WO2002006837A1

WO2002006837A1 - Proteine a marquage de particules et immuno-chromatographe utilisant ce dernier

Info

Publication number: WO2002006837A1
Application number: PCT/JP2001/006113
Authority: WO
Inventors: Nobuyuki Shigetou; Hiroshi Nakayama
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority date: 2000-07-14
Filing date: 2001-07-13
Publication date: 2002-01-24
Also published as: US20040043510A1; EP1302770A4; EP1302770A1

Description

明細書微粒子標識タンパク質及びそれを用いた免疫クロマトグラフィー装置技術分野本発明は、免疫凝集反応や免疫クロマトグラフィ一等の免疫的検出の際に用いられる ί救粒子標識タンパク質およびそれを用いた免疫クロマトグラフィー装置に関する。背景技術従来、免疫的検出に用いられるタンパク質標識用の標識物としては、赤色の金コロイド粒子および青色に着色した着色ラテックス粒子などがある。これらを用いて作製した標識タンパク質は、主にラテックス凝集法および免疫クロマトダラフィ一などに用いられている。しかし、青色ラテックスは、肉眼での視認性が乏しく、赤色がパックグラウンドとなる血液アツセィでは、青色ラテックスは使用に適切ではないとされている。 . 免疫クロマトグラフィーは、抗原抗体反応の高い特異性および検出感度を利用し、測定されるべき物質と特異的に反応する物質（例えば、抗体）を検出手段の材料として用いる測定方法である。この方法は現在、体外診断薬の基盤技術として広く利用されている。なかでも、妊娠診断薬は典型的な免疫クロマトグラフィ一装置であり、その代表的な構造が、例えば米国特許第 5 , 6 0 2 , 0 4 0号に開示されている。この免疫クロマトグラフィー装置では、標識タンパク質として金コロイド標識抗体、測定試料として尿を用いて、測定対象である h C Gと金コロイド標識抗体との複合体を形成させ、その複合体に由来する赤色の着色像の有無を目視で判定する。 1 06113

上記従来の標識タンパク質は、波長 2 0 0〜8 0 0 nmの内、 4 0 0 nmから -8 0 0 n m、約 6 0 0〜 8 0 0 n m、特に 6 5 0〜8 0 0 n mに特定波長領域の光に対して吸収を持たない微粒子を標識物として用いていることから、有色試料での免疫的検出には、試料と異なる色を有する微粒子、すなわち異なる波長領域に吸収を持たない微粒子を用いる必要がある。したがって、試料の色に応じて異なる標識タンパク質を用意する必要があった。特に、例えば血液中に含まれる微量マーカなどの成分の免疫的検出では、赤色の金コロイド標識抗体を標識タンパク質として用いた場合、目視で着色を判定し難いため、高精度の測定が困難であるという問題点があった。また、青色ラテックスは、視認性が乏しく使用に適切ではない。本発明は、上記の問題点に鑑み、従来簡便かつ高精度の測定が困難であった試料についてそのような測定をすることができる微粒子およびその微粒子を用いて作製した微粒子標識タンパク質、ならびに免疫クロマトグラフィー方法および装置を提供することを目的とする。さらに、本発明は、試料の色に依らず、簡便か高精度に、免疫クロマトグラフィーなどの免疫的検出を用いて定性測定および定量測定をすることができる微粒子およびそれを用いて作製した微粒、子標識タンパク質、ならびにそれを用いた免疫ク口マトグラフィ一方法および装置を提供することを目的とする。発明の開示上記課題を解決するために、本発明は、クロマトグラフィ一において使用するための微粒子およびその微粒子を利用した微粒子標識夕ンパク質を提供する。この微粒子の表面に、タンパク質が結合または吸着して微粒子標識タンパク質で結合体化されて、タンパク質結合体が形成される。ここで、上記微粒子は、波長約 6 5 0〜約 8 0 0 n m、好ましくは約 4 0 0〜約 8 0 0 nm、より好ましくは約 2 0 0 nm〜約 8 0 0 n mの波長範囲において少なくとも部分的（例えば、その 1点、好ましくは例えば、少なくとも約 5 O n mの波長範囲）、より好ましくはそのすベての波長に測定可能な吸光度（例えば、濃度 10^1Q個/ ml以上、光路長 1 c mでの測定条件下で 0. 1以上）を有する。この微粒子は、通常、その粒径が 1 Onm以上 10 m以下であり得る。 1つの実施形態では、上記波長範囲において、少なくとも約 50nm、好ましくは 100 nm、より好ましくは 150 nmの範囲にわたって測定可能な吸光度を有し得る。この測定可能な吸光度を有する波長範囲は、力パーすべき全体の波長範囲が約 150 nmを超える場合（例えば、約 400 nm、約 600 nmなど）には、約 200 nm、約 250 nm、約 300 nm、約 350 nm、約 40 0 nm、約 450 nm、約 500 nm、約 550 nm、約 600 nmなどであり得る。別の実施形態では、上記波長範囲において、少なくとも異なる 2箇所（例えば、 3箇所、 4箇所など）にわたつて少なくともある範囲において、好ましくは約 5 Onm、より好ましくは、少なくとも約 100nm、より好ましくは、約 200 nm、約 250 nm、約 300 nm、約 350 nm、約 400 nmなどの範囲にわたる測定可能な吸光度を有し得る。より好ましい実施形態では、上記波長範囲におけるすべての波長について測定可能な吸光度を有し得る。

