CN1278601A - 一种T－淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag－NORs的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种T－淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag－NORs的检测方法,其包括细胞培养、细胞分防、制片、染色、检测五个部分,具有用血量小、操作简便、过程简单、易于普及等优点。
Description
本发明属于生物检测方法，特别是一种淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法。
现有技术中的检测只用于组织切片，受检者必须先行手术，取活体组织进行制片染色检查，病人痛苦大，并且不宜重复检查。
本发明采取了新检测对象，即对外周血中的T—淋巴细胞进行检测，克服了现有技术中的不足，提供了一种用血量小、操作简便、过程简单、易于普及的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法。
本发明的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，包括细胞培养、细胞分离、制片、染色、检测五个部分。
1．细胞培养：
(1)培养液的制备：
培养液的组成成分及配制1000克培养液的用量为：
N—(2—羟乙基)哌嗪—N’—2—乙烷磺酸(Hepes) 3—6g
碳酸氢钠 1—3g
RPMI 1640培养基(干粉) 5—10g
L—谷氨酰胺(LG) 0．1—0．3g
肝素钠(150u／mg) 0．1—0．3g
植物血凝素(PHA) 5—20mg
胎牛血清 100—300ml
青霉素(80万u／2ml) 0．1—0．5ml
链霉素(100万u／2ml) 0．1—0．5ml
余量用蒸馏水补齐。
该培养液的PH值为6．5—7．5。
该培养液是通过如下方法及步骤制备而成的：
①将Hepes、碳酸氢钠和1640培养基三种试剂按计量置于容器中，向容器中加入约300毫升蒸馏水，于37℃下混合溶解，再加入剩余量的蒸馏水，混合均匀待用；
②取密封在容器中的胎牛血清或将胎牛血清置于容器中，在56℃水浴箱内30分钟灭活，冷却至室温后加入到①步骤制得的水溶液中；
③将L—谷氨酰胺、肝素钠、植物血凝素(PHA)、青霉素和链霉素，加入到②步骤的溶液中，充分混匀，直至全部溶解。
④将上述溶液用滤膜滤菌器过滤，即得本发明的培养液。
将培养液分装、密封后，于—18℃以下冰冻保存。培养液置于37℃孵箱内孵育一周无细菌生长，则为合格。
(2)细胞培养：
依如下方法和步骤进行T—淋巴细胞培养：
①室温下将冰冻的、上述T—淋巴细胞培养液解冻；
②抽取静脉血注入盛培养液的容器内，立即混匀，血与培养液的体积比为1∶8—12；
③将培养瓶置于37℃±O．5℃培养箱中，48—96小时后即完成细胞培养。
2．细胞分离：
(1)吸入上述细胞培养步骤制得的细胞液4．5ml，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
(2)弃上清，然后加入低渗液5ml充分混匀，再加固定液0．5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
(3)弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
(4)弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
(5)弃上清，加固定液0．3ml，混匀备用。
上述低渗液为0．43％氯化钠溶液；固定液为甲醇与冰醋酸按体积比3∶1比例配制的混合溶液。
3．制片：
(1)将冷冻载玻片置于水平位；
(2)吸取经细胞分离步骤后的细胞悬液，在距玻片20cm高度处，向玻片滴加2—3滴；
(3)细胞悬液快干时，将玻片快速过火2—3次，室温凉干。
4．染色：
(1)染色液的制备：
染色液由A液和B液两部分组成，A液的组成成分及其配比为：硝酸银(分析纯)30—60g，蒸馏水100ml。A液的优选配比为：硝酸银(分析纯)50g，蒸馏水100ml。A液的配制方法为：按比例将硝酸银加入到蒸馏水中，充分搅拌，直至完全溶解，并装入棕色瓶中于2—8℃保存。
