WO2002016428A1 - Proteine de liaison a l'irap - Google Patents

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WO2002016428A1
WO2002016428A1 PCT/JP2001/007117 JP0107117W WO0216428A1 WO 2002016428 A1 WO2002016428 A1 WO 2002016428A1 JP 0107117 W JP0107117 W JP 0107117W WO 0216428 A1 WO0216428 A1 WO 0216428A1
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WO
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protein
amino acid
salt
acid sequence
dna
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PCT/JP2001/007117
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Hideaki Tojo
Nozomu Katayama
Shigeya Kakimoto
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention provides a method for preventing hyperglycemia or diabetes using a protein or a salt thereof binding to insulin, responsive aminopeptidase (IRAP) or glucose transporter 4, or a protein or a salt thereof.
  • the present invention relates to a method for screening a therapeutic agent, a compound obtained by the screening method, use of the compound, and the like. Background art
  • glucose transporter saliva transport carrier
  • GLUT4 which is strongly involved in insulin-mediated glucose transport activity, is mainly expressed in skeletal muscle and adipose tissue (Fukumoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 5434-5438, 1988; Birnbaum et al., Cell, 57, 305-315, 1989).
  • GLUT4 is present in intracellular vesicles called GLUT4 endoplasmic reticulum.
  • glucose is taken up by the action of insulin to transfer it to the cell membrane (translocation). It is thought to promote (Bell et al., Diabetes Care, 13, 198-208, 1990; Czech et al., Trens. Bio Sci., 17, 197-201, 1992).
  • GLUT4 It has been attempted to identify not only the proteins themselves but also other proteins constituting the GLUT4 endoplasmic reticulum.
  • VMAP s vesicle-associated membrane proteins; Cain et al., J. Biol. Chem., 267, 11681-11634, 1992
  • SCAMP s secretory component-assacitated membrane proteins; Thiodis et al, J. Biol. Chem., 268, 11691-11696, 1993; Why et al., J. Biol.
  • I RAP is a one-time transmembrane membrane protein, also called gpl60, which is localized in the GLUT4 endoplasmic reticulum in intracellular organelles.
  • gpl60 a one-time transmembrane membrane protein
  • 109 amino acids at the amino terminus are the cytoplasmic domain, followed by a transmembrane domain of 22 amino acids, and an extracellular domain consisting of 785 amino acids at the carboxyl terminus (C-terminus)
  • Kandror & Pilcli Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8017-8021, 1994; Keller et al, J. Biol. Chem., 270, 23612-23618, 1995.
  • the extracellular domain is a zinc-dependent protease (aminopeptidase) whose activity has been confirmed (Kandror et al., J. Biol. Chem. 269, 30777-30780, 1994).
  • aminopeptidase aminopeptidase
  • cytoplasmic domain cytoplasmic domain
  • the presence of a protein that binds to I RAP is expected to be retained (Walters et al., J. Bio 1. Chem, 272, 23323-23327, 1997).
  • the cDNA obtained by the present invention matches the sequence of human very long chain acy 1-CoA dehydrogenase (VLCAD) which has already been reported (Andersen et al., Hum. Mol. Benet., 5, 461). -472, 1996), and literatures that report that this protein binds to I RAP or that it is directly involved in glycemic control. There is no. DISCLOSURE OF THE INVENTION
  • the present invention provides a method for screening a compound having a blood glucose lowering effect by applying the protein-protein interaction between VLCAD and IRAP, a compound obtained by the screening method, and the like.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and have found that the yeast two-hybrid method (Fields & Strenglanz, Trens.Genet., 10, 286-292, 1994; Brent & Finley, A. Rev. Genet., 31, 663-704, 1997) successfully cloned VLCAD as an I RAP-binding protein from a human skeletal muscle-derived cDNA library.
  • the present inventors have further studied and completed the present invention. That is, the present invention
  • a diagnostic agent comprising a DNA containing the DNA encoding the protein of (1) above,
  • a method for preventing or treating hypoglycemia which comprises administering to a non-human mammal an effective amount of the protein or a salt thereof according to (1) above;
  • An antisense DNA containing a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein described in (1) or a part thereof is used.
  • a pharmaceutical comprising
  • a diagnostic agent comprising an antibody against the protein or salt thereof according to (1) above,
  • a hyperglycemic effect or hypoglycemic effect characterized by using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • a blood sugar increasing effect characterized by using a DNA containing a DNA encoding the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a DNA encoding a partial peptide thereof; Or a method for screening a compound having a blood glucose lowering effect or a salt thereof,
  • a blood glucose-increasing effect comprising a DNA containing a DNA encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof,
  • a screening kit for a compound having a hypoglycemic effect or a salt thereof
  • a medicament comprising the compound according to (19) or a salt thereof, (21) a medicament according to (20), which is a preventive or therapeutic agent for hypoglycemia,
  • a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of insulin responsive * aminobeptidase is identified as SEQ ID NO: 5 at amino acids 55-8.
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 containing a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof Protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the above, its partial peptide, or its salt and insulin
  • (32) a medicament comprising the compound of (31) or a salt thereof, (33) a medicament of (32), which is a prophylactic or therapeutic agent for hyperglycemia or diabetes
  • (34) a method for preventing or treating hyperglycemia or diabetes, which comprises administering to a non-human mammal an effective amount of the compound according to (31) or a salt thereof, (35) hyperglycemia or Prevention of diabetes mellitus (31) Use of the compound or a salt thereof described above,
  • a method for preventing or treating hypoglycemia which comprises administering an effective amount of the compound or a salt thereof according to (36) to a non-human mammal;
  • a compound or a salt thereof comprising a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, which promotes or suppresses the expression of the protein; Screening kit,
  • (50) a method for preventing or treating hypoglycemia, which comprises administering an effective amount of the compound or a salt thereof according to (47) to a non-human mammal;
  • Figure 1 shows the nucleotide sequence of the human VLCAD (MD25) gene (cDNA) and the predicted amino acid sequence (continued from Figure 2).
  • Figure 2 shows the nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of the human VLCAD (MD25) gene (cDNA) (continued from Figure 1 and continued to Figure 3).
  • Figure 3 shows the nucleotide sequence of the human VLCAD (MD25) gene (cDNA) and the predicted amino acid sequence.
  • FIG. 4 shows the interaction of IRAP and VLCAD by quantification of 8-galactosidase activity.
  • b ait indicates only a GAL4-DNABD sequence
  • I RAP indicates a sequence obtained by fusing I RAP (55-82) to this.
  • one of p rey indicates a control without the p rey vector
  • MD 25 indicates a sequence obtained by fusing GAL4-AD with the 118th and subsequent bases of VLCAD.
  • I RAPZMD25 shows significant galactosidase activity. The resulting value is] 3 galactosidase activity units (mean standard deviation).
  • FIG. 5 shows the tissue distribution of MD25 mRNA.
  • brain is the brain and heart is the heart
  • Skeletal muscle means skeletal muscle
  • colon means colon
  • thymus means thymus
  • spleen means spleen
  • kidn ey kidney
  • liver means liver
  • smal l intestine means small intestine
  • placenta means placenta
  • lung means lung and leulocyute means leukocyte.
  • the RNA size (kb) is shown on the left.
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention may be a human or other warm-blooded animal (for example, cells of guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, pigs, sheep, hidges, horses, monkeys, etc.
  • hepatocytes eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, knee / 3 cells, Bone marrow cells, mesangial cells, Langerin cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibroblasts, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T Cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, Mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells) or any tissue in which these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, cerebrum) Baseball, hippocampus, thalamus,
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Amino acid sequences having homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • Preferred is a protein having substantially the same properties as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Substantially the same property includes, for example, binding activity to IRAP or GLUT4.
  • Substantially the same means that those properties are qualitatively the same. Therefore, it is preferable that the binding activity to IRAP or GLUT4 is equal, but the quantitative factors such as the degree of these properties and the molecular weight of the protein may be different.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention more specifically, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 And the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • Examples of the protein of the present invention include: (1) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 (preferably, An amino acid sequence in which about 1 to 25, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids have been deleted.
  • SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: : 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (preferably, about 1 to 25, preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5))
  • Amino acid sequence having amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or 1 or more (preferably, About 1 to 25, preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or 1 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (preferably 1 to 25 Amino acid sequence in which about 5, preferably about 1 to 10, more preferably about (1 to 5) amino acids have been substituted with another amino acid, or an amino acid sequence combining them. So-called mutins, such as proteins containing the sequence, are also included.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • the C-terminus is usually a carboxylate group (-COOH) or a carboxylate (-CO01).
  • C-terminal is amide (one CONH 2 ) or ester (-COOR ).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl, d-6 alkyl group such as n- butyl, for example, C 3 cyclopentyl, cyclohexylene, etc.
  • cyclohexyl - 8 cycloalkyl group for example, phenyl, shed one naphthyl C, such as 6 - 1 2 Ariru group, e.g., benzyl, phenyl, such as phenethyl - C I 2 alkyl or flight, such as single naphthylmethyl ⁇ - Nafuchiru C 2 ⁇ alkyl group C 7 such as - An aralkyl group, a bivaloyloxymethyl group and the like are used.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) other than at the C-terminus, the protein of the present invention includes a lipoxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the amino acid residue at the N-terminal is protected by a protecting group (eg, d-6 acyl such as formyl group, acetyl group, etc.). Group, etc.), N-terminal dalluminin residue generated by cleavage in vivo, oxidized with lipamine, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (e.g.
  • _ OH one SH, amino group, imidazole group, i Ndoru group, Guanijino group, etc.) a suitable protecting group (e.g., C i, such as C i-6 Arukanoiru groups such as formyl group, Asechi Le group - 6 And complex proteins, such as so-called glycoproteins, to which sugar chains are bound.
  • a suitable protecting group e.g., C i, such as C i-6 Arukanoiru groups such as formyl group, Asechi Le group - 6
  • complex proteins such as so-called glycoproteins, to which sugar chains are bound.
  • the protein of the present invention include, for example, a protein derived from human skeletal muscle having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, VLC AD (Andersen et al., Hum. Mol. Benet., 5, 46, 472, 1996).
  • the partial peptide of the protein of the present invention (hereinafter, sometimes abbreviated as the partial peptide of the present invention) is a partial peptide of the protein of the present invention described above, and is preferably the same as the above-described protein of the present invention. Any material having properties may be used. For example, at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, among the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention.
  • a peptide having an amino acid sequence of 100 or more, most preferably 200 or more is used.
  • a peptide having an amino acid sequence consisting of 200 to less than 655 (more preferably, 200 to less than 620) amino acid residues continuous from the C-terminus of the protein of the present invention is used.
  • the partial peptide of the present invention lacks one or more (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) of amino acids in its amino acid sequence, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence, or 1 or 2 or more amino acids are added to the amino acid sequence. (Preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5) amino acids) or one or more amino acids in the amino acid sequence (preferably 1 to 10 The degree, more preferably the number (about 1 to 5) of amino acids may be replaced by another amino acid.
  • partial peptide of the present invention an amino acid sequence represented by the 36th (Ala) to 655th (Phe) from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 And partial peptides containing the same.
  • the C-terminus is usually a hydroxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO—), but the C-terminus is an amide, as in the protein protein of the present invention described above. (One CONH 2 ) or ester (one COOR).
  • the partial peptide of the present invention includes, as in the protein protein of the present invention described above, those in which the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is protected by a protecting group, Pyroglutamine-oxidized glutamine residues generated by cleavage in vivo, those in which the substituents on the side chains of the amino acids in the molecule are protected with appropriate protecting groups, or so-called glycopeptides to which sugar chains are bound And other composite peptides.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue eg, methionine residue
  • the partial peptide of the present invention can be used as an antigen for preparing an antibody, and can also be used for screening for a compound that inhibits the binding of the protein of the present invention to IRAP or GLUT4.
  • the salt of the protein or partial peptide of the present invention is physiologically acceptable Salts with acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts) are used, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid,
  • the protein, partial peptide or salt thereof of the present invention can be produced from the above-mentioned method for purifying a protein from human or other warm-blooded animal cells or tissues, or a DNA encoding those protein or peptide can be produced. Can also be produced by culturing a transformant containing It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the protein of the present invention When producing the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof from human or other mammalian tissues or cells, homogenize human or other mammalian tissues or cells, and then extract with acids or the like.
  • the obtained extract can be purified and isolated by combining chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can usually be used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4 -Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl Fm ocaminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • amino acids having appropriately protected amino groups and side chain functional groups are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein or peptide according to various known condensation methods.
  • the protein or peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. Obtain these amides.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt) or may be pre-formed as the corresponding acid anhydride or HOBT or HOOBt ester. It can be added to the resin after activation of the protected amino acids.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOBt, HOOBt
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • solvents known to be usable for the protein condensation reaction for example,
  • Acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpiperidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; alcohols such as trifluoroethanol; Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • the ninhydrin reaction when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group.
  • unreacted amino acids can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole to prevent the subsequent reaction from being affected.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C11Z, Br-Z, a Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenyl Phosphinothio oil, Fmoc, and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, an alkyl esterified (eg, a linear, branched or cyclic alkyl such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl).
  • an alkyl esterified eg, a linear, branched or cyclic alkyl such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl.
  • Esterification aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarponyl hydrazide , T-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification eg, benzyloxycarponyl hydrazide , T-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, groups derived from carbonic acid such as lower (d- 6 ) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, benzyloxy carbonyl group and ethoxycarbonyl group. It is required.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz and C 1 2 - Bz l, 2- nitrobenzyl, B R_Z, such as t- butyl are used.
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc. Can be
  • Examples of the activated carboxylic acid group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromethylphenol, 2,4 —Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOB t).
  • active ester eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromethylphenol, 2,4 —Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOB t.
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or anhydrous hydrogen fluoride, Acid treatment with sulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, a base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and sodium in liquid ammonia Reduction by acetic acid is also used.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or anhydrous hydrogen fluoride
  • Acid treatment with sulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof a base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and sodium in liquid ammonia Reduction by acetic acid is also
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° (: to 40 ° C.)
  • anisol for example, anisol, phenol, thioanisole, methcresol
  • a cation scavenger such as paracresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,21-ethanedithiol, etc.
  • 2,4-dinitride used as an imidazole protecting group for histidine is effective.
  • the mouth phenyl group is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tributofan is not only protected by acid treatment in the presence of 1,2-ethanedithiol, 1,4-butanedithiol as described above, It is also removed by alkaline treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protection group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group that plays a role in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide of the target protein or peptide for example, first, amidation and protection of the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal, and then a peptide (protein) chain is desired on the amino group side
  • the protein or peptide is obtained by removing only the protecting group of the ⁇ -terminal monoamino group of the peptide chain or by removing only the peptide and the protecting group of the C-terminal lipoxyl group.
  • the two proteins or peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein or peptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain the desired protein or peptide amide.
  • the desired protein or peptide ester can be obtained in the same manner as the protein or peptide amide. .
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide of the present invention with the remaining portion (peptide or amino acid), and removing the protective group when the product has a protective group, the desired peptide is obtained.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the protein or peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. it can.
  • the protein or peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein or peptide is obtained as a salt, a known method Alternatively, it can be converted to a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • genomic DNA, genomic DNA library, c Any of DNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell-tissue.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include, for example, DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and high stringency Any DNA may be used as long as it has a nucleotide sequence that hybridizes under suitable conditions and encodes a protein having substantially the same properties as the protein of the present invention.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, preferably For example, DNA containing a base sequence having about 99% or more homology is used.
  • Hybridization is performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). be able to.
  • a commercially available library it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringency conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 70 ° C.
  • the conditions at 65 are shown. Particularly, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes the above-described partial code of the present invention. Any nucleic acid containing the nucleotide sequence encoding the peptide may be used. Genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA derived from the above-described cells and tissues Either library or synthetic DNA may be used.
  • DNA having a part of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is highly stringent
  • a DNA having a base sequence that hybridizes under the conditions and a part of a DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention may be used.
  • the DNA that can hybridize with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 has the same significance as described above.
  • a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the protein of the present invention is used.
  • the DNA base sequence can be replaced using a known kit, for example, Mutan TM -G (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), or other known methods such as the Gapped duplex method and the Kunkel method. It can be carried out in accordance with an equivalent method.
  • the cloned DNA encoding the protein of the present invention can be used as it is or, if desired, digested with a restriction enzyme or added with a linker, if desired.
  • the DNA has ATG as a translation initiation codon at the 5 'end, and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. May be provided. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, for example, cDNA, and (mouth) converting the DNA fragment into an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting to the downstream of the Promo All Night.
  • vectors examples include E. coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, , PSH19, pSH15), bacteriophage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, ⁇ 1, ⁇ RcZCMV, pRc / RSV, pc DNAI / Neo is used.
  • E. coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, PSH19, pSH
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when animal cells are used as host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, etc.
  • CMV (cytomegalovirus) promoter, SRo! It is preferable to use one or the like.
  • trp promoter one coater, lac promoter, re cA promoter, AP L promoter, l pp promoter Isseki one, such as T 7 promoter, if the host is Ru der Bacillus
  • yeast such as SPO1 Promoter, SP02 Promoter, penP Promoter, etc., PH5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may further include an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter, sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like, if desired.
  • a selection marker for example, dihydrofolate reductase (hereinafter, dh fr And sometimes abbreviated) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes Amp abbreviation), the neomycin resistance gene (hereinafter, ⁇ abbreviated as Ne o f, G418 resistance).
  • dh fr gene is used as a selection marker using Chinese hamster cells deficient in the dh fr gene
  • the target gene can also be selected using a thymidine-free medium.
  • a DNA encoding a signal sequence suitable for the host is added to the 5 ′ terminal side of the DNA encoding the protein of the present invention.
  • a bacterium belonging to the genus Escherichia a Pho A signal sequence, an Omp A signal sequence, and the like are used.