1つの実施形態では、上記測定可能な吸光度は、濃度 10^1Q個 Zml以上、光路長 1 cmでの測定条件下で、約 0. 1以上であり得る。好ましくは、この吸光度は、この条件下で約 0. 2以上であり得る。より好ましくは、この吸光度は、約 0. 3以上、約 0. 4以上、約 0. 5以上、約 0. 75以上、約 1. 0以上などであり得る。ある実施形態では、上記波長範囲は、約 600〜約 800 nmmであり得、より好ましくは、約 400〜約 800 nmであり得る。より好ましくは、この波長範囲は、約 200〜約 800 nmであり得る。この波長範囲の上限および下限は、測定対象、測定条件などによって任意に設定することができ、下限は、 200 η m未満でもあり得、上限は、 800 nmを超過し得る。例えば、下限としては、約 100 nm、約 1 10 nm、約 120 nm、約 130 nm、約 140 nm、約 150 nm、約 1 60 nm、約 170 nm、約 1 80 nm、約 190 nm、約 2 00 nm、約 210 nm、約 220 nm、約 230 nm、約 240 n.m、約 25 0 nm、約 260 nm、約 270 nm、約 280 nm、約 290 nm、約 300 nm、約 31 0 nm、約 320 nm, 約 330 nm, 約 340 nm, 約 350 n m、約 360 nm、約 370 nm、約 380 nm、約 390 nm、約 400 nm、約 410 nm、約 420 nm、約 430 nm, 約 440 nm、約 450 nm、約

460 nm, 約 470 nm、約 480 nm、約 490 nm、約 500 nm、約 5 10 nm、約 520 nm、約 530 nm、約 540 nm、約 550 nm、約 56 0 nm、約 570 nm、約 580 nm、約 590 nm、約 600 nm、約 61 0 nm、約 620 nm、約 630 nm、約 640 nm、約 650 nm、約 660 n m、約 670 nm、約 680 nm、約 690 nm、約 700 nm、約 710 nm、約 720 nm、約 730 nm、約 740 nm、約 750 nm、約 760 nm、約 770 nm、約 780 nm、約 790 nmなどが挙げられる。他方、上限としては、約 1 10 nm、約 120 nm、約 130 nm、約 140 nm、約 1 50 nm、約 1 60 nm、約 170 nm、約 180 nm、約 190 nm、約 200 nm、約 21 0 nm、約 220 nm、約 230 nm、約 240 nm、約 250 nm、約 2

60 nm、約 270 nm、約 280 nm、約 290 nm、約 300 nm、約 3 1 0 nm、約 320 nm、約 330 nm、約 340 nm、約 350 nm、約 360 nm、約 370 nm、約 380 nm、約 390 nm、約 400 nm, 約 410 n m、約 420 nm、約 430 nm、約 440 nm、約 450 nm、約 460 nm、約 470 nm、約 480 nm、約 490 nm、約 500 nm、約 5 1 0 nm、約

