WO2002002588A1

WO2002002588A1 - Composes dendrimeres de type carbosilane contenant des chaines glucidiques, son procede de production et agents neutralisants et antiviraux de la verotoxine

Info

Publication number: WO2002002588A1
Application number: PCT/JP2001/005717
Authority: WO
Inventors: Koji Matsuoka; Taiyo Terunuma; Hiromi Kuzuhara; Yasuo Suzuki; Yasuhiro Natori; Kiyotaka Nishikawa
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2002-01-10
Also published as: EP1302475A4; EP1302475A1; US20040040554A1

Description

明細書糖鎮含有カルボシランデンドリマ一化合物とその製造方法並びにべ'口毒素中和剤と抗ウィルス剤技術分野

この出願の発明は、抗ウイルス活性やべ口毒素に対する中和活性を有する糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物とその製造方法に関するものである。また、この出願の発明は、末端にウイルスを特異的に結合接着するシァリルラク卜ースを有する糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物とその製造方法に関するものである。背景技術

腸管出血性大腸菌 0— 1 5 7が産生するべ口毒素は、赤痢菌由来志賀毒素と類似した細菌毒素の A B ₅ フアミリーに属するタンパク質である。これらの毒素は、腎臓細胞上のグロボ卜リオシルセラミド（Gb₃、 Ga l a 1 -4Ga l β l -4G l e j8 1 -C e r ) 中のグロボ 3糖部分を認識し、接着することにより細胞内に取込まれ毒性を示すことが知られている。

そこで、この毒素の接着過程を効果的に阻害し、毒素を中和する物質に関する研究、開発が精力的に行われてきている。

ベロ毒素の中和活性を示す物質としては、これまでに S i 分子を分岐点とし、グロポ 3糖を均一に担持したカルボシランデンドリマーが見出されている。

しかしながら、これまでに報告されているこの種のカルボシランデンドリマーは、十分なベロ毒素中和活性を有するものではなく、実用性に欠けるものであった。そのため、より高いベロ毒素中和活性を有し、しかも化学構造の分子設計が容易で発展性のある新しいカルボシランデンドリマーが求められていた。

一方、インフルエンザウイルス等 φウィルスは、表面に種々のタンパク質を有し、これらのタンパク質が生体内の糖鎖等を認識し、接着することにより感染する。抗ウィルス剤としては、これらのタンパク質を阻害する働きを有する物質が一般的であり、各種のものが提供されている。

例えば、インフルエンザウイルス表面には、シアル酸を切除するシァリダ一ゼとシァリルラク卜一スを認識するへマグルチニンの二つのタンパク質が存在する。そして、従来の抗インフルェンザウイルス剤は、シァリダーゼの作用を阻害するシァリダーゼ阻害剤であった。

さらに、ウィルス表面のタンパク質の作用を阻害することにより、生体への感染を抑制する物質以外に、それらのタンパク質を特異的に認識し、接着させることのできる物質も抗ウイルス剤として有効と考えられる。このような物質は、医薬品として投与できるだけでなく、精度の高いウイルス除去フィルター充填材等として利用できることが斯待される。

このような観点から、この出願の発明者らは、インフルエンザウィルス等のウィルス表面に存在するへマグルチニンを特異的に接着し、体内でのウイルス感染を防止できる物質としてシァリルラク卜ースに着目した。しかし、このようなシァリルラク卜ースに関しては、これまでウィルスを効率よく接着できるような分子構造を有する誘導体は実現していなかった。そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、分子設計により分子量や形状さらには集積効率を調節でき、高いベロ毒素中和活性ゃ抗ウイルス活性を有する新しいカルボシランデンドリマー化合物を提供すること、さらには、シァリルラク卜一ス含有物質としてのカルボシランデンドリマー化合物を提供することを課題としている。発明の開示

この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして第 1 には、次式（ I )

(R¹)m-Si — -Si [R⁶1, [R^-Si (R⁷)k (R⁴— S— R⁵— A)₃— _k]_3-l

(ただし、式中の R R⁶および R⁷は、各々同一または別異に、置換基を有していてもよい炭化水素基を示し、 R²、 R³、 R⁴および R⁵は、各々同一または別異に、置換基を有していてもよい炭化水素鎖を示し、 Aは、糖鎖、 mは 0〜 3のいずれかの数、 nは 4 ~ 1 のいずれかの数であり、 m + n = 4、さら（こ、 1<は 0〜 2のいずれかの数、 I は 0 ~ 2のいずれかの数である）で表わされる糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物を提供する。

第 2 には、この出願の発明は、次式（I I)

(R¹)m~Si [― R²-Si (R⁶), (R⁴-S-R⁵-A)3., ] _n

(ただし、式中の R¹および R⁶は、置換基を有してもよい炭化水素基を示し、 R²、 R⁴および R⁵は、各々同一または別異に、置換基を有していてもよい炭化水素基を、 Aは糖鎖を示し、 mは 0 ~ 3のいずれかの数を、 nは 4〜 1 のいずれかの数を示し、 m + n = 4、さらに I は 0〜 2のいずれかの数である）で表わされる糖鎖含有カルボシランデン'ドリマ一化合物を提供する。

この出願の発明は、第 3 には、 R ¹がフエニル基、 mが 1 、が 3である前記いずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物を提供する。

さらに、この出願の発明は、第 4には、 R ¹がメチル基であり、 mおよび nが各々 2である前記いずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物を提供する。

この出願の発明は、第 5 には、糖鎖 Aが次式（I I I )

で表される前記いずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物を、第 6 には、糖鎖 Aが次式（I V)

(ただし、 Rは水素原子またはァセチル基、 R 'は水素原子またはメチル基である）で表される前記いずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物を提供する。 '

この出願の発明は、第 7には、前記式（ I ) の化合物の製造方法であって、次式（V)

(R¹)m~Si — R²-Si [R⁶], [R^-Si (R⁷)k (R⁴— X)₃._k]₃-i (V)

(ただし、 R'、 R K R³、 R⁴、 R⁶、 .R⁷、 m、 n、 k、 I は前記のとおりのものを示し、 Xは八ロゲン原子を示す）で表わされるハロゲン化合物を、次式（VI)

A― R⁵— S— Y ( VI )

(ただし、 R⁵および Aは前記のとおりのものを示し、 Yは反応離脱性の保護基を示す）で表わされるスルフィド化合物と反応させることを特徴とする糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物の製造方法を提供する。

さらに、第 8には、この出願の発明は、前記化合物（I I) の製造方法であって、次式（VI I)

(R m-Si -R²— Si (R°), (R— )₃-ι (VII)

( R¹、 R²、 R⁴、 R⁶、 m、 n、 I は前記のとおりのものを示し、 Xはハロゲン原子を示す）で表わされるハロゲン化合物を、次式 (VI)

A― R⁵-S— Y ( VI )

( R⁵および Aは前記のとおりのものを示し、 Yは反応離脱性の保護基を示す）で表わされるスルフィドヒ合物と反応させることを特徴とする糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物の製造方法を提供する。

第 9には、この出願の発明は、式（VI)において、 Aが次式（I I I)

で表される糖鎮含有カルボシランデンドリマー化合物の製造方法を提供する。

また、第 1 0には、この出願の発明は、式（VI) において、 A が次式（IV)

(IV)

で表される糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物の製造方法を提供する。

さらに、第 1 1 には、この出願の発明は、前記第 9および 1 0 の発明において、式（VI) における丫がァセチル基である糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物の窭造方法を提供する。

この出願の発明は、第 1 2には、前記第 1 0の発明の化合物の製造方法であって、 N—ァセチルノイラミン酸のチ才メチルダリコシド体とラク卜一スの卜リメチルシリルェチルダリコシド 3 '， 4 ' ジオール体をグリコシデーシヨンした後、次式（VI I I) (VIII)

