成され、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−または−ＮＨ−で示される基を持ち、窒素、酸素および硫黄の中から任意に選択される原子を１〜３個有するヘテロ環を有する、上記（１７）〜（１９）のいずれかに記載のスクリーニング法により得られた化合物を有効成分として含有するＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、
（２１） 上記（２０）記載のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗ＨＩＶ剤、
（２２） 上記（２０）記載のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤を有効成分として含有するエイズ治療剤、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤の存在下でＨＩＶの野性株を細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に感染させ、継代培養し、数日後、ＨＩＶ感染細胞をホモジネートし、ＰＣＲ法を用いてＨＩＶ ｐｒｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡの塩基配列をシークエンスすることにより、そのＨＩＶインテグラーゼをコードする核酸配列を調べた。
ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤としては、ＷＯ００／３９０８６またはＳｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｖｏｌ．２８７，ｐ６４６−６５０に記載の化合物を使用することができる。例えば、４−（１−ベンゼンスルホニル−５−クロロインドール−３−イル）−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（以下、化合物Ａとする。）、１−［５−（４−フルオロベンジル）フラン−２−イル］−３−ヒドロキシ−３−（５−クロロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）プロペノン（以下、化合物Ｂとする）、１−［５−（４−フルオロベンジル）フラン−２−イル］−３−ヒドロキシ−３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）プロペノン（以下、化合物Ｃとする）、４−［１−（４−フルオロベンジル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（以下、化合物Ｄとする）、１−［５−（４−フルオロフェニルチオ）フラン−２−イル］−３−ヒドロキシ−３−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）プロペノン（以下、化合物Ｅとする）、４−［３，５−（ビスベンジルオキシ）フェニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（以下、化合物Ｆとする）などを使用することができる。
次に、得られたシークエンスに基づき、各変異部位についてのモレキュラークローンを作製し、該変異がＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対する耐性獲得のために必要な変異部位であるか否かを調べた。
すなわち、ＨＩＶのモレキュラークローン（ＮＬ４３）のインテグラーゼ部分の配列のみを、上記シークエンスに基づき作製されたＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）で置換し、プラスミドｐＮＬ４３を作製し、細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に取り込ませ、目的の変異を持つＨＩＶインテグラーゼを有するＨＩＶのウイルスクローンを作製した。
このようにして得られたＨＩＶのウイルスクローンが、使用されたＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対して耐性を獲得しているか否かを、野性株に対する阻害活性と比較することにより調べた。
その結果、化合物Ａに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・６６番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・７４番目のアミノ酸がメチオニンとなる変異
・１４５番目のアミノ酸がセリンとなる変異
・２４９番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・２５０番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
化合物Ｂに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・７０番目のアミノ酸がアルギニンとなる変異
・１１８番目のアミノ酸がセリンとなる変異
・１３８番目のアミノ酸がリジンとなる変異
・１４６番目のアミノ酸がアルギニンとなる変異
・１４８番目のアミノ酸がリジンとなる変異
・１５１番目のアミノ酸がロイシンとなる変異
・１５５番目のアミノ酸がセリンまたはイソロイシンとなる変異
・１６７番目のアミノ酸がアスパラギン酸となる変異
化合物Ｃに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・６３番目のアミノ酸がバリンとなる変異
・６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンとなる変異
・７４番目のアミノ酸がメチオニンとなる変異
・９２番目のアミノ酸がグルタミンとなる変異
・１２４番目のアミノ酸がアスパラギンとなる変異
・１３８番目のアミノ酸がリジンとなる変異
・１４０番目のアミノ酸がセリンとなる変異
・１４６番目のアミノ酸がアルギニンとなる変異
・１４８番目のアミノ酸がリジンとなる変異
・１５１番目のアミノ酸がロイシンとなる変異
・１５３番目のアミノ酸がアラニンとなる変異
・１５５番目のアミノ酸がセリン、トレオニンまたはヒスチジンとなる変異
・１６０番目のアミノ酸がアスパラギンとなる変異
化合物Ｄに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・７２番目のアミノ酸がアラニンとなる変異
・７４番目のアミノ酸がメチオニンとなる変異
・１４８番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンとなる変異
・１５１番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・１５５番目のアミノ酸がセリンとなる変異
化合物Ｅに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンとなる変異
・１４８番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンとなる変異
・１５３番目のアミノ酸がチロシンとなる変異
化合物Ｆに対する耐性変異として、以下の変異を確認した。
・６６番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・７４番目のアミノ酸がメチオニンとなる変異
・１２１番目のアミノ酸がチロシンとなる変異
・１５１番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
・１５３番目のアミノ酸がチロシンとなる変異
・１５４番目のアミノ酸がイソロイシンとなる変異
すなわち、化合物存在下でＨＩＶインテグラーゼの変異が容易に起こる部位（以下、変異部位という。）を見い出し、特にその変異部位において置換されるアミノ酸を特定し、それらの事実に基づき、本発明を完成した。
本発明であるＨＩＶインテグラーゼは、ＨＩＶ野性株に比較して、上記耐性変異部位から任意に選択される変異部位が任意のアミノ酸で１以上置換された、活性中心のアミノ酸が保存されたＨＩＶインテグラーゼを意味する。一般的にはＨＩＶインテグラーゼは２８８個のアミノ酸からなるポリペプチドであるが、本発明のＨＩＶインテグラーゼは、２８８個のアミノ酸からなるポリペプチドに限定されるものではない。数個〜数十個のアミノ酸が欠失、付加していてもよい。例えば、配列表の配列番号１５及び１６記載のＨＩＶインテグラーゼのように、Ｃ末端に１０アミノ酸伸びた２９８個のアミノ酸からなるＨＩＶインテグラーゼ等も存在する。
なお、活性中心のアミノ酸は、６４番目および１１６番目のアミノ酸がアスパラギン酸であり、１５２番目のアミノ酸がグルタミン酸である。本発明のＨＩＶインテグラーゼは活性中心のアミノ酸が保存されており、ＨＩＶインテグラーゼ活性を有する。さらには、１５６番目および１５９番目のアミノ酸が保存されているＨＩＶインテグラーゼが好ましい。なお、１５６番目および１５９番目のアミノ酸はリジンである。また、Ｚｎフィンガーモチーフ（１２番目および１６番目のアミノ酸がヒスチジンであり、４０番目および４３番目のアミノ酸がシステインである）も保存されていることが好ましい。
本発明は、化合物（例えば、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤）存在下でＨＩＶインテグラーゼの変異が容易に起こる部位を見出したものであり、特に変異部位のアミノ酸の種類を限定するものではない。すなわち、変異部位のアミノ酸は、野性株として知られているアミノ酸以外の任意のアミノ酸であればよい。具体的には、本発明のＨＩＶインテグラーゼは、以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有するＨＩＶインテグラーゼを意味する。
（ａ）６３番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸である；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸である；
（ｅ）７４番目がロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸である；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｇ）１１８番目がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である；
