WO2001073086A2 - Verfahren zur genetischen modifizierung einer pflanze - Google Patents

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WO2001073086A2
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Wolf-Bernd Frommer
John M. Ward
Andreas Weise
Laurence Barker
Waltraud Schulze
Christina KÜHN
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Frommer Wolf Bernd
Ward John M
Andreas Weise
Laurence Barker
Waltraud Schulze
Kuehn Christina
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid molecules which encode a saccharide, in particular sucrose transporter, vectors and host cells which contain these nucleic acid molecules, and to fungi, plant cells and plants transformed with the nucleic acid described and vectors transformed.
  • the invention further relates to methods for modifying the transport of saccharide, in particular sucrose, in plants.
  • Higher plants have heterotrophic tissues that are supplied with carbohydrates by autotrophic tissues.
  • the main form of transport of the carbohydrates is sucrose and its derivatives.
  • the heterotrophic tissues are supplied via the phloem, which the organs, which photoassimilates, ie carbohydrates, provide in excess and which can export them, so-called source organs with organs who have to import photoassimilates in their net balance, so-called sink organs.
  • Source organs are, for example, adult leaves and germinating seeds.
  • Sink organs are, for example, young leaves, young tubers, roots, fruits, flowers and other reproductive organs.
  • the phloem is made up of various cell types such as sieve elements, escort cells, parenchyma cells and bundles vaginal cells built up.
  • the translocation current of the photoassimilates moves from places of export to places of import.
  • Both the loading of the phloem with photoassimilations and the unloading can in principle be carried out in an apoplastic and symplastic way, with a large number of factors such as osmotic conditions, concentration gradients, plasma membranes to be passed, etc. influencing the loading and unloading.
  • Both the loading of the phloem and the supply of the sink organs with photoassimilates are accordingly highly complex processes, which obviously involve a large number of closely linked and regulated transport steps. These transport steps take place with the participation of different plasma membrane proteins, in particular transport proteins. So z. B.
  • sucrose transporter sucrose transporter
  • the SUT genes encode hydrophobic proteins that have 12 transmembrane domains and can be clearly distinguished from the members of the hexose transporter family. London et al. (The Plant Cell (1999) 11, 707-726) suggests that the members of the SUT family have a high affinity for sucrose. It is assumed that the sucrose transporter SUT1 from Lycopersicon esculentum, Nicotiana tabacum and Solanum tuberosu is responsible for long-distance transport in the phloem (Riesmeier et al., Plant Cell (1993) 5, 1591-1598).
  • WO94 / 00574 discloses the DNA and amino acid sequences of SUT1 from spinach and potato. This one in The sucrose transporter located in the plasma membrane of the sieve elements of the phloem is an essential component for the long-distance transport of sucrose in the phloem, as can be seen, for example, in antisense inhibition experiments in transgenic potato and tobacco plants (Riesmeier et al., EMBO J (1994) 13, 1-7) (Lalonde et al., Loc. Cit.). The expression pattern of SUT1, in particular the expression in the entire phloem, proves that SUT1 is responsible for maintaining the concentration gradient of sucrose between loading and unloading zones (leaves, respectively sink organs).
  • SUT1 therefore appears to be less responsible for the (initial) loading of the phloem in source organs than for the return of sucrose that has migrated from the phloem. This function is further confirmed by the relatively high affinity and the associated low transport capacity. SUT1 can therefore import very small amounts of sucrose from the apoplast into the phloem (back) and thus keeps the apoplastic concentrations low. Since he works at these low concentrations, he cannot be responsible for high transport rates.
  • sucrose transporters in addition to the sucrose transporters, other functional elements are involved in the sucrose transport, for example regulator and sensor elements.
  • regulator and sensor elements the extraordinary complexity of the sucrose transport system has so far not allowed a specific assignment of structures to functions and a prediction of their interactions in a manner that makes it possible to carry out targeted interventions in the saccharide, in particular sucrose transport with the aim of certain properties to obtain improved plants. This can be seen most clearly from the fact that an overexpression of SUT1 did not result in any changes in the allocation of assimilates, but only showed an influence on the flowering behavior (US 6,025,544; P 44 39 748.8).
  • the technical problem on which the present invention is based is therefore methods and means for the production of a genetic engineering provide modified plant that allow targeted intervention in the saccharide, especially sucrose transport streams of the plant such that a plant with improved properties, e.g. B. higher sugar levels in sink organs, especially in the harvesting organs can be generated.