で表されるシァリルラク卜ース誘導体にチ才酢酸をラジカル付加し、次式（IX)

で表されるァセチルチオ誘導体とした後、式（V) または（VI I) のカルボシランデンドリマーと縮合することを特徴とする糖鎖含有力ルポシランデンドリマー化合物の製造法を提供する。

そして、第 1 3 には、この出願の発明は、前記のいずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物を有効成分として含有するべ口毒素中和剤を、第 1 4には同成分を有効成分とする抗ウイルス剤をも提供する。図面の簡単な説明

図 1 は、この出願の発明の実施例において、この発明の化合物について、単独で 50 g/g体重マウスに投与した場合（〇）、 Stx2 のみを単独で致死量（0.25ng/g 体重）投与した場合（X)、および Stx2 (0. 25ng/g体重）を各々の化合物（50j g/g体重）とともに投与した場合（秦）のマウスの生存率を示す図である。図 2は、この出願の発明の実施例において、致死量（0. 25ng/g体重）の Stx2 と各濃度（1.5、 5、 15、 50Atg/g 体重）のこの発明の化合物を投与した場合のマウスの生存率を示す図である。（： 1.5^g/g 体重、 △ ： 5.0 μ g/g体重、〇： 15/ g/g体重、 □ ： 50 g/g体重、 X ：化合物非添加）発明を実施するための最良の形態

この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

この出願の発明が提供する前記化合物（ I ) (I I) においては、いずれの場合も、符号 R²、 R R ⁴および R ⁵は、同一または別異の置換基を有していてもよい炭化水素鎖であるが、これらの炭化水素鎖としては、直鎖または分岐鎖状の脂肪族炭化水素鎖、脂環式炭化水素鎖、芳香族炭化水素鎖のうちの各種のものであってよい。なかでも、アルキレン鎖が代表的なものとして示される。たとえば一（C H₂し一（ただし、 r = 2 ~ 6 ) が例示される。また、 R¹、 R^sおよび R⁷の置換基を有していてもよい炭化水素基も上記と同様のものとして、各種のものでよく、たとえば、アルキル基、シクロアルキル基、ァリール基、ァリールアルキル基等が例示される。

これらの炭化水素鎖が炭化水素基については、適宜な置換基を有していてもよい。たとえば炭化水素基や、アルコキシ基、エステル基等である。

符号 Aの糖鎖については、糖分子によって構成される連結構造部であって、各種の態様であってよい。具体的には、 Aとしては、次式（I I I) で表されるグロボ 3糖や（IV) で表されるシァリルラク卜一スが代表的なものとして例示される。

糖鎖 Aは、符号 R⁵の炭化水素基に対して、化学式（III) 場合にょうに炭素—炭素結合していてもよく、化学式（IV) の場合にように、エーテル結合等の各種の異種原子を介して結合していてもよい。

この発明の化合物（ I ) (I I) についてその代表的な構造のものを例示すると次のようなものが挙げられる。

① ②

化合物（ II ) 化合物（ I ) m = 1 m = 2 n = 3 n = 2 I = 0 k = 0

I = 0 略称： Fan ( 1 ) 9型略称： Dumbbel I ( 2 ) 1 8型

化合物（ I )

m = 0

n = 4

k = 0

I = 0

略称： Bal I ( 2 ) 3 6型上記式中の波線部は、 R ²、 R⁴、 R ⁵等を示し、たとえば一（C 1"1₂)₄_ゃ一（〇 H₂) ₃—等のアルキレン鎖である。また、〇印部は、前記の式（I I I) jlV)に代表される各種の糖鎖を表す。

これらの化合物例においては、糖鎖部が 9個のファン（Fan) 型のカルボシランデンドリマー化合物① （略称： Fan (1) 9 型）は、 R ¹がフエニル基で mが 1 、 nが 3、 I が 0の化合物（ II ) を例示しておリ、また、糖鎖部が 1 8個のダンベル（Dumbbel l) 型の力ルポシランデンドリマー化合物②（略称： Dumbbel I (2) 18型）は、 [^がメチル基で171が 2、 nが 2、 kおよび I が 0の化合物（ I ) を、そして、糖鎖部が 3 6個のポール（Bal l) 型のカルボシランデンドリマ一化合物③ （略称： Bal I (2) 36 .型）は、 mが 0、 nが 4、 kおよび I が 0の化合物（ I ) を各々例示している。

この発明の前記化合物（ I ) (I I) の製造については、前記のとおり、ハロゲン化物（V) または（VI をスルフィド化合物（VI) と反応させることによって実現される。このとき、糖鎖 Αは、前記の式（I I I) や式（IV) のものが例示される。また、スルフィド化合物（VI) において、反応離脱性保護基 Yは、たとえばァセチル基とすることが好ましい。

さらに詳しく説明すると、たとえば次の手順が採用される。 < 1 >カルボシランデンドリマ一骨格の合成

クロ口シランを原料として、グリニャール反応によりァリル基を導入し、ヒドロケィ素化反応、グリニャール反応を繰り返すことにより化合物（ 1 ) (I I)のいずれかに対応する骨格を形成する。得られたデンドリマーの末端ァリル基は、ヒドロホウ素化反応により相当するアルコールへと変換し、次いで常法によリメシル化後、臭化ナトリウムで処理することにより、末端が臭素原子で置換されたハライド化合物へと効率良く変換することができる。たとえば以上のようにして、前記の化合物（V) または（VI I) が準備される。ハロゲン原子（X) は、上記のような臭化ナトリゥ厶に由来して臭素でもよいし、あるいは塩素、沃素等の他のものでもよい。

< 2 >糖鎖誘導体の形成

たとえばグロボ 3糖（I I I) 誘導体は次のようにして合成することができる。すなわち、グロボ 3糖骨格は、 D—ガラク卜一スと D—ラク卜一ス由来 nーブテニル βーグリコシドからそれぞれ誘導した糖供与体と糖受容体との一段階のグリコシデーションにより構築する。さらに種々の保護脱保護を経た後、プテニル基へのベンジルメルカプタンのラジカル付加、最終的な保護基の除去を行いデンドリマーとの結合'用前駆体を調製することができる。たとえばこのようにして、前記の化合物（VI) が準備されることになる。反応離脱性の保護基（Y ) については、上記のようにしてべンジル（Bn) 基でもよいし、他種のものであってもよい。一方、シァリルラクトース（IV) 誘導体は、次のように合成することができる。

すなわち、公知の方法により合成される N—ァセチルノイラミン酸のチオメチルダリコシド体（ A. Hassega a, et al. , Carbohydr. Res. , 212, 277-281 (1991) ) をシアル酸ドナーとし、公知の方法により合成されるラク卜一スの卜リメチルシリルェチルグリコシド 3 ', 4 ' ジ才一ル体（K. P. R. artha, et al. , J. Carbohydr. Chem. , 8, 145-158 (1989)をラクト一スァクセプターとし、両者をグリコシデーシヨンした後、ァグリコンをペンテ二ル基とすればデンドリマーとの結合用前駆体（シァリルラク卜一ス誘導体）が得られる。

< 3 >カルポジランデンドリマ一骨格と糖鎖の結合反応

これまでに発明者らが開発した液体アンモニア中でのワンポッ卜法を用いることができる。すなわち、まず、グロボ 3糖由来の前記べンジルスルフィド誘導体からパーチ還元にょリチオアニォンを生成させ、続いてデンドリマ一上の臭素原子との S N 2反応を同一容器内で行うことにより目的化合物（ I ) または（I I) を得ることができる。

シァリルラクトース（IV) のカルボシランデンドリマーへの導入については、前記のシァリルラク卜ース誘導体にチォ酢酸をラジカル付加し、化学式（V I I I ) のァセチルチオ誘導体とした後、末端に臭素や塩素等のハロゲン原子を有するカルボシランデンドリマーと縮合する方法が適用できる。また、これを脱保護することにより、前記一般式（I V) において.、 Rおよび R 'が水素原子となったカルボシランデンドリマーが得られるのである。

