WO2001074482A1 - Nouveau materiau utilise pour la separation et procede de separation - Google Patents

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Kimihiro Yoshizako
Teruo Okano
Katsuhiko Ueno
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    • G01N30/52—Physical parameters
    • G01N30/54—Temperature

Definitions

  • the present invention makes it possible to reversibly change the interaction force of a substance (ligand) that specifically interacts with a target substance in an aqueous system by changing the structure and polarity of a stimuli-responsive polymer by physical stimulation.
  • the stimuli-responsive polymer is characterized by having no affinity for a substance that specifically interacts with a target substance, and a metal ion, a drug, a biological component, etc.
  • the present invention relates to a separation material such as a filler capable of separating a target substance, and a novel method for separating a substance using the separation material.
  • Ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, etc. which are used for the separation and purification of biological components and pharmaceuticals, are currently the most effective and efficient means. Furthermore, with the rapid progress of biotechnology in recent years, bioactive substances such as recombinant proteins and glycoproteins are being mass-produced, and these target substances are prevented from being deactivated, and a rapid and efficient separation and purification method. Is required.
  • the salt concentration, organic solvent concentration, pH concentration, etc. of the eluate are changed when eluting biological components, pharmaceuticals, recombinant proteins, glycoproteins, etc. as target substances.
  • the elution method is used.
  • the pH concentration, the organic solvent, and the like often become harsh conditions for the target substance, and the recovery rate is reduced.
  • it is necessary to finally remove salts, organic solvents, pH conditions, etc. used for elution of the target substance by desalting, drying, etc. it is necessary to separate and purify the target substance.
  • Ga laefeta 1 J. Chromatog. A64 (19949 37-43) describes the use of a substrate (base matri) carrying a temperature-responsive polymer to which a dye (ligand) is physically adsorbed. It describes the temperature-dependent elution of lactate dehydrogenase (LDH) in a covalently coupled chromatography system.
  • base matri carrying a temperature-responsive polymer to which a dye (ligand) is physically adsorbed. It describes the temperature-dependent elution of lactate dehydrogenase (LDH) in a covalently coupled chromatography system.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Ho man et a 1. (WO 87 06152) describes a separation method in which a ligand is bound to a temperature-responsive polymer. Binding and elution of the target occur on the same side of the critical solution temperature.
  • the present inventors have studied and developed the elution of the target substance by a physical method in order to solve the above problem.
  • poly N- By binding a molecule (ligand) that interacts with the target substance to (pyracrylamide), a complex of the stimulus-responsive polymer and the ligand is synthesized, and the ligand and the target substance are combined with the ligand by physical stimulation using this complex. It has been found that a separation material having a variable interaction can be obtained.
  • the present inventors utilize not only the adsorption of the target substance to the ligand molecule and the desorption of the ligand molecule but also the use of the polymer having a small molecular weight distribution by utilizing the elongation and aggregation of the polymer caused by physical stimulation.
  • the change in volume effectively to select, separate, and purify them according to the difference in the size of the target substance. That is, they have found that these can be achieved by reducing the molecular weight distribution (Mw / Mn) of the polymer.
  • Mw / Mn molecular weight distribution
  • the present invention includes a substance that specifically interacts with a stimulus-responsive polymer and a target substance.
  • a separation material including a composite material in which the interaction of a substance interacting with a target undergoes a change in the chemical or physical environment, and the interaction force with the target substance changes reversibly by a physical stimulus.
  • the present invention relates to a separation material characterized in that the hydrophilic polymer has no affinity for a substance that specifically interacts with a target substance. This means that the target substance is released from both the ligand and the separation material, so that the target substance can be separated from the complex or separation material.
  • the use of a polymer with a uniform molecular weight distribution means that the target can be selected at the same time depending on the size of the target substance.
  • the present invention also relates to a method for separating a target substance, comprising using the above-mentioned separation material.
  • the present invention relates to (a) the separation material (including a chromatographic filler) obtained by chemically modifying a complex containing a stimulus-responsive polymer and a molecule (ligand) that interacts with a target substance. Binding of the target substance to the stationary phase; and (b) the temperature of the ligand and the target substance is changed continuously or stepwise, preferably by external physical means (eXterna 1 means).
  • the mobile phase is a liquid, for example, an aqueous solution.
  • the present invention provides a filler (for example, Filler).
  • a filler for example, Filler
  • the present invention relates to a method for separating a target substance, which comprises using the above filler.
  • Figure 1 is a differential spectrum showing the affinity between Cibacron Blue and poly (N-isopropylacrylamide).
  • FIG. 2 is a chromatogram showing that a BSA molecule retained by a CB molecule elutes from a p (NIPAAm) —AmCB column due to a change in temperature.
  • FIG. 3 is a chromatogram of a control using a p (NIPAAm) column.
  • Figure 4 shows the calibration curve of the packing material on which the complexes with different molecular weights were immobilized.
  • Another embodiment of the present invention is a method for separating one or more target substances from a liquid. This embodiment includes the following steps.
  • step (a) the liquid sample is separated from the separation material.
  • the separation material may be washed alternatively before step (b).
  • the liquid (II) may be separated from the separation material. If so desired, the target substance may be removed from the liquid (II).
  • Biomolecules for example, nucleotide structure (including nucleic acid), polypeptide structure (protein)
  • target substances in the form of (including white matter), biomolecules having a carbohydrate structure, a steroid structure, etc.
  • the ligands typically used so far have been aqueous solutions.
  • This aspect of the present invention is characterized by the following points.
  • the separation material comprises a stimulus responsive macromolecule, as defined elsewhere herein, wherein the macromolecule is formed by a ligand, preferably after the macromolecule is formed; Functionalized by covalent bonds, and
  • step (ii) In step (a), and at least at the time of binding of the target substance to the ligand, the stimulus-responsive macromolecule is a conformation that enhances the binding of the target substance to the ligand (conformation). Now stimulate the separation material, and
  • step (b) the stimulus-responsive macromolecule is applied to the separation material at a level / strength that is a conformation that prevents binding of the target substance to the ligand. Give stimulation.
  • the level intensity of the stimulus is the exact opposite of the critical level Z intensity for the stimuli-responsive polymer used and other conditions applied at each stage.
  • This process may be performed periodically after step b, typically after a special wash regeneration step and an equilibration step, if step a is repeated. At this time, if the molecular weight distribution of the polymer is small, the polymer is selected according to the size of the target substance in the (ii) stage.
  • the various aspects of the above-described inventive method can be performed in a batch mode or a mouth chromatography mode.
  • chromatographic methods involve passing various liquids in a plug flow (mobile phase) over a separation material, while, on this separation material, individual steps and the stimulus used. This can be done by providing an appropriate stimulus for the responsive polymer.
  • the separation material may be a porous material or a packed or fluidized particle.
  • the batch mode is particularly relevant for turbulent flows (turbulent flow) and / or suspended particles in combination with liquids.
  • the physical stimulus in the method of the present invention is, for example, temperature.
  • Changing the molecular recognition ability of a molecule that interacts with a target substance by changing the temperature is achieved by, for example, complexing with a thermoresponsive polymer.
  • a thermoresponsive polymer For example, an amino group at the end of the complex, Chromatography packing materials chemically modified with polyalkylamides having a sil group, a hydroxyl group, or the like, or copolymers thereof, may be used.
  • the chemically modified carrier includes, for example, a silica carrier.
