WO2002004002A2 - Verwendung von stämmen des parapoxvirus ovis zur herstellung von antiviralen arzneimitteln und arzneimitteln gegen krebs - Google Patents

Verwendung von stämmen des parapoxvirus ovis zur herstellung von antiviralen arzneimitteln und arzneimitteln gegen krebs Download PDF

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    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24211—Parapoxvirus, e.g. Orf virus
    • C12N2710/24232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • the present invention relates to the use of strains of the Parapoxvirus ovis as an immunotherapeutic in immunodeficiency of infectious or non-infectious
  • the present invention further relates to the use of strains of the Parapoxvirus ovis and medicinal forms produced therefrom as immunotherapeutic agents or immunoprophylactic agents, in stress metaphylaxis for the prevention or prevention of infectious diseases after stress (for example operations); the use in infection prophylaxis to prevent or prevent infectious diseases by administering before surgery or surgery (eg before implantation of prostheses or before dental surgery), the use in infection prevention or therapy of acute or chronic viral infections, for example of the respiratory tract, papillomavirus infections , infection with He ⁇ esviren, HIV infection, virus infection of internal organs such as infection with hepatitis viruses, the use in wound healing to accelerate wound healing processes and the use to support the healing of poorly or non-healing wounds (eg ulcus cruris), the Use in diseases such as multiple sclerosis / asthma, warts and other forms of new skin, use in diseases of the allergic type, use to prevent the outbreak of systemic allergies and use in topical all rgien and the use to improve well-
  • Descendants of these strains or parts or fragments of viruses of these strains or these descendants obtained by passage and / or adaptation to specific cells, for example WI-38, MRC-5 or Vero cells, can also be used.
  • Parts are to be understood as meaning genomic or subgenomic fragments expressed by means of suitable vectors, for example vaccinia, in suitable systems, for example fibroblast cell cultures. Fragments are understood to mean the fractions obtained by biochemical purification, for example by chromatography, physically, for example by exposure to ultrasound, of disrupted particles.
  • the present invention further relates to the use of said strains of parapoxvirus ovis for the production of medicaments and pharmaceutical preparations. Furthermore, the invention relates to the use of said strains of parapoxvirus ovis in combination with other agents for the production of medicaments and pharmaceutical preparations for antiviral or cancer therapy.
  • latent and chronically persistent viral infections can be activated or reactivated by immunosuppression, or vice versa, that the immune system suppresses (eg recurs) the acute disease that can be caused by a virus that is latent a latent He ⁇ esvirus infection with immunosuppression: lip sores with stress or cortisone). It is also known that chronic persistent and latent viral infections are difficult or impossible to treat with conventional antiviral substances on a low molecular weight basis.
  • viral enzymatic activity in such infections for example the lack of viral polymerase activity which must first incorporate a nucleoside inhibitor into the viral nucleic acid so that it can lead to chain termination in the viral DNA, for example; the lack of a viral thymidine kinase activity, which, for example, must first phosphorylate an antiviral compound so that it can become active
  • the lack of recognition infection of infected or degenerate cells for example cancer cells or viral antigens, by the host's immune system.
  • Paramunity inducers consist, for example, of chemically inactivated parapoxvirus ovis, Strain D 1701 (DE 3 504 940) this virus (Parapoxvirus ovis, Strain D 1701) is a product manufactured
  • the inactivated parapoxvirus induces non-specific protection against infections with a wide variety of pathogens in animals. It is believed that this protection is conveyed through various mechanisms of the organism's own defense system.
  • the task therefore arises to further improve the therapeutic usability of the excellent action of parapoxvirus ovis in such a way that the generalized so-called induction of a paraspecific immune response of the parapoxvirus ovis, strain D 1701 described above is qualitatively increased and improved by use lower doses better antiviral or anti-tumor effects can be achieved. This would also lead to the expectation of a therapeutic effect with fewer side effects.
  • the object of the invention was therefore to improve the immunological effect of the parapoxvirus.
  • the object is achieved by using the above-mentioned strains of parapoxvirus ovis instead of the conventionally used strain D 1701.
  • the present invention relates to the use of viruses which belong taxonomically to one of the strains NZ2, NZ-7, NZ-10 or orf-11 of Parapoxvirus ovis, for the production of medicaments for viral infections and cancer in humans and animals.
  • the invention relates to the use of by passage or adaptation to suitable cell systems such as, for example, human cells such as WI-38, MRC-5, monkey cells, e.g. Vero cells, bovine cells such as e.g. BK-K13A47 / Reg or MDBK, and ovine cells such as MDOK
  • suitable cell systems such as, for example, human cells such as WI-38, MRC-5, monkey cells, e.g. Vero cells, bovine cells such as e.g. BK-K13A47 / Reg or MDBK, and ovine cells such as MDOK
  • a preferred object of the invention is the use of one of the
  • parapoxvirus ovis NZ-2 mentioned here as an example was deposited on July 10, 2001 with the European Collection of Cell Cultures, Center for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdom.
  • accession number is
  • the concentration of the viruses was carried out as follows: 500 ml of supernatant from parapoxvirus ovis, strain NZ 2 (titer approx. 2x10 5 TCID 50 / ml) and parapoxvirus ovis, strain D 1701 (titer lxlO 7 TCID 50 / ml) were added to the same Virus titer set. A Beckmann ultracentrifuge (rotor SW28 at 28000 RPM 3 hours 4 ° C) was used for this. After centrifugation, the pellet with corresponding volumes dilution medium to a titer of lxl 0 7 TCID 50 were / ml adjusted.
  • RNAse A Qiagen, Hilden
  • the CDP-Star® system (Boehringer Mannheim) was used for immunological detection in accordance with the manufacturer's instructions.
  • a Lumilmager® (Boehringer Mannheim) was used for the evaluation. The quantification
  • HBV-specific DNA in the blood was carried out by means of quantitative PCR. First the plasma was obtained by centrifugation of the EDTA blood. The DNA was purified using the HighPure 16 System Viral Nucleic Acid Kit (Boehringer Mannheim) and examined for HB V-specific signals by quantitative PCR with the ABI PRISM TM 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems).
  • ayw-570f (sense) 5 '- CTGTACCAAACCTTCGGACGG - 3' ayw-670r (antisense) 5 '- AGGAGAAACGGGCTGAGGC - 3 probe: ayw-613t 5 - CCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATT - 3 ⁇
  • the DNA was amplified in 50 ul reaction volume (the reaction contained
  • a histochemical analysis was carried out using antibodies against the hepatitis B virus core antigen (Dako). For this, parts of a liver lobe were fixed in 4% formaldehyde overnight, embedded in paraffin and cut (5 ⁇ m). After dewaxing and rehydration, the endogenous peroxidase activity was reduced to 3%
  • the immune response was visualized with 3.3 diaminobenzidine tetrachloride and hydrogen peroxide.
  • the sections were counterstained hematoxylin / eosin.
  • Parapoxvirus ovis induce the complex capacity of the immune system to a strength that differs significantly from the potency of the previously known paramunity inducers.
  • FIG 1 shows results of the treatment of HBV transgenic mice with strain
  • HBV-specific DNA is significantly reduced in the liver in all dose groups in both strains compared to the placebo group, but more by Strain NZ 2. At the two lowest NZ 2 doses there is a significantly greater reduction in HBV-specific DNA than with the equivalent D 1701 dose groups.
  • Figure 2 shows the result of the treatment of HBV transgenic mice with Strain D 1701 or NZ 2 in plasma. HBV-specific DNA is significantly reduced in plasma in all dose groups in both strains compared to the placebo group, but more by Strain NZ 2. In contrast to the lowest NZ 2 dose, the lowest dose of Strain D 1701 is no longer significantly antiviral.
  • mice 7-8 weeks old Female Balb / c mice 7-8 weeks old were kept under sterile conditions and used for the experiment. The animals were randomized and grouped divided with 6 animals each. The following treatment regimen was used:
  • Group 2 Parapoxvirus ovis strain D 1701; 5xl0 4 TCID 50 / dose
  • Group 3 Parapoxvirus ovis strain NZ 2; 5x10 4 TCID 50 / dose
  • Group 5 Parapoxvirus ovis strain D 1701; 5x10 4 TCID 50 / dose
  • Group 6 Parapoxvirus ovis strain NZ 2; 5x10 4 TCID 50 / dose
  • the application volume was 10 ml / kg, the application was intraperitoneal.