  • the host is yeast, MFu signal sequence, SUC2 signal sequence, etc.
  • the host is animal cells, insulin-signal sequence, ⁇ —interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Can be used.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli (Esclieric hia coli) K12 ⁇ DH1 [Procedures of the national academy ⁇ Ob '' Science of the observatory ⁇ U.S.A. (Proc. Natl. Acad. Sc. USA), 60, 160 (1968)), JMl 03 (Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)), J A2 21 [Journal of Molecular Biology], 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)] And C600 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus sp. include, for example, Bacillus subtilis MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal Journal of Biochemistry, 95, 87 (1 984)] and the like are used.
  • Sacdiaromyces cerevisiae Sacdiaromyces cerevisiae (Sacdiaromyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Yl 90, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 or the like is used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of the night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Tricoplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al.
  • animal cells examples include monkey cells COS-7, Vero, Chinese Eight Muster cells CHO (hereinafter, abbreviated as CHO cells), dh fr gene-deficient chicks, and Chinese hamster cell CHO (hereinafter, CHO (dh fr ”) cells. Abbreviation), mouse
  • L cells mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a night medium is suitable as a medium to be used for cultivation, and the carbon required for the growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip lica, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, and the like.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the size of the medium is preferably about 5 to 8.
  • Examples of a culture medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, a 9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics). Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory New York 1972]. If necessary, an agent such as 3 / 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours.
  • Burkholder's minimal medium Bostian, KL et al., Prossings of the National Academy of Cultures, Inc. Science medium of the US- (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)) or SD medium containing 0.5% casamino acid (Bitter, GA et al., Processings Prob. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the culture medium used is 10% immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, T., Nature, 195, 788 (1962)). Those to which additives such as serum are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association at The Journal of the American Medical Association at Volume 199, 519 (1967)] 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine], 73, 1 (1950)].
  • ⁇ is about 6-8.
  • Cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40X for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the protein of the present invention is placed in the cells, cell membrane or extracellular cells of the transformant. It can produce protein.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • Purification of the protein of the present invention contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods mainly include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Method using difference in molecular weight Method using charge difference such as ion exchange chromatography, Method using specific affinity such as affinity mouth chromatography, Hydrophobicity such as reversed phase high performance liquid chromatography
  • a method using the difference between the isoelectric points such as a method utilizing the difference between the isoelectric points, and an isoelectric point electrophoresis method are used.
  • the thus-obtained protein of the present invention when obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto. It can be converted to a free form or another salt by a method or a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • the protein-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by, for example, enzyme immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein, partial peptide or salt thereof of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein of the present invention or its salt.
  • an antibody against the protein, partial peptide or a salt thereof of the present invention (hereinafter, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention) can be obtained by using the protein of the present invention as an antigen and producing a known antibody or antiserum.
  • the protein of the present invention can be manufactured according to
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site capable of producing an antibody upon administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained in them.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained in them.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Köhler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG ) And Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP 2/0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used to screen the monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which the protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mouse) or protein A
  • a monoclonal antibody bound to the solid phase A monoclonal antibody bound to a solid phase is prepared by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like. And a method for detecting antibody.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in an animal cell culture medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium containing 1-10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or hybridoma culture Serum-free medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 ° (preferably about 37 ° C.)
  • the culturing time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)). Adsorption-desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which the antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G and the bond is dissociated to obtain the antibody). Can be done.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting an antibody-containing substance for the protein and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier-protein and the mixing ratio of carrier and hapten are different from those of hapten immunized by cross-linking with carrier.
  • Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as it can be efficiently prepared.
  • serum serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 1 hapten to 1 hapten.
  • a method of coupling at a rate of 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually made once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • an antisense DNA having a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as the DNA of the present invention).
  • any antisense DNA as long as it has a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the DNA of the present invention and has an action capable of suppressing the expression of the DNA. There may be.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70% of the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology. In particular, about 70% or more of the total nucleotide sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention is complementary to the complementary sequence of the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention (for example, the nucleotide sequence near the start codon).
  • An antisense DNA having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable.
  • These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • a protein, a partial peptide or a salt thereof of the present invention hereinafter sometimes abbreviated as a protein of the present invention
  • a DNA encoding the protein or a partial peptide of the present invention hereinafter abbreviated as a DNA of the present invention
  • the use of an antibody against the protein, partial peptide or salt thereof of the present invention hereinafter, sometimes abbreviated as the antibody of the present invention
  • antisense DNA will be described.
  • the protein of the present invention binds to I RAP to form GLUT 4 endoplasmic reticulum (GLUT4, I RAP, VAMP s, SCAMP s, Rab 4 and other proteins). (Localized endoplasmic reticulum) within the cells, and suppresses the uptake of sugar in the blood into muscle cells and fat cells, thereby increasing blood sugar levels. Therefore, the protein of the present invention or the DNA of the present invention can be used as a medicament such as an agent for preventing or treating various diseases such as hypoglycemia.
  • the (mouth) cell is inserted with the DNA of the present invention, and after expressing the protein of the present invention, the cells are expressed.
  • the role of the protein of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted by transplanting the protein of the present invention into the patient, or (8) administering the protein of the present invention to the patient.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-described prophylactic / therapeutic agent, the DNA is used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. It can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the protein purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. It is preferred to use.
  • the protein of the present invention can be used, for example, as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, or as an aerosol in the form of an inhalant, or water or other pharmaceutical agent, if necessary. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions with suspensions that are acceptable, or suspensions.
  • the protein of the present invention is mixed with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of preparations. Thus, it can be manufactured. In these formulations The amount of the active ingredient is such that a suitable dosage in the range indicated is obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical manufacturing methods, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D_mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents for example, alcohols (for example, alcohol), polyalcohols (for example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (for example, Polysorbate 80 TM, HCO-50, etc.) You may use together with.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • a preservative eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • an antioxidant e.g., an antioxidant, and the like may be blended.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention is inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and thus can be used, for example, in humans or other warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, sheep, bush, pests, Poma, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.).
  • the dosage of the protein of the present invention varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the protein of the present invention is orally administered for the purpose of treating hypoglycemia, generally the adult (60 kg) is used.
  • the protein is administered from about O.lmg to: LO Omg, preferably from about 1.0 to 50 mg, more preferably from about 1.0 to 2 Omg per day.
  • the single dose of the protein varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the protein of the present invention is injected into an adult (body weight) in the form of an injection. 6 Okg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0 • 1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg of the protein per day is injected into the affected area. It is convenient to administer by doing so. In the case of other animals, a dose converted per 6 Okg can be administered.
  • the protein of the present invention binds to the cytoplasmic domain of IRAP, retains the GLUT4 endoplasmic reticulum in cells, and suppresses the uptake of blood sugar into muscle cells and fat cells. Therefore, a compound that inhibits the binding of the protein of the present invention to IRAP, and preferably a compound that inhibits the binding of the protein of the present invention to the cytoplasmic domain of IRAP, is a blood sugar muscle cell and fat. It can promote uptake into cells and lower blood glucose levels.
  • diabetes eg, type 1 diabetes, type 2 diabetes, gestational diabetes, etc.
  • impaired glucose tolerance I GT (I Immediate aired Glucose Tolerance)
  • diabetic complications e.g., neuropathy, nephropathy, retinopathy, cataract, macrovascular disease, osteopenia, hyperglycemic hyperosmolar coma, infectious diseases (e.g., respiratory Infections, urinary tract infections, gastrointestinal tract infections, skin and soft tissue infections, lower limb infections, etc.), diabetic gangrene, xerostomia, decreased hearing, cerebrovascular disorders, peripheral blood circulation disorders, etc.
  • Therapeutic agent and an inhibitor for the transition from glucose intolerance to glucoseuria What pharmaceutically useful.
  • diabetes was defined as a fasting blood glucose level (glucose concentration in venous plasma) of 126 mg / d1 or more and a 75 g transglucose tolerance test (75 gOGTT). ) A state in which the 2-hour value (glucose concentration in venous plasma) is 20 OmgZd 1 or more, and the blood glucose value (glucose concentration in venous plasma) is 20 OmgZd 1 or more.
  • diabetes is defined as a fasting blood glucose level (dulcose concentration in venous plasma) of 126 mg / d1 or more, and a 2-hour 75 g glucose tolerance test (glucose in venous plasma). Concentration) is 20 Omg / d 1 or more.
  • impaired glucose tolerance refers to a fasting blood glucose level (glucose concentration in venous plasma) of less than 126 mg / d1 and a 2-hour value of 75 g transglucose glucose test (venous plasma glucose). Is less than 14 Omg / d1 and less than 20 OmgZd1.
  • IFG Impaired Fasting Glucose
  • the 2-hour value of the 75 g translobulin glucose tolerance test was less than 4 Omg / d1. Is called IFG (Impaired Fasting Glycemia).
  • Compounds that inhibit the binding of the protein of the present invention to IRAP include diabetes, borderline type, impaired glucose tolerance, IFG (Immediate aired Fasting Glucose) and IFG (Impaired) determined by the above-mentioned new criteria. It is also used as a preventive or therapeutic agent for Fasting Glycemia). Furthermore, the compound of the present invention that inhibits the binding of the protein to I RAP can also prevent progression of borderline type, impaired glucose tolerance, IFG (Impaired Fasting Glucose) or IFG (Impaired Fasting Glycemia) to diabetes. it can. Examples of the compound that inhibits the binding between the protein of the present invention and IRAP include, for example, a compound represented by the formula:
  • the protein of the present invention also binds to the cytoplasmic domain of GLUT4 (amino acid number 468 to 510 of GLUT4; SEQ ID NO: 7), and by retaining the GLUT4 endoplasmic reticulum in the cell, Suppresses sugar uptake into muscle cells and fat cells. Therefore, compounds that inhibit the binding between the protein of the present invention and GLUT4
  • the compound that inhibits the binding of the protein of the present invention to the cytoplasmic domain of GLUT4 is, like the compound that inhibits the binding of the protein of the present invention to IRAP, for example, hyperglycemia, diabetes, etc. It is useful as a drug for prevention and treatment of diseases.
  • the protein of the present invention is used, and further, IRAP or a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of IRAP or GLUT4 or a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of GLUT4 may be used.
  • the screening method of the present invention relates to a method for producing a cell capable of producing the protein of the present invention (preferably, a transformant transformed with the DNA encoding the protein of the present invention (eg, yeast, animal cells, etc.) Cells)) may be used.
  • the transformant may be a transformant transformed with DNA encoding the protein of the present invention and a DNA encoding a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of IRAP or IRAP, or the protein of the present invention. And a transformant transformed with DNA encoding GLUT4 or DNA encoding GLUT4 or a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of GLUT4.
  • the protein of the present invention is immobilized on a solid phase (eg, EIA plate) using an antibody against the protein of the present invention, or the protein of the present invention is tagged with a Tag protein (eg, His_Tag, GST (Dal After fusion with thione-S-transferase), immobilize it on a solid phase.
  • a Tag protein eg, His_Tag, GST (Dal After fusion with thione-S-transferase
  • a partial peptide having binding activity to IRAP or GLUT4 such as amino acids 36 to 655 of SEQ ID NO: 1 is preferably used.
  • nickel is used for His-Tag
  • daltathione is used for GST.
  • a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of IRAP or IRAP (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a partial sequence thereof, preferably amino acid numbers 55 to 82 of SEQ ID NO: 5) or GLUT 4 or a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of GLUT 4 (SEQ ID NO: 7) labeled with biotin or the like is added and allowed to bind.
  • This A test compound is added to the complex of the present invention, and I RAP or I RAP partial peptide or GLUT4 or GLUT4 partial peptide released as a result of inhibition of the binding of the protein of the present invention to I RAP or GLUT 4 is labeled with biotin or the like. Detection and quantification are performed using a commercially available kit for detecting the body or a known anti-IRAP antibody or a commercially available anti-GLUT4 antibody.
  • a compound that releases IRAP or IRAP partial peptide or GLUT4 or GLUT4 partial peptide is a compound that inhibits the binding of the protein of the present invention to IRAP or GLUT4 (hereinafter referred to as a binding inhibitor). There is).
  • a partial peptide corresponding to IRAP or an IRAP cytoplasmic domain (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a partial sequence thereof, preferably amino acids 55 to 82 of SEQ ID NO: 5) or cytoplasm of GLUT4 or GLUT4
  • a partial peptide (SEQ ID NO: 7) corresponding to the internal domain is immobilized on a solid phase, and the protein of the present invention is bound thereto.
  • the protein of the present invention may be a protein of the present invention fused to Tag protein, and in that case, the released protein of the present invention is detected and quantified by an antibody against the protein of the present invention. Alternatively, detection and quantification may be performed using an antibody against the Tag protein.
  • the compounds that release the proteins of the invention are selected as binding inhibitors.
  • the inhibitory activity of the selected compound can be confirmed by a known method such as an immunoprecipitation method using an anti-IRAP antibody, an anti-GLUT4 antibody, an antibody against the protein of the present invention, or an antibody against Tag. .
  • a known method such as an immunoprecipitation method using an anti-IRAP antibody, an anti-GLUT4 antibody, an antibody against the protein of the present invention, or an antibody against Tag.
  • the protein of the present invention or IRAP or GLUT4 released by inhibiting the binding of the protein of the present invention to IRAP or GLUT4 by the selected compound is added to the protein of the present invention.
  • yeast e.g., Saccharomyces cerevisiae, more preferably S. cerevisiae Y190 strain
  • yeast corresponds to the partial peptide corresponding to the IRAP cytoplasmic domain or the GLUT4 cytoplasmic domain to which the repo overnight gene binding domain is fused.
  • Expression of DNA encoding the protein of the present invention in which the DNA encoding the partial peptide is fused with the reporter gene transcription activation domain, causes the j3_galactosidase gene, a repo overnight gene, to be expressed by the action of two-hybrid. And the histidine synthesis gene HIS3 phenotype is expressed.
  • This yeast strain is cultured for a certain period of time in the presence of the test compound, and a compound that reduces the jS-galactosidase activity of the yeast strain or converts the yeast strain to histidine auxotrophy is selected.
  • the yeast strain can be cultured in the same manner as described above for the culture of the transformant in which the host is yeast.
  • 3-galactosidase activity is X-Ga1 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-i3-D-galactopyranoside), ONPG (o-nitropenyl j8-D-galactopyranoside) or CP RG (chlo rophenyl red- -D-galactopyranoside) can be measured as a substrate according to a known method.
  • Expression of the HIS3 phenotype can be measured by culturing yeast in a minimal medium lacking histidine.
  • compounds having cytotoxicity and compounds that inhibit the activity of the reporter gene product itself due to interaction with the reporter gene product can be excluded as false positive compounds.
  • An animal cell eg, a Chinese hamster berry (CHO) cell
  • a repo overnight gene for example, a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene or a firefly luciferase gene.
  • the transcriptional regulatory region of the reporter gene binds, for example, the transcriptional activation sequence (UAS) of GAL1 downstream of a promoter that functions in animal cells (eg, the minimal promoter from adenovirus E1b (TATA bo)).
  • Yeast two-hybrid system Introduce the transcriptional regulatory system of GAL4-GAL1 into animal cells to induce the expression of reporter genes in animal cells.
  • a DNA encoding a partial peptide corresponding to the IRAP cytoplasmic domain or a partial peptide corresponding to the GLUT4 cytoplasmic domain fused to a GAL4-DNA binding domain is added thereto.
  • Expression of the DNA encoding the protein of the present invention fused to DNA encoding the virus-derived VP16 protein yields an animal cell line in which the repo allele gene is expressed by the action of two-hybrid. This cell line is cultured for a certain period of time in the presence of the test compound, the activity of the reporter gene product is measured, and a compound that reduces the activity is selected.
  • the animal cell strain can be cultured in the same manner as the culture of the above-mentioned transformant whose host is an animal cell.
  • the activity of repo overnight gene products such as CAT and luciferase can be measured using a commercially available kit according to a known method.
  • compounds that inhibit the activity of the reporter gene product itself due to interaction with the cytotoxic compound and the reporter gene product can be excluded as false positive compounds.
  • the transcriptional regulatory region of the DNA of the present invention is cloned, and a reporter gene (eg, one galactosidase, firefly luciferase, Ramphenicol acetyl transferase (CAT) etc.) and transfect into animal cells (eg, CHO cells).
  • a reporter gene eg, one galactosidase, firefly luciferase, Ramphenicol acetyl transferase (CAT) etc.
  • CAT Ramphenicol acetyl transferase
  • This cell line is cultured for a certain period of time in the presence of the test compound, and a compound that increases or decreases the production of the reporter gene product is selected.
  • the animal cell strain can be cultured in the same manner as the culture of the above-described transformant whose host is an animal cell.
  • the increase or decrease in the production of the repo overnight gene product can be determined, for example, by measuring the activity of the reporter gene product in the culture solution.
  • cytotoxic compounds and compounds that increase or decrease the activity of the reporter gene product itself due to interaction with the reporter gene product or the like can be excluded as false positive compounds.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • Examples of the compound that suppresses the expression of the protein of the present invention include a compound that suppresses the expression of the protein of the present invention obtained by the above-described screening, the above-described antisense DNA, and a promoter that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention described below. And the like.
  • Examples of the compound that promotes the expression of the protein of the present invention include a compound that promotes the expression of the protein of the present invention obtained by the above screening, and a compound that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention described below.
  • the screening kit of the present invention contains the protein of the present invention, and further contains IRAP or a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of IRAP or GLUT4 or a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of GLUT4. Is also good.
  • the screening kit of the present invention comprises a cell having the ability to produce the protein of the present invention (preferably, a transformant transformed with DNA encoding the protein of the present invention (eg, yeast, animal cells). Cells))).