（ｉ）１３８番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸である；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸である；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がセリンおよびアラニン以外のアミノ酸である；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸である；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がバリンおよびロイシン以外のアミノ酸である；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸である。
特に、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対する耐性獲得という点からは、６６番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸であるＨＩＶインテグラーゼが重要である。
また、本発明は、上記の変異部位において置換されるアミノ酸も見い出したものである。具体的には、以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有するＨＩＶインテグラーゼが挙げられる。
（ａ）６３番目のアミノ酸がバリンである；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンである；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がアラニンである；
（ｅ）７４番目のアミノ酸がメチオニンである；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミンである；
（ｇ）１１８番目のアミノ酸がセリンである；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｉ）１３８番目のアミノ酸がリジンである；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がセリンである；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がセリンである；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンである；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がロイシンである；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンである；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がアスパラギンである；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がイソロイシンである；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がイソロイシンである。
特に、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に対する耐性獲得という点からは、６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンであるＨＩＶインテグラーゼが重要である。
なお、本発明のＨＩＶインテグラーゼは活性中心のアミノ酸が保存されているので、活性中心及び上記変異部位以外のアミノ酸は、ＨＩＶインテグラーゼの機能を損わない限り、すなわちＨＩＶインテグラーゼ活性を有する限り、任意のアミノ酸であってよい。例えば、データベース等で検索して選択したアミノ酸でもいいし、野性株、臨床分離株のアミノ酸でもよい。なお、「ＨＩＶインテグラーゼ活性を有する」とは、酵素系の実験でＨＩＶインテグラーゼ活性を有する場合のみならず、ＨＩＶとした場合に増殖可能なＨＩＶを構成することができるものであればよい。
具体的には、ＨＩＶ野性株のＨＩＶインテグラーゼとして知られている配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列（配列番号１：ＨＩＶ−１ ｐＮＬ４３ ｓｕｂｃｌｏｎｅ４−２０ Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、アクセション番号：Ｕ２６９４２；配列番号２：ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ；配列番号３：ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ（ｓｈｉｏｎｏｇｉ ｃｌｏｎｅ）Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ；配列番号４：ＩＩＩＢ／ＬＡＩ ｃｌｏｎｅ ＨＸＢ２ Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、アクセション番号：ＡＦ０３３８１９）において１以上のアミノ酸が、任意に選択された上述のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
本発明のＨＩＶインテグラーゼの６４番目および１１６番目のアスパラギン酸、１５２番目のグルタミン酸、および上記選択された変異部位のアミノ酸以外の１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたＨＩＶインテグラーゼも本発明の範囲内である。
１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたＨＩＶインテグラーゼとは、例えば、基準となるＨＩＶインテグラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＨＩＶインテグラーゼを意味する。
例えば、配列表のアミノ酸からなる群より選択される対照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチドの配列が対照アミノ酸配列のアミノ酸１００個ごとに２０個までのアミノ酸の変化を含みうることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列と対照配列が同一である場合を意味する。言い換えると、対照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、対照配列中のアミノ酸の２０％までが欠失または他のアミノ酸と置換していてもよく、あるいは対照配列中の全アミノ酸数のうち２０％までのアミノ酸が対照配列に挿入されたものであってもよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に存在してもよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存在してもよく、対照配列中に散在していてもよく、あるいは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなしていてもよい。
また、本発明のＨＩＶインテグラーゼは、増殖可能なＨＩＶを構成することができるＨＩＶインテグラーゼが好ましい。増殖可能なＨＩＶを構成することができるＨＩＶインテグラーゼか否かは、本発明のＨＩＶインテグラーゼを含有するＨＩＶを作製し、細胞に感染させ、細胞での増殖能を調べればよい。
なお、本発明のＨＩＶインテグラーゼは、遺伝子組み換え技術により生産されたＨＩＶインテグラーゼ、天然に存在するＨＩＶインテグラーゼ、または有機合成されたＨＩＶインテグラーゼのすべてを包含する。好ましくは、遺伝子組み換え技術により生産されたＨＩＶインテグラーゼである。
なお、本明細書中、アミノ酸とは、天然型アミノ酸を意味し、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられる。
本発明であるＨＩＶインテグラーゼは、それらをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ断片）を制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、市販のベクターまたはプラスミド等に導入し、宿主細胞（例えば大腸菌等）を用いて大量にタンパク質を発現させ、発現生成物を回収し単離生成することにより作製することができる。なお、細胞の培養は、プロモーター活性化、形質転換体選択または遺伝子増幅に適するように修飾された慣用的な培地中で行なうことができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、使用された宿主細胞に依存するが、当業者であれば容易に設定することができる。
上記発現系がＨＩＶインテグラーゼを増殖培地中に分泌する場合、該ＨＩＶインテグラーゼを培地から直接精製することができる。また、ＨＩＶインテグラーゼが分泌されない場合、該ＨＩＶインテグラーゼを細胞溶解物から単離するか、あるいは細胞膜フラクションから回収することができる。
回収、単離および精製法としては、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー等が挙げられる。最後に高品質液体高速クロマトグラフィーを使用してもよい。
また、別法として、本発明のポリペプチドをペプチド合成装置により合成的に得ることもできる。
制限酵素としては、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩなど使用することができる。ＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどを使用することができる。
ベクターまたはプラスミドとしては、下記に記載のベクターを使用することができる。例えば、ノヴァジェン社のｐＥＴ１５ｂベクターなどを使用することができる。