  • the invention solves this problem by providing a method for modifying the saccharide flux and / or the saccharide concentration, in particular sucrose flux and / or concentration in tissues of a plant, according to which a modified activity of a saccharide transporter in a plant with low saccharide affinity but high saccharide transport capacity.
  • the teaching according to the invention provides means and methods for specifically influencing the saccharide flux and the saccharide concentration in the various tissues of the plant by modifying the activity of a saccharide transporter with low saccharide affinity and high saccharide transport capacity to modify ie, wherein • this method produced a modified plant in the course.
  • the present invention provides for the first time an HCS system, that is to say a sucrose transport system with a high transport capacity for sucrose but low affinity for sucrose, which is expressed, in particular in microveins of a plant.
  • a modification of the activity of the sacchar ridtransports is understood to mean a change in the normally present activity compared to the wild-type activity, eg. B. Complete suppression, reduction, or increased activity.
  • This increase in activity may be due to a change in the activity of the protein itself.
  • B. by post-transcriptional modifications such as phosphorylations or dephosphorylations.
  • it can also be due to a changed expression rate of the coding gene, a changed stability or translation rate of the mRNA formed or the like, ie also to a changed amount of saccharide transporters present in a tissue.
  • the activity of the saccharide transporter can also be modified by the activity of an element which controls or regulates the activity of the saccharide transporter, for example a sensor or regulator protein.
  • a saccharide means sucrose and a saccharide transporter means a sucrose transporter, in particular, unless stated otherwise, SUT4 (sucrose transporter 4), that is to say a transporter with low affinity for sucrose and a high transport capacity for sucrose.
  • SUT4 sucrose transporter 4
  • Low or low affinity in the sense of the present invention is an affinity which is below the SUT1 affinity, for example 50%, preferably 80%, 100%, 200%, 300% or 400% below that of SUT1, for example an affinity K m > 2.7 mM, preferably> 4 mM,> 6 mM,> 8 mM,> 10 mM,> 15 mM,> 20 mM and preferably> 25, in particular 26 mM.
  • High transport capacity in the sense of the present invention is a transport capacity which is above the transport capacity of SUT1, for example 50%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500% above that of SUT1.
  • a transport capacity V m ⁇ of> 0.7, in particular>1,>1.5,>2,>3,> 3.5 in particular 3.6 n ol cm -2 in ⁇ 1 is preferred.
  • the invention is based on the knowledge and the teaching derived therefrom, using technical, in particular genetic engineering, means to influence an activity of the saccharide transporter mentioned, which may only be endogenous, or to introduce such activity into a plant.
  • sink organs is understood to mean organs or tissues of plants which have to import photoassimilates in their net balance.
  • plant organs or tissues are young leaves, tubers, fruits, roots, flowers, reproductive organs, wood, marrow tissue, buds, seeds, beets etc.
  • source organ is understood to mean organs or tissues of plants which have an excess of photoassimilates in their net balance and can export them.
  • Source organs are e.g. B. adult leaves and germinating seeds, tubers and onions.
  • an increased expression rate of the saccharide transporter modified according to the invention or an increased transport rate, for example in transfer cells and / or sieve elements considerably increases the saccharide, in particular sucrose, loading of the phloem, in particular under high light intensity or CO 2 concentration, as a result of which plants with harvesting organs which have an increased sucrose content can advantageously be obtained.
  • the invention thus solves the problem in particular by providing a method for modifying the saccharide flux and / or the saccharide concentration in the tissues of a plant, the activity of a saccharide transporter being modified with low affinity for the saccharide and high transport capacity for the saccharide by transforming at least one plant cell with at least one vector which contains nucleotide sequences which enable the modification of the saccharide transporter, and the plant cell which contains these nucleotide sequences in a stably integrated manner is regenerated into a plant in whose tissue a modified saccharide flux and / or a modified one is regenerated Saccharide concentration, in each case in comparison with a wild-type plant, that is to say a plant not transformed according to the invention, is present.
  • the invention thus provides the teaching of specifically modifying a saccharide transporter with a high transport capacity for the saccharide and with a low affinity for the saccharide, this being done by means of genetic engineering manipulation of the plant.
  • this can be done by transforming a plant cell with at least one vector containing the coding nucleotide sequences of the saccharide transporter, which preferably allows over-expression of the saccharide transporter in transformed tissue after stable integration of the nucleotide sequences into the genome of the transformed cell.
  • Plants produced by the procedure according to the invention have e.g. B. a higher carbohydrate content in sink organs, such as roots, fruits, bulbs, flowers or seeds.
