WO2002020014A1 - Unkompetitive inhibitoren der helikase-primase - Google Patents

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WO2002020014A1
WO2002020014A1 PCT/EP2001/009843 EP0109843W WO0220014A1 WO 2002020014 A1 WO2002020014 A1 WO 2002020014A1 EP 0109843 W EP0109843 W EP 0109843W WO 0220014 A1 WO0220014 A1 WO 0220014A1
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alkyl
heφes
compounds
helicase
primase
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PCT/EP2001/009843
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French (fr)
Inventor
Gerald Kleymann
Rüdiger Fischer
Martin Hendrix
Guy Hewlett
Veniamin Pevzner
Ulrich Betz
Wolfgang Bender
Peter Eckenberg
Gabriele Handke
Udo Schneider
Olaf Weber
Kerstin Henninger
Axel Jensen
Jörg Keldenich
Judith Baumeister
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Bayer Aktiengesellschaft
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Publication date
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/99—Isomerases (5.)

Definitions

  • the present invention relates to inhibitors of the viral helicase-primase enzyme complex with anti-He ⁇ es activity and to medicaments which contain these compounds in a suitable formulation.
  • the invention further describes a method for identifying anti-viral substances in order to treat hot infections in humans and animals.
  • a viral replication assay is described, which makes it possible to identify effective and compatible antiviral compounds.
  • the strategy is based on the simultaneous selection of molecules according to 2 essential criteria, firstly with reference to the anti-microbial effect (the molecule binds functionally to a relevant target (positive selection)) and secondly, the
  • connections are compatible, i.e. the molecules then do not bind or modulate unwanted (host) targets (negative selection).
  • an active ingredient that simultaneously inhibits two essential targets in a pathogen's reproductive cycle can have an enhanced therapeutic effect.
  • This enhancement of effects is based on cumulative, inhibitory effects such as that in the past for the analog case of combination therapy, which is often the (a molecule of chemo-) monotherapy, in which the active ingredient of the therapeutic agent is usually only a relevant binding pocket of a protein or a subunit of one Protein complex is modulated, superior, has been shown. If the active substance binds in the area of the contact point of two targets, stronger binding can often be determined on the basis of avidity effects. The better binding properties and or the cumulative inhibitory effects result in a superior therapeutic effect, which ideally unfolds without side effects, i.e. characterized by a very good tolerance. Fortunately, this means lower doses for the patient.
  • the He ⁇ esviridae evolved over millions of years and are very common in nature. Members of this family have been identified in humans, non-humanoid primates, and most other mammals and vertebrates (Virology, 1996, Fields et al. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA 19106, USA).
  • the He ⁇ esviruses are enveloped, double-stranded DNA viruses that infect permissive cells, which in addition to negative charges of the heparan sulfate and or the glycosaminoglycans also carry the so-called herpes viral entry mediator on their cell surface.
  • a remarkable property of the viruses is their maturity, a lifelong latency in the train infected hosts and reactivate them with endogenous or external stimuli from the pool of latently infected cells more or less frequently and trigger recurrent infections.
  • HHVl to HHV8 Eight human He ⁇ esviruses (HHVl to HHV8) have been described so far.
  • the viral genomes ( ⁇ 125-230 kbp information) were sequenced and stored in the common databases, which are also available on the Internet (GeneBank, EMBL database etc.). High sequence homologies were identified when comparing the genomes. This applies in particular to the genes coding for the helicase and primase; This means that the replication machinery among the He ⁇ es viruses is highly conserved but can be clearly differentiated from the DNA replication of the host when compared to eukaryotic genes.
  • the genomes code for more than 50 reading frames, which are essential for the virus propagation cycle in vitro and or in vivo.
  • He ⁇ esviren were in 3 subfamilies, namely in ⁇ - (HHVl to 3), ß- (HHV5 to 7), and ⁇ - (HHV4 and
  • HHV8 He ⁇ esviren, divided. Trivial names were derived on the basis of the clinical symptoms of the clinical picture or simply for historical reasons as follows: He ⁇ es simplex virus 1 and 2 (HSV-1 and -2 cause He ⁇ es labialis and genitalis) also stand for HHVl and 2, the varicella zoster virus (VZV is the causative agent of chickenpox and shingles) becomes synonymous with HHV3 and that Epstein-Barr virus (EBV) and the cytomegalovirus (HCMV) are used interchangeably with the names HHV4 and 5.
  • HSV-1 and 2 cause He ⁇ es labialis and genitalis
  • VZV varicella zoster virus
  • EBV Epstein-Barr virus
  • HCMV cytomegalovirus
  • the proportion of those infected with one or more He ⁇ es viruses is between less than 10 and more than 90% depending on the
  • He ⁇ es virus Age group, gender, social status, geographical aspects and of course which He ⁇ es virus is examined. Precisely because some He ⁇ esviruses are ubiquitous pathogens that trigger a number of diseases, which can range from mild symptoms that only affect normal daily activities to visual acuity or life-threatening diseases; Keratitis, a generalized viremia or retinitis in AIDS patients, abortion in pregnant women and hepatitis, enccephalitis or deafness in newborns are particularly worth mentioning here. there is a strong medical need for safe and effective medication and extensive research programs have been launched to find new, more effective antivirals.
  • Zovirax TM (Acyclovir), a selective and specific inhibitor of He ⁇ es virus replication, was the first milestone in the development of antiviral agents at the end of the 1970s.
  • the nucleosides are so-called pro-drugs, which first phosphorylate through the viral thymidine kinase (TK) and then have to be subsequently converted by cellular kinases so that the actual active ingredient, the nucleoside triphosphate, has the activity of the viral DNA polymerase can inhibit.
  • TK viral thymidine kinase
  • the virus does not have any functionally active TC, as is the case for example with resistant HHV1 mutants, with TC negative viruses such as HCMV or viruses that do not have an optimal primary structure with reference to the viral DNA
  • TC negative viruses such as HCMV or viruses that do not have an optimal primary structure with reference to the viral DNA
  • polymerase is present, the active ingredient cannot develop its full potential, the selectivity index is significantly reduced and higher doses have to be applied, which in turn can lead to increased side effects.
  • nucleosides and nucleotides are obligatory or non-obligatory terminators of DNA polymerisation, they have mutagenic potential, which has been extensively documented for the nucleoside Cymevene TM (ganciclovir).
  • nucleoside Cymevene TM ganciclovir
  • Mechanisms of action are based, clearly outlined.
  • Inhibitors of He ⁇ es helicase primase are also known from J. Med. Chem. 1995, 38, 1811-1819.
  • the patent application WO 97/24343 describes a method for identifying inhibitors with anti-he ⁇ es properties, which is characterized in that compounds are selected which, if they bind to the DNA-helicase-primase complex, stabilize the DNA-enzyme complex. It is believed that these inhibitors bind to allosteric binding sites on the UL5 or UL52 gene product of HSV helicase primase or homologous he hees viral enzyme complexes, and thus trigger the stabilizing effect. This allosteric binding pocket is said to be located in the region of the AB sequence on the UL52 subunit and the inhibition is mediated by blocking a terminal zinc finger on a catalytic subunit of the He ⁇ es helicase primase.
  • a decisive disadvantage of this method is that compounds are often identified which do not have the required selectivity index in vitro or the desired tolerance in vivo have, and as a consequence usually can not be used for the treatment of He ⁇ es infections due to the unsafe drug safety.
  • the aim of this invention is therefore to provide a method with which not only alternative or more effective compounds can be identified, but above all active ingredients with an improved selectivity index in vitro and a superior compatibility with respect to the prior art can be found.
  • Another aspect of this invention is to identify and provide active substances which can be used for the therapy of infections which are triggered by nucleoside / nucleotide-resistant He ⁇ es viruses.
  • the present invention solves the problem described above by making available medicaments which contain non-competitive inhibitors of He ⁇ es helicase primase.
  • the medicaments are characterized in that the helicase primase is at least 50% homologous to the heliase primase of He ⁇ es simplex virus 1, based on the nucleotide sequence or the amino acid sequence, respectively after what's higher.
  • the medicaments are characterized in that the virus carrying the helicase primase is He ⁇ es-Simplex virus 1.
  • the medicaments are characterized in that those compounds are selected in the medicament which have the ability to bind simultaneously to the helicase and the primase subunit of the helicase-primase complex.
  • the medicaments are characterized in that those compounds are selected in the medicament which have the ability to inhibit the DNA-dependent NTPase activity of the helicase primase.
  • the medicaments are characterized in that those compounds are selected in the medicament which have the ability to inhibit the replication of a He ⁇ es virus. In a further preferred embodiment, the medicaments are characterized in that those compounds are selected in the medicament which have the ability to inhibit the replication of a He ⁇ es virus in cell culture at a concentration of 10 ⁇ M by at least 50%.
  • the medicaments are characterized in that those compounds are selected in the medicament which have the ability to inhibit the replication of a He ⁇ es virus in cell culture at a concentration of ⁇ 500 nM by at least 50%.
  • the medicaments are characterized in that the viruses carrying helicase primase are PRV or BHV.
  • a method for identifying compounds with anti-He ⁇ es activity is described, which is characterized in that the compounds are tested for their ability to inhibit the helicase primase and those compounds are selected which are suitable for the helicase Inhibit primase enzyme complex incompetitively.
  • the invention relates to compounds that are identified by any method or method claimed herein.
  • the invention is characterized in that the compound is not a nucleoside or nucleotide.
  • the invention relates to compounds which are used for the production of medicaments for the treatment and prophylaxis of He ⁇ es infections.
  • the invention relates to pharmaceuticals or pharmaceutical formulations which contain compounds according to the methods or processes listed above.
  • the invention describes a method for the treatment and prophylaxis of He ⁇ es infections in mammals, which is characterized in that a therapeutically effective amount of the pharmaceutical or pharmaceutical formulation claimed here is administered to the mammal in need of such therapy.
  • the invention relates to medicaments which are characterized in that they contain compounds which have the following general structural formula (I),
  • Z for (C 6 -C 1 o) aryl which is optionally substituted by 1 to 3 substituents, selected from (CrC alkanoyl, (-C ⁇ alkoxy, (Ct-C 6 ) alkyl, halogen, (-C ⁇ Al - Koxycarbonyl, nitro, halogen (C ⁇ -C 6 ) alkyl, halogen (C_-C 6 ) alkoxy, amino, (C 1 -C 6 ) alkylthio, hydroxy, carboxyl, carbamoyl, mono- or di (C ⁇ -
  • alkylaminocarbonyl mono- or di (C -C 6) alkanoylamino, (CrC ⁇ Al koxycarbonylamino, (C ⁇ -C 6.)
  • Alkylsulfoxy (C -C ö ⁇ alkylsulfonyl, Tr ⁇ ö dC.) - alkylsilyloxy, a 3- to 8-membered saturated or unsaturated, non-aromatic mono- or bicyclic heterocycle optionally bonded via a nitrogen atom can be substituted with up to 3 heteroatoms from the series S, N and / or O, and / or cyano, or
  • Z stands for a 5- to 6-membered aromatic heterocycle, optionally bonded via a nitrogen atom, with up to 3 heteroatoms from the series S, N and / or O, which may be substituted by 1 to 3 substituents, selected from (C 1 -C 6 ) alkanoyl, (C 1 -C 6 ) alkoxy, (C ⁇ -C6) alkyl, halogen, (C ⁇ -C 6 ) alkoxycarbonyl, nitro, halogen (C ⁇ -C 6 ) alkyl, Halogen (C 1 -C 6 ) alkoxy, amino, (C 1 -C 6 ) alkylthio, hydroxy, carboxyl, carbamoyl, mono- or di (C 1 -C 6 ) alkylaminocarbonyl, mono- or di (C 6 -C 6 ) alkanoylamino , (Ci-C 6 ) alkoxycarbonylamino, (-C-C 6 ) alkylsul
  • Z stands for a 3- to 8-membered saturated or unsaturated, non-aromatic, mono- or bicyclic heterocycle, optionally bonded via a nitrogen atom, with up to 3 heteroatoms from the series S, N and / or O, optionally with 1 to 3 substituents selected from oxo, halogen, hydroxy, (QC ⁇ -alkoxycarbonyl, (C.-C 6 ) alkoxycarbonylamino, (C ⁇ -C 6 ) alkyl, halogen (C ⁇ -C 6 ) alkyl and hydroxy (C 1 -C 6 ) - alkyl can be substituted, or
  • Z stands for -OR 19 , -NR 20 R 21 or -CO-NR 22 R 23 ,
  • R denotes phenyl, which in turn is optionally substituted by a group of the formula -NR 24 R 25 ,
  • R 24 and R 25 are the same or different and are hydrogen, (C Cö) - alkyl or (C ⁇ -C 6 ) -acyl,
  • R 19 (C.-C6) alkyl or (C 3 -C 8) represents cycloalkyl which is optionally mono- to trisubstituted by hydroxyl and / or halogen,
  • R 20 and R 21 are identical or different and are hydrogen, carbamoyl, mono- or di (Ci-C6) a_kylammocarbonyl, phenyl, (C 1 -C 6 ) acyl or (Ci-C 6 ) alkyl,
  • Alkoxy, (-C-Ce) -acyl is substituted by phenyl or by a 5- to 6-membered aromatic heterocycle with up to 3 heteroatoms from the series S, N and / or O,
  • Heterocycle are optionally mono- to trisubstituted identically or differently by halogen and / or hydroxy, and
  • R 22 and R 23 are identical or different and denote hydrogen or (dC ⁇ alkyl
  • R 4 , R 4 , R 5 , R 5 , R 9 and R 9 are the same or different and are hydrogen
  • Heterocycle a 3- to 8-membered saturated or unsaturated, non-aromatic heterocycle, optionally bonded via a nitrogen atom,
  • R 1 and R 2 are identical or different and for hydrogen, (-C-C 6 ) -
  • angle AX-SO being 2 , 153 ° ⁇ 15% and the compound having a molar mass of less than 500 g / mol
  • the invention set out here solves the problems listed above or fulfills the goals set for new therapeutic agents by methods for identifying new (non-nucleosidic) active substances which directly affect the enzymatic activity of He ⁇ es
  • He ⁇ es insofar as it is used in the context of this invention, includes all viruses of the family of He ⁇ es viruses and includes in particular the He ⁇ es viruses which code for helicase primase proteins. This is especially true for proteins that are homologous with reference to the He ⁇ es helicase primase of the HSV virus. This applies in particular to those in which the helicase or primase is at least 50% homologous to the helicase or primase of He ⁇ es simplex virus 1, based on the nucleotide or amino acid sequence, whichever is higher.
