WO2001092536A1 - Nouveaux genes de l'acyltransferase aliphatique - Google Patents

Nouveaux genes de l'acyltransferase aliphatique Download PDF

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WO2001092536A1
WO2001092536A1 PCT/JP2001/004677 JP0104677W WO0192536A1 WO 2001092536 A1 WO2001092536 A1 WO 2001092536A1 JP 0104677 W JP0104677 W JP 0104677W WO 0192536 A1 WO0192536 A1 WO 0192536A1
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PCT/JP2001/004677
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Keiko Sakakibara
Toru Nakayama
Tokuzo Nishino
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International Flower Developments Proprietary Limited
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding a protein having an activity of transferring an aliphatic acyl group to a sugar at the 5-position of a flavonoid, and a method of using the same.
  • anthocyanins The major component of flower color is a group of compounds in Flavonoids, collectively called anthocyanins. It is known that a variety of anthocyanins exist in plants, and many of their structures have already been determined. The color of anthocyanin mainly depends on its structure (Harborne (1986) The Flavonoids, p565).
  • Enzymes involved in the biosynthesis of anthocyanin and its genes are also being studied, and examples of the use of molecular biology techniques and gene transfer into plants to change the structure of anthocyanin and change the color of flowers (Plant Cell, 7 (1995) Holton and Cornish, p. 1071, Plant Cell Physiol. 39 (1998) Tanaka et al. Plll9;).
  • the biosynthetic pathway of anthocyanin is common to most flowering plants up to anthocyanidin 3 -glucoside (Holton e t al. (1995) Plant Cell, 7, pl071). Thereafter, anthocyanidin 3-dalcoside undergoes various species- and variety-specific modifications. This diversity contributes to the variety of flower colors.
  • Anthocyanin is an unstable compound in neutral solution, but its stability is improved by modification with sugar or acyl group (Forkmann
  • anthocyanin becomes slightly red by glycosylation, and becomes blue by the addition of an aromatic acyl group (Forkmann (1991) Plant Breeding, 106, pi). Roughly speaking, there are an aromatic group (for example, caffeoyl group and coumaroyl group) and an aliphatic group (for example, malonyl group and acetyl group). Is not known other than increasing the solubility of anthocyanin.
  • Flavonol 3MaT Enzyme that catalyzes the transfer of a malonyl group to the sugar at position 3 of flavonol
  • Flavone / Flavonol 7MaT the reaction that transfers the malonyl group to the sugar at position 7 of flavone and flavonol
  • Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983, 224, 26 to 271 Measurement of activity in organs of Flameol 3MaT and Flavone / Flavonol 7MaT of parsley)
  • Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983, 226, 206-217 Purification of Flavonol 3MaT and Flavone / Flavonol 7MaT in
  • the effect of malonylation on the flower color in the acylation of anthocyanin by an aliphatic acyltransferase is clarified, and a gene encoding a protein having an aliphatic acyltransferase activity, preferably an anthocyanin,
  • a gene encoding a protein having an aliphatic acyltransferase activity preferably an anthocyanin
  • An object was to obtain a gene encoding a protein having an aliphatic acyl transfer activity.
  • the flower color can be changed by introducing and expressing the gene encoding the protein having an aliphatic acyl transfer activity obtained in the present invention into a plant.
  • anthocyanin machinylation As described above, there is no report on the effect of anthocyanin machinylation on flower color. To elucidate its effects, three types of anthocyanins, namely delphinidin 3,5-diglucosid, apadin (delphinidin 3- (coumaroyl) darcoside-5-glucoside), malonyradivanin Comparison of the color of the solution of (delphinidin 3- (coumaroyl) darcoside-5- (malonyl) darcoside) showed that the color of malonylapapanin was the bluest, indicating that malonylation contributed to the bluening of anthocyanin. Was done.
  • the present invention relates to a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 23, 25, 27 or 29, and having an activity of transferring an aliphatic acyl group to a sugar at position 5 of flavonoid.
  • the amino acid sequence thereof which has been modified by the addition, deletion and / or substitution of another amino acid to one or more amino acid sequences thereof, and the presence of a flavonoid.
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring an aliphatic acyl group to the sugar at position 5.
  • the present invention also provides an amino acid sequence (J having 50% or more homology to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 23, 25, 27 or 29). And a gene encoding a protein having an activity of transferring an aliphatic acyl group to a sugar at the 5-position of a flavonoid.
  • the present invention also relates to 5 ⁇ SSC: 50 ° to part or all of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 23, 25, 27 or 29.
  • a gene encoding a protein that hybridizes under the conditions of C and has an activity of transferring an aliphatic acyl group to the 5-position sugar of flavonoids.
  • the present invention further provides a setter comprising the above gene.
  • the present invention also provides a host transformed with the vector.
  • the present invention also provides a protein encoded by any one of the above genes. '
  • the present invention also relates to a method of culturing or growing said host,
  • the present invention provides a method for producing a protein having an activity of transferring an aliphatic acyl group to a saccharide at the 5-position of a flavonoid from the above.
  • the present invention also provides a plant into which the above-described gene has been introduced, or progeny of the plant or a tissue thereof having the same properties.
  • the present invention further provides a cut flower of the above plant or a progeny of the plant having the same properties.
  • the present invention further provides a method for changing the color of a flower using the above gene.
  • the present invention further provides a method for making a flower blue using the above gene.
  • Examples of the gene of the present invention include those encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 23, 25, 27 or 29.
  • a protein having an amino acid sequence modified by addition or deletion of a plurality of amino acids and / or substitution with another amino acid also has the same enzymatic activity as the original protein. It has been known. Accordingly, the present invention relates to the following: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 23, 25, 27 or 29 as long as the protein has an activity to transfer an aliphatic acyl group to the sugar at position 5 of the flaponoid.
  • a protein having an amino acid sequence modified by addition or deletion of one or more amino acid sequences to the amino acid sequence and / or substitution with another amino acid, and the protein The gene encoding the gene also belongs to the present invention.
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 23, 25, 27 or 29, or a part of the nucleotide sequence, preferably 6 amino acids
  • a nucleotide sequence encoding the above for example, a nucleotide sequence encoding six or more amino acid sequences in the consensus region
  • a gene that hybridizes to a 5xSSC at 50 ° C and encodes a protein having an activity to transfer an aliphatic acyl group to the sugar at position 5 of the flavonoid. is there.
  • the appropriate hybridization temperature depends on the base sequence and the length of the base sequence.For example, when a DNA fragment consisting of 18 bases encoding 6 amino acids is used as a probe, Temperatures below 50 ° C are preferred.
  • Genes selected by such hybridization include those derived from natural sources, for example, those derived from plants, for example, genes derived from petunia trennia, and those derived from non-plants. Good.
  • the gene selected by the hybridization may be cDNA or genomic DNA.
  • the present invention further relates to an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 23, 25, 27 or 29, of about 50% or more, preferably 60% or 70% or more, or further 80%. Or a gene encoding a protein having an amino acid sequence having a homology of 90% or more and having an activity of transferring an aliphatic acyl group to the sugar at position 5 of the flaponoid. It is about usage.
  • the gene having the native nucleotide sequence can be obtained, for example, by screening a cDNA library, as specifically shown in Examples.
  • DNA encoding a protein having a modified amino acid sequence can be synthesized using conventional site-specific mutagenesis or PCR based on DNA having a native nucleotide sequence.
  • a DNA fragment to be modified is obtained by treating a native cDNA or genomic DNA with a restriction enzyme, converting the fragment into type III, and performing site-directed mutagenesis or PCR using a primer into which a desired mutation has been introduced. Then, a DNA fragment into which the desired modification has been introduced is obtained.
  • the DNA fragment into which this mutation has been introduced may be ligated to a DNA fragment encoding another part of the target protein.
  • a DNA encoding a protein consisting of a shortened amino acid sequence for example, a DNA encoding an amino acid sequence longer than the desired amino acid sequence, for example, a DNA encoding the full-length amino acid sequence, is desired. If the DNA fragment obtained by cutting with a restriction enzyme does not encode the entire amino acid sequence of interest, a DNA fragment consisting of the missing sequence may be synthesized and ligated.
  • the obtained gene encodes a protein having an aliphatic acyl transfer activity. Can be confirmed. Further, by expressing the gene, it is possible to obtain a gene product, a protein having an activity of transferring an aliphatic acyl group. Alternatively, using an antibody against the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 23, 25, 27 or 29, a protein having an activity of transferring an aliphatic acyl group can be obtained. It can also be used to clone a gene encoding a protein having an aliphatic acyl transfer activity from another organism.
  • the present invention also relates to a recombinant vector containing the above-mentioned gene, particularly an expression vector, and a host transformed with the vector.
  • Prokaryote or eukaryote can be used as a host.
  • a prokaryote a common host such as a bacterium, for example, a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, a microorganism belonging to the genus Escherichia coli or Bacillus, for example, a bacterium of Pasillus subtilis, for example, Bacillus subtilis, should be used.
  • eukaryotic hosts lower eukaryotes, for example, eukaryotic microorganisms, for example, fungi such as yeast or filamentous fungi can be used.
  • yeast examples include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae. Aspergillus (Aspergillus), genus microorganisms such as Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus niger, Examples include microorganisms of the genus Penicillium.