  • peritoneal cells were concentrated using a centrifugation step (5 min at 3000 ⁇ m at room temperature in an Eppendorf table centrifuge), then in 0.2 ml lysis buffer (lysis solution: 25 mM sodium citrate, 4 M guanidium isothioeyanate, 0. 5% N-lauroyl sarcosine), shock-frozen and stored at -75 ° C until the RNA preparation.
  • lysis buffer 25 mM sodium citrate, 4 M guanidium isothioeyanate, 0. 5% N-lauroyl sarcosine
  • the total RNA was prepared by means of acidic phenol / chloroform extraction.
  • the samples frozen in lysis buffer were thawed at room temperature and the following solutions were added for extraction: 1/10 lysis buffer volume 2 m sodium acetate (pH 4.0), 1 lysis buffer volume water-saturated phenol, 1/5 lysis buffer volume chloroform / isoamyl alcohol (24: 1).
  • This mixture was mixed on the vortexer for 10 seconds and then tempered on ice for 10 minutes. The phases are separated by centrifugation at 15365 g and 4 ° C for
  • RNA-MATRIX from the Rnaid TM plus kit (DIANOVA) added and incubated for 15 minutes at room temperature.
  • the resulting RNA / RNA-MATRIX complex was pelleted by centrifugation at 7000 g and the supernatant was discarded.
  • the pellet was then washed twice with 250 ml of RNA-WASH (DIANOVA) and dried after the last washing by vacuum centrifugation.
  • the RNA was eluted by adding 20-30 ml of RNAse-free distilled water by tempering at 55 ° C for 15 minutes. After centrifugation at 7000 g and room temperature for 1 minute, the matrix was separated by transferring the RNA solution into a new tube.
  • the quality of the RNA was checked by gel electrophoresis.
  • the RNA was stored at -70 ° C.
  • the cDNA was synthesized by reverse transcription of the mRNA using oligo (dT) primers as starter molecules for the polymerization. in the
  • the following components were present in the synthesis approach: 200 ng-2 ⁇ g total RNA, 2 ⁇ l reverse transcriptase M-MLV (200 U / ⁇ l) (GIBCO / BRL), 8 ⁇ l of the associated 5xRT buffer (GIBCO / BRL), 1 ⁇ l DTT (0.1M) (GIBCO / BRL), 4 ⁇ l dNTP (2.5 mM) (SIGMA), 2 ⁇ l oligo (dT) 12-18 primer (100 ⁇ g / ml) (PROMEGA), 1 ⁇ l human pla zental RNAse Inhibitor (10000 U / ml) (GIBCO / BRL) and water ad 40 ⁇ l total volume.
  • the mixture was tempered for 10 minutes at room temperature and then incubated at 37 ° C. for 45 minutes, subsequently heated to 95 ° C. for 3 minutes and immediately cooled on ice.
  • the cDNA synthesized in this way was stored at -20 ° C.
  • the amounts of the cDNAs were standardized using a "housekeeping" gene ( ⁇ -actin).
  • the quantitative PCR was carried out using the ABI PRISM TM 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems). The following primers were used:
  • ß-Actin sense 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3 ' antisense: 5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3 '
  • IFN- ⁇ sense 5'-AGCGGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG-3 'antisense: 5 * -GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG-3'
  • TNF- ⁇ sense 5'-GGC AGG TCT ACT TTG GAG TCA TTG C-3 'antisense: 5'-ACA TTC GAG GCT CCA GTG AAT TCG G-3'
  • IL-15 sense 5'-GCC AAC TGG ATA GAT GTA AGA TAT GAC CT-3 'antisense: 5'-CGT GTT GAT GAA CAT TTG GAC AAT GCG TAT-3'
  • the DNA was amplified in 25 ul reaction volume (the reaction contained 1.4 mM of each dNTP, 4 mM MgCl 2 , 0.3 ⁇ mol of each primer and that
  • Probe 2.5 ⁇ l 10-fold PCR buffer with SYBR Green [all PCR reagents came from the SYBR Green PCR core reagent kit; Perkin Elmer / Roche Molecular Systems Inc.] and 1.25 U Taq DNA polymerase and 0.25 U Amp Erase. After an initial denaturation step (95 ° C for 10 min), the samples were exposed to 40 cycles of denaturation (95 ° C for 30 s) and annealing / extension (60 ° C, 1.30 min).
  • the products were analyzed using the ABI PRISM TM 7700 Sequence Detection System Standard Software. The statistical analysis of the results was carried out with the analysis of variance and post hoc comparison.
  • interferon ⁇ is induced after treatment with Strain D 1701 or Strain NZ 2 6 and 12 hours after the application ( Figure 3). In Strain NZ 2, this induction is both significantly higher compared to placebo and to Strain D 1701. The level of interferon ⁇ expression observed after administration of D 1701 is not significant compared to placebo control. The values shown are those measured in cells obtained by peritoneal lavage.
  • IL-15 is induced after treatment with Strain D 1701 or with Strain NZ 2 6 and 12 hours after the application ( Figure 5). This induction is 6 hours after application with Strain NZ 2 significantly higher than with Strain D 1701 or placebo. The level of IL-15 expression observed after administration of D 1701 is not significant compared to the placebo control. The values shown are those measured in cells obtained by peritoneal lavage.
  • MDA-MB231 cells (ATCC # HTB26) were placed in complete medium (DMEM 88 5, FBS 10%, penicillin / streptomycin 1%, L-glutamine 1% while Gibco Life Technologies)) at 37 ° C and 5% CO 2 in an incubator cultured. On the day of the
  • the cells were approximately 70% confluent. The cells were trypsinized, washed with HBSS, counted and adjusted to 2.5x10 7 cells / ml with precooled PBS.
  • Female NCr nude mice (taconic) were used. The mice were between 8 and 10 weeks old and weighed approximately 22 g. All manipulations on the animals were carried out under sterile conditions.
  • mice 5x10 6 cells in a total volume of 0.2 ml were injected subcutaneously into the flank region. The mice were then kept for a further seven days until the tumors reached an average mass of approximately 80 mg. The tumors were measured and the mice were randomly divided into three groups of ten animals each. The individual groups were administered as follows: Group 1 placebo (PBS) Group 2 parapoxvirus ovis, strain Dl 701 Group 3 parapoxvirus ovis, strain NZ2
  • D1701 was at a dose of 2.5xl0 5 TCID 50 , NZ2 at a dose of lxlO 5
  • TCID J0 administered a total of four times three days apart. The tumors were measured twice a week. Significance was determined using Student's test.
  • Figure 6 shows the mean size of the tumors (in milligrams) in animals of the groups
  • NK natural clientele
  • Cytokines / chemokines conditional. With a complete and intact immune system, it would be assumed that the better effectiveness of NZ2 becomes even clearer.
  • Adaptation to human cell lines is an important prerequisite for the production of viral strains on human cell lines.
  • MRC-5 is suitable for the production of biological agents and vaccines.
  • the strains were used with the same starting titer and the corresponding cell culture supernatants continued over 5 passages in MRC-5 cells.
  • the titration of samples from the supernatants of the respectively infected MRC5 cells in TCID 50 is shown via the passenger number.
  • FIG. 8 shows the virus titer in passenger experiments of DI 701 on bovine BK clone 3 a cells and on human WI-38 cells via the Number of passages. It can be seen that Dl 701 is still passable on BK clone 3a cells, but not on human WI-38 cells.
  • mice Challenge tests have been performed on mice. Three groups of 10 test animals each were treated with lxlO 4 TCID 50 , 5xl0 4 TCID 50 and lxlO 5 TCID 50 , a control group received a placebo. The survival rate of the four test groups is shown in FIG. 10 over time after He ⁇ es virus infection. It was surprisingly found that NZ2 did not lose its immunostimulatory properties due to the passage on WI-38 cells.
  • the therapeutic agent based on Parapoxvirus is applied systemically, for example intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally, intravenously, per os, or locally.
  • the parapoxvirus is either purified and lyophilized and / or is suspended in a suitable solvent immediately before application or is in another suitable formulation or is in an enteric or other oral form of application.
