WO2002034907A1

WO2002034907A1 - Methode de synthese d'acide nucleique simple brin

Info

Publication number: WO2002034907A1
Application number: PCT/JP2001/009452
Authority: WO
Inventors: Kentaro Nagamine; Tetsu Hase; Tsugunori Notomi
Original assignee: Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2002-05-02
Also published as: EP1333089A1; US20060141452A1; AU2001296015A1; CN1483078A; JPWO2002034907A1; EP1333089A4

Description

明細書

1本鎖核酸の合成方法技術分野

本発明は 1本鎖 DNAの合成方法に関する、更に詳しくは 2本鎖丽 Aのうちセンス又はアンチセンス鎖の一方のみを選択的に合成する方法に関する。景技術

ハイブリダィゼーシヨンアツセィのプローブに使用する 1本鎖 DNAの調製方法として最も一般的な方法は、熱又はアルカリによる 2本鎖 DNAの変性によるものである。しかしながら、この方法では生成物中に相補鎖が共存するため、 2 本鎖を形成する条件下におくと相補鎖同士が再結合し、ハイブリダィゼーシヨンの効率が低下することがある。 M13等の 1本鎖ファージを利用したクローニングによる 1本鎖 DNAの調製方法も知られているが、コストや時間がかかるという欠点があ。

数十 base程度の短い 1本鎖 DNAであれば化学合成により容易に合成できるが、 lOObaseを超える長い 1本鎖 DNAを化学合成すると収率や塩基配列の正確さが低下する。また、 T7RNAポリメラーゼは DNAを铸型に 1本鎖 RNAを合成できるが、鐯型 DNAには該酵素が認識するプロモーター配列が必要である。

一方、 W099/09211には、 2本鎖核酸の第 1鎖上の標的配列を増幅する方法であつて、第 1鎖上の標的配列 5'末端部を切断し、かつ該切断により第 2鎖の 3'末端領域が突出するように制限酵素を用いて 2本鎖核酸を切断し、次いで前記第 2鎖の 3'末端に相補的なプライマーと鎖置換型ポリメラーゼを用いて、第 2鎖を铸型とした伸長反応を行わせ、前記標的配列を増幅する方法が開示されている。この方法では、プライマーによる標的領域の合成と同時に制限酵素切断部位も再生される原理になっているが、反応の開始時点で標的領域は該制限酵素切断部位を 5' 末端に有している必要があり、その認識部位の提供については十分な開示はされていない。またこの方法は、 SDA法 (St rand Di splacement Ampl i f icat ion) [Pro Nat l. Acad. Sc i. USA, 89, 392-396 : 1992] [Nucleic Ac id. Res. , 20， 1691—1696 ; e の改良法であって、本来 2本鎖 DMの増幅を目的としたものである。したがつて、切断によって生じるそれぞれの 3'側突出部の配列が同一（回文配列）の場合には、単一のプライマ一のみを使用してもセンス鎖、アンチセンス鎖の両方が合成されてしまう。つまり、この方法は必ずしも 1本鎖 DNAを提供するものではない。

なお、ここで SDA法について若干の説明を加えておく。 SDA法は、ある塩基配列の 3'側に相補的なプライマーを合成起点として相補鎖合成を行うときに、 5'側に 2本鎖の領域が有るとその鎖を置換しながら相補鎖の合成を行う特殊な DNAポリメラーゼを利用する方法である。 SDA法では、プライマーとしてァニールさせた配列に予め制限酵素認識配列を挿入しておくことによって、 PCR法においては必須となっている温度変化工程の省略を実現できる。すなわち、制限酵素によってもたらされるニックが相補鎖合成の起点となる 3' - 0H基を与え、そこから鎖置換合成を行うことによって先に合成された相補鎖が 1本鎖として遊離して次の相補鎖合成の鍀型として再利用される。このように SDA法は PCR法で必須となつていた複雑な温度制御を不要とした。発明の開示

本発明が解決すべき課題は、比較的長いセンス又はアンチセンス鎖の一方を選択的かつ効率的に合成する方法を提供することである。

本発明者らは鋭意検討した結果、 L崖 P法を応用した DNA増幅方法と「3'末端が突出した断片を形成し、かつ切断後のそれぞれの断片の 1本鎖領域の塩基配列が異なるように切断可能な制限酵素」を用いることにより、 1 本鎖核酸を選択的かつ効率的に合成しうることを見出し本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の構成からなる。

(1) 以下の工程からなる 1本鎖核酸の合成方法。

1) 標的配列よりも 5 ' 側に制限酵素認識配列を有する 2本鎖 DNAを、

a) 3'末端が突出した断片を形成し、かつ

b) 切断後のそれぞれの断片の 1本鎖領域の塩基配列が異なるように制限酵素で切断する工程。

2) 制限酵素により切断された DNA断片の 1本鎖領域に、少なくとも 3'末端にその領域に相補的な塩基配列を持つプライマーをァニールさせる工程。

3) プライマーの 3'末端を起点に鎖置換型ポリメラーゼにより核酸を合成する工程。

(2) 前記制限酵素認識配列を有する 2本鎖 DNAが、以下の工程を含む方法によつて提供されることを特徴とする、上記（1)記載の方法。

1) 該制限酵素認識配列をクローニングサイトの中に、あるいはクローニングサイ卜に隣接して有するベクターを用いて増幅すべき丽 Aをクローニングする工程

2) 該制限酵素認識配列上あるいはこれより 3 ' 側にァニールするプライマーを用いた DNA増幅法によって、該制限酵素認識配列及び増幅すべき DNAを含む領域を増幅する工程。

(3) 前記 DNA増幅法が LAMP法である、上記（2)記載の方法。

(4) 前記制限酵素認識配列を有する 2本鎖顺 Aが、該制限酵素認識配列を含むプ 'ライマーを用いた DNA増幅法によって提供されることを特徴とする上記（1)記載の方法。

