WO2002000917A1

WO2002000917A1 - Procede de detection de proteines argyrophiles presentant une region organisatrice des nucleoles (ag-nor) des lymphocytes t

Info

Publication number: WO2002000917A1
Application number: PCT/CN2000/000337
Authority: WO
Inventors: Guoqing Zhang
Original assignee: Beijing Jianerkang Medical Equipment Co.Ltd
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2002-01-03
Also published as: AU2000278995A1; CN1278601A

Description

一种 T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白 Ag-NORs的检测方法技术领城

本发明属于生物检测方法，特别是一种淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白 Ag-NORs的检测方法。

背景技术

现有技术中的检测只用于组织切片，受检者必须先行手术，取活体组织进行制片染色检查，病人痛苦大，并且不宜重复检查。

本发明采取了新检测对象，即对外周血中的 T—淋巴细胞进行检测，克服了现有技术中的不足，提供了一种用血量小、操作简便、过程简单、易于普及的 T一淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白 Ag- NORs的检测方法。

发明概述

本发明的 T一淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白 Ag-NORs的检测方法，包括细胞培养、细胞分离、制片、染色、检测五个部分。

1.细胞培养：

(1)培养液的制备：

培养液的组成成分及配制 1000克培养液的用量为：

N- (2-羟乙基）派嗪 -N， - 2-乙烷磺酸（Hepes) 3-6g 碳酸氢钠 l-3g RPMI 1640培养基（干粉） 5-1 Og

L -谷氨酰胺 (LG) 0. 1- 0. 3g 肝素钠（150u/rag) 0. 1- 0. 3g 植物血凝素 ( PHA ) 5-2 Omg 胎牛血清 100 -300ml 青霉素 ( 80万 u /2ml ) 0. 1- 0. 5ml 链霉素 ( 100万 u /2ml ) 0. 1— 0. 5ml 余量用蒸餾水补齐。

该培养液的 PH值为 6. 5-7. 5。

该培养液是通过如下方法及步骤制备而成的：

①将 Hepes、碳酸氢钠和 1640培养基三种试剂按计量置于容器中，南容器中加入约 300亳升蒸餾水，于 37 °C 下混合溶解，再加入剩余量的蒸榴水，混合均匀待用；

②取密封在容器中的胎牛血清或将胎牛血清置于容器中，在 56。C 水浴箱内 30分钟灭活，冷却至室温后加入到①步骤制得的水溶液中；

③将 L-谷氨酰胺、肝素钠、植物血凝素（PHA )、青霉素和链霉素，加入到②步骤的溶液中，充分混匀，直至全部溶解。

④将上述溶液用滤膜滤菌器过滤，即得本发明的培养液。

将培养液分装、密封后，于- 18 °C以下水冻保存。培养液置于 37 "C 孵箱内孵育一周无细菌生长，则为合格。

(2)细胞培养：

依如下方法和步骤进行 T一淋巴细胞培养：

①室温下将水冻的、上述 T—淋巴细胞培养液解冻；

②抽取静脉血注入盛培养液的容器内，立即混勾，血与培养液的体积比为 1: 8-12;

③将培养瓶置于 37 °C 土 0. 5 °C培养箱中， 48— 96小时后即完成细胞培养。

•2.细月包分离：

(1)吸入上述细胞培养步骤制得的细胞液 4. 5ml , 在转速为 2000转 /分条件下离心 5分钟;

(2)弃上清，然后加入低渗液 5ml充分混勾，再加固定液 0. 5ml混匀，在转速为 2000转 /分条件下离心 5分钟；

(3)弃上清，加固定液 5ml混勾，在转速为 2000转 /分条件下离心 5 分钟

(4)弃上清，加固定液 5ml混勾，在转速为 2000转 /分条件下离心 5 分钟；

(5)弃上清，加固定液 0. 3ml , 混匀备用。

上述低渗液为 0. 43%氯化钠溶液；固定液为曱醇与冰醋酸按体积比 3: 1比例配制的混合溶液。

3.制片：

(1)将冷冻载玻片置于水平位；

(2)吸取经细胞分离步骤后的细胞悬液，在距玻片 20cra高度处，向玻片滴加 2— 3滴；

(3)细胞悬液快干时，将玻片快速过火 2— 3次，室温凉干。

4.染色：

(1)染色液的制备：染色液由 A液和 B液两部分组成， A液的组成成分及其配比为：硝酸 4艮（分析纯） 30— 60g , 蒸馏水 100ml 。 A液的优选配比为：硝酸银（分析纯） 50g , 蒸馏水 100ml 。 A液的配制方法为：按比例将硝酸银加入到蒸馏水中，充分搅拌，直至完全溶解， '并装入棕色瓶中于 2-8 °C保存。