  • Suitable preparations can also be derived from offspring of NZ2 and the other strains or parts or fragments of NZ2 and the other strains or obtained by passage and / or adaptation to certain cells, for example WI-38, MRC-5 or Vero cells these descendants are made.
  • vaccinia parts are to be understood as meaning expressed genomic or subgenomic fragments in suitable systems, for example fibroblast cell cultures. Fragments are understood to mean the fractions obtained by biochemical purification, for example chromatography, physically, for example by exposure to ultrasound, of disrupted particles.
  • Intramuscular application of 10 6 to 10 7 TCID 50 Tissue Culture Infective Dosage for 4 weeks on every 3rd day followed by a 2 week break; repeated intramuscular application of 10 6 to 10 7 TCID 50 for 4 weeks on every 3rd
  • TCID 50 of the formulation are applied subcutaneously in the abdominal area or intramuscularly in the area of the deltoid or quadriceps every 3rd day, a total of 5 times. Deviations from this scheme can be made according to the needs arising from the disease. The prophylaxis of colds is gargle and repeat this application daily as long as there is a risk of infection.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Stämmen des Parapoxvirus ovis als Immuntherapeutikum bei Immunschwächen infektiöser oder nicht infektiöser Natur, sowie die Verwendung von Stämmen des Parapoxvirus ovis zur Behandlung von Tumorerkrankungen, viralen Infektionen und damit einhergehenden Erkrankungen, sowie die Verwendung von Stämmen des Parapoxvirus ovis für die Herstellung von Arzneimitteln zur Anwendung bei Mensch und Tier.

Description

Verwendung von Stämmen des Parapoxyirus ovis zur Herstellung von anti- viralen Arzneimitteln und Arzneimitteln gegen Krebs
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Stämmen des Parapoxvirus ovis als Immuntherapeutikum bei Immunschwächen infektiöser oder nicht infektiöser
Natur, sowie die Verwendung von Stämmen des Parapoxvirus ovis zur Behandlung von Tumorerkrankungen, viralen Infektionen und damit einhergehenden Erkrankungen, sowie die Verwendung von Stämmen des Parapoxvirus ovis für die Herstellung von Arzneimitteln zur Anwendung bei Mensch und Tier.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung von Stämmen des Parapoxvirus ovis und daraus hergestellter Arzneiformen als Immuntherapeutika oder Immunprophylaktika, bei der Stressmetaphylaxe zur Verhinderung oder Vorbeugung von Infektionskrankheiten nach Stress (z.B. Operationen); die Verwendung bei der Infektionsprophylaxe zur Verhinderung oder Vorbeugung von Infektionskrankheiten durch die Gabe vor Operationen oder Eingriffen (z.B. vor Implantation von Prothesen oder vor zahnärztlichen Eingriffen), die Verwendung bei der Infektionsmeta- phylaxe oder Therapie akuter oder chronischer viraler Infektionen beispielsweise des Respirationstraktes, der Papillomvirusinfektionen, der Infektion mit Heφesviren, der HIV - Infektion, der Virusinfektion innerer Organe wie beispielsweise der Infektion mit Hepatitisviren, die Verwendung bei der Wundheilung zur Beschleunigung von Wundheilungsprozessen und die Verwendung zur Unterstützung der Heilung schlecht oder nicht heilender Wunden (z.B. Ulcus cruris), die Verwendung bei Erkrankungen wie Multipler Sklerose/Asthma, Warzen und anderer Neubildungen der Haut, die Verwendung bei Erkrankungen des allergischen Formenkreises, die Verwendung zur Verhinderung des Ausbruchs systemischer Allergien sowie die Verwendung bei topischen Allergien und die Verwendung zur Verbesserung des Wohlbefindens, z.B. im Alter, wobei im Rahmen der Erfindung als Stämme von Parapoxvirus ovis die Stämme NZ2, NZ-7, NZ-10 und orf-11 verwendet werden. Verwendet werden können weiter durch Passagierung und/oder Adaptation an bestimmte Zellen, beispielsweise WI-38, MRC-5 oder Vero-Zellen erhaltene Abkömmlinge dieser Stämme bzw. Teile oder Bruchstücke von Viren dieser Stämme oder diesen Abkömmlingen. Unter Teilen sind mittels geeigneter Vektoren, beispielsweise Vaccinia, in geeigneten Systemen beispielsweise Fibroblastenzell- kulturen exprimierte genomische oder subgenomische Fragmente zu verstehen. Unter Bruchstücken versteht man die durch biochemische Aufreinigung, beispielsweise durch Chromatografie, erhaltenen Fraktionen physikalisch, beispielsweise durch Einwirkung von Ultraschall, aufgeschlossener Partikel.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung besagter Stämme von Parapoxvirus ovis zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung besagter Stämme von Parapoxvirus ovis in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arz- neimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen zur antiviralen- oder Krebstherapie.
Es ist bekannt, dass latente und chronisch persistente virale Infektionen durch eine Immunsuppression aktiviert bzw. reaktiviert werden können, oder umgekehrt, dass das Immunsystem die akute Erkrankung, die durch ein Virus, das latent ist, hervor- gerufen werden kann, unterdrückt (z.B. rekurriert eine latente Heφesvirus-Infektion bei Immunsuppression: Lippenbläschen bei Stress oder Kortisongabe). Es ist weiter bekannt, dass chronisch persistente und latente virale Infektionen schwer oder gar nicht mit herkömmlichen antiviralen Substanzen auf niedermolekularer Basis thera- pierbar sind.
Ein Grund dafür kann die fehlende virale enzymatische Aktivität bei solchen Infektionen sein (beispielsweise das Fehlen einer viralen Polymerase-Aktivität, die einen nukleosidischen Inhibitor erst in die virale Nukleinsäure einbauen muss, damit dieser z.B. zum Kettenabbruch in der viralen DNA führen kann; beispielsweise das Fehlen einer viralen Thymidinkinase- Aktivität, die z.B. eine antivirale Verbindung erst phosphorylieren muss, damit diese aktiv werden kann) oder aber die fehlende Erken- nung infizierter oder entarteter Zellen, z.B. Krebszellen oder viraler Antigene durch das Immunsystem des Wirtes.
Bekannt ist ebenfalls, dass bei chronisch persistierenden viralen Infektionen eine Superinfektion mit einem anderen Virus zu antiviralen, gegen das chronisch persis- tierende Virus gerichteten Effekten führen kann.1} Die Abhängigkeit dieses Effektes von Interferonen wie IFN-γ und TNF-α, die von T-Zellen, natürlichen Killerzellen und Makrophagen sezerniert werden, konnte von den Autoren 1} gezeigt werden.
Die Ergebnisse dieser Autoren bestätigte eine andere frühere Studie, in der gezeigt wurde, dass Class-I-restringierte cytotoxische T-Zellen die hepatozelluläre HBV- Genexpression in HBV- transgenen Mäusen hemmen konnten, dass dieser Prozess ohne Zerstörung der Leberzellen ablief und dass der Prozess durch TNF-α und IFN-γ hervorgerufen wurde 2).
In der tiermedizinischen Praxis wird seit längerer Zeit ein Produkt zur Induktion „paraspezifischer Immunität" ein sogenannter Paramunitätsinducer therapeutisch, meta- und prophylaktisch eingesetzt. Paramunitätsinducer bestehen z.B. aus chemisch inaktiviertem Parapoxvirus ovis, Strain D 1701 (DE 3 504 940). Ein auf der Basis dieses Virus (Parapoxvirus ovis, Strain D 1701) hergestelltes Produkt ist
BAYPAMUN®.
Das inaktivierte Parapoxvirus induziert im Tier einen unspezifischen Schutz gegenüber Infektionen mit den verschiedensten Erregern. Man nimmt an, dass dieser Schutz über verschiedene Mechanismen des organismus-eigenen Abwehrsystems vermittelt wird.
Zu diesen Mechanismen zählen die Induktion von Interferon, die Aktivierung der natürlichen Killerzellen, die Induktion der „Kolonien-Stimulierenden Aktivität" (CSA), sowie die Stimulierung der Lymphozytenproliferation. Frühere Untersuchun- gen zum Wirkmechanismus zeigten die Stimulation von Interleukin 2 und Interferon- α 3).
