WO2002000746A2 - Solution de traitement de surface minimisant les phenomenes d'adsorption et/ou d'electroosmose - Google Patents

Solution de traitement de surface minimisant les phenomenes d'adsorption et/ou d'electroosmose Download PDF

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WO2002000746A2
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Jean-Louis Viovy
Valessa Barbier
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Institut Curie
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Definitions

  • the present invention relates to the transfer, analysis, purification or separation, within a channel, of a fluid or of species contained in said fluid, or the conservation of a fluid in a container, and aims more particularly to propose a useful surface treatment solution to significantly reduce the non-specific adsorption of species contained in this fluid, on the walls of said channel or said container.
  • the invention is more particularly advantageous for the methods in which said fluid is contained in channels or capillaries of which at least one of the dimensions is submillimetric, and typically between 1 ⁇ m and 200 ⁇ m (hereinafter called microchannels).
  • the invention relates to techniques for analyzing or separating species, according to which it is necessary to transport said species in a channel, while minimizing the non-specific interactions of said species or other components of said medium. , with the walls of said channel or more generally with walls or solid elements present in - said channel or said medium.
  • These are in particular methods of separation or analysis of biological macromolecules - by capillary electrophoresis, by chromatography, or by any method used in microchannels (microfluidic systems, "laboratories on chips”). Examples of such systems are described for example in “Capillary electrophoresis in analytical biotechnology", Righetti ed., CRC press, 1996, or in Cheng, J. et al., (1996), Molecular Diagnosis, 1, 183-200. The invention is particularly useful in the case of electrophoresis.
  • the invention also relates to so-called hybridization or affinity techniques, in which it is desired to analyze, within a channel or a container, the species contained in a sample, according to their specific affinity with respect to ligands contained in said channel or container, or fixed at predetermined locations on the walls of said container or said channel.
  • it is intended to use "non-specific adsorption", according to the usual acceptance in those skilled in the art, as an attractive interaction between certain species or impurities contained in a sample and the walls of the container and of the channel, and dependent in a weak or insufficiently controlled manner on the characteristics of said species or impurities.
  • affinity an interaction between a species and a substrate, the strength of which depends significantly on said species and on said substrate, and in any event sufficient to induce the separation or identification of different species according to their biological or physico-chemical characteristics.
  • microfluidic system will mean any system in which fluids and / or species contained in a fluid are moved within a channel or a set of channels, one of the dimensions of which at least is submillimetric, and we will designate by capillary electrophoresis (CE) the microfluidic systems in which the transport of species takes place under the action of an electric field.
  • CE capillary electrophoresis
  • non-crosslinked linear water-soluble polymers having the advantage of being able to be replaced as often as necessary.
  • Many non-crosslinked polymers have been proposed as media for the separation of species within a channel, in particular in the context of capillary electrophoresis.
  • a major problem for all the methods involving species within channels is the non-specific adsorption of said species. at the walls of said channels. This problem is particularly exacerbated in the case of small channels and biological macromolecules, the latter often being amphiphilic.
  • This phenomenon of non-specific adsorption to the walls of species contained in the sample or the fluid has the effect of delaying certain analytes and of creating an additional dispersion and therefore a loss of resolution, in the case of analytical methods.
  • This adsorption can also give rise to contamination of the walls of the channel, capable of affecting the fluids which it is desired to introduce into the latter subsequently.
  • the analysis that we wish to perform on the species involves a specific interaction of the species with the separation medium, as in chromatography, electrochromatography or affinity electrophoresis methods, or with zones predetermined walls, as in hybridization methods such as "DNA chips” or "protein chips", or with solid walls contained in the channel or container, as in methods of separation by affinity with latex.
  • electroosmosis an overall movement of the separation medium due to the presence of charges on the walls of the capillary or canal. Since this movement is often variable over time and non-uniform, it affects the reproducibility of the measurements and the resolution. It is due to the charges which can be present on the surface of the capillary due to its chemical structure, but can also be generated or increased by the adsorption on the wall of charged species initially contained in the samples to be separated, and in particular proteins.
  • the present invention is more particularly concerned with the inhibition of these two phenomena, namely adsorption of species to surfaces and / or electroosmosis.
  • Methods have already been proposed for combating electroosmosis and / or the adsorption of species to surfaces.
  • a first type of method involves treating the surface of the channel by adsorption of essentially neutral species, prior to the actual separation (Wi torowicz et al., Electrophoresis, 11, 769, 1990, Tsuji et al., J. Chromatogr 594, 317 (1992) It has also been proposed to adsorb surfactants with a charge opposite to that of the wall, in order to reinforce adhesion by electrostatic interactions.
  • a more effective solution consists in irreversibly grafting an essentially neutral polymeric layer such as acrylamide or polyvinyl alcohol on the walls, as for example described in US 4,680,201, or even US 5,502,169, or US 5,112 460.
  • Ready-to-use treated capillaries are thus commercially available. These irreversibly treated capillaries lead to a good reduction in electroosmosis for a certain number of separations. Unfortunately, their lifespan is limited and their cost high.
  • separation media comprising a sieving medium and a surface interaction component consisting of a polymer with adsorption properties on the walls, of molecular weight between 5,000 and 1,000,000, of the disubstituted acrylamide polymer type.
  • matrices and more particularly polydimethylacrylamide (PDMA) make it possible to reduce electroosmosis and lead for certain applications, such as sequencing, to good separation properties.
  • PDMA polydimethylacrylamide
  • they are relatively hydrophobic, which limits their performance for certain applications such as DNA sequencing, and is even more harmful for other applications such as the separation of proteins.
  • they lead to slow separations. Consequently, although many methods have been proposed to reduce adsorption to the walls and / or electroosmosis, they are not entirely satisfactory.
  • the object of the present invention is precisely to propose a new family of surface treatment solutions, advantageous for minimizing the phenomena of non-specific adsorption and electroosmosis.
  • the subject of the present invention is a solution for treating the surface of an element intended to be brought into contact with a fluid and / or the species contained in this fluid during transport, analysis, purification, separation or preservation of said fluid, characterized in that said solution comprises at least one polymer composed of several polymer segments, said polymer being of the block copolymer or comb polymer type and having on average at least three junction points between polymer segments of different chemical or topological nature.
  • crosslinked is understood, according to the usual acceptance in those skilled in the art, a set of polymers having between them a large-scale network of crosslinking points, which gives this set of polymers the properties of a solid or gel.
  • element mainly any channel used for the transport, analysis, purification and separation of a fluid or of species contained in this fluid, or any container used to store fluid.
  • solid particles of the bead type for example, capable of being brought into contact with a fluid for the purposes of analysis, separation or purification, in particular by affinity.
  • This definition also extends to any element intended to constitute a wall of a channel or a container used during an operation of transport, analysis, de-purification, conservation or separation of a fluid or of species contained in this fluid, or to be part of said wall.
  • the polymer according to the invention has a chemical composition different from that of the materials constituting said element. It can thus confer on the walls of said channel or of said container properties which are advantageous, difficult or impossible to obtain in its absence, taking into account the chemical nature of the elements composing the channel or the container.
  • the polymers used according to the invention minimize the adsorption of species to the walls and thus improve either the recovery rate of these, for example in the preparative or micropreparative systems, or the resolution in the analytical methods. , or else avoid contamination of said walls, in particular during transport, analysis or storage of biological fluids liable to contamination.
  • polymer is intended to denote a product consisting of a set of macromolecules and characterized by certain properties such as molecular mass, polymolecularity, chemical composition and / or microstructure.
  • polymolecularity is intended to denote the molecular mass distribution of the macromolecules, in the sense of the average mass familiar to those skilled in the art.
  • microstructure is meant the way in which the monomers entering their chemical composition are arranged within macromolecules.
  • the invention is particularly advantageous in the case of methods for the separation of species within a fluid.
  • the term “separation” is intended to cover any method aiming to separate, identify or analyze all or some of the species contained in a sample.
  • the fluid is in this case called "separation medium”.
  • the term “species” is intended to denote in general terms particles, organelles or cells, molecules or macromolecules, and in particular biological macromolecules such as nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides), the nucleic acid analogs obtained by chemical synthesis or modification, proteins, polypeptides, glycopeptides and polysaccharides. In analytical methods, said species are commonly called “analytes”.
  • the invention is particularly advantageous in the case of electrokinetic separation methods.
  • electrokinetic separation is intended to cover any method aiming to separate all or some of the species contained in a mixture, by causing them to migrate within a medium under the action of an electric field, that the field exerts its motive action on the analytes directly or indirectly, for example by means of a displacement of the medium itself, as in electrochromatography, or a displacement of annexed species such as micelles , in the case of micellar electrochromatography, or by any combination of direct and indirect actions.
  • a method of electrokinetic separation according to the invention will also be considered any method of separation in which said action of the electric field is combined with another driving action of non-electric origin. Are therefore called “electrokinetic", capillary electrophoresis methods or electrophoresis on "chips”.
  • the fluid consists of an electrolyte.
  • the term “electrolyte” is intended to denote a condensed medium capable of conducting ions.
  • this medium is an aqueous buffered medium, such as buffers based on phosphate, tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), Borate, N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropane sulfonic acid (TAPS), histidine, lysine, etc.
  • buffers which can be used in electrophoresis are known to those skilled in the art, and a certain number of them are described, for example, in "Sambrook et al. .
  • electrolyte can be used in the context of the invention, in particular hydroorganic solvents such as, for example, water-acetonitrile, water-formamide or water-urea mixtures, polar organic solvents such as, again by way of example, N-methylformamide.
  • hydroorganic solvents such as, for example, water-acetonitrile, water-formamide or water-urea mixtures
  • polar organic solvents such as, again by way of example, N-methylformamide.
  • electrolytes “sequencing buffers” consisting of an aqueous buffer at alkaline pH added with a significant proportion of urea and / or formamide prove to be particularly useful in the context of the invention.
  • channel is intended to denote any volume delimited by one or more solid walls, and having at least two orifices, intended to contain or to be traversed by a fluid.
  • container is intended to denote any volume delimited by several solid walls, having at least one orifice and used to contain a fluid.
  • the invention is particularly advantageous in systems comprising at least one channel or a container of which at least one dimension is of submillimetric dimension, such as electrokinetic capillary separation systems, microfluidic systems, and more generally systems for the separation of 'species using micro channels, micro containers or nanorecipients.
  • the polymers according to the invention have on average at least four junction points, preferably a number of junction points between 4 and 100, and more preferably a number of junction points between 4 and 40
  • junction point is meant a point connecting either two polymer segments of significantly different chemical nature, as in the case of a block copolymer, or a crosslinking point between a number of polymer segments, of identical or different chemical nature. , greater than two, as in comb polymers.
  • a comb polymer comprising three lateral branches has three junction points and seven distinct polymer segments.
  • a block-block copolymer of type A-B-A-B has three junction points and four distinct polymer segments.
  • the term “polymer segment” is intended to denote or
  • segment a set of monomers covalently linked together and linear, and belonging to a given type of chemical composition, that is to say generally having specific physicochemical properties, in particular as regards solvation and / or interaction with a solid wall.
  • An example of a polymer segment within the meaning of the invention is given by a sequence of all identical monomers (homopolymer segment), or a copolymer having no significant composition correlation over distances of more than a few monomers (segment of random copolymer type ).
  • block copolymer is intended to denote a copolymer consisting of polymer segments linked together covalently, and belonging to at least two different types of chemical composition.
  • two adjacent polymer segments within a block copolymer are by definition within the framework of the invention of significantly different chemical nature.
  • the block copolymer is defined by the fact that each of the segments comprises a sufficient number of monomers to present within the electrolyte physicochemical and in particular solvation properties, comparable to those of a homopolymer of the same composition and of the same cut.
  • the size of the homopolymer segments necessary to obtain this block character can vary depending on the types of monomers and of the electrolyte, but it is typically a few tens of atoms along the skeleton of said segment.
  • a block copolymer may be constituted within the meaning of the invention, in which part or all of the segments are themselves constituted by a copolymer of statistical type, insofar as one can distinguish within said block copolymer polymeric segments of sufficient size and difference in chemical composition to give rise from one segment to another to a significant variation in the physicochemical properties and in particular of solvation and / or interaction with the walls.
  • a portion of polymer must have along its backbone at least 10 atoms.
  • the polymer according to the invention is of the block block copolymer type.