  • the family of He ⁇ esviruses include, for example, HHV-1 to HHV-8, EHV, BHV, PRV, etc.
  • He ⁇ es simplex viruses 1 and 2 are named according to their serotype, which are characterized on the basis of specific monoclonal antibody reactions.
  • helicase primase refers to the helicase primase enzyme complex that is necessary for replication of the viral DNA.
  • this erizyme complex consists of the proteins of the genes UL5, UL8 and UL52 or at least the (necessary or essential) UL5 and UL52 gene products; if there are other members of the He ⁇ es family, reference is made to the corresponding homologs.
  • helicase denotes the subunit of the helicase-primase complex that is involved in viral DNA replication. In the case of He ⁇ es simplex viruses, this is the UL5 gene product; if there are other members of the He ⁇ es family, reference is made to the corresponding homologs.
  • primase denotes the subunit of the helicase-primase complex that is involved in viral DNA replication. In the case of He ⁇ es simplex viruses, this is the UL52 gene product; if there are other members of the He ⁇ es family, reference is made to the corresponding homologs.
  • the abbreviation moi stands for "multiplicity of infection” and is the quotient of the number of infectious particles or cells of the pathogen divided by the number of cells to be infected.
  • MOI number of cells or number of infectious particles of the pathogen / number of cells that are infected).
  • IC50 or EC50 describes the concentration or amount of active ingredient that is required to achieve 50% inhibition in a given test system or the effective concentration that is required to achieve a half-maximum signal in an assay.
  • SI selectivity index
  • formulation with reference to active ingredients describes a pharmaceutical composition which consists of non-toxic, generally inert auxiliaries and carrier materials which do not have a negative effect on the action of the active ingredient, but rather an optimal application of the active ingredient with reference to Allow pharmacokinetics and pharmacodynamics.
  • uncompetitive inhibition describes a rare type of inhibitor in which the inhibitor binds to the enzyme-substrate complex. With this type of inhibition, the maximum speed changes, Km remains unchanged in the context of experimental uncertainty.
  • uncompetitive expressly includes the partially uncompetitive inhibitor types.
  • target here generally refers to the target molecule, which activity may be modulated by active substances.
  • the target is general I often speak of a gene product that is essentially involved in the development of a clinical picture.
  • mutation in a target describes a mutation in a gene that leads to a change in the amino acid sequence of the corresponding protein.
  • (C.-C 6 ) -alkyl suitably represents a straight-chain or branched alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms.
  • a straight-chain or branched alkyl radical having 1 to 4 carbon atoms (C 1 -C 4 ) is preferred. Examples include: methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl and n-hexyl.
  • (C 6 -C ⁇ o) aryl generally represents an aromatic radical having 6 to 10 carbon atoms.
  • Preferred aryl radicals are phenyl and naphthyl.
  • (C 3 -C 8 ) cycloalkyl stands for cyclopropyl, cyclopentyl, cyclobutyl, cyclohexyl, cycloheptyl or cyclooctyl. The following may preferably be mentioned: cyclopropyl, cyclopentyl and cyclohexyl.
  • the meaning of (C 3 -C 6 ) cycloalkyl is appropriately cyclopropyl, cyclopentyl, cyclobutyl, cyclohexyl.
  • a 5- to 6-membered aromatic heterocycle with up to 3 heteroatoms from the series S, O and / or N is, for example, pyridyl, pyrimidyl, thienyl, furyl, pyrrolyl, thiazolyl, N-triazolyl, oxazolyl or nidazolyl. Pyridyl, furyl, thiazolyl and N-triazolyl are preferred.
  • a 5- to 6-membered aromatic benzocondensed heterocycle with up to 3 heteroatoms from the series S, O and / or N is, for example, benzimidazolyl.
  • a 3- to 8-membered saturated or unsaturated, non-aromatic heterocycle, optionally bonded via a nitrogen atom, with up to 3 heteroatoms from the series S, N and / or O includes e.g. Mo ⁇ holinyl, piperidinyl, piperazinyl, methylpiperazinyl, Thiomo ⁇ holinyl or pyrrolidinyl and 3-, 7- and 8-membered heterocycles, such as e.g. Aziridines (e.g. 1-azacyclopropan-l-yl), azetidines (e.g. 1-azacyclobutan-l-yl) and azepines (e.g. 1-azepan-l-yl).
  • the unsaturated representatives can contain 1 to 2 double bonds in the ring.
  • Inhibiting helicase-primase complex can be identified by the ability of the substances to bind to the helicase (subunit) and or
  • Primase (subunit) of the helicase-primase complex is checked.
  • HTS high-throughput screening
  • the ability of the substances to inhibit viral replication in an in vitro cell culture system can also be tested and then the substances can be selected which uncompetitively inhibit the DNA-dependent hydrolysis of relevant nucleotides.
  • Measuring proteins however, many of these test systems require purified protein or at least an enriched fraction to get quantitative results. At this point it should not be left unmentioned that not all molecules binding to the protein or enzyme modulate the function of the target in the desired manner.
  • the enzymatic assay can be carried out easily, but the enzyme must be functionally purified from a He ⁇ es infected cell culture.
  • the genes of the enzyme complex can be cloned into a corresponding expression system using genetic engineering methods and then expressed. Will that
  • enzyme If enzyme is produced functionally, it must be enriched with the usual purification techniques or, preferably, presented in pure form.
  • a viral replication assay can be carried out very simply in a cell culture system as described in this application. This assay is possibly more sensitive than the enzymatic test systems mentioned because the virus multiplication in cell culture best simulates the real infection process and the number of enzyme molecules may be lower with respect to the inhibitor than in the enzyme assay. If inhibitors of virus replication are identified, however, other methods such as the production of mutants with subsequent genome sequencing must be used in combination with a complementation analysis. in order to elucidate the mechanism of action or to identify the underlying target (in the present example the viral helicase primase).
  • test systems make it possible to determine whether a given active substance inhibits the enzyme-mediated RNA primer biosynthesis or whether the substance modulates the helicase activity of the complex.
  • DNA preferably single-stranded DNA with a corresponding primase consensus sequence in the case of the primase assay, or a DNA substrate that forms a structure similar to a replication fork can be used in the helicase assay.
  • Numerous options are described and here is the overview literature (Boehmer PE & Lehmann IR 1997) or the special publications
  • the (non-nucleosidic) compound can also be tested for the ability to inhibit He ⁇ es helicase primase-mediated RNA primer biosynthesis or the helicase activity. It is crucial, however, that the (non-nucleosidic) active substances described in this invention are tested for their ability to inhibit virus replication in cell culture at a concentration of less than 10 ⁇ M by at least 50%.
  • the compounds which inhibit virus replication at as low concentrations as possible are preferably selected. However, it must be taken into account here that these compounds also have the desired phanakokinetic pharmacodynamic properties.
  • the compounds, the formulated active ingredients and the methods disclosed are suitable for successfully treating He Heesinfections that do not respond to nucleoside therapy and are usually triggered by nucleoside-resistant He ⁇ esviruses.
  • this aspect of the invention includes the method of treating acyclovir-resistant He ⁇ es infections by administering to the infected mammal effective doses of one of the disclosed compounds, which may optionally be formulated accordingly.
  • the antiviral activity of the compounds can be demonstrated using biochemical, microbiological and biological methods.
  • This invention discloses the inhibition of the viral replication of the He ⁇ es viruses in cell culture, which is shown by way of example for members of the He ⁇ es family such as HSV, BHV and PRV (see Table 1).
  • the HTS-capable viral replication test to be carried out in cell culture provides analog data such as the so-called plaque reduction assay in a more efficient manner and is described below.
  • the proof of a therapeutic effect of the compounds is carried out using an in vivo model.
  • the so called lethal challenge animal model as well as the
  • Table 1 summarizes the inhibition data of the helicase-primase enzyme complex (Ki values), results on the mechanism of action, the IC50 and EC 50 inhibition data of the virus replication of the wild-type and therapy-resistant HSV strains, the ED 50 values of the wild-type virus in the animal model and the relevant mutations - as well as cross resistance patterns together.
  • Acyclovir (ZoviraxTM) market standard The data obtained in vivo clearly show that this activity found in vitro of the compounds is reflected in a superior potency and effectiveness in the animal model.
  • the example compounds inhibit acyclovir-resistant HSV-1 (F) mutants and wild-type HSV-1 F) with almost identical IC 50 values.
  • Broadband spectrum anti-He ⁇ es activity is shown with the selected compounds Example 1, 4, 5, 6 and 7, which inhibit as different He ⁇ es viruses such as the human He ⁇ es simplex virus as well as the swine (PRV) and cattle (BHV) animal He ⁇ es virus. These compounds are also effective against all clinical isolates tested so far (39 HSV-1 and 19 HSV-2 isolates were tested).
  • PRV swine
  • BHV cattle
  • HSV-1 DNA-dependent ATPase assay (this in vitro assay allows testing for inhibition of HSV-1 helicase primase).
  • the HSV-1 helicase-primase heterodimer enzyme complex was generated using the recombinant baculovirus expression system in double-infected Sf9 (Spodoptera frugiperda) cells.
  • a recombinant baculovirus codes for the helicase gene UL5 and the second virus for the manipulated primate gene UL52-6xHis.
  • the genes were amplified by PCR from the HSV-1 (F) genome (American Tissue Culture Collection ATCC VR-733) and cloned into the baculovirus (UL5 -> pFASTBACl; UL52 -> pFASTHTb) like this in the Instruction Manual BAC-TO-
  • the refined heterodimeric helicase-primase complex (200 ng) was treated with 1 ⁇ g
  • DNA (Sigma D3287 or D8681) in 20 mM HEPES (pH 7.6; 4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazineethanesulfonic acid), 5 mM MgCl 2 , 0.2-5 mM ATP, 100 ⁇ g BSA (bovine serum albumin) per ml, 10% glycerol, 1 mM DTT (DL- (othiothreitiol) and possibly inhibitor in the appropriate concentration for 60 min at 37 ° C.
  • HEPES pH 7.6; 4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazineethanesulfonic acid
  • 5 mM MgCl 2 0.2-5 mM ATP
  • 100 ⁇ g BSA bovine serum albumin
  • 10% glycerol 10% glycerol
  • DTT DL- (othiothreitiol) and possibly inhibitor in the appropriate concentration for 60 min at 37 ° C.
  • the released inorganic phosphate was determined colorimetrically as described in "An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate ", 1979, PA Lanzetta, IJ Alvarez, PS Reinach and OA Candia, Analytical Biochemistry, 100: 95-97.
  • the inhibition of DNA-dependent ATPase activity was calculated from the change in absorption in the presence and absence of inhibitor.
  • the enzyme kinetic evaluations were carried out according to the standard works of the literature such as Enzyme kinetics by Hans Bisswanger, theory and methods, VCH publishing company, 1994.
  • the K values were calculated using Sigma Plot Software 4.0 and the non-linear method
  • Table 2 shows the dose dependent inhibition / titration of the ATPase activity of the HSV-1 helicase-primase enzyme complex with the representative example 6.