  • the transformant may be a transformant transformed with a DNA encoding the protein of the present invention and a DNA encoding a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of IRAP or IRAP, or a protein of the present invention.
  • a transformant may be a transformant which is transformed with DNA encoding GLUT4 or a DNA encoding a peptide corresponding to GLUT4 or the cytoplasmic domain of GLUT4.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention may be a test compound as described above, for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, or a plant. Extract, animal tissue extraction A compound selected from night, plasma, etc., for example, a compound that inhibits the binding of the protein of the present invention to IRAP or GLUT4, a compound that promotes or suppresses the expression of the protein of the present invention And so on.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • the compound that suppresses the expression of the protein of the present invention is useful as a medicament such as a prophylactic or therapeutic agent for diseases such as hyperglycemia and diabetes.
  • the compound that promotes the expression of the protein of the present invention is useful, for example, as a medicament such as an agent for preventing or treating diseases such as hypoglycemia.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention can be formulated according to a conventional method.
  • the drug containing the protein of the present invention it is formulated into tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like, and is orally or parenterally administered. can do.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans or other warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, sheep, bush, puppies, puppies, birds, cats, cats). Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.For example, it inhibits the binding of the protein of the present invention to IRAP or GLUT4 for the purpose of treating diabetes.
  • Oral administration of a compound that inhibits the expression of the protein of the present invention or a compound of the present invention generally requires about 0.1 to 100 mg of the compound per day for adults (with a body weight of 60 kg). Preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered.
  • the single dose of the compound may vary depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the protein of the present invention may be used in combination with IRAP or GLUT4.
  • a compound that inhibits the binding or a compound that suppresses the expression of the protein of the present invention is usually administered to an adult (as 6 O kg) in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day. It is convenient to administer the drug by intravenous injection, preferably of the order of 0.1 to 20 mg, more preferably of the order of 0.1 to 1 Omg. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • a compound that promotes the expression of the protein of the present invention when administered for the purpose of treating hypoglycemia, generally, in an adult (assuming a body weight of 6 O kg), the compound is administered daily. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound.
  • the compound of the present invention that promotes the expression of the protein of the present invention when usually administered to adults (as 60 kg) in the form of an injection for the purpose of treating hypoglycemia, the compound may be administered in an amount of about 0.01 to about 0.01 per day. It is convenient to administer about 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg, by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • Antibody to the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention)
  • one of the antibodies is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the monoclonal antibody of the present invention In addition to quantifying the protein of the present invention using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like is also possible. it can.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution.
  • any measurement method may be used as long as the amount of the body is detected by chemical or physical means, and this is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the above-mentioned enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example,) 3-galactosidase, ⁇ -darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, and malate dehydrogenase are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, J-reciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test solution is allowed to react with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • an antibody for solid phase or an antibody for labeling The type of antibody used in the method is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies may be used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method or a nephelometry.
  • a competition method an antigen in a test solution and a labeled antigen are used for the antibody.
  • the competitive reaction the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated (
  • B / F separation B, F labeling amount is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing scattering by a laser is preferably used.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, (1) when an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected, for example, a disease such as hyperglycemia or diabetes (2) When a decrease in the concentration of the protein of the present invention is detected, for example, a disease such as hypoglycemia, or It can be diagnosed that there is a high possibility that the event will occur.
  • a disease such as hyperglycemia or diabetes
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • a subject such as a body fluid or a tissue.
  • the detection of the protein of the present invention in each fraction during purification, and the analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce human or other warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, sheep, horses, horses, cats, cats, cats).
  • human or other warm-blooded animals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, sheep, horses, horses, cats, cats, cats.
  • abnormalities geneetic abnormalities
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the well-known Northern Eighth hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)), The National Academy of Sciences of the USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA), Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) it can.
  • Antisense DNA that binds complementarily to the DNA of the present invention and can suppress the expression of the DNA can suppress the production of the protein of the present invention in a living body. Like the compounds that suppress the expression of, it can be used as, for example, an agent for preventing or treating hyperglycemia or diabetes.
  • the above-mentioned antisense DNA is used as the above-mentioned preventive / therapeutic agent, it can be carried out in the same manner as the above-mentioned various preventive / therapeutic agents containing DNA of the present invention.
  • the antisense DNA when used, the antisense DNA may be used alone or in a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus bacterium. After insertion into a suitable vector, such as a citrate virus vector, it can be carried out according to conventional means.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and then administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, they can be aerosolized and administered to the trachea as an inhalant.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • a drug containing the antibody of the present invention a drug containing the antibody of the present invention
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the protein of the present invention, can be used as a medicament (prophylactic / therapeutic agent) for diseases such as hyperglycemia and diabetes.
  • the prophylactic and therapeutic agents for humans or other warm-blooded animals eg, rats, puppies, sheep, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, etc.
  • the dosage varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.For example, when used for the prevention and treatment of diabetes in adults, the antibody of the present invention is usually administered as a single dose.
  • 0.0 1-2 O mg Z kg body weight preferably 0.1-1 O mg / kg body weight, more preferably 0.1-5 mg Zkg body weight about 1-5 times a day, It is convenient to administer by intravenous injection preferably about once to three times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased depending on the symptoms.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the antibody of the present invention and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms
  • specific examples include tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups, emulsions, and suspensions.
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, and the like
  • suitable solubilizing agents for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxy ethylene (5 Omol) adduct of hydrogenated catalyst)) and the like may be used in combination.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxy ethylene (5 Omol) adduct of hydrogenated catalyst)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a unit dosage form adapted to the dose of the active ingredient.
  • dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories and the like, and usually 5 to 500 mg, especially
  • the injection preferably contains 5 to 100 mg of the above antibody, and other dosage forms contain 10 to 250 mg of the above antibody.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the present invention relates to a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). And a non-human mammal having the same.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa, and germ cells including their progenitor cells.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, and the lipofection method It can be produced by transferring the target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, a retrovirus method, or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • Non-human mammals that can also produce the DNA-transferred animal of the present invention by fusing the above-mentioned germ cells with the above-mentioned germ cells by a known cell fusion method include, for example, porcupine, pig, sheep, goat, goat, and Nu, cats, guinea pigs, eight musters, mice, rats and the like are used.
  • rodents and biological cycles are relatively short in terms of the creation of disease animal model systems, and rodents that are easy to breed, especially mice (for example, as pure strains, C57BL6 strains, DBA2 strains, etc.
  • mice for example, as pure strains, C57BL6 strains, DBA2 strains, etc.
  • hybrid line BSC SF line, BDFt line, BSDSFi line, BALBZc line, ICR line, etc.
  • rat for example, Wistar, SD etc.
  • the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals humans and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals but to the DNA of the present invention isolated and extracted from mammals.
  • mutant DNA of the present invention those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of base, deletion, substitution with another base, etc. DNA that has been used is used, and also includes abnormal DNA.
  • a mutation for example, mutation
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same species or a different species from the target animal.
  • the human DNA of the present invention when transferred, it can be derived from various mammals having the DNA of the present invention having high homology to the human DNA (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.).
  • the DNA construct of the present invention eg, a vector
  • a target mammal for example, a mouse fertilized egg
  • microinjecting the DNA construct of the present invention downstream of various promoters capable of expressing DNA by microinjecting the DNA construct of the present invention downstream of various promoters capable of expressing DNA.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus.
  • animal viruses such as E. coli are used.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • Examples of the promoter that regulates the expression of DNA include: (1) a promoter of DNA derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni monoleukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.); (1) (2) Promoters derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, perobrakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle Creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, dalhithion S-transferase, platelet-derived growth factor j3, keratin Kl, ⁇ 10 and ⁇ 14, collagen type I and II, cyclic AMP Dependent protein kinase / 3 I supplement, disto-fin fin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, at
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target messenger RNII in a DNA-transferred mammal (generally called Yuichi Mineta-1). For example, it is derived from viruses and various mammals.
  • the sequence of each of the above DNAs can be used, and preferably, SV40 terminator of Simian virus or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are used 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or translation for the purpose of further expressing the target exogenous DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention may be a liver, a kidney, a thyroid cell, a fibroblast derived from a human or various mammals (eg, a heron, a dog, a cat, a guinea pig, a hams, a rat, a mouse, etc.).
  • Complementary DNA prepared by known methods from the source DNA and various genomic DNA libraries commercially available as all or part of genomic DNA, or from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts. It can be obtained as a raw material.
  • a foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal protein translation region obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional genetic engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the transgenic animal after the DNA transfer indicates that all the progeny of the transgenic animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. Means to do.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is reared as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that inherited the exogenous DNA of the present invention obtained a homozygous animal having an exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells in which the introduced DNA is present in both homologous chromosomes. By mating the male and female animals, all offspring are bred to have the DNA in excess. Can be passaged.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the function of endogenous normal DNA, thereby ultimately obtaining the protein of the present invention. It may develop hyperfunction and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine methods for treating these diseases. Is possible.
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used in screening tests for prophylactic and therapeutic drugs against diseases related to the protein of the present invention. Is also available.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is reared as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it. Further, the desired exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a source.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by a usual genetic engineering technique. Transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the transfer of DNA means that all the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention expresses the abnormal DNA of the present invention at a high level, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA to thereby ultimately reduce the function of the protein of the present invention. It may become a functionally inactive refractory disease and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention (dominant negative activity). Action).
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used in a therapeutic drug screening test for a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. Is also available.
  • ⁇ ⁇ Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of its antibody can be considered. Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of a disease related to the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. More detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the protein of the present invention can be obtained, which will contribute to the development of new treatment methods and the research and treatment of secondary diseases caused by the disease. it can.
  • each organ is removed from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells using a protease such as trypsin. It is.
  • the protein of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism can be examined, and its abnormality can be examined. It is an effective research material for elucidation.
  • the DNA transgenic animal of the present invention in order to use the DNA transgenic animal of the present invention to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including a refractory inactive type of the protein of the present invention, Using a quantitative method or the like, it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease.
  • using the DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention it is possible to examine and develop a method for treating a DNA associated with the protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA in which the DNA of the present invention is inactivated (7) the DNA is a drug resistance gene (eg, neomycin resistance gene) or a reporter gene (eg, derived from Escherichia coli) (6)
  • the non-human mammal according to (6), wherein the non-human mammal is inactivated by introducing the same, and the repo overnight gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention which comprises administering a test compound to the animal according to (7) and detecting the expression of a drug resistance gene or a reporter gene. Or a method for screening a salt thereof.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is defined as a DNA obtained by artificially mutating the DNA of the non-human mammal to suppress the expression of the DNA.
  • the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by the non-human mammal described above is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or a 1 ac Z (/ 3-galactosidase gene).
  • a DNA chain having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as targeting vector 1) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cells are used in the present invention.
  • the DNA sequence on or near the DNA used in the Southern hybridization analysis or the targeting vector and the DNA sequence in the neighboring region other than the DNA of the present invention used in the preparation of the targeting vector were used. It can be obtained by analyzing by a PCR method using primers and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or the known methods of Evans and Kaufman may be used. It may be newly established according to. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used. However, since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetic background is used.
  • BDFi mice C57BLZ6 and DBAZ2 BD Ft mice can be used successfully, etc.
  • the BD Ft mice have C57BL / 6 mice as their background
  • the ES cells obtained by using the method are advantageous in that, when a disease model mouse is created, the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing with C57BL / 6 mice. Can be used.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Many early embryos can be obtained.
  • Either male or female ES cells may be used, but male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • a method for determining the sex of ES cells for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be mentioned.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture
  • the primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between males and females, and the early stages of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative properties, but they must be carefully subcultured because they tend to lose their ability to generate individuals.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblast
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen. , 5% CO2, 90% air
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin Z0.1-
  • a single cell is prepared by treating with 5 mM EDTA (preferably about 0.1% trypsin / ImM EDTA), and the cells are seeded on a freshly prepared feeder cell.
  • Such subculture is usually performed every 11 to 13 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells can be cultured in monolayers at high densities or in suspension cultures to form cell clumps under appropriate conditions to produce various types of cells such as parietal, visceral, and cardiac muscles.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature, 292, 154, 1981; GR Martin, Processings of the National Academy of Sciences Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journals of Embryology and Extermental Morphology. 87, 27, 1985
  • the DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful in in vitro cell biology studies of the protein of the present invention. It is.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA amount of the animal using a known method and indirectly comparing the expression levels. It is.
  • non-human mammal those similar to the aforementioned can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be obtained, for example, by introducing the Yuichii getter vector prepared as described above into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells.
  • the DNA sequence in which the DNA of the present invention of the getter vector has been inactivated by homologous recombination replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by homologous recombination. By doing so, the DNA of the present invention can be knocked out.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA sequence on the targeting vector.
  • the determination can be made by PCR analysis using, as primers, the DNA sequence of a nearby region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used.
  • the cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated is cloned by homologous gene recombination, and the cell line is cloned at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudo-pregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both the cells having the normal DNA locus of the present invention and the cells having the artificially changed DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention, and mated with individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention.
  • a homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which a targeting vector is introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg by a microinjection method.
  • a transgenic non-human mammal of the present invention by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the germline can be obtained and maintained according to a standard method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and plural homozygous animals are obtained. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are very useful for producing a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Since it can be a model, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods. (10) A method for screening a compound having a prophylactic and / or therapeutic effect on a disease caused by DNA deficiency or damage according to the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be used for screening for a compound having a preventive / therapeutic effect against diseases (eg, hypoglycemia, etc.) caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention. Can be.
  • diseases eg, hypoglycemia, etc.
  • the present invention is characterized in that a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention, and changes in the animal are observed and measured.
  • a method for screening a compound or a salt thereof having a preventive / therapeutic effect on a resulting disease is provided.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include the same ones as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound. Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are used as indices. Test compounds can be tested for their prophylactic and therapeutic effects.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound selected from the test compounds described above, and is used for a disease (eg, hypoglycemia, etc.) caused by decreased expression of the protein of the present invention. Since it has preventive and therapeutic effects, it can be used as a medicament such as a safe and low-toxic preventive and therapeutic agent for the disease. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal).
  • a physiologically acceptable acid addition salt is preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs). And monkeys and monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like.
  • the compound when the compound is orally administered for the purpose of treating hypoglycemia, generally the adult (body weight) is used. (As 6 O kg) at about 0.1 to: L 0 O mg, preferably about 1.0 to 5 O mg, more preferably about 1.0 to 2 mg of the compound per day.
  • Omg is administered.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (6O O) for the treatment of hypoglycemia.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the present invention provides a method for administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention, and detecting the expression of a repo overnight gene, thereby promoting the activity of a promoter for a DNA of the present invention. Or a method of screening for a compound or a salt thereof that inhibits the compound.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention includes, among the above-mentioned non-human mammals deficient in expression of the DNA of the present invention, the DNA of the present invention into which a repo allele gene is introduced. And those in which the repo overnight gene can be expressed under the control of the promoter for the DNA of the present invention.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the reporter gene the same one as described above is used, and a / 3-galactosidase gene (1 ac Z), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention because the reporter gene is present.
  • a tissue that originally expresses the protein of the present invention may be used.
  • 3-galactosidase Ze is expressed. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a substrate for j3-galactosidase, such as 5-bromo-4-monochloro-3-indolyl / 3-galactopyranoside (X-gal), the present method can be easily performed.
  • a reagent serving as a substrate for j3-galactosidase such as 5-bromo-4-monochloro-3-indolyl / 3-galactopyranoside (X-gal)
  • X-gal 5-bromo-4-monochloro-3-indolyl / 3-galactopyranoside
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at room temperature. After reacting at about 7 ° C for about 30 minutes to 1 hour, the j3-galactosidase reaction can be stopped by washing the tissue specimen with ImM EDTA / PBS solution, and the color can be observed. .
  • mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity on DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (I (1, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts such as inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) and the like.
  • physiologically acceptable acid addition salts such as inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) and the like.
  • salts with organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tart
  • the compound or salt thereof that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention can promote the expression of the protein of the present invention and the activity of the protein, and thus can be used, for example, for diseases such as hypoglycemia. It is useful as a safe and low toxic prophylactic and therapeutic agent.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity for DNA of the present invention can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the activity of the protein. It is useful as a drug such as a safe and low toxic prophylactic / therapeutic agent for diseases.
  • the compounds derived from the compounds obtained by the above-mentioned screening are also the same. Can be used.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like.
  • a compound that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention for the purpose of treating diabetes is orally administered.
  • a compound that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention for the purpose of treating diabetes is orally administered.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention for the purpose of treating diabetes is injected.
  • the compound When administered to a normal adult (as 6 O kg) in the form of a dosage form, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • a compound of the present invention which promotes the promoter activity to DNA for the purpose of treating hypoglycemia generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg), the compound is reduced to about 0 per day. l-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but, for example, promotes the promoter overnight activity against the DNA of the present invention for the purpose of treating hypoglycemia.
  • the compound When the compound is usually administered to an adult (as 6 O kg) in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg. It is convenient to administer about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. Investigate or prevent the cause of various diseases caused by DNA expression deficiency.
  • transgenic animal In addition, using a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal). ) Makes it possible to specifically synthesize the protein and examine its action in living organisms. Furthermore, by binding an appropriate repo overnight gene to the above promoter portion and establishing a cell line in which the gene is expressed, the action of specifically promoting or suppressing the ability of the protein itself of the present invention to produce in the body can be achieved. It can be used as a search system for low molecular weight compounds. It is also possible to find new cis-elements and transcription factors that bind to them by analyzing a part of the promoter.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • VLCAD The amino acid sequence of human MD25 (VLCAD) is shown.
  • [SEQ ID NO: 2] Shows the nucleotide sequence of the human MD25 (VLCAD) gene (cDNA).