(5) 前記 DNA増幅法が、以下の A)及び B)からなるプライマーを用いた LAMP法である、上記（4)記載の方法。

2本鎖 DNAの第 1の DNA鎖上にある標的配列の 3'末端から該 DNA鎖の 3 ' 末端方向に向かって順に第 1の任意配列 Flc及び第 2の任意配列 F2cをそれぞれ選択し、また該標的配列の 5 ' 末端から該 DNA鎖の 5 ' 末端方向に向かって順に第 3の任意配列 R1及び第 4の任意配列 R2をそれぞれ選択したとき、

A)前記 F2cに相補的な配列 F2及び前記 Flcと同一の配列を 3 ' 側から 5 ' 側にこの順で含むプライマー、又は前記 F2cに相補的な配列 F2、前記制限酵素認識配列及び前記 Flcと同一の配列を 3 ' 側から 5 ' 側にこの順で含む

B)前記と同一の配列、前記制限酵素認識配列及び前記 R1に相補的な配列 Rlcを 3 ' 側から 5 ' 側にこの順で含むプライマー

(6) 前記 DNA合成工程において、さらに前記インナープライマーよりも 3'側にァニールするアウタープライマーを用いることを特徴とする上記（5)記載の方法 _c

(7) 制限酵素による切断部位の 1本鎖領域の長さが、少なくとも 5塩基以上であることを特徴とする上記 U)〜（6)のいずれか 1に記載の方法。

(8) 制限酵素による切断部位の 1本鎖領域の長さが、少なくとも 7塩基以上であることを特徴とする上記（1)〜（6)のいずれか 1に記載の方法。

(9) プライマーが検出可能な標識物質又は固相と結合しているか、あるいはこれらに結合可能なように修飾されていることを特徴とする上記 [1]〜 [8]のいずれか 1に記載の方法。

(10) 2本鎖丽 Aの第 1の DNA鎖上にある標的配列の 3'末端から該 DNA鎖の 3'末端方向に向かって順に第 1の任意配列 Flc及び第 2の任意配列 F2cをそれぞれ選択し、また該標的配列の 5'末端から該顺 A鎖の 5'末端方向に向かって順に第 3の任意配列 R1及び第 4の任意配列 R2をそれぞれ選択したとき、以下の A) 及び B) からなるインナープライマー。

A) 前記 F2cに相補的な配列 F2及び前記 Flcと同一の配列を 3'側から 5'側にこの順で含むプライマ一、又は前記 F2cに相補的な配列 F2、以下の制限酵素の認識配列及び前記 Flc と同一の配列を 3'側から 5'側にこの順で含むプライマー

a) 3'末端が突出した断片を形成し、かつ

b) 切断後のそれぞれの断片の 1本鎖領域の塩基配列が異なる

ように切断可能な制限酵素

B) 前記 R2と同一の配列、前記制限酵素の認識配列及び前記 R1に相補的な配列 Rlcを 3'側から 5'側にこの順で含むプライマー

(11) クローニングサイトの中に、あるいはクローニングサイトに隣接して、以下の塩基配列を持つことを特徴とする、 1本鎖核酸合成用ベクター。

制限酵素で切断した際に、

a) 3'末端が突出した断片を形成し、かつ

ように切断される塩基配列

(12) 少なくとも以下の試薬を含む 1本鎖核酸合成用試薬キット。

1) 以下の特徴を持つ制限酵素

a) 3'末端が突出した断片を形成し、かつ

b) それぞれの断片の塩基配列が異なるように切断可能である 2) 上記制限酵素により切断された DNA断片の 1本鎖領域にァニール可能なプライマー

3) 鎖置換型ポリメラーゼ

4) 上記（10)記載のインナープライマー又は上記（11)記載の 1 本鎖核酸合成用ベクター

本発明にかかる 1本鎖核酸の合成方法において、「1本鎖核酸」とは 2本鎖 DNA のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のみからなる蘭 A、すなわち 1本鎖 DNAを意味する。また、「ァニール」とは核酸がワトソン一クリックの法則に基づく塩基対結合によって 2本鎖構造を形成することを意味する。したがって、 1 本鎖核酸が分子内でこのような塩基対結合を形成しても、ァニールである。本発明において、ァニールとハイブリダィズは、核酸が塩基対結合による 2本鎖構造を構成する点で同義である。

本発明において、「標的配列（或いは領域)」とは 1本鎖核酸として合成すべき塩基配列（あるいは領域）を意味するものとする。また、铸型となる 2本鎖 DNA のうち、該標的配列を含む方の鎖を第 1鎖、これに相補的な鎖を第 2鎖を意味するものとする。

本発明では L細 P法の技術が応用される。 LAMP法は本発明者らが開発した核酸の増幅方法で、ィンナープライマーペア或いはこれにアウタープライマーペアを加えた、 2種或いは 4種の特異的プライマーと、鎖置換 DNAポリメラーゼ及び基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（65°C前後）で DNA又は RNAを迅速かつ安価に増幅する方法である。 LAMP 法の詳細については Nagamine e t. al. , Cl inical Chemi s t ry (2001) , Vol. 47, No. 9， 1742-1743, Notomi et. al. , Nuc le ic Ac ids Research (2000) , Vol. 28, e63 及び国際出願（国際公開番号： TO0O/28O82、 W001/34838, W001/34790等）等に記載されており、該記載は参照として本明細書中に取り入れるものとする。