発現用ベクターとしてはｐＥＴ１５ｂ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３））、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バクテリオファージλ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細胞）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性細胞）、ｐＬＡＦＲＩ（グラム陰性細胞）、ｐＭＥ２９０（非Ｅ．ｃｏｌｉグラム陰性細胞）、ｐＨＶ１４（Ｅ．ｃｏｌｉおよびバチルス・ズブチリス）、ｐＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプトミセス）、ｐＵＣ６（ストレプトミセス）、Ｙｉｐ５（サッカロミセス）、バキュロウイルス昆虫細胞系、Ｙｃｐ１９（サッカロミスス）などが挙げられる。特に、ベクターとしてはｐＥＴ１５ｂ、宿主細胞としてはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の組合わせが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを意味する。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のＨＩＶインテグラーゼまたはその欠失体、置換体、付加体のアミノ酸配列により特徴づけられるＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチドを意味する。
また、本発明のポリヌクレオチドは、ＨＩＶのＲＮＡゲノム中に含まれる一部であってもよく、ＨＩＶ持続感染細胞のＤＮＡゲノムの中の一部であってもよい。
なお、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態、または例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖のいずれであってもよく、一本鎖の場合、コーディング鎖または非コーディング鎖（アンチセンス鎖）であってよい。
本発明のＨＩＶインテグラーゼをコードするコーディング配列は、ＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチドであれば、特に特定の核酸配列に限定されるものではない。すなわち、同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列であれば、すべての核酸配列が含まれる。
例えば、配列表の配列番号５または６記載の核酸配列において、１８７番目のＣがＧ、１９６番目のＡがＧ、１９７番目のＣがＴ、２２０番目のＴがＡ、３５２番目のＧがＡ、４３３番目のＣがＴ、４３７番目のＡがＧ、４４２番目のＣがＡ、４５１番目のＡがＴ、４５８番目のＣがＡ、４６２番目のＧがＡ、４６４番目のＡがＧまたはＣ、および／または７４５番目のＧがＡに置換された核酸配列を有するポリヌクレオチドが例示される。なお、配列表の配列番号５記載の核酸配列は野性株（ＮＬ４３）のインテグラーゼ部位をコードする核酸配列であり、配列番号６記載の核酸配列は野性株のアミノ酸配列を変化させずに制限酵素部位（ＸｂａＩとＣｌａＩ）を導入した核酸配列である。
なお、上記は具体例であり、遺伝暗号の縮重の結果、異なる核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
なお、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書開示のＤＮＡ配列により特徴づけられるコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変種であるコーディング配列を有していてもよい。当該分野において知られているように、対立遺伝子変種は、１個またはそれ以上のヌクレオチドが置換、欠失または付加されていてもよいポリヌクレオチド配列の別形態であり、コードされているポリペプチドの機能を実質的に変化させないものである。
また、本発明のＨＩＶインテグラーゼを細胞に発現させる場合、以下の配列を含んでいてもよい。すなわち、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコーディング配列のみを含むものであってもよく、あるいは成熟ポリペプチドのコーディング配列ならびにリーダー配列または分泌配列またはプロ蛋白配列のごときさらなるコーディング配列を含むものであってもよい。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコーディング配列および／または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
それゆえ、本発明は、成熟ポリペプチドのコーディング配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を促進するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列）にフレーム中で融合していてもよいポリヌクレオチドを包含する。
リーダー配列を有するポリペプチドはプレ蛋白であり、宿主細胞により開裂されてポリペプチドのプロ蛋白を生じる。ポリヌクレオチドはプロ蛋白をコードしていてもよく、プロ蛋白は成熟蛋白とさらなるＮ末アミノ酸残基とからなる。プロ配列を有する成熟蛋白が開裂されると活性成熟蛋白が残る。
よって、例えば、本発明ポリヌクレオチドは成熟蛋白をコードしていてもよく、あるいはプロ配列を有する蛋白またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有する蛋白をコードしていてもよい。
本発明ポリヌクレオチドは、遺伝子の５’または３’末端のいずれかにおいて、本発明ポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にフレーム中で融合したコーディング配列を有していてもよい。マーカー配列は、ｐＥＴシリーズのベクター（ノヴァジェン社により市販）により提供されるヘキサ−ヒスチジンタグであってもよく、該タグは細菌宿主の場合にマーカーに融合したポリペプチドの精製を可能にする。
本発明のポリヌクレオチドは、ＨＩＶのＲＮＡゲノムを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ法またはｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法等を用いて大量に複製することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、増殖可能なＨＩＶを構成することができるポリヌクレオチドが好ましい。増殖可能なＨＩＶを構成することができるポリヌクレオチドか否かは、本発明のポリヌクレオチドを含有するプラスミドを作製し、細胞に導入してウイルスを産生させ、そのウイルスを細胞に感染させてその増殖能を調べればよい。
本発明のベクターまたはプラスミドは、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを意味し、本発明のポリヌクレオチドを制限酵素、ＤＮＡリガーゼを用いて、市販のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージなど）に導入することにより作製することができる。
制限酵素としては、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩなどを使用することができる。ＤＮＡリガ、ーゼとしては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどを使用することができる。
ベクターとしては、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド、及びファージＤＮＡの組合わせに由来するベクターを意味するが、宿主細胞中で複製可能ある限り、上記以外のベクターを使用してもよい。ベクターとしては、例えば、細菌ベクターとして、ｐＥＴ１５ｂベクター、ｐＥＴ３ベクター、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅ ｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｄｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられ、真核細胞ベクターとして、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬが挙げられる。特に、ノヴァジェン社のｐＥＴ１５ｂベクターが好ましい。
ポリヌクレオチドのベクターへの挿入は、様々の方法が知られているが、例えば、ポリヌクレオチドをベクターの適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター中のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ合成を指令する適当なプロモーターに作動可能に連結される。プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃまたはｔｒｐ、ラムダファージのＰｔプロモーター、原核細胞、真核細胞、またはそれらのウイルスにおいて遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。
さらにベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、転写ターミネーター、発現増幅のための適当な核酸配列を含んでいてもよい。
ベクターは、形質転換宿主細胞の選択のための表現型を付与する１またはそれ以上の選択可能マーカーを含んでいてもよい。マーカーとしては、例えば、真核培養細胞においてはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子を使用することができ、大腸菌においてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子を使用することができる。
本発明のＨＩＶは、本発明のＨＩＶインテグラーゼまたは本発明のポリヌクレオチドを含有するＨＩＶを意味する。
本発明のＨＩＶは、以下のように作製できる、すなわち、モレキュラークローンｐＮＬ４３のインテグラーゼ部分の配列のみを上記シークエンスに基づき作製されたＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）で置換したプラスミドを作製し、細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に取り込ませ、目的の変異を持つＨＩＶインテグラーゼを有するＨＩＶのウイルスクローンを作製すればよい。
本発明のＨＩＶが持続感染した細胞は、本発明のＨＩＶが持続感染した細胞を意味する。