Vor diesem Hintergrund stellt sich daher die Aufgabe, die therapeutische Nutzbarkeit der ausgezeichneten Wirkung von Parapoxvirus ovis dahingehend weiter zu verbessern, dass die oben beschriebene generalisierte sogenannte Induktion einer paraspezifischen Immunantwort des Parapoxvirus ovis, Stamm D 1701 qualitativ erhöht und dahingehend verbessert wird, dass durch Einsatz geringerer Dosen bessere antivirale oder anti-Tumorwirkungen erzielt werden können. Dies ließe zusätzlich einen ne- benwirkungsärmeren therapeutischen Effekt erwarten.
Aufgabe der Erfindung war es deshalb, die immunologische Wirkung des Parapoxvirus zu verbessern. Die Aufgabe wird gelöst durch Verwendung der oben genannten Stämme von Parapoxvirus ovis anstelle des herkömmlich verwendeten Strain D 1701.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Viren, die taxonomisch zu einem der Stämme NZ2, NZ-7, NZ-10 oder orf-11 von Parapoxvirus ovis gehören, zur Herstellung von Arzneimitteln gegen virale Infektionen und Krebs bei Mensch und Tier.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von durch Passagierung oder Adaptation an geeigneten Zellsystemen wie beispielsweise humanen Zellen wie WI-38, MRC-5, Affenzellen, z.B. Vero-Zellen, bovine Zellen wie z.B. BK- K13A47/Reg oder MDBK, und ovinen Zellen wie MDOK, erhaltenen
Abkömmlingen der erfindungsgemäßen Stämme zur Herstellung von Arzneimitteln gegen virale Infektionen und Krebs bei Mensch und Tier zum Gegenstand hat, und weiter die Verwendung von Teilen oder Bruchstücken der genannten Stämme und ihrer Passagierungs- und Adaptationsvarianten, wobei unter Teilen mittels geeigneter Vektoren wie Vacciniaviren in geeigneten Systemen wie Fibroblastenzellkulturen exprimierte genomische oder subgenomische Fragmente und unter Bruchstücken die durch biochemische Aufreinigung wie Chromatografie erhaltenen Fraktionen der exprimierten oder physikalisch aufgeschlossenen viralen Partikel zu verstehen sind, zur Herstellung von Arzneimitteln gegen virale Infektionen und Krebs bei Mensch und Tier zum Gegenstand hat, und weiter die Verwendung von einem der Stämme von Parapoxvirus ovis und wie vorstehend beschrieben abgeleiteten Derivate zur
Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen als Immuntherapeutika oder Immunprophylaktika bei Autoimmunerkrankungen und bei akuten und chronischen viralen Infektionen des Respirationstraktes und der inneren Organe, zum Gegenstand hat, und weiter die Verwendung von einem der Stämme und abgeleiteten Derivate zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen
Zubereitungen für die Stressmetaphylaxe und zur Verhinderung oder Vorbeugung von Infektionskrankheiten nach Stress sowie bei der Infektionsprophylaxe im Rahmen von Operationen und zahnärztlichen Eingriffen zum Gegenstand hat, und weiter die Verwendung von einem der Stämme und abgeleiteten Derivate zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die
Verwendung bei der Infektionsmetaphylaxe oder Therapie akuter und chronischer viraler Infektionen beispielsweise des Respirationstraktes, der Papillomvirus- infektionen, der Infektion mit Viren der Heφesgruppe, der HIV-Infektion, der Virusinfektion innerer Organe wie beispielsweise der Infektion mit Hepatitisviren sowie die Verwendung bei Erkrankungen wie Multipler Sklerose, Asthma, Warzen und anderer Neubildungen der Haut zum Gegenstand hat, und weiter die Verwendung von einem der Stämme und abgeleiteter Derivate zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die Verwendung an Wunden zur Beschleunigung von Wundheilungsprozessen und die Verwendung zur Unterstützung der Heilung schlecht oder nicht heilender Wunden und Ulcus cruris zum Gegenstand hat, und weiter die Verwendung von einem der Stämme und abgeleiteter Derivate zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die Verwendung bei Erkrankungen des allergischen Formenkreises, Psoriasis, Neuroderemitis, anderen Autoimmunerkrankungen wie z.B. Lupus erythematodes, sowie zur Ver- besserung des Wohlbefindens, z.B. im Alter zum Gegenstand hat, und weiter die
Verwendung von einem der Stämme und abgeleiteter Derivate zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die Verwendung gegen entzündliche, degenerative und proliferative Erkrankungen der inneren Organe, z.B. Morbus Crohn, der Haut, des Blutes, des Zentralnervensystems und seiner Anhangsgebilde einschließlich des Auges, einschließlich Krebs zum Gegenstand hat, und weiter die Verwendung von einem der Stämme und davon abgeleiteter Derivate in
Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen zur antiviralen- oder Krebstherapie bei Mensch und Tier zum Gegenstand hat.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von einem der
Stämme von Parapoxvirus ovis in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die orale Applikation, und/oder in einer magensaftresistenten Formulierung für die orale Applikation.
Der hier beispielhaft genannte Parapoxvirus ovis NZ-2 wurde am 10. Juli 2001 bei der European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG,United Kingdom hinterlegt. Die Hintelegungsnummer lautet
Beispielhaft wurde gefunden:
1. Nachweis der therapeutischen Wirksamkeit in Hepatitis B Virus - transgenen Mäusen
Für den „proof of concept" Versuch wurden Hepatitis B Virus transgene Mäuse
(Stamm HBV 1.3 X'tg,) verwendet. Es wurden 7 männliche Tiere im Alter von 8 bis 10 Wochen je Gruppe verwendet. Die Applikation der verschiedenen Dosen erfolgte intraperitoneal in einem Volumen von 0.15 ml am Tag 1 (Beginn des Experimentes) und Tag 4. Für die Applikation wurden folgende Verdünnungen eines jeden Virus-Strains für die einzelnen Dosisgruppen hergestellt:
1. Dosis l,5xl06 TCID50
2. Dosis 5xl05 TCTD '5<0
3. Dosis l,5xl05 TCID 50
4. Dosis 5x104 TCID 50
Als Placebo-Kontrolle diente steriles, pyrogenfreies PBS.
Die Aufkonzentration der Viren wurde folgendermaßen vorgenommen: 500 ml Über- stand aus Parapoxvirus ovis, strain NZ 2 (Titer ca. 2x105 TCID50/ml) und Parapoxvirus ovis, strain D 1701 (Titer lxlO7 TCID50/ml) wurden auf denselben Virustiter eingestellt. Dafür wurde eine Beckmann Ultrazentrifuge (Rotor SW28 bei 28000 RPM 3 Std. 4°C) benutzt. Nach der Zentrifugation wurden die Pellets mit entsprechenden Volumina Verdünnungsmedium auf einen Titer von lxl 07 TCID50/ml eingestellt.
Aliquots der entsprechenden Dosierungen wurden für eine kontrollierende Rücktitration verwendet, die die Titer dieser Dosierungen bestätigte. Die entsprechenden Dosen wurden nach Entnahme der Kontrollaliquots für 1 Stunde bei 56°C inaktiviert.
Verdünnungsmedium: 10 ml EMEM 1 Ox
2,7 ml Bicarbonat 2 g/1 1 ml Glutamin 1 % 86,3 ml Aqua-bidest
Am Tag 5 wurden die Tiere schmerzlos getötet und Leber und Blut entnommen. Etwa 20 mg Leber je Tier wurden mit QIAamp Tissue Kit (Qiagen, Hilden) aufgearbeitet, die Konzentration der DNA wurde photometrisch bestimmt und die Integrität in einem l%igen Agarosegel elektrophoretisch kontrolliert. Die DNA wurde in einem Dot-Blot-Hybridisierungsverfahren mit einer HBV-spezifischen Sonde hybridisiert. Zuvor wurde die DNA mit RNAse A (Qiagen, Hilden) behandelt, um durch RNA hervorgerufene Signale auszuschließen. 200 μl DNA (10 μg) wurde auf eine Nylon-Membran (Boehringer Mannheim) gebracht, 4 mal für jeweils 3 Minuten mit Soak I (0,5N NaOH; IM NaCl) und zwei mal mit Soak II (3M NaCl; 0,5M Tris-HCl, pH 7,4) behandelt, bei 120°C für eine halbe Stunde gebacken und im Anschluss mit einem Standard Hybridisierungspuffer (5xSSC, N-lauroylsarcosine, 0,1 % w/v; SDS,
0,02 %; Blocking reagent, lx and 100 μg/ml fϊsh sperm DNA) ohne Sonde für 30 Minuten bei 60°C prähybridisiert. Im Anschluss an diesen Schritt erfolgte die Hybridisierung mit einer random-Oligonukleotid geprimten Sonde, die das gesamte HBV Genom enthält (20-40 ng/ml Hybridisierungspuffer). Der Filter wurde danach für 10 Minuten bei 64°C in 4xSSC/0,l %SDS, 2xSSC/0,l %SDS undlxSSC/0,1 %SDS gewaschen.