以上のとおりの製造法において、反応の各ステップは、酸化、還元、付加、縮合、置換、保護、脱保護、イオン交換等の公知の化学実験的手法によりなされるものである。前記（I V) のシァリルラク卜一スを末端に結合したデンドリマ一については、これまで合成例が全くなかったものである。各反応の溶媒、温度、圧力等の条件はとくに限定されない。

したがって、この出願の発明の糖含有カルポシランデンドリマ一化合物は、カルボシランデンドリマー部位の分子設計や合成が比較的容易であり、用途に応じて分子の大きさゃデンドロサブュニットの密度（パッキング）、糖鎖数をも調整できるものである。また、糖鎖部分を変更することによって、適用対象を幅広く変化させることができるという特徴も有している。また、この出願の発明の糖含有カルボシランデンドリマーは構造上毒性が低い点でも特徴的である。—

さらに、この出願の発明の化合物（ I ) ( I I ) は、大腸菌 O— 1 5 7が産生するべ口毒素に対しての中和活性を有している。特に前記のダンベル（D um b b e l I )型の化合物には優れたべ口毒素中和活性が認められる。また、これらの化合物は、インフルエンザゃェィズ等のゥィルスに対する阻害剤としても適用可能である。

とくに、今回初めて合成された糖鎖 Aとして（I V) のシァリルラク卜一スを有するカルポシランデンドリマーは、シァリルラク卜一スがゥィルスと特異的に結合できることから、ゥィルスを効率よく接着できる物質である。したがって、体内に摂取すれば、ゥィルスの感染を防止する抗ウイルス薬剤有効成分として作用し、また、空気等の環境中からウィルスを特異的に接着除去するフィルター用充填材としても有用である。

以下、実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらにしく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。実施例

<参考例 1> 末端に臭素原子を有するカルボシランデンドリマ一の合成（A)

次の反応式に従って末端に臭素原子を有するカルボシランデンドリマーを合成した。

( 1 ) Dial lyldimethylsi lane (化合物 i )

アルゴン雰囲気下、ジクロロジメチルシラン（0.40niL, 77.5 mmol) を蒸留したジェチルエーテル（20mL) に溶解し、氷冷下、 1Mァリルマグネシウムプロミド ■ ジェチルェ一テル溶液（232ml， 232mmol) を滴下し、 5 0 °Cで 8時間攪拌した。反応終了後、氷冷下 1 規定塩酸（約 150mlJ を加え、ジェチルエーテルで抽出し、蒸留水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナ卜リゥ厶で乾燥した後、溶液をろ過して濃縮した。残渣を減圧蒸留（54關 HgZ 5 8 °C) により精製し、液状の化合物 ί (7.48g, 68.8¾) を得た。

表 1 に同定結果を示した。

表 1

1H NMRd(200 MHz, CDC1₃), 0.01(s, 6H, 2Me), 1.54(m, 4H， 2SiCH₂ CH=CH₂)， 5.23(m, 4H, 2SiCH₂CH=CH₂)， 5.78(m, 2H, 2SiCH₂CH=CH₂)

( 2 ) Bis (trial lylsi ly I propyl ) dime thy Isi lane (ィ匕合物 i i) アルゴン雰囲気下、化合物 i (7.00g, 49.9mraol) を蒸留した T H F (50mL) に溶かし、 Speier触媒（0.1Mへキサクロ口白金（IV) 酸六水和物 ·ィソプロパノール溶液）を触媒量滴下した。続いて、氷冷下、卜リクロロシラン（20.1mL, 200mmol) を滴下し、蒸留 T H F (30mいで滴下ロー卜を共洗いした。室温で 18.5時間攪拌した後、反応液を常圧蒸留（ 7 5 ~ 8 0 °C) し、溶媒と過剰のトリクロロシランを留去した。そこへ、蒸留した T H F (60mL) を加え、氷冷下、〗Mァリルマグネシウムプロミド · ジェチルエーテル溶液（645ml, 645mmol) を滴下し、 0 °Cで 1 時間、室温で 1 . 5 時間、 5 0 °Cで 1 8時間攪拌した。反応終了後、氷冷下、 1 規定塩酸（約 500mL) を加え、ジェチルエーテルで抽出し、蒸留水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶液をろ過して濃縮した。残渣をシリカゲルクロマ卜グラフ（へキサンのみ）で精製し、液状の化合物に I (8.33g, 37.5¾) を得た。

同定結果を表 2に示した。

15

差替え用（規則 23) 表 2

1H NMR （200 MHz, CDC1₃), -0.05(s, 6H， 2Me)， 0.61(m,8H, 2SiMe₂ CH₂CH₂CH₂Si)， 1.33(m, 4Η, 2SiMe₂CH₂CH₂CH₂Si), 1.59(m, 12H, 6Si CH₂CH=CH₂), 4.88(m, 12H, 6 SiCH₂CH=CH₂), 5.80(m, 6H， 6 SiCH₂

CH=CH₂)

( 3 ) Bis [tris (3-hydroxy ropy I) si lylpropyl] dimethylsi lane (化合物 i i i)

アルゴン雰囲気下、化合物 i i (3.00g, 6.74mmol) を蒸留した T H F (90mL) に溶かし、氷冷下、 1. OM BH3- THF錯体 · T H F溶液（27.0mL, 27. Ommol) を滴下し、室温で 2 0時間攪拌した。その後、氷冷下、蒸留水（7.28mL, 405mmol) を滴下し、水冷下、 3.0M 水酸化ナ卜リゥム水溶液（8.99mし 27· Ommol)、 3 0 %過酸化水素水（9. 17mL, 80.9mmol) を順に加え、室温で 2時間攪拌した。反応終了後、氷冷下、硫酸鉄（I I)七水和物（22.5g, 80.9mmol) を少量の水に溶かして加え、 1 時間攪拌した。二層に分かれた反応液の上層をデカン卜して三角フラスコへ移し、そこへ食塩を加えることで T H F層と水層とに分け、 T H F層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶液をろ過して濃縮した。残渣をシリカゲルカラ厶フロマ卜グラフ（6:1 クロ口ホルム：メタノール）で精製し、液状の化合物 i i i (1.82g, 48.9) を得た。

同定結果を表 3に示した。

16

差替え用紙（規則 2G) 表 3

¾ NMR 5 (200 MHz, DMSO-de), -0.12(s, 6H， 2Me), 0.44(m, 20H, 2Si

Me₂CH₂CH₂CH₂Si, 6SiCH₂CH₂CH₂OH), 1.31(m, 16H, 2SiMe₂CH₂CH₂

CH₂Si, 6SiCH₂CH₂CH₂OH), 3.28(t, 12H, 6SiCH₂CH₂CH₂OH)

Anal. Calcdfor C26¾₀O₆Si₃(553.01)： C, 56.47; H, 10.94. Found C， 56.21; H， 11.10 さらに、化合物 i ί i をメシル化して、液状の B i s [t r i s (3-bromopropy I) si lylpropyUdimethylsi lane (ィヒ合物 i v： 420mg, 55.0¾) を得た。表 4に同定結果を示した。

表 4

IR(neat) 1239 cm^-1(CH₂Br)

1H NMR 5 (200 MHz, CDC1₃), -0.02(s, 6H, 2Me), 0.62(m, 20H, 2SiMe₂ CH₂CH₂CH₂Si, 6SiCH₂CH₂CH₂Br), 1.30(m, 4H, 2SiMe₂CH₂CH₂CH₂Sり

1.81(m, 12H, 6SiCH₂CH₂CH₂Br)， 3.39(t, 12H, 6SiCH₂CH₂CH₂Br)