  • the ATPase activity of the helicase-primase heterodimer was
  • Detection by formation of inorganic phosphate (Pi) measured in the presence of saturated DNA concentrations and varying ATP and inhibitor concentrations, as explained under the point ATPase assay.
  • the inhibition of ATPase activity by example compound 6 is dose-dependent and is also influenced by the ATP concentration.
  • HSV HSV-1 Walki, HSV-1F or HSV-2G was tested on Vero cells (ATCC CCL-1)
  • the cells were grown in ml 99 medium (5% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin) in cell culture bottles at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the cells were split 1: 4 twice a week. The medium was removed for the infection, the cells were washed with “Hank's solution”, with 0.05% trypsin,
  • 0.02% EDTA (Seromed L2143) detached and incubated at a density of 4x10 5 cells per ml under the above conditions for 24 hours. The medium was then removed and the virus solution with a moi of ⁇ 0.05 in a volume of 2 ml per 175 cm 2 surface was added. After incubation under the conditions mentioned for one hour, the medium was brought to a volume of
  • the viral titer was determined using a plaque assay.
  • Vero cells were seeded in a density of 4x10 5 cells per well in 24 well plates and after 24 hours incubation (37 ° C, 5% CO 2 ) infected with dilutions of the virus stock from 10 "2 to 10 " 12 (100 ⁇ l inoculum). 1 hour after infection, the medium was removed and the cells with 1 ml overlay medium (0.5% methyl cellulose, 0.225 sodium bicarbonate, 2 mM glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 5% fetal calf serum in MEM-Eagle medium with Earfs Salt) overlaid and incubated for 3 days. The cells were then fixed with 4% formalin for 1 hour, washed with water, stained with Giemsa (Merck) for 30 min and in
  • the virus stocks used for the experiments had a titer of lxl0 6 / ml - lxl0 8 / ml.
  • the anti-HSV effect was determined in a screening test system in 96-well microtitre plates with the aid of various cells of neuronal, lymphoid and epithelial origin such as, for example, Vero (kidney cell line of the green sea cat), MEF (murine embryonic fibroblasts) , HELP (human embryonic
  • Fibroblasts Fibroblasts
  • NT2 human neuronal cell line
  • Jurkat human lymphoid T cell line
  • a suspension of cells (1 ⁇ 10 4 cells per well) such as Vero cells in Ml 99 (medium 199) with 5% fetal calf serum, 2 mM glutamine and optional 100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin or
  • MEF cells in EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • HELF cells in EMEM with 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine and optional 100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin
  • NT2 and Jurkat cells in DMEM 4.5 mg / 1 glucose plus pyridoxine
  • Calf serum 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyravate, non-essential amino Acids and optionally 100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin were added to each well and the cells in the relevant wells were infected with an appropriate amount of virus (HSV-1 F or HSV-2 G with a moi (multiplicity of infection) of 0 , 0025 for HELF, Vero and MEF cells and a moi of 0.1 for NT2 and Jurkat cells).
  • the plates are then at 37 ° C in a CO 2 -
  • Incubator (5% CO 2 ) incubated for several days. After this time, the cell lawn of, for example, Vero cells in the substance-free viral controls, starting from 25 infectious centers, is completely lysed or destroyed by the cytopathogenic effect of the HSV viruses (100% CPE). The plates are first evaluated optically using a microscope and then analyzed using a fluorescent dye.
  • the cell culture supernatant from all the wells of the MTP is suctioned off and filled with 200 ⁇ l PBS washing solution.
  • the PBS is aspirated again and all wells are filled with 200 ⁇ l fluorescent dye solution (fluorescein diacetate, 10 ⁇ g / ml in PBS).
  • the test plates are measured in a fluorescence measuring device at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 538 nm.
  • the IC 50 is the concentration of the inhibitor at which viral replication in cell culture is inhibited by 50% compared to the non-infected cell control or alternatively to an acyclovir control treated with the 20-fold IC 5 ⁇ concentration.
  • the reduction is determined here by the fact that the fluorescence signal of the infected well of an MTP reaches 50% of the signal of the control listed above.
  • Naturally occurring resistant viral mutants were 5 o concentration of the other examples as listed in Table 1 in the presence of 1 .mu.M of the sample substance or at least 7 of the 100 times the IC, selected by means of the viral replication assay in cell culture.
  • 10,000 Vero cells are made in 96-well microtiter plates Seeded as described above and incubated overnight. The substance is added in the appropriate concentration and the cells are then infected with 1000 PFU (plaque forming units; moi 0.1). Mutants occurred at a frequency of 1x10-6 to 5x10-6 in the case of the HSV-1 (F).
  • the mutants were identified by microscopic observation or simply by freezing (-80 ° C) of 10 ⁇ l
  • the virus DNA was prepared according to the protocols found in the method manual "He ⁇ es Simplex Virus Protocols, 1998, Ed. SM Brown & AR MacLean, Humana Press, Totowa, New Jersey” and according to the protocol "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, 1977, Sanger F, Nicklen S, Coulson
  • the mutations found in the resistant viruses are listed in Table 1 by way of example.
  • IC50 HSV-1 F / Vero cells
  • the compounds according to the invention are therefore valuable active substances for the treatment and prophylaxis of diseases which are triggered by He ⁇ es viruses, in particular He ⁇ es simplex viruses.
  • He ⁇ es viruses in particular He ⁇ es simplex viruses.
  • He ⁇ es infections especially He ⁇ es Simplex infections in patients with clinical pictures such as He ⁇ es labialis, He ⁇ es genitalis, and HSV-related keratitis, encephalitis, pneumonia, hepatitis etc.
  • He ⁇ es infections in particular He ⁇ es Simplex infections in immunosuppressed patients (e.g. ATDS patients, cancer patients, patients with genetically related uterine deficiency, transplant patients)
  • immunosuppressed patients e.g. ATDS patients, cancer patients, patients with genetically related uterine deficiency, transplant patients
  • mice 6 week old female mice, strain BALB / cABom, were obtained from a commercial breeder (Bomholtgard Breeding and Research Center Ltd.).
  • the animals were anesthetized in a tight glass jar with diethyl ether (Merck). 50 ⁇ l of a dilution of the viral stock (infection dose 5 ⁇ 10 4 Pfu) was introduced into the nose of the anesthetized animals using an Eppendorf pipette. In 90-100% of the animals this infection dose leads to a generalized infection with prominent respiratory and central nervous symptoms on average between 5 and 8
  • Tylose / PBS (Hoechst) resuspended (final concentration 1.5% DMSO, 0.5% tylose in PBS).
  • the active substance can act systemically and / or locally.
  • it can be applied in a suitable manner, such as, for example, orally, parenterally, pulmonally, nasally, sublingually, lingually, buccally, rectally, transdermally, conjunctivally, otically or as an implant.
  • the active ingredient can be administered in suitable administration forms for these administration routes.
  • Known application forms which release the active ingredient quickly and / or modified such as e.g. Tablets (non-coated and coated tablets, e.g. enteric coatings), capsules, dragees, granules, pellets, powders, emulsions, suspensions and solutions.
  • Tablets non-coated and coated tablets, e.g. enteric coatings
  • capsules dragees, granules, pellets, powders, emulsions, suspensions and solutions.
  • Parenteral administration can be done by bypassing a resorption step (intravenously, intraarterially, intracardially, intraspinally or intralumbally) or by switching on a resection (intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, percutaneously, or intraperitoneally).
  • Suitable forms of application for parenteral administration include: Injection and infusion preparations in the form of solutions, suspensions, emulsions, lyophilisates and sterile powders.
  • Inhaled drug forms e.g. powder inhalers, nebulizers
  • nasal drops / solutions, sprays e.g., nasal drops / solutions, sprays; tablets or capsules to be applied lingually, sublingually or buccally, suppositories, ear and eye preparations, vaginal capsules, aqueous suspensions (lotions, shaking mixtures), lipophilic suspensions, ointments, creams, milk, pastes, powder or
  • the active compounds can be converted into the administration forms mentioned in a manner known per se. This is done using inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients. These include carriers (eg microcrystalline cellulose), solvents (eg liquid polyethylene glycols), emulsifiers (eg sodium dodecyl sulfate), dispersants (eg polyvinylpyrrolidone), synthetic and natural biopolymers (eg albumin), stabilizers (eg antioxidants such as ascorbic acid), colorants (eg inorganic pigments such as iron oxides) or taste and / or odor correctors.
  • carriers eg microcrystalline cellulose
  • solvents eg liquid polyethylene glycols
  • emulsifiers eg sodium dodecyl sulfate
  • dispersants eg polyvinylpyrrolidone
  • synthetic and natural biopolymers eg albumin
  • stabilizers eg antioxidants such as ascorbic acid
  • colorants eg
  • the amount is approximately 0.1 to 50 mg / kg, preferably approximately 0.5 to 15 mg / kg body weight.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren des viralen Helikase-Primase Enzymkomplexes mit anti-Herpes Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen folgende allgemeine Strukturformel: Z-Y-A-X-SO2NR1R2 (I) aufweisen.

Description

Unkompetitive Inhibitoren der Helikase-Primase
Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren des viralen Helikase-Primase Enzym- komplexes mit anti-Heφes Aktivität sowie Medikamente, die diese Verbindungen in geeigneter Formulierung enthalten. Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung von anti-viral wirksamen Substanzen, um heφes Infektionen bei Mensch und Tier zu behandeln.
Die Wirkung der Verbindungen beruht im wesentlichen auf der unkompetitiven
Hemmung der viralen Helikase-Primase, der simultanen Bindung der Substanzen an die Helikase und die Primase Untereinheit des Enzymkomplexes, der Inhibition der Virusreplikation in vitro und in vivo sowie nicht zuletzt auf den sehr guten pharma- kokinetischen und pharamakodynamischen Eigenschaften, die _uι einer bislang nicht erreichten Wirkung im Tiermodell führen.
Im folgenden werden die einzelnen Aspekte wie der virale Replikationsassay in Zellkultur, die Bindung eines Moleküls an zwei Targets, die Heφes Viren sowie das Forschungsumfeld, der Stand der Technik und die Erfindung selbst beschrieben.
In dieser Anmeldung ist ein viraler Replikationsassay beschrieben, der es erlaubt, wirksame und verträgliche antivirale Verbindungen zu identifizieren. Die Strategie basiert auf der simultanen Auswahl von Molekülen nach 2 wesentlichen Kriterien und zwar erstens mit Bezug zur anti-mikrobiellen Wirkung (das Molekül bindet funktionell an ein relevantes Target (Positivselektion)) und zweitens müssen die
Verbindungen verträglich sein, d.h. die Moleküle binden oder modulieren dann keine unerwünschten (Wirts-) Targets (Negativselektion).
Zahlreiche Medikationen und Therapien wurden erfunden und in der jüngeren Ver- gangenheit werden diese Methoden zunehmend kombiniert, um die therapeutische
Wirksamkeit zu erhöhen, weil Monotherapien in einigen Fällen nicht den gewünsch- ten profunden Nutzen bei der Applikation am Patienten gezeigt haben. Leider werden bei der Anwendung der Kombinationstherapie in einigen Fällen neben der erwünschten Potenzierung des Therapieeffektes auch verstärkt Nebenwirkungen beobachtet, die auf eine geringe Verträglichkeit .αiriickzuführen sind. Als ein klassi- sches Beispiel der Kombinationtherapie kann hier die Behandlung der HιV-rnfizier- ten bzw. das Therapieschema der AIDS Patienten aufgeführt werden.
Im Bereich der Antiinfektiva Forschung zum Beispiel, kann ein Wirkstoff, der simultan zwei essentielle Targets im Vermehrungszyklus eines Pathogens inhibiert, einen verstärkten Therapieeffekt entfalten. Diese Wirkungsverstärkung basiert auf kumulativen, inhibitorischen Effekten wie das in der Vergangenheit für den analogen Fall der Kombinationstherapie, die häufig der (ein Molekül Chemo-) Monotherapie, bei welcher der Wirkstoff des Therapeutikums in der Regel nur eine relevante Bindungstasche eines Proteins oder einer Untereinheit eines Proteinkomplexes modu- liert, überlegen ist, gezeigt wurde. Bindet der Wirkstoff im Bereich der Kontaktstelle von zwei Targets so kann häufig eine stärkere Bindung aufgrund von Aviditäts- effekten festgestellt werden. Die besseren Bindungseigenschaften und oder die kummulativen inhibitorischen Effekte resultieren in einer überlegenen therapeutischen Wirkung, die sich idealerweise ohne Nebenwirkungen entfaltet, d.h. durch eine sehr gute Verträglichkeit auszeichnet. Für den Patienten bedeutet das erfreulicherweise in der Konsequenz niedrigere Dosen.