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • 1 shows the amino acid sequence of the N-terminal 109 amino acid residues of I RAP.
  • 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence of the N-terminal 109 amino acid residues of I RAP.
  • 3 shows the amino acid sequence of the 468th to 510th amino acid residues of GLUT4.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence of the 468th to 510th amino acid residues of GLUT4.
  • CDNA encoding a protein that binds to insulin responsive aminopeptidase was cloned by the yeast two-hybrid method.
  • the yeast two-hybrid method was basically performed using a MATCHMAKER two-hybrid system manufactured by C Ion tech.
  • a DNA fragment encoding the polypeptide from amino acid residue 55 to 82 of I RAP was prepared. It was chemically synthesized and inserted into the plasmid PGBT9 (manufactured by Clontech) expressing the GAL4-DNA binding domain (GAL4-BD) under the control of the ADH1 promoter. And As a cDNA library to be screened, a human skeletal muscle-derived cDNA library manufactured by Clontech was used.
  • This library is constructed so that the library cDNA is expressed in yeast under the control of the ADH1 promoter and fused to the GAL4 transcription activation domain (GAL4-AD).
  • GAL4-AD GAL4 transcription activation domain
  • Sacclmromyces cerevisiae Y190 was used as a host yeast.
  • This yeast strain contains the jS _ galactosidase gene (Lac Z) and the histidine synthesis gene (HIS 3 ) On its chromosome.
  • S. cerevisiae Y190 was introduced with pBait-2 (TRP1 marker) and a human skeletal muscle-derived cDNA library plasmid (LEU2 marker), containing both plasmids and a two-hybrid reporter gene.
  • TRP1 marker pBait-2
  • LEU2 marker human skeletal muscle-derived cDNA library plasmid
  • a transformant yeast expressing one HIS 3 was added with 60 mM 3-aminotriazole as the minimum medium.
  • selection was made on SD medium without tryptophan, leucine, and histidine.
  • the selected transformant colonies were transferred to a nylon membrane by a replica method, and the yeast cell wall was disrupted by freezing and thawing with liquid nitrogen, followed by X-Gal (5-bromo-4-chloro- / 3-D- The strain showing j8-galactosidase activity was used as the primary candidate strain. Screened 10 7 or more libraries one c DNA by the above method, it was obtained candidate genes 12 clones. A cell extract was prepared from these yeasts using Zymolyase (manufactured by Seikagaku Corporation), and the DNA fraction was used to transform Escherichia coli HB101, a leucine-requiring Escherichia coli.
  • the transformed Escherichia coli was spread on M9 medium containing no leucine, and Escherichia coli strains having library plasmid (LEU2 marker) were selected, and plasmids were extracted therefrom.
  • S. cerevisiae Y190 was again transformed with the extracted library plasmid and the I RAP bait vector pBait-2, and the histidine auxotrophy and / 3_galactosidase activity of the resulting transformant were determined. Upon examination, 5 clones showing reproducibility were obtained. Among these, a clone (MD 25 strain) having a strong ⁇ -galactosidase activity was selected.
  • VLCAD very-long chain acyl-CoA dehydrogenase
  • the MD25 cDNA base sequence (SEQ ID NO: 2) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) are shown in FIGS. Example 2 Confirmation of binding activity by measurement of ⁇ -galactosidase activity
  • Yeasts carrying both B ait and p rey vectors were subjected to liquid culture, and the cells were collected.
  • the cell wall was disrupted by freezing and thawing with liquid nitrogen.
  • CPRG was added to the suspension of the disrupted cells, and the absorbance at 578 nm of these samples was measured as / 3-galactosidase activity.
  • the unit of activity of 8-galactosidase was one unit of the enzymatic activity of one yeast cell hydrolyzing 1 mol of CP RG into chlorophenol red and D_galactoside per minute.
  • the B ait sequence includes I RAP (55-82; amino acid numbers 55 to 82 of SEQ ID NO: 5), and the prey sequence is an MD25 cDN A sequence directly isolated by the yeast two-hybrid method ( Sequences corresponding to the 3′-side from the base number 1 18 in FIGS. 1 to 3) were used. Further, as a negative control, a vector pGBT9 expressing a non-fused sequence of bALIT in GAL4-BD was used. The plasmid having these sequences was used to transform S. cerevisiae Y190, and the; 8-galactosidase activity of the reconstructed yeast transformant was measured.
  • the transformant having the MD25 cDNA exhibited about 11 units of / 3-galactosidase activity when I RAP (55-82) was defined as b ait.
  • GAL4-BD alone showed almost no binding activity to a protein having no bait sequence.
  • the value of / 3-galactosidase activity was lower than the detection limit in experiments using strains that did not have the MD25 cDNA, which is the prery sequence (Fig. 4).
  • the parent strain, S. cerevisiae Y190, is originally a histidine-requiring strain, but when bait and prey bind, HIS3, one of the repo overnight genes, is expressed, so the yeast strain does not require histidine. And sex. Strains containing I RAP as bait and MD 25 as prey were added with 4 OmM 3-aminotriazole and SD medium (minimal medium) without tributophan, leucine and histidine. Grew up. This confirmed that IRAP and MD25 bind.
  • the distribution of expression of MD25 mRNA in human tissues was detected by Northern plotting. That is, northern blotting was performed on poly (A) + RNA (each 2 / ig) of each human tissue using MD25 cDNA (base number 479-2049 of SEQ ID NO: 3) as a probe. As the nylon membrane to which the mRNA of each tissue of the human was transferred, an MTN blot (human 12 lane) manufactured by Clontech was used.
  • the MD25 cDNA probe labeled with 32 P was hybridized and washed under stringent conditions, and detected with an image analyzer BAS2000 II (manufactured by FUJIFILM Corporation). As shown in FIG. 5, MD25 mRNA was found to be strongly expressed in heart, skeletal muscle, kidney and liver with a length of about 2.4 kb. Industrial applicability
  • the protein of the present invention is strongly expressed in heart, skeletal muscle, kidney and liver.
  • the protein of the present invention increases the blood glucose level by binding to I RAP, and is therefore useful as a preventive and therapeutic agent for hypoglycemia.
  • the protein of the present invention is obtained by combining the protein of the present invention with I RAP or
  • the compound of the present invention that inhibits the binding between the protein and IRAP or GLUT4 is useful as an agent for preventing and treating diseases such as hyperglycemia and dysuria.

Description

明細書
I RAP結合タンパク質 技術分野
本発明は、 インシュリン ·レスポンシブ ·アミノぺプチダーゼ （I RAP) も しくはグルコーストランスポーター 4に結合するタンパク質またはその塩、 該タ ンパク質またはその塩などを用いた、 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤のス クリーニング方法、 該スクリーニング方法で得られる化合物、 該化合物の使用な どに関する。 背景技術
血糖値はィンシユリンの作用により、 骨格筋ならびに脂肪組織におけるダルコ —スの取り込みにより調節される。 糖尿病はこの作用の低下が原因で高血糖が持 続することにより生じる。 グルコースが細胞へ取り込まれるためにはグルコース トランスポー夕一 （糖輸送担体） と呼ばれる膜タンパク質の介在が必要である。 グルコーストランスポーターには現在 GLUT 1一 8の 8種類のものが知られて いるが (Bell et al.、 J. Biol. Cliem.、 268； 3352-3356、 1993; Olson & Pessi n、 Annu. Rev. Nutr. 16、 235-256、 1996; Ibberson et al.、 J. Biol. Ctiem.、 275、 4607—4612、 2000; Doege et al.、 J. Biol. Chem. , 275、 16275-16280) 、 これらのうちインシュリンによる糖輸送活性に強く関わるのは、 骨格筋、 脂肪組 織での発現が主に見られる GLUT 4である （Fukumoto et al.、 Proc. Natl. A cad. Sci. USA.、 85、 5434—5438、 1988; Birnbaum et al.、 Cell, 57、 305-315 、 1989) 。
通常、 GLUT 4は細胞内では GLUT 4小胞体と呼ばれる細胞内小胞に存在 しているが、 血糖上昇時は、 インシュリンの作用によりこれが細胞膜へ移行 （ト ランスロケーション） されることにより糖取り込みを促進すると考えられている (Bell et al.、 Diabetes Care, 13、 198—208、 1990; Czech et al.、 Trens. Bi oche Sci. , 17、 197 - 201、 1992) 。
この G L U T 4小胞体移行の分子メカニズムを明らかにするため GLUT4そ れ自身のみならず GLUT4小胞体を構成する他の夕ンパク質を同定することが 行われてきた。 現在のところ GLUT4小胞体を構成する分子として、 VMAP s (vesicle-assosiated membrane proteins; Cain et al.、 J. Biol. Chem.、 2 67、 11681-11634, 1992) 、 SCAMP s (secretory component-assacitated m embrane proteins; Thiodis et al、 J. Biol. Chem. , 268、 11691—11696、 1993; Laurie et al.、 J. Biol. Chem, 268、 19110 - 19117、 1993) 、 phosphatidylino sitol 4-kinase (Del Yacchio & Pilch, J. Biol. Chem, 266、 13278-13283, 19 91) 、 低分子量 G TP結合タンパク質 R a b 4 (Cormont et al.、 J. Biol. Che m.、 268、 1949卜 19497、 1993) 等の他に、 I RAP (insulin-responsive amino peptidase; Kandror & Pilch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 91、 8017-8021、 1 994、 Kandror et al.、 J. Biol. Chem. 269、 30777-30780, 1994, Keller et al 、 J. Biol. Chem. , 270、 23612-23618、 1995) が知られている。
I RAPは gp l 60とも呼ばれる一回膜貫通型の膜タンパク質で、 細胞内ォ ルガネラでは GLUT4小胞体に局在している。 タンパク質構造的には、 ァミノ 末端 （N末端） の 109アミノ酸が細胞質内ドメインで、 続いて 22アミノ酸の 膜貫通ドメイン、 さらにカルポキシ末端 （C末端） の 785アミノ酸からなる細 胞外ドメインから構成される (Kandror & Pi lcli、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 、 91、 8017-8021、 1994; Keller et al、 J. Biol. Chem. , 270、 23612-23618, 1 995) 。 細胞外ドメインは亜鉛依存性のプロテア一ゼ （アミノぺプチダーゼ） で ありその活性が確認されている （Kandror et al.、 J. Biol. Chem. 269、 30777- 30780、 1994) 。 これらのドメインのうち、 N末端側ドメイン （細胞質側ドメイ ン） に相当するべプチドを細胞内へ注入すると G L UT 4小胞体の細胞表面への 移行が生じることから、 GLUT 4小胞体を細胞内へ引き留めているための、 I RAPに結合するタンパク質の存在が予想されている （Walters et al.、 J. Bio 1. Chem, 272、 23323-23327, 1997) 。
本発明で得られた c DNAは既に報告されているヒトの very long chain acy 1-CoA dehydrogenase (VLCAD) の配列と一致するが （Andersen et al.、 Hu m. Mol. Benet.、 5、 461-472, 1996) 、 このタンパク質が I RAPと結合してい ることを報じた文献あるいは血糖調節に直接的に関与していることを報じた文献 は無い。 発明の開示 ， 本発明は、 VLCADと I RAPのタンパク質間相互作用を応用した血糖低下 作用を有する化合物のスクリーニング方法、 該スクリーニング方法で得られる化 合物などを提供する。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 酵母 two - hybrid法 (Fields & Strenglanz, Trens. Genet.、 10、 286-292、 1994; Brent & Finley、 A画. Rev. Genet.、 31、 663-704、 1997) を用いてヒト骨格筋由来 c DNAライブラリーから I RAP結合タンパク質として VLCADをクローニン グすることに成功した。 本発明者らはさらに検討を重ね、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は、
(1) インシュリン ·レスポンシブ ·アミノぺプチダ一ゼもしくはグルコース トランスポーター 4に結合する配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
(2) 上記 （1) 記載のタンパク質またはその塩を含有してなる医薬、
(3) 上記 （1) 記載のタンパク質をコードする DNAを含有する DNAを含 有してなる医薬、
(4) インシュリン 'レスポンシブ ·アミノぺプチダ一ゼもしくはグルコース トランスポーター 4への結合剤である上記 （2) または （3) 記載の医薬、
(5) 低血糖症予防 ·治療剤である上記 （2) または （3) 記載の医薬、
(6) 上記 （1) 記載のタンパク質をコードする DNAを含有する DNAを含 有してなる診断剤、
(7) 非ヒト哺乳動物に対して、 上記 （1) 記載のタンパク質またはその塩の 有効量を投与することを特徴とする低血糖症の予防 ·治療方法、
(8) 低血糖症の予防 ·治療剤を製造するための上記 （1) 記載のタンパク質 またはその塩の使用、
(9) 上記 （1) 記載のタンパク質をコードする DNAの塩基配列に相補もし くは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンス DNAを 含有してなる医薬、
(10) 上記 （1) 記載のタンパク質またはその塩に対する抗体を含有してな る医薬、
(11) 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤である上記 （9) または （10 ) 記載の医薬、
(12) 非ヒト哺乳動物に対して、 上記 （1) 記載のタンパク質またはその塩 に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする高血糖症または糖尿病の予防 •治療方法、
(13) 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤を製造するための上記 （1) 記 載のタンパク質またはその塩に対する抗体の使用、
(14) 上記 （1) 記載のタンパク質またはその塩に対する抗体を含有してな る診断剤、
(15) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩を用いる ことを特徴とする、 血糖増加作用または血糖低下作用を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法、
(16) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNA を含有する DNAを用いることを特徴とする、 血糖増加作用または血糖低下作用 を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(17) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩を含有し てなる、 血糖増加作用または血糖低下作用を有する化合物またはその塩のスクリ 一二ング用キッ卜、
(18) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする D N A を含有する D N Aを含有してなる、 血糖増加作用または血糖低下作用を有する化 合物またはその塩のスクリーニングキット、
(19) 上記 （15) もしくは （16) 記載のスクリーニング方法または上記 (17) もしくは （18) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 血糖増加作用を有する化合物またはその塩、
(20) 上記 （19) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (21) 低血糖症の予防 ·治療剤である上記 （20) 記載の医薬、
(22) 上記 （15) もしくは （16) 記載のスクリーニング方法または上記 (17) もしくは （18) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 血糖低下作用を有する化合物またはその塩、
(23) 上記 （22) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(24) 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤である上記 （23) 記載の医薬
(25) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩を用いる ことを特徴とする、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩 とインシユリン · レスボンシブ ·アミノぺプチダーゼもしくはグルコーストラン スポ一夕一 4との結合を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、
(26) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを産生する能力を有 する細胞を用いることを特徴とする上記 （25) 記載のスクリーニング方法、
(27) —方が固相に固定化された、 ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分べ プチド、 またはその塩と②標識したインシュリン ·レスポンシブ ·ァミノべプチ ダーゼもしくはグルコーストランスポーター 4との複合体に、 試験化合物を添加 し、 遊離物を検出することを特徴とする上記 （25) 記載のスクリーニング方法
(28) ①レポ一夕一遺伝子結合ドメインを融合させたインシュリン ·レスポ ンシブ ·アミノぺプチダーゼの細胞質側ドメインに相当する部分べプチドもしく はグルコーストランスポーター 4の細胞質内ドメインに相当する部分ペプチドを コードする DNAと②レポ一夕一遺伝子転写活性ドメインが融合した配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAで形質転換した細胞を 試験化合物の存在下および非存在下に培養し、 それぞれの場合におけるレポ一夕 一遺伝子の発現を検出することを特徴とする上記 （25) 記載のスクリーニング 方法、
(29) インシュリン ·レスポンシブ*ァミノべプチダ一ゼの細胞質側ドメイ ンに相当する部分ペプチドが配列番号： 5で表されるアミノ酸配列の第 55〜8
2番目のアミノ酸配列を含有する部分ペプチドで、 グルコーストランスポーター 4の細胞質内ドメインに相当する部分ペプチドが配列番号： 7で表されるァミノ 酸配列を含有する部分ペプチドである上記 （28) 記載のスクリーニング方法、
(30) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩を含有す る、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩とインシュリン
•レスボンシブ ·アミノぺプチダ一ゼもしくはグルコーストランスポーター 4と の結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(31) 上記 （25) 〜 （29) 記載のスクリーニング方法、 または上記 （3
0) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 1で表され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク 質、 その部分ペプチド、 またはその塩とインシュリン ·レスボンシプ ·ァミノべ プチダーゼもしくはグルコーストランスポーター 4との結合を阻害する化合物ま たはその塩、
(32) 上記 （31) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (33) 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤である上記 （32) 記載の医薬
(34) 非ヒト哺乳動物に対して、 上記 （31) 記載の化合物またはその塩の 有効量を投与することを特徴とする高血糖症または糖尿病の予防 ·治療方法、 (35) 高血糖症または糖尿病の予防 '治療剤を製造するための上記 （31) 記載の化合物またはその塩の使用、
(36) 上記 （25) 〜 （29) 記載のスクリーニング方法、 または上記 （3 0) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、 配列番号： 1で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質 、 その部分ペプチド、 またはその塩とインシュリン ·レスボンシブ ·アミノぺプ チダーゼもしくはグルコーストランスポ一夕一 4との結合を促進する化合物また はその塩、
(37) 上記 （36) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (38) 低血糖症の予防 ·治療剤である上記 （37) 記載の医薬、
(39) 非ヒト哺乳動物に対して、 上記 （36) 記載の化合物またはその塩の 有効量を投与することを特徴とする低血糖症の予防 ·治療方法、
(40) 低血糖症の予防 ·治療剤を製造するための上記 （36) 記載の化合物 またはその塩の使用、
(41) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、 当 該タンパク質の発現を促進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング 方法、
(42) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAの転写調節領域にレポ一 夕一遺伝子を融合させた DN Aで形質転換した細胞を試験化合物の存在下および 非存在下に培養し、 それぞれの場合におけるレポ一ター遺伝子の発現を検出する ことを特徴とする上記 （41) 記載のスクリーニング方法、
(43) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩を含有してなる、 当該タンパク 質の発現を促進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング用キッ卜、
(44) 上記 （41) または （42) 記載のスクリーニング方法または上記 （ 43) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 1で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質の発現を抑制する化合物またはその塩、 (45) 上記 （44) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(46) 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤である上記 （45) 記載の医薬
(47) 上記 （41) または （42) 記載のスクリーニング方法または上記 （ 43) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 1で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質の発現を促進する化合物またはその塩、
(48) 上記 （47) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(49) 低血糖症の予防 ·治療剤である上記 （48) 記載の医薬、
(50) 非ヒト哺乳動物に対して、 上記 （47) 記載の化合物またはその塩の 有効量を投与することを特徴とする低血糖症の予防 ·治療方法、
(51) 低血糖症の予防 ·治療剤を製造するための上記 （47) 記載の化合物 またはその塩の使用などに関する。 図面の簡単な説明
図 1はヒト VLCAD (MD 25) 遺伝子 （cDNA) の塩基配列ならびに予 想されるアミノ酸配列を示す （図 2へ続く） 。
図 2はヒト VLCAD (MD 25) 遺伝子 （cDNA) の塩基配列ならびに予 想されるアミノ酸配列を示す （図 1の続き、 図 3へ続く） 。
図 3はヒト VLCAD (MD 25) 遺伝子 （cDNA) の塩基配列ならびに予 想されるァミノ酸配列を示す。
図 4は; 8—ガラクトシダーゼ活性の定量による I RAPと VLCADの相互作 用を示す。 図中、 b a i tの—は GAL 4— DNABD配列のみを、 I RAPは これに I RAP (55 - 82) を融合させた配列を示す。 また、 p r eyの一は p r e yベクタ一なしのコントロールを、 MD 25は GAL 4— ADに VL C A Dの 118番目の塩基以降を融合した配列を示す。 I RAPZMD25では有意 に ガラクトシダーゼ活性が認められる。 結果の値は ]3ガラクトシダーゼ活性 単位 （平均値士標準偏差） である。
図 5は MD25 mRNAの組織分布を示す。 図中、 brainは脳、 heartは心臓 、 skeletal muscleは骨格筋、 colonは結腸、 thymusは胸腺、 spleenは脾臓、 kidn eyは腎臓、 l iverは肝臓、 smal l intest ineは小腸、 placentaは胎盤、 lungは肺、 leulocyuteは白血球を示す。 なお、 RNAのサイズ （k b ) は左端に表示した。 発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を有するタンパク質 （以下、 本発明のタンパク質と称することもあ る） は、 ヒトやその他の温血動物 （例えば、 モルモット、 ラッ.卜、 マウス、 ニヮ トリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細 胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 /3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲ ル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細 胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B 細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞 もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など ) もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例 、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎 、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下 腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来す るタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては 、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以 上、 より好ましくは、 約 9 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を 有するァミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有 するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。 実質的に同質の性質としては、 例えば、 I R A Pまたは G L UT 4への結合活 性などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が定性的に同質であるこ とを示す。 したがって、 I R A Pまたは G L U T 4への結合活性が同等であるこ とが好ましいが、 これらの性質の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素は異 なっていてもよい。
本発明の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 として、 より具体的には、 例えば、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列、 配列 番号： 1 0で表されるアミノ酸配列、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列な どがあげられる。