  • sink organs such as roots, fruits, bulbs, flowers or seeds.
  • there is a higher carbohydrate content especially in harvesting organs of the plant, which are often sinking organs.
  • an increased oil content can be found in the harvesting organs.
  • the observation that the number of harvesting organs per plant can be increased and their weight can be increased is particularly advantageous.
  • the overexpression of the saccharide transporter of the type mentioned in source organs provided according to the invention can advantageously also result in the flowering time of the transformed plant being changed. Since the transport of sugar in the phloem is often reciprocally coupled with the amino acid transport in the phloem, the increase in the saccharide content in the phloem provided according to the invention can cause the undesired amino acid content in sink organs, e.g. B. potato tubers or tap roots of the sugar beet are lowered. Finally, the procedure according to the invention enables the glycosylation rate to be endogenous to substances present in plants or also to exogenously administered substances such as xenobiotics, eg B. herbicides or pesticides, to increase their mobility.
  • xenobiotics eg B. herbicides or pesticides
  • the above-described overexpression in source organs is achieved by cloning SUT4-encoding nucleotide sequences into a vector under the control of source-specific promoters, that is to say in particular leaf-specific and / or guide cell-specific promoters at least one plant cell is transformed and, preferably stably, integrated into the genome of the plant cell.
  • constitutively expressing promoters such as the 35SCaMV promoter, the control cell-specific rolC promoter from Agrobacterium or the enhanced PMA4 promoter (Morian et al., Plant J (1999) 19, 31-41 ) to use.
  • the invention provides for the modification of the saccharide transport to be carried out by the saccharide transporter is modified by overexpression in leaf mesophyll tissue and / or leaf epidermis.
  • the specific expression of SUT4-coding nucleotide sequences in these tissues leads to a competitive effect with regard to the endogenous sucrose transporter active in the sieve elements, so that the carbohydrate content in the leaves is increased.
  • the plants produced in this way have larger leaves, which moreover have an improved protection potential against pathogens.
  • genes with a defense function are activated by an increased sugar content.
  • leaf mesophyll and epidermis provided in this preferred embodiment can be achieved by the use of the StLSl / L700 promoter (Stockhaus et al., Plant Cell (1989) 1, 805-813), other epidermis-specific promoters or that provided in a particularly preferred embodiment PFP promoter (palisade parenchyma) (WO 98/18940) for expressing the SUT4-coding nucleotide sequences can be achieved.
  • a further preferred embodiment of the present invention provides for overexpression of the saccharide transporter to be provided specifically in sink cells or organs, in particular developing seeds of a plant.
  • this enables an improved germination rate to be achieved, since both the carbohydrate and especially the oil content of the seeds is increased.
  • tissue-specific promoters to be used preferably in this embodiment for the expression of the SUT4-coding nucleotide sequences in seed tissue are e.g. the Vicilin promoter from Pisum sativum (Newbigin et al., Planta (1990) 180, 461-470).
  • an aforementioned method is provided, overexpression of the saccharide transporter being provided by using tissue-specific regulatory elements for the epidermis and parenchyma of sink organs.
  • the increased expression of the saccharide transporter used according to the invention in sink organs increases their saccharide absorption capacity and the saccharide flux into the sink tissue.
  • Plants produced according to the invention therefore have, for example, larger, more colorful and / or a higher number of flowers, larger seeds, larger tubers or larger tap roots.
  • the sink organs can also be characterized by a higher carbohydrate and oil content, an improved structure, in particular strength, faster growth and / or improved cold tolerance, if necessary, due to the higher content of osmotically active substances. It is also possible to influence the flowering time and duration as well as the development of the fruit.
  • the invention provides for the above-mentioned expression in the sink epidermis and parenchyma the AAP-1 (amino acid permease 1) promoter, for example the A-rabidopsis promoter AtAAPl (expression in endosperm and during early embryo development) or AtAAP2 (expression in phloem of the funiculus) (Hirner et al. , Plant J. (1998) 14, 535-544, the B33 (patent) promoter (Rocha-Sosa et al., EMBO J.
  • AAP-1 amino acid permease 1 promoter
  • AtAAPl expression in endosperm and during early embryo development
  • AtAAP2 expression in phloem of the funiculus
  • the invention also relates to the modification of the saccharide transport activity in the tissues of a plant, the activity of a saccharide transporter, in particular sucrose transporter, having a high transport capacity for sucrose and a low affinity for sucrose being suppressed or reduced, in particular inhibited or cosuppressed becomes.