Die Heφesviridae entwickelten sich in der Evolution über Millionen von Jahren und sind in der Natur sehr weit verbreitet. Mitglieder dieser Familie wurden im Men- sehen, nicht-humanoiden Primaten und den meisten anderen Säugetieren und Verte- braten nachgewiesen (Virology, 1996, Fields et al. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA 19106, USA). Bei den Heφesviren handelt es sich um umhüllte, doppelsträngige DNA Viren, die permissive Zellen infizieren, welche auf ihrer Zelloberfläche neben negativen Ladungen des Heparansulfates und oder der Glykosami- noglycane zusätzlich noch den sogenannten herpes viral entry mediator tragen. Eine bemerkenswerte Eigenschaft der Viren ist ihre Fälligkeit, eine lebenslange Latenz im infizierten Wirt auszubilden und bei endogenen oder externen Stimuli aus dem Pool der latent infizierten Zellen mehr oder weniger häufig zu reaktivieren und rekurrente Infektionen auszulösen.
Acht humane Heφesvirusen (HHVl to HHV8) wurden bislang beschrieben. Die viralen Genome (~ 125-230 kbp Information) wurden sequenziert und in den gängigen Datenbanken, die auch über das Internet verfügbar sind, hinterlegt (GeneBank, EMBL database etc.). Hohe Sequenzhomologien wurden beim Vergleich der Genome identifiziert. Im besonderen trifft dieses auf die für die Helikase und Primase kodierenden Gene zu; das bedeutet, daß die Replikationsmaschinerie unter den Heφes Viren hochkonserviert ist aber beim Vergleich mit eukaryontischen Genen klar von der DNA Replikation des Wirtes abgegrenzt werden kann. Die Genome kodieren für mehr als 50 Leserahmen, die für den Vermehrungszyklus der Viren in vitro und oder in vivo essentiell sind. Zahlreiche Publikationen diskutieren die Relevanz oder die Eignung dieser potentiellen Targets für eine erfolgreiche anti- virale Therapie. Die Funktion des Helikase-Primase Enzymkomplexes im Replika- tionszyklus und dessen Eignung als Target für eine effiziente antivirale (Che o) Therapy einer Heφes-viralen Infektion ist bereits veröffentlicht (Heφes Simplex Virus Replication, 1997, Annual review of Biochemistry, Boehmer PE & Lehmann IR, 66, 347-384; The Structure and function of the HSV DNA replication proteins: defining novel antiviral targets, 1993, Antiviral Research, Matthews JT, Terry BJ, Field AK, 20, 89-114).
Aufgrund von ähnlichen biologischen Eigenschaften wurden die Heφesviren in 3 Subfamilien, und zwar in α-(HHVl bis 3), ß-(HHV5 bis 7), und γ-(HHV4 und
HHV8) Heφesviren, eingeteilt. Trivialnamen wurden auf Grundlage der klinischen Symptome des Krankheitsbildes oder einfach aus historischen Gründen wie folgt abgeleitet: Heφes simplex virus 1 und 2 (HSV-1 und -2 verursachen Heφes labialis und genitalis) stehen auch fiir HHVl und 2, das Varicella Zoster Virus (VZV ist der Erreger der Windpocken und der Gürtelrose) wird synonym mit HHV3 und das Epstein-Barr- Virus (EBV) und das Cytomegalievirus (HCMV) werden synonym mit der Bezeichnung HHV4 und 5 benutzt.
Innerhalb einer Population liegt der Anteil der mit einem oder mehreren Heφes Viren Infizierten zwischen weniger als 10 und mehr als 90 % abhängig von der
Altersgruppe, dem Geschlecht, dem sozialen Status, geographischen Aspekten und natürlich davon welches Heφesvirus untersucht wird. Gerade weil es sich bei einigen Heφesviren um ubiquitär vorkommende Pathogene handelt, die eine Reihe von Krankheiten auslösen, welche von leichten Symptomen, die nur die normalen Tages- aktivitäten beeinträchtigen, bis hin zu Visus oder lebensbedrohlichen Erkrankungen reichen kann; insbesondere seien hier die bei immunsupprimierten Patienten die Keratitis, eine generalisierte Virämie oder bei AIDS Patienten eine Retinitis, bei Schwangeren der Abort und bei Neugeborenen eine Hepatitis, Enczephalitis oder Taubheit genannt; ist ein starker medizinischer Bedarf an einer sicheren und wirksa- men Medikation vorhanden und es wurden umfangreiche Forschungsprogramme aufgelegt, um neue, effektivere Virustherapeutika zu finden.
Zovirax™ (Acyclovir), ein selektiver und spezifischer Inhibitor der Heφes Virus Replikation, war Ende der 70iger Jahre des 20. Jahrhunderts der erste Meilenstein in der Entwicklung antiviraler Wirkstoffe. Neue Abkömmlinge dieses kommerziell sehr erfolgreichen Nukleosids sind Penciclovir oder die or pharmakokinetisch optimierten Pro-drugs Valacyclovir und Famciclovir, die dem Patienten bequemere Dosis oder Theφieregime eröffnen, wurden Mitte bis Ende der 90iger Jahre ausgeboten. Nukleoside sind heute in Ermangelung einer Alternative in der Tat die Therapeutika der Wahl bei Heφes Infektionen. Bei den Nukleosiden handelt es sich jedoch um sogenannte Pro-drugs, die zuerst durch die virale Thymidin-Kinase (TK) phosphory- liert und dann nachfolgend von zellulären Kinasen umgesetzt werden müssen, damit der eigentliche Wirkstoff das Nukleosidtriphosphat die Aktivität der viralen DNA- polymerase hemmen kann. Weist der Virus keine funktionell aktive TK auf, wie das zum Beispiel bei resistenten HHVl Mutanten, bei TK negativen Viren wie HCMV oder Viren, die nicht über eine optimale Primärstruktur mit Bezug zur viralen DNA- Polymerase aufweisen, der Fall ist, so kann der Wirkstoff nicht sein volles Potenital entfalten, der Selektivitätsindex ist deutlich reduziert und höhere Dosen müssen appliziert werden, die wiederum zu vermehrten Nebenwirkungen führen können. Da es sich bei den Nucleosiden und Nukelotiden um obligate oder nicht-obligate Termi- natoren der DNA-Polymerization handelt, besitzen sie mutagenes Potential was für das Nucleosid Cymevene™ (Ganciclovir) umfangreich dokumentiert ist. Zusam- mengefast kann man feststellen, daß eine mögliche Breitbandspektrum anti-Heφes Aktivität, die Wirksamkeit der Medikamente besonders bei spät einsetzender Therapie, die Arzneimittelsicherheit und das Auftreten von Nukleosid-resistenten Viren, die anvisierten Ziele für die nächste Generation von Therapeutika, die auf neuen
Wirkmechanismen beruhen, klar umreissen.
Eine neue Option, der ternäre Heφes Helikase Primase Komplex bestehend aus UL5, UL 8 und UL 52, ist bekannt (Ann. Ref. Biochem. 1990, 59, 289-329), ebenso wie seine Eignung als Anti-Heφes-Target (Antiviral Research 20, 1993, 89-114.
Inhibitoren der Heφes-Helicase-Primase sind ebenfalls bekannt aus J. Med. Chem. 1995, 38, 1811-1819.
Die Patentanmeldung WO 97/24343 beschreibt eine Methode, um Inhibitoren mit anti-heφes Eigenschaften zu identifizieren, die dadurch gekennzeichnet ist das Verbindungen ausgewählt werden, die, sofern sie and den DNA-Helikase-Primase Komplex binden, den DNA-Enzymkomplex stabilisieren. Es wird angenommen, daß diese Inhibitoren an allosterische Bindungsstellen auf dem UL5 oder UL52 Genprodukt der HSV Helikase-Primase oder homologer heφes viraler Enzymkomplexe binden, und somit den Stabilisierungseffekt auslösen. Diese allosterische Bindungstasche soll im Bereich der A-B Sequenz auf der UL52 Untereinheit lokalisiert sein und die Inhibition wird durch Blockierung eines terminalen Zinkfingers auf einer katalytischen Untereinheit des Heφes Helikase-Primase vermittelt. Ein entscheidender Nachteil dieser Methode ist es, daß häufig Verbindungen identifiziert werden, die nicht den notwendigen Selektivitätsindex in vitro oder die gewünschte Verträglichkeit in vivo aufweisen, und in der Konsequenz in der Regel nicht für die Behandlung von Heφes Infektionen aufgrund der nicht gewährleisteten Arzneimittelsicherheit eingesetzt werden können.
Die Anmeldung WO 99/42455 und die Veröffentlichung von Spector, F.C., Journal of Virology 1998, Vol 72, No 9, pages 6979-6987 beschreibt Verbindungen die exklusiv an die UL5 Untereinheit des Helikase-Primase Enzymkomplexes binden, was durch umfangreiche Mutationsanalyse von mindestens 25 unterschiedlichen UL5 Mutanten nachgewiesen wird. Es wird weiterhin festgestellt, daß z.B Tl 57602 als Verteter dieser Verbindungsklasse weder ATP noch DNA kompetitiv vom Enzymkomplex verdrängt. Substituierte Thiazolylphenylderivate sind bemerkenswerterweise auch als essentielles und zentrales Strukturmotiv für die Verbindungen der oben zitierten Anmeldung WO 97/24343 beschrieben.
Obwohl der Helicase-Primase-Komplex schon geraume Zeit bekannt ist und ein dringendes Bedürfnis nach neuen antiviralen Targets vorherrscht (Antiviral Research, 20, 1993, 89-114), konnte trotz diverser Patentanmeldungen auf diesem Gebiet bisher keine Klasse von geeigneten Verbindungen identifiziert werden, die es bis zur Marktreife geschafft hätte. Dies ist neben mangelnder Aktivität zum großen Teil auf das Auftreten starker Nebenwirkungen zurückzuführen.