また、 本発明のタンパク質としては、 例えば、 ①配列番号： 1、 配列番号： 9 、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜2 5個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ま しくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 5個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列 番号： 1、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 5個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸 配列、 ④配列番号： 1、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で 表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 5個程度、 好 ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他の ァミノ酸で置換されたァミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたアミノ酸配 列を含有するタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表さ れるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明のタンパク質は 、 C末端が通常力ルポキシル基 （一 C O OH) またはカルポキシレート（—C O 0一） であるが、 C末端がアミド （一 C ONH2) またはエステル （― C O O R ) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピル、 n—ブチルなどの d— 6アルキル基、 例えば、 シクロペンチル 、 シクロへキシルなどの C 3-8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ一ナフ チルなどの C 6— 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル - Cぃ2アルキル基もしくはひ一ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C 2ァ ルキル基などの C 7— 1 4ァラルキル基、 ビバロイルォキシメチル基などが用いら れる。
本発明のタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキシレート ) を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているも のも本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記 した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 Ν末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残 基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの d- 6アル力 ノィルなどの d— 6ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて 生成する N末端のダル夕ミン残基がピ口ダル夕ミン酸化したもの、 分子内のァミ ノ酸の側鎖上の置換基 （例えば _ OH、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 ィ ンドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ル基などの C i— 6アルカノィル基などの C i - 6ァシル基など） で保護されている もの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質など も含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列を有するヒ卜骨格筋由来のタンパク質、 即ち、 文献記載の V L C AD ( Andersen et al. 、 Hum. Mol. Benet. 、 5、 46ト 472、 1996) などがあげられる。 本発明のタンパク質の部分ペプチド （以下、 本発明の部分ペプチドと略記する 場合もある） としては、 前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればい ずれのものでもよい。 例えば、 本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少 なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 よ り好ましくは 100個以上、 最も好ましくは 200個以上のアミノ酸配列を有す るペプチドなどが用いられる。 特に好ましくは、 本発明のタンパク質の C末端か ら連続した 200個以上 655個未満 （さらに好ましくは、 200個以上 620 個未満） のァミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するぺプチドが用いられる。 また、 本発明の部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が欠 失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜10個 程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのァ ミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましく は数 （1〜5) 個） のアミノ酸が揷入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1ま たは 2個以上 （好ましくは、 1〜10個程度、 より好ましくは数 （1〜5) 個程 度） のァミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明の部分ペプチドとして、 より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列の N末端から第 36番目 （A l a) 〜第 655番目 （Phe) で表され るァミノ酸配列を含有してなる部分べプチドなどがあげられる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常力ルポキシル基 （― COOH) ま たはカルポキシレート （― COO— ) であるが、 前記した本発明のタンパク質夕 ンパク質のごとく、 C末端がアミド （一 CONH2) またはエステル （一 COO R) であってもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のタンパク質タンパク質 と同様に、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基で 保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピロ グルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で 保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合べ プチドなども含まれる。
本発明の部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができ、 ま た本発明のタンパク質と I RAPまたは GLUT 4との結合を阻害する化合物の スクリーニングに用いることもできる。
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に許容される 酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ 、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例 えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有 機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンス ルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはその塩は、 前述したヒトやその他の 温血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造するこ ともできるし、 それらのタンパク質またはペプチドをコードする D NAを含有す る形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のぺ プチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から本発明のタンパク質、 その部分 ぺプチドまたはその塩を製造する場合、 ヒトやその他の哺乳動物の組織または細 胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 得られた抽出液を逆相クロマ 卜グラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドもしくはそのアミド体、 またはその塩の合 成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹 脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリ ルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂 、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメ チルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2 ' , 4 ' —ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 ' , 4 ' —ジメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げ ることができる。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖官能基を適当に保 護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質またはペプチドの配列通りに、 公知の 各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質ま たはべプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分 子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質、 ペプチドまたはそ れらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, N ' ージイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチ ルー N ' — （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対応する酸無水物または HO B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の 活性化を行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、
N， N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン、 ジォキサン、 テ卜ラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度は夕ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応 を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十 分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて 未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないよう にすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチルォキシ 力ルポニル、 イソボルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシカル ポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロア セチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、 ジフエ二ル ホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一 ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルポニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （d— 6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシ カルポニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いら れる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラニル基、 t -プチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz し C 12- Bz l、 2—ニトロベンジル、 B r_Z、 t—ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メトキシ —2， 3, 6 _卜リメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル 、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2 ， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N —ヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用い られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 ° (：〜 4 0 の温度で行われるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フ ェノール、 チオア二ソ一ル、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフ イド、 1 , 4一ブタンジチオール、 1， 2一エタンジチオールなどのようなカチ オン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として 用いられる 2， 4一ジニト口フエニル基はチオフエノール処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2 一エタンジチオール、 1， 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に鬨与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
目的とするタンパク質もしくはペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保 護した後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後 、 該ペプチド鎖の Ν末端の 一ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質もしく はべプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質もしく はペプチドとを製造し、 この両タンパク質またはべプチドを上記したような混合 溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護夕ンパク質もしくはべプチドを精製した後、 上記方法によりすべて の保護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 こ の粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画 分を凍結乾燥することで所望の夕ンパク質もしくはぺプチドのアミド体を得るこ とができる。
目的とするタンパク質もしくはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 力 ルポキシ末端アミノ酸のひ一力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミ ノ酸エステルとした後、 タンパク質もしくはペプチドのアミド体と同様にして、 所望のタンパク質もしくはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、 公知のペプチドの合成法に従って、 あ るいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することによって製造す ることができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法 のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の部分ペプチドを構成し得る部分べ プチドもしくはアミノ酸と残余部分 （ペプチドもしくはアミノ酸） とを縮合させ 、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを 製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下 の①〜⑤に記載された方法が挙げられる。
(DM. Bodanszkyおよび M. A. OndeU i、 ペプチド ·シンセシス （Pept ide Synthes i s) 、 Intersc ience Publ ishers, New York ( 1 9 6 6 ;
② Sciiroederおよび Luebke、 ザ 'ペプチド (The Pept ide) 、 Academic Press, Ne w York ( 1 9 6 5年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 （株） （1975年）
④矢島治明および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 I V, 2 0 5、 （ 1 9 7 7年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 1 4巻、 ペプチド合成、 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、.溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマ卜ダラ フィ一 ·液体クロマ卜グラフィ一 '再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク 質またはペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られるタンパク質 またはペプチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法に よって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方 法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができ る。
本発明のタンパク質をコードする D NAとしては、 前述した本発明のタンパク 質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム D N Aライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D N Aのいずれ でもよい。
ライブラリーに使用するべクタ一は、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 -組織より total R NAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcrip tase Polymerase Chain React ion (以下、 R T— P C R法と略称する） によって 増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表 される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号 '. 2で表される塩基配列を有 する D N Aとハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有 し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NAであれば何れのものでもよい。 配列番号： 2で表される塩基配列を有する D NAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズできる D NAとしては 、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クロ一ニング （Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. 、 Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこ とができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記 載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェント な条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜 6 5での条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 の 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を コードする D NAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を有する D NAな どが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードする D NAとしては、 前述した本発明の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ レ^ また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DNAのい ずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で 表される塩基配列の一部分を有する DNA、 または配列番号： 2で表される塩基 配列を有する DN Aとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基 配列を有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコ ードする DNAの一部分を有する DNAなどが用いられる。
配列番号： 2で表される塩基配列を有する DNAとハイプリダイズできる DN Aは、 前記と同意義を示す。
本発明のタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらを単に本発明のタンパク質 と略記することもある） をコードする DNAのクローニングの手段としては、 本 発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成 DNAプライマーを用いて PC R 法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み込んだ DN Aを本発明の夕 ンパク質の一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは合成 DNAを用 いて標識したものとのハイプリダイゼーシヨンによつて選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （Mole cular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al.、 Cold Spring Harbor Lab. Press、 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ 一を使用ずる場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる
DNAの塩基配列の置換は、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- G (宝酒造） 、 M utan™-K (宝酒造） などを用いて、 Gapped duplex法や Kunkel法などの公知の方 法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のタンパク質をコードする DN Aは目的によりそのま ま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用す ることができる。 該 DNAはその 5， 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを 有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAG を有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DN Aアダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質を コードする DNA、 例えば c DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口 ) 該 DNA断片を適当な発現べクタ一中のプロモ一夕一の下流に連結することに より製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322、 p BR 32 5、 pUC 12、 pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10、 pTP 5、 p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19、 p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス、 ワクシニアウィルス 、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 ρΧΤ 1、 ρ RcZCMV、 pRc/RSV、 p c D N A I /N e oなどが用いられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モー夕—、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRo!プロモ 一ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモ一ター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 APLプロモー ター、 l ppプロモ一夕一、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SPOlプロモ一夕一、 SP02プロモータ一、 p e nPプロモ一タ 一など、 宿主が酵母である場合は、 PH〇 5プロモーター、 PGKプロモーター 、 GAPプロモータ一、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞で ある場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp 略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne ofと略称する塲合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子 を選択マ一カーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列をコードする DNAを、 本発 明のタンパク質をコードする DNAの 5 ' 端末側に付加する。 宿主がェシエリヒ ァ属菌である場合は、 P h o A ·シグナル配列、 Omp A ·シグナル配列などが 、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリ シン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 MF u ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 インシュリン - シグナル配列、 《—インターフェロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列 などのシグナル配列がそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DNAを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ （Esclieric hia coli) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデ ミ一 ·ォブ 'サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sc i. USA) 、 60巻、 160 (1968)〕 、 J Ml 03 〔ヌクイレック ·ァシッズ • リサーチ、 （Nucleic Acids Research) 、 9巻、 309 (1981)〕 、 J A2 21 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Biology) 〕 、 120巻、 517 (1978)〕 、 HB101 〔ジャーナル ·ォブ -モレキュラー 'バイオロジー、 41巻、 459 (1969)〕 、 C 600 〔ジェ ネティックス （Genetics) 、 39巻、 440 (1954)〕 などが用いられる。 バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis ) M I 114 〔ジーン、 24巻、 255 (1983)〕 、 207 - 21 〔ジャーナ ル ·ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) 、 95巻、 87 (1 984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス ·セレビシェ （Sacdiaromyces cere visiae) AH 22, AH22R―、 NA87— 11A、 DKD— 5D、 20B— 12、 Yl 90、 シゾサッカロマイセス ·ボンべ （Schizosaccharomyces pombe ) NCYC1913、 NCYC 2036, ピキア ·パストリス （Pichia pastori s) KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Tric oplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra b rassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞； BmN細胞 ) などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711 ) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴイボ （In Vivo) 、 13、 21 3-217、 (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一
(Nature) 、 315卷、 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7、 Ve ro、 チャイニーズ八 ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh f r遺伝子欠損チヤィニ —ズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r ") 細胞と略記） 、 マウス
L細胞、 マウス At T— 20、 マウスミエローマ細胞、 ラット GH3、 ヒト FL 細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ.ォブ-ザ
•ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ .ォブ ·ザ ·ユーエスエー （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、 69巻、 2110 (1972) やジーン （Ge n e) 、 17巻、 107 (1982) などに記載の方法に従って行なうことがで きる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー 'アンド ·ジエネラ ル'ジエネティックス （Molecular & General Genetics) 、 168巻、 111 ( 1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ ·イン ·ェンザィモロジ一 （Meth ods in Enzymology) 、 194巻、 182— 187 (1991) 、 プロシ一ジン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル，アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ - ュ一エスエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) 、 75巻、 1929 (1978) などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ/テクノロジー （Bi o/Technology) 、 6、 47-55 (1988) ) などに記載の方法に従って行なうことがで さる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコ一ル. 263— 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジ一 （Virolo gy) 、 52巻、 456 (1973) に記載の方法に従って行なうことができる。 このようにして、 本発明のタンパク質をコードする DNAを含有する発現べク ターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては夜体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ·リカ一、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加 してもよい。 培地の ΡΗは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む Μ 9培地 〔ミラー （Miller) 、 ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ •イン 'モレキュラー 'ジェネティックス （Journal of Experiments in Molecu lar Genetics) 、 431 -433, Cold Spring Harbor Laboratory New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため に、 例えば、 3 /3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダ一 （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L.ら、 プロシージングズ ·ォブ •ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ ― (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、 77巻、 4505 (1980)〕 や 0. 5% カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A.ら、 プロシ一ジングズ ·ォブ · ザ .ナショナル ·アカデミー ·ォブ .サイェンシィズ .ォブ .ザ .ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、 81巻、 5330 (1984) ] が挙げられ る。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20°C〜35 °Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace's Insect Medium (Grace, T. 、 ネイチヤー （Nature) 、 195、 788 (1962 ) ) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる 。 培地の p Hは約 6. 2〜 6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °C で約 3〜5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) 、 122巻、 501 (1952)〕 、 DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) 、 8巻、 396 (1959)) 、 RPMI 1640培地 〔ジャーナル 'ォブ ·ザ ·アメリカン ' メアイカル'アソシエーション （The Journal of the American Medical Associ at ion) 199巻、 519 (1967)〕 、 199培地 〔プロシージング.ォブ · ザ ·ソサイエティ 'フォー ·ザ ·バイオロジカル 'メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) 、 73巻、 1 (1950) 〕 など が用いられる。 ρΗは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30°C〜40 Xで約 15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタン パク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後 、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波 、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した のち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いら れる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリトン X - 1 0 0™などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に本発明の夕 ンパク質が分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細胞と 上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明のタン パク質の精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる 。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用 する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマ トグラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトグラフィ —などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの 疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法 などが用いられる。