520 nm、約 530 nm、約 540 nm、約 550 nm、約 560 nm、約 5

70 nm、約 580 nm、約 590 nm、約 600 nm、約 610 nm、約 62 0 nm、約 630 nm、約 640 nm、約 650 nm、約 660 nm、約 670 nm、約 680 nm、約 690 nm、約 700 nm、約 71 0 nm, 約 720 n m、約 7 3 0 nm、約 7 4 0 n m、約 7 5 0 nm、約 7 6 0 nm、約 7 7 0 nm、約 7 8 0 nm、約 7 9 0 nm、約 8 0 0 nm、約 8 1 0 nm、約 8 2 0 nm、約 8 3 0 nm、約 8 4 0 nm、約 8 5 0 n m、約 8 6 0 nm、約 8 7 0 nm、約 8 8 0 nm、約 8 9 0 n m、約 9 0 0 nm、約 9 1 0 nm、約 9 2 0 nm、約 9 3 0 nm、約 9 4 0 nm、約 9 5 0 nm、約 9 6 0 nm、約 9 7 0 nm、約 9 8 0 nm、約 9 9 0 nmなどが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の微粒子は、黒色であり得る。別の実施形態において、上記微粒子は、グラフ.アイトまたはフェライトであり得る。本発明の微粒子は、クロマトグラフィーにおいて使用することができればどのような粒径でもよいが、通常、約 1 0 nm〜約 1 0 mであり得る。別の局面において、本発明は、本発明の微粒子がタンパク質に結合または吸着している、微粒子標識タンパク質を提供する。

1つの実施形態において、上記タンパク質は、前記微粒子の表面に結合または吸着してい得る。微粒子標識タンパク質の別の実施形態において、上記微粒子は、グラフアイトまたはフェライトであり得る。好ましい実施形態では、上記タンパク質は、ある標的と特異的に結合し得る夕ンパク質であり得る。より好ましくは、このタンパク質は、抗体である。抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクロ一ナル抗体であってもよい。

1つの実施形態において、上記微粒子標識タンパク質の濃度 1 0 ^{1 Q}個ノ m l 以上、光路長 1 c mでの測定条件下での測定可能な吸光度は、約 5 4 0 nmにおける反射吸光度に対する約 6 5 0 nmにおける反射吸光度の比が約 2 ： 1以下であり得る。

1つの実施形態では、上記微粒子標識タンパク質は、それに結合している微粒子と実質的に同様の吸光度を有し得る。

1つの実施形態において、上記比は約 2 ： 1〜約 1 ： 2であり得る。他の局面において、本発明は、試料中の標的物を検出するクロマトグラフィー方法を提供する。この方法は以下の工程：

a ) 上記標的物に特異的に反応するタンパク質を本発明の微粒子を結合または吸着させて、微粒子標識タンパク質を ^成する工程；および

b ) 上記微粒子標識タンパク質と、上記標的物とを接触させて、上記微粒子由来のシグナルを検出する工程、

を包含し得る。

1つの実施形態において、上記標的物は、抗原であり、上記タンパク質は、該抗原に対して特異的な抗体であり得る。別の実施形態において、上記検出する工程は、肉眼による検出であり得る。他の実施形態において、検出する工程は、分光光度測定による測定であり得る。他の局面において、本発明は、本発明の微粒子または微粒子標識タンパク質を利用したクロマトグラフィー装置を提供する。クロマトグラフィー装置は、抗原抗体反応に基づいて試料中の抗原を検出する。このクロマトグラフィー装置は、上記試料を導入する試料導入部、上記の微粒子標識タンパク質を含む標識部、および検出対象の抗原に結合する抗体が固定化された検出部を備える。ここで、好ましくは、上記試料導入部、上記標識部および上記検出部は、上記試料導入部に導入された上記試料の内少なくとも一部が上記標識部を経由して上記検出部に移動するようにけられている。ある実施形態において、本発明の、試料中の標的物を検出するクロマトグラフィ一装置は、以下：