  • stimulus-responsive polymer is often called "functional polymer (intellligentpo1ymerrs)".
  • Stimuli-responsive polymers are characterized by their structural and irreversible changes in their physicochemical properties when exposed to the right intensity or level of the right stimulus (critical stimulus intensity or critical stimulus level). .
  • the change may be a conversion from significant hydrophobicity to significant hydrophilicity or vice versa.
  • the exact level of stimulus required, the strength and type of Z, depends on the structure of the macromolecule, and often has properties that also depend on other conditions (solvents, solutes such as salts, etc.).
  • the best-known and most widely used polymers of this type respond to heat (thermoresponsive or temperature-responsive polymers).
  • Temperature-responsive macromolecules are recognized by having a sharp phase transition temperature or temperature transition from significant hydrophilicity to significant hydrophobicity or vice versa. For temperature-responsive polymers in solution, changes in conformational / physicochemical properties occur at the so-called critical solution temperature (criticaalsolutiointtimerture: CST).
  • LCST lower critical temperature
  • UCT upper critical temperature
  • the temperature-responsive polymer preferably has a lower affinity for the target substance than the affinity between the target substance and the covalently bound ligand. It is preferable that there is no large affinity between the ligand and the thermoresponsive polymer.
  • the basic structural units of the temperature-responsive polymer include, for example, (meth) N-isopropylacrylamide, (meth) N-acryloylpiperidine, (meth) N-propylacrylamide, (meth) N, N-ge Tylacrylamide, (meth) N-cyclopropylacrylamide, (meth) N-acryloylpyrrolidine, (meth) N, N-ethylmethylacrylamide, (meth) N-ethylacrylamide (Meth) N-alkylacrylamide homopolymers and their copolymers, and carboxyl groups, amino groups, hydroxysuccinimide groups, thiol groups, iminos for chemical complexation with molecules that interact with the target substance And a monomer containing a functional group such as an epoxy group.
  • Examples of the polyalkylacrylamide used in the method of the present invention include a poly- (N-isopropylacrylamide) -dye complex.
  • Examples of the target substance and a molecule that interacts with the target substance include a biological component composed of an amino acid, a sugar, a nucleic acid, and the like, an organic compound having a molecular weight of 1000 or less, and the like.
  • the amount of ligand to be chemically complexed with the stimuli-responsive polymer can be arbitrarily controlled, but is preferably 0.1% to 50% of the composition in the complex. Further, the physical and chemical properties of the stimuli-responsive polymer can be changed depending on the amount of the complexed molecule interacting with the target substance.
  • the homopolymer has a lower critical temperature of around 32 ° C, but this can be controlled by the amount of complexing molecules that interact with the target substance.
  • the molecular weight distribution (Mw / Mn) of the high molecule immobilized on the substrate is desirably 3 or less. If the molecular weight is 3 or more, it is not easy to perform separation based on the difference in molecular weight or size of the target substance due to the presence of polymers having different molecular weights. Separation materials (eg, packing material for chromatography)
  • the separation material to be used in the present invention comprises a base (carrier), which may be based on organic and / or inorganic materials. No. If the liquid used is aqueous, the substrate is preferably hydrophilic. This applies in particular to target substances which are biopolymers of the kind described above.
  • the substrate is preferably a polymer, which is preferably insoluble in water and more or less swellable.
  • Hydrophobic polymers that have been modified to be hydrophilic are included in this definition.
  • Suitable polymers include polyhydroxy polymers (eg, polyhydroxy polymers based on polysaccharides such as agarose, dextran, cellulose, starch, pullulan, etc.) and synthetic polymers (eg, polyacrylamide, polymethacrylic acid).
  • Amides poly (hydroxyalkyl vinyl ethers), poly (hydroxyalkyl acrylates) and polymethacrylates (eg, polyglycidyl methacrylate), polyvinyl alcohol and polymers based on styrene and divinylphenylbenzene, and the aforementioned It is a copolymer containing two or more monomers corresponding to the polymer.
  • Water-soluble macromolecules may be modified to be insoluble, for example, by cross-linking and by bonding to insoluble substances by adsorption or covalent bonding.
  • the hydrophilic group is formed on the hydrophobic polymer by polymerization of a monomer having a group that can be converted to OH, or by making the final polymer hydrophilic (for example, adsorption of a suitable compound such as a hydrophilic polymer).
  • a suitable compound such as a hydrophilic polymer
  • Suitable inorganic materials to be used in the substrate are silica, zirconium oxide, graphite, tantalum oxide and the like.
  • Preferred substrates are those that lack hydrolytically labile groups such as silane groups, ester groups, amide groups and groups that are present in silica as such.
  • the substrate may be porous or non-porous. This means that the substrate may be fully or partially permeable (porous) or completely impermeable (non-porous) to the compound to be removed. I do.
  • the pores may have a size of at least 0.1 lm (e.g., at least 0.5), which means that a sphere having a diameter of at least 0.1 m (e.g., at least 0.5 m in diameter) Sphere) can pass through.
  • the applied liquid may be capable of flowing through such a pore system (penetration).
  • Support group If the support matrix is in the form of beads packed in a separation material, the ratio between the pore size of the penetrating pore system and the particle diameter is typically 0.01-0.3, preferably Is 0.05—0.2.
  • Pores with a size greater than 0.5 lm (eg, greater than 0.5 m) are often referred to as macropores.
  • the substrate may have pores having a size of 0.5 m or less (for example, 0.1 m or less), which reduces the diameter to 0.5 m or less (for example, 0.5 or less). Means that only the spheres that have can pass through. Pore sizes less than 0.5 xm (eg, less than 0.1 xm) are often referred to as micropores.
  • the substrate is in the form of irregular or spherical particles in the size range of 11-1000 am, for high-performance applications 5-50 mm, A size of 50-30 Om is preferred for preliminary (preparatory) purposes.
  • the substrate may also be in the form of a monolith having at least macropores as defined above.
  • An alternative geometry is the inner wall of a tube or the like.
  • a stimuli-responsive polymer as defined above is capable of binding to a substrate on its outer surface and on Z or its inner surface (macropore surface and Z or micropore surface).
  • the stimulus-responsive polymer may also be a part of the polymer constituting the base material itself.
  • the stimulus-responsive polymer may be bound to the substrate by physical adsorption and Z or covalent bonding, the latter being preferred.
  • the ligand is bound to the stimulus-responsive polymer before or after the stimulus-responsive polymer is bound to or incorporated into the substrate.
  • the binding to the stimuli-responsive polymer can be by affinity bonds or covalent bonds, preferably the latter.
  • Certain typical types of ligands bind, to varying degrees, to target substances by purely ionic (electrostatic) interactions. Alternatively, the binding involves more complex interactions, such as affinity binding (affinity adsorption).
  • the ligand is a positively charged or negatively charged substance (ion exchange; immobilized substances are primary amine, secondary amine, tertiary amine, quaternary ammonium, sulfonic acid salt, sulfate) Salt, phosphonate, phosphate, carboxy, etc.). More complex interactions are exemplified by ligands, which are affinity members in a pair.
  • the affinity component includes a substance involved in a catalytic reaction (for example, an enzyme, an enzyme substrate, a coenzyme, an auxiliary substrate (cossubstrates), etc.). Also included are components of cell-cell interactions and cell-cell surface interactions, as well as synthetic compounds of affinity components produced in vivo.