Ziel dieser Erfindung ist es deshalb ein Verfahren bereitzustellen, mit dem nicht nur alternative oder wirksamere Verbindungen identifiziert werden können, sondern vor allem Wirkstoffe mit einem verbesserten Selektivitätsindex in vitro und einer überle- genden Verträglichkeit mit Bezug zum Stand der Technik gefunden werden können.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist es Wirkstoffe zu identifizieren und bereitzustellen, die zur Therapie von Infektionen eingesetzt werden können, die durch Nukleosid/Nukleotid resistente Heφes Viren ausgelöst werden.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass sich Arzneimittel, die die nachfolgend aufgeführten Merkmale bzw. Eigenschaften aufweisen und den Heφes-Helikase- Primase Komplex in einer hier beschriebenen neu gefundenen Art und Weise inhibi- ieren zur Behandlung von Heφes-Infektionen geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung löst die oben beschriebene Problemstellung indem Arzneimittel, die unkompetitive Inhibitoren der Heφes-Helicase-Primase enthalten, zur Verfügung gestellt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel nach dadurch gekennzeichnet, daß die Helicase-Primase mindestens 50 % homolog ist zur Heli- case-Primase des Heφes-Simplex- Virus 1, bezogen auf die Nukleotid-Sequenz oder die Aminosäure-Sequenz, je nachdem was höher ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Helikase-Primase tragenden Virus um Heφes- Simplex- Virus 1 handelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, gleichzeitig an die Helikase und die Primase Untereinheit des Helikase-Primase Komplexes zu binden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die DNA-abhängige NTPase Aktivität der Helikase-Primase zu inhibieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die Replikation eines Heφes Virus zu inhi- bieren. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die Replikation eines Heφes Virus in Zellkultur bei einer Konzentration von 10 μM um mindestens 50 % zu inhibieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass solche in dem Arzneimittel enthaltenden Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen die Replikation eines Heφes Virus in Zellkultur bei einer Konzentration von < 500 nM um mindestens 50 % zu inhibieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, sind die Arzneimittel dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Helikase-Primase tragenden Viren um PRV oder BHV handelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen mit Anti-Heφes-Aktivität beschrieben, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß die Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die Helikase-Primase zu inhibieren, getestet werden und solche Verbindungen ausgewählt werden, die den Helikase-Primase Enzymkomplexes unkompetitiv inhibieren.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Verbindungen, die nach irgendeiner hier beanspruchten Methode oder Verfahren identifiziert wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung dadurch gekenn- zeichnet, daß die Verbindung kein Nukleosid oder Nukleotid ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verbindungen, die zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und Prophylaxe von Heφes Infektionen verwendet werden. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel oder pharmazeutische Formulierungen, die Verbindungen entsprechend den oben aufgeführten Methoden oder Verfahren enthalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von Heφes Infektionen in Säugern, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Säuger, der eine derartige Therapie benötigt, eine therapeutisch wirksame Menge des hier beanspruchten Arzneimittels oder der pharmazeutischen Formulierung verabreicht wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Verbindungen enthalten, die folgende allgemeine Strukturformel (I) aufweisen,
Z-Y-A-X-SO2NR , l1τR>2 (I), worin
Z für (C6-C1o)-Aryl, das gegebenenfalls durch 1 bis 3 Substituenten, ausgewählt aus (CrC Alkanoyl, ( -C^-Alkoxy, (Ct-C6)-Alkyl, Halogen, ( -C^Al- koxycarbonyl, Nitro, Halogen(Cι-C6)alkyl, Halogen(C_-C6)alkoxy, Amino, (C1-C6)Alkylthio, Hydroxy, Carboxyl, Carbamoyl, Mono- oder Di(Cι-
C6)alkylaminocarbonyl, Mono- oder Di(C.-C6)alkanoylamino, (CrC^Al- koxycarbonylamino, (Cι-C6)Alkylsulfoxy, (C.-Cö^Alkylsulfonyl, Tr^d-Cö)- alkylsilyloxy, einem gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen mono- oder bicyclischen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O, und/oder Cyano substituiert sein kann, oder
Z steht für einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 5- bis 6- gliedrigen aromatischen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O, der gegebenenfalls durch 1 bis 3 Substituenten, ausgewählt aus (C1-C6)Alkanoyl, (C1-C6)-Alkoxy, (Cι-C6)-Alkyl, Halogen, (Cι-C6)Alkoxycarbonyl, Nitro, Halogen(Cι-C6)alkyl, Halogen(C;ι-C6)alkoxy, Amino, (C_-C6)Alkylthio, Hydroxy, Carboxyl, Carbamoyl, Mono- oder Di(Cι-C6)alkylaminocarbonyl, Mono- oder Di(Cι-C6)alkanoylamino, (Ci- C6)Alkoxycarbonylamino, (Cι-C6)Alkylsulfoxy, (CrC6)Alkylsulfonyl, einem gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen mono- oder bicychschen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und oder O, und/oder Cyano substituiert sein kann, oder
Z steht für einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen, mono- oder bicychschen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O, der gegebenenfalls durch 1 bis 3 Substituenten ausgewählt aus Oxo, Halogen, Hydroxy, (Q-C^-Alkoxycarbonyl, (C.-C6)-Alkoxy- carbonylamino, (Cι-C6)-Alkyl, Halogen(Cι-C6)alkyl und Hydroxy(C1-C6)- alkyl substituiert sein kann, oder
Z steht für -OR19, -NR20R21 oder -CO-NR22R23 ,
worin
R Phenyl bedeutet, das seinerseits gegebenenfalls durch eine Gruppe der Formel -NR24R25 substituiert ist,
worin
R24 und R25 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, (C Cö)- Alkyl oder (Cι-C6)-Acyl bedeuten,
oder R19 (C.-C6)-Alkyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl bedeutet, das gegebenenfalls ein- bis dreifach durch Hydroxy und/oder Halogen substituiert ist,
R20 und R21 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Carbamoyl, Mono- oder Di(Ci-C6)a_kylammocarbonyl, Phenyl, (C1-C6)-Acyl oder (Ci- C6)-Alkyl bedeuten,
wobei zuvor genanntes (Cι-C6)-Alkyl gegebenenfalls durch (Cι-C6)-
Alkoxy, (Cι-Ce)-Acyl, durch Phenyl oder durch einen 5- bis 6- gliedrigen aromatischen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O substituiert ist,
wobei zuvor genanntes Phenyl und zuvor genannter aromatischer
Heterocyclus gegebenenfalls ein- bis dreifach gleich oder verschieden durch Halogen und/oder Hydroxy substituiert sind, und
R22 und R23 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder (d-C^-Alkyl bedeuten,
für (C6-Cιo)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen ge- sättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht
und gegebenenfalls mit ein bis drei Substituenten substituiert sein kann, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Halogen, (d-C6)-Alkoxy, (d-C^-Alkoxycarbonyl, (CrC^-Alkylthio, Hydroxy, Carboxyl, partiell fluoriertem (C_-C6)-Alkoxy mit bis zu 6 Fluoratomen, (d-C6)-Alkyl,
A für eine Gruppe der Formeln -CR4 R5'-C(O)-CR4R5- , -CR4 R5'-C(O)-NR9- ,
-NR9'-C(O)-CR4R5- oder-NR9'-C(O)-NR9- steht,
woπn
R4, R4 ,R5, R5 , R9 und R9 gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff,
(d-C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl, (d-C6)-Alkoxy-(Cl-C6)-Alkyl, oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
X für (C6-C1o)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Hetero- cyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten
Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (Cι-C6)-
Alkyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
wobei der Winkel A-X-SO2, 153° ± 15 % beträgt und die Verbindung eine Molmasse von kleiner als 500 g/mol aufweist,
und deren Salze.
Die hier dargelegte Erfindung löst die oben aufgeführten Probleme bzw. erfüllt die gesteckten Ziele für neue Therapeutika, indem Verfahren zur Identifizierung neuer (nicht-nukleosidischer) Wirkstoffe, die direkt die enzymatische Aktivität des Heφes
Helikases Primase Komplexes auf eine neue hier erstmalig beschriebene Art und Weise inhibieren, beschrieben werden. Die Inhibition dieses essentiellen Enzymkomplexes führt bei geeigneter Struktur der Verbindung, die hier durch ein gene- risches Pharmakophormodel neben Beispielhaft konkret aufgeführten Wirkstoffen offenbart wird, nicht nur zur Inhibition der DNA replication sondern auch insbeson- dere zur Inhibition der Heφesvirus Replikation in vitro und in vivo. Darüber hinaus, gerade weil der Enzymkomplex der Helikase-Primase bei der Familie der Heφes viridae hoch konserviert ist, konnten mit der vorliegenden Erfindung eine Breitbandspektrum anti-Heφesvirus Aktivität der Verbindungen zeigen (Tabelle 1). Die selektive Wirkung der Inhibitoren auf Mitglieder der Familie der Heφesviren und insbe- sondere gegen Acyclovir-resistente Heφesvirusen, in Kombination mit einem geeigneten Sicherheitsprofil machen diese Wirkstoffe zu einem seit Jahren gewünschten Agens, um Heφes Infectionen zu behandeln.
Der Begriff "Heφes", sofern er im Kontext dieser Erfindung gebraucht wird, schließt alle Viren der Familie der Heφes Viren ein und umfaßt insbesondere die Heφesviren, die für Helikase-Primase Proteine kodieren. Dies gilt besonders für Proteine, die homolog sind mit Bezug zur Heφes Helikase-Primase des HSV Virus. Insbesondere gilt dies für solche, bei denen die Helikase oder Primase mindestens 50 % homolog zur Helikase oder Primase des Heφes simplex Virus 1 ist, basierend auf der Nukleo- tid oder Aminosäure-Sequenz, je nachdem was höher ist. Zur Familie der Heφesviren gehören zum Beispiel HHV-1 bis HHV-8, EHV, BHV, PRV usw.
Die Heφes simplex Viren 1 and 2 werden entsprechend ihrem Serotyp bezeichnet die auf Basis spezifischer monoklonaler Antiköφerreaktionen charakterisiert sind.
Der Begriff Helikase-Primase bezieht sich auf den Helikase-Primase Enzymkomplex, der zur Replikation der viralen DNA notwendig ist. Im Falle der Heφes simplex Viren besteht dieser Erizymkomplex aus den Proteinen der Gene UL5, UL8 und UL52 oder zumindest den (notwendigen oder essentiellen) UL5 und UL52 Genpro- dukten; handelt es sich um weitere Mitglieder der Heφesfamilie, so wird Bezug auf die korrespondierenden Homologe genommen. Der Begriff Helikase bezeichnet die Untereinheit des Helikase-Primase Komplex der an der viralen DNA-Replikation beteiligt ist. Im Falle der Heφes simplex Viren handelt es sich hierbei um das UL5 Genprodukt; handelt es sich um weitere Mitglieder der Heφesfamilie, so wird Bezug auf die korrespondierenden Homologe genommen.
Der Begriff Primase bezeichnet die Untereinheit des Helikase-Primase Komplex der an der viralen DNA-Replikation beteiligt ist. Im Falle der Heφes simplex Viren han- delt es sich hierbei um das UL52 Genprodukt; handelt es sich um weitere Mitglieder der Heφesfamilie, so wird Bezug auf die korrespondierenden Homologe genommen.
Die Abkürzung moi steht für „multiplicity of infection" und ist der Quotient der Zahl der infektiösen Partikel oder Zellen des Pathogens dividiert durch die Zellzahl der zu infizierenden Zellen.
(MOI = Zellzahl oder Zahl der infektiösen Partikel des Erregers / Zahl der Zellen, die infiziert werden).
Der Begriff IC50 oder EC50 beschreibt die Konzentration oder die Menge an Wirkstoff, die benötigt wird um eine 50%ige Inhibition in einem gegebenen Testsystem zu erreichen oder die effektive Konzentration, die benötigt wird um ein halbmaximales Signal in einem Assay zu erreichen.
Der Begriff Selektivitätsindex (SI) bezieht sich auf den Quotient der Konzentrationen, bei der die Zellvitalität auf 50 % gegenüber der Zellkontrolle reduziert ist, dividiert durch die Konzentration, bei der die anti-mikrobielle Wirkung mindestens 50 % einer maximal möglichen Inhibition der Erregervermehrung erreicht, d.h. SI = (CC50/IC50). Je größer diese Zahl ist, um so größer ist die Verträglichkeit der Ver- bindung. Bevorzugt werden Verbindungen mit SI- Werten größer 10. Der Begriff therapeutischer Index (TI; Verträglichkeit) bezieht sich auf einen Quotient der lefhalen Dosis (LD; lethal dose) bei der 50 % der Versuchstiere aufgrund der Substanzwirkungen sterben und der effektiven Dosis (ED; effective dose) bei der 50 % der Versuchtiere die Infektion überleben TI = (LDso/ED5o).
Der Begriff Formulierung mit Bezug zu Wirkstoffen beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die aus nicht-toxischen, generell inerten Hilfsstoffen und Träger- materialen, die keinen negativen Effekt auf die Wirkung des aktiven Bestandteil verursachen, besteht, sondern vielmehr eine optimale Applikation des Wirkstoffes mit Bezug zur Pharmakokinetik und Pharmakodynamik erlauben.
Der Begriff inhibieren beschreibt, wenn er im Zusammenhang mit der enzymatischen Aktivität Verwendnung findet, die Inhibition der maximal möglichen Enzymaktivität um mindestens 50 % bei einer Konzentration von etwa IC5υ = 100 μM oder weniger und bevorzugt bei einer Konzentration die so niedrig wie möglich ist in einem entsprechenden in vitro Assay der zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität eingesetzt wird.
Der Begriff unkompetitive Hemmung beschreibt einen seltenen Hemmtyp, bei wel- chem der Hemmstoff an den Enzym-Substrat-Komplex bindet Bei diesem Hemmtyp ändert sich die Maximalgeschwindigkeit, Km bleibt im Rahmen der experimentellen Unsicherheit unverändert. Der Begriff unkompetitiv schließt ausdrücklich die partiell unkompetitiven Hemmtypen mit ein.
Der Begriff inhibieren beschreibt, wenn er im Zusammenhang mit dem in vitro viralen Replikationassay gebraucht wird, generell die Inhibition des Mikrobenwachstums um ca. 50 % bei einer Konzentration von IC50 = 100 μM oder geringer und bevorzugt eine Konzentration, die so niedrig ist wie möglich, um den Wert zu erreichen.
Der Begriff Target bezieht sich hier in der Regel auf das Zielmolekül, welches gegebenenfalls durch Wirkstoffe in seiner Aktivität moduliert wird. Das Target ist allge- meiner gesprochen häufig ein Genprodukt, das essentiell an der Entstehung eines Krankheitsbildes beteiligt ist.
Der Begriff der Mutation in einem Target beschreibt eine Mutation in einem Gen, die zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des entsprechenden Protein führt.
Der Begriff Reduktion mit Bezug zum Verlust der Erhöhung oder Erniedrigung der Aktivität wird verwendet, wenn die Änderung der Aktivität signifikant ist, besser den Faktor 2 erreicht und bevorzugt sich um eine Größenordnung ändert.
(C.-C6)-Alkyl steht zweckmäßig für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (Cι-C4). Beispielsweise seien genannt: Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n- Hexyl. Besonders bevorzugt ist ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis
3 Kohlenstoffatomen ((C1-C3)Alkyl).
(C6-Cιo)-Aryl steht im allgemeinen für einen aromatischen Rest mit 6 bis 10 Kohlen- stoffatomen. Bevorzugte Arylreste sind Phenyl und Naphthyl.
(C3-C8)-Cycloalkyl steht im Rahmen der Erfindung für Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl. Bevorzugt seien genannt: Cyclopropyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl. Die Bedeutung von (C3-C6)Cycloalkyl steht entsprechend zweckmäßig für Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl, Cyclo- hexyl.