本発明では、制限酵素切断部位を a) 3'末端が突出した断片を形成し、かつ b) 切断後のそれぞれの断片の 1本鎖領域の塩基配列が異なる、という特徴を併せ持つ制限酵素を使用する。制限酵素の大半は切断後に 5'末端が突出した断片か、平滑末端を持つ断片を形成する。しかし、少数ながら切断後に 3'末端が突出した断片を形成する制限酵素が知られており、そのような酵素を用いて切断した爾 A断片の一本鎖領域にプライマーをァニールさせ、ポリメラーゼにより核酸を合成することが可能である。ただし、突出した 3'末端領域にプライマーをァニールさせ核酸の合成反芯を行うためには、塩基配列の特異性や結合の強度を考慮すると、 1 本鎖領域の長さが少なくとも 5塩基以上、好ましくは 7塩基以上必要である。また、制限酵素の中には、認識部位に挟まれた、あるいは認識部位に隣接した任意の配列中に切断部位を持つものがある。たとえば、 Bgl lは GCCN題 NNGGCという配列の 7番目と 8番目の塩基の間を切断する。このような制限酵素で切断した断片は、切断部位の塩基配列が異なる非対称な断片を生成する。すなわち、 GCCAAAAAGGCという配列を Bgl lで切断した場合、切断部位の塩基配列は GCCAAAA と GCCTTTTである。このような非対称な断片では一方に相補的な塩基配列を持つプライマー（プローブ）は他方には結合できない。

上に述べた特徴を併せ持つ制限酵素（以下、本発明の制限酵素という）としては例えば TspRIが挙げられる。 TspRIは題 CA (C or G) TGNNという塩基配列を認識し、 3'末端の任意の塩基と隣接する塩基の間を切断するので、切断後の 1本鎖領域の長さは 9塩基になる。

TspRI を例として、本発明の 1本鎖核酸合成方法の原理について説明する。上述の通り、 TspRIは 3'側の切断面が 9塩基の突出末端を持つ制限酵素である。さらに、認識配列 NNCA (C/G) TGNN の両端の 2塩基（腿）は ATGCのいずれでも良く、非対称な認識酡列を形成することができる。これを利用することにより鎖特異的な DNA合成が可能となる。例えば、 BamHIクローニングサイ卜の両端に TspRIサィ卜を持つ配列を作製する。これを TspRIで消化すると異なる塩基配列を持つ 4 つの 3'突出末端が得られる。つぎに、このうちの 1つを認識する配列（図 1中 [1] )でプライマ一（Primer : GACACTGGA) を作製する。このプライマ一は [2] [3] [4]とは完全に一致する配列でないためァニールする事が出来ない。したがって、プライマーが [1] にァニールして伸長反応が起こると、同一鎖のみを铸型として合成反応が起こる。

上記合成反応に前記 LAMP法 (Nuc le ic Ac ids Research (2000) , Vol. 28, e63) の技術を応用することができる。例えば、

1)前記制限酵素認識配列をクローニングサイトの中に、あるいはクローニンダサィトに隣接して有するベクターを用いて増幅すべき DNAをクローニングする。

2)次いで、該制限酵素認識配列上、あるいはこれより 3 ' 側にァニールする LAMP 用プライマーを設計する。

3)そして、該プライマー及び鎖置換型ポリメラーゼを用いて、該制限酵素認識配列と増幅すべき DNAを含む領域を LAMP法により増幅する。

増幅した制限酵素認識配列を有する 2本鎖丽 Aから 1本鎖丽 Aを合成する過程は上述したとおりである。 LAMP法は等温条件下、短時間で大量の DNAを得ることができるため、上記合成方法と組み合わせることでより多くの鎖特異的一本鎖丽 Aを効率的に得ることができる。

なお、上記の L AMP用プライマ一とは L AMP法で用いられる特異的プライマーで、前述した Nagamine e t. al. , Cl ini cal Chemi s t ry (2001)等に基づいて容易に調整することができる。

前記 1本鎖 DNAの合成に使用するプライマーは、制限酵素で切断後の第 2の DN A鎖上に存在する 3 '末端の突出した 1本鎖部分に相補的に結合するものであれば特に制限はない。長さは前記 1本鎖領域と完全に一致する必要はなく、相補的結合の特異性を損なわない範囲で 5'側あるいは 3'側が短くなつていてもかまわないし、 5 '側に任意の塩基配列が伸びていてもよい。

さらに、プライマーは検出可能な標識物質、又は固相と結合している、あるいは結合可能なように修飾されていてもよい。かかる 1本鎖 DNA合成用プライマーの標識には、公知の標識物質、標識方法が利用できる。標識物質としては例えば、放射性物質、蛍光物質、ピオチン、及び酵素等が挙げられる。これらの標識物質を公知の方法によりプライマーに付加したり、プライマーを化学合成する際に予め標識されたヌクレオチドを取り込ませることにより、標識プライマーを作製することができる。また、上記の標識物質やラテックス粒子、磁性粒子、及び反応容器の内壁と結合可能なようにプライマーには適当な官能基を導入しても良い。プライマーの標識部位は相補鎖とのァニーリングや、それに続く伸長反応を阻害しないように選択する必要がある。したがって、たとえば 3'末端の標識は好ましくない。また、標識物質の分子量に応じて、立体障害が発生しないように 5'側にリンカーとなる塩基配列を介した上で標識物質を結合させることも可能である。本発明の 1本鎖核酸の合成方法において、本発明の制限酵素認識配列をもたない 2本鎖 DNAへの該認識配列の挿入は、 PCR, LCRなど公知の遺伝子増幅法を利用して行うことができる。例えば、用いるプライマーに本発明の制限酵素認識配列を組み込んで、標的配列あるいはこれに相補的な配列を遺伝子増幅させれば、目的とする制限酵素認識配列を標的配列の 3 ' 側に挿入することができる。

また、前述したように、クロ一ニングベクターのクローニングサイトの中に、あるいは該クローニングサイ卜に隣接して本発明の制限酵素認識配列を組み込んだベクターを用いてもよい。

本発明の好適な態様として、本発明の制限酵素認識配列をもたない 2本鎖 DNA に対し、 LAMP法を利用して該制限酵素認識配列を導入することができる。すなわち、制限酵素認識配列を挿入したプライマーを用いて LAMP増幅反応を行うことにより、制限酵素認識配列を有する 1本鎖核酸合成用の錶型 DNA鎖を迅速かつ大量に調整することができる。