  • the term ligand also refers to complex biomolecules, such as oligopeptide or polypeptide structures (including proteins), oligonucleotide and polynucleotide structures (including nucleic acids), oligosaccharide structures, or It also includes complex biomolecules with polysaccharide structures, etc., and more or less complex organic molecules (eg, dyes) that bind to.
  • oligopeptide or polypeptide structures including proteins
  • oligonucleotide and polynucleotide structures including nucleic acids
  • oligosaccharide structures or It also includes complex biomolecules with polysaccharide structures, etc., and more or less complex organic molecules
  • BSA bovine serum albumin
  • CB Cibacron Blue molecule
  • the cock was closed again, and the polymerization tube containing the reaction solution was put in propanol to completely dissolve the sample in the polymerization tube.
  • This operation was repeated three times (freeze-thaw degassing method).
  • the fully degassed sample and the decompressed polymerization tube are placed in a shaking thermostat at 70 ° C, and subjected to a radical polymerization reaction for 2 hours to produce a copolymer having a lipoxyl group at one end. Synthesized.
  • the reaction solution was dropped into ice-cooled getyl ether, and the copolymer was reprecipitated to obtain a polymer.
  • the obtained polymer was collected by filtration, dried under reduced pressure at room temperature overnight, dissolved in a THF solvent, and purified again in getyl ether.
  • the obtained polymer was collected by filtration, applied to a gel filtration column to separate the desired polymer, lyophilized, dissolved in THF solvent, and reprecipitated again to obtain the obtained polymer.
  • the succinylated p (NI PAAm) -AmCB complex 1.08 was dissolved in 100 ml of 1,4-dioxane and immobilized on an aminopropyl silica gel at room temperature. After stirring for 24 hours, the new succinylated p (NI PAAm) -A 111 ⁇ 8 complex 1.0 ⁇ was dissolved again in 100 ml of 1,4-dioxane and reacted for 24 hours. This operation was repeated once more, and the collected product was thoroughly washed with an organic solvent such as dimethylformamide and methanol or a 66.7 mM phosphate buffer (containing 100 mM to 50 OmM NaCl). The desired filler was obtained. 1-1-e) Introduction to carrier (2)
  • the silica particles were collected by filtration, and similarly, 0.6 g of a copolymer having a lipoxyl group at one end, 30 mg of N-ethoxycarbonyl-12-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ), 30 mg of THF 1 After adding 0 Oml and performing N2 substitution operation for 30 minutes, stirring was performed at room temperature overnight. After completion of the stirring, the silica particles are collected by filtration, washed thoroughly with an organic solvent such as dimethylformamide or methanol, or 66.7 mM phosphate buffer (containing 100 mM to 50 OmM NaCl). ) (NI PAAm)-Ambilized silica column with immobilized AmCB complex.
  • EEDQ N-ethoxycarbonyl-12-ethoxy-1,2-dihydroquinoline
  • NI PAAm NI PAAm
  • Disperse 0.6 g of silica immobilized with AmCB complex in a packing solvent prepared at a volume ratio of methanol: 2-propanol: water 1: 1: 1 for column packing Put in the packer.
  • the first 25 m 1 performs Hama charged with 100 kg / cm 2, then was charged into a stainless column (4. 6X 30 mm) at 400 k gZcm 2.
  • BSA was dissolved in 66.7 mM phosphate buffer (pH 7.0) to adjust the concentration to 7.60 mg / ml.
  • Results Fig. 2 shows a typical chromatogram when 201 BSA solution (7.6 mg / m 1) was injected into p (NI PA Am) -AmC B column. After the injection, the temperature was reduced from 40 ° C to 2 ° C in 50 minutes. The liquid flow was stopped for 20 minutes to equilibrate the temperature to 2 ° C, and the flow rate was returned to the initial flow rate of 0.2 ml / min. 71. An elution peak was observed at 25 minutes, the brown color was shown by the micro BCA protein assay, and the molecular weight was the same as that of BSA from the result of gel filtration chromatography analysis. The peak was confirmed.
  • CB-poly (N-isopropylacrylamide) composites having different molecular weights shown in Table 1 below were immobilized on silica gel to synthesize three types of carriers.
  • the three types of synthesized carriers were packed in a stainless steel column to produce three types of columns.
  • calibration curves at 40 ° C and 10 ° C were measured using pullulans having different molecular weights (Fig. 4).
  • the change in elution volume due to temperature change suggested that the complex caused a structural change on the support surface due to temperature change.
  • BSA which is the target substance
  • the molecular weight of the complex composed of the stimulus-responsive polymer is affected by the molecular weight of the complex composed of the stimulus-responsive polymer, depending on the molecular weight of the composite polymer immobilized on the carrier surface, and It was suggested that the elution amount was different due to adsorption and temperature change. It was also shown that the amount of nonspecific adsorption on the carrier surface is affected by the molecular weight of the complex composed of the stimuli-responsive polymer.
  • the separation method using the separation material in the present invention has the following advantages.
  • the method of the present invention does not use harsh chemical conditions, and therefore has a higher recovery rate of useful biopolymers.
  • an interaction different from the originally intended interaction with the target molecule can be caused by a change in the interaction caused by the physical stimulus.
  • Regeneration of the filler using the separation material of the present invention can be performed more quickly than in the case of a conventional affinity carrier.
  • the stimulus-responsive polymer used in the present invention does not need to have an affinity for a ligand, various stimulus-responsive polymers can be used.
  • target substance separation and adsorption can be controlled by the molecular weight of the stimuli-responsive polymer used.
  • separation and adsorption can be performed based on the molecular weight of the target substance.