  • block block copolymer means a block copolymer composed of polymer segments belonging to at least two distinct chemical types, said polymer segments being linked in a linear fashion.
  • the polymer according to the invention is of the comb polymer type.
  • comb polymer is intended to denote a polymer having a linear skeleton of a certain chemical nature, and polymer segments called “side branches”, of an identical or different chemical nature, also linear but significantly shorter than the skeleton, attached covalently to said skeleton by one of their ends.
  • side branches of an identical or different chemical nature, also linear but significantly shorter than the skeleton, attached covalently to said skeleton by one of their ends.
  • the polymeric segments constituting the skeleton and those constituting the lateral branches differ in their topological nature. If the polymer segments constituting the side branches of the comb polymer and those constituting its skeleton also differ in their chemical nature, the polymer has both the characteristic of "comb polymer” and that of "block copolymer".
  • Such polymers, called “comb copolymers” constitute a subset of the comb polymers and can of course be used in the context of the invention.
  • the number of polymer segments of a given chemical or topological type present in the polymers according to the invention is understood to be an average value, it being understood that it is always a population of a large number of molecules, having in said numbers a certain polydispersity.
  • all the molecular masses, as well as all the means on sets of chains or on sets of polymeric segments, such as the average molecular mass, the average number of atoms along the skeleton, the number of junction points, or even the number means of grafts in the case of a comb polymer are understood as mass averages in the usual sense of polymer physics.
  • the polymer according to the invention is of irregular type, that is to say that all of the segments of at least one type of chemical or topological nature entering into its composition exhibit a polymolecularity of at least 1, 5, and preferably greater than 1, 8.
  • the polymolecularity of a type of polymer segment entering into the composition of a polymer according to the invention is understood as the average value of the molecular mass of said segments, taken over all of the segments of this type (average in mass in the usual sense of the physicochemistry of polymers)
  • a preferred variant of an irregular comb polymer consists in presenting a polymolecularity of the lateral branches of at least 1.5, and preferably greater than 1.8.
  • Another preferred variant of an irregular comb polymer consists in presenting a polymolecularity of the skeleton segments comprised between two lateral branches of at least 1.5, and preferably greater than 1.8.
  • the segments of each of the types of chemical or topological nature entering into the composition of the polymer according to the invention have a polymolecularity of at least 1.5, and preferably greater than 1.8. .
  • the polymers according to the invention have a molecular mass (average in mass) greater than 50,000, preferably greater than 300,000, more preferably greater than 1,000,000, and still more greater than 3 000,000.
  • the polymolecularity of the polymers according to the invention is greater than 1.5, and preferably greater than 1.8.
  • the length and the number of polymer segments present in the comb polymers or the copolymers used in the media according to the invention, as well as their chemical nature, can vary significantly within the scope of the invention, and it is thus possible greatly vary the properties of said media according to the desired application, as will be shown more precisely in the description of the examples of implementation.
  • the polymers contained in the solution according to the invention show a significant affinity for the walls of said channel, in the presence of the fluid within which the transport or separation takes place.
  • a particularly preferred mode consists of a copolymer having at least one type of polymeric segments showing, in the presence of the fluid, a particular affinity with the wall, and at least one type of polymeric segments having in said fluid less or no affinity with Wall.
  • types of polymer segments having no affinity with the wall are made of polymers that are easily soluble in the fluid.
  • polymers which are soluble in the fluid there may exist polymers which are soluble in the fluid, and which nevertheless have in it a particular affinity for a wall.
  • segments without affinity with the wall are typically very hydrophilic segments.
  • segments with affinity are not very hydrophilic or even hydrophobic.
  • other more specific types of affinity can be used, depending on the nature of the wall and that of the fluid.
  • Copolymers optimized for the implementation of the invention are in particular those in which the set of segments having a particular affinity with the wall represents between 2 and 80% by mass, preferably between 5 and 50%, of the molar mass average total of said copolymers, or between 3 and 90% and preferably between 5 and 60% of the total composition of the copolymers in number of moles of monomers.
  • the copolymers optimized for the implementation of the invention are in particular those in which the set of segments having a particular affinity with the wall represents between 2 and 25% by mass, preferably between 5 and 15%, of the average total molar mass of said copolymers, or between 3 and 30% and preferably between 5 and 20% of the total composition of the copolymers in number of moles of monomers.
  • the set of segments having a particular affinity with the wall represents between 2 and 25% by mass, preferably between 5 and 15%, of the average total molar mass of said copolymers, or between 3 and 30% and preferably between 5 and 20% of the total composition of the copolymers in number of moles of monomers.
  • a preferred variant consists in alternating, along the polymer, segments having a particular affinity with the wall, and segments having less or zero affinity for the wall;
  • all or part of said polymer is in the form of comb copolymers, the skeleton of which consists of several polymer segments having a particular affinity with the wall, and the lateral branches of which consist of segments polymers with little or no affinity for the wall.
  • all or part of said polymer is in the form of comb copolymers, the lateral branches of which are constituted by polymer segments having a particular affinity for the wall, and the skeleton of which consists of polymer segments having a less or no affinity for the wall.
  • the set of polymer segments of a given type of chemical or topological nature has, along their skeleton, a number of atoms greater than 75, and preferably still greater than 210, or has a molecular mass greater than 1500, and preferably greater than 4500.
  • the different types of segments have, along their skeleton, an average number of atoms greater than
  • polyacrylamide and polyacrylic acid As a representative of the types of polymer segments having in an aqueous fluid little or no affinity with the walls, there may be mentioned in particular polyacrylamide and polyacrylic acid, poly N-isopropylacrylamide, polyacryloylaminopropanol, acrylic polymers and copolymers and water-soluble allylics, dextran, polyethylene glycol, polysaccharides and various cellulose derivatives such as hydroxyethylcellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, or methylcellulose, polyvinyl alcohol, polyurethanes, polyamides polysulfonamides, polysulfoxides, polyoxazoline, polystyrenesulfonate, as well as polymers carrying hydroxyl groups and all the random copolymers of the derivatives mentioned above.
  • polymeric segments soluble in the fluid can be used according to the invention, depending on the nature of said fluid and that of the walls of the channel or container, the particular application and the ease of introducing them. within a block polymer of desired structure.
  • polymer segments can be chosen to constitute the polymer segments constituting a polymer according to the invention, depending on the electrolyte envisaged, among the types of polymers known to those skilled in the art, in particular among those soluble in aqueous medium. It is thus possible to refer to the book "Polymer Handbook” Brandrupt & Immergut, John Wiley, New York.
  • Another preferred mode of implementation which is particularly advantageous when the species to be separated are biological macromolecules, consists in using copolymers according to the invention which also have a different affinity with different analytes.
  • This affinity can be obtained by integrating into the structure of said polymers segments capable of exhibiting a specific affinity for certain species to be separated.
  • Such segments can be constituted for example and in a non-exhaustive manner, by a predetermined sequence of different monomers, such as a polynucleotide or a polypeptide.
  • This affinity can also be obtained by combining with the polymer according to the invention a native or denatured protein, a protein fraction or a protein complex, or an acid or basic function, and / or an acid or base function in the Lewis sense. .
  • the polymers according to the invention can be natural or synthetic polymers. According to a particularly advantageous additional mode, thanks to the control which it allows on the structure, the polymers according to the invention are synthetic polymers.
  • the invention is particularly suitable for:
  • - copolymers of the comb copolymer type the skeleton of which is of a type selected for its strong affinity with a wall of the channel or of the container of a particular chemical nature, and in particular of the polyolefin type, polymer of aromatic derivatives, of fluoroalkyls , silanes, fluorosilanes, and carries side segments of the polymer type dextran, agarose, acrylamide, substituted acrylamide, acrylic acid, acryloylaminoethanol, dimethylacrylamide (DMA), allylglycidylether (AGE), random copolymer of DMA and AGE, oxazoline of oxazoline derivatives, dextran, methylcellulose, hydroyethylcellulose, modified celluloses, polysaccharides, ether-oxides, N- isopropylacrylamide.
  • DMA dimethylacrylamide
  • AGE allylglycidylether
  • copolymers according to the invention are advantageous because of their capacity to combine properties belonging to polymers of different chemical nature, which cannot always be combined in a homopolymer or a random copolymer. Thus, they make it possible to adapt the chemical nature of the copolymer more flexibly, as a function on the one hand of the chemical nature of the fluid, and on the other hand of the chemical nature of the wall of the channels or containers.
  • channels or containers made of polymers or elastomers such as PDMS (polydimethylsiloxane), PMMA (polymethylmethacrylate), polycarbonate, polyethylene, polypropylene, - polyethylene terephthalate, polyimide, polycyclohexane, polyurethanes or inorganic materials such as ordinary glass, borosilicate glass, pyrex, fused silica, silicon oxide, ceramics, silicon, diamond, zirconia, semiconductors .
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • polycarbonate polyethylene
  • polypropylene polypropylene
  • - polyethylene terephthalate polyimide
  • polycyclohexane polyurethanes or inorganic materials
  • inorganic materials such as ordinary glass, borosilicate glass, pyrex, fused silica, silicon oxide, ceramics, silicon, diamond, zirconia, semiconductors .
  • the polymers according to the invention have the unique property of being able to have on each polymer, a large number of polymer segments having a significant affinity with the wall, which allows a high energy of adsorption, and therefore a reduction durable electroosmosis, while also containing a large number of loops not having affinity with the walls, which can be used to avoid the adsorption of species.
  • preparation of the polymers used according to the invention can be carried out by any conventional technique of polymerization or polycondensation.
  • the choice of preparation method is generally carried out taking into account the desired structure for the polymer, namely comb or linear, and the chemical nature of the various blocks constituting it.
  • polymers are obtained by: polycondensation, polymerization or copolymerization, ionic or radical, of identical or different monomers, of identical or different macromonomers, or of a mixture of monomers and macromonomers or by grafting of several polymer segments onto a linear or branched polymer backbone of identical or different chemical nature.
  • the term reactive function means a group allowing the molecule carrying this group to be integrated into the macromolecule during the copolymerization reaction without interrupting said copolymerization.
  • said solution may include, as a base for the dissolution of the copolymers according to the invention, a aqueous solution (preferably buffered), an organic solvent, a hydroorganic solvent or an electrolyte.
  • the polymers contained in the solutions of surface treatment according to the invention are fixed on the solid walls by physical adsorption without establishing a covalent bond.
  • the polymers contained in the surface treatment solutions according to the invention are fixed to the solid walls by one or more covalent bonds.
  • the person skilled in the art is capable of preparing polymers in accordance with the invention, by adapting the structure, the nature and the method of preparation of said polymers in depending on the properties sought for one application or another.
  • the subject of the invention is also a method of surface treatment of an element, in particular to avoid the phenomena of electroosmosis and / or non-specific adsorption of species liable to appear at this surface during its contact with a fluid and / or species contained in this fluid.
  • it is a method of surface treatment of an element intended to be brought into contact with a fluid and / or of the species contained in this fluid during transport, analysis, purification, - separation and / or conservation of said fluid comprising bringing said element into contact with at least one non-crosslinked polymer, of the block-copolymer or comb polymer type and having on average at least three junction points between polymer segments of different chemical or topological nature.
  • the polymer is used in the form of an aqueous solution of polymer as claimed and preferably containing said polymer at a concentration of between 0.01% and 20% and more preferably between 0.1 and 5% by mass.
  • the method comprises the treatment of the element, before its use, with a treatment solution in accordance with the invention.
  • this solution is of a composition different from that of the fluid intended to be transported or preserved.
  • this solution has a composition different from that of the separation medium.
  • the treatment is obtained by leaving said solution in contact with the walls for the necessary time. Depending on the applications and embodiments, this time can be very variable, ranging from a fraction of seconds to several hours, or even for the most difficult applications several days.
  • This solution is then extracted from the channel or container, before or simultaneously with its filling with said fluid.
  • said fluid does not for its part contain the polymers according to the invention.
  • the latter remain present in the channel or the container only in a form adsorbed on the walls, and do not contribute to altering the properties of said fluid. In particular, they do not significantly increase its viscosity.
  • this treatment can be repeated between each transport or separation operation, or on the contrary after a given number of separations, or even - when there is a degradation of the properties which makes it necessary.
  • the contacting of said surface treatment solution with the surface of the element vis-à-vis which it is desired to reduce non-specific adsorption or electroosmosis can be followed by a treatment intended to reinforce the action of said solution, such as, by way of example and without limitation, a heat treatment, a treatment by radiation (light radiation, Ultraviolet, X-rays, Gamma, etc.) , the drying of the wall, or its incubation in the presence of a liquid different from said solution.
  • a treatment intended to reinforce the action of said solution such as, by way of example and without limitation, a heat treatment, a treatment by radiation (light radiation, Ultraviolet, X-rays, Gamma, etc.) , the drying of the wall, or its incubation in the presence of a liquid different from said solution.
  • the surface of the element can be "regenerated" before the treatment, by a solution intended to clean the wall impurities adsorbed during the separations.