このようにして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、 公 知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で 得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当なタンパ ク修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部 分的に除去することもできる。 タンパク修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン 、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリ コシダーゼなどが用いられる。 このようにして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェン ザィムィムノアツセィゃウエスタンプロッティングなどにより測定することがで さる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、 本発明の夕 ンパク質またはその塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノク ローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはその塩 （以下、 これらを単に本発明 のタンパク質と略記することもある） に対する抗体は、 本発明のタンパク質を抗 原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバン卜や不完全フロイントアジュバン卜を投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよびラッ卜が好 ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化夕 ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミ ルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature) 、 256、 495 (1975) 〕 に従い実施する ことができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G ) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜 20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜 37 °C で 1〜 10分間ィンキュベ一トすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添 加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば 、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 1640 培地、 1〜10%の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ) あるい はハイプリドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ) などを 用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40° (、 好ましくは約 37°Cであ る。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は 、 通常 5%炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価 は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b) モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分 離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン 交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相 あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを 採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことができ る。
〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って製造 することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あるいはそれと キヤリァ一夕ンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法 と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明の夕ンパク質に対する 抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することができ る。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァ一夕ンパク質との複 合体に関し、 キャリア一タンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバン卜や不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。 抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一ナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで さる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドをコードする DNA (以下、 これらの DN Aを本発明の DNAと略記することもある） に相補的な、 または実質的に相補的 な塩基配列を有するアンチセンス DNAとしては、 本発明の DN Aに相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有し、 該 DN Aの発現を抑制し得る作用を有 するものであれば、 いずれのアンチセンス DN Aであってもよい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNAに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられ る。 特に、 本発明の DN Aの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のタンパク質の N 末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など ) の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90% 以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンス DNAが好適 である。 これらのアンチセンス DNAは、 公知の DNA合成装置などを用いて製 造することができる。 以下に、 本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発明の夕 ンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質、 部分ペプチドをコード する DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） 、 本発明のタンパク 質、 部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場 合がある） 、 およびアンチセンス DNAの用途を説明する。
(1) 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防 ·治療剤
本発明のタンパク質は、 I RAPと結合することにより GLUT 4小胞体 （G LUT4、 I RAP, VAMP s、 SCAMP s、 R a b 4などのタンパク質が 局在している小胞体） を細胞内にとどめ、 血中の糖の筋肉細胞および脂肪細胞へ の取込みを抑制することにより血糖値を上昇させる。 よって、 本発明のタンパク 質または本発明の D N Aは低血糖症などの種々の疾患の予防 ·治療薬などの医薬 として使用することが出来る。
例えば、 生体内において本発明のタンパク質などが減少あるいは欠損している ために、 生体の恒常性維持または生体防御機構が十分に、 あるいは正常に発揮さ れない患者がいる場合に、 （ィ） 本発明の D N Aを該患者に投与し、 生体内で本 発明のタンパク質を発現させることによって、 （口） 細胞に本発明の D NAを挿 入し、 本発明のタンパク質を発現させた後に、 該細胞を患者に移植することによ つて、 または （八） 本発明のタンパク質を該患者に投与することなどによって、 該患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、 あるいは正常に発揮させる ことができる。
本発明の D NAを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 該 D NAを単独 あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァ ソシェ一テッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段 に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D NAは、 そ のままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体と ともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによつ て投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なくとも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましくは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のタンパク質は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤 、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいはエアロゾル 化して吸入剤の形で、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との 無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば 、 本発明のタンパク質を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル 、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される 単位用量形態で混和することによつて製造することができる。 これら製剤におけ る有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤製造法に従って処方する ことができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D _マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 ェ夕ノ ールなど) 、 ポリアルコール (例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0™、 H C O—5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などが挙げられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どと併用してもよい。 また、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム 緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど ) 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保 存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合 してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
本発明の D NAが挿入されたべクタ一も上記と同様に製剤化され、 通常、 非経 口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた はその他の温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒ ッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与 することができる。 本発明のタンパク質の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより 差異はあるが、 例えば、 低血糖症の治療目的で本発明のタンパク質を経口投与す る場合、 一般的に成人 （60kgとして） においては、 一日につき該タンパク質 を約 O. lmg〜： L O Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは 約 1. 0〜2 Omg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該タンパク質の 1回 投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 低血糖症の治療 目的で本発明のタンパク質を注射剤の形で成人 （体重 6 Okgとして） に投与す る場合、 一日につき該タンパク質を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0 • 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を患部に注射する ことにより投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 Okg当たりに換 算した量を投与することができる。
(2) 結合阻害物質のスクリーニング
本発明のタンパク質は I RAPの細胞質側ドメインに結合し、 GLUT 4小胞 体を細胞内に留め、 血中の糖の筋肉細胞および脂肪細胞への取込みを抑制する。 したがって、 本発明のタンパク質と I RAPとの結合を阻害する化合物、 好まし くは本発明のタンパク質と IRAPの細胞質側ドメインとの結合を阻害する化合 物は、 血中の糖の筋肉細胞および脂肪細胞への取込みを促進し、 血糖値を低下さ せることができ、 例えば、 高血糖症、 糖尿病 （例、 1型糖尿病、 2型糖尿病、 妊 娠糖尿病等） 、 耐糖能不全 [I GT (I即 aired Glucose Tolerance) ] 、 糖尿 病性合併症 [例、 神経障害、 腎症、 網膜症、 白内障、 大血管障害、 骨減少症、 糖 尿病性高浸透圧昏睡、 感染症 （例、 呼吸器感染症、 尿路感染症、 消化器感染症、 皮膚軟部組織感染症、 下肢感染症等） 、 糖尿病性壊疽、 口腔乾燥症、 聴覚の低下 、 脳血管障害、 末梢血行障害等] などの予防 ·治療剤；および耐糖能不全から糖 尿病への移行抑制剤などの医薬として有用である。
糖尿病の判定基準については、 1999年に日本糖尿病学会から新たな判定基 準が報告されている。
この報告によれば、 糖尿病とは、 空腹時血糖値 （静脈血漿におけるグルコース 濃度） が 126mg/d 1以上、 75 g経ロブドウ糖負荷試験 （75 gOGTT ) 2時間値 （静脈血漿におけるグルコース濃度） が 20 OmgZd 1以上、 随時 血糖値 （静脈血漿におけるグルコース濃度） が 20 OmgZd 1以上のいずれか を示す状態である。 また、 上記糖尿病に該当せず、 かつ、 「空腹時血糖値 （静脈 血漿におけるグルコース濃度） が 11 Omg/d 1未満または 75 g経ロブドウ 糖負荷試験 （75g〇GTT) 2時間値 （静脈血漿におけるグルコース濃度） が 14 Omg/d 1未満を示す状態」 （正常型） でない状態を、 「境界型」 と呼ぶ また、 糖尿病の判定基準については、 1997年に ADA (米国糖尿病学会） から、 1998年に WHOから、 新たな判定基準が報告されている。
これらの報告によれば、 糖尿病とは、 空腹時血糖値 （静脈血漿におけるダルコ ース濃度） が 126mg/d 1以上であり、 かつ、 75 g経ロブドウ糖負荷試験 2時間値 （静脈血漿におけるグルコース濃度） が 20 Omg/d 1以上を示す状 態である。
また、 上記報告によれば、 耐糖能不全とは、 空腹時血糖値 （静脈血漿における グルコース濃度） が 126mg/d 1未満であり、 かつ、 75 g経ロブドウ糖負 荷試験 2時間値 （静脈血漿におけるグルコース濃度） が 14 Omg/d 1以上 2 0 OmgZd 1未満を示す状態である。 さらに、 ADAの報告によれば、 空腹時 血糖値 （静脈血漿におけるグルコース濃度） が 110mg/d l以上 126mg Zd 1未満の状態を I FG (Impaired Fasting Glucose) と呼ぶ。 一方、 WHO の報告によれば、 該 I FG (I即 aired Fasting Glucose) のうち、 75 g経ロブ ドウ糖負荷試験 2時間値 （静脈血漿におけるグルコース濃度） 力 4 Omg/d 1未満である状態を I FG (Impaired Fasting Glycemia) と呼ぶ。
本発明のタンパク質と I RAPとの結合を阻害する化合物は、 上記した新たな 判定基準により決定される糖尿病、 境界型、 耐糖能異常、 I FG (I即 aired Fas ting Glucose) および I FG (Impaired Fasting Glycemia) の予防'治療剤と しても用いられる。 さらに、 本発明のタンパク質と I RAPとの結合を阻害する 化合物は、 境界型、 耐糖能異常、 I FG (Impaired Fasting Glucose) または I FG (Impaired Fasting Glycemia) から糖尿病への進展を防止することもでき る。 本発明のタンパク質と I RAPとの結合を阻害する化合物としては、 例えば、 式：
[化 1 ]
Figure imgf000036_0001
または
[化 2]
Figure imgf000036_0002
で表される化合物等が挙げられる。
また、 本発明のタンパク質は GLUT 4の細胞質内ドメイン （GLUT 4のァ ミノ酸番号 468~510 ；配列番号： 7) にも結合し、 GLUT4小胞体を細 胞内に留めることにより、 血中の糖の筋肉細胞および脂肪細胞への取込みを抑制 する。 したがって、 本発明のタンパク質と GLUT 4との結合を阻害する化合物 、 好ましくは本発明のタンパク質と GLUT 4の細胞質内ドメインとの結合を阻 害する化合物は、 本発明のタンパク質と I RAPとの結合を阻害する化合物と同 様に、 例えば高血糖症、 糖尿病などの疾病に対する予防 ·治療剤などの医薬とし て有用である。
本発明のスクリーニング方法には、 本発明のタンパク質が用いられ、 さらに I RAPもしくは I RAPの細胞質側ドメインに相当するペプチドまたは G L U T 4もしくは GLUT 4の細胞質内ドメインに相当するペプチドが用いられてもよ レ^ また、 本発明のスクリーニング方法は、 本発明のタンパク質を産生する能力 を有する細胞 （好ましくは、 本発明のタンパク質コードする DNAで形質転換さ れた形質転換体 （例、 酵母、 動物細胞などの細胞） ） が用いられてもよい。 該形 質転換体は、 本発明のタンパク質をコ一ドする DNAおよび I RAPまたは I R APの細胞質側ドメインに相当するペプチドをコードする DN Aで形質転換され た形質転換体、 あるいは本発明のタンパク質をコードする DNAおよび GLUT 4または GLUT 4の細胞質内ドメインに相当するべプチドをコードする DN A で形質転換された形質転換体であつてもよい。
(2-1) In vitro結合試験によるスクリーニング
本発明のタンパク質を本発明のタンパク質に対する抗体を用いて固相 （例、 E I Aプレート） に固定化するか、 あるいは本発明のタンパク質を T a gタンパク 質 （例、 H i s _Ta g、 GST (ダル夕チオン— S—トランスフェラーゼ） 等 ) と融合させた後、 固相に固定化する。 本発明のタンパク質として本発明の部分 ペプチドを用いる場合には、 好ましくは I RAPまたは GLUT 4との結合活性 を有する部分ペプチド （配列番号： 1のアミノ酸番号 36〜655など） が用い られる。 タンパク質の固相への固定に際しては、 H i s— Tagであればニッケ ル、 GSTであればダルタチオンが用いられる。 これに、 I RAPもしくは I R APの細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （配列番号： 5で表されるアミ ノ酸配列またはその部分配列、 好ましくは配列番号： 5のアミノ酸番号 55〜8 2) または GLUT 4もしくは GLUT 4の細胞質内ドメインに相当する部分べ プチド （配列番号： 7) をピオチンなどで標識したものを加えて結合させる。 こ の複合体に試験化合物を添加し、 本発明のタンパク質と I RAPまたは GLUT 4との結合の阻害の結果として遊離した I RAPもしくは I RAP部分ペプチド または GLUT4もしくは GLUT4部分ぺプチドを、 ピオチンなどの標識体を 検出する市販のキットまたは公知の抗 I RAP抗体もしくは市販の抗 GLUT 4 抗体を用いて、 検出、 定量する。 I RAPもしくは I RAP部分ペプチドまたは GLUT4もしくは GL UT 4部分べプチドを遊離させる化合物を、 本発明の夕 ンパク質と I RAPもしくは GLUT4との結合を阻害する化合物 （以下、 結合 阻害剤と略称する場合がある） として選択する。
また、 I RAPもしくは I RAP細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （ 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列またはその部分配列、 好ましくは配列番号 ： 5のアミノ酸番号 55〜82) または GLUT4もしくは GLUT4の細胞質 内ドメインに相当する部分ペプチド （配列番号： 7) を固相に固定化し、 これに 本発明のタンパク質を結合させる。 I RAPもしくは I RAP部分ペプチドまた は GLUT 4もしくは GLUT 4部分ペプチドを固相へ固定化する際には、 例え ばピオチンで標識された I RAPもしくは I RAP部分ペプチドまたは GLUT 4もしくは GLUT4部分ペプチドとアビジンで標識された固相 （例、 プレート ) が好ましく用いられる。 この複合体に試験化合物を添加し、 遊離する本発明の タンパク質を本発明のタンパク質に対する抗体または T a gタンパク質に対する 抗体で検出、 定量する。 この方法において、 本発明のタンパク質は T a gタンパ ク質と融合させた本発明のタンパク質を用いてもよく、 その際には、 遊離する本 発明のタンパク質を本発明のタンパク質に対する抗体で検出、 定量してもよく、 また Tagタンパク質に対する抗体で検出、 定量してもよい。 本発明のタンパク 質を遊離させる化合物を、 結合阻害剤として選択する。
選択された化合物は、 抗 I RAP抗体、 抗 GLUT4抗体、 本発明のタンパク 質に対する抗体または T a gに対する抗体を用いた免疫沈降法等の公知の方法に より、 その阻害活性を確認することができる。 該免疫沈降法では、 選択された化 合物によって本発明のタンパク質と I RAPもしくは GLUT 4との結合が阻害 されることにより遊離する本発明のタンパク質または I RAPもしくは GLUT 4を本発明のタンパク質に対する抗体、 Tagタンパク質に対する抗体、 I RA Pに対する抗体または G L U T 4に対する抗体によって検出する。
(2-2) Two- Hybrid法によるスクリーニング
(2-2-1) 酵母 two- hybrid法によるスクリーニング
酵母 （例、 Saccharomyces cerevisiae、 より好ましくは S. cerevisiae Y190株 ) においてレポ一夕一遺伝子結合ドメインを融合させた上記 I RAP細胞質側ド メインに相当する部分ペプチドもしくは上記 G L U T 4細胞質内ドメインに相当 する部分べプチドをコードする D N Aとレポーター遺伝子転写活性ドメインが融 合した本発明のタンパク質をコードする DN Aを発現させると、 two-hybridの作 用により、 レポ一夕一遺伝子である j3_ガラクトシダーゼ遺伝子とヒスチジン合 成系遺伝子 H I S 3の表現形が発現する。 この酵母株を試験化合物の存在下、 一 定時間培養し、 酵母株の jS—ガラクトシダ一ゼ活性を減少させるか、 あるいは酵 母株をヒスチジン要求性に転換させる化合物を選択する。 該酵母株は、 上記した 宿主が酵母である形質転換体の培養と同様に培養できる。 ）3—ガラクトシダーゼ の活性は X— G a 1 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-i3-D-galactopyranoside) 、 ONPG (o-nitrop enyl j8-D-galactopyranoside) あるいは CP RG (chlo rophenyl red- -D-gal ac topyranos ide) を基質として公知の方法に従って測定 することができる。 HI S 3表現形の発現はヒスチジン欠損の最小培地で酵母を 培養することにより測定することができる。 選択された化合物のうち、 細胞毒性 のある化合物ならびにレポーター遺伝子産物との相互作用等でレポーター遺伝子 産物自身の活性を阻害する化合物は擬陽性化合物として除外できる。
(2-2-2) 動物細胞 two-hybrid法によるスクリーニング
動物細胞 （例、 チャイニーズハムスターォバリー （CHO) 細胞） にレポ一夕 一遺伝子として、 例えばクロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ （C AT) 遺伝子またはホタルルシフェラ一ゼ遺伝子を導入する。 レポーター遺伝子 の転写調節領域は、 例えば動物細胞で機能するプロモーター （例、 アデノウィル ス E 1 b由来の最小プロモー夕一 （TATA bo ) など） の下流に、 例えば GAL1の転写活性配列 （UAS) を結合したものを用い、 酵母 two- hybridシス テムの GAL 4— GAL 1の転写調節系を動物細胞内に導入し、 動物細胞内でレ ポーター遺伝子の発現が誘導されるようにする。 これに GAL 4—D NA結合ド メインに融合された上記 I R A P細胞質側ドメインに相当する部分べプチドもし くは上記 G L U T 4細胞質内ドメインに相当する部分ペプチドをコードする D N Aと、 例えば単純へルぺスウィルス由来 V P 1 6タンパク質をコードする D NA に融合した本発明のタンパク質をコードする D N Aを発現させると、 two- hybrid の作用によりレポ一夕一遺伝子が発現される動物細胞株が得られる。 この細胞株 を試験化合物の存在下、 一定時間培養し、 レポーター遺伝子産物の活性を測定し 、 活性を低下させる化合物を選択する。 該動物細胞株は、 上記した宿主が動物細 胞である形質転換体の培養と同様に培養できる。 C AT、 ルシフェラーゼなどの レポ一夕一遺伝子産物の活性は公知の方法に従って、 市販のキットを用いて測定 できる。 選択された化合物のうち、 細胞毒性のある化合物ならびにレポーター遺 伝子産物との相互作用等でレポーター遺伝子産物自身の活性を阻害する化合物を 擬陽性化合物として除外できる。
( 3 ) 本発明のタンパク質の発現を促進または抑制する化合物のスクリーニング 本発明の D NAの転写調節領域をクロ一ニングし、 これにレポ一ター遺伝子 （ 例、 一ガラクトシダーゼ、 ホタルルシフェラ一ゼ、 クロラムフエニコールァセ チルトランスフェラーゼ （C AT) 等） を融合し、 動物細胞 （例、 C HO細胞） に導入する。 この細胞株を試験化合物の存在下、 一定時間培養し、 レポーター遺 伝子産物の産生量を上昇または低下させる化合物を選択する。 該動物細胞株は、 上記した宿主が動物細胞である形質転換体の培養と同様に培養できる。 レポ一夕 一遺伝子産物の産生量の上昇または低下は、 例えば、 培養液中のレポーター遺伝 子産物の活性を測定することによって判定することができる。 選択された化合物 のうち、 細胞毒性のある化合物ならびにレポーター遺伝子産物との相互作用等で レポ一ター遺伝子産物自身の活性を上昇または低下させる化合物を擬陽性化合物 として除外できる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げ られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。
本発明のタンパク質の発現を抑制する化合物としては、 上記スクリーニングで 得られる本発明のタンパク質の発現を抑制する化合物、 上記したアンチセンス D NA、 後述の本発明の DN Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物などが あげられる。
本発明のタンパク質の発現を促進する化合物としては、 上記スクリーニングで 得られる本発明のタンパク質の発現を促進する化合物、 後述の本発明の DNAに 対するプロモーター活性を促進する化合物などがあげられる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質を含有し、 さらに I RAPもしくは I RAPの細胞質側ドメインに相当するべプチドまたは G L U T 4もしくは GLUT4の細胞質内ドメインに相当するべプチドを含有していても よい。 また、 本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質を産生す る能力を有する細胞 （好ましくは、 本発明のタンパク質をコードする DNAで形 質転換された形質転換体 （例、 酵母、 動物細胞などの細胞） ) を含有する。 該形 質転換体は、 本発明のタンパク質をコードする DN Aおよび I RAPまたは I R A Pの細胞質側ドメインに相当するペプチドをコードする DN Aで形質転換され た形質転換体、 あるいは本発明のタンパク質をコードする DNAおよび GLUT 4または GLUT4の細胞質内ドメインに相当するぺプチドをコ一ドする D N A で形質転換された形質転換体であってもよい。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出 ί夜、 血漿などから選ばれた化合物であり、 例えば、 本発明のタンパク質 と I RAPまたは GLUT4との結合阻害する化合物、 本発明のタンパク質の発 現を促進または抑制する化合物などがあげられる。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用い られる。
本発明のタンパク質と I RAPもしくは GLUT 4との結合を阻害する化合物 または本発明のタンパク質の発現を抑制する化合物は、 例えば、 高血糖症、 糖尿 病などの疾病に対する予防 ·治療剤などの医薬として有用である。
本発明のタンパク質の発現を促進する化合物は、 例えば、 低血糖症などの疾病 に対する予防 ·治療剤などの医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上述の予防，治療剤として使用する場合、 常套手段に従つ て製剤化することができる。 例えば、 前記した本発明のタンパク質を含有する医 薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌 性溶液、 懸濁液剤などに製剤化し、 経口的または非経口的に投与することができ る。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは その他の温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥ マ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができ る。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより差異はあるが、 例えば、 糖尿病治療の目的で本発明のタンパク質と I RAPもしくは GLUT4との結合を阻害する化合物または本発明の夕ンパク 質の発現を抑制する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgと して） においては、 一日につき該化合物を約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜 20 m g投与する。 非経口的に投 与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異な るが、 例えば、 糖尿病治療の目的で本発明のタンパク質と I RAPもしくは GL UT 4との結合を阻害する化合物または本発明のタンパク質の発現を抑制する化 合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該 化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より 好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である 。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。 例えば、 低血糖症治療の目的で本発明のタンパク質の発現を促進する化合物を 経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につ き該化合物を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ま しくは約 1. 0〜20mg投与する。 例えば、 低血糖症治療の目的で本発明の夕 ンパク質の発現を促進する化合物を注射剤の形で通常成人 （60 kgとして） に 投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射によ り投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量 を投与することができる。