<参考例 2 > 末端に臭素原子を有するカルポシランデンドリマ —の合成（ B )

参考例 1 と同様に、下記反応式に従って、カルボシランデンドリマー骨格を有するハラィド化合物を合成した。

差替え用紙（則 26) CM

O

<参考例 3 > 糖鎖誘導体の合成（A)

1 7；7]1

差替え用紙（規則 ) 次の反応式に従って、グロボ 3糖のベンジルスルフィド誘導体を合成した。

0¾

1 8

差替え用紙（規則 2δ) すなわち、まずラク卜ースのァグリコンを、後の脱ベンジル化にも耐えるようなブテニル基へ変換し、 4 ' O H基のみ遊離の化合物 1 へと誘導した。そして、触媒を用い、既知のガラク卜シル供与体 2とグリコシデーシヨンを行い、 3糖誘導体 3を得た。バーチ還元により脱べンジル化した後、保護基をァセチル基へと変換し、ブテニル基へベンジルメルカブ夕ンをラジカル付加させ、脱 0 —ァセチル化して 4を合成した。

1 8ί?η

差替え用紙（規則 26) <参考例 4 > 糖鎖誘導体の合成（ B)

次の反応式にしたがって、シァリルラク卜ース誘導体を合成した。

1 7>2

差替え用紙（規則 2β) ( 1 ) Pentenyl [Methyl (5-acetam i do-4, 7, 8, 9-tetra-O-acety l- 3, 5-d i deoxy-D-gl ycero- -D-ga I acto-2-nonu lopyranosyl) o ate]- (2 → 3) -0- (2, 4, 6-tri-O-acetyl- β -D-galacto- pyranosy I) - (1→4) -2, 3, 6- 1 r i-O-acetyト /3 - D_ gl ucopyranos i de

(化合物 vi)

α — トリクロロアセ卜イミデ一卜体（化合物 v : 1.032mg, 0.853匪 o I ) をジクロロメタン（24· OmL) に溶解し、 4 —ペンテン - 1 —オール（0· 432mL, 4.265mmol)、 M S 4 A (2. Og) を加え、一 2 5 °Cに冷却した。ボロントリフル才リドエチルェ一テル錯体 (215 し 1, 71 O I) を加え、 2 0分間攪拌した後、反応液を一 5 °Cに戻し、さらに 4時間攪拌した。反応液をろ過し、セライトろ液を冷飽和炭酸水素ナ卜リゥ厶水溶液、飽和食塩水の順に抽出を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。この有機層をろ過し、ろ液を濃縮後、シリ力ゲルカラムクロマ卜グラフィー〔クロロホルム一メタノール（20:1 v/v)〕で精製し、泡状の 3糖ペンテニルダリコシド誘導体（化合物 vi ： 816mg, 84.3%) を得た。表 5に同定結果を示した。

19 嗨^ ·

R/0.5 [10:1 (v/v) chloroform-methanol]; Γα]₀ ¹⁰ -6.865 ⁰ (c 2.020, CHC1₃);

N. M. R. data： 1H (CDC1₃)， δ 5.78 (m, 1 H， -CH=CH₂), 5.54 (m, 1 H, H-8"), 5.39 (dd, 1 H， J₆',_T =

2.7 Hz, J _>8« = 9.3 Hz, H-7"), 5.18 (t， 1 H， ₃ = J₃.₄ = 9.3 Hz, H-3), 5.08 (d, 1 H, J _s- = 10.2 Hz,

NH), 5.02-4.85 (m, H-2, H-2', H-4', -CH=C¾), 4.67 (d, 1 H, J_r>2. = 10.0 Hz, H-l，)， 4.52 (dd, 1 H,

J2-.3' = 10.2 Hz, /₃',₄. = 3.3 Hz, H-3'), 4.45 (d, 1 H, J_1>2 = 8.0 Hz, H-1), 4.43 (m, 2 H， H-6b, H-9"),

4.18 (dd, 1 H， J5,_6a = 5.4 Hz, J_6a>6b = 11.9 Hz, H-6a), 4.02 (m), 3.87 (m, 3 H, H-4, one of OCH₂-， •CH), 3.84 (s, 3 H， COOC¾), 3.63 (dd, 1 H, J_s',₆" = 10.8 Hz, J ' = 2.7 Hz, H-6"), 3.59 (m, 1 H,

H-5), 3.49 (dt, 1 H, J^ = 9.6 Hz, J_vic = 6.7 Hz, one of O ¾-), 2.58 (dd, 1 H， J_{T ye} = 12.6 Hz, r

o J3»_e,4" = 4.5 Hz, H-3"eq), 2.25， 2.16, 2.09， 2.08， 2.06, 2.04, 2.03, 2.01， and 1.86 (each s， 33 H, NHAc,

OAc), 2.08 (m, OCH₂CH₂C¾CH=CH₂), 1.66 (m, OCH₂CH₂-， H-3"ax). n

N. M. R. data： ¹³C (CDC1₃), δ 170.66, 170.51, 170.48, 170.45, 170.35， 170.25, 170.17, 170.05,

169.65, 169.54， 169.48, 169.44, 167.81, 137.68, 114.91， 100.82, 100.40, 96.63, 76.19, 73.27， 72,45，

71.86， 71.70， 71.20， 70.30, 69.77, 69.20, 69.13， 67.70, 67.14, 66.78, 62.20, 62.12, 61.37, 52.98，

48.88, 37.25, 29.67, 28.44, 22.99, 2L36^20.78, 2067^θΤ62, 20.56, 20.52， 20.45.

I. R. data (KBr)： v (cm¹) 2949 (C-H), 1745 (C=0, ester), 1674 (C-0, SAc, amide), 1554 (N-H, amide), 1230 (C-O, ester), 1045 (C-O, ether).

Anal. Calc. for 0₄₉¾₉ 0₂₉： C， 51.80; H, 6.12; N, 1.23 %. Found: C, 51.50; H, 6.14; N, 1.19 %.

( 2 ) Penteny I (5 - acetami do- 3， 5-d i deoxy-D-gl ycero- a - D-galacto - 2 -議 ulopyrano- syl icacid) - 0 - β -D-ga I act opyranosy I - (1→4) -0- )8 -D-gl ucopyranos i de (化合物 vi i) 化合物 vi (50. Omg, 0. 0440mmol) をメタノール（1. Omいに溶解した。 1M ナ卜リウ厶メトキシドーメタノール溶液（44M L) を加え、室温で一晩攪拌した。反応液を強酸性陽イオン交換樹脂 IR-120B (H+型）（2mいで中和後、イオン交換樹脂をろ取し、ろ液を濃縮した。残渣に 0. 05M水酸化ナ卜リゥ厶水溶液（2mL)を加え、室温で 2 時間攪拌した。反応液を強酸性陽イオン交換樹脂 IR-120B (H+型）（1mL) で中和後、イオン交換樹脂をろ取し、ろ液を濃縮し、シァリルラク卜ース誘導体（化合物 vH :26. 0mg， 84.4¾) を得た。

20 /ι1

え用紙（規則 2

H-3"eq), 2.02 (q, 2 H,J = 7.1 Hz, -CH₂CH=C¾), 1.91 (s， 3 H, NDAc), 1.77 (t， 1 H， J_TA,4- = 12.1 Hz, H-3"ax), 1.60 (m, 2 H, OCH₂C¾CH₂).

I. R. data (KBr)： v (cm¹) 3394 (O-H), 2937 (C-H), 1732 (C=0, カルボン酸)， 1639 (C=0, amide), 1560 (N-H, amide), 1036 (C-O, alcohol, ether), 619 (N-H, 面外縦ゆれ).

Anal. Calc. for C₂₈H 7Ni0₁₉-1.5H20： C， 46.15; H， 6.92; N, 1.92 %· Found: C， 46.29; H, 6.77; N, 1.82 %.