  • animal cells or plant cells can be used, and as animal cells, cell lines such as mouse, hamster, sal, and human are used. Insect cells, such as silkworm cells, or adult silkworms themselves, are also used as hosts.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region, for example, a promoter and a terminator, an origin of replication, and the like, depending on the type of host into which they are to be introduced.
  • Usable promoters for bacterial expression vectors include conventional promoters such as trc promoter, tac promoter, lac promoter and the like, and yeast promoters such as glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter.
  • an amylase promoter, a trpC promoter, or the like is used as a filamentous fungal promoter.
  • a promoter for an animal cell host a viral promoter, for example, an SV40 early promoter, an SV40 rate promoter or the like is used.
  • the production of the expression vector can be carried out using a restriction enzyme, a ligase and the like according to a usual manner.
  • transformation of the host with the expression vector can be performed according to a conventional method.
  • the present invention is not limited to only the gene encoding a protein having an activity of transferring an aliphatic acyl group from Salvia.
  • the present invention relates to the use of a gene encoding a protein having a transposition activity.
  • the source of the protein having an aliphatic transacylation activity may be a plant, an animal, or a microorganism, and the protein having the aliphatic transacylation activity can be similarly used for flower color conversion.
  • the present invention relates to a plant or a progeny thereof whose color is regulated by introducing a gene encoding a protein having an aliphatic acyl transfer activity, or a tissue thereof.
  • the form may be a cut flower.
  • transformable plants include roses, chrysanthemums, carnations, goldfish, cyclamen, orchids, lisianthus, freesia, gerberas, gladioli, kasumi, kalanchoe, lilies, peranoregonids, geranids.
  • Example 1 Color change of various anthocyanins depending on pH Delphinidin 3,5-didacoside, apapanin (denolefinidin 3- (coumarinoid) gnolecoside-5-gnorecoside), malonylazine (delphinidin) 3- (Kumaroinore) Darukoshido -. 5- (Ma b two Honoré) Darukoshido) each 0 ⁇ 1 ⁇ , 0.3 mM, Mack Rubei down buffer at a concentration of 0.5 mM (pH5.3, pH5.6, P H6.
  • Adipanin is obtained by removing the 5-malonyl moiety of malonyl apanin (Tetrahedron Lett, 24, 4863-4866, 1983). Also, maloninoleazinonin was obtained by extracting from a plant body by the method described in Tetrahedron Lett, 24, 4863-4866, 1983. The larger the number in the color chart, the bluer the color. In the same figure, A is deeper. The results are summarized in Table 1. At any concentration and pH, malonyl apapanin had a blue color, indicating that the malonyl group contributed to the blue coloration of anthocyanin.
  • the activity of the malonyltransferase was measured using 100 ⁇ l of the reaction mixture (10 mM shisonine dissolved in 0.01% trifluoroacetic acid (TFA) in 20 mM potassium phosphate, pH 7.0). ⁇ g, malonyl-CoA 10 ⁇ g, and the enzyme preparation to be measured) at 30 ° C for 20 minutes, then stop by adding ice-cold 0.05% TFA aqueous solution 200 1 did.
  • the quantitative determination of shisonine and malonylshisonin was performed by reversed-phase high-performance liquid chromatography (DYNAMAX HPLC system) using a Shodex Asahipak ODP-50 4E column, using a 0.5% TFA aqueous solution as solution A.
  • Example 3 Purification of Salvia Malonyltransferase Protein Purification of malolyltransferase was carried out using 2,664 g of red flowers of Salvia splendens. Salvia flowers collected the entire flower, including the calyx, immediately before flowering, and were stored at -80 ° C until used in experiments.
  • ammonium sulfate fractionation was performed, and ammonium sulfate was collected as a precipitate of a 20-50% saturated fraction, and buffer A (100 mM potassium phosphate (pH 7.0), 30 mM 2-menolecaptoethanol) was dissolved in 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF) (2920 ml).
  • buffer A 100 mM potassium phosphate (pH 7.0), 30 mM 2-menolecaptoethanol
  • 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF 2920 ml
  • 280 ml of Octyl Sepharose Fast Flow was added, and with gentle stirring, ammonium sulfate was gradually added to a final concentration of 30% saturation. After sufficiently stirring, the mixture was allowed to stand still.
  • the gel in the serum was collected by suction filtration (filter paper, Whatmanll4).
  • the gel was sufficiently washed with buffer B (20 mM potassium phosphate (pH 7.0), 30 mM 2-mercaptoethanol, 20% saturated ammonium sulfate) while suction-filtering.
  • Buffer C (20 mM potassium phosphate ( ⁇ 70), 15 mM 2-mercaptoethanol, 50% ethylene glycol, 0.1% 3-[(3-colamidopropyl) dimethyl ammonium O] -1-Propanesulfonic acid (CHAPS) ⁇ 280 ml was added, and the mixture was gently stirred for 30 minutes, and then a malonyltransferase active fraction was collected by suction filtration. Perform elution with buffer C for 10 This was repeated twice to collect an active fraction.
  • CHAPS 3-[(3-colamidopropyl) dimethyl ammonium O] -1-Propanesulfonic acid
  • MIMETIC Yellow 2 (Nacalai Tesque, Inc.) was filled into Econoram (approx. 1.0 cm ⁇ 120 cm, Nippon Pyo. Rad Laboratories Co., Ltd.) and equilibrated with buffer D. After abundant enzyme solution 1 buffer, buffer solution! ), And elute the protein bound to the column with buffer E (20 mM calcium phosphate (pH 7.0), 30 mM 2_mercaptoethanol, 0.05% CHAPS) did. The active fraction was concentrated by Pellicon and ultrafiltration (YM-10, MILLIPORE CORPORATION) to obtain 32 ml of enzyme solution 2.
  • MIMETIC Red 3 (Nacalai Tester Co., Ltd.) is filled in an Econo column ( ⁇ 1.5 cm x 30 cm, Nippon Biotechnology, Inc., Lad Laboratories Co., Ltd.), and buffer solution! 7 (5 mM calcium phosphate ( ⁇ 7.0 ) And 15 mM 2-mercaptoethanol, 0.03% Triton X-100). After applying the entire amount of Enzyme Solution 2, wash with Buffer F, then Buffer G (5 mM potassium phosphate (pH 7.0), 30 mM 2-mercaptoethanol, 0.03% Triton X-100, 0.1 The protein bound to the column was eluted with mM acetyl CoA).
  • Example 3 To the protein recovered as a single peptide in Example 3, 2 pmol of trypsin (Promega Co., Ltd.) was added, digested at 37 ° C for 30 hours, and an attempt was made to determine the structure of each peptide fragment. Each peptide fragment was separated from the trypsin digest by reverse phase HPLC (RPC C2 / C18, Amersham Pharmacia Biotech). The separation conditions were as follows: 0.1% trifluoroacetic acid, linear concentration gradient of 8% to 80% acetonitrile in 60 minutes, absorption at 215 nm at a flow rate of 0.1 ml / min. Only the peak fraction was collected.
  • RPC C2 / C18 reverse phase HPLC
  • MTT21-1 Leu-Leu-Phe-Tyr-His-His-Pro-Ser-Ser-Lys (SEQ ID NO: 8)
  • MTT21-2 Ser-Gly-Asp-Lys-Ser-Asp-Glu-Asn-Ala-Pro-Glu-Leu-Phe-Ile-Ile-Pro-Ala-Asp-Ala (SEQ ID NO: 9)
  • MTT22-1 Met-Ala-Ala-Phe-Glu-Glu-Val-Phe (SEQ ID NO: 10)
  • MTT23 Trp-Leu-His-Tyr-His-Pro-Val (Disposition 'J number: 11)
  • MTT26 Gly-Ala-Glu-Asn-Trp-Met-Ser-Asp-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 12)
  • MTT27-2 Leu-Ala-Ala-Glu-Xaa-Gly-Phe- Ala-Vato Ala-Ala- Ala-A1 a-Ile-Gly_Gly-Gly-lie-lie-Gly (SEQ ID NO: 13)
  • MTT28 Ser-Phe-Ile-Asn-Asp-Pro-Asn-Lys-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe ( SEQ ID NO: 14)
  • MTT141 Thr-Ala-Ser-Phe-Pro-Leu-Pro-Thr-Asn-Arg (SEQ ID NO: 15)
  • MTT291 Asp-Ala-Asp-Gln-Phe-Tyr-Asp-Leu-Leu-Pro-Pro-Ile-Pro-
  • Example 5 Amplification of Salvia Malonyltransferase Gene Fragment The following primers were prepared based on the partial amino acid sequences MTT20 and MT142 obtained in Example 4.
  • MTT20-1 5 TA (T / C) GCI GCI GGI GA (T / C) TCI GTI CCI GT -3 '
  • MTT20-3 5 '-GTI CCI GTI ACI AT (A / T / C) GCI GC-3' (Distribution 'J number
  • ATCRr2 5'- (T / C) TT ICC CCA ICC (A / G) AA (A / G) TC IGC one 3 '(Toriki Column No .: 21)
  • PCR was performed using the following reaction mixture composition, using cDNA prepared from Salvia flowers as type II in a total amount of 100 ⁇ l: IxTAKARA PCR buffer, 200 mM dNTPs, Sanorebi, ⁇ cDNA 100 ng, MTT20-1 primer lpmol / 1 , ATC Rr2 Primer lpmol / ⁇ 1, TAKARA rTaq 2.5 units.