B液的组成成分及其配比为：明胶 1- 3g , 纯曱酸 200- 50(敫升，蒸馏水 100ml 。 B液的优选配比为：明胶 2g , 甲酸 250微升，蒸餾水 100ml 。 B液的配制方法为：将甲酸加入到蒸馏水中，混匀，再加入明胶，混合均匀，然后放入 37 °C培养或室温中至完全溶解，即得本发明的 B液。将 B液于 2— 8 Ό下保存。

细胞染色时， A液与 B液的体积比为： 1一 3： 1

(2)染色：

按如下方法进行细胞染色：

①将按上述 (1)步骤制得的染色液的 A液和 B液置于室温或 37 °C温箱中恒温备用；

②将三用水箱预热至 80- 90°C后恒温；

③将上述制片步骤制好的玻片放在水箱之铝板上；

④向玻片上有细胞悬液处，先后滴加 A液和 B液，两者的体积比为 1-3 ·： 1 , 混勾后将盖玻片盖上；

⑤待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；

⑥用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸馏水冲一遍，晾干，即完成染色。将上述经过染色步骤的玻片在 KL型肿瘤免疫图像分析系统（由北京健尔康医疗设备有限公司开发生产）进行读片，分析 30-50个细胞，取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。

本发明的所有步骤及过程中，所使用的器亚及其它用具等全部需要消毒灭菌处理，而且所有操作均应符合无菌操作，消毒灭菌方法和无菌操作方法均属于本领域的公知技术。

本发明的 T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白 Ag- NORs的检测方法，具有如下优点：

( 1 )用血量少，仅需睾 0. 4-0. 5ml血样，而现有技术一般需要 5- 10 毫升；

( 2 ) 细胞培养方法筒便、省时、易操作、设备简单，而现有技术中需要用淋巴细胞分离液做淋巴细胞分离 , 而且需要较昂贵的二氧化碳培养箱，操作繁瑣、费时、仪器昂贵。

( 3 )标本染色效果好，染色均匀，背景清晰；

( 4 ) 染好的标本片色泽稳定，室温干燥条件下 1—2个月不退色。

发明详细说明

下面结合实施例进一步说明本发明：

实施例一：

本实施例的 T一淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白 Ag- NORs的检测方法，包括细胞培养、细胞分离、制片、染色、检测五个部分。

1·细胞培养： (1)培养液的制备：

按上述方法配制培养液，其组成成分及配制 1000克培养液的用量

Hepes

碳酸氢钠

RPMI 1640培养基

L-谷氨酰胺 (LG)

肝素钠（150u/mg)

美国 sigma生产的 PHA-P

青霉素（80万 u/2ml)

链霉素（100万 u/2ml)

胎牛血清

余量用蒸馏水补齐。

该培养液的 PH值为 7. 0-7. 2。

(2)细胞培养：

依下列方法及步骤进行 T—淋巴细胞的培养：

( 1 ) 室温下将上述 4ral水冻的淋巴细胞培养液解冻；

( 2 )抽取静脉血 0. 4-0. 5ml注入盛培养液的容器内，立即将两者混匀；

(3) 将上述容器 ¾于 37。C ± 0. 5 °C培养箱中， 72小时后即完成细胞

(4) 培养。依此方法， T—淋巴细胞转化率达 80%以上，而且胞核涨大，核仁分裂。

2.细胞分离：

(1)吸入上述细胞培养步骤制得的细胞液 4. 5ml , 在转速为 2000转 /分条件下离心 5分钟；

(2)弃上清，然后加入^氐渗液 5ml充分混勾，再加固定液 0. 5ml混匀，在转速为 2000转 /分条件下离心 5分钟；

(3)弃上清，加固定液 5ml混勾，在转速为 2000转 /分条件下离心 5 分钟;

(5)弃上清, 加固定液 0. 3ml , 混匀备用。

上述低渗液为 0. 43%氯化钠溶液；固定液为甲醇与冰醋酸按体积比 3: 1比例配制的混合溶液。

3.制片：

(1)将冷冻载玻片置于水平位；

(²)吸取经细胞分离步驟分离的细胞悬液，在距玻片 20cm高度处，向玻片滴加 2— 3滴；

(3)细胞悬液快干时，将玻片快速过火 2— 3次，室温凉干。

4.染色：

(1)染色液的制备：

按上述方法制备如下配比的染色液： A液：硝酸银（分析纯） 50g，蒸馏水 100ml;