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Description

明 細 書
新規な分離材料および該分離材料を用いた分離方法 技術分野
本発明は、 水系で標的物質と特異的に相互作用する物質 （リガンド） の相互作 用力を、 物理的刺激による刺激応答性高分子の構造変化および極性変化により、 可逆的に変化させることが可能であり、 しかも該刺激応答性高分子は標的物質に 対して特異的に相互作用する物質に対して親和力のないことを特徴とし、 これを 含む分離材を用いて金属イオン、 医薬品、 生体成分などの標的物質を分離するこ とのできる充填材等の分離材料および該分離材料を用いた物質の新規な分離方法 に関する。 背景技術
生体成分、 医薬品の分離および精製に使われる、 イオン交換クロマトグラフィ 一、 逆相クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等は現在、 最 も有効で効率的な手段である。 さらに、 近年の著しいバイオテクノロジー技術の 進歩において、 組み換えタンパク質、 糖タンパク質等の生理活性物質の大量生産 が行われる中で、 これら標的物質の失活を防ぎ、 迅速でかつ効率的な分離精製手 法が求められている。
しかしながら、 上記に示したクロマトグラフィー的手法では標的物質となる生 体成分、 医薬品、 組み換えタンパク質および糖タンパク質等の溶出に際して、 溶 離液の塩濃度、 有機溶媒濃度、 p H濃度等を変化させて溶出させる手法が使われ ている。 しかしながら、 これらの手法は、 例えば p H濃度、 有機溶媒などは、 標 的物質に対して過酷な条件となることが多く、 回収率が低下することが知られて いる。 さらに、 標的物質の溶出の際に使用した、 塩、 有機溶媒、 p H条件等を最 終的には脱塩、 乾燥等の操作により取り除く操作を必要とするため、 標的物質の 分離および精製の後に、 これら塩、 有機溶媒、 p H等を除去する操作段階を経な ければならず、 このような操作段階が多いことから、 最終的な物質の活性および 回収率はしばしば低くなる。 標的物質溶出において、 塩、 有機溶媒、 pHなどのような化学的手法による溶 出は、 溶離液中に塩、 有機溶媒、 pHなどのような化学物質を使うことにより、 上記のような失活、 回収率の低下などの問題が起こる。 しかし、 このような化学 的手法による溶出ではなく熱、 光、 磁石などの物理的変化が標的物質の溶離に対 して影響を与えられるような環境をつくることができれば、 物理的手法による標 的物質の溶出が可能となり、 失活、 回収率の低下などの問題の解決になることが 期待できる。
最近、 イオン交換基に共有結合した刺激応答性高分子を含む分離材料に関する 記載が見られる （例えば、 特顧平 10— 14072号および対応する WO 99/ 61904公報を参照） 。
Ga l a e f e t a 1. (J. C r oma t og. A64 (19949 37 -43) は、 染料 （リガンド） が物理学的に吸着した温度応答性高分子を担 持する基材 （b a s e ma t r i ) に共有結合したクロマトグラフィー系に おいて乳酸デヒドロゲナーゼ （LDH) の温度による溶出を記述している。
Ho f man e t a 1. (WO 87 06152 ) は、 リガンドが温度応 答性高分子に結合した分離方法を記述している。 標的物質の結合と溶出は臨界溶 液温度の同じ側で起こる。
刺激応答性高分子を含むが、 温度応答性高分子に共有結合したリガンドを有し ていない分離材料に基づくクロマトグラフィーを記述した多くの刊行物もある。 G a w e h r e t a 1. (Ma c r omo l e c u l a r Chemi s t r y and Phy s i c s 193 (1992) 249— 256) は、 温度 応答性高分子で被覆した多孔質シリ力ビーズ上のゲルク口マトグラフィーを記述 している。 Ho s oya e t a 1. (Ana l. Ch em. 67 (1995 ) 1907— 1911) ； Y amamo t o e t a 1. (P r o c. 114 t h Na t i ona l Me e t i ng o f t he Ph a rmac eu t i c a 1 S o c i e t y o f J ap an, Tokyo (1994) 1 60 (19994年に東京で開催された第 114回日本薬学会総会講演要旨集 1 60) ； Kana z awa e t a 1. (薬学雑誌、 117 (10- 11) ( 1997) 817-824) ；金澤ら （Ana l. Ch em. 68 (1) (19 96) 100- 105) ；金澤ら （An a l . Ch em. 69 (5) (1997 ) 823-830) ；金澤ら （J. Ph a rm. B i ome d. Ana l . 1 5 (1997) 1 545- 1550) ；薬師寺ら （L angmu i r l 4 (16) (1998) 4657-466268) ；金澤ら （Tr nd s Ana l . B i o c h em. 1 7 (7) (1998) 435— 440) ；薬師寺ら （An a l . Ch em. 71 (6) (1999) 1 125- 1 130) ； Gr a c e & C o (EP 534016) ；岡野 （特開平 6— 108643 ) はいずれも、 生体 高分子の分離を目的とした熱応答性高分子により被覆されたマトリックス上で逆 相クロマトグラフィーを記述している。 当該マトリックスは多孔質であってもよ い。 利用された疎水性基は高分子自体に備わっているものである。 これらの先行 技術文献には、 重合の後で当該高分子に共有結合されたリガンドについての記載 はない。 また一方で、 大西らは （特開平 8— 103653、 特開平 9— 4983 0 ) 基材表面に導入した刺激応答性高分子と標的物質と親和性を有するリガンド 分子の共重合体が物理的刺激により、 高温側でこの共重合高分子が凝集した状態 で標的物質はリガンド分子と吸着し、 低温側で高分子が伸長したときに標的物質 がリガンド分子から脱着することを述べている。 しかしながら、 生体試料のよう な非常に複雑かつ各々の存在量 （ダイナミックレンジ） も異なる混合物から微量 の標的物質を分離精製する事は容易でない。 例えば、 標的物質と親和性を有する リガンド分子に対して複数の化合物が相互作用する場合には、 特開平 8— 103 653及び特開平 9—49830に記載の手法では、 分離精製は困難である。 ま た、 特開平 8— 103653及び特開平 9一 49830の実施例においては、 大 きさが約数^ mから数十 もある細胞が標的物質として記載されているのみで ある。 標的物質あるいは標的物質の他に標的物質と相互作用のある、 低分子有機 物質、 低分子ペプチド、 タンパク質などが存在する 2種類以上の混合物系から、 標的物質を分離精製する手法については示唆すらされていない。 発明の開示
そこで、 本発明者らは、 上記の問題に対して解決すべく、 物理的手法による標 的物質の溶出について検討および開発を行った。 その結果、 ポリ （N- ピルアクリルアミド） に標的物質と相互作用する分子 （リガンド） を結合させる ことで、 刺激応答性高分子とリガンドの複合体を合成し、 この複合体を用いて物 理的刺激によりリガンドと標的物質との相互作用が変化する分離材が得られるこ とを見いだした。 また、 本発明者らは、 物理的刺激による高分子の伸長、 凝集を 利用することで標的物質のリガンド分子への吸着およびリガンド分子の脱着のみ ならず、 同時に分子量分布の小さい高分子を利用することで、 その体積変化を効 果的に利用し標的物質の大きさの違いにより選別し分離、 精製することができる ことを見いだした。 すなわち、 高分子の分子量分布 (Mw/M n) を小さくする ことでこれらが達成できることを見出した。 本発明は、 かかる知見に基づき完成 したものである。