  • the activity of the saccharide transport can be suppressed or reduced by transforming plant cells with vectors, the nucleotide sequences coding for the sacc arid transporter used according to the invention or parts thereof sufficient for anti-sense repression in anti - have sense orientation to a promoter and are preferably stably integrated into the genome of the plant cell.
  • the expression of this antisense RNA suppresses or reduces the formation of the endogenously present saccharide transporter mentioned, so that the saccharide flux caused by this transporter can be manipulated.
  • the activity of this saccharide transporter is reduced or suppressed by the suppression effects introduced into the plant.
  • several copies of a vector are introduced into at least one plant cell, in particular stably in its genome, which has the nucleotide sequences coding for the saccharide transporter or parts thereof, and these copies being integrated in the genome.
  • sucrose transporter by RNA double-strand inhibition.
  • the aforementioned techniques for suppressing or reducing the activity of the saccharide transporter with low affinity for sucrose but high sucrose transport capacity are used, for example, in source tissues, e.g. B. leaves to build a higher carbohydrate content, especially sucrose.
  • this can be done by reducing or suppressing the saccharide transport capacity in source organs as described above. This reduces the structure and strength of sink organs, while the sucrose. Carbohydrate content in source organs increases.
  • provision can be made to suppress or reduce the activity of the saccharide transporter in the guard cells, for example by mutagenesis of endogenously present nucleotide sequences which code in the guard cells and which code for the saccharide transporter, by cosuppression effects, RNA double-strand inhibition or by using antisense constructs.
  • the capacity to open or close the stomata can be changed, in particular increased or reduced, by modifying saccharide transport processes and the associated changes in the provision of energy and osmotically active substances in guard cells.
  • a higher opening rate of the stomata allows an improved supply for C0 2 , so that the photosynthesis rate is improved.
  • a vector is used in order to achieve the aforementioned effects, in which the nucleotide sequences coding for the saccharide transporter used according to the invention are in sense or antisense orientation, e.g. B. under the control of a guard cell-specific promoter, e.g. B. the KATl promoter (Nakamura et al., Plant Physiol. (1995) 109, 371-374).
  • the saccharide transporter SUT4 is also expressed in sink organs, provision can be made to reduce the saccharide import into the sink cells or organs or preferably into certain sink cells or organs, particularly preferably into the flower. This can cause carbohydrates to accumulate in source cells or organs, which are useful for other synthetic routes, and the relative activity of individual sink cells can be shifted in favor of others, thus improving the yields qualitatively and quantitatively.
  • nucleotide sequences coding for SUT4 in particular sucrose transporters, particularly preferably SUT4-coding nucleotide sequences, further nucleotide sequences are used for the transformation which are used in the there is a functional connection with the sucrose concentration and the sucrose flux in the tissues of a plant.
  • these are nucleotide sequences which encode SUT1 or SUT2, e.g. B. genomic or cDNA nucleotide sequences.
  • SUT1 genomic and cDNA sequences are e.g. B. from WO94 / 00574 (potato, spinach), Riesmeier et al. , a. a. 0. (potato), Riesmeier et al. , (EMBO J. (1992) 11, 4705-4713 (spinach)), Bürkle et al. .
  • SUT1-coding nucleotide sequences used according to the invention as well as the amino acid sequence derived therefrom, shown in SEQ ID NOS 22 and 23, are also the subject of the present invention.
  • SUTl represents a sucrose transporter with high affinity for sucrose but low transport capacity for sucrose. Coexpression of sucrose transporters with different affinities for sucrose in one and the same tissue, eg in sieve elements, allows a regulated and the actual one present in the plant Manipulation of the sucrose flux that meets the circumstances.
  • a vector for transforming the at least one plant cell which has nucleotide sequences coding for SUT2.
  • SUT2 acts in particular as a regulator and sensor.
  • SUT2 also exhibits the biological activity of a low-affinity sucrose transport.
  • SUT2's transport rates are also low.
  • SUT2 is a regulator and / or sensor of the sucrose transporter, which in particular can determine its own transport activity and, if necessary, mediate it further. Its transport activity can on the one hand be a functional component of its sensor activity and on the other hand its sensor activity can be seen as a functional component of its transport activity.
  • SUT2 with its low affinity for sucrose, is a flux sensor that possibly transports a substrate, namely sucrose, and uses a signal cascade or is a component thereof, which measures the rate of transport.
  • the affinity of SUT2 for sucrose is lower than that of SUT4.