B液的组成成分及其配比为：明胶1—3g，纯甲酸200—500微升，蒸馏水100ml。B液的优选配比为：明胶2g，甲酸250微升，蒸馏水100ml。B液的配制方法为：将甲酸加入到蒸馏水中，混匀，再加入明胶，混合均匀，然后放入37℃培养或室温中至完全溶解，即得本发明的B液。将B液于2—8℃下保存。
细胞染色时，A液与B液的体积比为：1—3∶1
(2)染色：
按如下方法进行细胞染色：
①将按上述(1)步骤制得的染色液的A液和B液置于室温或37℃温箱中恒温备用；
②将三用水箱预热至80—90℃后恒温；
③将上述制片步骤制好的玻片放在水箱之铝板上；
④向玻片上有细胞悬液处，先后滴加A液和B液，两者的体积比为1—3∶1，混匀后将盖玻片盖上；
⑤待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；
⑥用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸馏水冲一遍，晾干，即完成染色。
5．检测：
将上述经过染色步骤的玻片在KL型肿瘤免疫图像分析系统(由北京健尔康医疗设备有限公司开发生产)进行读片，分析30—50个细胞，取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。
本发明的所有步骤及过程中，所使用的器皿及其它用具等全部需要消毒灭菌处理，而且所有操作均应符合无菌操作，消毒灭菌方法和无菌操作方法均属于本领域的公知技术。
本发明的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，具有如下优点：
(1)用血量少，仅需要0．4—0．5ml血样，而现有技术一般需要5—10毫升；
(2)细胞培养方法简便、省时、易操作、设备简单，而现有技术中需要用淋巴细胞分离液做淋巴细胞分离，而且需要较昂贵的二氧化碳培养箱，操作繁琐、费时、仪器昂贵。
(3)标本染色效果好，染色均匀，背景清晰；
(4)染好的标本片色泽稳定，室温干燥条件下1—2个月不退色。
下面结合实施例进一步说明本发明：
实施例一：
本实施例的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，包括细胞培养、细胞分离、制片、染色、检测五个部分。
1．细胞培养：
(1)培养液的制备：
按上述方法配制培养液，其组成成分及配制1000克培养液的用量为：
Hepes 4．76g
碳酸氢钠 1．6g
RPMI 1640培养基 8．32g
L—谷氨酰胺(LG) 0．3g
肝素钠(150u／mg) 0．1g
美国sigma生产的PHA—P 10mg
青霉素(80万u／2ml) 0．35ml
链霉素(100万u／2ml) 0．3m
胎牛血清 200ml
余量用蒸馏水补齐。
该培养液的PH值为7．0—7．2。
(2)细胞培养：
依下列方法及步骤进行T—淋巴细胞的培养：
(1)室温下将上述4ml冰冻的淋巴细胞培养液解冻；
(2)抽取静脉血0．4—0．5ml注入盛培养液的容器内，立即将两者混匀；
(3)将上述容器置于37℃±0．5℃培养箱中，72小时后即完成细胞
(4)培养。
依此方法，T—淋巴细胞转化率达80％以上，而且胞核涨大，核仁分裂。
2．细胞分离：
(1)吸入上述细胞培养步骤制得的细胞液4．5ml，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
(2)弃上清，然后加入低渗液5ml充分混匀，再加固定液0．5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
(3)弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
(4)弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
(5)弃上清，加固定液0．3ml，混匀备用。
上述低渗液为0．43％氯化钠溶液；固定液为甲醇与冰醋酸按体积比3∶1比例配制的混合溶液。
3．制片：
(1)将冷冻载玻片置于水平位；
(2)吸取经细胞分离步骤分离的细胞悬液，在距玻片20cm高度处，向玻片滴加2—3滴；
(3)细胞悬液快干时，将玻片快速过火2—3次，室温凉干。
4．染色：
(1)染色液的制备：
按上述方法制备如下配比的染色液：
A液：硝酸银(分析纯)50g，蒸馏水100ml；
B液：明胶2g，甲酸340微升，蒸馏水100ml。
(2)染色：
按如下方法进行T—淋巴细胞染色，其步骤为：
(1)将上述A液和B液置于室温或37℃温箱中恒温备用；
(2)将三用水箱预热至85℃后恒温；
(3)将上述制片后的玻片放在水箱之铝板上；