  • the reaction was carried out at 96 ° C for 1 minute, followed by 30 cycles of 96 ° C for 1 minute, 42 ° C for 2 minutes, 72 ° C for 3 minutes, and further at 72 ° C for 7 minutes. Allowed to react for minutes.
  • a cDNA library from Salvia guaranitica flowers was constructed using Stratagene; I ZAP II directional cDNA synthesis kit according to the manufacturer's recommendations. About 200,000 clones from this library were screened under the washing conditions (5x SS 0.1% SDS, 37 ° C) using the 889 bp DNA fragment obtained in Example 3 as a probe, 0 positive clones were obtained. They could be divided into three groups and the longest clones in each group were named SgMaTl, SgMaTl 'and SgMaT2. Screening of the library was performed by a known method (for example, Fujiwara et al, 1998, PI ant. J.16, 421).
  • the deduced amino acid sequence of SgMaTl there was a portion in which the partial amino acid sequence of the purified maxillary transferase clarified in Example 4 was partially different, but all were confirmed. Some differences are likely due to differences in the species of salvia used.
  • SgMaTl and SgMaTl 'genes encode an enzyme that transfers a malonyl group to the 5-position sugar of anthocyanin.
  • SgMaT2 had a 1530 bp cDNA, which contained an open reading frame of 1260 bp, encoding the full length.
  • SgMaTl is 52% identical to SgMaT2 showed that.
  • both genes are compatible with the transferases of other plants.
  • SgMaTl SgMaTl 'and SgMaT2 are shown in SEQ ID NOs: 1, 3 and 5, respectively, and the amino acid sequences deduced from these nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 2, 4 and 6, respectively.
  • Plasmid pSgMaTl (EcoRI of pBluescriptSr (Stratagene), containing the SgMaTl gene at the Xhol site, and addition of isopropyl beta thiogalactoside (IPTG) to LB medium containing ampicillin at a final concentration of 50 mg / L.
  • IPTG isopropyl beta thiogalactoside
  • a single colony of Escherichia coli transfected with the gene was inoculated, and precultured at 37 ° C. under vacuum. The culture (2 ml) was inoculated into 100 ml of an LB medium containing ampicillin, and main-cultured at 30 ° C until the absorbance at 600 nm became 0.5.
  • IPTG was added to the culture solution to a final concentration of ImM, and the cells were cultured at 30 ° C. for 9 hours after the addition of IPTG to collect the cells.
  • the collected cells are suspended in a buffer (0.1 M KPB, pH 7.0, 30 mM 2-mercaptoethanol, ImM EDTA, 0.1 mM PMSF, 0.1% TritonX-100), and the cells are ultrasonically disrupted while cooling forever. did.
  • the enzyme activity was measured using the supernatant (soluble fraction) obtained by centrifugation.
  • E. coli containing only pBluescriptSIT as a control was treated in the same manner.
  • the activity was measured using shisonin as a substrate.
  • Example 2 was used.
  • Example 8 Isolation of Salvia-derived malonyltransferase cDNA (2) ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) using a petal cDNA library of Sanolevia (Salvia splendens) using ⁇ ZAP II (Stratagene
  • SsMaTl showed 92% identity to SgMaTl and 52% identity to SgMaT2 at the amino acid level.
  • SsMaT2 The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 24, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 25.
  • SsMaT2 was 53% identical to SgMaTl, 96% identical to SgMaT2, and 52% identical to SsMaTl.
  • a young red leaf was collected from perilla (Perlla frutescens), and a cDNA library was prepared on the basis thereof using the ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) using I ⁇ (Stratagene) as a vector. It was constructed using the recommended method. This library is used in the same manner as in Example 8. Screening was performed using SgMaTl as a probe, and the clone having the longest cDNA among the obtained clones was designated as PfMaTl.
  • the nucleotide sequence of PfMaTl is shown in SEQ ID NO: 26, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 27.
  • PfMaTl showed 67% identity to SgMaTl, 57% to SgMaT2, 65% to SsMaTl, and 57% to SsMaT2 at the amino acid level.
  • Example 10 Isolation of lavender-derived malonyltransferase cDNA
  • a primer that introduces a BamHI site into the 5'-end of the SsMaTl gene obtained in Example 8 (Primer # l: 5'-GGA TCC ATC GAG GGA CGC ATG ACA ACA ACA ACA AC-3, (SEQ ID NO: 30))), 3-Primer for introducing a BamHI site at the-terminus of the SsMaTl gene (Primer # 2: 5, -GGA TCC TTA CAA TGG TTC GAC GAG CGC CGG AGA-3 '(Distribution' J number: 3 1)) and a primer that deletes the BamHI site in the SsMaTl gene (Primer # 3: 5'-G GAC CCG CCG ATA CCG GAA AAT TAC TTC-3 '(SEQ ID NO: 32)) was synthesized. .
  • Primer # l is the SsMaTl start code
  • a Factor Xa cleavage site (Ile-Glu-Gly-
  • PCR reaction solution composition: pBK-CMV- SsMaTl 100 ng, l Xpfu buffer, 200 ⁇ ⁇ dNTPs, ⁇ ⁇ ⁇ Primer # 1, 100 ng of first PCR product, 2.5 U pfu DNA polymerase (Stratagene); Reaction condition: 96.C for 7 minutes, (96 ° C for 2 minutes, 70 ° C for 1 minute, 72 ° C for 7 minutes) Min) X30 cycle, 72 ° C, 10 min).
  • the second PCR product was treated with calo with A-tail (100 ng of the second PCR product, 1X ExTaq buffer, 2 mM dATP, TaKaRa ExTaq; 70 ° C, 30 minutes), and then pCR2.1- Cloned into T0P0 vector (Clonetech, Inc.).
  • pCR2.1-SsMaTl plasmid into which full-length SsMaTl was inserted was obtained.
  • a DNA sequencer it was confirmed that the DNA sequence of the SsMaTl gene did not contain erroneous nucleotide incorporation by PCR.
  • pCR2.1-SsMaTl was completely digested with BamHI, and the generated DNA fragment of about 1400 bp was recovered. This DNA fragment was subcloned into the Escherichia coli expression vector pQE-30 (QIAGEN) at the BamHI site to give pQE_30Xa-SsMaTl.
  • the expression of SsMaTl in E. coli containing pQE-30Xa-SsMaTl followed the method described in Example 7. The activity of the enzyme was measured according to the method described in Example 2.
  • Example 7 using the plasmid prepared so that the PfMaTl gene obtained in Example 9 can be expressed as a fusion protein with LacZ protein, expressed in Escherichia coli as in Example 7, It was used for activity measurement. The activity of the enzyme was measured according to the method described in Example 2.
  • an aliphatic acyltransferase is involved in the control of flower color.
  • this protein By expressing this protein in petals and modifying anthocyanin, the color of the flower can be changed.
  • Aliphatic acyltransferases include the monkeys mentioned here. Not only genes from beer, perilla and lavender but also genes with similar enzymatic activities from other organisms can be used.