(4) 本発明のタンパク質の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある
) は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中の本 発明の夕ンパク質の定量、 特にサンドイツチ免疫測定法による定量などに使用す ることができる。
すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定 することを特徴とする被検液中の本発明の夕ンパク質の定量法、 および
(i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活 性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供す る。
上記 （i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部 を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体で あることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノ ク口ーナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を行な えるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗 体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F (a b') 2、 F ab'、 ある いは F a b画分を用いてもよい。 本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これ を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ れば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィム ノメトリック法およびサンドィツチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点 で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵素 としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ）3—ガラクトシダー ゼ、 β—ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リン ゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミ ン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 Jレシフェリン、 ルシゲニンなどが用い られる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン—アビジン系を 用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常夕 ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不 溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 ある いはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なって もよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 ま た、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等 の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタンパク 質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応お よび 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発 明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好まし くは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （
B/ F分離） 、 B、 Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する 。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレンダリ コール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体とし て固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体と して固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザーネフロメトリーな どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構 築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを 参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GY 」 Vol. 70 (Immunochemical Technigues (Part A) ) 、 同書 Vol. 73 (I画] IOC hemical Techniques (Part B) ) 、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techni ues (Part 0 ) 、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniaues (Part D: Selected I 匪漏 assays) ) 、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniaues (Part E:Monoclo nal Ant ibodies and General Immunoass y Methods) ) 、 同書 Vol. 121 (Immun ochemical Techniaues (Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Ant i bod ies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行) などを参照することができる。 以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質 を感度良く定量することができる。 - さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することに よって、 （1 ) 本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、 例えば、 高 血糖症または糖尿病などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断 することができ、 また （2 ) 本発明のタンパク質の濃度の減少が検出された場合 、 例えば、 低血糖症などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断 することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパ ク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を精製 するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパク質 の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用 することができる。 (5) 遺伝子診断剤
本発明の DNAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは その他の温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッ ジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明 のタンパク質をコードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出す ることができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるい は発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診 断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザン八イブ リダィゼーシヨンや PC R— SS CP法 （ゲノミックス （Genomics) 、 第 5巻、 874〜 879頁 （1989年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスエー （Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA) 、 第 86巻、 2766〜 2770 頁 （1989年） ） などにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンにより発現過多が検出された場合や PC R— S S CP法により DN Aの突然変異が検出された場合は、 例えば、 高血 糖症または糖尿病、 あるいは低血糖症などの疾病である可能性が高いと診断する ことができる。 (6) アンチセンス DNAを含有する医薬
本発明の D N Aに相補的に結合し、 該 D N Aの発現を抑制することができるァ ンチセンス DN Aは、 生体内における本発明のタンパク質の産生を抑制すること ができるので、 上記の本発明のタンパク質の発現を抑制する化合物と同様に、 例 えば、 高血糖症または糖尿病などの予防 ·治療剤として使用することができる。 上記アンチセンス DNAを上記の予防'治療剤として使用する場合、 前記した 本発明の DN Aを含有する各種の予防 ·治療剤と同様にして実施することができ る。
例えば、 該アンチセンス DNAを用いる場合、 該アンチセンス DNAを単独あ るいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソ シエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に 従って実施することができる。 該アンチセンス DNAは、 そのままで、 あるいは 摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺 伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 ある いは、 エアロゾル化して吸入剤として気管内に投与することもできる。
さらに、 該アンチセンス D NAは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在 やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用す ることもできる。 ( 7 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 高血糖症 、 糖尿病などの疾患に対する医薬 （予防 ·治療剤） として使用することができる 本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は、 そのまま液剤として、 ま たは適当な剤形の医薬組成物として、 ヒトまたはその他の温血動物 （例、 ラット 、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または 非経口的に投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与 ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の糖尿病の予防 ·治療のために使 用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 0 1〜2 O m g Z k g 体重程度、 好ましくは 0. 1〜1 O m g / k g体重程度、 さらに好ましくは 0. 1 〜5 m gZk g体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場 合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症 状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 本発明の抗体と薬理学的に許容され得 る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 このような組成物は、 経口 または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形 、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤など があげられる。 かかる組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において 通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠 剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシゥ ムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体また はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁また は乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩 水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤 、 例えば、 アルコール (例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレング リコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベー 卜 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxy ethylene ( 5 O mol) adduct of hydrogenated c astor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される 。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混 合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜2 5 0 m gの上記抗体が含有されていることが 好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。 (8) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明の 外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DNAと 略記する場合がある） を有する非ヒ卜哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその台 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法 、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキス卜ラン 法、 レトロウイルス法などにより目的とする DNAを転移することによって作出 することができる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織 細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養など に利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合 法により融合させることにより本発明の DNA転移動物を作出することもできる 非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ 、 ネコ、 モルモット、 八ムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも 、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57 BLノ 6系統、 DBA2系統など、 交雑系として、 B SC S F 系統、 BDFt 系統、 BSDSFi系統、 BALBZc系統、 I CR系統など） またはラット （ 例えば、 Wi s t a r、 SDなど） などが好ましい。 哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
本発明の外来性 D NAとは、 非ヒ卜哺乳動物が本来有している本発明の D NA ではなく、 レ たん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の D NAをいう。
本発明の変異 D NAとしては、 元の本発明の D N Aの塩基配列に変異 （例えば 、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への 置換などが生じた D N Aなどが用いられ、 また、 異常 D N Aも含まれる。
該異常 D N Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる D N Aを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る D NAなどが用いられる。
本発明の外来性 D NAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあた つては、 該 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した D N Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の D N Aを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の D NAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト D N Aを結合した D NAコンストラクト （例、 ベクタ一など） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の D N Aを高発現する D NA転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好 ましく用いられる。
上記の D NA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 ①ウィルス （ 例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J C ウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する D NAのプロモータ 一、 ②各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラ ット、 マウスなど） 由来のプロモー夕一、 例えば、 アルブミン、 インシュリン I I、 ゥロブラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋ク レアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダル夕チオン S—トランスフ エラ一ゼ、 血小板由来成長因子 j3、 ケラチン K l、 Κ 1 0および Κ 1 4、 コラー ゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ /3 Iサプュ ニット、 ジス卜口フィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナトリ ゥム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナ一ゼ （一般に T i e 2と略される ) 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロテ イナ一ゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン ]3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ポリ ペプチド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 α) 、 βァクチン、 ひおよび j8ミオシン重鎖 、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy ー 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネン ト、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 ァクチン、 プレブ口エンケフアリン A、 バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発 現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトポリペプチド鎖延 長因子 l o; (EF— 1 α) のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ ]3ァクチンプロ モーターなどが好適である。
上記べクタ一は、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Αの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネタ一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Aの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネ夕一などが 用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DNAのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5 ' 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 ' 下流に連結することも目的により可能である。 正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 ラット、 マウスなど） 由来の肝 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 D NAおよび市販の各種ゲノム D NAラ イブラリーよりゲノム D NAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲 状腺細胞、 線維芽細胞由来 R NAより公知の方法により調製された相補 D NAを 原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D NAは、 上記の細胞ま たは組織より得られた正常な夕ンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変 異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D NAコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の 遺伝子工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D NA転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D NA保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D NAの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D NAが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA転移動物を用いて、 本発明 のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の 解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾患に 対する予防 ·治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D NAを安定に保持することを確認して該 D NA保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D N Aを前述のプラス ミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモーターとの D NAコン ストラク卜は、 通常の遺伝子工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D NA転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D NAの機能を阻害することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。 また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の夕 ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応 症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D NA転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D NA転移動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析するか、 または D N Aにより発現されたタンパク質組織を分析することによる、 本発明の タンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性につい ての解析、
③ D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用し て、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリ —ニング、 および
⑤本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した D N A転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のタンパク 質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。 さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物ま たは本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク質が関連す る疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。
(9) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本 発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DN Aが薬剤耐性遺伝子 （例、 ネオマイシン耐性遺伝子） またはレポ一 ター遺伝子 （例、 大腸菌由来の J3—ガラクトシダーゼ遺伝子） を導入することに より不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物、 (7) 該 DN Aが薬剤耐性遺伝子 （例、 ネオマイシン耐性遺伝子） またはレポ一 ター遺伝子 （例、 大腸菌由来の j8—ガラクトシダ一ゼ遺伝子） を導入することに より不活性化され、 該レポ一夕一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーター の制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、 (9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 薬剤耐性遺伝子または レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプ 口モーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法 を提供する。 本発明の D NAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の D N Aに人為的に変異を加えることにより、 D NAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 D N Aがコードしている本発明のタンパク質の活性 を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明のタンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト D NAと称することがある） 非ヒト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 E S細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D N Aに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 D NA配列の一部又は全部の削除、 他 D NAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックァゥト D NAを作製すればよい。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の D NAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z ( /3—ガラク卜シダーゼ遺伝子 ) , c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラ一ゼ遗伝子) を代表 とするレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる D NA配列 （ 例えば、 p o 1 y A付加シグナルなど） を揷入し、 完全なメッセンジャー R NA を合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した D NA配列を有する D NA鎖 （以下、 ターゲッティングベクタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について 本発明の D N A上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブ リダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上の D N A配列と夕一 ゲッティングべク夕一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配 列をプライマーとした P C R法により解析し、 本発明のノックアウト E S細胞を 選別することにより得ることができる。 また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知の Ev ansと Kaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの E S細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫 学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景 が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BL/6マウスや C 57 BLZ6の採卵数の少なさを DBAZ2との交雑により改善した BDFiマ ウス （C 57 BLZ6と DBAZ2との を用いて樹立したものなども良好 に用いうる。 BD Ftマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利 点に加えて、 C 57 BL/6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた E S細胞は病態モデルマゥスを作出したとき、 C 57 BL/6マウスとバッククロ スすることでその遺伝的背景を C 57 BL/6マウスに代えることが可能である 点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの E S細胞を用いてもよいが、 通常雄の E S細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例として挙げることができる 。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要し ていたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養 初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能で あり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S T O繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で L I F (1— 1000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空 気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 °Cで培養するなどの方 法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0. 001 — 0. 5%トリプシン Z0. 1 - 5mM EDTA、 好ましくは約 0. 1 %トリプシ ン /ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞 上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に行なう が、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその 培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種 々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufm an、 ネィチヤ一 （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin, プロシ一ジ ングズ ·ォブ ·ザ，ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ュ 一エスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschmanら、 ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオロジー ·アンド ·ェクスぺリメ ンタル ·モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分化さ せて得られる本発明の DN A発現不全細胞は、 インビトロにおける本発明のタン パク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRN A量を公知の方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別す ることが可能である。
該非ヒ卜哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し た夕一ゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入により夕一ゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D NAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAを ノックアウトさせることができる。