本発明は、 刺激応答性高分子と標的物質に対して特異的に相互作用する物質を 含み、 刺激応答材料高分子が物理的刺激により構造変化を起こすことで、 標的物 質に対して特異的に相互作用する物質の相互作用が化学的もしくは物理的環境の 変化を受け、 標的物質との相互作用力が物理的刺激により可逆的に変化する複合 化材料を含む分離材料であって、 刺激応答性高分子が標的物質に対して特異的に 相互作用する物質に対して親和力のないことを特徴とする分離材料に関する。 こ のことは、 標的物質がリガンドからも分離材料からも解放され、 それによつて標 的物質を複合体または分離材料から分離することができることを意味する。 さら には高分子の分子量分布の均一なものを使用することで、 同時に標的物質の大き さによっても選別できることを意味する。
また、 本発明は、 上記分離材料を用いることを特徴とする標的物質の分離方法 に関する。 具体的には、 本発明は、 （a ) 刺激応答性高分子と標的物質と相互作 用する分子 （リガンド） を含む複合体を化学修飾した上記分離材料 （クロマトグ ラフィー用充填剤を含む） の固定相に標的物質を結合させ；次いで （b ) 温度を、 好ましくは外部の物理的な手段 （e X t e r n a 1 m e a n s ) により、 連続 的に若しくは段階的に変化させることによりリガンドと標的物質との相互作用を 弱めることによって、 分離を行う方法に関する。 この場合、 移動相は液体であり、 例えば、 水溶液でも良い。
さらに、 本発明は、 上記分離材料を含む充填材 （例えば、 用充填材） に関する。
さらに加えて、 本発明は、 上記充填材を用いることを特徴とする標的物質の分 離方法に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 チバクロンブルーとポリ （N—イソプロピルアクリルアミド） との間 の親和力を示す差スぺクトルである。
図 2は、 p (N I PAAm) — AmCBカラムから、 CB分子に保持された B S A分子が温度変化により溶出する示すクロマトグラムである。
図 3は、 p (N I PAAm) カラムを用いたコントロールのクロマトグラムで ある。
図 4は、 分子量の異なる複合体を固定化した充填材の較正曲線である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の別の態様は液体から 1種若しくは 2種以上の標的物質を分離する方法 である。 この態様は次の各段階を含む。
(a) 標的物質を含有する液体サンプル （I) を分離媒体 (s e p a r a t i o n me d i urn) 分離材料 （クロマトグラフィー用充填剤を含む） と接触さ せ （当該分離媒体若しくは分離材料は、 標的物質と結合することができるリガン ドにより機能化されている、 当該接触は標的物質のリガンドに対する結合を許容 する条件下で行う。
(b) 当該キヤリヤーを少なくとも 1種の上記標的物質を含有していないリガン ド （I I) と、 標的物質が前記リガンドから液体 (I I) に放出されるような条 件下で接触させる。
段階 （a) と段階 （b) の間において、 液体サンプルは分離材料から分離する ことが好ましい。 この分離材料は段階 （b) の前に交替で洗浄してもよい。 段階 (b) の後で、 液体 (I I) を分離材料から分離してもよい。 もしそうすること が望ましいのであれば、 標的物質を液体 (I I) から取り出してもよい。
生体分子 （例えば、 ヌクレオチド構造 （核酸を含む） 、 ポリペプチド構造 （蛋 白質を含む） 、 炭水化物構造、 ステロイド構造等を有する生体分子） の形の標的 物質に関しては、 典型的に用いられるリガンドはこれまで水溶液であった。 本発 明のこの態様は次の点によつて特徴づけられる。
(i) 前記分離材料は、 本願明細書の他の箇所で定義したように、 刺激応答性高 分子を含み、 この高分子はリガンドにより、 好ましくは当該高分子が形成された 後でこのリガンドの共有結合によって、 機能化されており、 そして
(i i) 段階 （a) において、 および少なくとも標的物質のリガンドへの結合時 において、 刺激応答性高分子が標的物質のリガンドへの結合を高めるコンホメー シヨン （c on f o rma t i on) であるレベルノ強さで分離材料に刺激を与 え、 そして
(i i i) 段階 （b) において、 および少なくとも標的物質をリガンドから放出 する時点において、 刺激応答性高分子が標的物質のリガンドへの結合を妨げるコ ンホメ一シヨンであるレベル/強さで分離材料に刺激を与える。
刺激のレベルノ強さは、 使用される刺激応答性高分子に関する臨界的レベル Z 強さおよび各段階において適用される他の条件と正反対である。 このプロセスは、 段階 bの後に、 典型的には特別の洗浄ノ再生段階および平衡段階の後に、 段階 a が繰り返される場合は、 周期的に行うことができる。 この時、 高分子の分子量分 布が小さければ （i i) 段階目において標的物質の大きさによって選別される。 上記発明方法の様々な態様がバッチ方式またはク口マトグラフィ一方式で実施 することが可能である。 例えば、 クロマトグラフィー方式は、 栓流 （p l ug f 1 ow) (移動相） における種々の液体を分離材料の上を通過させ、 一方では、 この分離材料の上に個々の段階および使用される刺激応答性高分子のために適切 な刺激を与えることにより実施することが可能である。 この分離材料は、 多孔体 (po r ou s mono l i t h) または充填若しくは流体化した粒子であつ てもよい。 バッチ方式は乱流 （t u r bu l en t f l ow) および/または 液体と組合わせた懸濁粒子と特に関係する。
本発明の方法における物理的刺激とは、 例えば温度である。 温度変化により、 標的物質と相互作用する分子の分子認識能を変化させることは、 例えば熱応答性 高分子との複合化により達成される。 例えば、 複合体末端にアミノ基、 カルポキ シル基、 水酸基等を有するポリアルキルアミドあるいはその共重合体で化学修飾 したクロマトグラフィー充填材が挙げられる。 化学修飾した担体とは例えば、 シ リ力担体などが挙げられる。
使用される具体的な刺激応答性高分子に応じて、 他の刺激、 例えば、 光、 磁場、 電場、 振動等を適用してもよい。 刺激応答性高分子はしばしば 「機能性高分子 （ i n t e l l i gen t p o 1 ym e r s ) 」 とよまれる。
刺激応答性高分子は、 正しい強度若しくはレベルの正しい刺激 （臨界刺激強度 若しくは臨界刺激レベル） にさらされると、 その物理化学的特性が構造的かつ可 逆的に変化することによつて特徴付けられる。 その変化は顕著な疎水性から顕著 な親水性への転換またはその逆の転換であることもある。 必要とされる刺激の正 確なレベル Z強度および種類は高分子の構造に依存し、 しばしば他の条件 （溶媒、 例えば塩類などの溶質、 等） にも依存する特性がある。 最もよく知られており、 力つ最も利用されているこの種の高分子は熱に応答する （熱応答性高分子または 温度応答性高分子） 。 温度応答性高分子は、 顕著な親水性から顕著な疎水性に転 換するかまたはその逆に転換する鋭い相転移温度あるいは温度限界 （ t emp e r a t u r e l imi t) を有することによって認識される。 溶液中における 温度応答性高分子に関して、 コンフオメーション /物理化学的特性の変化はいわ ゆる臨界溶液温度 (c r i t i c a l s o l u t i on t emp e r a t u r e : CST) において起こる。
水溶液系における温度応答性高分子に関しては、 下限臨界温度 （LCST) ま たは上限臨界温度 (UCST) がある。 LCSTを有する高分子に闋しては、 温 度が L C S Tより低い温度から L C S Tを通過しているときに、 親水性のコンフ オメーションから疎水性のコンフオメーシヨンに変化する。 US CTを有する高 分子に関しては、 温度が U C S Tより低い温度から U C S Tを通過しているとき に、 その変化は正反対になる。 1^〇3丁ぉょぴ11。3丁の正確な値は当該高分子 および適用される他の条件 （溶媒、 溶質、 等） に依存する。