前記制限酵素認識配列は第 1鎖上の標的配列の 5'側に挿入される必要があり、特に 3 ' 側及び 5 ' 側の両方に挿入されるとより好適である。すなわち、第 2鎖の 3 ' 側突出部にァニールするプライマーには制限酵素認識配列が必ず必要であるが、両方のプライマーに含まれるとより好適である。制限酵素切断部位が両側にあることにより、 1 種類の酵素により標的領域の両側を切断でき、必要な酵素の数を減らすことができるからである。なお、各プライマーから生じる伸長生成物を前記制限酵素で切断してできる断片の 1本鎖領域の塩基配列は当然異なることが好ましい。

本発明においては、上記 2種のプライマーをインナープライマーと呼ぶ。

具体的には、 LAMP法を利用して 2本鎖 DNAに制限酵素認識配列を導入する方法は以下の工程からなる。

1) 2本鎖 DNAの第 1の DNA鎖上にある標的配列の 3'末端から該 DNA鎖の 3 ' 末端方向に向かって順に第 1の任意配列 F lc及び第 1の任意配列 F2cをそれぞれ選択し、また該標的配列の 5 ' 末端から該 DNA鎖の 5 ' 末端方向に向かって順に第 3の任意配列 R1及び第 4の任意配列 R2をそれぞれ選択する工程。

2) 以下のインナープライマ一を調整する工程。

a)前記 F2cに相補的な配列 F2及び前記 F lcと同一の配列を 3 ' 側から 5 ' 側にこの順で含むプライマー、又は前記 F2cに相補的な配列 F2、前記制限酵素認識配列及び前記 F l c と同一の配列を 3 ' 側から 5 ' 側にこの順で含むプライマ一、並びに

b) 前記 R2と同一の配列、前記制限酵素認識配列及び前記 R1に相補的な配列 Rlcを 3 ' 側から 5 ' 側にこの順で含むプライマ一

3)前記 1本鎖 DNAのそれぞれの鎖を铸型として、前記プライマー及び鎖置換型ポリメラーゼを用いて、 DNA合成を行う工程。

なお、前記インナープライマ一において、 F2と制限酵素認識配列、制限酵素認識配列と F lcはオーバーラップしていてもよく、また間に数個の塩基配列が挿入されていてもよい。同様に R2と制限酵素認識配列、制限酵素認識配列と R l cはオーバーラップしていてもよく、また間に数個の塩基配列が揷入されていてもよい。好ましくは、 F2/R2、制限酵素認識配列、 F lc/Rlcの各配列間の距離は 1〜20 塩基、より好ましくは 1〜10塩基であると良い。

2本鎖 DNAへのインナ一プライマーの最初のァニールは、熱又はアルカリ等の公知の方法により 2本鎖 DNAの一部又は全部を解離させて行うことができる。その後は、鎖置換型 DNAポリメラーゼ、基質ヌクレオチドの存在下、 55〜70 程度の等温条件下で DNA合成反応が繰り返されていく。

上記 LAMP反応では、さらに前記ィンナープライマーとは異なる 2種のプライマ一を用いることもできる。かかるプライマーは、銬型 DNA上において前記インナ一プライマーよりもさらに外側 = 3'側にァニールするプライマーであり、本発明ではこれらをアウタープライマーと呼ぶ。該アウタープライマーは、以下のようにして調整することができる。

前述の第 1の DNA鎖上において、 F2cよりも 3'側にある任意配列 F3c及び前記よりも 5'側にある任意配列 R3を選択し、

a) 前記 F3cに相補的な配列 F3を含むプライマー、及び

b) 前記 R3と同一の配列を含むプライマー

をそれぞれアウタープライマ一として調整する。

なお、前記アウタープライマーからの DNA合成は、ィンナ一プライマーからの DNA合成よりも後に開始される必要がある。これを達成するには、（a)インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも高く（例えば 2〜50倍、好ましくは 4〜25倍高く）設定設定する方法、及び (b)ィンナープライマーの融解温度 (Tm:me l t ing temperature) をアウタープライマ一の融解温度よりも高く設定する方法などが挙げられる。その他、 LAMP法の実施条件については、前述の文献や特許を参照することにより適宜設定することができる。

さらに、上記 LAMP反応では、増幅反応の結果生じる、ヘアピン構造を有する増幅産物のループ部分に特異的にァニールしうるプライマーを用いると、該増幅反応をより効率的に行うことができる。本発明においては、上記ループ特異的ブライマ一をループプライマーと呼ぶ。なお、このループプライマーのいずれか一方の 3 ' 末端に本発明の制限酵素認識配列を揷入すれば、ループプライマー自身が 1 本鎖核酸合成用プライマーとして機能しうる。

本発明はまた、本発明の方法を実施するための 1本鎖核酸合成用試薬キットを提供する。該キットは、例えば特定配列のハイブリダィゼ一シヨンアツセィ用 1 本鎖核酸合成用試薬キットなどとして利用することができる。

前記キットは、本発明にかかる制限酵素、該制限酵素により切断された DNA断片の 1本鎖領域にァニール可能なプライマー、鎖置換型ポリメラーゼ、本発明にかかるィンナープライマ一を少なくとも含み、さらに本発明にかかるアウタープライマー及び/又はループプライマーを含んでいても良い。

前記キットはさらに上記試薬の他、本発明にかかる合成方法を実施するために必要な他の試薬、例えば基質ヌクレオチド、緩衝液、融解温度調整剤等を含んでいてもよい。図面の簡単な説明

図 1は、 TspRIを用いた 1本鎖核酸合成の原理を示す。

図 2は、実施例 1における伸長産物のハイブリダィゼーシヨンアツセィの結果を示す写真である。（A:センスオリゴ、 B :アンチセンスオリゴ）

図 3は、実施例における LAMP反応産物と TspRI処理した LAMP反応産物の電気泳動結果を示す写真である。（M:サイズマーカー、 1 :LAMP産物， 2 :TspRI処理した LAMP産物）