Die immunologische Detektion erfolgte mit dem CDP-Star® - System (Boehringer Mannheim) entsprechend den Vorschriften des Herstellers. Für die Auswertung wurde ein Lumilmager® (Boehringer Mannheim) verwendet. Die Quantifizierung
HBV-spezifischer DNA im Blut erfolgte mittels quantitativer PCR. Zunächst wurde mittels Zentrifugation des EDTA-Blutes das Plasma gewonnen. Die DNA wurde mittels des HighPure 16 System Viral Nucleic Acid Kits (Boehringer Mannheim) aufgereinigt und durch quantitative PCR mit dem ABI PRISM™ 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems) auf HB V-spezifische Signale untersucht.
Folgende Primer und Sonde wurden eingesetzt:
ayw-570f (sense) 5' - CTGTACCAAACCTTCGGACGG - 3' ayw-670r (antisense) 5' - AGGAGAAACGGGCTGAGGC - 3 Sonde: ayw-613t 5 - CCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATT - 3 \
Die DNA wurde in 50μl Reaktionsvolumen amplifiziert (die Reaktion enthielt
1,4 mM von jedem dNTP, 4.75 mM MgCl2, 15 pmol eines jeden Primers und der Sonde, 5 μl 10-fach PCR Puffer [alle PCR Reagenzien stammten aus dem TaqMan core reagent kit; Perkin Elmer/Roche Molecular Systems Inc.] und 1.25 U Taq DNA polymerase und 0.25 U Amp Erase. Nach einem initialen Denaturierungsschritt (10 min bei 95°C), wurden die Proben 40 Zyklen Denaturierung (95°C 30 sec) und Annealing/Extension (56°C, 1 min) ausgesetzt. Die Analyse der Produkte erfolgte mit der ABI PRISM™ 7700 Sequence Detection System Standard Software.
Eine histochemische Analyse erfolgte mittels Antiköφern gegen das Hepatitis B Virus core Antigen (Dako). Dafür wurden Teile eines Leberlappens über Nacht in 4 % Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und geschnitten (5μm). Nach Ent- paraffinisierung und Rehydration wurde die endogene Peroxydaseaktivität mit 3 %
H2O2 für einen Zeitraum von 20 Minuten gequencht. Unspezifische Bindung wurde mit Normal-Schafserum geblockt. Im Anschluss wurden die Schnitte 30 Minuten bei Raumtemperatur mit dem 1:500 verdünnten Antiköφer inkubiert. Alle nachfolgenden Schritte wurden mit dem Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories) wie vom Hersteller beschrieben durchgeführt.
Die Immunreaktion wurde mit 3.3 Diamino-benzidintetrachlorid und Wasserstoffperoxid visualisiert. Die Schnitte wurden Hematoxylin/Eosin gegengefärbt.
Die statistischen Analysen der Ergebnisse erfolgten durch Varianzanalyse und post hoc - Vergleich.
Im Ergebnis wurde überraschend festgestellt, dass man durch Verwendung des Strains NZ 2 eine Verstärkung der antiviralen Wirkung im Vergleich zu bekanntem Parapox ovis Strain D 1701 erreicht. Damit wird es erstmals möglich, mit Hilfe von
Parapoxvirus ovis die komplexe Kapazität des Immunsystems in einer Stärke zu induzieren, die sich signifikant von der Wirkstärke der bisher bekannten Paramunitätsinducer unterscheidet.
Folgende Ergebnisse wurden überraschenderweise erhalten: Leber: Bei mit NZ-2 behandelten Tieren wurde im Vergleich zu mit D 1701 behandelten Tieren eine signifikant stärkere Reduktion von HBV-spezifϊscher DNA festgestellt. Im Vergleich mit D 1701 ist NZ2 in seiner antiviralen Wirksamkeit potenter: In der höchsten Dosisgruppe reduziert die Gabe von NZ 2 die HBV-spezifische DNA um mehr als den Faktor 45 besser als die Gabe von gleicher Menge D 1701, in der niedrigsten Dosisgruppe um den Faktor 57. Im Plasma reduziert die Gabe von NZ 2 die HBV-spezifische DNA in der niedrigsten Dosisgruppe um mehr als den Faktor 10 besser als die Gabe von gleicher Menge D 1701. Damit wurde gezeigt, dass die therapeutische Wirksamkeit von Parapoxvirus ovis Strain NZ 2 signifikant besser als diejenige von Strain D 1701 ist.
In den Abbildungen wird die Reduktion HBV-spezifischer Signale im Vergleich zur Placebogruppe (diese wurde mit 100 % gleichgesetzt) aufgezeigt.
Abbildung 1 zeigt Ergebnisse der Behandlung HBV-transgener Mäuse mit Strain
D 1701 oder NZ 2. HBV-spezifische DNA wird in der Leber in allen Dosisgruppen bei beiden Strains signifikant im Vergleich zur Placebogruppe reduziert, durch Strain NZ 2 aber stärker. Bei den beiden niedrigsten NZ 2-Dosierungen liegt eine signifikant stärkere Reduktion der HBV-spezifϊschen DNA als bei den äquivalenten D 1701 Dosisgruppen vor. In Abbildung 2 wird das Ergebnis der Behandlung HBV- transgener Mäuse mit Strain D 1701 oder NZ 2 im Plasma gezeigt. HBV-spezifische DNA wird im Plasma in allen Dosisgruppen bei beiden Strains signifikant im Vergleich zur Placebogruppe reduziert, durch Strain NZ 2 aber stärker. Im Gegensatz zur niedrigsten NZ 2 - Dosierung wirkt die geringste Dosis von Strain D 1701 nicht mehr signifikant antiviral.
2. Induktion von Zytokinen:
7 bis 8 Wochen alte weibliche Balb/c Mäuse wurden unter sterilen Bedingungen ge- halten und für den Versuch verwendet. Die Tiere wurden randomisiert und in Grup- pen mit jeweils 6 Tieren aufgeteilt. Folgendes Behandlungsschema wurde angewendet:
Gruppe 1: Placebo
Gruppe 2: Parapoxvirus ovis strain D 1701; 5xl04 TCID50/Dosis
Gruppe 3: Parapoxvirus ovis strain NZ 2; 5x104 TCID50/Dosis
Gruppe 4: Placebo
Gruppe 5: Parapoxvirus ovis strain D 1701; 5x104 TCID50/Dosis
Gruppe 6: Parapoxvirus ovis strain NZ 2; 5x104 TCID50/Dosis
Das Applikationsvolumen betrug 10 ml/kg, die Applikation erfolgte intraperitoneal.
6 Stunden nach der Applikation wurden die Tiere der Gruppen 1 bis 3, 12 Stunden nach der Applikation die Tiere der Gruppen 4 bis 6 getötet, Peritonealzellen über eine Lavage mit eiskaltem PBS gewonnen sowie die portalen und mesenterialen
Lymphknoten isoliert.
Die Peritonealzellen wurden über einen Zentrifugationsschritt (5 min bei 3000 φm bei Raumtemperatur in einer Eppendorf-Tischzentrifuge) aufkonzentriert, anschlie- ßend in 0,2 ml Lysis-Puffer (Lysis-Lösung: 25 mM Natriumeitrat, 4 M Guanidini- umisothioeyanat, 0,5 % N-Lauroyl-Sarkosin) aufgenommen, schockgefroren und bis zur RNA-Präparation bei -75 °C gelagert.