( 3 ) ω - Acetyl thi o- pent any I [Methyl (5 - ace t ami do- 4, 7, 8， 9 - tetra-O-acety 1-3, 5-d i deoxy-D-gl ycero- a -D-ga I acto-2- nonulopyranosyl) onateJ- (2 → 3) -0- (2, 4, 6-tris-O-acety I- β -D-ga lactopyranosyl) - (1 ^→ 4) -2, 3, 6-tr i-O-acetyl- β -D-gl ucopyranos i de (化合物 vi i i)

空冷管をつけたフラスコ中、化合物 vi dOOmg, 0. 0881mmol) を 1 ， 4—ジォキサン（ 209 いに溶解し、チォ酢酸（209 ^し 3. Ommol) を加え、 5 0 °Cに加熱した。 A I BN ( 24.6mg, 0. 150mmol) を加え、 8 0 °Cに加熱攪拌した。 3時間攪拌後、室温に冷却し、シクロへキセン（608 tいを加え、数分攪拌した。反応液に卜ルェンを加え、共沸濃縮後、クロ口ホルムで希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順に抽出を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。この有機層をろ過し、ろ液を濃縮後、シリ力ゲルカラ厶クロマ卜グラフィー〔クロ口ホルム 100%→ クロ口ホルム一メタノール（30:1 v/v)〕で精製し、 3糖一 ω—ァセチルチオペンチルグリコシド誘導体（化合物 V i i i ： 105mg,

2 1 ;/f1

差替え ^紙（規則 26) ¾ *喻 λ

R/0.51 [10:1 (v/v) chloroform-methanol]; [ct]_D ²。 -6.276 °( 1.29， CHC1₃);

N. M. R. data： 1H (CDC1₃), δ 5.49 (m, 1 H， H-8"), 5.39 (dd, 1 H, J₆",ァ' = 2.8 Hz, J_r,s" = 9.4 Hz,

H-7")， 5.18 (t, 1 H, J_¾3 = J₃ = 9.4 Hz, H-3), 5.12 (d, 1 H， J ' = 9.9 Hz, NH), 4.93 (dd, 1 H， J_r,₂' =

8.1 Hz, J₂.,3. = 10.3 Hz, H-2'), 4.88 (m, H-2, H-4", -CH), 4.67 (d, 1 H, H-1'), 4.52 (dd, 1 H, J₃',₄， =

3.3 Hz, H-3'), 4.45 (d, 1 H, J_1>2 = 7.7 Hz, H-1), 4.43 (m, H-6b， H-9", -CH), 4.18 (dd, 1 H， =

11.9 Hz, J_5i6a = 5.4 Hz, H-6a), 4.09-3.82 (2m), 3.84 (s， 3 H， COOCH₃), 3.63 (dd, 1 H, J_y,₆" = 10.7

Hz, J₆", = 2.6 Hz, H-6"), 3.59 (m, 1 H, H-5), 3.46 (dt, 1 H， = 9.7 Hz, J_vk = 6.6 Hz, one of

OCH2-), 2.85 (t, 2 H, J = 7.2 Hz, SCH₂-), 2.58 (dd, 1 H, J₃»a,re = 12.7 Hz, J _eA« = 4.6 Hz, H-3"eq),

2.32 (s， 3 H， SAc), 2.24 (s， 3 H, NHAc), 2.16， 2.094, 2.086, 2.086, 2.077, 2.061, 2.040, 2.040, 2.008,

and 1.855 (each s， 30 H， 10 OAc), 1.61 (m, 5 H， H-3"ax, OCH₂C¾CH₂C¾CH₂S), 1.39 (m, 2 H，

I. R. data (KBr)： v (cm"¹) 2959 (C-H), 1756 (C=0， ester), 1689 (C=0， SAc, amide), 1544 (N-H,

amide), 1436 (C-N), 1250 (C-0, ester), 1040 (C-0, ether), 631-603 (N-H, 面外縦ゆれ).

FAB-MS Calc. for CsiHvs iOaoSi [M+H]⁺： 1212， [M+Na]+： 1234. Found： [M+H]⁺： 1212,

[M+Na]⁺ : 1234.

Anal. Calc. for

C, 50.53; H, 6.07; N, 1.16 %, Found: C， 50.03; H， 6.03; N， 1.14 %.

07 ぐ実施例 1 > 糖鎖含有カルポシランデンドリマー化合物の合成 ( 1 ) 参考例 3により得られたベンジルスルフィド誘導体 4をバ —チ還元し、チオア二オンを生成させ、そのまま液体アンモニア中で、上記の参考例 2において合成した B r原子を持つデンドリマーハライド化合物と S N 2反応させることで、グロポ 3糖を 1 8個含む、ダンベル型構造の糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物（次式の化合物 a ) を合成した。

2 2； ?：1

差替え用 ¾ (規則 2G)

この物 a ：略称 Dumbbel I ( 2 ) 1 8の物性値は、表 8のとおりであった。

表 8

MaLDI-TOF-MAS [M+Na]⁺

実測： 12049.9

計算： 12048.6

IR (KBr) (cm—¹)

3361 {v O-H) , 2915 (Z/ _G一 _H), 1420 (v _{S G}), 1274 (v _C-o-c 706 ( V _{s C}) 上記物性値とともに、 H N M R ( D₂0)、 C N M R ( D₂0) の結果から、化合物 aを同定した。

( 2 ) 同様にして、次の反応式に従って、グロボ 3糖を 3 6個含む、ボール型構造の糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物（化合物 b ) を合成じた。

23

この化合物 b ：略称 Bal I ( 2 ) 3 6の物性値は、表 9のとおりであった。

表 9

MaLDI-TOF-MAS [M+Na]⁺

実測： 23988.2

計算： 23986.1

IR ( Br) (cm^-1)

3402.1 ( v O-H) , 2914 (y _G— _Η)， 1417 (y _Si__c), 1076 ( _c一。一 _G), 702 ( v _Si__c) CNMR (D₂0)

δ =103.41, 102.5, 100.46, 78.71, 77.54, 75.60， 74.95, 74.71,

73.13, 72.40, 71.04, 70.99, 69.97, 69.31, 69.10, 68.75, 60.72,

60.58, 60.43, 35.95, 31.84, 28.81， 26.08， 24.44,

GK23.39, 19.29, 19.05), G0(18.02， 15,26， 13.53), 12.12

化合物 bの同定には、 H N M R ( D_zO) の分析値も用いた。

( 3 ) 同様にして、グロボ 3糖を 9個含む、ファン型構造の糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物（次式の化合物 c ) を合成した。

24

c

この化合物 c ：略称 Fan ( 2 ) 9の物性値は、表 1 0のとおリであった。

表 1 0

FAB-MS [ +H]⁺

実測: 6019.7

計算： 6019.3

IR (KBr) (cm—¹)

3393 ( V。一 H) , 2915 _{G Η}), 1419 ( _Si__G), 1073 _c_₀__c), 707 ( V _Si__c)

CNMR (D₂0)

5=103.48, 102.54， 100.55, 78.78, 77.60, 75.68, 75.01, 74.81,

73.26, 72.46, 71.14, 70.05, 69.51， 69.27, 69.05, 68.71, 60.77,

60.65, 60.42, Gl (35.88, 31.84, 28.89， 26.12， 24.51)，

GO (21.07, 18.94, 17.74), 12.11

( 4 ) 同様にして、グロボ 3糖を 4個含む、ダンベル型構造の糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物（次式の化合物 d ) を合成した。

25

d

この化合物 d ：略称 Dumbbel I ( 1 ) 4の物性値は、表 1 1 のとおりであった。

表 1 1

FAB-MS [M+H]⁺

実測： 2764.1

計算： 2764.1

IR (KBr) (cm一¹)