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Description

明 細 書 新規脂肪族ァシル基転移酵素遺伝子 発明の分野
本発明はフラボノィ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活 性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子およびその利用方法に関する ものである。 背景技術
花き産業においては多様性に富んだ新品種の顕花植物を開発する ことが重要である。 なかでも、 花の色は花きのもっとも 要な形質 であり、 交配に頼った従来の育種法によ り、 さまざまな色の,1品種が 育種されてきたが、 交配可能な植物種の遺伝資源が限定されている ため、 単一の植物種がすべての色の品種を有することはまれである 花の色の主な成分は、 アントシァニンと総称される、 フラボノィ ド.の一群の化合物である。 植物には多様なアントシァニンが存在す ることは知られており、 それらの多くの構造が既に決定されている 。 アントシァニンの色は主と してその構造に依存している （Harbor ne (1986) The Flavonoids, p565) 。 アン ト シァニンの生合成に関 わる酵素やその遺伝子に関しても研究が進んでおり、 分子生物学的 手法と植物への遺伝子導入により 、 アン ト シァニンの構造を変換し 、 花の色を変えた例もある （Plant Cell, 7 (1995) Holton and Co rnish, p.1071 、 Plant Cell Physiol. 39 (1998) Tanaka et al. plll9 ；) 。 アン ト シァニンの生合成経路はァン ト シァ-ジン 3 —グ ルコシドに至るまではほとんどの顕花植物で共通である （Holton e t al. (1995) Plant Cell, 7， pl071 ) 。 その後アントシァニジン 3 一ダルコシ ドは種および品種特異的に多様な修飾を受ける。 この 多様性が花色の多彩さの一因となっている。
アン ト シァニンは中性溶液中では不安定な化合物であるが、 糖や ァシル基により修飾されることによ り安定性が向上する （Forkmann
(1991) Plant Breeding, 106, pi ) 。 また、 配糖化により、 アン トシァニンの色はやや赤くなり、 芳香族ァシル基の付加により青く なる (Forkmann (1991) Plant Breeding, 106, pi ) 。 アシノレ基ま 、 大別すると芳香族ァシル基 （例えばカフェオイル基、 クマロイル 基等） と脂肪族ァシル基 （例えばマロニル基、 ァセチル基等） があ るが、 脂肪族ァシル基の花色に関する生理的役割については、 アン トシァニンの溶解度を増加させるという以外にはわかっていない。 アントシァニンに脂肪族ァシル基を転移する酵素の精製や生化学 的性質については、 これまでいくつか報告されている [Archives 0 f Biochemistry and Biophysics, 1981， 208, 233-241(ノヽ0セ ])の Fl avonol 3MaT (フラボノールの 3位の糖にマロ二ル基を転移する反 応を触媒する酵素） と Flavone/Flavonol 7MaT (フラボンとフラボ ノールの 7位の糖にマロ二ル基を転移する反応を触媒する酵素） の 粗精製並びに分子量や基質特異性試験） ； Archives of Biochemist ry and Biophysics, 1983， 224, 26ト 271 (パセ リ の Fla雨 ol 3MaT と Flavone/Flavonol 7MaT の各器官における活性測定） ； Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983, 226, 206 - 217(ノヽ °セ リ の Flavonol 3MaT と Flavone/Flavonol 7MaT の単一標品への精製並び ίこ 3MaT抗体の作成） ； Eur. J. Biochem. 1983， 133, 439— 448(ノ セ リ にはマ口ニル化された Apigenin 7- 0- glucoside力 S存在することを 、 薩 などで構造確認） ； Archives of Biochemistry and Biophys ics, 1984, 234, 513- 521 (マメのイ ソフラボンに対する 7MaTの至適 pH、 分子量及び Kmの決定） ； Phytochemistry, 1993， 32, 1425 - 142 6(キク科植物の Dendranthema mor if ol ium の花弁粗抽出液にシァニ ジン 3—ダルコシドに対する脂肪族ァシル基転移酵素活性が存在す るこ との確認） ； Plant Science, 1996， 118， 109 - 118(Ajuca rept ans の培養細胞の粗抽出液中のマロニル基転移酵素活性の確認） ； Phytochemistry, 1999， 52, 15_18(ダリ アの花弁由来マロ二ノレ基転 移酵素の基質特異性の決定） 〕 力 、 その蛋白質の一次構造を明らか にした例はなく、 遺伝子クローユングの報告もない。 発明の開示
本発明では、 アントシァニンの脂肪族ァシル基転移酵素によるァ シル化のうちマロニル化が花色に及ぼす影響を明らかにし、 脂肪族 ァシル基転移活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子、 好ましく は アントシァニンに対して脂肪族ァシル基転移活性を有する蛋白質を コー ドする遺伝子を得ることを課題と した。 本発明で得られた脂肪 族ァシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を植物に導 入し、 発現させることで、 花色を変換することが可能である。
前記のように、 アントシァニンのマ口ニル化が花色に及ぼす影響 については報告がない。 その効果を明らかにするために、 3種のァ ン トシァニンすなわちデルフィ二ジン 3，5-ジグルコシ ド、 ァヮパ二 ン (デルフィ二ジン 3-( クマロイル） ダルコシド -5- グルコシド） 、 マロニルァヮバニン (デルフィニジン 3 - ( クマロイル） ダルコシ ド- 5- (マロニル） ダルコシド） の溶液の色を比較したところ、 マ ロニルァヮパニンの色がもっとも青く、 マロニル化がアントシァニ ンの青色化に貢献していることが示された。
そこで、 サルビアの花を材料と して、 マロニル基転移酵素の精製 を試みた。 そして、 精製蛋白質の部分アミノ酸配列を決定し、 その 情報をもとに PCR によ り、 サルビアのマロニル基転移酵素遺伝子の DNA 断片を増幅した。 この DNA 断片をプローブと してサルビア · グ ァラニティカ花 cDNA l ibraryをスク リーニングし、 2種類のマ口二 ル基転移酵素遺伝子を得た。 さ らに、 これらをプローブにして、 サ ルビア · スプレンデンス、 シソ、 ラベンダーからホモログを得た。 従って本発明は、 配列番号 ： 2 、 4 、 6 、 23、 25、 27又は 29に記 载のアミノ酸配列を有し、 フラボノイ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル 基を転移する活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子、 あるいはそ れらのアミ ノ酸配列に対して 1個又は複数個のアミ ノ酸の付加、 欠 失及び/または他のアミノ酸による置換によって修飾されており、 且つフラボノィ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活性を有 する蛋白質をコー ドする遺伝子を提供する。
本発明はまた、 配列番号 ： 2 、 4 、 6 、 23、 25、 27又は 29に記載 のァミ ノ酸配列に対して 50% 以上の相同性を示すァミ ノ酸配歹 (Jを有 し、 且つフラボノィ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活性 を有する蛋白質をコー ドする遺伝子を提供する。
本発明はまた、 配列番号 ： 2 、 4 、 6 、 23、， 25、 27又は 29に記载 のァミノ酸配列をコードする塩基配列の一部または全部に対して、 5 X SSC： 、 50°Cの条件下でハイブリ ダィズし、 且つフラボノイ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活性を有する蛋白質をコー ド する遺伝子を提供する。
本発明はさ らに前記の遺伝子を含んでなるベタターを提供する。 本発明はまた、 前記ベクターによ り形質転換された宿主を提供す る。
本発明はまた、 上記いずれかの遺伝子によってコ ー ドされる蛋白 質を提供する。 '
本発明はまた前記の宿主を培養し、 又は生育させ、 そして該宿主 からフラボノィ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活性を有 する蛋白質を採取することによる該蛋白質の製造方法を提供する。 本発明はまた、 上記の遺伝子が導入された植物もしく はこれと同 じ性質を有する該植物の子孫またはそれらの組織を提供する。
本発明はさらに、 上記の植物又はこれと同じ性質を有する該植物 の子孫の切り花を提供する。
本発明はさらに、 上記の遺伝子を用いて花の色を変える方法を提 供する。
本発明はさらに、 上記の遺伝子を用いて花の色を青くする方法を 提供する。 発明の実施の形態
本発明の遺伝子と しては、 例えば配列番号 ： 2、 4、 6、 23、 25 、 27又は 29に記載するァミ ノ酸配列をコー ドするものが挙げられる 。 しかしながら、 複数個のアミ ノ酸の付加、 欠失および/または他 のアミ ノ酸による置換によつて修飾されたァミノ酸配列を有する蛋 白質も、 もとの蛋白質と同様の酵素活性を有することが知られてい る。 従って本発明は、 フラポノイ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を 転移する活性を有している蛋白質である限り、 配列番号 ： 2、 4、 6、 23、 25、 27又は 29に記載のアミ ノ酸配列に対して 1個または複 数個のァミ ノ酸配列の付加、 欠失および/または他のァミノ酸によ る置換によって修飾されたアミ ノ酸配列を有する蛋白質および該蛋 白質をコー ドする遺伝子も本発明に属する。