本発明のＨＩＶが持続感染した細胞は、本発明のベクターまたはプラスミドを、ＨＩＶ形成に必要な他の酵素等をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドＤＮＡと共に、細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に取り込ませることにより作製することができる。また、細胞に本発明のＨＩＶを感染させることによっても作製することができる。細胞としては、ヒトＴ細胞等を用いることができる。
本発明のプローブまたはプライマーは、本発明のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーを意味する。
本発明のポリヌクレオチドを検出または複製するために使用されるプローブまたはプライマーであり、本発明のポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブまたはプライマーであれば、特に限定するものではない。すなわち、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドの核酸配列にハイブリダイズするプローブまたはプライマーであればよい。また、変異部位の検出に使用する場合は、変異部位を含む７〜２０アミノ酸をコードするポリヌクレオチドに相補的なプローブまたはプライマーが好ましい。
ストリンジェントな条件でハイブリダズするプローブまたはプライマーとは、配列間の同一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％である場合にハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。例えば、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトワウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものなどが挙げられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）、とりわけその第１１章に実例が示されている。
本発明のポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブまたはプライマーとは、野性株に結合せず、変異株（耐性変異株）に結合するプローブまたはプライマーを意味する。
また、本発明のプローブまたはプライマーを使用して、本発明のＨＩＶを検出することができる。特に、野性株と変異株を区別して検出する方法が好ましく、例えば、以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とするＨＩＶの検出法が好ましい；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からトレオニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からフェニルアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からセリンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からアスパラギン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異。
さらに詳しくは、以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とするＨＩＶの検出法が好ましい；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からバリンをコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からイソロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からメチオニンをコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミンをコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からリジンをコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からリジンまたはアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からロイシンをコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンをコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアスパラギンをコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異。
本発明の検出法は、上記化合物Ａ〜Ｆを含有するＨＩＶインテグラーゼ阻害剤の投薬患者から得られたＨＩＶの検出のみならず、他のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤の投薬患者、あるいは全く未投与の患者から得られたＨＩＶの検出法としても使用できる。
具体的には、耐性変異の配列を内部に持ったＤＮＡやＲＮＡ、または耐性変異部位は含まず、その直前または直後の配列を持つＤＮＡやＲＮＡをプローブや鋳型に用いたハイブリダイゼーション法やオリゴヌクレオチドライゲイション法とそれらの応用法、耐性変異の配列を持ったＤＮＡやＲＮＡをプライマーに用いたＲＴ−ＰＣＲ法またはＰＣＲ法、耐性変異部位の５’側直前の配列を持つＤＮＡやＲＮＡをプライマーにした伸長反応を応用した方法などにより検出することができる（▲１▼中村祐輔．（２０００）ＳＮＰ：その重要性と解析法．実験医学．ｖｏｌ．１８，ｐ１５８７−１５９４．▲２▼西村俊秀、須田三記也．（２０００）ＳＮＰタイピング技術の現状と将来．実験医学．ｖｏｌ．１８，ｐ１８９４−１９００．）。
また、上記とは別の薬剤耐性ＨＩＶ検出法としては、以下の検出法が挙げられる。まず、ＨＩＶ感染者からＨＩＶまたは持続感染細胞を得、次にインテグラーゼ阻害剤（化合物Ａ〜Ｆ）に対する感受性をインビトロで測定し、そのインテグラーゼ阻害剤によってどの程度増殖が阻止されているかを薬剤非存在下と比較し、そのインテグラーゼ阻害剤に対する感受性が低下していれば、該ＨＩＶは薬剤耐性を獲得しているといえる。すなわち、この検出法により、該ＨＩＶが、本発明において明らかになった変異（例えば、表１に記載の変異）を有していると結論できる。
本発明のＨＩＶおよび本発明のＨＩＶが持続感染した細胞は、アッセイに用いることができる。すなわち、本発明のＨＩＶを細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に感染させ、または本発明のＨＩＶが持続感染した細胞（例えば、ヒトＴ細胞）を使用し、当業者に広く知られているＭＴＴアッセイを行えばよい。このようなアッセイにより、本発明のＨＩＶであるＨＩＶインテグラーゼ阻害剤耐性ＨＩＶに対しても有効な化合物や薬剤を見い出すことができる。この際、ＥＣ５０値（ウイルスによる細胞障害を５０％抑制する化合物濃度）とＣＣ５０値（化合物による細胞毒性が５０％である化合物濃度）を比較することにより、有効な化合物を選択することができる。また、ＨＩＶの野性株に対しても同時に活性を測定し、耐性株に対する活性と比較することにより、その化合物や薬剤の有用性をさらに検討することができる。また、耐性株そのものを用いる以外に以下のような方法でアッセイを行っても良い。すなわち、インテグレーション活性が欠損しているＨＩＶに、インテグラーゼのみを別の分子として発現させたものを取り込ませることによりインテグレーション活性が相補されてウイルスの感染が成立することが知られている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２５５，１９９９，ｐ７７−８５，Ａ ｎｏｖｅｌ Ｖｐｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｔｅｇｒａｓｅ（ＩＮ）ｒｅｓｔｏｒｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＩＮ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＨＩＶ−１ ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｊ．Ｋｕｌｋｏｓｋｙ，Ｍ．ＢｏｕＨａｍｄａｎ，Ａ．Ｇｅｉｓｉｔ，Ｒ．Ｊ．Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ）。ただし、ウイルス粒子にインテグラーゼを取り込ませるために、インテグラーゼのＮ末端にたとえばＶｐｒが融合された形で発現させるなどの工夫が必要である。この方法を用いれば耐性株を用いなくともインテグラーゼに対する耐性変異の影響を簡単に調べることができる。
また、本発明のＨＩＶインテグラーゼも、本発明のＨＩＶ、本発明のＨＩＶが持続感染した細胞同様、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤（または活性化剤）探索のためのアッセイに使用することができる。すなわち、被験化合物がＨＩＶインテグラーゼと結合または相互作用し、ＨＩＶインテグラーゼ活性を阻害（または活性化）するか否かを測定すればよい。本アッセイ法は、被験化合物とＨＩＶインテグラーゼとの結合または相互作用が可能な条件下で、被験化合物とＨＩＶインテグラーゼを接触させ、被験化合物とＨＩＶインテグラーゼの結合または相互作用によるＨＩＶインテグラーゼ活性の変化を測定し、ＨＩＶインテグラーゼを阻害するか否かを評価することにより行うことができる。例えば、基質ＤＮＡとターゲットＤＮＡを使用し、被験化合物とＨＩＶインテグラーゼの結合または相互作用により、ＨＩＶインテグラーゼによる基質ＤＮＡのターゲットＤＮＡへの組み込みの減少を測定すればよい。
このようなアッセイ法としては、具体的には、ＷＯ００／３９０８６に記載のアッセイ法が挙げられる。本発明の耐性変異を持つＨＩＶインテグラーゼを、ＷＯ００／３９０８６に記載の野生型のインテグラーゼの代わりに通常の反応バッファーに添加するだけで全く同じ方法でアッセイに用いることができる。このようなアッセイにより、既存の薬剤耐性ＨＩＶに対しても有効な化合物や薬剤を見出すことができる。また、野性型インテグラーゼに対しても同時に活性を測定し、耐性変異をもつインテグラーゼに対する活性と比較することにより、その化合物や薬剤の有用性を検討することができる。