3400 ( V O-H) ,2911 {v _c— _H)， 1419 (y _Si一 _c), 1073 (2/ _G一 ₀__c), 705 ( v _Si一 _c)

CNMR (D₂0)

δ =103.43, 102.57, 100.49, 78.71, 77.55, 75.63, 74.96, 74.74,

73.14, 72.42, 71.05, 71.05, 69.92, 69.34, 69.12, 68.76, 60.74,

60.60, 60.44, GI (35.87， 31.81， 28.84, 26.92， 24.45),

GO (20.32， 18.80, 18.80)， GI (13.50), Me (-2.31,-4.43) なお、化合物 dの同定は、 H N H Rでも行った。

<実施例 2 >

次の反応式にしたがって、各種の糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物を合成した。

26

O = (viii)の三糖部分：（ix)

= (vii)の≡糖部分： (xi)

(vii)の三糖部分： (xii)

( 1 ) Fan- (0) 3— 2， 3 _ S L a c— A c (化合物 ix) 略称： Fan (0) 3 - Brデンドリマ一（6.48mg， 0.013748mmol) と 3糖オメガ—ァセチルチオペン夕ナルグリコシド誘導体（化合物 viii： lOOmg, 0.08249mmol) を D M F (0.2mL) に均一系になるまで溶解した。溶解後、メタノール（0.2mU を加え、 1 時間室温で攪拌した。ナトリウムメトキシド（4.90mg) を加え、一晚攪拌した後、酢酸（0.1mU を加え、数分間攪拌し、濃縮した。濃縮後、無水酢酸（2mし）、ピリジン（2mL) を加え攪拌し、ァセチル化完了後反応液を濃縮し、冷 1M塩酸、飽和食塩水の順にク口口ホルムで抽出を行い、有機層を無水硫酸ナ卜リウ厶で乾燥した。この有機層をろ過し、ろ液を濃縮後、メタノール、ジェチルエーテルに溶解し、ジァゾメタンエーテル溶液を滴下した。反応液に酢酸を加え、濃縮後、シリカゲルカラムクロマ卜グラフィー〔クロ口ホル厶ーメ夕ノール（30:1 v/v)、フラッシュシリカゲル 20mL〕で精製し、さらにセフアデックス LH- 20 (MeOH) によるゲルろ過精製を行い、 Fan (0) 3-2, 3-SLac-Ac (化合物 ix： 41.2mg, 80.2%)を得た。表 1 2に同定結果を示した。

27 β嗨 ¾ ^

Ν. Μ. R. data： 1H (CDC1₃), δ 7.40 (m, 5 ¾ Ph), 5.53 (m, 3 H, H-8"), 5.39 (dd, 3 H, " , = 2.7 Hz,

J_r,s" = 9.1 Hz, H-7"), 4.52 (dd, 1 H， J₂'，₃' = 10.2 Hz, Jy_A- = 3.2 Hz, H-3，)， 3.84 (s, COOCH₃), 2.58

(dd, J₃»a.3"c = 12.6 Hz, J₃"_e>4» = 4.6 Hz, H-3"eq), 2.49 (t, J_vic = 7.0 Hz, SC¾-)， 2.43 (t, J_vic = 7.0 Hz,

00 SCH2-), 2.25-1.85 (each s， NHAc, OAc), 1.55 (br, OCH₂C¾CH₂CH₂CH₂S)， 1.39 (br, 6 H,

-C¾CH₂CH₂S), 0.92 (br, 6 H, SiC¾). t

I. R. data (KBr)： v (cm ¹) 2941 (C-H), 1749 (C=0， ester), 1687 (C=0, amide), 1543 (N-H, amide), 1435 (C-N), 1230 (C-O, ester), 1039 (C-O, ether).

FAB-MS Calc. for C₁₆₂H23₃N₃0₈₇S₃Si [M+Na]⁺： 3761.2785. Found： [M+Na]⁺： 3760.84.

( 2 ) Dumbbel I (1) 6 - 2 , 3 - S L a c - A c (化合物 x ) 略称： Dumbbel I (1) 6-Br デンドリマー（化合物 iv ： 12.8mg, 0.01375mmol)と化合物 vi i i (200tng, 0.165mtnol)を D M F (0.2mいに均一系になるまで溶解した。溶解後、メタノール（0.2ml_) を加え、 2時間室温で攪拌した。ナトリウムメトキシド（9.8mg, 0.182mmol) を加え、一晩攪拌した後、酢酸（0.1mL) を加え、数分間攪拌し、濃縮した。濃縮後、無水酢酸（1mい、ピリジン（1mL) を加え攪拌し、ァセチル化完了後反応液を濃縮し、冷 1M塩酸、飽和食塩水の順にクロ口ホルムで抽出を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。この有機層をろ過し、ろ液を濃縮後、メタノール、ジェチルエーテル（1:1 (v/v) ) に溶解し、ジァゾメタンエーテル溶液を滴下した。反応液に酢酸を加え、濃縮後、シリカゲルカラ厶クロマ卜グラフィ一〔ク口口ホル厶一メタノール（30:1 ν/ν) , シリカゲル 30mL〕で精製して、 Dumbbel I (1) 6-2, 3- SLac-Ac

(化合物 x ： 79mg, 76.7%) を得た。

表 1 3に同定結果を示した。

28l7i1

差替え用紙（規則 2β) 表 1 3

/ 2 () ^ ½一Jqp【qsΛΛSOSTlT

339S§SK q) S£()S i 6s 9 600 ( ¾s ¾sw- - .. - 一寸 Ζ ( (J).) I ΊN) T OU 6 ϋ I H ¾《JG >M- Ζΐ30。))寸 £ Νο)£ 1寸( s03 Δ ¾--- * -

S98W pS- 【¾nnoB,

2 9

差替え用紙（規則 26) ( 3 ) Fan- (0) 3— 2， 3 - S L a c - O H (化合物 xi) 略称： Fan (0) 3- 2， 3-SLac-Acデンドリマー（化合物 ix) をメタノールに溶解し、ナトリウムメトキシド（cat. ) を加え、室温で一晚攪拌した。反応液を強酸性陽イオン交換樹脂 IR- 120B (H+型）で中和後、イオン交換樹脂をろ取し、ろ液を濃縮してセフアデックス G-25 (5¾ AcOH) によるゲルろ過精製を行い、脱保護された Fan (0) 3-2, 3-SLac-OH (化合物 xi) を凍結乾燥粉として定量的に得た。

同定結果を表 1 4に示した。

29^ ! 1

差替え用紙（規則 26) ,t ¾

暴

^ U V ( V x I

c

cr 3 S L c^ ^

r a I

CD cr

CD N. M. R. data ： ^lH (D₂0), HDO δ 4.70, 6 7.30 (m, 5 H, SiPh), 4.45 (br, 3 H, H-1'), 4.32 (br, 3 H，

H-1), 4.07 (near d, 3 H, H-3，)， 3.98-3.46 (m), 3.24 (br, 3 H， H-2), 2.66 (near d, 3 H, H-3"eq), 2.38 (br, 12 H, -CH₂SCH₂-)， 1.95 (s, 9 H, NDAc), 1.84， 1.46, and 1.32 (3 m), 0.81 (br, 6 H, CH₂Si).

I

5 * δ 2.33 (near dd, H-3"eq of Lactone) Included about 8 %.

O

I. R. data (KBr)： v (cm ¹) 3396 (O-H), 2927 (C-H), 1730 (C=0, カルボン酸)， 1633 (C=0, amide), 1566 (N-H, amide), 1072, and 1034 (C-O, alcohol, ether), 706， and 619 (N-H, 面外縦ゆれ).

FAB-MS Calc. for C₉₉H₁₆₇N₃0₅₇S₃Si [M+H]'： 2433.9146. Found： 2434.1.