B液：明胶 2g , 甲酸 340微升，蒸馏水 100ml 。

(2)染色：

按如下方法进行 T—淋巴细胞染色，其步骤为：

(1)将上迷 A液和 B液置于室温或 37°C温箱中恒温备用；

(2)将三用水箱预热至 85°C后恒温；

(3)将上述制片后的玻片放在水箱之铝板上；

(4)向玻片上先后滴加 A液 4滴、 B液 2滴，混匀后将盖玻片盖上；

(5)待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；

(6)用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸榴水冲一遍，晾干，即完成染色。

5.检测：

将上述经过染色步骤的玻片在 KL型肿瘤免疫图像分析系统（由北京健尔康医疗设备有限公司开发生产）进行读片，分析 30-50个细胞, 取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。

实旅例二：

本实施例中所用染色液的 B液的组成成分及配比为：明胶 2g , 曱酸 250 ：升，蒸馏水 100ml 。其余试剂、步骤及条件均与实施例一相同。

Claims

权利要求

1.一种 T一淋巴细胞核仁形成区嗜艮蛋白 Ag- NORs的检测方法，其特征在于其包括 T一细胞的培养、分离、制片、染色、检测五个部分； • ( 1 )细胞培养：

①培养液的制备：

培养液的组成成分及配制 1000克培养液的用量为：

N- (2-羟乙基）哌嗪 -N， -2-乙垸磺酸（Hepes) 3-6g 碳酸氢钠 l-3g

RPMI 1640培养基（以干粉量计） 5-10g L-谷氨酰胺 (LG) 0. 1- 0. 3g 肝素钠（150u/mg) 0. 1 - 0. 3g 植物血凝素 ( PHA ) 5-2 Omg 胎牛血清 100 -300ml 青霉素 ( 80万 u /2ml ) 0. 1- 0. 5ml 链霉素（100万11 /2ml ) 0. 1- 0. 5ral 余量用蒸榴水补齐；

该培养液的 PH值为 6. 5-7. 5;

②细胞培养：

I .室温下将冰冻的、上述①步骤制备的 T一淋巴细胞培养液解

II .抽取静脉血注入盛培养液的容器内，立即混匀，血与培养液的体积比为 1: 8-12; III.将上述容器置于 37°C 士 0. 5 °C培养箱中 48— 96小时；

(2)细胞分离：

① 吸入经过细胞培养步骤制得的细胞液 4. 5ml , 在转速为 2000转 /分的条件下离心 5分钟；

②弃上清，然后加入低渗液 5ml充分混勾，再加固定液 0. 5ml混匀，在转速为 2000转 /分条件下离心 5分钟；

③弃上清，加固定液 5ml混勾，在转速为 2000转 /分条件下离心 5 分钟；

④弃上清，加固定液 5ml混勾，在转速为 2000转 /分条件下离心 5 分钟；

⑤弃上清，加固定液 0. 3ml , 混匀备用；

上述 ¼^渗液为 0. 43%氯化钠溶液；固定液为甲醇与冰醋酸按体积比 3： 1比例配制的混合溶液；

(3)制片：

①将冷冻载玻片置于水平位；

②吸取经细胞分离步骤分离的细胞悬液，在距玻片 20cm高度处，向玻片滴力 P2— 3滴；

③细胞悬液快干时，将玻片快速过火 2— 3次，室温凉干；

(4)染色:

①染色液的制备：

染色液由 A液和 B液两部分组成， A液的组成成分及其配比为：硝酸银（分析纯） 30— 60g ，蒸馏水 100ml ； B液的组成成分及其配比为：明胶 1一 3g , 纯甲酸 200— 500微升，蒸镏水 100ml ；细月包染色时， A液与 B液的体积比为： 1— 3： 1;

②染色：

按如下方法进行细胞染色：

I .将上述①步骤制备的染色液 A液和 B液置于室温或 37 °C温箱中恒温备用；

II .将三用水箱预热至 80-90Ό后恒温；

III.将上述制片步骤制好的玻片放在水箱之铝板上；

IV.向玻片上有细胞悬液处，先后滴加 A液和 B液，两者的体积比为 1一 3 : 1，混勾后将盖玻片盖上；

V.待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；

VI.用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸榴水冲一遍，晾干，即完成染色；

(5)检测：

将上述（4 ) 步骤经过染色的玻片在 KL型肿瘤免疫图像分析系统进行读片，分析 30- 50个细胞，取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。

2.如权利要求 1所述的 T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白 Ag- NORs 的检测方法，其特征在于所述组成染色液的 A液和 B液的组成成分和配比为：

A液：硝酸银（分析纯） 50g , 蒸馏水 100ml ；

B液：明胶 2g , 曱酸 250微升，蒸馏水 100ml 。