図 4は、実施例 2におけるプライマー伸長産物（DIG標識）の検出結果を示す写真である。（l :negat ive cont rol, 2 :プライマー伸長産物）

図 5は、実施例 2におけるプライマ一伸長産物をドットブロットハイプリダイゼーシヨンした結果を示す写真である。

図 6は、実施例 3におけるプライマー伸長産物（DIG標識）の検出結果を示す写真である。 (l:Klenow (-) , 2:Klenow (+), 3:Bst (-) 60°C, 4:Bst (+) 60°C， 5: Bst (-) 65 ， 6:Bst (!) 65°C)

図 7は、実施例 4における lambda exonucl ease処理したプライマー伸長産物の電気泳動結果を示す写真である。（M:サイズマーカー， 1:λ (-）， 2:λ (+)) 図 8は、実施例 5におけるプライマー伸長産物（DIG標識）の検出結果を示す写真である。

図 9は、実施例 5におけるプライマー伸長産物をドットブロットハイプリダイゼーシヨンした結果を示す写真である。

図 10は、実施例 6における LAMP反応産物と TspRI処理した LAMP反応産物の電気泳動結果を示す写真である。（M:サイズマーカー， 1:LAMP産物， 2:TspRI処理した L崖 P産物）

図 11は、実施例 6におけるプライマー伸長産物をドッ卜ブロットハイプリダイゼーシヨンした結果を示す写真である。本明細書は、本願の優先権の基礎である特願 2000-328219号の明細書に記載された内容を包含する。発明を実施するための最良の形態

実施例 1：

1. ベクターの調製

以下のプライマーを用い、 pBluescript IIベクター（Genbank DB No. X52324) を铸型として、 PCRを行った。

T7TspRI (Forward) :5' -GACAGTGTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3' (配列番号 1) T3TspRI (Reverse) :5' -GGATCCAGTGTCCCTTTAGTGAGGGTTAAT-3' (配列番号 2)

40 n 1の反応系に 1 X buffer [16 mM (NH₄) ₂S0₄、 50 mM Tris-HCl H 9.2、 1.75 mM MgCl₂、 0.001% (w/v) gelatin]、 0.2 mMの dNTPs、 1.4 Uの Taa DNAポリメラ一ゼと Pwo DNAポリメラーゼ（EXpand Long Template PCR System, 口ッシュ社）、 0.5 mMの上記特異的プライマーペアを加え、 15サイクルの PCRを 94°C 20 秒、 62°C 30秒、 68°C 120秒の条件で行った。

増幅産物を T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化し、 T4 DNAリガーゼを用いてライゲーシヨンを行った。これを大腸菌 DH5ひへ導入し、得られた形質転換体より目的とするベクターを得た（pBSTspRIと命名）。

このべクタ一は、 pBluescript I Iベクターに存在した Sac Iから Kpn Iまでのマルチプルクローニングサイト（下線部）を欠失しているが、代わりに TspRI-BamHI-TspRIサイトを持ち、外来遺伝子を BamHIサイ卜に挿入する事が出来る。

(A) pBluescript I Iベクター：

5' -GAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTT

ATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC AGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTG GAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTC GATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTA TAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAA CCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAA TAGCGAAGAGGCCCGCACCG-3' (配列番号 10)

•下線部の配列（配列番号 11) はマルチプルクローニングサイトを示す

(B) TspRI-BamHI-TspRIサイトを有する配列：

5' -GGGACACTGGATCCGACAGTGTCGCCC-3' (配列番号 3)

2. DNAのクローニング

PUC19ベクター（GenBank DB No. :L09137) を Sau3AIで消化し、 109 bp及び 82 bp DNA断片を単離した。この断片を前記ベクターの BamHIサイ卜にそれぞれ挿入し、クローニングした。

109 bp Sau3AI断片：

TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATC-3' (配列番号 12)

82 bp Sau3AI断片：

5' -GATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATT ATCAAAAAGGATC-3' (配列番号 13) 3. LAMP反応

Sau3AI断片を組み込んだ前記ベクターを錶型として LAMP反応（Nucle ic Ac ids Research (2000) , Vol. 28， e63 参照）により標的領域の増幅をおこなった。用いた反応液組成を表 1に、またプライマーの配列と濃度を以下に示す。

(表 1 )

反応液組成（25 L中)

20 mM Tris-HCl H 8. 8

10 mM KC1

10 mM (NH₄) ₂S0₄

8 mM MgS0₄

0. 8 M Betaine

0. 1% Tri ton X-100

5. 6 mM dNTPs

8 U Bs t DNA ポリメラーゼ（NEW ENGLAND BioLabs) プライマー：

Inner primer (1600 nM)

Forward： 5' -TCCAGTGTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCA-3'

(配列番号 4)

Reverse： 5' -GACAGTGTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3'

(配列番号 5)

Outer primer (400 nM)

Forward : 5' -GTAACGCCAGGGTTTTCC-3' (配列番号 6)

Reverse : 5' -GAATTGTGAGCGGATAACAAT-3' (配列番号 7)

Loop primer (800 nM)

Forward : 5' -GCGCGCTTGGCGTAATCA-3' (配列番号 8)

Reverse : 5' -GCGCGCTCACTGGCCG-3' (配列番号 9) ターゲット DNAは熱変性をしないものを用意し、反応液を 65°Cで反応させた。これを PCR pulification kit (QIAGEN社)を用いて 200 1 (D Tris-HCl (pH8.0) に溶出した。

3. TspRIによる消化

LAMP産物 25 1を 50 Uの TspRI (NEW ENGLAND BioLabs) で 65で、 90分反応した。反応後、 PCR pulification Kit (QIAGEN社) を用いて 100/i 1の Tris- HC1 (p H8.0) に溶出した。