Die Präparation der totalen RNA erfolgte mittels saurer Phenol/Chloroform-Extrak- tion. Dazu wurden die in Lysispuffer eingefrorenen Proben bei Raumtemperatur aufgetaut und zur Extraktion mit folgenden Lösungen versetzt: 1/10 Lysispuffer- Volumen 2 m Natriumacetat (pH 4,0), 1 Lysispuffer-Volumen wassergesättigtes Phenol, 1/5 Lysisppuffer- Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24:1). Dieser Ansatz wurde für 10 Sekunden auf dem Vortexer vermischt und anschließend 10 Minuten auf Eis temperiert. Die Phasentrennung erfolgt durch Zentrifugation bei 15365 g und 4°C für
30 Minuten. Danach wurde die wässrige Phase in ein neues Gefäß überführt, und zur Isolation der in dieser Phase befindlichen RNA 8 ml RNA-MATRIX aus dem Rnaid™ plus Kit (DIANOVA) zugegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der entstandene RNA/RNA-MATRIX-Komplex wurde durch Zentrifugation bei 7000 g pelletiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde nachfolgend 2x mit je 250 ml RNA-WASH (DIANOVA) gewaschen und nach dem letzten Waschen durch Vakuumzentrifugation getrocknet. Die RNA wurde durch Zugabe von 20-30 ml RNAse freiem destillierten Wasser durch Temperieren bei 55 °C für 15 Minuten eluiert. Nach Zentrifugation bei 7000 g und Raumtemperatur für 1 Minute wurde die Matrix durch Überführen der RNA-Lösung in ein neues Gefäß abgetrennt.
Die Qualität der RNA wurde mittels Gelelektrophorese übeφriift. Die RNA wurde bei -70°C gelagert.
Die Synthese der cDNA erfolgte durch reverse Transkription der mRNA unter Ver- wendung von Oligo(dT)-Primern als Startermoleküle für die Polymerisation. Im
Synthese-Ansatz waren folgende Komponenten vorhanden: 200 ng-2 μg totale RNA, 2 μl reverse Transkriptase M-MLV (200 U/μl) (GIBCO/BRL), 8 μl des zugehörigen 5xRT-Puffer (GIBCO/BRL), 1 μl DTT (0.1M) (GIBCO/BRL), 4 μl dNTP (2,5 mM) (SIGMA), 2 μl Oligo(dT)12-18-Primer (100 μg/ml) (PROMEGA), 1 μl human pla- zental RNAse Inhibitor (10000 U/ml) (GIBCO/BRL) und Wasser ad 40 μl Gesamtvolumen. Der Ansatz wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur temperiert und anschließend 45 Minuten bei 37°C inkubiert, nachfolgend für 3 Minuten auf 95 °C erhitzt und sofort auf Eis abgekühlt. Die auf diese Weise synthetisierte cDNA wurde bei -20°C gelagert.
Die Mengen der cDNAs wurden mittels eines „housekeeping" Gens (ß-Aktin) standardisiert. Die quantitative PCR wurde mit dem ABI PRISM™ 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems) durchgeführt. Folgende Primer wurden eingesetzt:
ß-Actin sense: 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3' antisense: 5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3'
IFN-γ sense: 5'-AGCGGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG-3' antisense: 5*-GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG-3 '
TNF-α sense: 5'-GGC AGG TCT ACT TTG GAG TCA TTG C-3' antisense: 5'-ACA TTC GAG GCT CCA GTG AAT TCG G-3'
IL- 15 sense: 5'-GCC AAC TGG ATA GAT GTA AGA TAT GAC CT-3 ' antisense: 5'-CGT GTT GAT GAA CAT TTG GAC AAT GCG TAT-3 '
Die DNA wurde in 25 μl Reaktionsvolumen amplifiziert (die Reaktion enthielt 1,4 mM von jedem dNTP, 4 mM MgCl2, 0,3 μmol eines jeden Primers und der
Sonde, 2,5 μl 10-fach PCR Puffer mit SYBR Green [alle PCR Reagenzien stammten aus dem SYBR Green PCR core reagent kit; Perkin Elmer/Roche Molecular Systems Inc.] und 1.25 U Taq DNA polymerase und 0.25 U Amp Erase. Nach einem initialen Denaturierungsschritt (95°C für 10 min), wurden die Proben 40 Zyklen Denaturierung (95°C 30 s) und Annealing/Extension (60°C, 1,30 min) ausgesetzt.
Die Analyse der Produkte erfolgte mit der ABI PRISM™ 7700 Sequence Detection System Standard Software. Die statistischen Analysen der Ergebnisse erfolgte mit der Varianzanalyse und post hoc - Vergleich.
Folgende Ergebnisse wurden überraschenderweise erhalten:
1. Die Expression von Interferon γ wird nach Behandlung mit Strain D 1701 oder Strain NZ 2 6 und 12 Stunden nach der Applikation induziert (Abbildung 3). Diese Induktion ist bei Strain NZ 2 sowohl signifikant höher gegen- über Placebo, als auch gegenüber Strain D 1701. Die nach Gabe von D 1701 beobachtete Höhe der Interferon γ Expression ist nicht signifikant gegenüber der Placebokontrolle. Dargestellt sind die Werte, die in durch peritoneale Lavage erhaltenen Zellen gemessen wurden.
2. Die Expression von TNF α wird nach Behandlung mit Strain D 1701 12
Stunden oder nach Behandlung mit Strain NZ 2 6 und 12 Stunden nach der Applikation induziert, (wobei nach 12 Stunden bereits ein Absinken im Vergleich zum 6 Stunden- ert festgestellt werden kann; Abbildung 4). Diese Induktion ist 6 Stunden nach der Applikation bei Strain NZ 2 signifikant höher als vergleichsweise gegenüber Strain D 1701. Dargestellt sind die Werte, die in durch peritoneale Lavage erhaltenen Zellen gemessen wurden.
3. Die Expression von IL-15 wird nach Behandlung mit Strain D 1701 oder mit Strain NZ 2 6 und 12 Stunden nach der Applikation induziert (Abbidung 5). Diese Induktion ist 6 Stunden nach der Applikation bei Strain NZ 2 signifi- kant höher als vergleichsweise gegenüber Strain D 1701 oder Placebo. Die nach Gabe von D 1701 beobachtete Höhe der IL-15 - Expression ist nicht signifikant gegenüber der Placebokontrolle. Dargestellt sind die Werte, die in durch peritoneale Lavage erhaltenen Zellen gemessen wurden.
3. Nachweis der therapeutischen Wirksamkeit in tumortragenden
Nacktmäusen
MDA-MB231 Zellen (ATCC#HTB26) wurden in Komplettmedium (DMEM 88 5, FBS 10 %, Penicillin/Streptomycin 1 %, L-Glutamin 1 % Geweils Gibco Life Technologies)) bei 37°C und 5 % CO2 in einem Inkubator kultiviert. Am Tage der
Transplantation waren die Zellen zu ca. 70 % konfluent. Die Zellen wurden trypsiniert, mit HBSS gewaschen, gezählt und auf 2,5x107 Zellen/ml mit vorgekühltem PBS eingestellt. Es wurden weibliche NCr nude Mäuse (taconic) verwendet. Die Mäuse waren zwischen 8 und 10 Wochen alt und wogen ca. 22 g. Alle Manipulationen an den Tieren wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
5x106 Zellen wurden in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml subcutan in die Flankenregion injiziert. Danach wurden die Mäuse weitere sieben Tage gehalten bis die Tumoren eine durchschnittliche Masse von ca. 80 mg erreicht hatten. Die Tumoren wurden vermessen und die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen zu jeweils zehn Tieren eingeteilt. Die einzelnen Gruppen erhielten wie folgt verabreicht: Gruppe 1 Placebo (PBS) Gruppe 2 Parapoxvirus ovis, Stamm Dl 701 Gruppe 3 Parapoxvirus ovis, Stamm NZ2
D1701 wurde in einer Dosis von 2,5xl05 TCID50, NZ2 in einer Dosis von lxlO5
TCIDJ0 insgesamt jeweils vier mal im Abstand von jeweils drei Tagen verabreicht. Die Tumoren wurden zwei mal pro Woche vermessen. Signifikanzen wurden mittels Student's Test ermittelt.