本発明の D NAがノックアウトされた細胞は、 本発明の D NA上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ一ション解析またはター ゲッティングベクター上の D N A配列と、 ターゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D NA以外の近傍領域の D N A配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D NA座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することにより夕ーゲッティングベクタ一を染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒ卜哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。 さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NAを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1、 ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴ一卜動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴー卜動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒ卜哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及 び治療法の検討に有用である。 ( 1 0 ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防 ·治療効 果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷など に起因する疾病 （例、 低血糖症など） に対して予防 ·治療効果を有する化合物の スクリーニングに用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病に対して予防 ·治療効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など が挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であ つてもよい。 具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し 、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を 指標として試験化合物の予防 ·治療効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物 から選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の発現低下などによって引き起 こされる疾患 （例、 低血糖症など） に対して予防，治療効果を有するので、 該疾 患に対する安全で低毒性な予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる 。 さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例アル カリ金属） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好 ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水 素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フ マル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸 、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 低血糖症の治療目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜： L 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 Omg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象 、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 低血糖症の治療目的で該化合物を 注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物 を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好まし くは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の 動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(1 1) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合 物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕一遺伝 子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 /3—ガラクトシダ —ゼ遺伝子 （ 1 ac Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DNAをレポ一夕一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポ一ター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレ一スする ことにより、 プロモータ一の活性を検出することができる。
例えば、 本発明の夕ンパク質をコードする D N A領域の一部を大腸菌由来の ]3 一ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 ac Z) で置換している場合、 本来、 本発明のタ ンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに ;3—ガラクトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモ—4一クロロー 3—インドリル— /3 一ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような j3—ガラクトシダーゼの基質とな る試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内に おける発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損 マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩液 （P B S ) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近 で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を I mM E D TA/ P B S 溶液で洗浄することによって、 j3—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観 察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検出しても よい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモー夕一活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリ一二ング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （伊 (1、 無機酸） や塩基 (例、 有機酸） な どとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この 様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレ イン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスル ホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモー夕一活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質の発現を促進し、 該タンパク質の活性を促進することができ るので、 例えば、 低血糖症などの疾病に対する安全で低毒性な予防 ·治療剤など の医薬として有用である。
—方、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその 塩は、 本発明のタンパク質の発現を阻害し、 該タンパク質の活性を阻害すること ができるので、 例えば、 高血糖症、 糖尿病などの疾病に対する安全で低毒性な予 防 ·治療剤などの医薬として有用である。
さらに、 上記スクリ一ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に对して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 糖尿病の治療目的で本発明の DNAに対するプロモー ター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgと · して） においては、 一日につき該化合物を約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投 与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異な るが、 例えば、 糖尿病の治療目的で本発明の DNAに対するプロモーター活性を 阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一 日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することが できる。
一方、 例えば、 低血糖症の治療目的で本発明の DNAに対するプロモーター活 性を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0 〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する 場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 低血糖症の治療目的で本発明の D N Aに対するプロモ一夕一活性を促進 する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日に つき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度 、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合 である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができ る。 このように、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する D N Aを使って、 そ の下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に 注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特 異的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能とな る。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポ一夕一遺伝子を結合させ、 これが 発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内での産 生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として 使用できる。 また該プ口モータ一部分を解析することにより新たなシスエレメン トやそれに結合する転写因子を見つけることも可能である。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I U P A C— I U B Commission on Biochemical Nomenclature による略号ある いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またァ ミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すもの とする。
D NA デォキシリポ核酸
c D NA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
R NA リポ核酸
mR NA メッセンジャーリポ核酸
d AT P デォキシアデノシン三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグァノシン三リン酸
dCTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SD S ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y
A 1 a ァラニン
Va 1 パリン
L e u ロイシン
I I e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u ダル夕ミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p 卜リブ卜ファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n
p G 1 u ピログルタミン酸 また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
Me メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン' 4 (R) 一力ルポキサミド基
T o s p—トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
C 12— B z 1 2， 6—ジクロロべンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルボニル
C 1一 z 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r -Z 2一ブロモベンジルォキシカルボニル
B o c t一ブトキシカルポニル
DNP ジニトロフエニル
T r t 卜' Jチル
Bum t一ブトキシメチル
Fm o c N— 9—フルォレニルメ卜キシカルポニル
HOB t 1—ヒドロキシベンズ卜リアゾール
HOOB t 3, 4ージヒドロー 3—ヒドロキシー 4—ォキソ一
1, 2， 3 _ベンゾトリアジン
HONB 1 -ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2, 3-ジカルポキシイミド DCC N, N' —ジシクロへキシルカルポジイミド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒ卜 MD25 (VLCAD) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕 ヒト MD25 (VLCAD) 遺伝子 （cDNA) の塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 1で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 1で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
I RAPの N末端 1 0 9個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
I RAPの N末端 1 0 9個のアミノ酸残基のアミノ酸配列をコードする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
GLUT4の 468〜510番目のアミノ酸残基のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
GLUT4の 468〜510番目のアミノ酸残基のアミノ酸配列をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
ラット VLCADのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 10〕
マウス VLCADのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 11〕
ゥシ VLCADのアミノ酸配列を示す。 後述の実施例 1で得られた MD 25の c D NA塩基配列 （配列番号： 2 ) を含 有するプラスミド pTB 2124を保持する形質転換体ェシエリヒア 'コリ （Es cliericliia coli) DH5 K/PTB 2 1 24は、 20 0 0年 9月 4日から茨城県 つくば巿東 1丁目 1番 1号 中央第 6 独立行政法人産業技術総合研究所 特許 生物寄託センター （旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I B H) ) に寄託番号 FERM BP— 7 2 9 0として、 2 0 00年 8月 24日から 大阪府大阪市淀川区十三本町 2丁目 17— 85 財団法人 ·発酵研究所 （ I F 0 ) に寄託番号 I FO 16469として寄託されている。 実施例
以下に、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はそれに 限定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキユラ 一'クローニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1 酵母 two- hybrid法による I RAP結合タンパク質をコードする c DN Aのクローニング
Insulin responsive aminopeptidase ( I RAP)に結合するタンパク質をコー ドする cDNAは酵母 two-hybrid法によりクローニングした。 酵母 two- hybrid法 は、 基本的には C Ion tech社製の MATCHMAKER two-hybrid systemを用いて行った。
I RAPのアミノ酸残基 55から 82番目のポリペプチド （Keller et al、 J . Biol. Chem.、 270、 23612-23618, 1995；配列番号： 5のアミノ酸番号 55 〜82) をコードする DNA断片を化学合成し、 これを ADH 1プロモーター支 配下で GAL4— DNA結合ドメイン （GAL4— BD) を発現するプラスミド PGBT9 (Clontech社製） に融合させる形で挿入し、 これを ba i tベクター 、 pBa i t— 2とした。 スクリーニングする c DNAライブラリ一は Clontech 社製のヒ卜骨格筋由来 cDNAライブラリーを用いた。 このライブラリ一は、 A DH1プロモーター支配下で GAL 4転写活性化ドメイン （GAL4— AD) に 融合した形で、 ライブラリー c D N Aが酵母内で発現されるように構築されてい る。 宿主酵母には Sacclmromyces cerevisiae Y190を用いた。 この酵母株は、 レ ポ一夕一遺伝子として GAL 1の TATA 0 と11八3 (upstream activati ng sequences) に制御下にある jS _ガラクトシダーゼ遺伝子 （L a c Z) とヒス チジン合成系遺伝子 （H I S 3) をその染色体上に保持している。
S. cerevisiae Y190に p B a i t— 2 (TRP1マーカ一） とヒ卜骨格筋由来 cDNAライブラリ一プラスミド （LEU2マ一カー） を導入し、 両方のプラス ミドを持ち、 かつ two- hybridのレポーター遺伝子の一つである H I S 3を発現し ている形質転換体酵母を最小培地である 60 mM 3—アミノ卜リァゾール添加 ならびにトリプ卜ファン、 ロイシン、 ヒスチジン非添加 SD培地で選択した。 選択 された形質転換体コロニーをナイロン膜にレプリカ法で移し、 液体窒素による凍 結，融解で酵母細胞壁を破砕した後、 X— Ga l (5-bromo-4-c loro-/3-D-gala ctoside) で染色を行い、 j8—ガラクトシダーゼ活性を呈する株を一次候補株と した。 上記の手法で 107個以上のライブラリ一 c DNAをスクリーニングし、 12クローンの候補遺伝子を取得した。 これらの酵母からザィモリエース （生化 学工業社製） を用いて細胞抽出液を調製し、 その DNA画分を用いてロイシン要 求性の大腸菌である Escherichia coli HB 101を形質転換した。
形質転換された大腸菌をロイシン不含 M 9培地に塗布し、 ライブラリープラス ミド （LEU2マーカー） を有する大腸菌株を選択し、 これらからプラスミドを 抽出した。 抽出されたライブラリープラスミドと I RAP b a i tベクターで ある pBa i t— 2を用いて、 再び S. cerevisiae Y190を形質転換し、 得られた 形質転換体のヒスチジン要求性ならびに /3_ガラクトシダ一ゼ活性を検査し、 再 現性を示す 5クローンを得た。 これらのなかから β—ガラクトシダーゼ活性の強 いクローン （MD 25株） を選択した。 MD 25の塩基配列はヒト very- long ch ain acyl-CoA dehydrogenase (Genbank D43682; 以下 VLCADと称する） の一 部と完全に一致した。 一致した部分は VLCADの全長 655アミノ酸 （配列番 号： 1) のうち 36番目のアミノ酸から下流側であった。 VLCADの N末端 ¾ 含む cDNA配列はヒト骨格筋 cDNAライブラリーを鍀型とする polymerase c hain reaction (PGR) で得た。 この P CRに用いたプライマー配列を以下に 示す。
( 1 ) 5'-AGAGATTCGGAGATGCAGGCGGCT-3' (配列番号： 3 )
(2) 5'-AGGGTAATGCCCACGCCAAGGTCA-3' (配列番号： 4)
この PC R断片と酵母 two-hybrid法によりクローニングした VLCADの部分 断片を制限酵素 S p h Iの部分でつなぎ合わせ、 全長 MD 25 c DNAとした (pTB 2124) 。
MD25の cDNA塩基配列 （配列番号： 2) ならびにアミノ酸配列 （配列番 号： 1) を図 1~3に示す。 実施例 2 β一ガラクトシダーゼ活性の測定による結合活性の確認
MD 25の I RAPへの結合を定量的に確認するため CP RG (chlorophenol red- 3-D-ga!actopyranoside) を基質とした ]3—ガラクトシダ一ゼ活性の測定 を行った。
B a i tと p r e yの両方のベクタ一を保持した酵母を液体培養し、 細胞を回 収後、 液体窒素による凍結 ·融解で細胞壁を破砕した。 この破砕された細胞の懸 濁液に CP RGを添加し、 それらのサンプルの 578 nmの吸光度を /3—ガラク トシダ一ゼ活性として測定した。 ；8—ガラクトシダーゼの活性の単位は 1分間に 1個の酵母細胞が 1 mo 1の CP RGを chlorophenol redと D_galactosideに 加水分解する酵素活性を 1単位とした。 B a i t配列には I RAP (55-82 ；配列番号： 5のアミノ酸番号 55〜 82) を、 また p r e y配列としては MD 25 cDN A配列のうち酵母 two-hybrid法で直接単離された配列 （図 1〜3の 塩基番号 1 1 8より 3 ' 側に相当する配列） を用いた。 さらに、 ネガティブコン トロールとして GAL 4— BDに b a i tとする配列の融合されていないものを 発現するベクター pGBT 9を用いた。 これらの配列を持つプラスミドを用いて S. cerevisiae Y190を形質転換し、 再構築された酵母形質転換株の；8—ガラクト シダーゼ活性を測定した。 MD25 cDNAを有する形質転換株は I RAP ( 55 - 82) を b a i tとしたとき約 1 1単位の /3—ガラクトシダーゼ活性を呈 した。 一方、 GAL4— BDのみで b a i t配列を持たないタンパク質に対して は殆ど結合活性を示さなかった。 なお、 p r e y配列である MD 25 cDNA を持たない株を用いた実験での /3—ガラクトシダ一ゼ活性の値は検出限界以下で あった （図 4) 。 実施例 3 ヒスチジン非要求性試験
親株である S. cerevisiae Y190は本来ヒスチジン要求性の株であるが、 b a i tと p r e yが結合した場合はレポ一夕一遺伝子の一つである H I S 3が発現す るので、 酵母株はヒスチジン非要求性となる。 b a i tとして I RAPを、 また p r e yとして MD 25を導入した株は 4 OmM 3ーァミノ卜リアゾ一ル添加 ならびにトリブトファン、 ロイシン、 ヒスチジン非添加 SD培地 （最小培地） で 生育した。 このことから I RAPと MD 25は結合することが確認された。 実施例 4 MD 25 mRNAのヒト組織における発現分布
MD 25 mRNAのヒ卜組織における発現分布をノーザンプロッティングに より検出した。 すなわち、 ヒト各組織の poly (A) + RNA (各 2 /i g) に対し MD 25 cDNA (配列番号： 3の塩基番 479— 2049) をプローブとしてノ —ザンブロッティングを行った。 ヒ卜の各組織の mRNAを転写されたナイロン 膜は Clontech社製の MTN blot (human 12 lane)を用いた。
32Pで標識した MD 25 cDNAプローブをストリンジェン卜な条件でハイ ブリダィズならびに洗浄し、 イメージアナライザ一 BAS 2000 I I (富士フ イルム社製） で検出した。 図 5に示すように、 MD 25 mRNAは約 2. 4 k bの長さで心臓、 骨格筋、 腎臓、 肝臓で強く発現していることが認められた。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質は心臓、 骨格筋、 腎臓、 肝臓で強い発現がみられる。 本発明のタンパク質は I RAPと結合することにより、 血糖値を上昇させるこ とから、 低血糖症の予防 ·治療剤として有用である。
また、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質と I RAPまたは GLUT
4との結合を阻害するスクリ一二ング方法に用いることができる。 本発明のタン パク質と I RAPもしくは GLUT4との結合を阻害する化合物は高血糖症、 糖 尿病などの疾病の予防 ·治療剤として有用である。

Claims

請求の範囲
I. インシュリン ' レスボンシブ'アミノぺプチダーゼもしくはグルコーストラ ンスポーター 4に結合する配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
2. 請求項 1記載のタンパク質またはその塩を含有してなる医薬。
3. 請求項 1記載のタンパク質をコードする DNAを含有する DNAを含有して なる医薬。
4. インシュリン ·レスボンシブ ·アミノぺプチダ一ゼもしくはグルコーストラ ンスポ一夕一 4への結合剤である請求項 2または 3記載の医薬。
5. 低血糖症予防 ·治療剤である請求項 2または 3記載の医薬。
6. 請求項 1記載のタンパク質をコードする DNAを含有する DNAを含有して なる診断剤。
7. 非ヒト哺乳動物に対して、 請求項 1記載のタンパク質またはその塩の有効量 を投与することを特徴とする低血糖症の予防 ·治療方法。
8. 低血糖症の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1記載のタンパク質または その塩の使用。
9. 請求項 1記載のタンパク質をコードする DNAの塩基配列に相補もしくは実 質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンス DNAを含有し てなる医薬。
10. 請求項 1記載のタンパク質またはその塩に対する抗体を含有してなる医薬
I I. 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤である請求項 9または 10記載の医
12. 非ヒト哺乳動物に対して、 請求項 1記載のタンパク質またはその塩に対す る抗体の有効量を投与することを特徴とする高血糖症または糖尿病の予防 ·治療 方法。
13. 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1記載の夕 ンパク質またはその塩に対する抗体の使用。
1 4. 請求項 1記載のタンパク質またはその塩に対する抗体を含有してなる診断 剤。
1 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩を用いること を特徴とする、 血糖増加作用または血糖低下作用を有する化合物またはその塩の スクリーニング方法。
1 6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードする D N Aを含 有する D NAを用いることを特徴とする、 血糖増加作用または血糖低下作用を有 する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 7 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩を含有してな る、 血糖増加作用または血糖低下作用を有する化合物またはその塩のスクリー二 ング用キット。
1 8 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする D N Aを含 有する D N Aを含有してなる、 血糖増加作用または血糖低下作用を有する化合物 またはその塩のスクリーニングキット。
1 9 . 請求項 1 5もしくは 1 6記載のスクリーニング方法または請求項 1 7もし くは 1 8記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 血糖増加作用を有 する化合物またはその塩。
2 0 . 請求項 1 9記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
2 1 . 低血糖症の予防 ·治療剤である請求項 2 0記載の医薬。
2 2 . 請求項 1 5もしくは 1 6記載のスクリーニング方法または請求項 1 7もし くは 1 8記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 血糖低下作用を有 する化合物またはその塩。
2 3 . 請求項 2 2記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
2 4. 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤である請求項 2 3記載の医薬。
2 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩を用いること を特徴とする、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩とィ ンシュリン- レスボンシブ.アミノぺプチダーゼもしくはグルコーストランスポ 一ター 4との結合を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法。
2 6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを産生する能力を有する 細胞を用いることを特徴とする請求項 2 5記載のスクリ一二ング方法。
2 7 . 方が固相に固定化された、 ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分べプチ ド、 またはその塩と②標識したインシユリン ·レスボンシブ ·アミノぺプチダ一 ゼもしくはグルコーストランスポーター 4との複合体に、 試験化合物を添加し、 遊離物を検出することを特徴とする請求項 2 5記載のスクリーニング方法。
2 8 . ①レポ一夕一遺伝子結合ドメインを融合させたインシュリン ·レスポンシ ブ ·アミノぺプチダーゼの細胞質側ドメインに相当する部分べプチドもしくはグ ルコーストランスポーター 4の細胞質内ドメインに相当する部分べプチドをコ一 ドする D NAと②レポ一ター遺伝子転写活性ドメインが融合した配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する夕 ンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NAで形質転換した細胞を試験 化合物の存在下および非存在下に培養し、 それぞれの場合におけるレポーター遺 伝子の発現を検出することを特徴とする請求項 2 5記載のスクリーニング方法。
2 9 . インシュリン ·レスポンシブ*アミノぺプチダ一ゼの細胞質側ドメインに 相当する部分ペプチドが配列番号： 5で表されるアミノ酸配列の第 5 5〜8 2番 目のアミノ酸配列を含有する部分ペプチドで、 グルコーストランスポーター 4の 細胞質内ドメインに相当する部分ペプチドが配列番号： 7で表されるアミノ酸配 列を含有する部分べプチドである請求項 2 8記載のスクリ一ニング方法。
3 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩を含有する、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質、 その部分ペプチド、 またはその塩とインシュリン ·レ スポンシブ ·アミノぺプチダ一ゼもしくはグルコーストランスポ一夕一 4との結 合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
3 1 . 請求項 2 5〜2 9記載のスクリーニング方法、 または請求項 3 0記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分 ペプチド、 またはその塩とインシュリン ·レスポンシブ*アミノぺプチダ一ゼも しくはグルコーストランスポーター 4との結合を阻害する化合物またはその塩。
3 2 . 請求項 3 1記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
3 3 . 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤である請求項 3 2記載の医薬。
3 4 . 非ヒト哺乳動物に対して、 請求項 3 1記載の化合物またはその塩の有効量 を投与することを特徴とする高血糖症または糖尿病の予防 ·治療方法。
3 5 . 高血糖症または糖尿病の予防，治療剤を製造するための請求項 3 1記載の 化合物またはその塩の使用。
3 6 . 請求項 2 5〜 2 9記載のスクリーニング方法、 または請求項 3 0記載のス クリーニング用キットを用いて得られる、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、 その部分べ プチド、 またはその塩とィンシュリン · レスボンシブ ·アミノぺプチダ一ゼもし くはグルコーストランスポーター 4との結合を促進する化合物またはその塩。
3 7 . 請求項 3 6記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
3 8 . 低血糖症の予防 ·治療剤である請求項 3 7記載の医薬。 ' 3 9 . 非ヒト哺乳動物に対して、 請求項 3 6記載の化合物またはその塩の有効量 を投与することを特徴とする低血糖症の予防 ·治療方法。
4 0 . 低血糖症の予防 ·治療剤を製造するための請求項 3 6記載の化合物または その塩の使用。
4 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、 当該夕 ンパク質の発現を促進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法
4 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D NAの転写調節領域にレポーター 遺伝子を融合させた D NAで形質転換した細胞を試験化合物の存在下および非存 在下に培養し、 それぞれの場合におけるレポ一夕一遺伝子の発現を検出すること を特徴とする請求項 4 1記載のスクリーニング方法。
4 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩を含有してなる、 当該タンパク質の 発現を促進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。 4 4. 請求項 4 1または 4 2記載のスクリーニング方法または請求項 4 3記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を 抑制する化合物またはその塩。
4 5 . 請求項 4 4記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
4 6 . 高血糖症または糖尿病の予防 ·治療剤である請求項 4 5記載の医薬。
4 7 . 請求項 4 1または 4 2記載のスクリーニング方法または請求項 4 3記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を 促進する化合物またはその塩。
4 8 . 請求項 4 7記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
4 9 . 低血糖症の予防 ·治療剤である請求項 4 8記載の医薬。
5 0 . 非ヒト哺乳動物に対して、 請求項 4 7記載の化合物またはその塩の有効量 を投与することを特徴とする低血糖症の予防 ·治療方法。
5 1 . 低血糖症の予防 ·治療剤を製造するための請求項 4 7記載の化合物または その塩の使用。
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