4. プライマー伸長反応

上記 TspRI断片に 5' ジゴキシゲニン（DIG) 標識したプライマー（BSTspRI: 5'-GACACTGGA-3') を加え、 DNA ポリメラーゼ Klenow fragment, 3'→5'exo- (N EW ENGLAND BioLabs社）による伸長反応を行った。用いた反応液組成を表 2に示す。

(表 2)

反応液組成

10 mM Tris-HCl (pH7.5)

5 mM MgCl₂

7.5 mM Dithiothreitol

0.25 mM dNTPs

5 Primer (BSTspRI primer)

1U Klenow fragment, 3'→5'exo- (NEW ENGLAND BioLabs) このときプライマー BSTspRIは TspRI消化断片の 1つの粘着末端のみにしかァニールする事ができないため、伸長反応によって得られる DNA鎖は単一であるはずである。

5. ドットプロットハイブリダイゼーション

ナイロンメンブランフィルター (BiodyneB，Pall) に 109 bp Sau3AI DNA断片の塩基配列から設計したセンスオリゴ（109A oligo) あるいはアンチセンスオリゴ

(109B oligo) をブロットした。各配列を以下に示す。

109A oligo： 5'-GTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGC-3'

(配列番号 15) 109B ol igo： 5' -GCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGAC-3'

(配列番号 16)

このフィルタ一に対して上記伸長産物をプローブとして用いてハイブリダイゼーシヨンを行った。ハイブリダィゼーシヨンには Perfec tHyb buf fer (T0Y0B0) を使用し、 60°Cで終夜行った。シグナルの検出は DIG核酸検出キット（ロッシュ社）を使用した。この結果、アンチセンスオリゴをブロットしたところにのみシグナルが得られた（図 2)。すなわち、単一の鎖特異的な一本鎖が得られたことを意味する。実施例 2：

铸型を別のものに変えても同様な結果が得られるかを確認するために、前述 82 bpクローニング産物を使用して実験を行った。

実施例 1で作製した 82 bpクローニングベクタ一を铸型として前述と同様な反応条件で LAMP反応を行った。今回 LAMP反応にはループプライマーを使用せず、以下のインナープライマ一および実施例 1と同様のアウタープライマー（濃度も実施例 1と同じ）を使用した。

Inner primer (1600 nM)

Forward : 5' -GTGTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCACACAGGAAACAGCTATG-3' (配列番号 17) Reverse : 5' -TGTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACCAGTCACGACGTTGTAAA-3' (配列番号 18)

LAMP反応産物を TspRI処理し、 2%ァガロースゲル電気泳動にて確認した（図 3)。電気泳動にて完全に TspRIで消化出来ていることを確認後、プライマーェクステンションを実施例 1と同様な方法にて行った。プライマーエクステンションが行われていることを確認するために、この産物を 2 %ァガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（BiodyneB, Pal l) にメンブラントランスファーした。このメンプランに対して、 DIG核酸検出キット（ロッシュ社）を使用し泳動産物に標識物が含まれているか検出した（図 4)。この結果、 TspRI産物中に DIGラベルされたプライマーから伸長した産物が含まれることが確認できた。

標識されていることが確認できたのでこの産物をプローブとして、ドッ卜プロットハイブリダィゼーシヨンを行った（図 5)。ブロットされている DNAは以下の通りである。

1 ; 82 bpのアンチセンスオリゴ DNA (配列番号 14)

2 ; 82 bpのセンスオリゴ DNA (配列番号 13)

3 ; 109A ol igo

4; 109B ol igo

5 ; 82 bpの LAMP産物を熱変性したもの

6 ; 無関係な LAMP産物（A DNA増幅産物）を熱変性したもの

この結果、 1 と 5にのみシグナルが得られた。すなわち、実施例 1 と同様に鍀型を変えても鎖特異的な DNAのみが合成されたことが示された。また、 LAMP産物を熱変性したものにもシグナルが見られたことから、 LAMP産物そのものでもプローブの標的になることが分かった。 LAMP産物は構造上、繰り返し配列を有しているためハイプリダイゼーシヨンの効率は非常に悪いと考えられた。しかし、今回 LAMP産物でもハイプリダイゼーシヨンが行えたことから、 DNAチップの基板上に LAMP産物をスポットして使用することも可能であることが示唆された。

今回の検討ではプライマーの 5'末端に DIG標識したものを使用した。これをァミノリンカーやピオチン標識したものを使用すると、標識された DNA鎖を単離することも可能である。実施例 3 : Bs t DNAポリメラーゼを用いた伸長反応

鎖置換型 DNA合成酵素である Bs t DNAポリメラーゼを用いてプライマ一伸長反応が行えるかどうかを検討した。用いた反応液組成を表 3に示す。

(表 3)

反応液組成

20 mM Tris-HCl pH 8. 8

10 mM KC1

10 mM (NH₄) ₂S0₄

4 mM MgS0₄

0. 1¾ Tri ton X- 100

1. 6 mM dNTPs

1 U Bst DNA ポリメラーゼ (NEW ENGLAND BioLabs) 60 又は 65°Cで 1時間反応後、プライマーエクステンションが行われていることを確認するために、この産物を 2 %ァガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（BiodyneB, Pal l) にメンブラントランスファーした。このメンブランに対して、 DIG核酸検出キット（ロッシュ社）を使用して泳動産物に標識物が含まれているかを検出した（図 6)。その結果、 Bs t DNAポリメラーゼを用いても DI Gラベルされたプライマーから伸長反応が起こることが確認できた。実施例 4：プライマー伸長産物の lambda exonuc lease処理

プライマーエクステンション後は、遊離した 1本鎖 DNAと 2本鎖 DNAが生成する。この 2本鎖 DNAのプライマーからの伸長鎖には 5'末端にリン酸基が付いていない。そのため、 l ambda exonuc lease処理すると、錶型となった DNA鎖は 5'側から DNAの分解が起こるが、伸長鎖は分解されない。これにより、片側だけの DNA 鎖だけが存在することになる。