なお、これらのアッセイの結果選択される化合物は、例えば、分子量１５〜１０００の有機化合物を意味し、構成原子としては、水素、リチウム、ホウ素、炭素、窒素、酸素、フッ素、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、硫黄、塩素、カリウム、カルシウム、鉄、バリウム、臭素、沃素等が挙げられる。特に、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−または−ＮＨ−で示される基を持つ化合物が好ましい。また、窒素、酸素および硫黄の中から任意に選択される原子を１〜３個有するヘテロ環を有する化合物が好ましい。
上記化合物を有効成分として含有するＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、および該ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤を含有する抗ＨＩＶ剤、エイズ治療剤も本発明に包含される。
上記化合物は、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与による場合、上記化合物は通常の製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤若しくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合、上記化合物は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。その調製に際しては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等を任意に用いることができる。
本発明の製剤は、治療有効量の上記化合物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに組み合わせる（例えば混合する）ことによって製造される。上記化合物の製剤は、周知の、容易に入手できる成分を用いて既知の方法により製造される。
上記化合物の医薬組成物を製造する際、活性成分は担体と混合されるかまたは担体で希釈されるか、カプセル、サッシェー、紙、あるいは他の容器の形態をしている担体中に入れられる。担体が希釈剤として働く時、担体は媒体として働く固体、半固体、または液体の材料であり、それらは錠剤、丸剤、粉末剤、口中剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（液体媒質中の固体）、軟膏にすることができ、例えば、１０％までの活性化合物を含む。本発明化合物は投与に先立ち、製剤化するのが好ましい。
当業者には公知の適当な担体はいずれもこの製剤のために使用できる。このような製剤では担体は、固体、液体、または固体と液体の混合物である。例えば、静脈注射のために本発明化合物を２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、４％デキストロース／０．５％クエン酸ナトリウム水溶液中に溶解する。固形の製剤は粉末、錠剤およびカプセルを包含する。固形担体は、香料、滑沢剤、溶解剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤、カプセル剤にする材料としても役立つ１またはそれ以上の物質である。経口投与のための錠剤は、トウモロコシデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、および／またはゼラチン、アカシアなどの結合剤、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、滑石などの滑沢剤とともに炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムなどの適当な賦形剤を含む。
粉末剤では担体は細かく粉砕された活性成分と混合された、細かく粉砕された固体である。錠剤では活性成分は、適当な比率で、必要な結合性を持った担体と混合されており、所望の形と大きさに固められている。粉末剤および錠剤は約１〜約９９重量％の本発明の新規化合物である活性成分を含んでいる。適当な固形担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、ココアバターである。
液体製剤は懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む。活性成分は、滅菌水、滅菌有機溶媒、または両者の混合物などの製薬上許容し得る担体中に溶解または懸濁することができる。活性成分はしばしば適切な有機溶媒、例えばプロピレングリコール水溶液中に溶解することができる。水性デンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液、または適切な油中に細かく砕いた活性成分を散布することによってその他の組成物を製造することもできる。
上記化合物の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、状態及び疾患の種類によっても異なるが、通常、経口投与の場合、成人１日あたり約０．０５ｍｇ〜３０００ｍｇ、好ましくは、約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇを、要すれば分割して投与すればよい。また、非経口投与の場合、成人１日あたり約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜５００ｍｇを投与する。
実施例
実施例１ ＨＩＶインテグラーゼをコードする遺伝子の変異部位の確認
１．ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ持続感染細胞である、ＩＩＩＢ／Ｍｏｌｔ−４細胞（約１ｘ１０５／ｍｌ）とＭＴ−２細胞を（約３ｘ１０５／ｍｌ）を混合し（細胞比 約１：３）、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％に設定）で３日間培養した。混合３日後の、ＨＩＶが増殖し巨細胞が出現している状態の感染細胞を耐性ウイルス分離用のウイルスとした。
２．ＭＴ−２細胞を培養液で約３ｘ１０５／ｍｌに分散し、２４ｗｅｌｌプレートに１ｍｌずつ分注した。同様に、巨細胞出現後の感染細胞（上記参照）を適度に希釈し、０．５ｍｌづつ分注した。希釈した被験試料を添加してプレートミキサーで混和後、ＣＯ２インキュベーターで培養した。
３．感染３−４日目に感染細胞中のＨＩＶによる巨細胞形成の有無を確認した。培養上清１ｍｌを新たなプレートに分注し、新たなＭＴ−２細胞（約２ｘ１０５／ｗｅｌｌ）、培養液、薬剤を添加した。３−４日おきに細胞を観察し、このウイルスの継代操作を繰り返した。この時、強度の巨細胞形成が出現していた時は培養上清０．５ｍｌ、その他の場合は感染細胞０．５ｍｌを継代に用いた。細胞を継代する場合、ＭＴ−２細胞の添加量は適宜調節した。各ｗｅｌｌの培養液量は、約１．５−２．０ｍｌで行った。
４．細胞の継代時に、その薬剤の濃度において明らかな強度の巨細胞形成が繰り返して出現した時は、継代時に薬剤濃度を５倍量に上げ、再度培養を続けた。この操作を繰り返し、薬剤濃度を徐々に上げていった。最終的に薬剤濃度４，０００−１０，０００ｎｇ／ｍｌにおいてＨＩＶが増殖可能となるまで続けた。この間、約１週間おきに培養液、感染細胞をサンプリングした。
５．採取した感染細胞について、ＤＮＡ抽出キットを用いてプロウイルスゲノムＤＮＡを抽出した。インテグラーゼ領域の両側の２本のプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡに関してシークエンスを行った。
以下の表に使用した薬剤と変異部位を示す。
下記に、代表的なｍｕｔａｎｔの作製法を示す。クローンは、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅであるｐＮＬ４３２を用いた。予め、インテグラーゼに変異を導入しやすいように、ｐＮＬ４３２のインテグレースの最初の位置にＸｂａＩを作製したものを用いた（以降、ＮＬ４３２ Ｘｂａとする）。
１．Ｔ６６Ｉ ｍｕｔａｎｔの作製法
化合物Ｃ耐性ウイルス（ＮＬ４３２）より得られたインテグレースＴ６６ＩのｍｕｔａｎｔウイルスＤＮＡをテンプレートにして、下記に示すプライマ−ＩＮＴ−Ｘｂａ、ｖｐｒ−ＥｃｏでＰＣＲを行った。これで得られた断片をＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩでカットし、ＮＬ４３２ Ｘｂａの同領域と置き換えた。
ｐＮＬ４３２をテンプレートにして、下記のプライマ−ＩＮＴ−Ｘｂａ、１２４Ａ Ｂａｍ（−）でＰＣＲを行い、これで得られた断片をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩでカットした（＝ＸｂＢａ１２４Ａ）。またｐＮＬ４３２をテンプレートにして、下記のプライマ−１２４Ａ Ｂａｍ（＋）、ｖｐｒ−ＥｃｏでＰＣＲを行い、これで得られた断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでカットした（＝ＢａＥｃ１２４Ａ）。続いてＸｂＢａ１２４Ａ、ＢａＥｃ１２４Ａ断片をライゲーションさせた後に、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩへクローニングした。このプラスミドをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩでカットし、その断片をｐＮＬ４３２ Ｘｂａの同領域と置き換えた。
ｐＮＬ４３２をテンプレートにして、下記のプライマ−ＩＮＴ−Ｘｂａ、１４８Ｋ Ｂａｍ（−）でＰＣＲを行い、これで得られた断片をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩでカットした（＝ＸｂＢａ１４８Ｋ）。また、ｐＮＬ４３２をテンプレートにしてプライマ−１４８Ｋ Ｂａｍ（＋）、ｖｐｒ−ＥｃｏでＰＣＲを行い、これで得られた断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでカットした（＝ＢａＥｃ１４８Ｋ）。続いてＸｂＢａ１４８Ｋ、ＢａＥｃ１４８Ｋ断片をライゲーションさせた後、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩへクローニングした。このプラスミドを、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩでカットし、その断片をｐＮＬ４３２ Ｘｂａの同領域と置き換えた。