Ein 5- bis 6-gliedriger aromatischer Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, O und/oder N steht beispielsweise für Pyridyl, Pyrimidyl, Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, N-Triazolyl, Oxazolyl oder nidazolyl. Bevorzugt sind Pyridyl, Furyl, Thiazolyl und N-Triazolyl. Ein 5- bis 6-gliedriger aromatischer benzokondensierter Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, O und/oder N steht beispielsweise für Benz- imidazolyl.
Ein gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundener 3- bis 8- gliedriger gesättigter oder ungesättigter, nicht aromatischen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O schließt z.B. Moφholinyl, Piperidinyl, Piperazinyl, Methylpiperazinyl, Thiomoφholinyl oder Pyrrolidinyl ein sowie 3-, 7- und 8-gliedrige Heterocyclen, wie z.B. Aziridine (z.B. 1-Azacyclopropan-l-yl), Azetidine (z.B. 1-Azacyclobutan-l-yl) und Azepine (z.B. 1-Azepan-l-yl) ein. Die ungesättigten Vertreter können 1 bis 2 Doppelbindungen im Ring enthalten.
Die in dieser Patentanmeldung beschriebenen Verbindungen bzw. die Pharma- kophorformel sowie der Wirkmechanismus der Substanzen ist neu und kann klar insbesondere gegen die Anmeldungen WO 97/24343, WO 99/42455 sowie alle bis zur Priorität veröffentlichten Publikationen abgegrenzt werden. Während die in der Anmeldung WO 97/24343 offengelegten Substanzen an eine allosterische Bindungsstelle auf dem UL5 oder dem UL52 Genprodukt der HSV Helikase Primase binden, und somit die Bindung Enzymkomplexes an das DNA-Substrat verstärken bzw. sta- bilisieren (den Autoren zufolge liegt diese allosterische Bindungsstelle innerhalb der sogenannten A-B Sequenz auf der UL52 Untereinheit und der inhibitorische Effekt wird durch Modulation eines terminalen Zinkfingermotivs auf einer katalytischen Untereinheit des Heφes Helikase-Primase Komplexes verursacht), binden die in der Anmeldung WO 99/42455 veröffentlichten Substanzen exklusiv an die UL5 Unter- einheit des Komplexes, was explizit in der Veröffentlichung von Spector, F.C., Journal ofVirology 1998, Vol 72, No 9, pages 6979-6987 festgestellt wird.
Geeignete Verbindungen, die entsprechend dem oben genannten Mechanismus den
Helikase-Primase Komplex inhibieren, können identifiziert werden, indem die Fähigkeit der Substanzen auf Bindung an die Helikase (Untereinheit) und oder die
Primase (Untereinheit) des Helikase-Primase Komplexes geprüft wird. Bevorzugt wird die Fälligkeit der Wirkstoffe die Enzym-assoziierte DNA-abhängige NTPase Aktivität der Heφes Helikase-Primase (wie zum Beispiel Helikase-Primase des Heφes simplex virus) zu inhibieren geprüft, was vorteilhafterweise technisch mittels eines Hochdurchsatzscreenings (HTS, high throughput screening) durchgeführt wird. Alternativ kann auch die Fähigkeit der Substanzen die virale Replikation in einem in vitro Zellkultursystem zu inhibieren getestet werden und anschließend die Substanzen ausgewählt werden, die die DNA abhängige Hydrolyse relevanter Nukleotide unkompetitiv inhibieren.
Zahlreiche Methoden sind beschrieben, um direkt die Bindung von Molekülen an
Proteine zu messen, jedoch erfordern viele dieser Testsysteme, um zu quantitativen Ergebnissen zu gelangen, gereinigtes Protein oder zumindest eine angereicherte Fraktion. Es sollte an dieser Stelle nicht unerwähnt bleiben, daß nicht alle an das Protein oder Enzym bindenden Moleküle die Funktion des Targets in der gewünsch- ten Art und Weise modulieren.
Der enzymatische Assay kann einfach durchgeführt werden, aber das Enzym muß funktionell aus einer Heφes infizierten Zellkultur gereinigt werden. Alternativ können die Gene des Enzymkomplexes mit gentechnologischen Methoden in ein ent- sprechendes Expressionssystem Moniert und dann exprimiert werden. Wird das
Enzym ftinktionell produziert, so muß es mit den gängigen Aufreinigungstechniken angereichert oder bevorzugt rein dargestellt werden.
Ein viraler Replikationsassay kann sehr einfach wie in dieser Anmeldung beschrie- ben in einem Zellkultursystem durchgeführt werden. Dieser Assay ist möglicherweise sensitiver als die genannten enzymatischen Testsysteme, weil die Virusver- mehrung in Zellkultur das reale Infektionsgeschehen am besten simuliert und gegebenenfalls die Zahl der Enzymmoleküle niedriger ist mit Bezug zum Inhibitor als im Enzymassay. Werden Inhibitoren der Virusreplikation identifiziert, so müssen jedoch weitere Methoden wie z.B das Herstellen von Mutanten mit anschließender Genomsequenzierung in Kombination mit einer Komplementationsanalyse angewendet wer- den, um den Wirkmechanismus aufzuklären bzw. das zugrundeliegende Target (im vorliegenden Beipiel die virale Helikase-Primase) zu identifizieren.
Wirkstoffe, die einen Effekt im Enzymassay zeigen oder die Virusreplikation im Zellkultursystem hemmen, können näher in einem Test charakterisiert werden, der
Rückschlüsse auf die Bindungseigenschaften des Moleküls an den Helikase-Primase Komplex erlaubt. Andererseits können Verbindungen die einen Effekt im Bindungstest hervorrufen nachfolgend mittels eines Enzymtestes funktioneil genauer untersucht oder auf Hemmung der Virusreplikation in Zellkultur geprüft werden. Auch wenn die nachfolgend beschriebenen Testsyteme in einer möglichen Reihenfolge aufgeführt werden, so ist darunter nicht zu verstehen, daß alle Tests für eine erfolgreiche Identifizierung von Heφes Helikase-Primase hihibitoren in exakt dieser Reihenfolge durchgeführt werden müssen, sondern daß vielmehr die Zahl der verschiedenen Tests wie auch deren Reihenfolge im Ermessensbereich des Fachmannes liegt, um effizient zum Ziel zu gelangen.
Wiederum andere Testsysteme erlauben es festzustellen, ob ein gegebener Wirkstoff die Enzym-vermittelte RNA Primer Biosynthese inhibiert oder ob die Substanz die Helikaseaktivität des Komplexes moduliert.
DNA und zwar bevorzugt Einzelstrang-DNA mit einer entsprechenden Primase Konsensus Sequenz im Falle des Primase Assays oder ein DNA Substrat das eine Replikationgabel ähnliche Struktur ausbildet kann im Helikase Assay eingesetzt werden. Zahlreiche Optionen sind beschrieben und an dieser Stelle sei auf die Über- Sichtsliteratur (Boehmer PE & Lehmann IR 1997) oder die speziellen Publikationen
(High-Throughput Screening Assay for Helicase Enzymes, 1998, Analytical Bio- chemistry, M Sivaraja, H Giordano, MGPeterson, 265, 22-27) verwiesen
Bevorzugte oder geeignete Verbindungen, die in dieser Anmeldung beschrieben wer- den, interkalieren nicht in noch binden sie auf andere Weise direkt an doppel- strängige DNA. In all den oben beschriebenen Verfahren kann die (nicht-nucleosidische) Verbindung auch auf die Fähigkeit geprüft werden, die Heφes Helikase-Primase vermittelte RNA Primer Biosynthese oder die or Helikase Aktivität zu inhibieren. Entscheidend ist jedoch, daß die in dieser Erfindung beschriebenen (nicht-nukleosidischen) Wirkstoffe auf ihre Fähigkeit geprüft werden, die Virusreplikation in Zellkultur bei einer Konzentration von weniger als 10 μM um mindestens 50 % zu inhibieren. Bevorzugt werden die Verbindungen ausgewählt, die bei so niedrigen Konzentrationen wie möglich die Virusreplikation hemmen. Es muß jedoch hierbei beachtet werden, daß diese Verbindungen auch die gewünschten phaπnakokinetischen pharmakodyna- mischen Eigenschaften aufweisen.
Es sollte nicht unerwähnt bleiben, daß die Verbindungen, die formulierten Wirkstoffe und die offenbarten Verfahren geeignet sind, um erfolgreich Heφesinfektionen, die nicht auf eine Nukleosidtherapie ansprechen und in der Regel durch Nukleosid- resistente Heφesviren ausgelöst werden, zu behandeln.
Dieser Aspekt der Erfindung schließt natürlich das Verfahren ein, Acyclovir-resis- tente Heφesinfektionen dadurch zu behandeln, daß dem infizierten Säugetier wirk- same Dosen einer der offenbarten Verbindungen, die gegebenenfalls entsprechend formuliert sein kann, verabreicht werden.
Unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren konnten Inhibitoren der Heφes Helikase-Primase erfolgreich identifiziert werden. Die spezifische und selektive Wir- kung der Verbindungen gegen Heφesviren in Kombination mit einem entsprechendem Sicherheitsprofil machen die Wirkstoffe zu dem gewünschten Agens um zukünftig Heφesinfektionen zu behandeln. Anti-Herpes Aktivität und Testsysteme
Die antivirale Aktivität der Verbindungen kann mit biochemischen, microbiologischen und biologischen Verfahren gezeigt werden.
Diese Erfindung offenbart die Inhibition der viralen Replikation der Heφes Viren in Zellkultur, was exemplarisch für Mitglieder der Heφesfamilie wie HSV, BHV und PRV gezeigt wird (siehe Tabelle 1).
Der in Zellkultur durchzuführende HTS fähige virale Replikationstest liefert auf effizientere Art und Weise analoge Daten wie der sogenannte Plaque Reduction Assay und ist nachfolgend beschrieben.
Ein biochemisches Verfahren, um die Wirksamkeit der Verbindung gegen das virale Target Helikase-Primase zu demonstrieren, wird im Abschnitt biochemische Assay beschrieben. Dieser ATPase Assay ist nur eine der zahlreichen Optionen die dem Fachmann zur Verfügung stehen und Beispielsweise in ,,High-Throughput Screening Assay for Helicase Enzymes, 1998, M. Sivaraja, H. Giordano and M.G. Peterson, Analytical Biochemistry, 265, 22-27" aufgeführt sind. Weitere Testsysteme die dort in diversen Konfigurationen aufgeführt sind, eignen sich um festzustellen, ob gegebenenfalls Verbindungen direkt die Helikase oder die Primase Aktivität des Helikase-Primase Komplexes hemmen.
Der Nachweis eines therapeutischen Effektes der Verbindungen wird mittels eines in vivo Modells geführt. Das so bezeichnete lethal challenge Tiermodel sowie die
Applikationsdosen und Therapieregime sind unten detailiert zusammengefaßt. Beschreibung der Tabellen
Tabelle 1 faßt die Hemmdaten des Helikase-Primase Enzymkomplexes (Ki Werte), Ergebnisse zum Wirkmechanismus, die IC50 und EC50 Hemmdaten der Virusreplika- tion der Wildtyp und Therapie-resistenten HSV Stämme, die ED50 Werte vom Wildtypvirus im Tiermodel und die relevanten Mutations- sowie Kreuzresistenzmuster zusammen.
Ein direkter Vergleich der in Zellkultur gewonnenen IC50 Werte zeigt, daß einige ausgewählte Verbindungen um mindestens eine Größenordnung potenter sind als der
Marktstandard Acyclovir (ZoviraxTM). Die in vivo erzielten Daten zeigen klar, daß sich diese in vitro gefundene Wirkung der Verbindungen in einer überlegenden Potenz und Wirksamkeit im Tiermodel wiederspiegelt. Die Beispielverbindungen hemmen Acyclovir resistente HSV-1 (F) Mutanten und Wildtyp HSV-1 F) mit nahezu identischen IC50 Werten. Breitbandspektrum anti-Heφes Aktivität wird mit den ausgewählten Verbindungen Beispiel 1, 4, 5, 6 und 7, die so unterschiedliche Heφes Viren wie z.B. das humane Heφes simplex Virus genauso wie das schweine (PRV) und Rinder (BHV) Tierheφesvirus hemmen, gezeigt. Diese Verbindungen sind auch gegen alle bislang getesteten klinischen Isolate wirksam (geprüft wurden 39 HSV-1 und 19 HSV-2 Isolate). Erstmalig wird offenbart, daß Verbindungen, die die Kriterien der oben aufgeführten Merkmale erfüllen oder mit anderem Worten ausgedrückt unter die nachfolgend aufgeführten Ansprüche fallen, neu sind mit Bezug zum Stand der Technik und den Therapiestandard im Tiermodel um mindestens eine Größenordnung übertreffen. Assays und Testsvsteme
HSV-1 DNA-abhängiger ATPase Assay (dieser in vitro Assay erlaubt die Prüfung auf hihibition der HSV- 1 Helikase-Primase).
a) Herstellung und Aufreinigung des Enzyms
Der HSV-1 Helikase-Primase Heterodimer Enzymkomplex wurde mit Hilfe des rekombinanten Baculovirus Expressionssystems in doppelinfizierten Sf9 (Spodoptera frugiperda) Zellen. Ein rekombinantes Baculovirus codiert für das Helicasegen UL5 und das zweite Virus für das manipulierte Primasegen UL52-6xHis.