a ) 試料を導入する導入部；

b) 本発明の微粒子標識タンパク質を含む標識部であって、前記タンパク質は、上記標的物について特異的である、標識部；および

c ) 上記標的物と、上記微粒子標識タンパク質との相互作用を検出する検出部、を備え得る。ある実施形態において、上記標的物は抗原であり、上記タンパク質は該抗原に対して特異的な抗体であり得る。この抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。別の実施形態において、上記試料導入部、上記標識部および上記検出部が上記試料導入部に導入された上記試料のうち、少なくとも一部が上記標識部を経由して上記検出部に移動するように配置されてい得る。図面の簡単な説明図 1は、本発明の実施例および比較例の微粒子標識タンパク質において用いた微粒子の吸収スぺクトルを示すグラフである。図 2は、本発明の実施例における免疫クロマトグラフィー装置を示す縦断面図である。図 3は、本発明の実施例における免疫ク口マトグラフィー装置を示す平面図である。

(符号の説明）上記図面において、以下の符号は、それぞれ、右に説明するものをさす。

1 試料導入部

2

3 検出部

4 吸液部

5 裏打ちシ一ト< 発明の詳細な説明本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、 [ a n」、「 t h e」など、独語の場合の「e i n」、「d e r」、「d a s」、「d i e」などおよびその変化形、他の言語における対応する冠詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。本発明は、クロマトグラフィーにおいて使用するための微粒子およびその微粒子を利用した微粒子標識タンパク質を提供する。この微粒子の表面に、タンパク質が結合または吸着して微粒子標識タンパク質で結合体化されて、タンパク質結合体が形成される。ここで、上記微粒子は、波長約 6 5 0〜約 8 0 0 nm、好ましくは約 4 0 0〜約 8 0 0 nm、より好ましくは約 2 0 0 nm〜約 8 0 0 nmの波長範囲において少なくとも部分的（例えば、その 1点、好ましくは例えば、少なくとも約 5 O nmの波長範囲）、より好ましくはそのすベての波長に測定可能な吸光度（例えば、濃度 1 0 ^{1 Q}個 Zm l以上、光路長 1 c mでの測定条件下で 0 . 1以上）を有する。この微粒子は、その粒径が、通常、 1 O nm以上 1 0 m以下であり得る。このような微粒子標識タンパク質は、波長 6 5 0 nm~ 8 0 0 nmにおいて吸収を有すること、好ましくは、黒色を呈することから、クロマトグラフィー手段、例えば、免疫クロマトグラフィーなどの特異的検出に用いることにより、従来検出が困難であった試料（例えば、波長 6 5 0 nm〜8 0 0 nmにおいて吸収を有しない試料）でも容易に検出することが可能になった。本発明の好ましい実施形態では、試料の色に依らず容易に着色を目視で検出することができることから、試料の色に応じて異なる標識タンパク質を調製する必要がなく、簡便かつ高精度に定性測定をすることができる。また、抗原抗体反応に基づく着色を、試料の吸収波長と異なる波長の光を用いた吸光度測定により計測することにより、簡便かつ高精度に定量測定をすることができる。用語「微粒子」とは、ある範囲の微小な大きさ（例えば、通常、粒径が 1 0 n m以上 1 O m以下）を有する、固体物質をいう。本発明の微粒子には、その表面にタンパク質が結合または吸着することができ、したがって、クロマトグラフィ一において使用され得る。本発明の微粒子は、波長約 6 5 0〜約 8 0 0 nm、好ましくは約 4 0 0〜約 8 0 0 nm、より好ましくは約 2 0 0 nm〜約 8 0 0 n mの波長範囲において少なくとも部分的（例えば、少なくともその 1点、好ましくは例えば、少なくとも約 5 0 nmの波長範囲）、より好ましくはそのすベての波長において、測定可能な吸光度（例えば、濃度 1 0 ^{ι α}個 Zm l以上、光路長 1 c mでの測定条件下で 0 . 1以上）を有する。例示的な本発明の微粒子としては、例えば、グラフアイト、フェライト、二酸化マンガン（M n〇₂) 、酸化クロム（C r ₂〇₃) 、硫化銅（C u S) 、硫化亜鉛（Z n S ) 、硫化銀（A g₂S ) が挙げられる。ここで、微粒子は、水中において安定なコロイド状態、または安定な懸濁分散状態を形成できることが好ましい。また、タンパク質との結合または吸着能力に優れる点から、グラフアイトまたはフェライトであることが好ましいがそれらに限定はされない。用語「タンパク質」とは、当該分野において、通常用いられる意味で使用され、 2以上の、好ましくは、 1 0個以上の、より好ましくは 5 0個以上のアミノ酸 (天然または非天然）がべプチド結合で重合したポリマーをいう。