ｐＮＬ４３２をテンプレートにして、下記のプライマ−ＩＮＴ−Ｘｂａ、１５５Ｓ Ｓａｃ（−）でＰＣＲを行い、これで得られた断片をＸｂａＩ／ＳａｃＩでカットした（＝ＸｂＳａ１５５Ｓ）。また、ｐＮＬ４３２をテンプレートにしてプライマ−１５５Ｓ Ｓａｃ（＋）、ｖｐｒ−ＥｃｏでＰＣＲを行い、これで得られた断片をＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩでカットした（＝ＳａＥｃ１５５Ｓ）。続いてＸｂＳａ１５５Ｓ、ＳａＥｃ１５５Ｓ断片をライゲーションさせた後、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩへクローニングした。このプラスミドを、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩでカットし、その断片をｐＮＬ４３２ Ｘｂａの同領域と置き換えた。
実施例３ ＨＩＶインテグラーゼをコードする核酸の作製法
本発明の変異を持つ耐性ウイルスのモレキュラークローンＤＮＡ５ｎｇを鋳型にして、制限酵素部位ＮｄｅＩ（５’側）とＢａｍＨＩ（３’側）を付加できるように設計されたプライマー（５’−ｇｇＣ ＡｇＣ ＣＡＴ ＡＴｇ ＴＴＴ ＴＴＡ ｇＡＴ ｇｇＡ ＡＴＡ ｇＡＴ ＡＡｇ ｇＣＣ Ｃ−３’（配列番号：３１）と５’−ｇＣＡ ｇＣＣ ｇｇＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＴｇ ＴＣＴ ＡＣＴ ＴｇＣ ＣＡＣ−３’（配列番号：３２））と東洋紡社より購入したＫＯＤ ｄａｓｈ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて本発明の変異を持つインテグラーゼをコードするＤＮＡ断片を増幅した。反応条件は１０μｌの１０ｘＫＯＤ ｂｕｆｆｅｒ（組成：１．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ ＫＣｌ，６０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、１６μｌのｄＮＴＰ混合液（各々２ｍＭ）、プライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ１μｌづつ、鋳型ＤＮＡを５ｎｇ分、最後にＫＯＤ ｄａｓｈ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕｎｉｔｓ／μｌ）を１．５μｌ入れて１００μｌのスケールで９４℃、３０ｓｅｃ．、５２℃、３０ｓｅｃ．、７４℃、３０ｓｅｃ．のサイクルを３０回行った。
実施例４ 変異ＨＩＶインテグラーゼの作製法
前項の実施例で増幅した本発明の変異を含むインテグラーゼをコードするＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断してから１％アガロースゲルに電気泳動を行い、イルミネーター上でバンドを検出して切り出し精製した。他方ノヴァジェン社のｐＥＴ１５ｂベクターも同様に制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲルに電気泳動することにより余分なＤＮＡ断片を取り除いた。これらの耐性インテグラーゼをコードするＤＮＡ断片とｐＥＴ１５ｂベクターをＴ４ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いてライゲーションを行い、発現ベクターを構築した。
次に構築した発現ベクターをノヴァジェン社より購入したコンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションを行い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（組成：１０ｍｇ／ｍｌ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ，５ｍｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ，５ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ）にまいて３７℃で終夜培養した。翌日プレートに生えたコロニーを集めて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地（組成：１２ｍｇ／ｍｌ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ，２４ｍｇ／ｍｌ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ，４μｌ／ｍｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２．３１ｍｇ／ｍｌ ＫＨ２ＰＯ４，１２．５４ｍｇ／ｍｌ Ｋ２ＨＰＯ４）中で３０℃で培養を行った。６００ｎｍにおける吸光度が０．８に達した時点で終濃度が０．４ｍＭになるようＩＰＴＧを添加してインテグラーゼの発現を誘導した。発現誘導後は３７℃で３時間培養を行った後に集菌した。集めた菌を溶解バッファー（組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）に溶解して終濃度０．３ｍｇ／ｍｌになるようにライソザイムを加えて氷上で３０分間インキュベーションを行った。ダウンス型ホモジュナイザーで破砕後、超遠心（条件：４℃、６０分、４００００ ｘ ｇ）を行った。沈殿物を５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む可溶化バッファー（組成：２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２），４００ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｅｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＮＰ−４０，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，４Ｍ ｕｒｅａ）に溶解して０．２２−μＭのフイルターに通した後にニッケルキレートアフィニティーゲル（アマシャムファルマシアバイオテック）にアプライした。洗浄バッファー（組成：４０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２），４００ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｅｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＮＰ−４０，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，４Ｍ ｕｒｅａ）でカラムを洗浄後、３００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む可溶化バッファーで溶出した。溶出されたフラクションを１０００倍量の１０ｍＭ ＤＴＴを含む可溶化バッファーに対して２回透析し、インテグレーション活性を調べた。
実施例５ 変異ＨＩＶウイルス検出法
本発明の耐性ウイルス検出例（Ｔ６６Ｉの場合）を以下に示す方法に基づき実施した。
（１）プロウイルスＤＮＡを用いた検出法
合成した表２の各ＤＮＡをＴＥバッファー（組成：１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．６））に溶解させ、プライマー溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を調製した。野生型を検出する場合はＲＷＴ−２（５’−ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＧＴＡ Ｃ−３’（配列番号：３３））とＲＲＷ−１（５’−ＣＴＡ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＴＡ ＣＴＴ ＧＴＧ ＴＧＣ−３’（配列番号：３４））のプライマーを、耐性変異型を検出する場合はＲＭ−２（３’−Ｇ ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＣＡＡ Ｔ−５’（配列番号：３５））とＲＲＷ−１のプライマーを各々０．５μｌ用いた。０．５ｕｎｉｔｓのＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭと３μｌの添付バッファー（組成：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）とｄＮＴＰ混合液（各々２．５ｍＭ）を混ぜて２８μｌの反応液を作製し、様々な濃度の鋳型ＤＮＡを含む溶液２μｌを加えた。ミネラルオイルを一滴ずつ加えてからシータス社の機械を用いて、野生型を検出する場合は９４℃、１ｍｉｎ．、５７℃、３０ｓｅｃ．、７２℃、３０ｓｅｃ．のサイクルを３０回の条件で、耐性変異型を検出する場合は９４℃、１ｍｉｎ．、６０℃、３０ｓｅｃ．、７２℃、３０ｓｅｃ．のサイクルを２７回繰り返す反応条件でＰＣＲ反応を行った。野生型ウイルスＤＮＡの鋳型としてはモレキュラークローンｐＮＬ４３２を用いた（Ａｄａｃｈｉ，Ａ．，Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｋｏｅｎｉｇ，Ｓ．，Ｆｏｌｋｓ，Ｔ．，Ｗｉｌｌｅｙ，Ｒ．，Ｒｏｂｓｏｎ，Ａ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ａ．（１９８６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．５９，ｐ２８４−２９１．）。耐性ウイルスＤＮＡの鋳型としてはｐＮＬ４３２のインテグラーゼ部分のアミノ酸配列にのみＴ６６Ｉ、Ｌ７４Ｍ（ＡＣＡ→ＡＴＡ、ＴＴＧ→ＡＴＧ）の変異を持つモレキュラークローンｐＴＹＩ−３０２を用いた。ＰＣＲ反応後の反応液５μｌを１％アガロースゲルに電気泳動し、下方よりＵＶを照射しながらバンドを検出することにより結果を判定した。その結果、野生型検出の場合は０．０００２ｎｇ／３０μｌ以上の濃度のｐＮＬ４３２を鋳型として用いた場合のみ検出でき、ｐＴＹＩ−３０２を鋳型とした場合は検出されなかった。逆に耐性変異型検出の場合は０．０００２ｎｇ／３０μｌ以上の濃度のｐＴＹＩ−３０２を鋳型として用いた場合のみ検出でき、ｐＮＬ４３２を鋳型として用いた場合は検出されなかった。
実施例６ 変異ＨＩＶインテグラーゼを使用したアッセイ
本発明の耐性変異を持つインテグラーゼを用いて以下に示す野生型の場合と同じアッセイ法に基づき種々の化合物の阻害活性を調べた。
（１）ＤＮＡ溶液の調製