本発明はまた、 配列番号 ： 2、 4、 6、 23、 25、 27又は 29に記载 のァミ ノ酸配列をコー ドする塩基配列、 またはそれらの塩基配列の 一部分、 好ましくはアミノ酸 6個以上をコー ドする塩基配列、 例え ばコンセンサス領域の 6個以上のァミ ノ酸配列をコー ドする塩基配 列に対して、 例えば 5xSSC 、 50°Cの条件下でハイブリ ダィズし、 か っフラボノィ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活性を有す る蛋白質をコー ドする遺伝子に関するものである。 なお、 適切なハ イブリ ダイゼーショ ン温度は塩基配列やその塩基配列の長さによつ て異なり、 例えばアミ ノ酸 6個をコードする 18塩基からなる DNA フ ラグメ ン トをプローブと した場合には 50°C以下の温度が好ましい。
このよ うなハイブリ ダィゼーシヨ ンによって選択される遺伝子と しては、 天然由来のもの、 例えば植物由来のもの、 例えば、 ペチュ 二ァゃトレニァ由来の遺伝子が挙げられるが、 植物以外の由来であ つてもよい。 また、 ハイブリ ダィゼーシヨ ンによって選択される遺 伝子は cDNAであってもよく、 ゲノム DNA であってもよい。
本発明はさらに配列番号 ： 2 、 4 、 6 、 23、 25、 27又は 29に記载 のァミノ酸配列に対して約 50 %以上、 好ましく は 60 %または 70 %以 上、 あるいはさらに、 80 %又は 90 %以上、 の相同性を有するァミ ノ 酸配列を有し、 かつフラポノィ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転 移する活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子の花色変換への利用 に関するものである。
生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に具体的に示すように、 例えば cDNAライブラリーのスク リーニングによって得られる。 また 、 修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコー ドする DNA は生来 の塩基配列を有する DNA を基礎と して、 常用の部位特定変異誘発や PCR 法を用いて合成することができる。 例えば修飾を導入したい DN A 断片を生来の cDNAまたはゲノム DNA の制限酵素処理によって得、 これを铸型にして、 所望の変異を導入したプライマーを用いて部位 特異的変異誘発または PCR 法を実施し、 所望の修飾を導入した DNA 断片を得る。 その後、 この変異を導入した DNA 断片を目的とする蛋 白質の他の部分をコー ドする DNA 断片と連結すればよい。 あるいはまた、 短縮されたアミ ノ酸配列からなる蛋白質をコー ド する DNA を得るには、 例えば目的とするアミ ノ酸配列より長いアミ ノ酸配列、 例えば全長アミノ酸配列をコー ドする DNA を所望の制限 酵素により切断し、 その結果得られた DNA 断片が目的とするアミ ノ 酸配列の全体をコ一ドしていない場合は、 不足部分の配列からなる DNA 断片を合成し、 連結すればよい。
また、 得られた遺伝子を大腸菌および酵母での遺伝子発現系を用 いて発現させ、 酵素活性を測定することによ り、 得られた遺伝子が 脂肪族ァシル基転移活性を有する蛋白質をコードするこ とを確認す ることができる。 さらに、 当該遺伝子を発現させることによ り、 遺 伝子産物である脂肪族ァシル基転移活性を有する蛋白質を得ること ができる。 あるいはまた、 配列番号 ： 2、 4、 6、 23、 25、 27又は 29に記載のアミ ノ酸配列に対する抗体を用いても、 脂肪族ァシル基 転移活性を有する蛋白質を得ることができ、 抗体を用いて他の生物 由来の脂肪族ァシル基転移活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子 をク ローン化することもできる。
従って本発明はまた、 前述の遺伝子を含む組換えベクター、 特に 発現ベクター、 及び当該ベクターによって形質転換された宿主に関 するものである。 宿主と しては、 原核生物または真核生物を用いる ことができる。 原核生物と しては細菌、 例えばェシエリ ヒア （Esch erichia ) 属に属する細菌、 例えば大腸菌 （Escherichia coli) 、 パシルス （Bacillus) 属微生物、 例えばパシルス . スブチルス （Ba cillus subtilis ) など常用の宿主を用いることができる。 真核性 宿主としては、 下等真核生物、 例えば真核性微生物、 例えば真菌で ある酵母または糸状菌が使用できる。
酵母と しては例えばサッカロ ミセス （Saccharomyces ) 属微生物 、 例えはサッカ ロ ミセス . セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) 等が挙げられ、 また糸状菌と してはァスペルギルス （Aspergi l lus ) .属微生物、 例えばァスぺノレギルス. ォリゼ （Asperg i l lus oryzae ) 、 ァスぺノレギノレス. 二ガー ( Aspergi l lus niger ) 、 ぺニシリ ゥ ム （Peni c i l l ium ) 属微生物が挙げられる。 さらに動物細胞または 植物細 が使用でき、 動物細胞と しては、 マウス、 ハムスター、 サ ル、 ヒ ト等の細胞系が使用される。 さらに昆虫細胞、 例えばカイコ 細胞、 またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
本発明の発現べクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存し て発現制御領域、 例えばプロモーターおよびターミネータ一、 複製 起点等を含有する。 細菌用発現ベクターのプロモーターと しては、 常用のプロモーター、 例えば t r c プロモーター、 tac プロモーター 、 lac プロモーター等が使用され、 酵母用プロモーターとしては、 例えばグリセルアルデヒ ド 3 リ ン酸デヒ ドロゲナーゼプロモーター 、 PH05プロモーター等が使用され、 糸状菌用プロモーターとしては 例えばアミ ラーゼプロモーター、 t rpCプロモーター等が使用される 。 また動物細胞宿主用プロモーターと してはウィルス性プロモータ 一、 例えば SV40アーリープロモーター、 SV40レートプロモーター等 が使用される。 発現ベクターの作製は制限酵素、 リガーゼ等を用い て常用に従って行う ことができる。 また、 発現ベクターによる宿主 の形質転換も常法に従って行う ことができる。
前記の発現べクターによって形質転換された宿主を培養、 栽培ま たは生育し、 培養物等から常法に従って、 例えば、 濾過、 遠心分離 、 細胞の破碎、 ゲル濾過クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマ ト グラフィ一等によ り 目的とする蛋白質を回収、 精製することができ る。
本発明はサルビア由来の脂肪族ァシル基転移活性を有する蛋白質 をコードする遺伝子のみに限定されるものではなく、 脂肪族ァシル 基転移活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子の利用に関するもの である。 脂肪族ァシル基転移活性を有する蛋白質の起源と しては、 植物でも動物でも微生物であってもよく、 脂肪族ァシル基転移活性 を持っていれば、 同様に花色変換へ利用できる。 さ らに本発明は、 脂肪族ァシル基転移活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子を導入 することによ り、 色合いが調節された植物もしく はその子孫又はこ れらの組織に関するものであり、 その形態は切り花であってもよい 本発明で得た脂肪族ァシル基転移活性を有する蛋白質をコー ドす る遺伝子を用いると、 液胞内に蓄積しているアントシァニンをァシ ル化することで青くでき、 結果と して花の色を青くすることができ る。 現在の技術水準をもってすれば、 植物に遺伝子を導入し、 その 遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能である し、 またアンチセンス法やコサプレツション法によって目的の遺伝 子の発現を抑制することも可能である。
形質転換可能な植物の例と しては、 バラ、 キク、 カーネーシ ョ ン 、 金魚草、 シクラメ ン、 ラン、 トルコギキヨ ウ、 フリージア、 ガー ベラ、 グラジオラス、 カスミ ソゥ、 カランコェ、 ユリ、 ペラノレゴニ ゥム、 ゼラニゥム、 ペチュニア、 トレニァ、 チューリ ップ、 イネ、 才ォムギ、 小麦、 ナタネ、 ポテ ト、 トマ ト、 ポプラ、 パナナ、 ユー カリ、 サッマイモ、 タイズ、 ァノレフ アルファ、 ルーピン、 トウモロ コシなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。 実施例
以下実施例に従って、 発明の詳細を述べる。 分子生物学的手法は とく に断らなレヽ限り、 Mo l e cul ar Cl oning ( Sambr o ok e t al . , 198 9 ) に依った。 実施例 1 . 種々のアントシァニンの pHによる色彩変化 デルフィ二ジン 3，5-ジダルコシ ド、 ァヮパニン （デノレフィニジン 3- ( クマロイノレ） グノレコ シ ド—5- グノレコ シ ド） 、 マ ロ ニルァヮノ 二 ン (デルフィ二ジン 3-( クマロイノレ） ダルコシド- 5- (マ ロ 二ノレ） ダルコシド） をそれぞれ 0· 1 ιηΜ、 0.3 mM、 0.5 mM .の濃度でマック ルベイ ン緩衝液（pH5.3， pH5.6, PH6.0) に溶解し、 その溶液の色を カラーチャート (Royal Horticultural Society ) で評価した。 な お、 デルフィ二ジン 3， 5-ジダルコシドは、 その 3， 5-ジァセチルダノレ コシド体からアルカ リ加水分解により、 ァセチル部分を除去するこ とにより得られる (Tetrahedron, 48, 4313-4326, 1992) 。