タンパク質としては、特異的相互作用に基づく検出、好ましくは、免疫学的検出において、測定対象である物質（標的物）と特異的に反応する能力を有するものであればよく、従来公知の酵素および抗体を特に限定なく用いることができ、そのようなタンパク質を、当業者は容易に認識する。この中では、タンパク質が抗体であることが好ましい。用語「微粒子標識タンパク質」とは、本発明の微粒子が結合または付着した夕ンパク質をいう。この微粒子標識タンパク質は、そのもととなる微粒子と本質的に同一の吸収を有し得る。したがって、微粒子について上記に説明したような波長範囲において吸収を有する。ただし、結合したタンパク質に由来する吸収が追加されて観察され得る。本発明の微粒子標識タンパク質は、当該分野で公知の方法を用いて作製することができ、例えば、微粒子を含む懸濁液に、抗体を含有する緩衝液を添加し、放置することで作製することができる。試料中の標的物を検出するクロマトグラフィー方法は、当該分野で公知の方法に適用することができる。この方法は以下の工程：

a ) 上記標的物に特異的に反応するタンパク質を本発明の微粒子を結合または吸着させて、微粒子標識タンパク質を生成する工程；および

b ) 上記微粒子標識タンパク質と、上記標的物とを接触させて、上記微粒子由来のシグナルを検出する工程を包含し得る。ここで、本発明の微粒子標識タンパク質は、本発明の微粒子およびタンパク質を用い、本発明で公知の多くの方法のいずれかを用いて調製することができる。この調製は、装置を使用してもよく、手動で行ってもよい。この調製はまた、ク口マトグラフィー装置に組み込んでもよく、独立の装置で行ってもよい。装置は、自動化装置であり得る。上記標的物は、ある物質と何らかの特異性を有していれば、どのようなものでもよいが、好ましくは抗原であり得る。上記タンパク質は、この標的物に対して特異的であればよいが、好ましくは抗体であり得る。また、上記タンパク質は、本発明の微粒子と特異的であることが好ましい。上記検出する工程は、肉眼による検出または装置を用いた検出であり得る。装置を用いた測定には、分光光度測定、紫外線吸収測定、赤外線吸収測定、 X線測定、蛍光強度測定、比濁測定による測定であり得る。本発明によるクロマトグラフィー装置は、タンパク質の特異的相互作用、好ましくは抗原抗体反応に基づいて試料中の標的物、例えば抗原を検出する。このク口マトグラフィー装置は、上記試料を導入する試料導入部、タンパク質として例えば、抗体を用いた上記の微粒子標識タンパク質を含む標識部、および検出対象の、例えば、抗原に結合する抗体が固定化された検出部を備え得る。上記試料導入部、上記標識部および上記検出部は、上記試料導入部に導入された上記試料の内少なくとも一部が上記標識部を経由して上記検出部に移動するように設けられている。このようにすると、試料導入部に導入された試料が、標識部に到達すると、標識部に含まれている微粒子標識タンパク質が試料中の抗原と特異的に結合する。その後、この微粒子標識タンパク質は、試料とともに検出部に移動し、検出部で固定化された抗体と微粒子標識夕ンパク質とが抗原を介して結合し、検出部が本発明の微粒子が有する色、好ましくは黒色に着色される。従って、有色の試料を用いた場合でも、その試料とは異なる着色を目視で判定することができ、好ましくは、試料の色に依らず容易に着色を目視で判定することができる。このことによって、試料の色に応じて異なる標識タンパク質を調製する必要がなく、簡便かつ高精度に定性測定をすることができる。また、検出部での着色を、試料の吸収波長と異なる波長の光を用いた吸光度測定により計測することにより、簡便かつ高精度に定量測定をすることができる。試料としては、どのような試料でもよく、特に限定されないが、血液、尿、唾液、便などの生物学的試料を試料とした場合に特に効果を発揮する。上記試料導入部、標識部および検出部は、従来公知の材料である、ガラス濾紙または二卜ロセルロースなどの多孔質担体を適宜用いて作製することができる。上記標識部および検出部は、従来公知の方法により作製することができ、例えば、標識部は、微粒子標識タンパク質を多孔質担体に含浸させた後、凍結乾燥することにより作製することができる。検出部は、多孔質担体上に抗体の水溶液を任意の形状に滴下した後乾燥し、洗浄することにより作製することができる。実施例以下、本発明の実施例を図 1 ~ 3を用いて説明するが、以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明を限定する意図は全くないことが理解されるべきである。図 1は、本発明の実施例および比較例の微粒子標識夕ンパク質に用いた本発明の微粒子の吸収スペクトルを示すグラフである。図 2は、本発明の免疫クロマトグラフィ一装置を示す縦断面図であり、そして図 3は、本発明の免疫クロマトグラフィー装置を示す平面図である。なお、本実施例においては、タンパク質として抗 C反応性タンパク質（以下、 C R Pと略称する）モノクローナル抗体、微粒子標識タンパク質を用いた検出方法として免疫クロマトグラフィー、そして検出対象物として C R Pを用いた。