〇

0.00608mmol) をメタノール（3mいに溶解し、ナトリウムメ卜キシド（1.97mg, 0.03648mmol) を加え、室温で一晩攪拌した。反応液を強酸性陽イオン交換樹脂 IR-120B (H+型）で中和後、イオン交換樹脂をろ取し、ろ液を濃縮した。残渣に 0.05M水酸化ナ卜リゥ厶水溶液（2mL) を加え、室温で一晩攪拌した。反応液を強酸性陽イオン交換樹脂 IR- 120B (H+型）で中和後、イオン交換樹脂をろ取し、ろ液を濃縮してセフアデックス G-25 (5¾ AcOH) によるゲルろ過精製を行い、脱保護された Dumbbel I (1) 6- Lac-OH (化合物 xii) を凍結乾燥粉として定量的に得た。

同定結果を表 1 5に示した。

30

差替え用紙（規則 26) ¾ W啦： I

N. M. R. data： 1H (D₂0), HDO δ 4.70, δ 4.46 (near 6 H, Η-Ι'), 4.36 (near d, 6 H, H-1), 4.08 (near d, 6 H, H-3，)， 3.99-3.46 (m), 3.26 (br, 6 H, H-2), 2.67 (near d, 3 H, H-3"eq), 2.50 (br, 24 H,

-CH2SCH2-), 1.96 (s, 18 H， NDAc), 1.85, 1.57， and 1.41 (3 br), 0.63 (br, 20 H， Si C¾), -0.06 (br, 6

H， Si ).

* δ 2.23 (near dd, J₃-_¾3»_c = 12.9 Hz, Jy_e,4" = 4.8 Hz, H-3"eq of Lactone) Included about 3%.

I. R. data (KBr)： v (cm"¹) 3406 (O-H), 2931 (C-H), 1730 (C=0，カルボン酸)， 1643 (C=0， amide),

o

1566 (N-H, amide), 1032 (C-O, alcohol, ether), 624 (N-H, 面外縦ゆれ).

01

FAB-MS Calc. for C₁₉₄H₃₄₂N₆0₁₁₄S₆Si₃ [M+H]"： 4857.8769. Found： 4859.2.

<実施例 3 > 糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物のベロ毒素中和活性

) 準備

( a ) 材料

実施例 1 で合成された糖鎖含有カルポシランデンドリマー化合物や、発明者らがすでに報告している糖含有カルボシランデンドリマ一化合物をはじめとする各種のデンドリマー化合物について、そのべ口毒素中和活性試験を行った。試験に用いた糖鎖含有カル

3 0Ϊ/ 2

差替え用紙（規則 26) ボシランデンドリマー化合物は、いずれも実施例 1 により、もしくは実施例 1 に従って合成された以下のとおりにその構造の概要が示されるものである。

3 1

差替え用紙（規則 26)

Dumbbell (2)18

3 1 ! 1 差替え用紙（規則 26) s s

s

s s

Ball (2)36

317|2

差替え用紙（規則 26)

Fan (0)3

Fan(l)9

000 差替え用紙（規則 26) 試験に際しては、公知の方法（例えば Microb. Pa thog. 2, 339-349 (1987) )によりべ口毒素 1 および 2 (リコンビナン卜 Stx1 および Stx2) を調製した。

リコンビナントグル夕チオン S— 卜ランスフェラ一ゼ（G S T) 融合 Stxl (Stx1-A2B₅-GST) は、次の.方法により得た： Stx1 をコードする配列を有する PUC118ベクター (Microb. Lett. 44, 23-26 (1987) ) を用いて P C Rにより配列番号 1 および 2のオリゴヌクレオチドをプライマーとして Ssm 1-EcoRI フラグメントを得た。得られたフラグメントを、 pGEX- 2T ベクタ一（Pharmacia 社）の »Η卜 EcoRI サイ卜に結合させた。

この Stxl- A2B₅- GSTをバクテリァに発現し、グル夕チオンーセファローズビーズを用いた公知の方法（ J Biol. Chem. 273, 23126-23133 (1998) ) により精製した。

さらに、 Stxl の Bサブュニッ卜に対してモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ — 13C4 を American Type Culture Col lectionから得た。

また、 ¹²⁵1 で標識した Stxl (¹²⁵卜 Stxl) および Stx2は公知のョゥ素モノクロリド法 U. Biol. Chem. 265, 5226 - 5231 (1990) ) により調製した。

( b ) 細胞

ベロ細胞（アフリカミドリザルの腎臓由来細胞）は、 10%ゥシ胎児血清を補充した Dulbecco' s modified Eagle' s medium (匿 M)を培地として、 2 4ゥエル（結合性試験用）または 9 6ゥエル（細胞毒性試験用）プラスチックマイクロプレー卜で培養した。

マウス腹膜マクロファージは公知の手法 (J. Biol. Chem. 265, 5226-5231 (1990) ) により調製した。

32 ( c ) 薄層クロマトグラフィー（TLC) 免疫染色アツセィの Gb3への結合アツセィは、公知の方法によリ、行つすこ（FEBS Lett. 442, 231-234 (1999) )。すなわち、プ夕赤血球 Gb3 (500ng、和光純薬社）を HPTLC プレー卜（Whatman社）に施し、クロ口木ル厶メタノール/水 60/35/8 ( V / V ) 混合溶媒で展開した。ブロッキングを行った後、 Stx1 (100ng/ml) と任意の量の糖含有カルボシランデンドリマ一ともに培養した。洗浄後モノク口一ナル抗体 13C4を用いて Stx1 を検出した。

( 2 ) 方法

( a ) 結合阻害活性試験

ベロ細胞を、 ¹²⁵卜 Stx1 または ¹²⁵卜 Stx2 (7 X 10⁶ cpm/ gまたは 2 x10⁶ cpm/^g) と任意の量の糖含有カルボシランデンドリマ一化合物の存在下、 4 °Cで 3 0分間処理し、洗浄した後、細胞を溶解液（0.1M NaOH、 0.5¾ SDS) に溶解した。

ァカウンター（Packard Inst. Comp.社）により放射線量を測定し、ベロ細胞に結合した ¹²⁵卜 Stx1 または ¹²⁵卜 Stx2の量から各糖含有カルボシランデンドリマー化合物の結合阻害活性を求めた。

( b ) 細胞毒性中和活性試験

9 6ゥエルプレ一卜中のサブコンフルェン卜なベロ細胞に任意の量の前記の糖鎮含有カルボシランデンドリマ一化合物存在下で Stxl または Stx2 (10 pg/ml) を添加し、 7 2時間処理した。相対的な細胞数を WST- 1 Cel l Counting Kit (和光純薬社）を用いた従来法 FEBS Lett. 442, 231-234 (1999) ) により求めた。

( c ) マウスへの静脈内投与試験

致死量の Stx1 または Stx2 (0.25 ng/g体重）を前記のとおりの各種の糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物存とともに 5〜

33 1 0個体の ICR マウス（体重 18~20g、日本エスエルシ一株式会社）の尾静脈から投与し、. その生存時間（日数）を測定した。 ( 3 ) 結果

( a ) 結合阻害活性

糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物の結合阻害活性試験から得られた 5 0 %抑制濃度を表 1 6 に示した。

表 1 6より、 Fan ( 1 ) 9をはじめ、 Dumbbel I型および Bal I 型の糖含有カルボシランデンドリマ一化合物は、いずれもベロ毒素 1 (Stxl) および 2 (Stx2) に対して高い結合阻害活性を示すことが確認される。

糖含有カルボシランデンドリマ一化合物が存在しない場合には、 ¹²⁵1 標識 Stx は 1 0 0 %ベロ細胞に結合した。また、糖含有カルボシランデンドリマー化合物の替わりに非標識 Stxl および Stx2 (50Mg/ral) を用いた場合にも、 ¹²Ί 標識 Stxのべ口細胞への結合が完全に阻害されることから、 ¹²⁵1 標識 Stxがべ口細胞に特異的に結合することが確認される。