Die Gene wurden mittels PCR aus dem HSV-1 (F) Genom amplifiziert (American Tissue Culture Collection ATCC VR-733) und in das Baculovirus Moniert (UL5 -> pFASTBACl; UL52 -> pFASTHTb) wie dieses im Instruction Manual BAC-TO-
BAC Baculoviras Expression Systems, Life-Technologies ausführlich beschrieben ist. Der Heterodimere Enzymkomplex wurde mit der sogenannten IMAC-Chromato- graphy, wie in "Inhibition of Heφes Simplex Virus Replication by a 2-Amino Thia- zole via interactions with the Helicase Component of the UL-5-UL8-UL52 Complex", 1998, Journal of Virology, F.C. Spector, L. Liang, H. Giordano, M. Siva- raja and M.G. Peterson, 74:6979-6987 publiziert, aufgereinigt.
b) Der ATPase Assay :
Der aufgerefnigte heterodimere Helikase-Primase Komplex (200 ng) wurde mit 1 μg
DNA (Sigma D3287 oder D8681) in 20 mM HEPES (pH 7.6; 4-(2-hydroxyethyl)-l- piperazineethanesulfonic acid), 5 mM MgCl2, 0,2-5 mM ATP, 100 μg BSA (bovine serum albumin) per ml, 10 % Glycerin, 1 mM DTT (DL-(üthiothreitiol) und gegebenenfalls Inhibitor in der entsprechenden Konzentration für 60 min bei 37 °C inku- biert. Das freigesetzte anorganische Phosphat wurde colorimetrisch bestimmt, wie dieses in "An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate", 1979, P.A. Lanzetta, I.J. Alvarez, P.S. Reinach and O.A. Candia, Analytical Biochemistry, 100:95-97 veröffentlicht wurde.
Die Inhibition der DNA-abhängigen ATPase Aktivität wurde aus der Änderung der Absoφtion in Gegenwart und Abwesenheit von Inhibitor berechnet.
Die enzymkinetischen Auswertungen wurden entsprechend den Standardwerken der Literatur wie z.B. Enzymkinetik by Hans Bisswanger, Theorie und Methoden, VCH Verlagsgesellschaft, 1994 vorgenommen. Die Berechnung der K Werte erfolgte unter Zuhilfenahme der Sigma Plot Software 4.0 und der Methode der nicht-linearen
Kurvenregression.
Die Tabelle 2 zeigt die Dosis abhängige Inhibition/Titration der ATPase Aktivität des HSV-1 Helikase-Primase Enzymkomplexes mit dem representativen Beispiel 6. Zu diesem Zweck, wurde die ATPase Aktivität des Helikase-Primase Heterodimers
(Nachweis durch Bildung von anorganischem Phosphat (Pi)) in Gegenwart von gesättigten DNA Konzentrationen und variierenden ATP und hihibitorkonzentra- tionen, wie unter dem Punkt ATPase Assay erläutert, gemessen. Die Hemmung der ATPase Aktivität durch die Beispielverbindung 6 ist dosisabhängig und wird darüber hinaus von der ATP Konzentration beeinflußt.
(Die ATP Kontrolle wird ohne Enzym und ohne DNA durchgeführt).
Dieses läßt sich natürlich besser durch den Vergleich der mathematischen Modelle für diverse hibitionsmechanismen belegen. Die experimentellen Hemmdaten mit Bezug zum Hemmtyp werden am besten durch die nicht-lineare Regression basierend auf der Formeln für das unkompetitive Hemmverhalten abgebildet. Viraler Replikationsassay in Zellkultur
a) Virusvermehrung und Bestimmung der Virastiter
HSV (HSV-1 Walki, HSV-1F oder HSV-2G) wurde auf Vero-Zellen (ATCC CCL-
81) unter folgenden Bedingungen vermehrt: Die Zellen wurden in Ml 99 Medium (5 % fötales Kälberserum, 2mM Glutamin, lOOIU/ml Penicillin, lOOμg/ml streptomycin) in Zellkulturflaschen bei 37°C und 5% CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal pro Woche jeweils 1:4 gesplittet. Für die Infektion wurde das Medium abgenommen, die Zellen mit „Hank's solution" gewaschen, mit 0.05%Trypsin,
0.02%EDTA (Seromed L2143) abgelöst und mit einer Dichte von 4xl05 Zellen pro ml unter den oben genannten Bedingungen für 24 Stunden inkubiert. Dann wurde das Medium abgenommen und die Viruslösung mit einer m.o.i von < 0.05 in einem Volumen von 2 ml pro 175 cm2 Oberfläche dazugegeben. Nach einstündiger Inkuba- tion unter den genannten Bedingungen wurde das Medium auf ein Volumen von
50ml pro 175 cm2 -Flasche aufgefüllt. 3 Tage nach Infektion zeigten die Kulturen deutliche Zeichen eines zytopathischen Effektes. Das Virus wurde durch zweimaliges Frieren (-80°C) und Tauen (37°C) freigesetzt. Der Zelldebris wurde durch Zentrifu- gation (300g, 10min, 4°C) abgetrennt und der Überstand in Aliquots bei -80°C weg- gefroren.
Der Virastiter wurde über einen Plaque- Assay bestimmt. Dafür wurden Verozellen in einer Dichte von 4x105 Zellen pro Vertiefung in 24 well Platten ausgesät und nach 24 Stunden Inkubation (37°C, 5% CO2) mit Verdünnungen des Virusstocks von 10"2 bis 10"12 (lOOμl Inokulum) infiziert. 1 Stunde nach Infektion wurde das Medium abgenommen und die Zellen mit 1 ml Overlay-Medium (0.5% Methylcellulose, 0.225 Natriumbikarbonat, 2mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin, lOOμg/ml Streptomycin, 5% fötales Kälberserum in MEM-Eagle Medium mit Earfs Salz) überschichtet und für 3 Tage inkubiert. Im Anschluß wurden die Zellen mit 4% Formalin für 1 Stunde fixiert, mit Wasser gewaschen, mit Giemsa (Merck) für 30 min gefärbt und im
Anschluß gewaschen und getrocknet. Mit einem Plaque-viewer wurde der Virastiter bestimmt. Die für die Experimente verwendeten Virusstocks hatten einen Titer von lxl06/ml - lxl08/ml.
b) Messung der antiviralen Aktivität von Testsubstanzen im in vitro Zellkultur- system
Die Anti-HSV- Wirkung wurde in einem Screening-Testsystem in 96-Well-Mikro- titeφlatten unter Zuhilfenahme von diversen ZeHinien neuronalen, lymphoiden und epithelialen Ursprungs wie zum Beispiel Vero (Nierenzellinie der grünen Meer- katze), MEF (murine embryonale Fibroblasten), HELF (humane embryonale
Fibroblasten), NT2 (humane neuronale Zellinie) oder Jurkat (humane lymphoide T- Zellinie) bestimmt. Der Einfluß der Substanzen auf die Ausbreitung des cytopatho- genen Effektes wurde im Vergleich zu der Referenzsubstanz Acyclovir-Natrium (ZoviraxR), einem Minisch zugelassenen anti-Heφes-Chemotherapeutikum, bestimmt.
Die in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelösten Substanzen (50 mM) werden auf Mikro- titeφlatten (z.B. 96-Well MTP) in Endkonzentrationen von 250 - 0,5 μM (mikromolar) in Doppelbestimmungen (4 SubstanzenPlatte) untersucht. Bei potenten Sub- stanzen werden die Verdünnungen über mehrere Platten bis 0,5 pM (picomolar) weitergeführt. Toxische und cytostatische Substanzwirkungen werden dabei miterfaßt. Nach den entsprechenden Substanzverdünnungen (1 :2) auf der Mikrotiteφlatte in Medium wird eine Suspension von Zellen (lxlO4 Zellen pro Vertiefung) wie zum Beispiel von Vero-Zellen in Ml 99 (Medium 199) mit 5 % fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin oder
MEF-Zellen in EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) mit 10 % fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, oder HELF-Zellen in EMEM mit 10 % fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, oder NT2- und Jurkat-Zellen in DMEM (4,5 mg/1 Glukose plus Pyridoxin) mit 10 % fötalem
Kälberserum 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium Pyravat, nicht essentiellen Amino- säuren und optional 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in jedes Näpfchen gegeben und die Zellen in den relevanten Vertiefungen mit einer entsprechenden Virusmenge infiziert (HSV-1 F oder HSV-2 G mit einer m.o.i (multiplicity of infection) von 0,0025 für HELF, Vero und MEF Zellen sowie einer m.o.i von 0,1 für NT2- und Jurkat-Zellen). Die Platten werden anschließend bei 37°C in einem CO2-
Brutschrank (5 % CO2) über mehrere Tage inkubiert. Nach dieser Zeit ist der Zellrasen von z.B. Vero-Zellen in den substanzfreien Viraskontrollen, ausgehend von 25 infektiösen Zentren, durch den cytopathogenen Effekt der HSV- Viren völlig lysiert bzw. zerstört (100 % CPE). Die Platten werden zunächst optisch mit Hilfe eines Mikroskopes ausgewertet und dann mit einem Fluoreszenzfarbstoff analysiert.
Hierzu wird der Zellkulturüberstand aller Näpfchen der MTP abgesaugt und mit 200 μl PBS-Waschlösung befüllt. Das PBS wird abermals abgesaugt und alle Wells mit 200 μl Fluoreszenzfarbstofflösung (Fluorescein-diacetate, 10 μg/ml in PBS) befüllt. Nach einer Inkubationszeit von 30-90 min werden die Testplatten in einem Fluores- zenzmessgerät bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 538 nm vermessen.
Der IC50 ist die Konzentration des Inhibitors, bei der die virale Replikation in Zellkultur um 50 % gehemmt ist im Vergleich zur nicht infizierten Zellkontrolle oder alternativ zu einer mit der 20 fachen IC5υ Konzentration behandelten Acyclovir- kontrolle. Die Reduktion wird hier dadurch bestimmt, daß das Fluoreszenzsignal des infizierten Näpfchens einer MTP 50 % des Signals der oben aufgeführten Kontrolle erreicht.
Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 1 in der Zusammenfassung dargestellt.
c) Generierung und Sequenzierung der resistenten viralen Mutanten
Natürlich vorkommende, resistente virale Mutanten wurden in Gegenwart von 1 μM der Beispielsubstanz 7 oder mindestens der 100 fachen IC5o Konzentration der weiteren Beispiele, wie in Tabelle 1 aufgeführt, mit Hilfe des viralen Replikationsassay in Zellkultur selektiert. 10 000 Vero Zellen werden in Mikrotiteφlatten mit 96 Vertie- fungen wie oben beschrieben ausgesäht und über Nacht inkubiert. Die Substanz wird in der entsprechenden Konzentration hinzugegeben und die Zellen werden dann mit 1000 PFU (plaque forming units; m.o.i. 0,1) infiziert. Mutanten traten mit einer Frequenz von 1x10-6 bis 5x10-6 im Falle des HSV-1 (F) auf. Die Mutanten wurden durch mikroskopische Beobachtung oder einfach durch Wegfrieren (-80°c) von 10 μl
Aliquots und anschließender Analyse der 20-40 MTP mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeindiacetat wie oben beschrieben ermittelt. Befindet sich ein resistentes Virus in einer Vertiefung, so sink das korrespondierende Fluoreszenzsignal um mindestens den FaMor 3 gegenüber einer Mutantenfreien Vertiefung ab. Die positiv getesteten Überstände oder die eingefrorenen Aliquots wurden benutzt, um größere
Mengen des resistenten Virus anzuziehen und dann den Titer zu bestimmen. Die Virus-DNA wurde entsprechend den Protokollen die im Methodenhandbuch "Heφes Simplex Virus Protocols, 1998, Ed. S.M. Brown & A.R. MacLean, Humana Press, Totowa, New Jersey" zu finden sind präpariert und nach dem Protokoll "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, 1977, Sanger F, Nicklen S, Coulson
AR, PNAS, 74, 5463-5467" und Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Kit der Firma Applied Biosystems oder unter Verwednung des DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit der Firma Amersham (apbiotech) sequenziert. Die Analyse der Proben wurde auf einem der gängigen Sequenzierautomaten ausgeführt.