(実施例 1 )

実施例 1では、微粒子として直径約 1 5 n mのフェライトを用いた。このフエライト粒子を用いて、濃度 3 . 7 9 2 X 1 0 ¹²偭 1の懸濁液を作製し、 0 . 2 M炭酸ナトリゥム水溶液を用いて p H = 9に調整した。この懸濁液 5 m 1をゆつくり撹拌しながら、抗 CRPモノクローナル抗体 30 O^gを添加した。そのまま室温で 5分間撹拌した後、約 40, 000 Gで遠心分離した。上清を除いた後、約 5mlのリン酸緩衝液（pH=7. 5、以下 PBSと略す）を加えて再分散した。得られた懸濁液を約 8， 000 Gで遠心分離した後、上清を除去してフェライト標識抗 CRPモノクローナル抗体を得た。

(実施例 2)

実施例 2では、 ί救粒子として直径約 80 nmのグラフアイトを用いた。このグラフアイト粒子を用いて、濃度 1X10¹¹個 Zmlの懸濁液を作製し、 0. 2M 炭酸ナトリウム水溶液を用いて pH= 9に調整した。この懸濁液 5mlをゆつくり撹拌しながら、抗 CRPモノクローナル抗体 300 を添加した。そのまま室温で 5分間撹拌した後、約 8， 000 Gで遠心分離した。上清を除いた後、約 5mlの純水を加えて再分散した。得られた懸濁液を約 8, 000 Gで遠心分離した後、上清を除去してグラフアイト標識抗 CRPモノクローナル抗体を得た。

(比較例 1 )

比較例 1として、粒径約 20 nmの金コロイドを微粒子として用いた標識抗体を作製した。この金コロイドを用いて、濃度 10¹²個 m 1のコロイド液を作製し、 0. 2 M炭酸ナトリウム水溶液を用いて pH= 9に調整した。このコロイド液をゆっくり攪拌しながら、抗 CRPモノクローナル抗体 330 gを添加した。そのまま室温で 5分間撹拌した後、 10%牛血清アルブミン（以下、 BSAと略称する）水溶液を 5. 5ml添加してさらに 2分間攪拌した。得られた反応液を 4°Cに保ち約 40, 000 Gで 1時間遠心分離した後、上清を除いた。 0. 1M Tr i s · 1%BSA溶液（pH=8. 2) を加えて再分散した後、 4°Cに保ち約 8, 000 Gで 1時間遠心分離した。上清を除去して金コロイド標識抗 CRP モノクローナル抗体を得た。