Figur 6 zeigt die mittlere Größe der Tumoren (in Milligramm) in Tieren der Gruppen
1 bis 3 über die Versuchszeit (in Tagen). (Symbole: Gruppe 1, Kreise; Gruppe 2, Dreiecke; Gruppe 3, Quadrate)
Überraschender Weise wurde im experimentellen System eine im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikante gegen Tumoren gerichtete Wirksamkeit gefunden
(p<0,05). Dabei zeigte sich der Stamm NZ2 deutlich potenter als der Stamm Dl 701. Zum Erreichen des gleichen Effektes war nur ungefähr die halbe Menge NZ2, verglichen mit Dl 701, nötig.
Dieser Befund belegt deutlich die therapeutische Wirksamkeit von erfϊndungsge- mäßen Viruspräparationen in tumortragenden Nacktmäusen.
Nacktmäuse sind immundefizient und verfügen nicht über funktioneile T-Zellen. Die gegen die Tumoren gerichtete Aktivität wird vermutlich im experimentellen System durch die natürlichen Klientelen (NK), andere Zellen und direkte Wirkung von
Zytokinen/Chemokinen bedingt. Bei einem vollständigen und intakten Immunsystem wäre zu vermuten, dass die bessere Wirksamkeit von NZ2 noch deutlicher ersichtlich wird.
4. Weitere biologische Unterschiede zwischen NZ2 und D1701 Es wurde gefunden, dass Parapox Virus NZ2 im Gegensatz zum Stamm Dl 701 auf humanen Zelllinien fortgesetzt passagierbar ist. Dies zeigt grundsätzliche Unterschiede im Replikationsverhalten und/oder in den viralen Rezeptoren bei NZ2 und D1701.
Die Adaptation an humane Zelllinien ist eine wichtige Voraussetzung für die Produktion von viralen Stämmen auf humanen Zelllinien.
4 .a) Fortgesetzte Passagierbarkeit auf humanen MRC-5 Zellen.
Ein Adaptionsversuch der Stämme NZ2 und Dl 701 an die humane diploide Zelllinie MRC-5 ist in Figur 7 dargestellt. MRC-5 ist für die Produktion von biologischen Wirkstoffen und Impfstoffen geeignet. Die Stämme wurden mit dem gleichen Ausgangstiter eingesetzt und die entsprechenden Zellkultur- überstände über 5 Passagen in MRC-5 Zellen weitergeführt. Dargestellt ist die Austitration von Proben aus den Überständen der jeweils infizierten MRC5-Zellen in TCID50 über die Passagennummer. Lediglich der Stamm NZ2, nicht aber D1701 war auf bovinen Nierenzellkulturen (BK Klon 3a) rücktitrierbar. Dies weist auf prinzipielle biologische Unterschiede der beiden Stämme im Infektions- und Replikationsverhalten hin. Gleichzeitig zeigt dieses Ergebnis, dass NZ2 in einem breiteren Spektrum von Zellen als Dl 701 reproduziert werden kann, woraus sich die Möglichkeit eines auf humanen Zellen beruhenden Produktionsverfahrens ergibt.
4. b) Passagierbarkeit von NZ2 und D1701 auf WI-38 Zellen und BK Klon 3a
Zellen
Wesentliche biologische Unterschiede zwischen NZ2 und Dl 701 Stämmen werden auch durch die in Figur 8 und Figur 9 dargestellten Experimente deutlich. Figur 8 zeigt den Virustiter in Passagierungs versuchen von Dl 701 auf bovinen BK Klon 3 a Zellen und auf humanen WI-38 Zellen über die Anzahl der Passagen. Es ist erkennbar, dass Dl 701 auf BK Klon 3a Zellen fortgesetzt passagierbar ist, auf humanen WI-38 Zellen jedoch nicht.
Anders verhält es sich mit dem NZ2 Stamm. Dieser Stamm ist über mehrere Tage sowohl auf BK Klon 3a Zellen als auch auf WI-38 Zellen fortgesetzt passagierbar (Figur 9).
Auch diese Ergebnisse weisen auf deutliche Unterschiede im Infektions- und Replikationsverhalten von NZ2 und Dl 701 hin.
4. c) Dosisabhängige Wirkung von NZ2 im Heφesvirus-Challenge-Test nach Passagierung auf WI-38
Zur Untersuchung der immunstimulatorischen Eigenschaften von NZ2 Stämmen, welche auf WI-38 Zellen passagiert worden sind, sind Heφesvirus-
Challenge-Tests an Mäusen durchgeführt worden. Es wurden drei Gruppen von jeweils 10 Versuchstieren mit jeweils lxlO4 TCID50, 5xl04 TCID50 und lxlO5 TCID50 behandelt, eine Kontrollgruppe erhielt ein Placebo. Die Überlebensrate der vier Versuchsgruppen ist in Figur 10 über die Zeit nach der Heφesvirusinfektion dargestellt. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass NZ2 durch die Passage auf WI-38 Zellen seine immunstimulatorischen Eigenschaften nicht verloren hat.
Alle experimentellen Ergebnisse dieses Beispiels weisen auf grundlegende biologische Unterschiede im Infektions- und Replikationsverhalten von NZ2 und Dl 701 hin. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die Herstellung von NZ2 zur Verwendung als Immunmodulator im Gegensatz zu Dl 701 nicht an Rindernierenzellen als Produktionszelllinie gebunden ist.
Unter Zugrundelegung der bekannten Zusammenhänge vom Einfluss einer Thl Immunantwort auf latente und chronisch persistente Virusinfektionen4'5) sowie pro- liferative Erkrankungen, z.B. Krebs8'9) und der im Vergleich zu Parapoxvirus ovis, Strain D 1701 besseren immunmodulatorischen Eigenschaften des Parapoxvirus ovis, Strain NZ 2 ist der Einsatz von Immunmodulatoren auf der Basis von Parapoxvirus ovis, Strain NZ 2 oder einer der o.g. Stämme als Monotherapie oder in Kombination mit biologisch aktiven, z.B. antiviralen, niedermolekularen Verbindungen an Mensch und Tier möglich und von therapeutischem Nutzen zur antiviralen Therapie von Infektionen mit dem Hepatitis B Virus; dem Hepatitis C Virus oder allen anderen Erregern aus der Gruppe der Hepatitis verursachenden Viren sowie anderen viralen Infektionen der inneren Organe, sowie Infektionen, auch in Begleitung anderer Er- krankungen, mit den verschiedenen Typen des Heφes simplex Virus (HSV), den verschiedenen Typen von humanem Papillomvirus (HPV), dem humanem Immun- defizienzvirus (HIV), dem Varizella Zoster Virus, dem humanem Cytomegalievirus (HCMV), sowie den entsprechenden Viruserkrankungen beim Tier.
Des weiteren können mit den oben genannten Stämmen von Parapoxvirus ovis aufgrund des gezeigten Wirkmechanismus insbesondere die folgenden prophylaktischen oder therapeutischen Behandlungen erfolgversprechend durchgeführt werden:
Verhinderung von Rekurrenzen bei Heφesvirus-Infektionen, Metaphylaxe, d.h. Ver- hinderung der Etablierung von viralen Infektionen (z.B. HIV), wenn unmittelbar nach der Exposition mit dem Mittel behandelt wird 7). Die Behandlung von Krebs ist aufgrund des Wirkmechanismus ebenfalls möglich 8'9).
Je nach klinischer Fragestellung wird das Therapeutikum auf der Basis von Parapox- virus systemisch, also beispielsweise intramuskulär, subcutan, intraperitoneal, intravenös, per os, oder lokal appliziert. Das Parapoxvirus liegt dabei entweder aufgereinigt und lyophilisiert vor und/oder wird unmittelbar vor der Applikation in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert oder es liegt in einer anderen geeigneten Formulierung vor oder es liegt in einer magensaftresistenten oder einer anderen oralen Applikationsform vor. Geeignete Zubereitungen können ebenfalls aus durch Passagierung und/oder Adaptation an bestimmte Zellen, beispielsweise WI-38, MRC-5 oder Vero-Zellen, erhaltenen Abkömmlingen von NZ2 und den anderen genannten Stämmen bzw. Teilen oder Bruchstücken von NZ2 und den anderen genannten Stämmen oder diesen Ab- kömmlingen hergestellt werden. Unter Teilen sind mittels geeigneter Vektoren, beispielsweise Vaccinia, in geeigneten Systemen, beispielsweise Fibroblastenzellkulturen, exprimierte genomische oder subgenomische Fragmente zu verstehen. Unter Bruchstücken versteht man die durch biochemische Aufreinigung, beispielsweise Chromatografie, erhaltenen Fraktionen physikalisch, beispielsweise durch Ein- Wirkung von Ultraschall, aufgeschlossener Partikel.