  • Such treatments are known to those skilled in the art, and may advantageously comprise washing with an acid solution, with an alkaline solution, with a detergent solution, with an organic solvent, or by a combination of these methods.
  • the claimed method comprises adding said polymer to the fluid to be transported, analyzed, purified, separated and / or preserved.
  • the copolymers characterizing the surface treatment solutions according to the invention are preferably introduced directly into the fluid transported, stored or used as separation medium, at a concentration low enough not to significantly modify otherwise the other properties of use of said fluid, and in particular without increasing its viscosity beyond a factor of 2, compared with the same fluid in the absence of said polymers.
  • the polymers according to the invention do not modify the viscosity of said fluid beyond a factor of 1.5.
  • the fluid into which the polymer according to the invention is directly introduced it may advantageously contain, in addition to the polymers according to the invention, other elements, and in particular components interacting with the species either by steric interaction or by affinity, and capable of inducing a total or partial separation between them.
  • other elements such as linear hydrophilic polymers, micelles, surfactants, chiral compounds, are known to those skilled in the art.
  • the present invention extends to any separation, filtration, analysis and / or purification process involving the implementation of the claimed process.
  • These filtration, separation, analysis and / or purification methods are partially identified below.
  • the present invention also relates to an element, preferably a channel, container, or particles, or any element intended to constitute a wall of a channel or a container used during a transport, analysis or purification operation. for preserving or separating a fluid or species contained in this fluid, or for entering into the constitution of said wall, treated with the claimed surface treatment solution.
  • Such elements can be used for the separation, purification, filtration or analysis of species chosen from molecular or macromolecular species, and in particular biological macromolecules such as nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides), analogs of nucleic acids obtained by synthesis or chemical modification, proteins, polypeptides, glycopeptides and polysaccharides, organic molecules, synthetic macromolecules or particles such as mineral particles, latex, cells or organelles.
  • nucleic acids DNA, RNA, oligonucleotides
  • analogs of nucleic acids obtained by synthesis or chemical modification
  • proteins proteins
  • polypeptides glycopeptides and polysaccharides
  • organic molecules synthetic macromolecules or particles
  • synthetic macromolecules or particles such as mineral particles, latex, cells or organelles.
  • the elements treated according to the invention are also particularly useful for DNA sequencing, insofar as they make it possible to obtain minimum bandwidths. Likewise, they prove to be suitable for the separation of proteins, proteoglycans, or cells, for which it is known that the problems of adsorption on the walls are particularly troublesome and particularly difficult to solve.
  • the surface treatment solutions according to the invention, the methods involving these solutions and more particularly the elements treated according to the invention are useful for diagnostic, genotyping, high throughput screening, quality control, or for detecting the presence of genetically modified organisms in a product.
  • the invention is also particularly advantageous for so-called hybridization or affinity techniques, in which it is desired to analyze or separate, within a channel or a container, the species contained in a sample, according to their respective specific affinity for ligands. These ligands are either contained in said channel or container, or fixed at predetermined locations on the walls of said container or said channel.
  • the invention makes it possible to carry out this type of analysis, while avoiding or minimizing non-specific adsorption of said species on the walls of the channel or of the container, or on solid surfaces contained in said channel or in said container.
  • this type of ligand can be associated with the element namely channel, container, element entering into the composition of said channel or container, or particles, by means of a treatment with a solution for treating surface according to the invention.
  • the treatment solution according to the invention performs two functions. It reduces non-specific adsorption and provides said ligands or helps immobilize them at the level of said element.
  • a family of polymers particularly advantageous for affinity analysis applications consists of a block copolymer having simultaneously
  • Said ligands can be in particular oligonucleotides, proteins, antibodies, peptides, or more generally polymers or fragments of biological or synthetic polymers.
  • the advantage of the invention in this application is to maintain the ligands linked to said walls or surfaces indirectly, while maintaining said ligands at a significant distance from the latter.
  • the polymer segment or segments carrying the ligands do not have any affinity with the wall and are therefore repelled by the steric interactions.
  • the polymers according to the invention therefore allow the analytes to interact with the ligands, without approaching the walls.
  • the present invention also relates to the use of the claimed solution to minimize the phenomena of adsorption or electroosmosis manifested at the surface or surface (s) of an element intended to be brought into contact with a fluid. and / or the species contained in this fluid during transport, analysis, purification, separation or conservation of said fluid.
  • the invention is particularly advantageous for the transport, analysis, or conservation of a biological fluid containing or liable to be contaminated with mineral, organic or biological products or living organisms.
  • the surface treatment solutions, the method and the claimed components are particularly useful for microfluidic systems, microtitration plates, "DNA and protein chips", and more generally all the systems of transport and analysis involving large surface / volume ratios, because they allow, through the optimal choice of different types of blocks within polymers, to combine blocks with good affinity for the surface of the walls to obtain a durable treatment, and blocks having good repulsion for the species to be separated, regardless of said species and the chemical nature of said component.
  • the figures and examples given below are presented by way of illustration and without limitation of the present invention.
  • FIGURES are a diagrammatic representation of FIGURES.
  • Figure 1 Control electropherogram representing the separation of the sizer 50-500 bp, Pharmacia biotech, obtained at 50 ° C in an ABI 310 device (Perkin-Elmer), using as buffer medium 100 mM Na TAPS buffer, 2 mM EDTA , 7 M Urea, in which 5% by weight of linear acrylamide is dissolved (molecular weight 700,000-1,000,000), in an untreated capillary. The numbers above the peaks indicate the size of the corresponding DNA fragment.
  • Figure 2 Control electropherogram representing a separation identical to that of Figure 1, in a capillary previously treated for 2 hours with a 3% aqueous solution of triblock copolymer "pluronic F127" (BASF). The numbers above the peaks indicate the size of the corresponding DNA fragment.
  • Figure 3 Electropherogram showing a separation identical to that of Figure 1, in a capillary previously treated for 2 hours with a 3% aqueous solution of comb polymer of the hydroxyethylcellulose skeleton type, carrying side chains of the short alkyl chain type ( NATROSOL PLUS 331, Aqualon). The numbers above the peaks indicate the size of the corresponding DNA fragment.
  • FIG. 4 Electropherogram representing a separation identical to that of FIG. 1, in a capillary previously treated for 2 hours min with a 3% aqueous solution of the copolymer according to the invention "PDMA-NIPAM” described in Example 2. The numbers above the peaks indicate the size of the corresponding DNA fragment.
  • FIG. 5 Electropherogram representing a separation identical to that of FIG. 1 in an untreated capillary, with addition to the separation medium of copolymer according to the invention "PDMA-NIPAM" described in Example 2 at a mass concentration of 0.5%. The numbers above the peaks indicate the size of the corresponding DNA fragment.
  • FIG. 6 Electropherogram showing a separation identical to that of Figure 2, 6a / with addition to the polymer separation medium "PAM-
  • Figure 7 Comparison of the calculated resolution between peaks differing from one base to 500 bases, obtained at 50 ° C in an ABI 310 device (Perkin-Elmer), using as buffer medium 100 mM Na TAPS buffer, 2 mM EDTA , 7 M Urea, in which 5% of linear acrylamide is dissolved (molecular weight 700,000 ⁇ 1,000,000), in an initially untreated capillary ("without treatment"), and after prior treatment of the capillary with an aqueous solution at 3% of the different polymers F127, Natrosol Plus, "PDAM-NIPAM” described in Example 2 and PAM-PDMA-1 described in Example 4.
  • Figure 8 Comparison of the resolution according to the number of base pairs for the separation of a "50-500bp sizer" (Pharmacia-Amersham), in a 5% solution of linear polymacrylamide having no wall treatment properties , in a 2mM EDTA buffer, 0.1 M Taps, 7M urea, with the addition of 0.5% of the polymers according to the invention following poly (AM-PDMA) -1 (prepared according to example 4), poly (AM-PDMA) -2 (prepared according to example 8), poly (AM-PDMA) -3, (prepared according to example 9), poly (DMA-PNIPAM) (prepared according to Example 2), and by way of comparison with the addition of 0.5% of linear homopolymer of PDMA
  • the radical polymerization of NIPAM is carried out in pure water.
  • the initiator is a redox couple whose oxidant is potassium persulfate, K 2 S 2 0 8 (KPS) and the reducing agent is aminoethanethiol (AET), HCI.
  • the priming reaction is:
  • the AET.HCI also acts as a transfer agent, which makes it possible to control the length of the chains.
  • the PNIPAM macromolecules synthesized have amino functions at the end of the chains, these originating from the aminoethanethiol initiator AET.HCI.
  • the reaction medium is stirred for one hour.
  • the acrylic acid being in strong excess compared to PNIPAM (the quantity of acrylic acid is approximately twenty times that of PNIPAM), the whole of the amino functions was amended.
  • the mixture is then filtered on a No. 4 frit to remove the dicyclohexylurea precipitate, a by-product resulting from the transformation of DCCI.
  • the mixture is then concentrated to 15 ml and then poured dropwise into 200 ml of ether to precipitate the polymer. It is filtered on a No. 4 frit and the solid is washed with three times 100 ml of ether and then it is dried under vacuum with the vane pump overnight.
  • a PNIPAM-C macromonomer is thus obtained carrying an allyl function at the end of the chain, with a mass yield of the order of 70%.
  • NIPAM macromonomers
  • the copolymerization of PNIPAM-C (0.7g) and DMA (2; 8g) is carried out for 4 hours in 30 ml of water at room temperature, with vigorous degassing with argon.
  • the initiator used is the redox ammonium persulfate ((NH 4 ) 2 S 2 0 8 ) (0.1 mol% of the amount of monomers) - sodium metabisulfite (Na 2 S 2 0 5 ) pair . (0.03% by mole of the amount of monomers).
  • the resulting copolymer is purified by ultrafiltration in a "Minitan millipore®", equipped with a membrane with a cutoff threshold of 30,000, then lyophilized.
  • the final incorporation rate of PNIPAM 10, measured by proton NMR on the polymers diluted to 2g / 100ml in heavy water (Bruker apparatus at 250 MHz) is 6.5%.
  • Preparation of a PDMA-type macromonomer carrying an acrylic function at one end the reaction is carried out according to the same protocol as for Example 1, by replacing one mole of NIPAM with one mole of DMA.
  • the purification is carried out by precipitation in ether then filtration.
  • the copolymerization of the pDMA macromonomers prepared in Example 3 (0.7g) and acrylamide (2; 8g) is carried out for 4 h in 30 ml of water at room temperature, with vigorous degassing with argon.
  • the initiator used is the redox ammonium persulfate ((NH 4 ) 2 S 2 0 8 ) pair (0.1 mol% of the amount of monomers) - sodium metabisulfite (Na 2 S 2 0 5 ) (0 , 03 mol% of the amount of monomers).
  • the resulting copolymer is purified by ultrafiltration in a "Minitan millipore®", equipped with a membrane with a cutoff threshold of 30,000, then lyophilized.
  • the proportion by mass of pDMA, measured by NMR, is 6.5%, which corresponds on average to 5 lateral branches along the skeleton.
  • the radical polymerization method used leads to a high polymolecularity of the polymer segments of the skeleton comprised between two lateral branches.
  • copolymers according to the invention considerably improves the fineness of the peaks, whether in the form of treatment of the capillary before separation (FIGS. 3 and 4), or in the form of additive in the medium of separation itself (Fig. 5).
  • This increase very marked with respect to the untreated capillary (FIG. 1), is also significant compared to a capillary treated with a commercial block copolymer which does not have the minimum number of polymer segments which characterizes the invention (FIG. 2 ).
  • the copolymers having lateral branches of high molecular weight and of irregular length lead to better separations than those having branches of low molecular weight and monodisperse (FIG. 3).
  • FIG. 7 represents the resolution extrapolated between peaks differing from a base, evaluated by interpolation from the results of the "Sizer 500". It is again noted that this resolution is improved by the polymers according to the invention.
  • This finesse of the peaks is attributed to the property of the methods according to the invention, which make it possible to reduce the interaction of the analytes with the wall.
  • the best performance obtained with the copolymers having high and irregular molecular weight polymer segments is attributed to the formation of a thick and "flexible" adsorbed layer: Such a layer would repel the analytes from the wall, while remaining very swollen with water and therefore unlikely to give specific interactions with them.
  • a microfluidic cell comprising a channel 20 ⁇ m thick and 100 ⁇ m wide is prepared with poly-dimethyl-siloxane, as described in Ocvirk et al., Electrophoresis, 21, 107 (2000).
  • the walls of the canal are treated by incubation for 30 min a / with a 3% solution of "Pluronics F127 ", and b / with a 3% solution of polymers according to the invention PDMA-NIPAM, prepared according to example 2.
  • the channel is rinsed, then filled with a solution of magnetic particles and subjected to a magnetic field of 60 mTestla, as described in Mayer et al., Mat. Res. Soc. Sy p. Proc.
  • the preparation is identical to that described in Example 4, except for the concentration of ((NH 4 ) 2 S 2 0 8 ) [0.1% instead of 0.075%, in mole of the amount of monomers] and in (Na 2 S 2 0 5 ) (0.015% instead of 0.0225%, in mole of the amount of monomers).
  • the viscosity, presented in FIG. 6, makes it possible to evaluate the molecular mass, of the order of 3000 k Dalton, from that of p (AM-PDMA) -1, using the cubic dependence of the viscosity as a function of molecular weight for entangled polymers.
  • the macromonomer with a molecular mass of 30,000 is prepared as described in Example 3, with the exception of the Ro ratio, fixed at 0.015 instead of 0.03.
  • This macromonomer is then polymerized with acrylamide, according to the protocol described in Example 9.
  • EXAMPLE 10 Evaluation of the performance of separation media incorporating a copolymer in accordance with the present invention.
  • the polymers added in an amount of 0.5% are: - poly (AM-PDMA) -1 prepared according to Example 4,
  • copolymers according to the invention give rise to performances comparable or superior to those of PDMA homopolymers, despite a much lower fraction of monomers having a strong affinity for the wall. It is also noted that the polymers of higher molecular weight (poly (AM-PDMA) -2), as well as those whose grafts are of higher molecular weight (poly (AM-PDMA-3), lead to the best resolution. On the contrary, the more hydrophobic polymer (poly (PDMA-NIPAM) leads to - less good resolution. In the particular case of poly (AM-PDMA) -2, 10 consecutive tests were carried out without intermediate regeneration of the walls of the channel.