(微粒子の吸収スぺクトルの測定）

実施例 1、実施例 2および比較例 1で用いた微粒子の吸収スぺクトルを測定した。測定には、日立製作所製 UV PC— 1600スぺクトルメータを用いた。図 1力 ^ら、実施例 1で用いたフェライト微粒子および実施例 2で用いたグラフアイト微粒子は、波長 200 nm〜800 nmの全ての波長の光に対して吸収を有するが、金コロイド微粒子は、約 650 nm〜800 nmの波長の光に対しては吸収を有さないことがわかる。

(免疫クロマトグラフィー装置の作製およびそれを用いた抗原の測定）実施例 1のフェライト標識抗 CRPモノクローナル抗体、実施例 2のグラファィト標識抗 CRPモノクローナル抗体、および比較例 1の金コロイド標識抗 CR Pモノクローナル抗体をそれぞれ異なるガラス濾紙に含浸させ、凍結乾燥した。この凍結乾燥したガラス濾紙を標識部として、図 2および図 3に示した構造の免疫クロマトグラフィ一装置を作製した。両面テープを全面に貼つた硬質ポリ塩化ビニル製の裏打ちシート 5 (0. 9 cmX 5. 5 cm) の表面に、ガラス繊維濾紙からなる吸液部 4 (0. 9 cmX2 cm) 、吸液部 4の上流側に、抗 CRPモノク口一ナル抗体を固定化した二トロセルロースメンブレンからなる検出部 3 (0. 9 cmx 2 cm) 、検出部 3の上流側に、実施例実施例 2または比較例 1の標識抗 CRPモノクローナル抗体を含浸させた標識部 2 (0. 9 cmX 1 cm) 、標識部 2の上流側にガラス繊維濾紙からなる試料導入部 1 (0. 9 cm X2. 5cm) を順次接着させ、試料導入部 1の一部を除いて、透明のセロハンテープ（図示せず）で覆った。こうして得た免疫クロマトグラフィー装置を中空のケース（図示せず）に組み込み、測定に使用した。作製した免疫クロマトグラフィー装置の試料導入部に、 0. lmg/d lの C RPを含有する水を試料として添加し、 10分後の検出部における着色度を、 5 40 nmおよび 650 nmでの反射吸光度で測定した。その結果を（表 1 ) に示す。【表 1】

(表 1 ) からわかるように、いずれの場合も、 5 4 0 nmでの反射吸光度に比ベて 6 5 O nmでの反射吸光度の値の方が減少しているが、その減少率は、実施例 1および実施例 2の微粒子標識タンパク質を用いた免疫クロマトグラフィー装置の方が、比較例 1の微粒子標識タンパク質を用いた免疫クロマトグラフィ一装置よりも小さくなつている。例えば、赤色の血液試料は、 5 0 0 ~ 6 0 0 nm付近に大きな吸収を有するが、 6 0 0 nm以上、特に 6 5 0 nm以上の波長領域にはほとんど吸収を持たず、特に、濃度 1 0 ^{1 Q}個 Zm 1以上、光路長 1 c mでの測定条件下では、 0 . 1以上の吸収は有しない。従って、試料が血液である場合には、比較例 1の微粒子標識タンパク質を用いた免疫クロマトグラフィー装置では、検出部での着色が赤色であるので目視による定性測定が困難であり、また、図 1および表 1からわかるように、約 6 0 0 nm以上では急激に吸光度が減少しているので、特定波長の光を用いた吸光度測定による定量測定も困難である。それに対して、実施例 1または実施例 2の微粒子標識タンパク質を用いた免疫クロマトグラフィー装置は、検出部での着色が黒色であるので目視による定性測定が容易であり、また、図 1および表 1からわかるように、 6 0 0 nm以上でも吸光度を有するので、 6 0 0 nm 以上の特定波長の光を用いた吸光度測定により定量測定を行うことができる。なお、実施例では、微粒子として粒径約 1 5 nmのフェライト微粒子および粒径約 8 0 n mのグラフアイト微粒子を用いたが、これに限定されず、 1 0 nm' 1 0 mの範囲の粒径を有するものであれば同様の効果を得ることができる。

産業上の利用可能性以上のように本発明によれば、試料の色に依らず、容易に免疫反応に基づく着色を検出することができる。従って、本発明の微粒子標識タンパク質を用いれば、簡便かつ高精度に、免疫クロマトグラフィー等の免疫的検出を用いた定性および定量測定を行うことができる。また、本発明の免疫クロマトグラフィー装置を用いれば、簡便かつ高精度に、免疫クロマトグラフィーによる定性および定量測定を行うことができる。