Mehrere Applikationen oder Langzeitbehandlung nach Zeitschemen, die den Erfordernissen der klinischen Fragestellung entsprechen, können dabei notwendig sein
So erweist sich bei der Krebstherapie beispielsweise (jedoch ohne Einschränkung) die Anwendung nach folgendem Schema als besonders erfolgversprechend:
Intramuskuläre Applikation von jeweils 106 bis 107 TCID50 (Tissue Culture Infective Dosage) für 4 Wochen an jedem 3. Tag gefolgt von 2 Wochen Pause; erneute intra- muskuläre Applikation von jeweils 106 bis 107 TCID50 für 4 Wochen an jedem 3.
Tag gefolgt von 2 Wochen Pause; erneute intramuskuläre Applikation von jeweils 106 bis 107 TCID50 für 4 Wochen an jedem 3. Tag gefolgt von 2 Wochen Pause; je nach Schweregrad und Heilungserfolg können diese Cyclen durch weitere Cyclen ergänzt werden; alternativ kann auch ein Schema unter dem die Formulierung jeden 4. bis 5. Tag über mindestens 3 Monate appliziert wird, indiziert sein.
Bei chronischer Virusinfektion werden beispielsweise 106 bis 107 TCID50 der Formulierung subcutan im Bauchbereich oder intramuskulär im Bereich des Deltoid oder Quadrizeps jeden 3. Tag, insgesamt 5 mal, appliziert. Abweichungen von diesem Schema können entsprechend den Bedürfnissen, die sich aus der Erkrankung ergeben, vorgenommen werden. Zur Prophylaxe von Erkältungen ist mit der Formulie- rung zu gurgeln und diese Anwendung täglich zu wiederholen, solange wie das Ansteckungsrisiko besteht.
Für die Vorbeugung von Infektionen nach oralchirurgischen Eingriffen (z.B. Zahn- Operation) ist am Vorabend vor dem Eingriff 1-2 min. zu gurgeln.
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Original (für EINREICHUNG) - gedruckt am 10.07.2001 01 :12:00 PM -1 Formular - PCT7RO/134 (EASY) Angaben zu einem hinterlegten Mikroorganismus und/oder anderem hinterlegten biologischen Material -1-1 erstellt durch Benutzung von PCT-EASY Version 2 . 91 (aktualisiert 01 . 01 .2001) -2 Internationales Aktenzeichen.
-3 Aktenzeichen des Anmelders oder LEA34376-WO Anwalts
Die nachstehenden Angaben betreffen den Mikroorganismus und/oder anderes biologisches Material, der/das in der Beschreibung genannt ist -1 Seite 6 -2 Zeile 15 -3 Angaben betr. Hinterlegung -3-1 Name der Hinterlegungsstelle Ξuropean Collection of Cell Cultures -3-2 Anschrift der Hinterlegungsstelle Vaccine Research and Production Laboratory , Public Health Laboratory Service , Centre for Applied Microbiology and Research , Porton Down , Salisbury , Wiltshire SP4 0JG , United Kingdom -3-3 Datum der Hinterlegung 10 Juli 2001 (10 . 07 . 2001) -3-4 Eingangsnummer ECACC -4 Weitere Angaben KEINE -5 Bestimmungsstaaten, für die alle Bestimmungs Staaten besondere Angaben gemacht werden -6 Gesondert eingereichte Angaben KEINE
Diese Angaben werden dem Internationalen Büro später übermittelt
VOM ANMELDEAMT AUSZUFÜLLEN
Figure imgf000024_0001
VOM INTERNATIONALEN BÜRO AUSZUFÜLLEN -5 Dieses Formular ist an folgendem Datum beim internationalen Büro eingegangen -5-1 Bevollmächtigter Bediensteter

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung von Viren, die taxonomisch zu einem der Stämme NZ2, NZ-7, NZ-10 oder orf-11 von Parapoxvirus ovis gehören zur Herstellung von Arz- neimitteln gegen virale Infektionen und Krebs bei Mensch und Tier.
2. Verwendung von durch Passagierung oder Adaptation an geeigneten Zellsystemen wie beispielsweise humanen Zellen wie WI-38, MRC-5, Vero- Zellen, bovinen Zellen wie BK-K13A47/Reg oder MDBK, und ovinen Zellen wie MDOK, erhaltenen Abkömmlingen der Viren gemäss Anspruch 1 zur
Herstellung von Arzneimitteln gegen virale Infektionen und Krebs bei Mensch und Tier.
3. Verwendung von Teilen oder Bruchstücken der Viren gemäss Anspruch 1 und 2, wobei unter Teilen mittels geeigneter Vektoren wie Vacciniaviren in geeigneten Systemen wie z.B. Fibroblastenzellkulturen exprimierte genomische oder subgenomische Fragmente und unter Bruchstücken die durch biochemische Aufreinigung wie Chromatografie erhaltenen Fraktionen der exprimierten oder physikalisch aufgeschlossenen viralen Partikel zu ver- stehen sind, zur Herstellung von Arzneimitteln gegen virale Infektionen und
Krebs bei Mensch und Tier.
4. Verwendung von einem der Stämme von Parapoxvirus ovis entsprechend Anspruch 1-3 zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zu- bereitungen als Immuntherapeutika oder Immunprophylaktika bei Autoimmunerkrankungen und bei akuten und chronischen viralen Infektionen des Respirationstraktes und der inneren Organe.
5. Verwendung von einem der Stämme entsprechend Anspruch 1-3 zur Her- Stellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die
Stressmetaphylaxe und zur Verhinderung oder Vorbeugung von Infektions- krankheiten nach Stress sowie bei der Infektionsprophylaxe im Rahmen von Operationen und zahnärztlichen Eingriffen.
6. Verwendung von einem der Stämme entsprechend Anspruch 1-3 zur Her- Stellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die Verwendung bei der Infektionsmetaphylaxe oder Therapie akuter viraler Infektionen beispielsweise des Respirationstraktes, der Papillomvirusinfektionen, der Infektion mit Heφesviren, der HIV-Infektion, der Virusinfektion innerer Organe wie beispielsweise der Infektion mit Hepatitisviren sowie die Ver- wendung bei Erkrankungen wie Multipler Sklerose, Asthma, Warzen und anderer Neubildungen der Haut.
7. Verwendung von einem der Stämme entsprechend Anspruch 1-3 zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die Ver- wendung an Wunden zur Beschleunigung von Wundheilungsprozessen und die Verwendung zur Unterstützung der Heilung schlecht oder nicht heilender Wunden und Ulcus cruris.
8. Verwendung von einem der Stämme entsprechend Anspruch 1—3 zur Her- Stellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die Verwendung bei Erkrankungen des allergischen Formenkreises, Psoriasis, Neuro- dermitis, anderen Autoimmunerkrankungen wie z.B. Lupus erythematodes, sowie zur Verbesserung des Wohlbefindens, z.B. im Alter.
9. Verwendung von einem der Stämme entsprechend Anspruch 1-3 zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die Verwendung gegen entzündliche, degenerative und proliferative Erkrankungen der inneren Organe (z.B. Morbus Crohn), der Haut, des Blutes, des Zentralnervensystems und seiner Anhangsgebilde einschließlich des Auges, ein- schließlich Krebs.
10. Verwendung von einem der Stämme von Parapoxvirus ovis entsprechend Anspruch 1-3 in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen zur antiviralen- oder Krebstherapie bei Mensch und Tier.
11. Verwendung von einem der Stämme von Parapoxvirus ovis entsprechend Anspruch 1-3 in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen für die orale Applikation und/oder in einer magensaftresistenten Formulierung für die orale Applikation.
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