上述のように、 温度応答性高分子が用いられる場合の本発明の特徴の 1つは、 リガンドへの結合およびリガンドからの放出は適用される臨界溶液温度の反対側 で行われるということである。 温度応答性高分子は、 標的物質および共有結合しているリガンドとの間の親和 力に比較して、 標的物質に対する親和力が小さいことが好ましい。 リガンドおよ び熱応答性高分子との間には大きな親和力がないことが好ましい。
温度応答性高分子の基本構成単位としては、 例えば、 （メタ） N—イソプロピ ルアクリルアミド、 (メタ） N—ァクリロイルピペリジン、 (メタ） N—プロピ ルアクリルアミド、 （メタ） N、 N—ジェチルアクリルアミド、 （メタ） N—シ クロプロピルアクリルアミド、 （メタ） N—ァクリロイルピロリジン、 （メタ） N、 N—ェチルメチルアクリルアミド、 （メタ） N—ェチルアクリルアミドをは じめとする （メタ） N—アルキルアクリルアミドのホモポリマーとこれらの共重 合体、 また標的物質と相互作用する分子と化学的に複合化させるためにカルポキ シル基、 アミノ基、 ヒドロキシスクシイミド基、 チオール基、 イミノ基、 ェポキ シ基等の官能基を含むモノマーとの共重合体が挙げられる。
本発明の方法において使用するポリアルキルアクリルアミドとしては、 例えば ポリ— （N—イソプロピルアクリルアミド） 一色素複合体が挙げられる。
標的物質および標的物質と相互作用する分子とは、 アミノ酸、 糖、 核酸などか らなる生体成分や分子量が 1 0 0 0以下の有機化合物などが挙げられる。 刺激応 答性高分子と化学的に複合化させるリガンドの量は任意に制御を行うことができ るが、 複合体中の構成中の 0 . 1 %〜5 0 %が望ましい。 また、 標的物質と相互 作用する分子の複合化する量により、 刺激応答性高分子の物理的、 化学的性質を 変化させることができる。 例えばポリ一 （N—イソプロピルアクリルアミド） の 場合、 ホモポリマーでは 3 2 °C付近に下限臨界温度を有するが、 標的物質と相互 作用する分子の複合化量によりこれを制御できる。 この時、 基材に固定化する高 分子の分子量分布 （Mw/M n) は 3以下であることが望ましい。 3以上では分 子量の異なる高分子の存在により標的物質の分子量あるいは大きさの違いによつ て分別するのは容易ではない。 分離材料 （例えば、 クロマトグラフィー用充填材）
本発明において使用されるべき分離材料は有機および/または無機材料に基づ くものでよい基材 （b a s e m a t r i ) (担体 （ c a r r i e r ) ) を含 む。 使用される液体が水性である場合、 基材は親水性であることが好ましい。 こ れは特に、 上述の種類の生体高分子である標的物質に適用される。
基材は高分子であるのが好ましく、 この高分子は水に不溶性でありかつ多かれ 少なかれ膨張性を示すものであることが好ましい。 親水性になるように修飾され た疎水性高分子はこの定義に含まれる。 好適な高分子は、 ポリヒドロキシ高分子 (例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロース、 でん粉、 プルラン等のよう な多糖類に基づくポリヒドロキシ高分子） および合成高分子 （例えば、 ポリアク リル酸アミド、 ポリメタクリル酸アミド、 ポリ （ヒドロキシアルキルビニルェ一 テル） 、 ポリ （ヒドロキシアルキルァクリレート） およびポリメタクリレート （ 例えば、 ポリグリシジルメタクリレート） 、 ポリビエルアルコール並びにスチレ ンおよびジビ'ニルベンゼンに基づく高分子） 、 および前記の高分子に対応する 2 種若しくは 3種以上のモノマーが含まれている共重合体である。 水に溶解する高 分子を、 例えば、 架橋により、 および吸着若しくは共有結合により不溶性物質に 結合させることにより、 不溶性に修飾してもよい。 親水性基は、 O Hに転換しう る基を有するモノマーの重合化により、 または最終高分子の親水性化 （例えば、 親水性高分子のような適当な化合物の吸着） により疎水性高分子上に （例えば、 モノビニルおよびジビニルベンゼンの共重合体上に） 導入することができる。 基材において使用されるべき適当な無機材料は、 シリカ、 酸化ジルコニウム、 グラフアイト、 酸化タンタル等である。
好ましい基材は、 シラン基、 エステル基、 アミド基およびシリカの中にそうい うものとして存在する基などのような加水分解に対して不安定な基を欠いたもの である。
基材は多孔質であっても非多孔質であってもよい。 このことは、 基材が十分に 若しくは部分的に透過性 （多孔質） であっても除去されるべき化合物に対して完 全に非透過性 （非多孔質） であってもよいことを意味する。
細孔 （p o r e ) は 0 . l m以上 （例えば、 0 . 以上） の大きさを有 していてもよく、 このことは直径が 0 . 1 m以上の球体 （例えば、 直径が 0 . 5 m以上の球体） が通過することができることを意味する。 適用される液体は この種の細孔系 （貫通性） を貫流することができるものであってもよい。 支持基 材 （s u p p o r t ma t r i x) が分離材料に充填されたビーズの形である 場合、 貫通性細孔系の細孔径と粒子の直径の間の比率は典型的には 0. 01— 0 . 3、 好ましくは 0. 05— 0. 2である。 大きさが 0. l m以上 （例えば、 0. 5 m以上） の細孔はしばしばマクロポア （ma c r o p o r e) と呼ばれ る。
基材は 0. 5 m以下 （例えば、 0. 1 m以下） の大きさを有する細孔を有 していてもよく、 このことは 0. 5 m以下 （例えば、 0. 以下） の直径 を有する球体だけが通過することができることを意味する。 大きさが 0. 5 xm 以下 （例えば、 0. l xm以下） の細孔はしばしばミクロポア （mi c r o p o r e) と呼ばれる。
本発明の特に興味ある実施態様において、 基材は大きさが 1一 1000 amの 範囲の不ぞろいの粒子若しくは球状粒子の形態であり、 高性能な利用を目的とす るには 5— 50 ΠΙ、 予備的な （準備段階の） 目的には 50— 30 O mの大き さが好ましい。
また、 基材は上で定義した通りの少なくともマクロポアを有するモノリスの形 態であってもよい。 代わりの幾何学的形態は管の内壁等である。
上で定義した通りの刺激応答性高分子は、 基材にその外表面上でおよび Zまた はその内表面上で結合することが可能である （マクロポア表面および Zまたはミ クロポア表面） 。 当該刺激応答性高分子はまた、 基材それ自体を構成する高分子 の一部であつてもよい。 刺激応答性高分子は物理的吸着および Zまたは共有結合 によって基材に結合していてもよく、 後者が好ましい。 リガンド
リガンドは、 刺激応答性高分子が基材に結合若しくは基材に組み込まれた前若 しくは後に当該高分子に結合される。 刺激応答性高分子への結合は親和力結合 （ a f f i n i t y bond s) 若しくは共有結合によ.り可能であり、 好ましく は後者である。 ある典型的な種類のリガンドは、 程度の差はあれ、 純然たるィォ ン性 （静電性） の相互作用によって標的物質に結合する。 あるいは、 その結合は 親和力結合 （親和力吸着） のようなもっと複雑な相互作用を含む。 イオン性の相 互作用に関しては、 リガンドは正に帯電した若しくは負に帯電した物質 （イオン 交換；固定化された物質は 1級ァミン、 2級ァミン、 3級ァミン、 4級アンモニ ゥム、 スルホン酸塩、 硫酸塩、 ホスホン酸塩、 リン酸塩、 カルポキシ等の基の中 力、ら選択される） を含む。 より複雑な相互作用は 1対のものにおける親和力構成 物質 （a f f i n i t y me mb e r s ) であるリガンドによって例証される。