アマシャムファルマシア社により合成された以下の各ＤＮＡを、ＫＴＥバッファー液（組成：１００ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．６））に溶解させることにより、基質ＤＮＡ溶液（２ｐｍｏｌ／μｌ）およびターゲットＤＮＡ溶液（５ｐｍｏｌ／μｌ）を調製した。各溶液は、一旦煮沸後、ゆるやかに温度を下げて相補鎖同士をアニーリングさせてから用いた。
（基質ＤＮＡ配列）
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を０．１Ｍ炭酸バッファー液（組成：９０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３，１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３）に溶かし、濃度を４０μｇ／ｍｌにした。この溶液、各５０μｌをイムノプレート（ＮＵＮＣ社製）のウエルに加え、４℃で一夜静置、吸着させる。次に各ウエルを燐酸バッファー（組成：１３．７ｍＭ ＮａＣｌ，０．２７ｍＭ ＫＣｌ，０．４３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．１４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で２回洗浄後、１％スキムミルクを含む燐酸バッファー３００μｌを加え、３０分間ブロッキングした。さらに各ウエルを燐酸バッファーで２回洗浄後、基質ＤＮＡ溶液（２ｐｍｏｌ／μｌ）５０μｌを加え、振盪下、室温で３０分間吸着させた後、燐酸バッファーで２回、次いで蒸留水で１回洗浄した。
次に上記方法で調製した各ウエルに、バッファー（組成：１５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２），７５ｍＭ ＭｎＣｌ２，５０ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，２５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，５００μｇ／ｍｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ−ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）１２μｌ、ターゲットＤＮＡ（５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌおよび蒸留水３２μｌから調製した反応溶液４５μｌを加えた。さらに各ウエルに被検化合物のＤＭＳＯ溶液６μｌを加え、ポジティブコントロール（ＰＣ）としてのウエルには、ＤＭＳＯ ６μｌを加える。次に耐性インテグラーゼ溶液（３０ｐｍｏｌ）９μｌを加え、良く混合した。ネガティブコントロール（ＮＣ）としてのウエルには，希釈液（組成：２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２），４００ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｅｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＮＰ−４０，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，４Ｍ ｕｒｅａ）９μｌを加えた。
各プレートを３０℃で１時間インキュベート後、反応液を捨て、燐酸バッファーで２回洗浄した。次にアルカリフォスファターゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗体（ヒツジＦａｂフラグメント：ベーリンガー社製）を１００μｌ加え、３０℃で１時間結合させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む燐酸バッファーで２回、燐酸バッファーで１回、順次洗浄した。次に、アルカリフォスファターゼ呈色バッファー（組成：１０ｍＭパラニトロフェニルホスフェート（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製），５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ９．５））を１５０μｌ加えて３０℃で２時間反応させ、１Ｎ ＮａＯＨ溶液５０μｌを加え反応を止めた後、各ウエルの吸光度（ＯＤ４０５ｎｍ）を測定し、以下の計算式に従い阻害率を求めた。
阻害率（％）＝１００［１−｛（Ｃ ａｂｓ．−ＮＣ ａｂｓ．）／（ＰＣ ａｂｓ．−ＮＣ ａｂｓ．）｝］
Ｃ ａｂｓ．；化合物のウエルの吸光度
ＮＣ ａｂｓ．：ＮＣの吸光度
ＰＣ ａｂｓ．：ＰＣの吸光度
なお、ＩＣ５０値は、上記の阻害率を用いて以下の計算式で求められる。すなわち阻害率５０％をはさむ２点の濃度において、ｘμｇ／ｍｌの濃度で阻害率Ｘ％、ｙμｇ／ｍｌの濃度で阻害率Ｙ％をそれぞれ示す時、ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）＝ｘ−｛（Ｘ−５０）（ｘ−ｙ）／（Ｘ−Ｙ）｝となる。
実施例７ ＨＩＶ変異株を使用したアッセイ
（１） ＨＩＶ変異株持続感染ヒトＴ細胞株Ｍｏｌｔ−４ｃｌｏｎｅ８を１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、上清を濾過してウイルスの力価を測定し、−８０℃で保存した。他方、被検化合物を上記の培養培地で所定の濃度になるように希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ分注する。次にＭＴ−４細胞浮遊液を５０μｌ（２．５×１０４細胞）ずつを分注し、更に上記ＨＩＶ含有上清を上記の培養培地で希釈したものを５０μｌ（６００ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ））ずつ加えた。
（２） 炭酸ガス培養器内で３７℃で５日間培養した後、全てのウエルにＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）５ｍｇ／ｍｌ，ＰＢＳ）を３０μｌずつ加え、更に１時間培養した。このとき、生存する細胞はＭＴＴを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を１５０μｌずつ取り除き、代わりに１５０μｌの溶解液（１０％トリトンＸ−１００及び０．４％（Ｖ／Ｖ）ＨＣｌ添加イソプロパノール）を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをＯＤ５６０ｎｍで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞障害を５０％抑制する化合物濃度をＥＣ５０とした。
（３） 上記（１）において、ＨＩＶ含有上清（ウイルス液）の代わりに各ウェルに培養培地５０μｌずつ加え、（２）と同様に処理し化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が５０％である化合物濃度をＣＣ５０とした。
産業上の利用可能性
本発明のＨＩＶまたはＨＩＶインテグラーゼは、薬剤耐性ＨＩＶに対する阻害剤のアッセイ法に使用することができ、有用である。また、本発明のＨＩＶインテグラーゼをコードする核酸またはそれらを含む核酸配列に相補的なプローブまたはプライマーは、薬剤耐性ＨＩＶ検出法に使用することができ、有用である。
【配列表】
Claims (22)
- ６４番目および１１６番目のアミノ酸がアスパラギン酸であり、１５２番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有するＨＩＶインテグラーゼ；
（ａ）６３番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がトレオニン以外のアミノ酸である；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸である；
（ｅ）７４番目がロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸である；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｇ）１１８番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である；
（ｉ）１３８番目のアミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸である；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸である；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸である；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がグルタミン以外のアミノ酸である；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸である；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がセリンおよびアラニン以外のアミノ酸である；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸である；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸である；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がバリンおよびロイシン以外のアミノ酸である；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸である；
ただし、配列表の配列番号７〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＨＩＶインテグラーゼは除く。 - 以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つの変異を有する請求の範囲第１項記載のＨＩＶインテグラーゼ；
（ａ）６３番目のアミノ酸がバリンである；
（ｂ）６６番目のアミノ酸がイソロイシンまたはアラニンである；
（ｃ）７０番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｄ）７２番目のアミノ酸がアラニンである；
（ｅ）７４番目のアミノ酸がメチオニンである；
（ｆ）９２番目のアミノ酸がグルタミンである；
（ｇ）１１８番目のアミノ酸がセリンである；