Die gefundenen Mutationen der resistenten Viren sind beispielhaft in der Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1 Pharmakologisches Profil der Helikasse-Primasse Inhibitoren
Figure imgf000030_0001
Tabelle 2
Hemmdaten der UL5-UL52-6xHis ATPase Reaktion
Titration der Enzymaktiviät mit der als Beispiel 6 genannten Verbindung
Figure imgf000031_0001
Bevorzugt sind Verbindungen, die im oben beschriebenen viralen Replikationsassay basierend auf dem Fluoreszenzsignal einen IC50 (HSV-1 F/Vero Zellen) Wert von weniger als 50 μM aufweisen, bevorzugter sind natürlich Verbindungen mit einem IC50 Wert von kleiner als 25 μM und die besten Verbindungen weisen in der Regel einen IC50 Wert von kleiner als 10 μM auf.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen stellen somit wertvolle Wirkstoffe zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankiingen dar, die durch Heφes- Viren, insbesondere Heφes Simplex-Viren ausgelöst werden. Als Indikationsgebiete können beispielsweise genannt werden :
1) Behandlung und Prophylaxe von Heφes-Infektionen, insbesondere Heφes Simplex-Infektionen bei Patienten mit Krankheitsbildem wie Heφes labialis, Heφes genitalis, und HSV bedingter Keratitis, Enzephalitis, Pneumonie, Hepatitis etc.
2) Behandlung und Prophylaxe von Heφes-Infektionen, insbesondere Heφes Simplex-Infektionen bei immunsupprimierten Patienten (z.B.ATDS-Patienten, Krebspatienten, Patienten mit genetisch bedingter hnmundefiziens, Trans- plantationspatienten)
3) Behandlung und Prophylaxe von Heφes- rfektionen, insbesondere Heφes Simplex-Infektionen bei Neugeborenen und lOeinkindem
4) Behandlung und Prophylaxe von Heφes-Infektionen, insbesondere Heφes
Simplex-Infektionen und Heφes-, insbesondere Heφes Simplex-positiven Patienten zur Unterdrückung der Rekurrenz (Suppressionstherapie)
d) In vivo- Aktivität / Tiermodelle Tiere:
6 Wochen alte weibliche Mäuse, Stamm BALB/cABom, wurden von einem kommerziellen Züchter (Bomholtgard Breeding and Research Centre Ltd.) bezogen.
Infektion:
Die Tiere wurden in einem dichten Glasgefäß mit Diethylether (Merck) anästhesiert. 50μl einer Verdünnung des Virasstocks (Infektionsdosis 5xl04 Pfu) wurden mit einer Eppendorfpipette in die Nase der anästhesierten Tiere eingebracht. Diese Infektionsdosis führt bei 90-100 % der Tiere durch eine generalisierte Infektion mit prominen- ten respiratorischen und zentralnervösen Symptomen im Mittel zwischen 5 und 8
Tagen zum Tode.
Behandlung und Auswertung:
6 Stunden nach Infektion wurden die Tiere mit Dosen von 0,1-100 mg/kg Köφer- masse 3 mal täglich 7.00 Uhr, 14.00 Uhr und 19 Uhr über einen Zeitraum von
5 Tagen behandelt. Die Substanzen wurden in DMSO vorgelöst und in
Tylose/PBS(Hoechst) resuspendiert (Endkonzentration 1,5 % DMSO, 0,5 % Tylose in PBS).
Nach der letzten Applikation wurden die Tiere weiter beobachtet und die Todeszeit- punkte festgestellt.
Ein Vergleich der Überlebenskurven erbrachte für die Verbindung des Beispiels 7 z.B eine ED50 von etwa 0,5 mg/kg für HSV-2, wobei ED50 bedeutet, das bei dieser
Dosis 50 % der Tiere überleben.
Die aufgeführten Wirkstoffe Beispiel 1 bis 7 wurden entsprechend dem nachfolgend aufgeführten allgemeinen Schema synthetisiert (Abbildung 2 zeigt das Schema zur Synthese der Thiazolylamide und Abbildung 3 zeigt den Syntheseweg zu den Thiazolylharnstoffderivaten).
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000035_0001
Der Wirkstoff kann systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann er auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublin- gual, lingual, buccal, rectal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat.
Für diese Applikationswege kann der Wirkstoff in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich bekannte, den Wirkstoff schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene sowie überzogene Tabletten, z.B. magensaftresistente Überzüge), Kapseln, Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resoφtionsschrittes geschehen (intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resoφtion (intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan, oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten und sterilen Pulvern.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen / -lösungen, Sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- und Augen-präparationen, Vaginalkapseln, wäßrige Suspensionen (Lotionen, Schüttel- mixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, Milch, Pasten, Streupuder oder
Implantate.
Die Wirkstoffe können in an sich bekannter Weise in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies geschieht unter Verwendung inerter nichttoxischer, pharmazeutisch geeigneter Hilfsstoffe. Hierzu zählen u.a. Trägerstoffe (z.B. mikro- kristalline Cellulose), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren (z.B. Natriumdodecylsulfat), Dispergiermittel (z.B. Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Biopolymere (z.B. Albumin), Stabilisatoren (z.B.Antioxi- dantien wie Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie Eisenoxide) oder Geschmacks- und / oder Gerachskorrigentien.
Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0,01 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,1 bis 10 mg/kg Köφer- gewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 0,1 bis 50 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,5 bis 15 mg/kg Kör- pergewicht.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Köφergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt.

Claims

Patentansprflche
1. Arzneimittel enthaltend unkompetitive Inhibitoren der Heφes-Helicase- Primase.
2. Arzneimittel nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Helicase- Primase mindestens 50 % homolog ist zur Helicase-Primase des Heφes- Simplex- Virus 1, bezogen auf die Nukleotid-Sequenz oder die Aminosäure- Sequenz, je nachdem was höher ist.
3. Arzneimittel nach Ansprach 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Virus ein Heφes-Simplex- Virus ist.
4. Arzneimittel nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen ausgewählt werden, die gleichzeitig an die Helikase und die
Primase Untereinheit des Helikase-Primase Komplexes binden.
5. Arzneimittel nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen die DNA-abhängige NTPase Aktivität der Heli- kase-Primase inhibieren.
6. Arzneimittel nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen die Fähigkeit besitzen die Replikation eines Heφes Virus zu inhibieren.
7. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen die Replikation eines Heφes Virus in Zellkultur bei einer Konzentration von 10 μM um mindestens 50 % zu inhibieren.
8. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß solche Verbindungen ausgewählt werden, die die Fähigkeit besitzen, die Replikation eines Heφes Virus in Zellkultur bei einer Konzentration von < 500 nM um mindestens 50 % zu inhibieren.
9. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Heφes Virus um PRV or BHV handelt.
10. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen mit Anti-Heφes- Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen auf ihre Fälligkeit, die enzy- matische Aktivität der Helikase-Primase zu inhibieren, getestet werden und solche Verbindungen ausgewählt werden, die den Helikase-Primase-Enzym- komplex inkompetitiv inhibieren.
11. Verbindungen, die nach Verfahren nach Anspruch 10 identifiziert werden.
12. Verbindungen nach Ansprach 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung kein NuMeosid oder Nükleotid ist.
13. Die Verwendung einer Verbindung nach Ansprach 11 oder 12 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und Prophylaxe von Heφes Infektionen.
14. Arzneimittel oder pharmazeutische Formulierungen die Verbindungen ent- sprechend den Ansprüchen 11 oder 12 enthalten.
15. Ein Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von Heφes InfeMionen in Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß dem Säuger, der eine derartige Therapie benötigt, eine therapeutisch wirksame Menge des Arzneimittels oder der pharmazeutischen Formulierung entsprechend Ansprach 14 verabreicht wird.
6. Arzneimittel nach irgend einem der Anprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen folgende allgemeine Strukturformel (I) aufweisen,
Z-Y-A-X-SOzNR'R2 (I) worin
Z für (C6-do)-Aryl, das gegebenenfalls durch 1 bis 3 Substituenten, ausgewählt aus (Cι-C6)Alkanoyl, (C1-C6)-Alkoxy, (d-C6)-Alkyl, Halogen, (d-C6)Alkoxycarbonyl, Nitro, Halogen(d-C6)alkyl, Halogene 1-C6)alkoxy, Amino, (d-C6)Alkylthio, Hydroxy, Carboxyl, Carbamoyl, Mono- oder Di(C1-C6)alkylaminocarbonyl, Mono- oder
Di(C1-C6)alkanoylamino, (Cι-C6)Alkoxycarbonylamino, (Cι-C6)A1- kylsulfoxy, (d-C6)Alkylsulfonyl,
Figure imgf000040_0001
einem gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8-gliedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen mono- oder bicychschen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S,
N und/oder O, und/oder Cyano substituiert sein kann, oder
Z steht für einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O, der gegebenenfalls durch 1 bis 3
Substituenten, ausgewählt aus (d-C6)Alkanoyl, (Cι-C6)-Alkoxy, (Ci- C6)-Alkyl, Halogen, (C1-C6)Alkoxycarbonyl, Nitro, Halogen(Cι- C6)alkyl, Halogen(Cι-C6)alkoxy, Amino, (Cι-C6)Alkylthio, Hydroxy, Carboxyl, Carbamoyl, Mono- oder Di(C1-C6)alkylaminocarbonyl, Mono- oder Di(C1-C6)alkanoylamino, (Cι-C6)Alkoxycarbonylamino,
(d-C6)Alkylsulfbxy, (d-C6)Alkylsulfonyl, einem gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- ghedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen mono- oder bicychschen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O, und/oder Cyano substituiert sein kann, oder steht für einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- ghedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen, mono- oder bicychschen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O, der gegebenenfalls durch 1 bis 3 Substituenten ausgewählt aus Oxo, Halogen, Hydroxy, (d-C6)- Alkoxycarbonyl, (Cι-C6)-Alkoxycarbonylamino, (Cι-C6)-Alkyl, Halogene ι-C6)alkyl und Hydroxy(C1-C6)-alkyl substituiert sein kann, oder
steht für -OR19, -NR20R21 oder -CO-NR22R23 ,
worin
R19 Phenyl bedeutet, das seinerseits gegebenenfalls durch eine
Gruppe der Formel -NR24R25 substituiert ist,
worin
R24 und R25 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, (Ci-
C6)-Alkyl oder (C1-C6)-Acyl bedeuten,
oder
R19 (d-C6)-Alkyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl bedeutet, das gegebenenfalls ein- bis dreifach durch Hydroxy und/oder Halogen substituiert ist,
R20 und R21 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Carbamoyl, Mono- oder Di(d-C6)alkylaminocarbonyl, Phenyl, (d-C6)-
Acyl oder (C.-C6)-Alkyl bedeuten, wobei zuvor genanntes (d-C6)-Alkyl gegebenenfalls durch (d-C6)-Alkoxy, (Cι-C6)-Acyl, durch Phenyl oder durch einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O substituiert ist,
wobei zuvor genanntes Phenyl und zuvor genannter aromatischer Heterocyclus gegebenenfalls ein- bis dreifach gleich oder verschieden durch Halogen und/oder Hydroxy substituiert sind, und
R22 und R23 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder (Ci- C6)-Alkyl bedeuten,
Y für (C6-Cιo)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- ghedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht
und gegebenenfalls mit ein bis drei Substituenten substituiert sein kann, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus
Halogen, (d-C6)-Alkoxy, (d-C6)-Alkoxycarbonyl, (d-C6)-Alkyl- thio, Hydroxy, Carboxyl, partiell fluoriertem (d-C6)-Alkoxy mit bis zu 6 Fluoratomen, (d-C6)-Alkyl,
A für eine Gruppe der Formeln -CR4 R5'-C(O)-CR4R5- , -CR4R5'-C(O)- NR9- , -NR9'-C(O)-CR4R5- oder -NR9'-C(O)-NR9- steht,
worin R4, R ',R5, R5', R9 und R9' gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (d-C6)-Alkyl, (C2-C6)-Alkenyl, (C1-C6)-Alkoxy- (Cl-C6)-Alkyl, oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
X für (C6-do)-Aryl, einen 5- bis 6-gliedriger aromatischen Hetero cyclus, einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen benzokondensierten Heterocyclus, einen gegebenenfalls über ein Stickstoffatom gebundenen 3- bis 8- ghedrigen gesättigten oder ungesättigten, nicht aromatischen Heterocyclus steht,
R1 undR2 gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, (Ci- C6)-Alkyl oder (C3-C8)-Cycloalkyl stehen,
wobei der Winkel A-X-SO2, 153° ± 15 % beträgt und die Verbindung eine Molmasse von Meiner als 500 g/mol aufweist,
und deren Salze.
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