(a) 抗体および抗原/ハプテン。
(b) レクチンおよび炭水化物構造。
( c ) I g G結合夕ンパク質および I g G。
(d) 高分子キレート化剤 （p o l ime r i c c h e l a t o r s) および キレー卜。
(e) 相補的な核酸。
また、 親和力構成物質は触媒反応 （例えば、 酵素、 酵素基質、 補酵素、 補助基 質 （c o s ub s t r a t e s) 等） に関与している物質を含む。 細胞一細胞相 互作用および細胞一細胞表面相互作用の構成物質並びに生体内で産生された親和 力構成物質の合成物もまた含まれる。 リガンドという用語はまた、 親和力によつ て複雑な生体分子、 例えば、 オリゴペプチド構造若しくはポリペプチド構造 （夕 ンパク質を含む） 、 オリゴヌクレオチド構造およびポリヌクレオチド構造 （核酸 を含む） 、 オリゴ糖構造若しくは多糖構造等を有する複雑な生体分子、 に結合す る多かれ少なかれ複雑な有機分子 （例えば、 染料） をも含む。 実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれによって 何ら限定されるものではない。
実施例 1
9. 95 Mの濃度となるように、 チパクロンブルーを 67mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) に溶解した （A液） 。 10. 5mMの濃度となるように、 ポリ （ N—イソプロピルアクリルアミド） （数平均分子量 4700) を 67mMリン酸 緩衝液 （pH7. 0) に溶解した （B液） 。 A液 2mLに B液 5 Lを加えた溶 液 （C液） に対する A液の差スペクトルを求め、 チバクロンブルーとポリ （N— イソプロピルアクリルアミド） との間に親和力があるかどうか調べた。 図 1にそ の差スペクトルを示す。 400 nmから 800 nmの間において、 C液と A液に スペクトルの差は見られず、 チバクロンブルーとポリ （N—イソプロピルァクリ ルアミド） との間に親和力はないことが明らかになった。 実施例 2
標的物質として牛血清アルブミン （BSA) を用いて、 標的物質と相互作用す る分子としてチバクロンブルー分子 （CB) を熱応答性高分子と複合化させて、 温度刺激による標的物質との相互作用の変化をクロマトグラム的手法により評価 を行い、 温度変化により相互作用が変化し、 BS Aが CB分子から解離すること を確認した。
1. ポリマーの合成
1一 1一 a) 力ルポキシル基末端を有するポリ （I PAAm—c o— AS I (N —ァクリキシスクシイミド） ） 合成
N—イソプロピルアクリルアミド 15 g、 官能基を有するモノマーとして N— ァクリロキシスクシイミド 1. 24g、 連鎖移動剤としてメルカプトプロピオン 酸 （MPA) 0. 28 g、 重合開始剤として 2， 2—ァゾビス （イソプチルニト リル） （AI BN) 82mg、 溶媒としてテトラヒドロフラン （THF) 500 mlを重合管にいれ、 コックを閉じた状態で重合管を液体窒素中にいれ完全に凍 結させ、 次にコックを開いて真空ポンプを用いて脱気した。 次にコックを再び閉 じてプロパノール中に反応溶液の入った重合管を入れて、 重合管内のサンプルを 完全に溶解させた。 この操作を 3回繰り返した （凍結融解脱気法） 。 このように、 十分脱気したサンプルで減圧状態になっている重合管を 7 0°Cの振とう恒温漕 に入れ、 2時間、 ラジカル重合反応させて片末端に力ルポキシル基を持つコポリ マーを合成した。 反応後、 反応溶液を氷冷したジェチルエーテル中に滴下し、 コ ポリマーを再沈殿させてポリマーを得た。 得られたポリマ一を濾取し、 常温一晩 減圧乾燥を行い、 これを THF溶媒に溶かし再びジェチルエーテル中で精製を行 つた。 得られたポリマーを濾取し、 ゲル濾過カラムにかけて目的のポリマ一を分 取し、 凍結乾燥後、 THF溶媒に溶かし、 再び再沈殿を行い、 得られたポリマー を濾取し、 常温で一晩減圧乾燥を行い目的のポリマ一を得た。
1一 1一 b) カルボキシル基末端を有するポリ （I PAAm— c o— AS I (N ーァクリロキシスクシイミド） ） へのァミノへキシルチバクロンブルー （AmC B) の複合化
合成したコポリマー 5. 0 gとァミノへキシルチバクロンブルー 0. 43 gを ピリジン 100 m 1中に溶解させて室温で 24時間撹拌を行い、 ィソプロピルァ ミン 2mlを添加し、 さらに 24時間撹拌を行いァミノへキシルチバクロンブル ーをコポリマーと複合化させた。 撹拌終了後、 ロータリーエバポレーターで溶媒 を除去し、 凍結乾燥により複合体を乾燥させた。 乾燥後、 これを精製水に溶解さ せてゲルろ過法により目的の複合体を分取し、 これを凍結乾燥させて目的のポリ マーを得た。 GPCにより求めた複合体の分子量分布 （Mw/Mn) はそれぞれ、 1. 77〜2. 14以内であった。
1一 1一 c) 力ルポキシル基末端をポリ （I PAAm— c o—AS I (N—ァク リキシスクシイミド） ） ーァミノへキシルチバクロンブルー複合体 （p (N I P AAm-AmCB) のカルボキシル基末端の活性エステル （スクシニル） 化 合成したコポリマ一 3 gに対して N, N—ジシクロへキシルカルポジイミド 0 . 5 g、 N—ヒドロキシスクシイミド 0. 5 gを 30 Omlのナス型フラスコに 入れ THF 100mlに溶解させ、 室温で 48時間撹拌を行った。 撹拌中に副生 成物としてジシクロへキシル尿素が析出するので、 これをろ過により取り除き、 最後にジェチルエーテル中で再沈殿させ、 片末端をスクシニル化した p (NI P A Am) — AmC B複合体を得た。
1— 1— d) 担体への導入 （1)
スクシニル化した p (N I PAAm) — AmCB複合体 1. 08を1， 4ージ ォキサン 100mlに溶解させ、 室温でァミノプロピルシリカゲル上に固定化し た。 24時間の撹拌の後に、 あらたなスクシ二ル化した p (N I PAAm) —A 111〇8複合体1. 0 ^を再び1, 4一ジォキサン 100m 1に溶かし 24時間反 応させた。 この操作をもう一度繰り返し、 最後に濾取したものを、 ジメチルホル ムアミド、 メ夕ノ一ルなどの有機溶媒や 66. 7 mMリン酸緩衝液 （ 100 mM 〜50 OmM NaC 1を含む） で十分洗浄し、 目的とする充填材を得た。 1-1-e) 担体への導入 （2)
片末端をカルポキシル基ィ匕したコポリマー 0. 65 gに対して、 N—エトシキ カルポニル一2—エトキシ— 1, 2—ジヒドロキノリン （EEDQ) 30mg、 ァミノプロピルシリカ 0. 8 g、 THF 10 Om 1を加え、 30分の N2置換の 操作の後に室温で一晩、 撹拌を行った。 撹拌終了後、 シリカ粒子を濾取し、 同様 に、 片末端を力ルポキシル基化したコポリマー 0. 6 g、 N—エトシキカルボ二 ル一2—エトキシー 1， 2—ジヒドロキノリン （EEDQ) 30mg、 THF 1 0 Omlを加え、 30分の N 2置換の操作の後に室温で一晩、 撹拌を行った。 撹 拌終了後、 シリカ粒子を濾取し、 ジメチルホルムアミド、 メタノールなどの有機 溶媒や 66. 7mMリン酸緩衝液 （100mM〜50 OmM NaClを含む） で十分に洗浄し、 これを！） （NI PAAm) — AmCB複合体を固定化したシリ 力カラム充填剤とした。
2. カラム充填
p (N I PAAm) — AmC B複合体を固定化したシリカ 0. 6 gをメタノー ル： 2—プロパノール：水 =1 ： 1 ： 1の体積比で調製した充填溶媒に分散させ て、 カラム充填用パッカーに入れた。 最初の 25m 1は 100 k g/cm2で充 填を行い、 その後は 400 k gZcm2でステンレスカラム （4. 6X 30 mm ) に充填を行った。
3. 試料調製
3— 1) 牛血清アルブミン （BSA) サンプルの調製