（ｈ）１２１番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｉ）１３８番目のアミノ酸がリジンである；
（ｊ）１４０番目のアミノ酸がセリンである；
（ｋ）１４５番目のアミノ酸がセリンである；
（ｌ）１４６番目のアミノ酸がアルギニンである；
（ｍ）１４８番目のアミノ酸がリジンまたはアルギニンである；
（ｎ）１５１番目のアミノ酸がロイシンである；
（ｏ）１５３番目のアミノ酸がチロシンである；
（ｐ）１５５番目のアミノ酸がセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンである；
（ｑ）１６０番目のアミノ酸がアスパラギンである；
（ｒ）２４９番目のアミノ酸がイソロイシンである；および
（ｓ）２５０番目のアミノ酸がイソロイシンである。 - １２番目および１６番目のアミノ酸がヒスチジンであり、４０番目および４３番目のアミノ酸がシステインであり、かつ１５６番目および１５９番目のアミノ酸がリジンである請求の範囲第１項または第２項記載のＨＩＶインテグラーゼ。
- 配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１以上の請求の範囲第１項または第２項記載のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼ。
- 請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載のインテグラーゼにおいて、６４番目および１１６番目のアスパラギン酸、１５２番目のグルタミン酸、および任意に選択された変異部位のアミノ酸以外の１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたＨＩＶインテグラーゼ；
ただし、配列表の配列番号７〜２２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するＨＩＶインテグラーゼは除く。 - 増殖可能なＨＩＶを構成することができる請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼ。
- 請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼをコードするポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号５または６記載の核酸配列において、１８７番目のＣがＧ、１９６番目のＡがＧ、１９７番目のＣがＴ、２２０番目のＴがＡ、３５２番目のＧがＡ、４３３番目のＣがＴ、４３７番目のＡがＧ、４４２番目のＣがＡ、４５１番目のＡがＴ、４５８番目のＣがＡ、４６２番目のＧがＡ、４６４番目のＡがＧまたはＣ、および／または７４５番目のＧがＡに置換された核酸配列を有する請求の範囲第７項記載のポリヌクレオチド。
- 増殖可能なＨＩＶを構成することができる請求の範囲第７項または第８項項記載のポリヌクレオチド。
- 請求の範囲第７項または第８項記載のポリヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミド。
- 請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに項記載のＨＩＶインテグラーゼまたは請求の範囲第７項または第８項記載のポリヌクレオチドを含有するＨＩＶ。
- 請求の範囲第１１項記載のＨＩＶが持続感染した細胞。
- 請求の範囲第７項または第８項記載のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得るプローブまたはプライマー。
- 請求の範囲第１３項記載のプローブまたはプライマーを使用したＨＩＶの検出法。
- 以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とする請求の範囲第１４項記載のＨＩＶの検出法；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からトレオニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からグリシンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からバリン、イソロイシンおよびグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からフェニルアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミン酸およびアスパラギン酸以外のアミノ酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からグリシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からグルタミン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびイソロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からセリンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からアスパラギン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からリジン、グルタミン、トレオニンおよびグルタミン酸以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からバリンおよびロイシン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からバリン、ロイシンおよびアラニン以外のアミノ酸をコードする核酸配列への変異。 - 以下に示す群から任意に選択される少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸配列の変異を検出することを特徴とする請求の範囲第１４項または第１５項記載のＨＩＶの検出法；
（ａ）６３番目のロイシンをコードする核酸配列からバリンをコードする核酸配列への変異；
（ｂ）６６番目のトレオニンをコードする核酸配列からイソロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｃ）７０番目のグリシンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｄ）７２番目のバリン、イソロイシンまたはグリシンをコードする核酸配列からアラニンをコードする核酸配列への変異；
（ｅ）７４番目のロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンをコードする核酸配列からメチオニンをコードする核酸配列への変異；
（ｆ）９２番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からグルタミンをコードする核酸配列への変異；
（ｇ）１１８番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｈ）１２１番目のフェニルアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｉ）１３８番目のグルタミン酸またはアスパラギン酸をコードする核酸配列からリジンをコードする核酸配列への変異；
（ｊ）１４０番目のグリシンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｋ）１４５番目のプロリンをコードする核酸配列からセリンをコードする核酸配列への変異；
（ｌ）１４６番目のグルタミンをコードする核酸配列からアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｍ）１４８番目のグルタミンをコードする核酸配列からリジンまたはアルギニンをコードする核酸配列への変異；
（ｎ）１５１番目のバリンまたはイソロイシンをコードする核酸配列からロイシンをコードする核酸配列への変異；
（ｏ）１５３番目のセリンまたはアラニンをコードする核酸配列からチロシンをコードする核酸配列への変異；
（ｐ）１５５番目のアスパラギンをコードする核酸配列からセリン、イソロイシン、トレオニンまたはヒスチジンをコードする核酸配列への変異；
（ｑ）１６０番目のリジン、グルタミン、トレオニンまたはグルタミン酸をコードする核酸配列からアスパラギンをコードする核酸配列への変異；
（ｒ）２４９番目のバリンまたはロイシンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異；および
（ｓ）２５０番目のバリン、ロイシンまたはアラニンをコードする核酸配列からイソロイシンをコードする核酸配列への変異。 - 請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載のＨＩＶインテグラーゼを使用した抗ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法。
- 請求の範囲第１１項記載のＨＩＶを使用した抗ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法。
- 請求の範囲第１２項記載のＨＩＶが持続感染した細胞を使用した抗ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング法。
- 分子量が１５〜１０００であり、水素、リチウム、ホウ素、炭素、窒素、酸素、フッ素、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、硫黄、塩素、カリウム、カルシウム、鉄、バリウム、臭素および沃素からなる群から選択された任意の原子により構成され、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−または−ＮＨ−で示される基を持ち、窒素、酸素および硫黄の中から任意に選択される原子を１〜３個有するヘテロ環を有する、請求の範囲第１７項〜第１９項のいずれかに記載のスクリーニング法により得られた化合物を有効成分として含有するＨＩＶインテグラーゼ阻害剤。
- 請求の範囲第２０項記載のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗ＨＩＶ剤。
- 請求の範囲第２０項記載のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤を有効成分として含有するエイズ治療剤。
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