ァヮパニンは、 マロニルァヮパニンの 5—マロニル部分を除去す ることによ り得られる （Tetrahedron Lett, 24, 4863-4866, 1983 ) 。 また、 マロニノレアヮノ ニンま、 Tetrahedron Lett , 24, 4863-4 866， 1983 に記載の方法により植物体から抽出して得られた。 カラ 一チャートは数字が大きいほど青い色で、 同じ数字の中では A がも つとも濃い。 結果を表 1にまとめた。 いずれの濃度、 p H において もマロニルァヮパニンがもつとも青く、 マロニル基がアントシァニ ンの青色化に貢献していることが示された。
表 1
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実施例 2 . サルビア · マロニル基転移酵素の活性測定
マロニル基転移酵素の活性測定は、 反応液 100 μ 1 (終濃度 20 m M リ ン酸カ リ ウム、 p Η7· 0中に、 0. 01% ト リ フルォロ酢酸 （TFA ) に溶解したシソニン 10 μ g、 マロニル CoA 10 μ g , および測定する 酵素標品を含む） を 30°Cで 20分間反応させた後、 氷冷 0. 05%TFA水溶 液 200 1 を添加することにより、 反応を停止した。 シソニンおよ びマロ二ルシソニンの定量は Shodex Asahipak ODP-50 4E カラムを 用いた逆相高速液体ク 口マ トグラフィー （DYNAMAX HPLCシステム） によ り、 0. 5%TFA 水溶液を A 液と し、 0. 5%TFA，50 %ァセ トニ ト リル 水溶液を B 液と して、 分離開始から 0 分、 3 分、 17分、 18分、 23分 、 24分、 30分における B 液濃度がそれぞれ 45% , 45%，55%，100%，100%， 45% , 45% になるよう直線濃度勾配で、 毎分 0. 7ml の流速で 520nm の 吸収をモニターしながら、 反応液 50 μ 1 を用いて行った。
実施例 3 . サルビア · マロニル基転移酵素のタ ンパク精製 マロ -ル基転移酵素の精製はサルビア . スプレンデンス （Salvia splendens) の赤色花 2，664 gを材料と して行った。 サルビア花は 開花直前までの萼を含む花全体を集め、 実験に用いるまで— 80度で 保存しておいた。
サルビア花 500 gに対してポリ ビニルポリ ピロ リ ドン（PVPP)IOO g、 抽出緩衝液 （100 mM リ ン酸カ リ ウム （ρΗ7· 0)、 30 mM 2_メル カプ トェタノール、 5 mM EDTA) 3 Lおよび終濃度 0· 5 mM フエ二 ルメチルスルホニルフルオラィ ド（PMSF)を加え、 HEAVY DUTY BLEND ER (WARING) にて破碎した。 得られた破砕液を 7， 500 X G、 20分間 遠心分離した。 上清を吸引 6過 （ろ紙、 Whatman 114 ) し、 粗酵素 液と した。 2，664 gから 10.4Lの粗酵素液を得た。
次に硫安分画を行い、 硫酸アンモニゥム 2 0 - 5 0 %飽和画分の 沈殿として回収し、 緩衝液 A (100 mM リ ン酸カ リ ウム （pH7.0)、 30 mM 2 -メノレカプ トエタノール、 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF) に溶 解した (2920ml) 。 これに Octyl Sepharose Fast Flow (アマシャム フアルマシア バイオテク株式会社） 280ml を加え、 静かに攪拌 しながら、 終濃度 30%飽和になるように硫酸ァンモ-ゥムを徐々に 添加した。 十分に攪拌した後、 ー晚静置した。 上清にマロ二ル基転 移酵素活性の残っていないことを確認した後、 泥漿液中のゲルを吸 引ろ過 （ろ紙、 Whatmanll4) により回収した。 ゲルを緩衝液 B (20 mM リ ン酸カ リ ウム （pH7.0 ) 、 30 mM 2-メルカプトエタノール、 20%飽和硫酸アンモニゥム） で吸引ろ過しながら十分に洗浄した。
ゲルに緩衝液 C {20 mM リ ン酸カ リ ウム （ρΗ7·0 ) 、 15 mM 2 -メ ルカプトエタノール、 50%エチレングリ コール、 0.1% 3-[(3- コラ ミ ドプロ ピル） ジメチルアンモニォ ]-1-プロパンスルホン酸（CHAPS ) } 280 mlを加え、 30分静かに攪拌した後、 吸引ろ過にてマロニル 基転移酵素活性画分を回収した。 この緩衝液 C による溶出操作を 10 回繰り返し行い活性画分を集めた。 Pellicon (Biomax 8K, MILLIPO RE CORPORATION) により濃縮した後、 緩衝液 D (10 mM リ ン酸カ リ ゥム （pH7.0) 、 15 mM 2-メルカプトエタノール、 0.03% TritonX- 100) にて脱塩し、 155mlの酵素液 1 を得た。
MIMETIC Yellow 2 (ナカライテスク株式会社) 100ml をェコノ力 ラム （ ψ 1.0cm X 120 cm, 日本パイォ . ラッ ド ラボラ ト リーズ株 式会社） に充填し、 緩衝液 D にて平衡化した。 酵素液 1全量をアブ ライ後、 緩衝液！） にて洗浄したのち、 緩衝液 E (20 mM リ ン酸カ リ ゥム （pH7.0 ) 、 30 mM 2_メルカプトエタノール、 0. 05% CHAPS ) によ り、 カラムに結合した蛋白質を溶出した。 活性画分を Pellic onおよび限外ろ過 （YM- 10, MILLIP0RE CORPORATION) により濃縮し , 3 2 m l の酵素液 2を得た。
MIMETIC Red 3 (ナカライテスタ株式会社) 50mlをェコノカラム ( φ 1.5cm X 30cm, 日本バイオ . ラッ ド ラボラ トリーズ株式会社 ) に充填し、 緩衝液!7 (5 mMリ ン酸カ リ ウム （ρΗ7·0 ) 、 15 mM 2 - メルカプトエタノール、 0.03% TritonX-100) にて平衡化した。 酵 素液 2 全量をアプライ後、 緩衝液 F にて洗浄したのち、 緩衝液 G ( 5 mMリ ン酸カ リ ウム （pH7.0 ) 、 30 mM 2-メルカプトエタノール、 0.03% TritonX- 100， 0.1 mM ァセチル CoA ) によ り、 カラムに結 合した蛋白質を溶出した。 活性画分を Pellicon, 限外ろ過およびセ ント リ コンによ り濃縮した後、 緩衝液 H (30 mM リ ン酸カリ ウム （ pH7.0)、 30 mM 2—メノレカプトエタノーノレ、 0, 03o/o TritonX-100) に て脱塩し、 3 m l の酵素液 3 を得た。
MIMETIC Red 3 (ナカライテスタ株式会社） 5ml をェコノカラム ( φ 1.0cm X 10cm、 日本バイオ ' ラッ ド ラボラ ト リーズ株式会社 ) に充填し、 緩衝液 F にて平衡化した。 酵素液 3 全量をアプライ後 、 緩衝液 F にて洗浄したのち、 緩衝液 Gによ り、 カラムに結合した 蛋白質を溶出した。 活性画分をセン ト リ コンによ り濃縮した後、 1. 5 m 1 の酵素液 4 を得た。
MonoQ5/5カラム (アマシャム フアルマシア バイオテク株式会 社） を緩衝液 G で平衡化した後、 酵素液 4全量を流速 0.05ml/minで アプライ し、 緩衝液 F で洗浄した （流速 0.05ml/min、 60分） 。 緩衝 液 I (20 mM リ ン酸カ リ ウム （pH7.0 ) 、 30 mM 2-メルカプトエタ ノーノレ、 0.03ο/。 TritonX— 100， 1 mM NaCl ) の 0 — 100 0/o直 ϋ勾酉己 (流速 0.05ml/min、 400 分） により、 カラムに結合した蛋白質を溶 出し、 活性画分をセン ト リ コンにて濃縮し、 0.8ml の酵素液 5を得 た。
Phenyl Superose HR 5/5 (アマシャム フアルマシア バイオテ ク株式会社） を緩衝液 B で平衡化した後、 終濃度 20%飽和になるよ う硫酸ァンモニゥムを添加した酵素液 5を,流速 0.02ml/minでァプラ ィ した。 緩衝液 B でカラムを洗浄後、 緩衝液 C の 0 — 100 %直線勾 配 （流速 0.02ml/min、 500 分） によ りカラムに結合した蛋白質を溶 出し、 活性画分を得た。
さ らに、 調製用電気泳動システム （バイオ ' フォレーシス III 、 ア ト一株式会社） にて分画し、 得られたマロニル基転移酵素画分 3. 2ml を限外ろ過膜濃縮、 0. 02%SDS/75mM ト リス塩酸緩衝液 （pH8.8
) 置換を行い 40 1 に濃縮した。 その後、 逆相カラム （PorosR2H 、 日本パーセプティブ株式会社） HPLCにて最終精製を行った。 分離 条件は、 0.1%TFA のも.と、 60分でァセ トニ ト リル濃度が 8 %から 8 0 %の直線濃度勾配、 毎分 0.1ml の流速で 2 8 0 nmの吸収をモニタ 一しながらピーク画分のみを分取した。 最終的に得られた蛋白質は 4 7 k Daの単一パンドであったことから、 マロニル基転移酵素の分 子量は 4 7 k Daであることが判明した。
実施例 4. サルビア · マ口ニル基転移酵素の部分ァミ ノ酸配列の 決定
実施例 3で単一パン ドと して回収した蛋白質に 2pmol の ト リ プシ ン （プロメガ株式会社） を加えて 37°Cで 30時間消化し、 各ペプチ ド 断片の構造決定を試みた。 ト リプシン消化液を逆相 HPLC ( RPC C2 /C18、 アマシャム フアルマシア バイォテク株式会社) によ り各 ペプチド断片を分離した。 分離条件は、 0.1%ト リ フルォロ酢酸のも と、 60分でァセ トニト リル濃度が 8 %から 8 0 %の直線濃度勾配、 毎分 0.1ml の流速で 215nmの吸収をモニターしながら吸収のピーク 画分のみを分取した。
各ピーク画分をスピー ドパックで濃縮 · 乾固させ、 37%ァセ ト二 ト リル 30 μ 1 に溶解させ、 アミ ノ酸シークェンサ一 （PSQ- 1 、 株式 会社島津製作所） に供した。 その結果、 12種のペプチドのアミ ノ酸 シークェンスを判読するこ とができた。 以下にァミ ノ酸配列を示す