BSAを 66. 7mMリン酸緩衝液 （pH7. 0) に溶かし、 濃度を 7. 60 mg/m 1に調製した。
4. HP LC測定条件
カラム： p (N I PAAm) 一 AmCB
移動相： 66. 7mMリン緩衝液 （pH7. 0)
流速： 0. 2m 1 /m i n
温度条件： 40°C〜2で
測定波長： 280 nm
5. 結果 図 2に p (N I PA Am) 一 AmC Bカラムに B S A溶液 （ 7. 6mg/m 1 ) を 20 1インジェクションしたときの典型的なクロマトグラムを示す。 イン ジェクシヨン後、 50分に 40°Cから 2°Cへ温度を低下させた。 また、 温度が 2 °Cに平衡化させるために 20 分間は送液を停止した後、 初期の流速 0. 2ml /m i n にもどした。 71. 25分に溶出ピークは見られ、 マイクロ BC A夕 ンパク質アツセィ法により褐色を示し、 ゲルろ過クロマトグラフィーの分析の結 果から分子量が BS Aのそれと同じものを示すことから BS Aの溶出ピークであ ることを確認した。 また、 p (N I PAAm) のみを固定化したシリカカラムを 用いて、 p (N I PAAm) — AmCBカラムを用いたときと同様な実験を行つ たが、 図 3に示すように BS Aは吸着せず、 素通りした。 また、 70. 9分のピ ークはマイクロ BCAタンパク質アツセィ法により BS Aではないことを確認し、 また B S Aを含まないコントロールのサンプルの場合にも認められたことから、 不純物によるピークと思われた。 これらの結果から温度刺激による標的物質と標 的物質と相互作用する分子との相互作用が温度のような物理的刺激により制御で きることが確認された。 実施例 3
実施例 2に記載されている手法を用いて、 下記表 1に示す分子量の異なる C B 一ポリ （N—イソプロピルアクリルアミド） 複合体をシリカゲル上に固定化を行 い 3種類の担体を合成した。 合成した 3種類の担体をステンレスカラムに充填し て、 3種類のカラムを作製した。 この 3種類のカラムを用いて、 40°Cおよび 1 0°Cにおける較正曲線を、 分子量の異なるプルランを用いて、 測定を行った （図 4) 。 温度変化により溶出容量が変化することから、 温度変化により担体表面上 で複合体が構造変化を起こすことが示唆された。 また、 固定化する分子量が異な ることで、 それぞれ異なる較正曲線が得られたことから、 刺激応答性高分子の分 子量の大きさにより、 それぞれの担体において、 分別されるプルランがその分子 量によって異なることがわかった。 この結果から、 担体表面上では固定化した剌 激応答性高分子からなる複合体の分子量の大きさにより、 担体表面上で、 標的物 質の分子量の分別および吸着に影響を与えることが示唆された。 また、 標的物質 の分子量の大きさによってその分別および吸着への影響が異なることを示した。 なお、 この時の溶出条件は次の通りであった。
流速： 0. 2m 1 Zm i n
温度： 10°Cおよび 40°C
カラムサイズ： 4. 6 X 30mm
溶離液： 66. 7mMリン酸緩衝液 （pH7. 0)
サンプル：プルラン
続いてこの 3種類のカラムを用いて、 BS Aの温度変化による溶出実験を行つ た （表 1) 。 また、 同時に固定化した複合体高分子量についての固定化量 （CH N増加量） を元素分析 （CHN分析） により求めた。 また、 複合体に含まれる C B量を、 固定化する前の活性エステル量から推測した値を示した。 固定化した複 合体高分子の分子量が小さいものほど、 温度変化後の溶出容量が大きかった。 こ の結果から、 担体表面上で固定化した複合体高分子の分子量の大きさにより、 標 的物質となる B S Aが刺激応答性高分子からなる複合体の分子量の大きさによる 影響を受け、 標的物質の吸着および温度変化による溶出量が異なることが示唆さ れた。 また、 担体表面の非特異的吸着量にも刺激応答性高分子からなる複合体の 分子量の大きさによる影響を与えることが示された。
表 数平均分子量（Mn)(Mw/Mn) 2,800 (1.83) 7,200 (2.14) 16,000 (1.77) 活性エステル量 0.91 1.50 1.39
CHN増加量 （％) 5.32 5.34 5.49 83八溶出量 （40で〜210 3.38 g 0.32 0.002 g 非特異的吸着量 0.72 g 8.06 g 6.37 産業上の利用の可能性
本発明における分離材料による分離方法は、 下記の利点を有する。
1 ) 従来のクロマトグラフィーで用いられている化学的な溶出方法に比べ、 本発 明の方法は過酷な化学的条件を用いないので有用な生体高分子の回収率が高い。
2 ) また、 本発明によれば、 物理的刺激による相互作用の変化により、 本来起こ るべき目的分子との相互作用とは異なる相互作用を起こすことができる。
3 ) 従来のァフィ二ティー担体ではカラムから溶出したサンプルに対して脱塩操 作、 P H調整などの操作を必要としたが、 本発明の分離材料においてはこのよう な操作を必要としない。
4 ) 本発明の分離材料を用いた充填剤の再生は、 従来のァフィ二ティー担体と比 ベて速やかに行うことができる。
5 ) 本発明において使用する刺激応答性高分子はリガンドに対して親和性を持つ 必要がないので、 種々の刺激応答性高分子を用いることが可能である。
6 ) 本発明によれば、 使用した刺激応答性高分子の分子量により標的物質の分別、 吸着を制御できる。
7 ) 本発明によれば、 標的物質の分子量に基づき分別、 吸着を行うことができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 刺激応答性高分子と標的物質に対して特異的に相互作用する物質を含み、 刺激応答材料高分子が物理的刺激により構造変化を起こすことで、 標的物質に対 して特異的に相互作用する物質の相互作用が化学的もしくは物理的環境の変化を 受け、 標的物質との相互作用力が物理的刺激により可逆的に変化する複合化材料 を含む分離材料であって、 刺激応答性高分子が標的物質に対して特異的に相互作 用する物質に対して親和力のないことを特徴とする分離材料。
2 . 標的物質に対して特異的に相互作用する物質に対して親和力のない刺激応 答性高分子の分子量の大きさを利用して、 刺激応答性高分子の大きさにより、 標 的物質をその分子量の大きさで分別および吸着でき、 物理的刺激により溶出する ことができる刺激応答性高分子を利用する、 請求項 1記載の分離材料。
3 . 標的物質の吸着量および溶出量を変化させることができる、 請求項 1また は 2記載の分離材料。
4. 標的物質の吸着量および溶出量を刺激応答性高分子を含む複合体の分子量 の大きさにより制御する、 請求項 3記載の分離材料。
5 . 物理的刺激が温度変化である、 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の分離材 料。
6 . 刺激応答性高分子が末端にアミノ基、 カルボキシル基等の官能基を有する ポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体である、 請求項 1〜5のいずれ か 1項記載の分離材料。
7 . 請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の分離材料を用いることを特徴とする標 的物質の分離方法。
8 . 請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の分離材料を含む充填材。
9 . 充填材が、 担体表面に刺激応答性高分子と標的物質に対して特異的に相互 作用する物質との複合材料で化学修飾したクロマトグラフィー用充填材である、 請求項 8記載の充填材。
1 0 . 請求項 8または 9記載の充填材を用いることを特徴とする標的物質の分 離方法。
11. 移動相が水である、 請求項 10記載の分離方法。
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