前述（109 bpのプライマ一伸長産物）のプライマー伸長産物に対して lambda exonuc lease処理を行った（37°C、 1時間反応）。用いた反応液組成を表 4に示す。

(表 4)

反応液組成

67 mM glyc ine-腿 ( H 9. 3)

2. 5 mM MgCl₂

0. 5 U l ambda exonuc lease (USB ft)

37°C、 1 時間反応後、 4 ァガロースゲルにて電気泳動した。プライマー伸長産物を lambda exonuclease処理して電気泳動した結果、約 50 bp付近にバンドがシフトしているのが見られた（図 7のレーン 2)。 1本鎖 DNAは泳動度が速くなることが知られており、これが目的の産物であると考えられた。以上のことから、プライマ一伸長産物を lambda exonucl ease処理することより、より多量の 1本鎖 DNAを得ることができることが確認できた。実施例 5： Tsp Iのバッファーを用いた Bs t DNAポリメラ一ゼ伸長反応

1. Bs t DNAポリメラーゼでの反応を TspRIのバッファ一を用いて行った。铸型として用いた LAMP産物は実施例 2と同様である。このとき終濃度 0， 0. 25, 0. 5， 1. 0, 2. 0 mMの dNTPsで検討した。用いた反応液組成を表 5に示す。

(表 5)

反応液組成

20 mM Tris- Acetate H 7. 9

50 mM K- Acetate

10 mM Mg - Acetate

1 mM DTT

0. 25-2 mM dNTPs

0. 1 U Bs t Wk ポリメラ一ゼ（NEW ENGLAND BioLabs)

5 M Primer

37°C, 1時間反応後プライマーエクステンションが行われていることを確認するために、反応産物を 2 %ァガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン (BiodyneB, Pal l) にメンブレントランスファーした。このメンブレンに対して、 DIG核酸検出キット（ロッシュ社）を使用し泳動産物に標識物が含まれているか検出した（図 8)。この結果、 TspRIのバッファ一を用いても Bs t DNAポリメラーゼによるプライマーからの伸長反応が起こることが確認できた。

以上より、本方法を用いれば、バッファーを共有することによりコスト低減が図れることがわかった。

2. TspRI のバッファ一で伸長反応が起こることが確認できたので、次に LAMP 以降の反応を同時に行えるか検討した。用いた反応液組成を表 6に示す。

(表 6)

反応液組成

20 mM Tris-Acetate pH 7. 9

50. mM K - Acetate

10 mM Mg- Acetate

1 mM DTT

1 mg/ml BSA

0. 5 mM dNTPs

7. 5 U TspRI (NEW ENGLAND BioLabs)

5 / M Primer LAMP反応後の反応液（1/50量）を上記反応系に添加し、 37°C、 1時間反応させた。反応液中の Bs t DNAポリメラーゼ量は 0. 16 ϋになる。前記実施例より 0. 1 U の酵素量があれば、反応が進むことは確認済みである。反応後、産物をプローブとして用いてドットブロットハイブリダィゼーションを行った（図 9)。ブロットされている DNAは以下の通りである。

1 ; 82 bpのアンチセンスオリゴ DNA

2 ; 82 b のセンスオリゴ DNA

3 ; 109A ol igo

4 ; 109B ol igo

この結果、 82bp のアンチセンスオリゴをブロットした位置（1) に強いシグナルが見られた。センスオリゴ側（2) に見られた弱いシグナルは、 TspRIによる反応で切れ残りがあつたためと考えられた。よって、特異的な増幅産物が出来ていることが確認できた。

以上の結果から、本方法を用いれば、コストの低減のみならず時間の短縮も可能であることが示された。実施例 6： LAMPプライマーを用いた制限酵素認識配列の挿入

1. TspRI部位を持たない铸型から鎖特異的 1本鎖を得るために、以下の TspRI認識配列を挿入したインナープライマー等を用い、 PUC19プラスミド（配列番号 19)

5 ngを铸型として LAMP反応を行った。

プライマー：

Inner primer (1600 nM：下線部は TspRI認識配列揷入部を示す）

Forward : 5' -GACCAAGTTTACTCATATATACGACACTGGAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAG-3' (配列番号 20)

Reverse : 5' -TGAGGCACCTATCTCA6CGATGACAGTGTCACGGGGAGTCAGGCAACTAT-3'

(配列番号 21)

Out er primer (400 nM)

Forward : 5' -TCAAAAAGGATCTTCACCTA-3' (配列番号 22)

Reverse : 5' -GTATCGTAGTTATCTACACG-3' (配列番号 23) Loop pr imer (800 nM)

Forward : 5' -ACTTTAGATTGATTTAAAA-3' (配列番号 24)

Reverse : 5' -TCTGTCTATTTCGTTCATCC-3' (配列番号 25) 反応溶液組成は実施例 1と同様の条件で 62. 8で、時間の LAMP反応を行ない、ついで、 LAMP増幅産物を実施例 1と同様に TspRI消化した。 LAMP産物および TspRI 消化物を 2%ァガロースゲルにて電気泳動した結果、これらが目的のサイズに現れることが確認された（図 10)。

2. 次に、プライマーエクステンションにより DIG標識し、ドットプロットハイブリダィゼ一シヨンを行った。ブロットされている DNAは以下の通りである。

1 ; 109A ol igo

2 ; 109B ol igo

この結果、目的のスポットのみにシグナルが得られることが確認された（図 11)。以上より、 TspRI部位を持たない錶型に LAMP反応を利用して制限酵素認識配列が挿入でき、これを鎳型として鎖特異的 1本鎖を得られることが示された。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。産業上の利用の可能性