ΜΤΤ20: Tyr-Ala-Ala-Gly-Asp-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ile-Ala-Ala-S er-Asn (配列番号 ： 7 )
MTT21-1: Leu-Leu-Phe-Tyr-His-His-Pro-Ser-Ser-Lys (配列番号 ： 8 )
MTT21-2: Ser-Gly-Asp-Lys-Ser-Asp-Glu-Asn-Ala-Pro-Glu-Leu-Ph e - Ile-Ile- Pro- Ala- Asp- Ala (配列番号 ： 9 )
MTT22-1: Met-Ala-Ala-Phe-Glu-Glu-Val-Phe (配列番号 ： 10) MTT23: Trp-Leu-His-Tyr-His-Pro-Val (配歹' J番号 ： 11)
MTT26: Gly-Ala-Glu-Asn-Trp-Met-Ser-Asp-Ile-Phe-Lys (配列番号 ： 12)
MTT27-2: Leu - Ala - Ala - Glu - Xaa - Gly - Phe- Ala - Vaト Ala - Ala- Ala - A1 a-Ile-Gly_Gly- Gly- lie- lie- Gly (配列番号 ： 13)
MTT28: Ser-Phe-Ile-Asn-Asp-Pro-Asn-Lys-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe ( 配列番号 ： 14)
MTT141: Thr-Ala-Ser-Phe-Pro-Leu-Pro-Thr-Asn-Arg (配列番号 ： 15)
MTT141-2: Phe-Pro-Gln-Leu-Arg (配列番号 ： 16)
MT142: Ala-Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys (配列番号 ： 17)
MTT291： Asp-Ala-Asp-Gln-Phe-Tyr-Asp-Leu-Leu-Pro-Pro-Ile-Pro-
Pro (配列番号 ： 18)
実施例 5. サルビア · マロニル基転移酵素の遺伝子断片の増幅 実施例 4で得られた部分アミ ノ酸配列 MTT20 と MT142 をもとにし て以下のプライマーを作成した。
MTT20-1 ： 5 TA(T/C) GCI GCI GGI GA(T/C) TCI GTI CCI GT -3'
( I ： イ ノ シン） （配列番号 ： 19)
MTT20-3 ： 5' - GTI CCI GTI ACI AT(A/T/C) GCI GC - 3' (配歹' J番号
： 20)
ATCRr2： 5'- (T/C)TT ICC CCA ICC (A/G)AA (A/G)TC IGC 一 3' (酉己 列番号 ： 21)
サルビア花から調製した cDNAを铸型として総量 100 μ 1 として、 以下の反応液組成で PCR を行った ； IxTAKARA PCR緩衝液、 200 mM dNTPs, サノレビ、ァ cDNA 100 ng, MTT20—1プライマー lpmol/ 1， ATC Rr2 プライマー lpmol/ μ 1, TAKARA rTaq 2.5ュニッ ト。 反応は 96 °Cで 1 分反応させた後、 96°Cにて 1 分、 42 °Cにて 2 分、 72°Cにて 3 分で 30サイクル反応させ、 さ らに 72°Cで 7 分間反応させた。
この反応産物を铸型として MTT20-3 、 ATCRr2プライマーを用いて 上記と同様の反応液組成で nested PCRを行った。 反応は 96度で 1 分 反応させた後、 96°Cにて 1分、 50°Cにて 2 分、 72°Cにて 3 分で 30サ ィクル反応させ、 さらに 72°Cで 7 分反応させた。 得られた PCR 産物 をサブクローニングしてシークェンスを行ったところ、 約 900bp の 反応産物の推定アミ ノ酸配列内にプライマーの設計に用いたもの以 外の部分アミノ酸配歹 IJMTT141、 MTT26 、 MTT27-2 (配列番号 ： 15, 12及び 13) が見出されたことから、 精製蛋白質をコー ドする遺伝子 断片であることが明らかになった。
実施例 6. サルビア · マロニル基転移酵素 c DNA の単離
サルビア · グァラ二ティカ （Salvia guaranitica) の花由来の cD NAライブラリーを Stratagene社の； I ZAP II directional cDNA synt hesis kit を用い製造者の推奨する方法で構築した。 このライブラ リ一の約 20万個のク口一ンを実施例 3で得られた 889bp の DNA 断片 をプローブとして洗浄条件 （5x SS 0.1% SDS, 37度） でスク リー ニングし最終的に 1 0ク ローンの陽性ク口 ンを得た。 それらは 3 種類のグループに分類できそれぞれのグループで最長のクローンを SgMaTl、 SgMaTl' および SgMaT2と名づけた。 なおライブラリーのス ク リーニングは、 公知の方法 （例えば、 Fujiwara et al， 1998, PI ant. J.16, 421 ) によった。
SgMaTlおよび SgMaTl' は、 それぞれ 1419bpおよび 1471bpで、 どち らも開始メチォニンを欠いていた。 SgMaTlと SgMaTl' はアミノ酸レ ベルで 98%の相同性を示したことから同一の酵素遺伝子をコ一ドす る対立遺伝子であると考えられた。 SgMaTlの推定ァミ ノ酸配列中に 実施例 4で明らかにした精製マ口ニル基転移酵素の部分ァミ ノ酸配 列が一部異なる部分もあったがすべて確認できた。 一部の異なる部 分は、 使用したサルビアの種の違いによるものと思われる。
これらの結果から SgMaTl及び SgMaTl' 遺伝子は、 アントシァニン の 5位の糖にマロ二ル基を転移する酵素をコー ドしていることが明 らカ になった。 SgMaT2は、 1530 bp の cDNAを持ち、 その中には 1260 bpからなるオープンリーディ ングフ レームが存在し全長をコー ドし ていた。 アミ ノ酸レベルで、 SgMaTlは SgMaT2に対して 52 %の同一性 を示した。 また、 いずれの遺伝子も他の植物のァシル基転移酵素と
37〜47%の同一性を示した。
リ ンドウでは、 同一品種内でも機能の異なるァシル基転移酵素は 、 35— 40%程度の同一'性し力、示さな ヽ （Yonekura— Sakakibara et a 1.， 2000, Plant Cell Physiol.41:495-502 ) 。 よって、 SgMaTlと SgMaT2における 55%という同一性は、 同一品種由来の遺伝子である ことを差し引いても、 SgMaTlと SgMaT2が機能的に類似しており、 Sg MaT2もアントシァニンへのマロニル基の転移反応を触媒することを 示している。 SgMaTl、 SgMaTl' 及び SgMaT2の塩基配列をそれぞれ配 列番号 ： 1、 3及び 5に示し、 これらの塩基配列から推定されるァ ミ ノ酸配列をそれぞれ配列番号 ： 2、 4及び 6に示す。
実施例 7. 大腸菌でのマロニル基転移酵素活性の確認
終濃度 50 mg/L のアンピシ リ ンを含有する LB 培地に、 プラスミ pSgMaTl (pBluescriptSr ( Stratagene )の EcoRI， Xhol サイ トに SgMaTl遺伝子を含み、 イ ソプロピルベータチォガラク ト シド （IPTG ) 添加によって SgMaTl遺伝子産物を lacZ蛋白質との融合蛋白質と し て発現できる） を導入した大腸菌のシングルコ ロ ニーを植菌し、 37 °Cでー晚しんと う しながら前培養した。 その培養液 （2 ml) を 100m 1 のアンピシ リ ン含有 LB培地に植菌し、 30度で 600nm の吸光度が 0. 5 になるまで本培養した。 その後、 培養液に IPTGを終濃度で ImM と なるように添加し、 さ らに 30°Cで IPTG添加後 9 時間培養し集菌した 。 集菌した菌体を、 緩衝液 （0.1 M KPB, pH 7.0， 30 mM 2- メルカ プトエタノーノレ、 ImM EDTA, 0.1 mM PMSF, 0.1% TritonX— 100 ) に 懸濁し、 永冷しながら細胞を超音波破碎した。
遠心分離にて得た上清部分 （可溶性画分） を用いて酵素活性を測 定した。 なお、 コントロールとして pBluescriptSIT のみを含んだ 大腸菌についても同様に処理した。 活性測定は、 シソニンを基質と して用い、 実施例 2に従った。
pSgMaTl 遺伝子発現産物による反応産物にほ、 シソニン （Rt 9.7 分） に加え、 マロ二ルシソニン （Rt 12.2 分） が検出されたが、 コ ント ロールでは、 シソニンのみしか検出されなかった。 このことか ら SgMaTl遺伝子は、 マロニル基転移活性を有する酵素をコー ドして いることが確認された。
実施例 8. サルビア由来のマロニル基転移酵素 cDNAの単離 （ 2 ) サノレビア （Salvia splendens) の花弁 c DNAライブラ リーを λ ZAP II (Stratagene|±) をベクターとする ZAP - cDNA Synthesis Kit (St ratagene社） を用いて、 製造者が推奨する方法により構築した。 実 施例 6で得られた SgMaTlをプローブと して実施例 6に記載の方法で スク リ一二ングした。 得られたクローンの中で最も c DNAの長かつ たク ローンを SsMaTlとした。 この塩基配列を配列番号 ： 2 2に示し 、 該塩基配列から推定されるアミ ノ酸配列を配列番号 ： 2 3に示す 。 この c DNAは、 その配列から、 完全長ではないと考えられる。
SsMaTlは、 アミノ酸レベルで SgMaTlに対して 9 2 %、 SgMaT2に対 して 5 2 %の同一性を示した。
また同様に同じライブラリ一を SgMaT2でスク リ一二ングし、 SsMa T2を得た。 この塩基配列を配列番号 ： 2 4に示し、 該塩基配列から 推定されるアミ ノ酸配列を配列番号 ： 2 5に示す。
SsMaT2は、 アミ ノ酸レベルで SgMaTlに対して 5 3 %、 SgMaT2に対 して 9 6 %、 SsMaTlに対して 5 2 %の同一' [~生を示した。
実施例 9. シソ由来のマロニル基転移酵素 cDNAの単離