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Abstract

La présente invention a pour objet une solution de traitement de surface d'un élément destiné à être mis en contact avec un fluide et/ou des espèces contenues dans ce fluide lors du transport, de l'analyse, de la purification, de la séparation ou de la conservation dudit fluide, caractérisée en ce que ladite solution comprend au moins un polymère composé de plusieurs segments polymériques, ledit polymère étant du type copolymère-bloc ou polymère en peigne et présentant en moyenne au moins trois points de jonction entre des segments polymériques de nature chimique ou topologique différente. Elle a également pour objet des procédés pour traiter à l'aide de ladite solution, un élément destiné à être mis en contact avec un fluide et/ou des espèces contenues dans ce fluide lors de la conservation, du transport, de l'analyse, de la purification ou de la séparation dudit fluide.

Description

SOLUTION DE TRAITEMENT DE SURFACE MINIMISANT LES PHÉNOMÈNES D'ADSORPTION ET/OU D'ELECTROOSMOSE. La présente invention concerne le transfert, l'analyse, la purification ou la séparation, au sein d'un canal, d'un fluide ou d'espèces contenues dans ledit fluide, ou la conservation d'un fluide dans un récipient, et vise plus particulièrement à proposer une solution de traitement de surface utile pour réduire significativement l'adsorption non-spécifique d'espèces contenues dans ce fluide, sur les parois dudit canal ou dudit récipient.
L'invention est plus particulièrement avantageuse pour les méthodes dans lesquelles ledit fluide est contenu dans des canaux ou des capillaires dont l'une des dimensions au moins est submillimétrique, et typiquement comprise entre 1 μm et 200 μm (appelés dans la suite microcanaux).
Plus particulièrement, l'invention a trait aux techniques d'analyse ou de séparation d'espèces, selon lesquelles il est nécessaire de transporter lesdites espèces dans un canal, tout en minimisant les interactions non-spécifiques desdites espèces ou d'autres composantes dudit milieu, avec les parois dudit canal ou plus généralement avec des parois ou éléments solides présents dans - ledit canal ou ledit milieu. Il s'agit en particulier de méthodes de séparation ou d'analyse de macromolécules biologiques- par électrophorèse capillaire, par chromatographie, ou par toute méthode mise en jeu dans des microcanaux (systèmes microfluidiques, "laboratoires sur puces"). Des exemples de tels systèmes sont décrits par exemple dans " Capillary electrophoresis in analytical biotechnology" , Righetti éd., CRC press, 1996, ou dans Cheng, J.et coll., (1996), Molecular Diagnosis, 1 , 183-200. L'invention est particulièrement utile dans le cas de l'électrophorèse.
L'invention a également trait aux techniques dites d'hybridation ou d'affinité, dans lesquelles on souhaite analyser, au sein d'un canal ou d'un récipient les espèces contenues dans un échantillon, en fonction de leur affinité spécifique vis à vis de ligands contenus dans le dit canal ou récipient, ou fixés à des emplacements prédéterminés sur les parois dudit récipient ou dudit canal. Dans le cadre de l'invention, on entend utiliser "adsorption non- spécifique", selon l'acceptation usuelle chez l'homme de l'art, comme une interaction attractive entre certaines espèces ou impuretés contenues dans un échantillon et les parois du récipient et du canal, et dépendant de façon faible ou insuffisamment contrôlée des caractéristiques desdites espèces ou impuretés. Dans la suite, on utilisera indifféremment "adsorption" ou "adsorption non-spécifique" pour désigner cette dernière, par opposition à. une interaction d'affinité spécifique. Par affinité, on entend une interaction entre une espèce et un substrat, dont la force dépend de ladite espèce et dudit substrat de façon importante, et en tout état de cause suffisante pour induire la séparation ou l'identification de différentes espèces en fonction de leurs caractéristiques biologiques ou physico-chimiques.
Dans ce qui suit, on désignera par "système "microfluidique", tout système dans lequel des fluides et/ou des espèces contenues dans un fluide sont mus au sein d'un canal ou d'un ensemble de canaux dont l'une des dimensions au moins est submillimétrique, et on désignera par électrophorèse capillaire (EC) les systèmes microfluidiques dans lesquels le transport desespèces s'effectue sous l'action d'un champ électrique. LΕC et les systèmes microfluidiques permettent des séparations plus rapides et plus résolutives que les méthodes plus anciennes d'électrophorèse sur gel, ne réclament pas de milieu anticonvectif, et leurs propriétés ont été utilisées largement pour effectuer des séparations d'ions en milieu liquide.
A l'heure actuelle, la grande majorité des séparations de macromolécules biologiques effectuées en EC ont recours, en tant que milieu de séparation, à des solutions de polymères hydrosolubles linéaires non- réticulés présentant l'avantage de pouvoir être remplacées aussi souvent que nécessaire. De nombreux polymères non réticulés ont été proposés comme milieux pour la séparation d'espèces au sein d'un canal, en particulier dans le contexte de l'électrophorèse capillaire. Un problème majeur pour toutes les méthodes mettant en jeu des espèces au sein de canaux est l' adsorption non spécifique desdites espèces aux parois desdits canaux. Ce problème est particulièrement exacerbé dans le cas de canaux de petites dimensions et de macromolécules biologiques, ces dernières étant souvent amphiphiles.
Ce phénomène d'adsorption non spécifique aux parois d'espèces contenues dans l'échantillon ou le fluide a pour conséquence de retarder certains analytes et de créer une dispersion supplémentaire et donc une perte de résolution, dans le cas des méthodes analytiques. Cette adsorption peut également donner lieu à une contamination des parois du canal, susceptible d'affecter les fluides qu'on souhaite introduire dans ce dernier par la suite. Enfin, si l'analyse qu'on souhaite effectuer sur les espèces met en jeu une interaction spécifique des espèces avec le milieu de séparation, comme dans les méthodes de chromatographie, d'électrochromatographie ou d'électrophorèse d'affinité, ou avec des zones prédéterminées des parois, comme dans les méthodes d'hybridation telles que les "puces à ADN" ou les "puces à protéines", ou encore avec des parois solides contenues dans le canal ou récipient, comme dans les méthodes de séparation par affinité avec des latex. Ces phénomènes d'adsorption peuvent entrer en compétition avec; les interactions spécifiques recherchées, et fausser ou empêcher l'analyse.
Une autre limitation, qui concerne plus particulièrement les méthodes de séparation électrocinétiques, est l'électroosmose, un mouvement d'ensemble du milieu de séparation dû à la présence de charges sur les parois du capillaire ou du canal. Ce mouvement étant souvent variable dans le temps et non- uniforme, il nuit à la reproductibilité des mesures et à la résolution. Il est dû aux charges qui peuvent être présentes à la surface du capillaire du fait de sa structure chimique, mais peut également être généré ou augmenté par l'adsorption sur la paroi d'espèces chargées initialement contenues dans les échantillons à séparer, et en particulier des protéines.
La présente invention est plus particulièrement concernée par l'inhibition de ces deux phénomènes, à savoir adsorption des espèces aux surfaces et/ou électroosmose. Des méthodes ont déjà été proposées pour combattre l'électroosmose et/ou l'adsorption d'espèces à des surfaces. Un premier type de méthodes implique un traitement de la surface du canal par adsorption d'espèces essentiellement neutres, préalablement à la séparation proprement dite (Wi torowicz et coll., Electrophoresis, 11 , 769, 1990, Tsuji et coll., J. Chromatogr. 594, 317 (1992). Il a également été proposé d'adsorber des agents de surface de charge opposée à celle de la paroi, pour renforcer l'adhésion par interactions électrostatique.
En fait, ces méthodes réduisent dans une certaine mesure l'électroosmose, mais elles sont peu efficaces pour empêcher l'adsorption d'espèces complexes de forte masse moléculaire, telles que par exemple les protéines.
Une solution plus efficace consiste à greffer de façon irréversible une couche polymérique essentiellement neutre tel que l'acrylamide ou l'alcool polyvinylique sur les parois, comme par exemple décrit dans US 4 680 201 , ou encore US 5 502 169, ou US 5 112 460. Des capillaires traités prêts à l'emploi sont ainsi disponibles commercialement. Ces capillaires traités de façon irréversible conduisent à une bonne réduction de l'électroosmose pour un certain nombre de séparations. Malheureusement, leur durée de vie est limitée et leur coût élevé.
Il a également été proposé d'utiliser au sein du milieu de séparation des polymères à propriétés d'adsorption aux parois, telles que la méthylcellulose (Hjerten, Chromatographie reviews, 9, 122, 1967), ou la polyvinylpyrolidone (Mazzeo et coll., Anal. Chem., 63, 2852, 1991 ). Dans la demande WO 98/10274, il est proposé des copolymères présentant une affinité avec les parois de silice et capables de réduire significativement l'électrosmose. Les polymères décrits sont des polymères triblocs de faibles masses moléculaires (typiquement inférieures à 20 000), de la famille polyoxyéthylène- polyoxypropylène-polyoxypropylène (POE-POP-POE). Cependant, ces polymères ont une gamme d'applications limitée. Ils nécessitent un changement de température entre l'introduction dans le capillaire et la phase d'analyse, ils n'exercent leur effet bénéfique qu'à des concentrations élevées, et ils sont également relativement hydrophobes ce qui les rend impropres par exemple au sequençage de l'ADN. De plus, dans ces différentes méthodes de l'art antérieur mettant en jeu des polymères au sein du milieu de séparation, la présence du polymère s'accompagne d'une variation importante des propriétés physiques, et en particulier d'une augmentation importante de la viscosité, qui peut poser des problèmes pour l'introduction du fluide dans le canal, et pour les propriétés de séparation elles-mêmes.
Dans US 5, 552 028, il est également proposé d'utiliser des milieux de séparation comportant un milieu tamisant et un composant d'interaction de surface constitué par un polymères à propriétés d'adsorption aux parois, de masse moléculaire comprise entre 5 000 et 1 000 000, du type polymère de d'acrylamide disubstitué. Ces matrices, et plus particulièrement le polydiméthylacrylamide (PDMA) permettent de réduire l'électroosmose et conduisent pour certaines applications, comme le sequençage, à de bonnes propriétés de séparation. Cependant, elles sont relativement hydrophobes, ce qui limite leurs performances pour certaines applications comme le séquençage- de l'ADN, et est encore plus néfaste pour d'autres applications comme la séparation de protéines. Par ailleurs, elles conduisent à des séparations lentes. En conséquence, bien que de nombreuses méthodes aient été proposées pour réduire l'adsorption aux parois et/ou l'électroosmose, elles ne s'avèrent pas totalement satisfaisantes.
La présente invention a précisément pour objet de proposer une nouvelle famille de solutions de traitement de surfaces, avantageuse pour minimiser les phénomènes d'adsorption non-spécifique et d' électroosmose.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet une solution de traitement de surface d'un élément destiné à être mis en contact avec un fluide et/ou des espèces contenues dans ce fluide lors du transport, de l'analyse, de la purification, de la séparation ou de la conservation dudit fluide, caractérisée en ce que ladite solution comprend au moins un polymère composé de plusieurs segments polymériques, ledit polymère étant du type copolymère-bloc ou polymère en peigne et présentant en moyenne au moins trois points de jonction entre des segments polymériques de nature chimique ou topologique différente. On entend par "réticulé", selon l'acceptation habituelle chez l'homme de l'art, un ensemble de polymères présentant entre eux un réseau à grande échelle de points de réticulation, qui confère à cet ensemble de polymères les propriétés d'un solide ou d'un gel.
Au sein de la présente invention, on entend plus particulièrement désigner sous le terme "élément", principalement tout canal utilisé pour le transport, l'analyse, la purification et la séparation d'un fluide ou d'espèces contenues dans ce fluide, ou tout récipient utilisé pour conserver un fluide. Sont également couvertes sous cette définition, les particules solides de type billes par exemple, susceptibles d'être mises en contact avec un fluide à des fins d'analyse, de séparation ou de purification, notamment par affinité. Cette définition s'étend également à tout élément destiné à constituer une paroi d'un canal ou d'un récipient utilisé lors d'une opération de transport, d'analyse, de- purification, de conservation ou de séparation d'un fluide ou d'espèces contenues dans ce fluide, ou à faire partie de ladite paroi. Entre en particulier dans le cadre de l'invention le traitement à l'aide d'une telle solution, de la surface de "puces à ADN", telles que décrites par exemple dans "Nature Genetics", 1999, 21 , 1-60, de "puces à protéines", de plaques de microtitration, ou plus généralement de surfaces destinées à être mises en contact avec un fluide dans un système d'analyse ou de séparation, ou dans un système de "criblage à haut débit".
Selon une variante privilégiée, le polymère selon l'invention est d'une composition chimique différente de celle des matériaux constituant ledit élément. Il peut ainsi conférer aux parois dudit canal ou dudit récipient des propriétés avantageuses, difficiles ou impossibles à obtenir en son absence compte tenu de la nature chimique des éléments composant le canal ou le récipient. Avantageusement donc, les polymères mis en jeu selon l'invention minimisent l'adsorption d'espèces aux parois et améliorent ainsi soit le taux de récupération de celles-ci, par exemple dans les systèmes préparatifs ou micropréparatifs, soit la résolution dans les méthodes analytiques, soit encore évitent la contamination desdites parois, en particulier lors du transport, de l'analyse ou de la conservation de fluides biologiques susceptibles de contamination.
Au sens de l'invention, on entend désigner par "polymère" un produit constitué par un ensemble de macromolécules et caractérisé par certaines propriétés telles que la masse moléculaire, la polymolécularité, la composition chimique et/ou la microstructure. On entend désigner par polymolécularité la distribution de masse moléculaire des macromolécules, au sens de la moyenne en masse familière aux hommes de l'art. Par microstructure, on entend la façon dont sont agencés au sein des macromolécules les monomères entrant dans leur composition chimique.
L'invention est particulièrement avantageuse dans le cas de méthodes de séparation d'espèces au sein d'un fluide. Au sens de l'invention, on entend couvrir sous l'expression séparation, toute méthode visant à séparer, identifier ou analyser, l'ensemble ou certaines des espèces contenues dans un échantillon. Le fluide est dans ce cas appelé "milieu de séparation". On entend désigner sous le terme "espèces" de manière générale des particules, organelles ou cellules, des molécules ou macromolécules, et en particulier des macromolécules biologiques comme les acides nucléiques (ADN, ARN, oligonucléotides), les analogues d'acides nucléiques obtenus par synthèse ou modification chimique, les protéines, les polypeptides, les glycopeptides et les polysaccharides. Dans les méthodes analytiques, les dites espèces sont communément appelées " analytes". L'invention est particulièrement avantageuse dans le cas de méthodes de séparation électrocinétiques.
On entend couvrir sous l'expression "séparation électrocinétique", toute méthode visant à séparer l'ensemble ou certaines des espèces contenues dans un mélange, en les faisant migrer au sein d'un milieu sous l'action d'un champ électrique, que le champ exerce son action motrice sur les analytes de façon directe ou indirecte, par exemple par l'intermédiaire d'un déplacement du milieu lui-même, comme dans l'électrochromatographie, ou d'un déplacement d'espèces annexes telles que des micelles, dans le cas de l'électrochromatographie micellaire, ou par n'importe quelle combinaison d'actions directes et indirectes. Sera également considérée comme une méthode de séparation électrocinétique selon l'invention toute méthode de séparation dans laquelle ladite action du champ électrique est combinée à une autre action motrice d'origine non-électrique. Sont de ce fait appelées "électrocinétiques", les méthodes d'électrophorèse capillaire ou d'électrophorèse sur "chips".
De façon avantageuse, en particulier dans le cas de séparations- électrocinétique, le fluide est constitué par un électrolyte.
Au sens de l'invention, on entend désigner par électrolyte, un milieu condensé capable de conduire les ions. Dans le cas le plus courant, ce milieu est un milieu aqueux tamponné, comme les tampons à base de phosphate, de tris(hydroxymethyl)aminométhane (TRIS), de Borate, de N- tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropane sulfonic acid (TAPS), d'histidine, de lysine, etc.. De nombreux exemples de tampons utilisables en électrophorèse sont connus de l'homme de l'art, et un certain nombre d'entre eux sont décrits par exemple dans " Sambrook et coll.", " Molecular Cloning: a laboratory manual" , Cold Spring Harbor Lab, New York, 1989. Cependant, tous types d'électrolyte peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention notamment les solvants hydroorganiques comme à titre d'exemple les mélanges eau- acétonitrile, eau-formamide ou eau-urée, les solvants organiques polaires tels que, encore à titre d'exemple, la N-methylformamide. Les électrolytes dits "tampons de sequençage", constitués par un tampon aqueux à pH alcalin additionné d'une proportion notable d'urée et/ou de formamide s'avèrent particulièrement utiles dans le cadre de l'invention.
On entend désigner par "canal" tout volume délimité par une ou plusieurs parois solides, et présentant au moins deux orifices, destiné à contenir ou à être traversé par un fluide. On entend désigner par "récipient" tout volume délimité par plusieurs parois solides, présentant au moins un orifice et utilisé pour contenir un fluide.