Claims

請求の範囲

1 . クロマトグラフィーにおいて使用するための微粒子であって、該微粒子は、波長約 6 5 0〜約 8 0 0 nmの波長範囲において少なくとも部分的に測定可能な吸光度を有する、微粒子。

2 . 前記波長範囲において、少なくとも約 5 0 nmの範囲にわたって測定可能な吸光度を有する、請求項 1に記載の微粒子。

3 . 前記波長範囲において、少なくとも異なる 2箇所にわたって少なくとも約 5 0 nmの範囲にわたる測定可能な吸光度を有する、請求項 1に記載の微粒子。

4. '前記波長範囲におけるすべての波長について測定可能な吸光度を有する、請求項 1に記載の微粒子。

5 . 前記測定可能な吸光度が濃度 1 0 ^{1 Q}個 Zm 1以上、光路長 1 c mでの測定条件下で、約 0 . 1以上である、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の微粒子。

6 . 前記測定可能な吸光度が前記条件下で約 0 . 2以上である、請求項 5に記載の微粒子。

7. 前記波長範囲が約 4 0 0〜約 8 0 0 n mである、請求項 1〜6のいずれか 1 項に記載の微粒子。

8. 前記波長範囲が約 2 0 0〜約 8 0 0 nmである、請求項 1〜 6のいずれか 1 項に記載の微粒子。

9 . 黒色である、請求項 1に記載の微粒子。

10. 粒径が約 10 nm〜約 10 imである、請求項 1〜 9のいずれカ 1項に記載の微粒子。

11. 請求項;！〜 10のいずれか 1項に記載の微粒子がタンパク質に結合または吸着している、微粒子標識タンパク質。

12. 前記タンパク質が前記微粒子の表面に結合または吸着している、請求項 1 1に記載の微粒子標識夕ンパク質。

13. 前記微粒子がグラフアイ卜またはフェライトである、請求項 11または 1 2に記載の微粒子標識タンパク質。

14. 前記タンパク質が抗体である、請求項 11〜13のいずれ力 M項に記載の微粒子標識タンパク質。

15. 前記微粒子標識タンパク質の濃度 10^1Q個/ ml以上、光路長 1 cmでの測定条件下での測定可能な吸光度が、約 540 nmにおける反射吸光度に対する約 650 nmにおける反射吸光度の比が約 2 ： 1以下である、請求項 11〜1 4のいずれか 1項に記載の微粒子標識タンパク質。

16. 前記比が約 2： 1〜約 1 ： 2である、請求項 15に記載の微粒子標識タンパク質。

17. 試料中の標的物を検出するクロマトグラフィー方法であって、該方法は以下の工程：

a) 該標的物に特異的に反応するタンパク質を請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の微粒子を結合または吸着させて、微粒子標識タンパク質を生成するェ程；および

b) 該微粒子標識タンパク質と、該標的物とを接触させて、該微粒子由来のシグナルを検出する工程、

を包含する、方法。

18. 前記標的物が抗原であり、前記タンパク質が該抗原に対して特異的な抗体である、請求項 17に記載の方法。

19. 前記検出する工程が、肉眼による検出である、請求項 17または 18に記載の方法。

20. 試料中の標的物を検出するクロマトグラフィー装置であって、以下： a) 試料を導入する導入部；

b) 請求項 1 1〜16のいずれか 1項に記載の微粒子標識タンパク質を含む標識部であって、前記タンパク質は、該標的物について特異的である、標識部；および

c) 該標的物と、該微粒子標識タンパク質との相互作用を検出する検出部、を備える、クロマトグラフィー装置。

21. 前記標的物が抗原であり、前記タンパク質が該抗原に対して特異的な抗体である、請求項 20に記載のクロマトグラフィー装置。

22. 前記試料導入部、前記標識部および前記検出部が該試料導入部に導入された前記試料のうち、少なくとも一部が該標識部を経由して該検出部に移動するように配置されている、請求項 20または 21に記載のクロマトグラフィー装置。