(4)向玻片上先后滴加A液4滴、B液2滴，混匀后将盖玻片盖上；
(5)待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；
(6)用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸馏水冲一遍，晾干，即完成染色。
5．检测：
将上述经过染色步骤的玻片在KL型肿瘤免疫图像分析系统(由北京健尔康医疗设备有限公司开发生产)进行读片，分析30—50个细胞，取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。
实施例二：
本实施例中所用染色液的B液的组成成分及配比为：明胶2g，甲酸250微升，蒸馏水100ml。其余试剂、步骤及条件均与实施例一相同。
Claims (2)
1．一种T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，其特征在于其包括T—细胞的培养、分离、制片、染色、检测五个部分；
(1)细胞培养：
①培养液的制备：
培养液的组成成分及配制1000克培养液的用量为：
N—(2—羟乙基)哌嗪—N’—2—乙烷磺酸(Hepes) 3—6g
碳酸氢钠 1—3g
RPMI 1640培养基(以干粉量计) 5—10g
L—谷氨酰胺(LG) 0．1—0．3g
肝素钠(150u／mg) 0．1—0．3g
植物血凝素(PHA) 5—20mg
胎牛血清 100—300ml
青霉素(80万u／2ml) 0．1—0．5ml
链霉素(100万u／2ml) 0．1—0．5ml
余量用蒸馏水补齐；
该培养液的PH值为6．5—7．5；
②细胞培养：
Ⅰ．室温下将冰冻的、上述①步骤制备的T—淋巴细胞培养液解冻；
Ⅱ．抽取静脉血注入盛培养液的容器内，立即混匀，血与培养液的体积比为1∶8—12；
Ⅲ．将上述容器置于37℃±0．5℃培养箱中48—96小时；
(2)细胞分离：
①吸入经过细胞培养步骤制得的细胞液4．5ml，在转速为2000转／分的条件下离心5分钟；
②弃上清，然后加入低渗液5ml充分混匀，再加固定液0．5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
③弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
④弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；
⑤弃上清，加固定液0．3ml，混匀备用；
上述低渗液为0．43％氯化钠溶液；固定液为甲醇与冰醋酸按体积比3∶1比例配制的混合溶液；
(3)制片：
①将冷冻载玻片置于水平位；
②吸取经细胞分离步骤分离的细胞悬液，在距玻片20cm高度处，向玻片滴加2—3滴；
③细胞悬液快干时，将玻片快速过火2—3次，室温凉干；
(4)染色：
①染色液的制备：
染色液由A液和B液两部分组成，A液的组成成分及其配比为：硝酸银(分析纯)30—60g，蒸馏水100ml；B液的组成成分及其配比为：明胶1—3g，纯甲酸200—500微升，蒸馏水100ml；细胞染色时，A液与B液的体积比为：1—3∶1；
②染色：
按如下方法进行细胞染色：
Ⅰ．将上述①步骤制备的染色液A液和B液置于室温或37℃温箱中恒温备用；
Ⅱ．将三用水箱预热至80—90℃后恒温；
Ⅲ．将上述制片步骤制好的玻片放在水箱之铝板上；
Ⅳ．向玻片上有细胞悬液处，先后滴加A液和B液，两者的体积比为1—3∶1，混匀后将盖玻片盖上；
Ⅴ．待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；
Ⅵ．用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸馏水冲一遍，晾干，即完成染色；
(5)检测：
将上述(4)步骤经过染色的玻片在KL型肿瘤免疫图像分析系统进行读片，分析30—50个细胞，取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。
2．如权利要求1所述的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，其特征在于所述组成染色液的A液和B液的组成成分和配比为：
A液：硝酸银(分析纯)50g，蒸馏水100ml；
B液：明胶2g，甲酸250微升，蒸馏水100ml。
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