L'invention est particulièrement avantageuse dans les systèmes comportant au moins un canal ou un récipient dont une dimension au moins est de dimension submillimétrique, tels que les systèmes de séparation électrocinétique en capillaire, les systèmes microfluidiques, et plus généralement les systèmes pour la séparation d'espèces employant des micro canaux, des micro récipients ou des nanorécipients.
Selon une variante privilégiée, les polymères selon l'invention présentent en moyenne au moins quatre points de jonction, de préférence un nombre de- points de jonction compris entre 4 et 100, et plus préférentiellement un nombre de points de jonction compris entre 4 et 40. Par point de jonction, on entend un point reliant soit deux segments polymériques de nature chimique significativement différente, comme dans le cas d'un copolymère-bloc, soit un point de réticulation entre un nombre de segments polymériques, de nature chimique identique ou différente, supérieur à deux, comme dans les polymères en peigne. A titre d'exemple, un polymère en peigne comportant trois branches latérales comporte trois points de jonction et sept segments polymériques distincts. Toujours à titre d'exemple, un copolymère-bloc séquence de type A- B-A-B comporte trois points de jonction et quatre segments polymériques distincts. Au titre de l'invention, on entend désigner par "segment polymérique" ou
"segment" un ensemble de monomères liés entre eux de façon covalente et linéaire, et appartenant à un type donné de composition chimique, c'est-à-dire présentant globalement des propriétés physicochimiques spécifiques, en particulier en ce qui concerne la solvatation et/ou l'interaction avec une paroi solide. Un exemple de segment polymérique au sens de l'invention est donné par un enchaînement de monomères tous identiques (segment homopolymère), ou un copolymère ne présentant pas de corrélation de composition significative sur des distances de plus de quelques monomères (segment de type copolymère statistique).
Au sens de l'invention, on entend désigner par copolymère-bloc, un copolymère constitué de segments polymériques reliés entre eux de façon covalente, et appartenant à au moins deux types différents de composition chimique. Ainsi, deux segments polymériques adjacents au sein d'un copolymèré-bloc sont par définition dans le cadre de l'invention de nature chimique significativement différente. Le copolymère-bloc se définit par le fait que chacun des segments comporte un nombre suffisant de monomères pour présenter au sein de l' électrolyte des propriétés physicochimiques et en particulier de solvatation, comparables à celles d'un homopolymère de même- composition et de même taille. Il s'oppose au copolymère statistique, dans lequel les différents types de monomères se succèdent de façon essentiellement statistique, et confèrent localement à la chaîne des propriétés globales, différentes de celles des homopolymères de chacune des espèces en question. La taille des segments homopolymères nécessaires pour obtenir ce caractère bloc peut varier en fonction des types de monomères et de l' électrolyte, mais elle est typiquement de quelques dizaines d'atomes le long du squelette dudit segment. Il est à noter qu'on peut constituer un copolymère bloc au sens de l'invention, dans lequel partie ou totalité des segments sont eux-mêmes constitués par un copolymère de type statistique, dans la mesure où on peut distinguer au sein dudit copolymère bloc des segments polymériques de taille et de différence de composition chimique suffisantes pour donner lieu d'un segment à l'autre à une variation significative des propriétés physicochimiques et en particulier de solvatation et/ou d'interaction avec les parois. En particulier, pour être considérée comme "segment polymérique" au sens de l'invention, une portion de polymère doit comporter le long de son squelette au moins 10 atomes.
Selon une variante privilégiée, le polymère selon l'invention est du type copolymère bloc séquence.
Au sens de l'invention, on entend par "copolymère bloc séquence" un copolymère bloc composé de segments polymériques appartenant à au moins deux types chimiques distincts, lesdits segments polymériques s'enchaînant de façon linéaire. Selon une autre variante privilégiée, le polymère selon l'invention est du type polymère en peigne.
Au sens de l'invention, on entend désigner par "polymère en peigne", un polymère présentant un squelette linéaire d'une certaine nature chimique, et des segments polymériques appelés "branches latérales", d'une nature chimique identique ou différente, également linéaires mais significativement plus courts que le squelette, attachés de façon covalente audit squelette par une de leurs extrémités. Dans un polymère en peigne, les segments, polymériques constituant le squelette et ceux constituant les branches latérales différent par leur nature topologique. Si les segments polymériques constituant les branches latérales du polymère en peigne et ceux constituant son squelette diffèrent également par leur nature chimique, le polymère présente à la fois la caractéristique de "polymère en peigne" et celle de "copolymère-bloc". De tels polymères, qu'on appelle "copolymères en peigne", constituent un sous- ensemble des polymères en peigne et peuvent bien sûr être utilisés dans le cadre de l'invention.
Le nombre de segments polymériques d'un type chimique ou topologique donné présents dans les polymères selon l'invention s'entend en valeur moyenne, étant entendu qu'il s'agit toujours d'une population d'un grand nombre de molécules, présentant dans lesdits nombres une certaine polydispersité. Dans la présente description et sauf mention contraire, toutes les masses moléculaires, ainsi que toutes les moyennes sur des ensembles de chaînes ou sur des ensembles de segments polymériques, comme la masse moléculaire moyenne, le nombre moyen d'atomes le long du squelette, le nombre de points de jonction, ou encore le nombre moyen de greffons dans le cas d'un polymère en peigne, s'entendent comme des moyennes en masse au sens habituel de la physique des polymères.
Selon une variante privilégiée le polymère selon l'invention est de type irrégulier, c'est-à-dire que l'ensemble des segments d'au moins un type de nature chimique ou topologique entrant dans sa composition présentent une polymolécularité d'au moins 1 ,5, et de préférence supérieure à 1 ,8.
La polymolécularité d'un type de segments polymériques entrant dans la composition d'un polymère selon l'invention, s'entend comme la valeur moyenne de la masse moléculaire des dits segments, prise sur l'ensemble des segments de ce type (moyenne en masse au sens habituel de la physicochimie des polymères)
Une variante privilégiée de polymère en peigne irrégulier, consiste à présenter une polymolécularité des branches latérales d'au moins 1 ,5, et de préférence supérieure à 1 ,8.
Une autre variante privilégiée de polymère en peigne irrégulier consiste à présenter une polymolécularité des segments du squelette comprise entre deux branches latérales d'au moins 1 ,5, et de préférence supérieure à 1 ,8.
Dans un autre mode de réalisation plus préférentiel, les segments de chacun des types de nature chimique ou topologique entrant dans la composition du polymère selon l'invention, présentent une polymolécularité d'au moins 1 ,5, et de préférence supérieure à 1 ,8.
Selon un mode de mise œuvre privilégié, les polymères selon l'invention ont une masse moléculaire (moyenne en masse) supérieure à 50 000, de préférence supérieure à 300 000, de préférence encore supérieure à 1 000 000, et plus encore supérieure à 3 000 000. Selon un mode de mise en œuvre privilégié, la polymolécularité des polymères selon l'invention est supérieure à 1 ,5, et de préférence supérieure à 1 ,8.
La longueur et le nombre des segments polymériques présents dans les polymères en peigne ou les copolymères mis en œuvre au sein des milieux selon l'invention, ainsi que leur nature chimique, peuvent varier significativement dans le cadre de l'invention, et on peut ainsi faire varier grandement les propriétés des dits milieux selon l'application désirée, comme il sera montré plus précisément à l'exposé des exemples de mise en œuvre.
Les polymères contenus dans, la solution selon l'invention manifestent une affinité significative pour les parois dudit canal, en présence du fluide au sein duquel s'effectue le transport ou la séparation.
Un mode particulièrement privilégié est constitué par un copolymère possédant au moins un type de segments polymériques manifestant, en présence du fluide, une affinité particulière avec la paroi, et au moins un type de segments polymériques présentant dans ledit fluide moins ou pas d'affinité avec la paroi.
Typiquement, des types de segments polymériques ne présentant pas d'affinité avec la paroi sont constitués de polymères facilement solubilisables dans le fluide. Par contre, il peut exister des polymères solubles dans le fluide, et présentant néanmoins dans celui-ci une affinité particulière pour une paroi. Dans le cas ou le fluide est une solution aqueuse, des segments sans affinité avec la paroi sont typiquement des segments très hydrophiles. En revanche, des segments avec affinité sont peu hydrophiles voire hydrophobes. Bien entendu, d'autres types d'affinité plus spécifiques peuvent être, utilisés, selon la nature de la paroi et celle du fluide. Des copolymères optimisés pour la mise en œuvre de l'invention sont notamment ceux dans lesquels l'ensemble des segments présentant une affinité particulière avec la paroi représente entre 2 et 80 % en masse, de préférence entre 5 et 50 %, de la masse molaire totale moyenne desdits copolymères, ou entre 3 et 90 % et de préférence entre 5 et 60 % de la composition totale des copolymères en nombre de moles de monomères.
Selon un autre mode de mise en œuvre privilégié, les copolymères optimisés pour la mise en œuvre de l'invention sont notamment ceux dans lesquels l'ensemble des segments présentant une affinité particulière avec la paroi représente entre 2 et 25% en masse, de préférence entre 5 et 15 %, de la masse molaire totale moyenne desdits copolymères, ou entre 3 et 30 % et de préférence entre 5 et 20 % de la composition totale des copolymères en nombre de moles de monomères. A titre illustratif des différentes structures susceptibles d'être adoptées par le polymère selon l'invention, on peut tout particulièrement citer celles où tout ou partie dudit polymère se présente :
- sous la forme de copolymères blocs séquences. Dans ce cas, une variante privilégiée consiste à alterner le long du polymère des segments présentant une affinité particulière avec la paroi, et des segments présentant une affinité moindre ou nulle pour la paroi ;
- sous la forme de polymères en peigne. Dans ce cas, selon une- première variante préférée tout ou partie dudit polymère se présente sous la forme de copolymères en peigne dont le squelette est constitué par plusieurs segments polymériques présentant une affinité particulière avec la paroi, et dont les branches latérales sont constituées de segments polymériques présentant une affinité moindre ou nulle pour la paroi. Selon une seconde variante préférée, tout ou partie dudit polymère se présente sous la forme de copolymères en peigne dont les branches latérales sont constituées par des segments polymériques présentant une affinité particulière pour la paroi, et dont le squelette est constitué par des segments polymériques présentant une affinité moindre ou nulle pour la paroi.
Selon un mode préféré de l'invention, l'ensemble des segments polymériques d'un type donné de nature chimique ou topologique possède le long de leur squelette, un nombre d'atomes supérieur à 75, et de préférence encore supérieur à 210, ou présente une masse moléculaire supérieure à 1500, et de préférence supérieure à 4500.
Selon un mode encore plus privilégié, les différents types de segments présentent le long de leur squelette, un nombre moyen d'atomes supérieur à
16, de préférence supérieur à 75, et de préférence encore supérieur à 210, ou présentent une masse moléculaire supérieure à 1500, et de préférence supérieure à 4500.
Il est particulièrement intéressant pour la mise en œuvre de l'invention d'utiliser des copolymères-blocs ou des polymères en peigne dont un des types de segments est constitué d'un polymère choisi parmi les polyéthers, polyesters comme l'acide polyglycolique, les homopolymères et copolymères statistiques solubles du type polyoxyalkylène comme le polyoxypropylène, polyoxybutylène, polyoxyéthylène, les polysaccharides, l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, les polyuréthanes, les polyamides, les polysulfonamides, les polysu If oxydes, la polyoxazoline, le polystyrènesulfonate, les dérivés polyacrylamides et polyméthacrylamides substitués ou non, les polymères et- copolymères porteurs de fonctions époxy, aminé, thiol ou acide carboxylique
A titre représentatif des types de segments polymériques présentant dans un fluide aqueux peu ou pas d'affinité avec les parois, on peut tout particulièrement citer le polyacrylamide et l'acide polyacrylique, le poly N- isopropylacrylamide, le polyacryloylaminopropanol, les polymères et copolymères acryliques et allyliques hydrosolubles, le dextrane, le polyethylène glycol, les polysaccharides et divers dérivés de la cellulose tels que Phydroxyéthylcellulose, la méthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose, ou encore la méthylcellulose, l'alcool polyvinylique, les polyuréthanes, les polyamides, les polysulfonamides, les polysulfoxydes, la polyoxazoline, le polystyrènesulfonate, ainsi que les polymères porteurs de groupements hydroxyles et tous les copolymères statistiques des dérivés mentionnés ci-dessus. Bien entendu, d'autres segments polymériques solubles dans le fluide peuvent être utilisés selon l'invention, en fonction de la nature dudit fluide et de celle des parois du canal ou du récipient, de l'application particulière et de la facilité à les introduire au sein d'un polymère bloc de structure souhaitée. A titre représentatif des types de segments polymériques, solubles ou non en solvants aqueux, et pouvant présentant dans ceux-ci une affinité particulière avec les parois, on peut citer le diméthylacrylamide, les acrylamides N-substitués par des fonctions alkyles, les acrylamides N,N disubstitués par des fonctions alkyles, l'allylglycidyléther, les copolymères des dérivés acryliques ci-dessus entre eux ou avec d'autres dérivés acryliques, les alcanes, les dérivés fluorés, les silanes, les fluorosilanes, l'alcool polyvinylique, les polymères et copolymères impliquant des dérivés de l'oxazoline, ainsi que les d'une manière générale les polymères présentant une combinaison de liaisons Carbone-Carbone et/ou de fonctions éther-oxyde et/ou de fonctions époxyde, ainsi que tous les copolymères statistiques de ces composés.
De nombreux types de segments polymériques peuvent être choisis pour, constituer les segments polymériques constituant un polymère selon l'invention, en fonction de l'électrolyte envisagé, parmi les types de polymères connus de l'homme de l'art, en particulier parmi ceux solubles en milieu aqueux. Il est ainsi possible de se reporter à l'ouvrage " Polymer Handbook" Brandrupt & Immergut, John Wiley, New York.
Un autre mode de mise en œuvre privilégié, particulièrement intéressant quand les espèces à séparer sont des macromolécules biologiques, consiste à utiliser des copolymères selon l'invention présentant en outre une affinité différente avec différents analytes.
Cette affinité peut être obtenue en intégrant dans la structure desdits polymères des segments aptes à présenter une affinité spécifique pour certaines espèces à séparer. De tels segments peuvent être constitués par exemple et de façon non-exhaustive, par une séquence prédéterminée de monomères différents, comme un polynucléotide ou un polypeptide. Cette affinité peut également être obtenue en associant au polymère selon l'invention une protéine native ou dénaturée, une fraction de protéine ou un complexe protéique, ou encore une fonction acide ou basique, et/ou une fonction de type acide ou base au sens de Lewis. Selon cette variante, on peut envisager soit d'alterner le long d'un copolymère bloc séquence des segments présentant une affinité spécifique avec certains analytes, et des segments présentant une affinité moindre ou nulle avec lesdits analytes, soit d'introduire dans un copolymère en peigne, des segments polymériques présentant une affinité spécifique pour certains analytes, soit sous la forme de branches latérales supplémentaires ou de segments annexes au niveau de leur squelette.
Les polymères selon l'invention peuvent être des polymères naturels ou synthétiques. Selon un mode supplémentaire particulièrement avantageux, grâce au contrôle qu'il permet sur la structure, les polymères selon l'invention sont des polymères synthétiques.
Conviennent tout particulièrement à l'invention:
- les copolymères du type copolymère bloc séquence et présentant le long de leur squelette une alternance de segments de type polyoxyéthylène et de segments de type polyoxypropylène, ou une alternance de segments de type polyoxyéthylène et de segments de type polyoxybutylène ou plus généralement une alternance de segments de polyethylène et de segments de type polyéther notablement plus hydrophobes que le polyoxyéthylène ;
- les copolymères du type copolymère bloc séquence et présentant le long de leur squelette une alternance de segments de type acrylamide, acide acrylique, acryloylaminoéthanol ou diméthylacrylamide d'une part, et de segments de type (N,N)-diméthylacrylamide (pDMA), ou du type copolymère de DMA et d'allylglycidylether (AGE), ou encore d'homopolymère ou de copolymère d'oxazoline ou de dérivés de Poxazoline ; - les polymères du type polymère en peigne dont le squelette est de type polymère d'agarose, d'acrylamide, d'acrylamide substitué, d'acide acrylique, d'acryloylaminoéthanol, de diméthylacrylamide (DMA), d'allylglycidylether (AGE), de copolymère statistique de DMA et d'AGE, d'oxazoline de dérivés de l'oxazoline, de dextrane, de méthylcellulose, d'hydroyéthylcellulose, de celluloses modifiées, de polysaccharides, d'éther-oxydes, et au niveau duquel sont greffés des segments latéraux de type polymère d'agarose, d'acrylamide, d'acrylamide substitué, d'acide acrylique, d'acryloylaminoéthanol, de diméthylacrylamide (DMA), d'allylglycidylether (AGE), de copolymère statistique de DMA et d'AGE, d'oxazoline de dérivés de l'oxazoline, de dextrane, de méthylcellulose, d'hydroyéthylcellulose, de celluloses modifiées, de polysaccharides, d'éther-oxydes, de N-isopropyl acrylamide.