( ) 細胞毒性中和阻害活性

( a ) と同様に、各糖含有カルボシランデンドリマー化合物の毒性中和阻害活性試験から得られた 5 0 %抑制濃度を表 1 6に示した。

表 1 6より、糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物、特に Dumbbel 1 ( 2 ) 1 8は、いずれもベロ毒素 1 (Stxl)および 2 (Stx2) に対しては、いずれも高い細胞毒性中和活性を示しことが確認される。

34 表 1 6

( c ) マウスへの静脈内投与

前記の Dumbbel I ( Ί ) 6および Ba I I ( 1 ) 1 2の化合物について、単独で 50 tg/g体重マウスに投与した場合（〇）、 Stx2 のみを単独で致死量（0.25ng/g体重）投与した場合（x)、および Stx2 (0.25ng/g体重）を各々の化合物（50 tg/g体重）とともに投与した場合（書）のマウスの生存率を図 1 (A) ( B ) に示した。図 1 より、 Bal I ( 1 ) 1 2化合物は Stx2毒性によるマウスめ死亡を遅延させる効果があることが示された。また、 Dumbbel I ( 1 ) 1 2化合物は Stx2 の細胞毒性を完全に中和できることが示された。 - 同様にして、致死量（0.25ng/g体重）の Stx2 と各濃度（1. 5、 5、 15、体重）の Dumbbel l ( 1 ) 1 2化合物を投与した場合のマウスの生存率を図 2 に示した。

図 2より、濃度が 1. 5および体重では、マウスの生存に個体差が見られ、 2 0 日後の生存率は 3 0 %となった。また、 15 wg/g体重の Dumbbel l( 1 ) 1 2化合物を投与することにより Stx2

35 の細胞毒性が完全に中和されることが確認された。

く実施例 4 > 糖含有カルポシランデンドリマ一化合物の抗ィンフルェンザゥィルス活性

参考例 4において合成されたシァリルラク卜ース誘導体化合物 vi i、実施例 2 ( 3 ) および 2 ( 4 ) で合成された Fan 型化合物 xiおよび Dutnbbel I型化合物 xi iを用いてィヌの肝臓上皮細胞（M D C K細胞）を用いてインフルエンザ Aウィルス（A/PR/8/34株）の赤血球の凝集阻止活性、細胞融合阻害活性、および

細胞への感染阻害活性をそれぞれ試験した。

結果を表 1 7に示した。表 1 7

表 1 7ょリ、シァリルラク卜ースがカルボシランデンドリマーに結合された化合物 xiおよび xi iでとくに高い抗インフルエンザゥィルス活性が確認される。産業上の利用可能性

以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、大腸菌 0— 1 5 7が産生するべ口毒素の中和活性等の機能を有する新し

36 い糖鎖含有カルボシランデンドリマーが提供される。

また、この発明によって、高い抗ウィルス性を有する物質として末端にシァリルラクト一スを有する新規カルボシランデンドリマー化合物が提供される。シァリルラクトースを有するカルボシランデンドリマー化合物は、カルボシランデンドリマー部の分子設計や合成が比較的容易である上、抗ウイルス性を有するシァリルラク卜一ス分子を多数結合 ·保有でき、さらにそれらの分子間隔をも調整できるため、効率的にウィルスを接着除去できる抗ゥィルス剤としての有用性が高い。

37

Claims

請求の範囲次式（ I )

( ¹)m-Si — R²-Si [R⁶],

(R⁷)_k (R⁴-S-R⁵-A)_3-k ]₃.,

(ただし、式中の R R ⁵および R ⁷は、各々同一または別異に、置換基を有していてもよい炭化水素基を示し、 R²、 R³、 R⁴および R⁵は、各々同一または別異に、置換基を有していてもよい炭化水素鎖を示し、 Aは、糖鎖、 mは 0〜 3のいずれかの数、 nは 4 ~ 1 のいずれかの数であり、 m+ n = 4、さらに、 kおよび I は各々同一または別異に 0 ~ 2のいずれかの数である）で表わされる糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物。

2. 次式（ I I)

(R¹)m-Si [— R²-Si (R⁶), (R⁴— S— R⁵— A)_3-l ] _n

(ただし、式中の R¹および R⁶は、置換基を有してもよい炭化水素基を示し、 R²、 R ⁴および R ⁵は、各々同一または別異に、置換基を有していてもよい炭化水素基を、 Aは糖鎖を示し、 m は 0 ~ 3のいずれかの数を、 nは 4 ~ 1 のいずれかの数を示し、 m+ n == 4、さらに I は 0 ~ 2のいずれかの数である）で表わされる糖鎖含有カルボシ.ランデンドリマ一化合物。

3. R ¹がフエニル基、 mが 1 、 nが 3である請求項 1 または 2 いずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物。

4. R ¹がメチル基であり、 mおよび nが各々 2である請求項 1 ないし 3のいずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合

38 物。

5. 糖鎖 Aが次式（I I I)

で表される請求項 1 ないし 4のいずれかの糖鎖含有カルポシランデンドリマ一化合物。

. 糖鎖 Aが次式（IV)

(ただし、 Rは水素原子またはァセチル基、 R 'は水素原子またはメチル基である）で表される請求項 1 ないし 4のいずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物。

7. 請求項 1 の糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物の製造方法であって、次式（V )

(R¹)_m— Si — R -Si [R^b], [R²— Si (R⁷)k (V)

(^R― ^X)3-k ]3-i

(ただし、 R ¹、 R R³、 R⁴、 R ⁶、 R⁷、 m、 n、 k、 1 は前記のとおりのものを示し、 Xはハロゲン原子を示す）で表わされるハロゲン化合物を、次式（VI) '

A— R -S— Y (VI)

39 (ただし、 R⁵および Aは前記のとおりのものを示し、 Yは反応離脱性の保護基を示す）で表わされるスルフィド化合物と反応させることを特徴とする糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物の製造方法。

8. 請求項 2の糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物の製造方法であって、次式（VI I)

(R¹)_m-Si — R²-Si (R⁶、, (R— Χ)₃-ι (VII)

( R¹、 R²、 R⁴、 R⁶、 m、 n、 I は前記のとおりのものを示し、 Xはハロゲン原子を示す）で表わされるハロゲン化合物を、次式

A— R S— Y (VI)

( R⁵および Aは前記のとおりのものを示し、 Yは反応離脱性の保護基を示す）で表わされるスルフィド化合物と反応させることを特徴とする糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物の製造方法。

9. 式（VI) において、 Aが次式（I I I)

で表される請求項 7または 8のいずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物の製造方法。

40

1 0. 式（VI) において、 Aが次式（IV)

で表される請求項 7または 8のいずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物の製造方法を提供する。

1 1 - 前記第 9および 1 0の発明において、式（VI) における

Yがァセチル基である糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物の製造方法を提供する。

1 2. 請求項 1 0または 1 1 の糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物の製造方法であって、 N—ァセチルノイラミン酸のチ才メチルダリコシド体とラク卜ースの卜リメチルシリルェチルグリコシド 3 '， 4 'ジオール体をダリコシデーションした後、次式 (VI I I)

41 で表されるァセチルチオ誘導体とした後、式（V ) またはのカルボシランデンドリマーと縮合することを特徴とする糖鎖含有カルボシランデンドリマー化合物の製造法。

3 . 請求項 1 ないし 6 'いずれかの糖鎖含有カルボシランデンドリマ一化合物を有効成分として肯有することを特徴とするベ口毒素中和剤。

4 . 請求項 1 ないし 6のいずれかの糖鎖含有カルポシランデンドリマー化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗ウィルス剤。

42