シソ （Perlla frutescens) から若い赤い葉を採集し、 これをも とに cDNAライブラリーを； I ΖΑΡΠ (Stratagene社） をベクターとす る ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社） を用いて、 製造者が推 奨する方法によ り構築した。 このライブラリ一を実施例 8 と同様に SgMaTlをプローブにしてスク リーエングし、 得られたクローンの中 で最も cDNAの長かったクローンを PfMaTlとした。 PfMaTlの塩基配列 を配列番号 ： 2 6に示し、 該塩基配列から推定されるアミノ酸配列 を配列番号 ： 2 7に示す。
PfMaTlは、 アミ ノ酸レベルで SgMaTlに対して 6 7 %、 SgMaT2に対 して 5 7 %、 SsMaTlに対して 6 5 %、 SsMaT2に対して 5 7 %の同一 性を示した。
実施例 1 0. ラベンダー由来のマロニル基転移酵素 cDNAの単離
ラベンダー (Lavendula angustifolia) の cDNAライブラリーを λ ZAP II (Stratagene社） をベクターとする ZAP - cDNA Synthesis Kit
(Stratagene社） を用いて、 製造者が推奨する方法により構築した 。 このライブラリ一を実施例 6で得られた SgMaT2をプローブと し、 実施例 6に記載の方法でスク リ ーニングし、 LnMaT2を得た。 この塩 基配列を配列番号 ： 2 8に示し、 該塩基配列から推定されるァミノ 酸配列を配列番号 ： 2 9に示す。
LnMaT2fま、 アミ ノ酸レべノレで SgMaTliこ対して 5 30/o、 SgMaT2こ対 して 6 50/ο、 SsMaTliこ対して 5 1 o/o、 SsMaT2こ対して 6 40/o、 PfMa T1に対して 5 6 %の同一性を示した。
実施例 1 1 . S. splendens MaTlの発現
実施例 8で得られた SsMaTl遺伝子の 5' -末端に BamHIサイ トを導 入するプライマー （Primer#l： 5' -GGA TCC ATC GAG GGA CGC ATG ACA ACA ACA ACA AC- 3， （配列番号 ： 3 0 ) ) 、 SsMaTl遺伝子の 3 ， -末端に BamHIサイ トを導入するプライマー （Primer#2： 5， -GGA TCC TTA CAA TGG TTC GAC GAG CGC CGG AGA-3' (配歹' J番号 ： 3 1 ) ) 、 および SsMaTl遺伝子中の BamHIサイ トを欠失させるプライマ 一 （Primer#3： 5' - G GAC CCG CCG ATA CCG GAA AAT TAC TTC-3' (配列番号 ： 3 2 ) ) を合成した。 なお Primer#lは SsMaTl開始コ ド ンのメチォニンの直前に Factor Xa切断サイ ト （ I le- Glu-Gly-Arg) をコー ドするよう設計した。
pBK-CMV ファージミ ドベクター （東洋紡績株式会社） のマルチク ローニングサイ ト （EcoRI、 Xhol) に SsMaTl cDNAが挿入されたプラ スミ ド （pBK- CMV-SsMaTl) を铸型と し、 Primer#2および Primer#3を 用いた一回目の PCR (反応液組成 ： pBK-CMV- SsMaTl 100 ng、 l Xpf u buffer (Stratagene社） 、 200 μ M dNTPs、 1 μ M Primer#2、 1 μ M Primer#3、 2.5 U pfu ポリ メラーゼ （Stratagene社； 反応条 件 ： 96°C 2分間、 （96°C 1分、 70°C 1分、 72°C 3分） X30サイ クル 、 72°C 7分） を行ない、 PCR産物 （約 500 bp) を得た。
さらに、 得られた PCR産物である SsMaTlの 2本鎖 DNA断片と Primer# 1を用いて、 PCR (反応液組成 ： pBK-CMV- SsMaTl 100 ng、 l Xpfu 緩衝液、 200 β Μ dNTPs、 Ι μ Μ Primer#l、 一回目の PCR産物 100 n g、 2.5 U pfu DNA ポリ メラーゼ （Stratagene社） ； 反応条件 ： 96 。C 7分間、 (96°C 2分、 70°C 1分、 72°C 7分) X30サイクル、 72 °C 10分) を行なった。
2回目の PCR産物は A-tail付カロ （2回目の PCR産物 100 ng、 1 X ExTa q 緩衝液、 2 mM dATP、 TaKaRa ExTaq； 70°C、 30分） をほどこした 後、 pCR2.1- T0P0ベクター (ク ローンテック株式会社) にクロー二 ングした。 その結果、 完全長 SsMaTlを挿入するプラスミ ド （pCR2. 1-SsMaTl) を得た。 DNAシークェンサ一によ り SsMaTl遺伝子の DNA配 列に PCR操作による誤ったヌク レオチ ドの取り込みがないことを確 認した。
pCR2.1- SsMaTlを BamHIで完全消化し、 生成した約 1400 bpの DNA断 片を回収した。 この DNA断片を大腸菌発現ベクター pQE-30 (QIAGEN 社） の BamHIサイ トにサブクローニングし、 pQE_30Xa- SsMaTlと した pQE- 30Xa- SsMaTlを含む大腸菌での SsMaTl発現は実施例 7に記载 の方法に従った。 また、 酵素の活性測定は実施例 2に記載の方法に 従つに。
SsMaTl遺伝子を発現している大腸菌抽出物を用いて酵素活性を測 定したところ、 シソニンに加え、 マロ二ルシソニンの産生が確認で きた。 すなわち、 SsMaTlがフラポノイ ドの 5位の糖にマロ二ル基を 転移する活性を有する蛋白質をコー ドしていることが確認された。
また、 基質と してマロニル CoAの代わりに、 ァセチル CoA、 メチル マ口ニル CoA、 サクシニル CoAを用いた場合でも、 シソニンに加え新 しいピークが HPLCによるカラムクロマ トグラフィ一で観察され、 Ss MaTlはこれらの基質をシソニンへ転移する活性を有することが判明 した。
実施例 1 2 . P. frutes cens MaTlの発現
実施例 7 と同様に、 実施例 9で得られた PfMaT l遺伝子を LacZ蛋 白質との融合蛋白質として発現できるように作製レたプラスミ ドを 用いて、 実施例 7 と同様に大腸菌で発現させ、 活性測定に供した。 酵素の活性測定は実施例 2に記載の方法に従った。
PfMaTl遺伝子を発現している大腸菌抽出物を用いて酵素活性を測 定したところ、 シソニンに加え、 マロ二ルシソニンの産生が確認で きた。 すなわち、 PfMaTlがフラボノィ ドの 5位の糖にマロ二ル基を 転移する活性を有する蛋白質をコードしていることが確認された。 産業上の利用可能性
本発明によ り、 脂肪族ァシル基転移酵素が花の色の制御に関わつ ていることがはじめて明らかとなった。 本蛋白質を花弁で発現させ 、 アン トシァニンを修飾させることによ り、 花の色を変化させるこ とができる。 脂肪族ァシル基転移酵素としては、 ここで述べたサル ビア、 シソ、 ラベンダー由来のものだけでなく、 他の生物の同様な 酵素活性をもつ遺伝子を用いることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . フラボノイ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活性を 有する蛋白質をコードする遺伝子。
2 . 配列番号 ： 2、 4、 6、 23、 25、 27又は 29に記載のアミ ノ酸 配列を有し、 フラボノィ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する 活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、 あるいはそれらのアミ ノ 酸配列に対して 1個又は複数個のァミノ酸の付加、 欠失及び また は他のアミ ノ酸による置換によって修飾されており、 且つフラボノ イ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活性を有する蛋白質を コー ドする請求項 1記載の遺伝子。
3 . 配列番号 ： 2、 4、 6、 23、 25、 27又は 29に記載のアミノ酸 配列に対して 50% 以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、 且つフ ラボノィ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活性を有する蛋 白質をコードする請求項 1又は 2記載の遺伝子。
4 . 配列番号 ： 2、 4、 6、 23、 25、 27又は 29に記載のアミ ノ酸 配列をコー ドする塩基配列の一部または全部に対して、 5 X SSC 、 50°Cの条件下でハイブリダィズし、 且つフラボノィ ドの 5位の糖に 脂肪族ァシル基を転移する活性を有する蛋白質をコー ドする請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の遺伝子。
5 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の遺伝子を含んでなるベ クタ一。
6 . 請求項 5に記載のベクターによ り形質転換された宿主。
7 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の遺伝子によってコー ド される蛋白質。
8 . 請求項 6に記載の宿主を培養し、 又は生育させ、 そして該宿 主からフラボノィ ドの 5位の糖に脂肪族ァシル基を転移する活性を 有する蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法。
9 . 請求項 1 〜 4のいずれか 1項に記載の遺伝子が導入された植 物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫またはそれらの組 織。
10. 請求項 9に記載の植物又はこれと同じ性質を有する該植物の 子孫の切り花。
11. 請求項 1〜 4に記載の遺伝子を用いて花の色を変える方法。
12. 請求項 1 〜 4に記載の遺伝子を用いて花の色を青くする方法
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