- les copolymères du type copolymère en peigne dont le squelette est de type polymère d'acrylamide, d'acrylamide substitué, d'acide acrylique, d'acryloylaminoéthanol, de diméthylacrylamide (DMA), d'allylglycidylether (AGE), de copolymère statistique de DMA et d'AGE, d'oxazoline, de dérivés de l'oxazoline, de dextrane, d'agarose, de méthylcellulose, d'hydroyéthylcellulose, de celluloses modifiées, de polysaccharides, d'éther-oxydes, et est porteur de segments latéraux hydrophobes à courtes chaînes tels que des chaînes , alkyles, des dérivés aromatiques, des fluoroalkyles, des silanes et des fluorosilanes. - les copolymères du type copolymère en peigne dont le squelette est d'un type sélectionné pour son affinité forte avec une paroi du canal ou du récipient d'une nature chimique particulière, et en particulier du type polyoléfine, polymère de dérivés aromatiques, de fluoroalkyles, de silanes, de fluorosilanes, et est porteur de segments latéraux de type polymère de dextrane, d'agarose, d'acrylamide, d'acrylamide substitué, d'acide acrylique, d'acryloylaminoéthanol, de diméthylacrylamide (DMA), d'allylglycidylether (AGE), de copolymère statistique de DMA et d'AGE, d'oxazoline de dérivés de l'oxazoline, de dextrane, de méthylcellulose, d'hydroyéthylcellulose, de celluloses modifiées, de polysaccharides, d'éther-oxydes, de N- isopropylacrylamide. • Il est également à noter que dans la majorité des applications, il est préférable d'utiliser un polymère selon l'invention essentiellement neutre. Il peut cependant être utile pour certaines applications, et en particulier pour éviter l'adsorption d'espèces présentant à la fois des charges et des parties hydrophobes, à choisir un polymère selon l'invention délibérément chargé, de préférence d'une charge opposée à celle desdites espèces.
Les copolymères selon l'invention sont avantageux en raison de leur capacité à combiner des propriétés appartenant à des polymères de nature chimique différente, qu'on ne peut pas toujours réunir dans un homopolymère ou un copolymère statistique. Ainsi, ils permettent d'adapter plus souplement la nature chimique du copolymère, en fonction d'une part de la nature chimique du fluide, et d'autre part de la nature chimique de la paroi des canaux ou récipients. Ils sont ainsi particulièrement avantageux dans les applications utilisant des canaux ou des récipients constitués de polymères ou d'élastomères tels que le PDMS (polydiméthylsiloxane), le PMMA (polymethylméthacrylate), le polycarbonate, le polyethylène, le polypropylène,- le polyethylène téréphtalate, le polyimide, le polycyclohexane, les polyuréthanes ou les matériaux inorganiques tels que le verre ordinaire, le verre borosilicate, le pyrex, la silice fondue, l'oxyde de silicium, les céramiques, le silicium, le diamant, la zircone, les semi-conducteurs. Par ailleurs, les polymères selon l'invention présentent la propriété unique de pouvoir disposer sur chaque polymère, d'un nombre important de segments polymériques présentant une affinité significative avec la paroi, ce qui permet une grande énergie d'adsorption, et donc une réduction durable de l'électroosmose, tout en contenant en outre un nombre important de boucles ne présentant pas d'affinité avec les parois, qui peuvent servir à éviter l'adsorption d'espèces.
En ce qui concerne la préparation des polymères mis en œuvre selon l'invention, elle peut être effectuée par toute technique conventionnelle de polymérisation ou polycondensation. Le choix de la méthode de préparation est généralement effectué en prenant en compte la structure désirée pour le polymère à savoir peigne ou linéaire et la nature chimique des différents blocs le constituant.
A titre représentatif de ces variantes de préparation, on peut tout particulièrement citer les procédés selon lesquels lesdits polymères sont obtenus par : polycondensation, polymérisation ou copolymérisation, ionique ou radicalaire, de monomères identiques ou différents, de macromonomères identiques ou différents, ou d'un mélange de monomères et de macromonomères ou par greffage de plusieurs segments polymériques sur un squelette polymérique linéaire ou ramifié de nature chimique identique ou différente.
De manière préférée, tout ou partie des polymères mis en œuvre selon l'invention sont obtenus par
-a: copolymérisation de monomères et de macromonomères comportant- à l'une au moins de leurs extrémités une fonction réactive, ou
-b: copolymérisation de macromonomères comportant au sein de leur structure au moins une fonction réactive.
Au sens de l'invention, on entend par fonction réactive un groupement permettant à la molécule porteuse de ce groupement d'être intégrée dans la macromolécule au cours de la réaction de copolymérisation sans interrompre la dite copolymérisation. Selon les applications, la nature chimique du capillaire auquel est destinée la solution de traitement de surface et le choix particulier de polymère selon l'invention utilisé pour le traitement, ladite solution pourra comporter comme base pour la dissolution des copolymères selon l'invention, une solution aqueuse (de préférence tamponnée), un solvant organique, un solvant hydroorganique ou un électrolyte.
Dans une variante privilégiée, les polymères contenus dans les solutions de traitement de surface selon l'invention se fixent sur les parois solides par adsorption physique sans établir de liaison covalente.
Selon une autre variante privilégiée, les polymères contenus dans les solutions de traitement de surface selon l'invention se fixent sur les parois solides par une ou plusieurs liaisons covalentes.
A l'aide des règles et modes privilégiés énoncés ci-dessus, l'homme de l'art est capable de préparer des polymères conformes à l'invention,, en adaptant la structure, la nature et le mode de préparation des dits polymères en fonction des propriétés recherchées pour une application ou une autre. L'invention a également pour objet un procédé de traitement de surface d'un élément, notamment pour éviter les phénomènes d'électroosmose et/ou d'adsorption non-spécifique d'espèces susceptibles de se manifester au niveau de cette surface lors de sa mise en contact avec un fluide et/ou d'espèces contenues dans ce fluide. Plus précisément, il s'agit d'un procédé de traitement de surface d'un élément destiné à être mis en contact avec un fluide et/ou des espèces contenues dans ce fluide lors du transport, de l'analyse, de la purification, de la - séparation et/ou de la conservation dudit fluide comprenant la mise en contact dudit élément avec au moins un polymère non réticulé, de type copolymère- bloc ou polymère en peigne et présentant en moyenne au moins trois points de jonction entre des segments polymériques de nature chimique ou topologique différente.
Pour la définition du polymère et de l'élément, on se reportera à la description précédente. Selon une variante préférée de l'invention, le polymère est mis en œuvre sous la forme d'une solution aqueuse de polymère telle que revendiquée et de préférence contenant ledit polymère à une concentration comprise entre 0,01 % et 20% et plus préférentiellement entre 0,1 et 5% en masse.
Selon un premier mode de réalisation, le procédé comprend le traitement de l'élément, préalablement à son utilisation, avec une solution de traitement conforme à l'invention. Dans le cas où le traitement est effectué en vue d'une opération de transport ou de conservation, cette solution est d'une composition différente de celle du fluide destiné à être transporté ou conservé. Dans le cas où le traitement est effectué en vue d'une application en séparation, cette solution est d'une composition différente de celle du milieu de séparation. Le traitement est obtenu en laissant ladite solution en contact avec les parois le temps nécessaire. Selon les applications et les modes de réalisation, ce temps peut être très variable, allant d'une fraction de secondes à plusieurs heures, voire pour les applications les plus difficiles plusieurs jours. Cette solution est ensuite extraite du canal ou récipient, préalablement ou simultanément à son remplissage par ledit fluide. Selon cette variante, ledit fluide ne contient pas quant à lui les polymères selon l'invention. Ainsi, ces derniers ne restent présents dans le canal ou le récipient que sous une forme adsorbée aux parois, et ne contribuent pas à altérer les propriétés dudit fluide. En particulier, ils n'augmentent pas significativement sa viscosité. Selon les applications, ce traitement peut être renouvelé entre chaque opération de transport ou de séparation, ou au contraire après un nombre donné de séparations, ou encore - quand on constate une dégradation des propriétés qui le rend nécessaire.
Selon une variante privilégiée de l'invention, la mise au contact de ladite solution de traitement de surface avec la surface de l'élément vis-à-vis duquel on souhaite réduire l'adsorption non-spécifique ou l'électroosmose, peut être suivie par un traitement destiné à renforcer l'action de la dite solution, comme, à titre d'exemple et de façon non restrictive, un traitement thermique, un traitement par un rayonnement (rayonnement lumineux, Ultraviolet, Rayons X, Gamma, etc.), l'assèchement de la paroi, ou son incubation en présence d'un liquide différent de ladite solution.
Cependant, ce traitement n'est pas toujours nécessaire, et certains polymères selon l'invention entrant dans la composition des solutions de traitement de surfaces selon l'invention, sont capables de minimiser efficacement l'adsorption non-spécifique et l'électroosmose sans traitement ultérieur. Selon un mode de réalisation préféré en particulier si de nombreuses séparations sont effectuées entre deux traitements de surface avec une solution selon l'invention , la surface de l'élément peut être "régénérée" avant le traitement, par une solution destinée à nettoyer la paroi des impuretés adsorbées au cours des séparations. De tels traitements sont connus de l'homme de l'art, et peuvent avantageusement comporter un lavage par une solution acide, par une solution alcaline, par une solution de détergent, par un solvant organique, ou par une combinaison de ces méthodes.
Selon un second mode de réalisation, le procédé revendiqué comprend l'addition dudit polymère au fluide devant être transporté, analysé, purifié, séparé et/ou conservé.
Selon ce second mode de réalisation, les copolymères caractérisant les solutions de traitement de surface selon l'invention sont de préférence introduits directement dans le fluide transporté, conservé ou utilisé comme milieu de séparation, à une concentration suffisamment faible pour ne pas modifier significativement par ailleurs les autres propriétés d'usage du dit fluide, et en particulier sans augmenter sa viscosité au-delà d'un facteur 2, par rapport au même fluide en l'absence des dits polymères. Selon une variante encore plus privilégiée, les polymères selon l'invention ne modifient pas la viscosité dudit fluide au-delà d'un facteur 1 ,5.
En ce qui concerne le fluide dans lequel est introduit directement le polymère selon l'invention, il peut avantageusement contenir, outre les polymères selon l'invention, d'autres éléments, et en particulier des composants interagissant avec les espèces soit par interaction stérique soit par affinité, et capables d'induire entre elles une séparation totale ou partielle. De nombreux composants de ce type, tels que les polymères linéaires hydrophiles, les micelles, les surfactants, les composés chiraux, sont connus de l'homme de l'art.
Bien entendu, la présente invention s'étend à tout procédé de séparation, filtration, analyse et/ou purification impliquant la mise en œuvre du procédé revendiqué. Ces procédés de filtration, séparation, analyse et/ou purification sont en partie identifiés ci-après.
La présente invention concerne également un élément, de préférence canal, récipient, ou particules, ou encore tout élément destiné à constituer une paroi d'un canal ou d'un récipient utilisé lors d'une opération de transport, d'analyse, de purification de conservation ou de séparation d'un fluide ou d'espèces contenues dans ce fluide, ou à entrer dans la constitution de ladite paroi, traité avec la solution de traitement de surface revendiquée. De tels éléments peuvent être utilisés pour la séparation, la purification, la filtration ou l'analyse d'espèces choisies parmi des espèces moléculaires ou macromoléculaires, et en particulier des macromolécules biologiques comme les acides nucléiques (ADN, ARN, oligonucléotides), les analogues d'acides nucléiques obtenus par synthèse ou modification chimique, les protéines, les polypeptides, les glycopeptides et les polysaccharides, des molécules organiques, des macromolécules synthétiques ou des particules telles que des particules minérales, de latex, des cellules ou des organelles.
Les éléments traités selon l'invention sont également particulièrement utiles pour le sequençage de l'ADN, dans la mesure où ils permettent d'obtenir des largeurs de bandes minimales. De même, ils s'avèrent appropriés pour la séparation de protéines, de protéoglycanes, ou de cellules, pour lesquelles on sait que les problèmes d'adsorption sur la parois sont particulièrement gênants et particulièrement difficiles à résoudre.
Cependant, la possibilité offerte par l'invention de faire varier grandement la nature chimique de la surface est également avantageuse pour d'autres applications.
Les solutions de traitement de surface selon l'invention, les procédés mettant en jeu ces solutions et plus particulièrement les éléments traités selon l'invention sont utiles pour les applications de diagnostic, de génotypage, de criblage à haut débit, de contrôle de qualité, ou pour la détection de présence d'organismes génétiquement modifiés dans un produit. L'invention est également particulièrement avantageuse pour les techniques dites d'hybridation ou d'affinité, dans lesquelles on souhaite analyser ou séparer, au sein d'un canal ou d'un récipient, les espèces contenues dans un échantillon, en fonction de leur affinité spécifique respective vis-à-vis de ligands. Ces ligands sont soit contenus dans ledit canal ou récipient, soit fixés à des emplacements prédéterminés sur les parois dudit récipient ou du dit canal. L'invention permet d'effectuer ce type d'analyses, tout en évitant ou en minimisant l'adsorption non spécifique desdites espèces sur les parois du canal ou du récipient, ou sur des surfaces solides contenues dans ledit canal ou dans le dit récipient.
Selon un mode de réalisation privilégié, ce type de ligand peut être associé à l'élément à savoir canal, récipient, élément entrant dans la composition dudit canal ou récipient, ou particules, par le biais d'un traitement par une solution de traitement de surface selon l'invention. En l'occurrence, la solution de traitement selon l'invention assure deux fonctions. Elle réduit l'adsorption non-spécifique et apporte lesdits ligands ou contribue à les immobiliser au niveau dudit élément.
Une famille de polymères particulièrement avantageuse pour les applications d'analyse par affinité, est constitué par un copolymère-bloc présentant simultanément
1/ Une multiplicité de segments polymériques présentant une affinité spécifique pour une paroi du canal ou du récipient, ou certaines parties prédéterminées des dites parois, ou encore avec certaines surfaces solides présentes dans le dit canal ou de dit récipient, telles que la surfaces de particules ou billes de latex, et
2/ Un ou plusieurs segments polymériques ne présentant pas d'affinité avec lesdites parois ou surfaces, et porteurs de ligands spécifiques de certaines espèces qu'on souhaite analyser. Lesdits ligands peuvent être en particulier des oligonucléotides, des protéines, des anticorps, des peptides, ou plus généralement des polymères ou fragments de polymères biologiques ou synthétiques. L'intérêt de l'invention dans cette application est de maintenir les ligands liés aux dites parois ou surfaces de façon indirecte, tout en maintenant lesdits ligands à une distance importante de ces dernières. En effet, dans le cadre de l'invention le ou les segments polymériques porteurs des ligands ne présentent pas d'affinité avec la paroi et en sont donc repoussés par les interactions stériques. Les polymères selon l'invention permettent donc aux analytes d' interagir avec les ligands, sans approcher des parois.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de la solution revendiquée pour minimiser les phénomènes d'adsorption ou d'électroosmose se manifestant au niveau de la ou des surface(s) d'un élément destiné à être mis en contact avec un fluide et/ou des espèces contenues dans ce fluide lors du transport, de l'analyse, de la purification, de la séparation ou de la conservation dudit fluide. L'invention est particulièrement intéressante pour le transport, l'analyse, ou la conservation d'un fluide biologique contenant ou susceptible d'être contaminé par des produits minéraux, organiques ou biologiques ou des organismes vivants.
En ce qui concerne les appareils, les solutions de traitement de surface, le procédé et les composants revendiqués sont particulièrement utiles pour les systèmes microfluidiques, les plaques de microtitration, les "puces à ADN et à protéines", et plus généralement tous les systèmes de transport et d'analyse impliquant de grands rapports surface/volume, car ils permettent à travers le choix optimal des différents types de blocs au sein des polymères, de combiner des blocs présentant une bonne affinité pour la surface des parois pour l'obtention d'un traitement durable, et des blocs présentant une bonne répulsion pour les espèces à séparer, et ce quelles que soient lesdites espèces et la nature chimique du dit composant. Les figures et exemples donnés ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.
FIGURES :