本発明を用いれば、 2 本鎖核酸のセンス、又はアンチセンス鎖の一方を選択的に合成することができる。かかる 1本鎖 DNAはハイブリダィゼーシヨンアツセィのプローブ等に使用することができ、本発明は該 1本鎖 DNAの効率的かつ安価な合成方法を提供する。配列表フリーテキスト

配列番号 1： T7TspRI primer (Forward)

配列番号 2： T7TspRI primer (Reverse)

配列番号 3： TspRI-BamHI-TspRI s i te

配列番号 4： Inner primer (Forward) 配歹' J番号 5： Inner primer (Reverse)

配列番号 6： Outer primer (Forward)

配列番号 7： Outer primer (Reverse)

配列番号 8： Loop primer (Forward)

配歹！]番号 9： Loop primer (Reverse)

配列番号 10： pBluescript II

配列番号 11： Multiple cloning site from pBluescript II

配列番号 12： pUC19 109bp Sau3AI flagment (sense)

配列番号 13： pUC19 82bp Sau3AI flagment (sense)

配列番号 1.4 : pUC19 82bp Sau3AI flagment (antisense)

配歹 ϋ番号 15： 109A oligo: Designed oligonucleotides (sense) based on pUC19

109bp Sau3AI flagment)

配歹 !J番号 16： 109B oligo: Designed oligonucleotides (antisense) based on

PUC19 109bp Sau3AI flagment)

配歹 (J番号 17： Inner primer (Forward)

配歹！]番号 18： Inner primer (Reverse)

配列番号 19： pUC19

配列番号 20： Inner primer (Forward)

配列番号 21： Inner primer (Reverse)

配列番号 22： Outer primer (Forward)

配列番号 23： Outer primer (Reverse)

酉己歹 (1番号 24： Loop primer (Forward)

配列番号 25： Loop primer (Reverse)

Claims

請求の範囲

1. 以下の工程からなる 1本鎖核酸の合成方法。

a) 3'末端が突出した断片を形成し、かつ

2. 前記制限酵素認識配列を有する 2本鎖丽 Aが、以下の工程を含む方法によって提供されることを特徴とする、請求の範囲第 1項記載の方法。

1) 該制限酵素認識配列をクローニングサイトの中に、あるいはクローニングサイ卜に隣接して有するベクターを用いて増幅すべき DNAをクローニングする工程

3. 前記 DNA増幅法が LAMP法である、請求の範囲第 2項記載の方法。

4. 前記制限酵素認識配列を有する 2本鎖 DNAが、該制限酵素認識配列を含むブライマ一を用いた DNA 増幅法によって提供されることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の方法。

5. 前記 DNA増幅法が、以下の A)及び B)からなるプライマ一を用いた LAMP法である、請求の範囲第 4項記載の方法。

2本鎖 DNAの第 1の DNA鎖上にある標的配列の 3'末端から該 DM鎖の 3 ' 末端方向に向かって順に第 1の任意配列 Flc及び第 2の任意配列 F2cをそれぞれ選択し、また該標的配列の 5 ' 末端から該爾 A鎖の 5 ' 末端方向に向かって順に第 3の任意配列 ΙΠ及び第 4の任意配列 R2をそれぞれ選択したとき、 Α)前記 F2cに相補的な配列 F2及び前記 Flcと同一の配列を 3 ' 側から 5 ' 側にこの順で含むプライマー、又は前記 F2cに相補的な配列 F2、前記制限酵素認識配列及び前記 F lcと同一の配列を 3 ' 側から 5 ' 側にこの順で含む

6. 前記 DNA合成工程において、さらに前記インナープライマーよりも 3'側にァニールするアウタープライマーを用いることを特徴とする請求の範囲第 5 項記載の方法。

7. 制限酵素による切断部位の 1本鎖領域の長さが、少なくとも 5塩基以上であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれか 1項に記載の方法。

8. 制限酵素による切断部位の 1本鎖領域の長さが、少なくとも 7塩基以上であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれか 1項に記載の方法。

9. プライマーが検出可能な標識物質又は固相と結合している力、、あるいはこれらに結合可能なように修飾されていることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 8 項のいずれか 1項に記載の方法。

10. 2本鎖 DNAの第 1の DNA鎖上にある標的配列の 3'末端から該 DNA鎖の 3'末端方向に向かって順に第 1の任意配列 F lc及び第 2の任意配列 F2cをそれぞれ選択し、また該標的配列の 5'末端から該 DNA鎖の 5'末端方向に向かって順に第 3の任意配列 R1及び第 4の任意配列 R2をそれぞれ選択したとき、以下の A) 及び B) からなるインナープライマー。

A)前記 F2cに相補的な配列 F2及び前記 Flcと同一の配列を 3'側から 5'側にこの順で含むプライマー、又は前記 F2cに相補的な配列 F2、以下の制限酵素の認識配列及び前記 F lcと同一の配列を 3'側から 5'側にこの順で含むプライマー

a) 3'末端が突出した断片を形成し、かつ

ように切断可能な制限酵素

B)前記 R2と同一の配列、前記制限酵素の認識配列及び前記 R1に相補的な配列 Rlcを 3'側から 5'側にこの順で含むプライマー

11. クローニングサイトの中に、あるいはクローニングサイトに隣接して、以下の塩基配列を持つことを特徴とする、 1本鎖核酸合成用ベクター。

制限酵素で切断した際に、

a) 3'末端が突出した断片を形成し、かつ

ように切断される塩基配列

12. 少なくとも以下の試薬を含む 1本鎖核酸合成用試薬キット。

1) 以下の特徴を持つ制限酵素

a) 3 '末端が突出した断片を形成し、かつ

b) それぞれの断片の塩基配列が異なるように切断可能である

2) 上記制限酵素により切断された DNA断片の 1本鎖領域にァニール可能なプライマ一

3) 鎖置換型ポリメラーゼ

4) 請求の範囲第 10項記載のィンナープライマー又は請求の範囲第 1 1項記載の 1本鎖核酸合成用ベクター