Figure 1 : Electrophorégramme témoin représentant la séparation du sizer 50-500 bp, Pharmacia biotech, obtenus à 50°C dans un appareil ABI 310 (Perkin-Elmer), en utilisant comme milieu de séparation un tampon 100 mM Na TAPS, 2 mM EDTA, 7 M Urée, dans lequel est dissous 5% en poids d'acrylamide linéaire (Masse moléculaire 700 000-1000000), dans un capillaire non traité. Les nombres au-dessus des pics indiquent la taille du fragment d'ADN correspondant.
Figure 2 : Electrophorégramme témoin représentant une séparation identique à celle de la figure 1 , dans un capillaire préalablement traité pendant 2 heures par une solution aqueuse à 3% de copolymère tribloc "pluronic F127" (BASF). Les nombres au-dessus des pics indiquent la taille du fragment d'ADN correspondant.
Figure 3 : Electrophorégramme représentant une séparation identique à celle de la figure 1 , dans un capillaire préalablement traité pendant 2 heures par une solution aqueuse à 3% de polymère en peigne du type à squelette hydroxyéthylcellulose, porteur de chaînes latérales du type courtes chaînes alkyles (NATROSOL PLUS 331 , Aqualon). Les nombres au-dessus des pics indiquent la taille du fragment d'ADN correspondant.
Figure 4 : Electrophorégramme représentant une séparation identique à celle de la figure 1 , dans un capillaire préalablement traité pendant 2 heures mn par une solution aqueuse à 3% du copolymère selon l'invention "PDMA-NIPAM" décrit dans l'exemple 2. Les nombres au-dessus des pics indiquent la taille du fragment d'ADN correspondant. Figure 5 : Electrophorégramme représentant une séparation identique à celle de la figure 1 dans un capillaire non traité, avec adjonction dans le milieu de séparation de copolymère selon l'invention "PDMA-NIPAM" décrit dans l'exemple 2 à une concentration en masse de 0,5%.. Les nombres au-dessus des pics indiquent la taille du fragment d'ADN correspondant.
Figures 6 : Electrophorégramme représentant une séparation identique à celle de la figure 2, 6a/ avec adjonction dans le milieu de séparation de polymère "PAM-
PDMA-" décrit dans l'exemple 4 à une concentration en masse de 0,5%; Les nombres au-dessus des pics indiquent la taille du fragment d'ADN correspondant.
6b/ après traitement pendant 2 heures du capillaire avec une solution aqueuse à 3% du polymère PAM-PDMA décrit dans l'exemple 4. Les nombres au-dessus des pics indiquent la taille du fragment d'ADN correspondant.
Figure 7 : Comparaison de la résolution calculée entre pics différant d'une base à 500 bases, obtenus à 50°C dans un appareil ABI 310 (Perkin- Elmer), utilisant comme milieu de séparation un tampon 100 mM Na TAPS, 2 mM EDTA, 7 M Urée, dans lequel est dissous 5% d'acrylamide linéaire (Masse moléculaire 700 000 ~ 1 000 000), dans un capillaire initialement non traité ("sans traitement"), et après traitement préalable du capillaire par une solution aqueuse à 3 % des différents polymères F127, Natrosol Plus, "PDAM-NIPAM" décrit dans l'exemple 2 et PAM-PDMA-1 décrit dans l'exemple 4.
Figure 8 : Comparaison de la résolution suivant le nombre de paires de bases pour la séparation d'un "50-500bp sizer" (Pharmacia-Amersham), dans une solution à 5% de polymacrylamide linéaire ne présentant pas de propriétés de traitement de paroi, dans un tampon 2mM EDTA, 0.1 M Taps, 7M urée, avec adjonction de 0,5% des polymères selon l'invention suivants poly(AM-PDMA)-1 (préparé selon l'exemple 4), poly(AM-PDMA)-2 (préparé selon l'exemple 8), poly (AM-PDMA)-3,(préparé selon l'exemple 9), poly(DMA-PNIPAM) (préparé selon l'exemple 2), et à titre de comparaison avec adjonction de 0.5% de d' homopolymère linéaire de PDMA
EXEMPLE 1 :
Préparation d'un macromonomère de PNIPAM fonctionnalisé de masse moléculaire moyenne voisine de 10 000 en vue de la préparation de copolymère conformes à l'invention.
1 ) Polymérisation du NIPAM
La polymérisation radicalaire du NIPAM est réalisée dans l'eau pure. L'amorceur est un couple redox dont l'oxydant est le persulfate de potassium, K2S208 (KPS) et le réducteur est l'aminoéthanethiol (AET), HCI. La réaction d'amorçage est :
K2S208 + 2CI", NH3 +-CH2CH2-SH → 2KHS04 + 2CI", HN3 +-CH2-CH2-S*
L'AET.HCI joue également le rôle d'agent de transfert, ce qui permet de contrôler la longueur des chaînes.
Mode opératoire Dans un tricol de 500 ml surmonté d'un réfrigérant et équipé d'un dispositif d'arrivée d'azote, on introduit 20 g de NIPAM (0,18 mole) et 200 ml d'eau, le mélange est alors agité et chauffé à 29° C par un bain d'eau. On démarre le barbotage d'azote. Au bout de 45 minutes, on ajoute 0,602 g d'AET.HCI (0,0054 mole) préalablement dissous dans 20 ml d'eau, puis 0,478 g de persulfate de potassium (KPS) dissous dans une quantité minimale d'eau. Le mélange est maintenu sous agitation durant 3 heures. La solution est ensuite concentrée puis lyophilisée.
Pour isoler le polymère on réalise une précipitation selon la procédure suivante : Le solide obtenu est redissout dans 100 ml de méthanol. Le chlorhydrate présent est neutralisé par addition de 0,0054 mole de KOH (soit 0,302 g dissous dans environ 25 ml de méthanol) incorporés goutte à goutte dans la solution. Le sel formé, KCI, précipite et est extrait par filtration. Le filtrat ainsi récupéré est concentré puis versé goutte à goutte dans 4 litres d'éther. Le polymère précipite et est récupéré par filtration sur fritte n° 4. Le solide est ensuite séché sous vide de pompe à palettes. Le rendement massique est de l'ordre de 50 %.
Le protocole ci-dessus conduit à un polymère aminé dénommé " PNIPAM-A-C " , et correspond à des rapports amorceur-monomère Ro=0,03 et Ao=0,01 , où: Ro = [R-SH] / [NIPAM] et Ao = [KPS] / [NIPAM].
2) Modification du PNIPAM aminé, PNIPAM-A-C
Les macromolécules de PNIPAM synthétisées présentent des fonctions aminés en bout de chaînes, celles-ci provenant de l'amorceur aminoéthanethiol AET.HCI.
Par réaction de la fonction aminé sur l'acide acrylique, on fixe une double liaison vinylique à l'extrémité de la chaîne selon le schéma réactionnel suivant :
PNIPAM — NH2 + CH2≈CH PNIPAM— NH— Ç— CH==CH2 O
OH
Mode opératoire :
Dans un bêcher de 100 ml, on introduit 50 ml de chlorure de méthylène, 1 ,5 g d'acide acrylique (0,021 mole), 9 g de PNIPAM et 4,3 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) (0,021 mole).
Le milieu réactionnel est agité pendant une heure. L'acide acrylique étant en fort excès par rapport au PNIPAM (la quantité d'acide acrylique est environ vingt fois celle du PNIPAM), l'ensemble des fonctions aminées a été modifié. Le mélange est ensuite filtré sur fritte n° 4 pour éliminer le précipité dicyclohexylurée, sous-produit résultant de la transformation du DCCI.
Le mélange est ensuite concentré jusqu'à 15 ml puis versé goutte à goutte dans 200 ml d'éther pour précipiter le polymère. On filtre sur fritte n° 4 et on lave le solide avec trois fois 100 ml d'éther puis on le sèche sous vide de la pompe à palettes pendant une nuit.
On obtient ainsi un macromonomère PNIPAM-C porteur d'une fonction allyle en bout de chaîne, avec un rendement massique de l'ordre de 70%.
Les masses molaires des macromonomères ainsi préparés ont été mesurées par SEC (chromatographie d'exclusion sterique) dans le THF à
40°C, avec colonne ultrastyragel, . double détection réfractométrique et étalonnage universel par rapport à des échantillons de polystyrène. NB: J'ai simplifié ici
D'autres macromonomères (NIPAM) ont été préparés selon ce protocole. Ils sont répertoriés dans le tableau I ci-après et sont caractérisés en termes de polymolécularité et poids moléculaires au niveau de chacun des deux types de segments et en poids.
Ces résultats montrent qu'il est possible de faire varier la masse moléculaire moyenne des macromonomères en variant la température de polymérisation, et le rapport amorceur/polymère Ro, les rapports Ro les plus élevés conduisant aux masses moléculaires les plus faibles. Ils montrent également que les polymolécularités des macromonomères sont élevées, en général supérieures à 2.
TABLEAU 1
Figure imgf000033_0001
EXEMPLE 2 :
Préparation d'un copolymère PDMA-NIPAM, à structure peigne et comprenant à titre de segments dénués d'affinité significative avec la paroi le PNIPAM-C préparé en exemple 1 , et à titre de squelette manifestant une affinité avec la paroi, le poly N,N Diméthyl acrylamide (PDMA).
La copolymérisation du PNIPAM-C (0.7g) et du DMA (2;8g) est réalisée pendant 4h dans 30 ml d'eau à température ambiante, avec un dégazage énergique à l'argon. L'amorceur utilisé est le couple redox persulfate d'ammonium ((NH4)2S208) (0,1 % en mole de la quantité de monomères) - métabisulfite de sodium (Na2S205). (0,03% en mole de la quantité de monomères). Le copolymère résultant est purifié par ultrafiltration dans un "Minitan millipore®", équipé d'une membrane à seuil de coupure 30 000, puis lyophilisé. Le taux d'incorporation final de PNIPAM 10, mesuré par RMN du proton sur les polymères dilués à 2g/100ml dans l'eau lourde (appareils Bruker à 250 MHz) est de 6,5%. La masse moléculaire, mesurée dans l'eau à 25°C par chromatograhie d'exclusion sterique sur colonne "Shodex®" avec double - détection réfractométrique et diffusion de lumière bi-angles (Précision Detector),est de Mw= 3 000 000, et la polymolécularité de 2. De ces valeurs et de la masse moléculaire du PNIPAM-C, on déduit le nombre moyen de branches latérales le long du squelette, de l'ordre de 18.
En raison du mode de polymérisation radicalaire utilisé, les macromonomères constituant les chaînes latérales sont intégrés dans la chaîne polymérique à des positions aléatoires déterminées par le hasard des collisions entre molécules (distribution statistique). Ce mode de polymérisation conduit à une distribution des masses moléculaires des segments polymériques du squelette compris entre deux branches latérales de forme approximativement exponentielle, et donc à des polymolécularités desdits segments polymériques du squelette largement supérieures à 1 ,8. EXEMPLE 3 :
Préparation d'un macromonomère de type PDMA porteur d'une fonction acrylique à une extrémité : la réaction est effectuée selon le même protocole que pour l'exemple 1, en remplaçant une mole de NIPAM par une mole de DMA. La purification est effectuée par précipitation dans l'éther puis filtration.
EXEMPLE 4 :
Préparation de copolymère "PAM-PDMA-1", à squelette acrylamide sans interactions avec la paroi et greffons pDMA présentant une forte affinité avec les parois de silice.
La copolymérisation des macromonomères pDMA préparés dans l'exemple 3 (0.7g) et de l'acrylamide (2;8g) est réalisée pendant 4h dans 30 ml d'eau à température ambiante, avec un dégazage énergique à l'argon. L'amorceur utilisé est le couple redox persulfate d'ammonium ((NH4)2S208) (0,1% en mole de la quantité de monomères) - métabisulfite de sodium (Na2S205) (0,03% en mole de la quantité de monomères). Le copolymère- résultant est purifié par ultrafiltration dans un "Minitan millipore®", équipé d'une membrane à seuil de coupure 30 000, puis lyophilisé. La masse moléculaire, mesurée par chromatographie d'exclusion (conditions identiques à l'exemple 2) est Mw= 813 kDa, et et la polymolécularité est 2.2. La proportion en masse de pDMA, mesurée par RMN, est de 6,5%, ce qui correspond en moyenne à 5 branches latérales le long du squelette. Comme dans l'exemple 2, le mode de polymérisation radicalaire utilisé conduit à une polymolécularité élevée des segments polymériques du squelette compris entre deux branches latérales.
EXEMPLE 5 :
Propriétés de séparation obtenues pour l'ADN (sizer 50-500 bp, Pharmacia biotech), sans et avec traitement du capillaire de silice par les copolymères préparés selon I' exemples 2: Les électrophorégrammes sont obtenus à 50°C dans un appareil ABI 310® (Perkin-Elmer, dans un tampon 50 mM Na TAPS, 2 mM EDTA, 7 M Urée, a) Dans l'acrylamide sans prétraitement du capillaire (figure 1) b) Dans l'acrylamide après traitement du capillaire par un copolymère tribloc commercial "pluronics F127", BASF (Figure 2) c/ Dans l'acrylamide après traitement du capillaire par un copolymère commercial en peigne à squelette d' hydroxyéthylcellulose porteur de fonctions alkyl à courtes chaînes (Natrosol Plus 331 , Aqualon) (figure 3) b) Dans l'acrylamide après traitement par le copolymère PDMA-NIPAM préparé selon l'exemple 2 (figure 4). e/ Dans l'acrylamide avec adjonction de 0.5 % du copolymère PDMA- NIPAM préparé selon l'exemple 2, dans le milieu de séparation. ( Fig. 5)
On constate que l'utilisation de copolymères selon l'invention améliore considérablement la finesse des pics, que ce soit sous la forme de traitement du capillaire avant séparation (Fig. 3 et 4), ou sous la forme d'additif dans le milieu de séparation lui-même (Fig. 5). Cette augmentation, très marquée vis à vis du capillaire non traité (Figure 1), est également significative par rapport à- un capillaire traité avec un copolymère bloc commercial qui ne présente pas le nombre minimum de segments polymériques qui caractérise l'invention (figure 2). Enfin, on note également que les copolymères présentant des branches latérales de forte masse moléculaire et de longueur irrégulière (figure 4 et 5), conduisent à de meilleures séparations que ceux présentant des branches de masse moléculaire faible et monodisperse (Fig. 3).
La figure 7 représente la résolution extrapolée entre pics différant d'une base, évaluée par interpolation à partir des résultats du "Sizer 500". On constate à nouveau que cette résolution est améliorée par les polymères selon l'invention. EXEMPLE 6:
Propriétés de séparation obtenues pour l'ADN (sizer 50-500 bp, Pharmacia biotech), à 50°C dans un appareil ABI 310 (Perkin-Elmer, dans un tampon 50 mM Na TAPS, 2 mM EDTA, 7 M Urée.
Ces propriétés sont évaluées selon deux variantes : a) Dans l'acrylamide avec adjonction de 0.5 % du copolymère PAM- PDMA-1 préparé selon l'exemple 4, dans le milieu de séparation. ( Fig. 6a) b) Dans l'acrylamide après traitement par le copolymère PAM-PDMA -1 préparé selon l'exemple 4 (figure 6b).
Par rapport à la figure 1 , on constate à nouveau que l'utilisation de cet autre copolymère selon l'invention améliore considérablement la finesse des pics, que ce soit sous forme de traitement du capillaire avant séparation, ou sous forme d'additif dans le milieu de séparation lui-même. On retrouve cette augmentation des performances dans la mesure de la résolution, figure 7.
Cette finesse des pics est attribuée à la propriété des procédés selon l'invention, qui permettent de réduire l'interaction des analytes avec la paroi. - On attribue les meilleures performances obtenues avec les copolymères présentant des segments polymériques de masse moléculaire élevée et irrégulière, à la formation d'une couche adsorbée épaisse et "souple": Une telle couche permettrait de repousser les analytes de la paroi, tout en restant très gonflée d'eau et donc peu susceptible de donner avec ceux-ci des interactions spécifiques.
EXEMPLE 7:
Utilisation d'une solution de traitement de surface selon l'invention en cellule microfluidique.
Une cellule microfluidique comportant un canal d'épaisseur 20 μm et de largeur 100 μm est préparée avec du poly-diméthyl-siloxane, comme décrit dans Ocvirk et coll., Electrophoresis, 21 , 107 (2000). Les parois du canal sont traités par incubation pendant 30 mn a/ avec une solution à 3% de "Pluronics F127", et b/ avec une solution à 3 % de polymères selon l'invention PDMA- NIPAM, préparé selon l'exemple 2. Dans les deux cas, le canal est rincé, puis rempli avec une solution de particules magnétiques et soumis à un champ magnétique de 60 mTestla, comme décrit dans Mayer et coll., Mat. Res. Soc. Sy p. Proc. 463, 57 (1998). La présence d'électroosmose est testée par la mise en mouvement des particules magnétiques, dans un champ électrique de 20 V/cm. Pour le capillaire traité avec le Pluronics, ce déplacement apparaît après 2 à 3 mn d'application du champ. Pour le capillaire traité avec le polymère selon l'invention, il n'y a toujours pas de déplacement observable après 3 heures d'application du champ. Les additifs copolymères selon l'invention donnent ainsi le moyen de mieux contrôler le transport d'un fluide ou d'espèces contenues dans ce fluide, dans des canaux microfluidiques de nature variée.
EXEMPLE 8 : Préparation d'un copolymère P(AM-PDMA)-2 à squelette acrylamide et greffons PDMA, de masse moléculaire environs 3000 kDalton.
La préparation est identique à celle décrite dans l'exemple 4, à l'exception de la concentration en ((NH4)2S208) [ 0.1 % au lieu de 0,075%, en mole de la quantité de monomères] et en (Na2S205) (0,015% au lieu de 0,0225%, en mole de la quantité de monomères). La viscosité, présentée dans la figure 6, permet d'évaluer la masse moléculaire, de l'ordre de 3000 kDalton, à partir de celle du p(AM-PDMA)-1 , en utilisant la dépendance cubique de la viscosité en fonction de la masse moléculaire pour des polymères enchevêtrés.
EXEMPLE 9: Préparation d'un copolymère P(AM-PDMA)-3 porteur de greffons PDMA de masse moléculaire environs 30 000.
Dans un premier temps, le macromonomère de masse moléculaire 30 000 est préparé comme décrit dans l'exemple 3, à l'exception du rapport Ro, fixé à 0,015 au lieu de 0,03. Ce macromonomère est ensuite polymérisé avec de l'acrylamide, selon le protocole décrit dans l'exemple 9. EXEMPLE 10 : Evaluation des performances de milieux de séparation incorporant un copolymère conforme à la présente invention.
Les polymères ajoutés à raison de 0,5% sont : - le poly(AM-PDMA)-1 préparé selon l'exemple 4,
- le poly(AM-PDMA)-2 préparé selon l'exemple 8,
- le poly(AM-PDMA)-3 préparé selon l'exemple 9,
- le poly(DMA-PNIPAM) préparé selon l'exemple 2, et
- l'homopolymère linéaire de PDMA qui représente l'essai comparatif. Les résultats obtenus sont illustrés en figure 8.
On constate que les copolymères selon l'invention donnent lieu à des performances comparables ou supérieures à celles du PDMA homopolymères, malgré une fraction bien inférieure en monomères présentant une affinité forte pour la paroi. On constate également, que les polymères de plus forte masse moléculaire (poly(AM-PDMA)-2), ainsi que ceux dont les greffons sont de plus forte masse moléculaire (poly(AM-PDMA-3), conduisent la meilleure résolution. Au contraire, le polymère plus hydrophobe (poly(PDMA-NIPAM) conduit à la - moins bonne résolution. Dans le cas particulier du poly(AM-PDMA)-2, 10 essais consécutifs ont été effectués sans régénération intermédiaire des parois du canal.
Avantageusement, on n'observe aucune diminution des performances.
Il est important de noter que l'homopolymère linéaire PDMA ne permet pas d'obtenir de tels résultats.

Claims

REVENDICATIONS
1. La présente invention a pour objet une solution de traitement de surface d'un élément destiné à être mis en contact avec un fluide et/ou des espèces contenues dans ce fluide lors du transport, de l'analyse, de la purification, de la séparation ou de la conservation dudit fluide, caractérisée en ce que ladite solution comprend au moins un polymère composé de plusieurs segments polymériques, ledit polymère étant du type copolymère-bloc ou polymère en peigne et présentant en moyenne au moins trois points de jonction entre des segments polymériques de nature chimique ou topologique différente.
2. Solution de traitement de surface selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'ensemble des segments d'au moins un type de nature chimique ou topologique entrant dans la composition dudit polymère présente une polymolécularité d'au moins 1 ,5.
3. Solution de traitement de surface selon la revendication 2, caractérisée en ce que les segments de chacun des types de nature chimique ou topologique entrant dans la composition du polymère, présentent une polymolécularité d'au moins 1 ,5.
4. Solution de traitement de surface selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que la polymolécularité est supérieure à 1 ,8.
5. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polymère a une masse moléculaire moyenne supérieure à 50 000, et de préférence supérieure à 300 000.
6. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'ensemble des segments polymériques d'au moins un type de nature chimique ou topologique possèdent en moyenne un nombre d'atomes supérieur à 75, et de préférence supérieur à 210, ou présentent une masse moléculaire supérieure à 1500 et de préférence supérieure à 4500.
7. Solution de traitement de surface selon la revendication 6, caractérisée en ce que les différents types de segments polymériques composant ledit polymère possèdent en moyenne un nombre moyen d'atomes supérieur à 75, et de préférence encore supérieur à 210, ou présentent une masse moléculaire supérieure à 1500, et de préférence supérieure à 4500.
8. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polymère possède au moins un type de segments polymériques manifestant au sein du milieu de séparation une affinité spécifique avec la paroi et au moins un type de segments polymériques présentant dans ledit milieu moins ou pas d'affinité avec la paroi.
9. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'ensemble des segments présentant une affinité spécifique avec la paroi représente entre 2 et 80 % en masse de la masse molaire totale moyenne dudit polymère.
10. Solution de traitement de surface selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'ensemble des segments présentant une affinité spécifique avec la paroi représente entre 2 et 25 % en masse de la masse molaire totale moyenne dudit polymère.
11. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polymère possède en moyenne un nombre de points de jonction compris entre 4 et 100, et de préférence compris entre 4 et 40.
12. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polymère est un copolymère bloc présentant en moyenne au moins quatre segments polymériques.
13. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications 1 à
11 , caractérisée en ce que le polymère est un polymère en peigne présentant en moyenne au moins deux chaînes latérales.
14. Solution de traitement de surface selon la revendication 13, caractérisée en ce que le polymère est un copolymère en peigne dont le squelette est constitué par plusieurs segments polymériques présentant une affinité spécifique avec la paroi, et dont les branches latérales sont constituées de segments polymériques présentant une affinité moindre ou nulle pour la paroi.
15. Solution de traitement de surface selon la revendication 13, caractérisée en ce que le polymère est un copolymère en peigne dont les. branches latérales sont constituées par des segments polymériques présentant une affinité spécifique pour la paroi, et dont le squelette est constitué par des segments polymériques présentant une affinité moindre ou nulle pour la paroi.
16. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polymère comprend au moins un type de segment choisi parmi les polyéthers, polyesters comme l'acide polyglycolique, les homopolymères et copolymères statistiques solubles du type polyoxyalkylène comme le polyoxypropylène, polyoxybutylène, polyoxyéthylène, les polysaccharides, l'alcool polyvinylique, la polyvinylpirrolidone, les polyuréthanes, les polyamides, les polysulfonamides, les polysulfoxydes, la polyoxazoline, le polystyrènesulfonate, les polymères et copolymères d' acrylamides, de méthacrylamides et d'allyles, substitués ou non, les polymères et copolymères porteurs de fonctions époxy, aminé, thiol ou acide carboxylique.
17. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polymère est choisi parmi :
- les copolymères du type copolymère en peigne dont le squelette est de type dextrane, acrylamide, acide acrylique, acryloylaminoéthanol ou (N,N- diméthylacrylamide et au niveau duquel sont greffés des segments latéraux de type acrylamide, acrylamide substitué, (N,N-dimethylacrylamide (DMA), N- isopropyl-acrylamide ou du type copolymère de DMA et d'allylglycidylether (AGE), ou d'homopolymère ou de copolymère d'oxazoline ou de dérivés de l'oxazoline ;
- les copolymères du type copolymère séquence et présentant le long de leur squelette une alternance de segments de type polyoxyéthylène et de segments de type polyoxypropylène, ou une alternance de segments de type polyoxyéthylène et de segments de type polyoxybutylène ou une alternance de segments de polyethylène et de segments de type polyéther plus hydrophobes - que le polyoxyéthylène ;
- les copolymères du type copolymère bloc séquence et présentant le long de leur squelette une alternance de segments de type acrylamide, acide acrylique, acryloylaminoéthanol ou diméthylacrylamide d'une part, et de segments de type (N,N)-dimethylacrylamide (DMA), ou du type copolymère de DMA et d'allylglycidylether (AGE), ou d'homopolymère ou de copolymère d'oxazoline ou de dérivés de l'oxazoline ; - les polymères du type polymère en peigne dont le squelette est de type polymère d'agarose, d'acrylamide, d'acrylamide substitué, d'acide acrylique, d'acryloylaminoéthanol, de diméthylacrylamide (DMA), d'allylglycidylether (AGE), de copolymère statistique de DMA et d'AGE, d'oxazoline de dérivés de l'oxazoline, de dextrane, de méthylcellulose, d'hydroyéthylcellulose, de celluloses modifiées, de polysaccharides, d'éther-oxydes, et au niveau duquel sont greffés des segments latéraux de type polymère d'agarose, d'acrylamide, d'acrylamide substitué, d'acide acrylique, d'acryloylaminoéthanol, de diméthylacrylamide (DMA), de N-isopropylacrylamide, d'allylglycidylether (AGE), de copolymère statistique de DMA et d'AGE, d'oxazoline de dérivés de l'oxazoline, de dextrane, de méthylcellulose, d'hydroyéthylcellulose, de celluloses modifiées, de polysaccharides, d'éther-oxydes
- les copolymères du type copolymère en peigne dont le squelette est de type polymère d'acrylamide, d'acrylamide substitué, d'acide acrylique, d'acryloylaminoéthanol, de diméthylacrylamide (DMA), d'allylglycidylether (AGE), de copolymère statistique de DMA et d'AGE, d'oxazoline, de dérivés de l'oxazoline, de dextrane, d'agarose, de méthylcellulose, d'hydroyéthylcellulose, de celluloses modifiées, de polysaccharides, d'éther-oxydes, et est porteur de segments latéraux hydrophobes à courtes chaînes tels que des chaînes alkyles, des dérivés aromatiques, des fluoroalkyles, des silanes, des fluorosilanes.
18. Solution de traitement selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polymère comprend en outre des segments - présentant une affinité pour des espèces à séparer au sein d'un fluide.
19. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polymère se lie aux surfaces solides par une ou plusieurs liaisons covalentes.
20. Solution de traitement de surface selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polymère se lie aux surfaces solides uniquement par adsorption physique.
21. Solution selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polymère est présent dans ladite solution à une concentration comprise entre 0,01 % et 20% en poids.
22. Procédé de traitement de surface d'un élément destiné à être mis en contact avec un fluide et/ou des espèces contenues dans ce fluide lors du transport, de l'analyse, de la purification, de la séparation ou de la conservation dudit fluide, comprenant la mise en contact dudit élément avec au moins un polymère non réticulé, de type copolymère-bloc ou polymère en peigne et présentant en moyenne au moins trois points de jonction entre des segments polymériques de nature chimique ou topologique différente.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que le polymère est mis en œuvre sous la forme d'une solution.
24. Procédé selon la revendication 23 caractérisé en ce que le polymère est mis en œuvre sous la forme d'une solution aqueuse contenant ledit polymère selon l'invention à une concentration comprise entre 0,01% et 20% et de préférence entre 0,1 et 5% en masse.
25. Procédé selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce . que le polymère est tel que défini en revendication 2 à 21.
26. Procédé selon la revendication 23 ou 25, caractérisé en ce que la mise en contact dudit élément avec ladite solution est réalisée préalablement à son utilisation pour le transport, l'analyse, la purification, la séparation ou la conservation dudit fluide.
27. Procédé selon la revendication 22 ou 25, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction dudit polymère dans le fluide devant être transporté, analysé, purifié, séparé ou conservé.
28. Procédé selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que l'élément traité est un canal, un récipient, une ou plusieurs particules ou un élément destiné à faire partie de la paroi d'un canal ou d'un récipient.
29. Procédé de séparation, filtration, analyse et/ou purification impliquant la mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 22 à 28.
30. Elément traité à l'aide d'un procédé selon l'une des revendications
22 à 28.
31. Utilisation d'un élément selon la revendication 30 pour la séparation, la purification, la filtration ou l'analyse d'espèces choisies parmi des espèces moléculaires ou macromoléculaires, des macromolécules biologiques comme les acides nucléiques (ADN, ARN, oligonucléotides), les analogues d'acides nucléiques obtenus par synthèse ou modification chimique, les protéines, les polypeptides, les glycopeptides et les polysaccharides, des molécules organiques, des macromolécules synthétiques ou des particules telles que des particules minérales, de latex, des cellules ou des organelles.
32. Utilisation d'un élément selon la revendication 30 pour le. sequençage de l'ADN ou pour la séparation de protéines.
33. Utilisation d'un élément selon la revendication 30 pour l'analyse ou la séparation d'espèces par affinité ou hybridation moléculaire.
34. Utilisation d'un élément selon la revendication 30 dans un système microfluidique.
35. Utilisation d'un élément selon la revendication 30 pour des applications de diagnostic, de génotypage, de criblage à haut débit, de contrôle de qualité, ou pour la détection de présence d'organismes génétiquement modifiés dans un produit.
36. Utilisation d'une solution selon l'une des revendications 1 à 21 , pour minimiser les phénomènes d'adsorption ou d'électroosmose se manifestant au niveau de la ou des surface(s) d'un élément destiné à être mis en contact avec un fluide et/ou des espèces contenues dans ce fluide lors du transport, de l'analyse, de la purification, de 'la séparation ou de la conservation dudit fluide.
37. Utilisation selon la revendication 36, caractérisée en ce que le fluide est un fluide biologique, un fluide contenant ou susceptible d'être contaminé par des produits organiques ou biologiques, ou un fluide contenant ou susceptible d'être contaminé par des organismes vivants.
38. Utilisation selon la revendication 36 ou 37, caractérisée en ce que l'élément est un canal, un récipient, une ou plusieurs particules, ou un élément destiné à faire partie de la paroi d'un canal ou d'un récipient.
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US15/588,951 US20180024095A1 (en) 2000-06-30 2017-05-08 Non-thermosensitive medium for analyzing species in a channel and for minimizing adsorption and/or electroosomosic phenomena
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1295113A2 (fr) * 2000-06-30 2003-03-26 Institut Curie Milieu liquide non-thermosensible pour l'analyse d'especes au sein d'un canal
WO2005036154A1 (fr) * 2003-10-07 2005-04-21 Spectrumedix Llc Supports de separation comprenant des polymeres d'oxazoline
JP2006510025A (ja) * 2002-12-11 2006-03-23 サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク プローブ分子と標的生体分子との間の少なくとも１つの特異的相互作用を電子的に検出する方法
EP2049652A2 (fr) * 2006-07-24 2009-04-22 Cell Biosciences, Inc. Revêtements pour capillaires capables de capturer des analytes
US20130153421A1 (en) * 2002-07-29 2013-06-20 Applied Biosystems, Llc Graft copolymers, their preparation and use in capillary electrophoresis
US8945361B2 (en) 2005-09-20 2015-02-03 ProteinSimple Electrophoresis standards, methods and kits

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2886301B1 (fr) * 2005-05-25 2010-08-20 Inst Curie Nouveau procede de preparation de copolymeres en peigne hydrosolubles
US7932339B2 (en) * 2005-05-25 2011-04-26 Centre National De La Recherche Scientifique Method for producing water-soluble comb-shaped copolymers
FR3003572B1 (fr) 2013-03-25 2015-03-27 Seppic Sa Nouveaux polymeres amphiphiles et leur utilisation dans le traitement de surfaces de materiaux hydrophobes
JP6990403B2 (ja) * 2015-06-25 2022-01-12 株式会社カワノラボ 分散質分析方法、および分析装置

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0087995A1 (fr) * 1982-02-19 1983-09-07 FMC Corporation Copolymère d'acrylamide et de résine de polysaccharide comme médium de gel électrophorétique
US4504641A (en) * 1982-02-19 1985-03-12 Fmc Corporation Polyacrylamide cross-linked with a polysaccharide resin as electrophoretic gel medium
US4542200A (en) * 1982-02-19 1985-09-17 Fmc Corporation Polyacrylamide cross-linked with a polysaccharide resin as electrophoretic gel medium
US4908405A (en) * 1985-01-04 1990-03-13 Ernst Bayer Graft copolymers of crosslinked polymers and polyoxyethylene, processes for their production, and their usage
US5225491A (en) * 1987-05-07 1993-07-06 The B. F. Goodrich Company Comb-shaped copolymers of a macromolecular monomer of polyhaloether with terminal olefinic unsaturation and process
US5306501A (en) * 1990-05-01 1994-04-26 Mediventures, Inc. Drug delivery by injection with thermoreversible gels containing polyoxyalkylene copolymers
EP0639592A1 (fr) * 1993-08-18 1995-02-22 Nippon Shokubai Co., Ltd. Copolymères greffés soluble dans l'eau, et leur procédé de préparation
US5552028A (en) * 1993-12-17 1996-09-03 The Perkin-Elmer Corporation Polymers for separation of biomolecules by capillary electrophoresis
WO1997009400A1 (fr) * 1995-09-08 1997-03-13 Rhone-Poulenc Chimie Utilisation en tant qu'agents thermoepaississants de copolymeres multiblocs
WO1997040078A1 (fr) * 1996-04-23 1997-10-30 Soane Biosciences Hydrogels thermoreversibles comprenant des copolymeres reticules et leur utilisation dans l'electrophorese
WO1998010274A1 (fr) * 1996-09-04 1998-03-12 The Research Foundation Of State University Of New York Nouveaux milieu de separation et traitement de surface destines a un appareillage d'electrophorese
WO1998013443A1 (fr) * 1996-09-24 1998-04-02 Shell Internationale Research Maatschappij B.V. Ameliorants de l'indice de viscosite formant agents de dispersion
EP0850963A1 (fr) * 1996-12-27 1998-07-01 Nippon Shokubai Co., Ltd. Polymère greffé hydrophile, son procédé de production, composition contenant ce polymère et son usage
FR2788008A1 (fr) * 1998-12-30 2000-07-07 Inst Curie Milieu thermosensible pour la separation electrocinetique d'especes au sein d'un canal de separation

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4496708A (en) * 1983-12-14 1985-01-29 Union Carbide Corporation Water-soluble polyurethane comb polymer production
US5264101A (en) * 1989-11-06 1993-11-23 Applied Biosystems, Inc. Capillary electrophoresis molecular weight separation of biomolecules using a polymer-containing solution
JPH04315046A (ja) * 1990-12-14 1992-11-06 Hewlett Packard Co <Hp> ゲル電気泳動用ミクロカラムおよびその製造法
US5290418A (en) * 1992-09-24 1994-03-01 Applied Biosystems, Inc. Viscous electrophoresis polymer medium and method
DE4425408A1 (de) * 1994-07-13 1996-01-18 Hoechst Ag Cycloolefinpolymere
US5571410A (en) * 1994-10-19 1996-11-05 Hewlett Packard Company Fully integrated miniaturized planar liquid sample handling and analysis device
US5807937A (en) * 1995-11-15 1998-09-15 Carnegie Mellon University Processes based on atom (or group) transfer radical polymerization and novel (co) polymers having useful structures and properties
US6001232A (en) * 1996-09-04 1999-12-14 The Research Foundation Of State University Of New York Separation medium for capillary electrophoresis
JP3980691B2 (ja) * 1996-12-27 2007-09-26 株式会社日本触媒 スケール防止剤およびそれを用いたスケール防止方法
FR2764892B1 (fr) * 1997-06-23 2000-03-03 Rhodia Chimie Sa Procede de synthese de polymeres a blocs
US6162877A (en) * 1998-12-04 2000-12-19 Hercules Incorporated Hydrophobically modified comb copolymers
US6306273B1 (en) * 1999-04-13 2001-10-23 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for conducting processes in microfluidic devices

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0087995A1 (fr) * 1982-02-19 1983-09-07 FMC Corporation Copolymère d'acrylamide et de résine de polysaccharide comme médium de gel électrophorétique
US4504641A (en) * 1982-02-19 1985-03-12 Fmc Corporation Polyacrylamide cross-linked with a polysaccharide resin as electrophoretic gel medium
US4542200A (en) * 1982-02-19 1985-09-17 Fmc Corporation Polyacrylamide cross-linked with a polysaccharide resin as electrophoretic gel medium
US4908405A (en) * 1985-01-04 1990-03-13 Ernst Bayer Graft copolymers of crosslinked polymers and polyoxyethylene, processes for their production, and their usage
US5225491A (en) * 1987-05-07 1993-07-06 The B. F. Goodrich Company Comb-shaped copolymers of a macromolecular monomer of polyhaloether with terminal olefinic unsaturation and process
US5306501A (en) * 1990-05-01 1994-04-26 Mediventures, Inc. Drug delivery by injection with thermoreversible gels containing polyoxyalkylene copolymers
EP0639592A1 (fr) * 1993-08-18 1995-02-22 Nippon Shokubai Co., Ltd. Copolymères greffés soluble dans l'eau, et leur procédé de préparation
US5552028A (en) * 1993-12-17 1996-09-03 The Perkin-Elmer Corporation Polymers for separation of biomolecules by capillary electrophoresis
WO1997009400A1 (fr) * 1995-09-08 1997-03-13 Rhone-Poulenc Chimie Utilisation en tant qu'agents thermoepaississants de copolymeres multiblocs
WO1997040078A1 (fr) * 1996-04-23 1997-10-30 Soane Biosciences Hydrogels thermoreversibles comprenant des copolymeres reticules et leur utilisation dans l'electrophorese
WO1998010274A1 (fr) * 1996-09-04 1998-03-12 The Research Foundation Of State University Of New York Nouveaux milieu de separation et traitement de surface destines a un appareillage d'electrophorese
WO1998013443A1 (fr) * 1996-09-24 1998-04-02 Shell Internationale Research Maatschappij B.V. Ameliorants de l'indice de viscosite formant agents de dispersion
EP0850963A1 (fr) * 1996-12-27 1998-07-01 Nippon Shokubai Co., Ltd. Polymère greffé hydrophile, son procédé de production, composition contenant ce polymère et son usage
FR2788008A1 (fr) * 1998-12-30 2000-07-07 Inst Curie Milieu thermosensible pour la separation electrocinetique d'especes au sein d'un canal de separation

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1295113A2 (fr) * 2000-06-30 2003-03-26 Institut Curie Milieu liquide non-thermosensible pour l'analyse d'especes au sein d'un canal
EP1295113B1 (fr) * 2000-06-30 2006-07-26 Institut Curie Milieu liquide non-thermosensible pour l'analyse d'especes au sein d'un canal
US20130153421A1 (en) * 2002-07-29 2013-06-20 Applied Biosystems, Llc Graft copolymers, their preparation and use in capillary electrophoresis
US20150159009A1 (en) * 2002-07-29 2015-06-11 Applied Biosystems, Llc Graft copolymers, their preparation and use in capillary electrophoresis
JP2006510025A (ja) * 2002-12-11 2006-03-23 サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク プローブ分子と標的生体分子との間の少なくとも１つの特異的相互作用を電子的に検出する方法
WO2005036154A1 (fr) * 2003-10-07 2005-04-21 Spectrumedix Llc Supports de separation comprenant des polymeres d'oxazoline
US8945361B2 (en) 2005-09-20 2015-02-03 ProteinSimple Electrophoresis standards, methods and kits
EP2049652A2 (fr) * 2006-07-24 2009-04-22 Cell Biosciences, Inc. Revêtements pour capillaires capables de capturer des analytes
EP2049652A4 (fr) * 2006-07-24 2010-07-21 Cell Biosciences Inc Revêtements pour capillaires capables de capturer des analytes

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