  • the N-termini of proteins of the SUT / SUC gene family impart a modified affinity for their substrate, in particular sucrose.
  • the N-termini of SUT2 but also of SUT1 mediate a modified sucrose affinity, in the case of SUT2 low affinity for sucrose and in the case of SUT1 high affinity.
  • the invention therefore also relates to the use of N-termini from sucrose transporters or nucleotide sequences encoding them, in particular vegetable sucrose transporters for modifying the sucrose transport or the sucrose sensing in plants, in particular for producing modified sucrose transporters and sensors modified affinity for sucrose in plants.
  • the invention also relates to the use of SUT2 and / or SUT2-coding DNA sequences, in particular the SUT2 loop as a regulator and sensor of sucrose transport, in particular for regulating the SUT4 and / or SUT1 activity, for example in plant or fungal cells.
  • SUT2 can be induced by sucrose.
  • SUT2 regulates the relative activity of in the same cell type, e.g. B. in the sieve elements, existing sucrose transporters.
  • SUT2 regulates the activity of the sucrose transporter SUT1, which has high sucrose affinity but low transport capacity and the SUT4 sucrose transporter with high transport capacity but low sucrose affinity. This regulation can be done by controlling expression, protein activity, e.g. B. by protein modification or the turnover rate of mRNA or protein and result in an increase or decrease in activity.
  • SUT2 is expressed in plants, particularly in the large leaf veins of adult leaves, flowers and sink organs.
  • the invention therefore also relates to the aforementioned N-termini and central loops or loops of proteins from the SUT / SUC gene family, in particular of SUT1, SUT2 and / or SUT4, and the nucleotide sequences encoding these regions. In a preferred embodiment, these are shown in SEQ ID No. 24, 25 and 26.
  • the N-termini of LeSUT2 (Lycopersicon esculentum) and StSUT2 (Solanum tuberosum) comprise the first 62 amino acids of the protein and are encoded by nucleotides 1 to 186 of SEQ ID No. 4 (Lycopersicon esculentum) and No. 29 (Solanum tuberosum).
  • the central loop of LeSUT2 is encoded by nucleotides 844 to 1131 of SEQ ID No. 4 and of StSUT2 by nucleotides 847 to 1134 of SEQ ID No. 29.
  • the SUT1, SUT4 and / or SUT2 coding sequences preferably arranged in a vector, in sense or antisense orientation to at least one regulatory element, in particular a promoter, e.g. B.
  • a promoter e.g. B.
  • one of the aforementioned promoters can be transformed into plant cells, the activity of cotransformed and / or endogenously present SUT4 being modified after integration in the genome and expression of the product.
  • this relates to a aforementioned method, in which a vector is transformed into the plant cell which contains nucleotide sequences which encode SUT2, preferably in sense or antisense orientation, under the operative control of a regulatory element, in particular a promoter. It can be provided that the vector containing the SUT2-encoding nucleotide sequences without further vectors, the z. B. SUT4 or SUTl-encoding nucleotide sequences to transform.
  • SUT2 is in particular a sucrose concentration sensor and regulator with the above-mentioned transporter properties as well as a sucrose flux sensor and regulator in the transformed plant, in particular the endogenously present sucrose transporter, namely SUT4 and / or SUTl.
  • This re- Gulation can take place at the transcriptional or post-transcriptional level, for example by direct protein interaction or indirectly via signal transduction.
  • the invention also relates to the use of the SUT2-encoding nucleotide sequences or parts thereof, in particular the nucleotide sequence encoding the N-terminal protein region, for transforming plant cells, which can be transformed together with SUT1 and / or SUT4-encoding nucleotide sequences , Even in such a case, the overexpression, cosuppression or antisense repression of SUT2 can modify the activity of SUT1 and / or SUT4, e.g. B. increase or decrease.
  • parts of the SUT2-coding nucleotide sequences in particular the nucleotide sequences of SUT2 (SEQ ID No.
  • SUT2 nucleotide sequences which contain SUT2 or parts of SUT2 are also referred to in the context of the present invention as modified SUT2 nucleotide sequences.
  • SUT2 interacts with other proteins, in particular with regulators, signal transduction factors and other sucrose transporters. Therefore, using SUT2 by interaction cloning, further regulators can be identified for whom protection is also sought.
  • the invention also relates to, preferably isolated and purified, regulatory proteins and sensor proteins, as well as nucleotide sequences coding for them, which contain the central cytoplasmic loop of SUT2, in particular chimeric proteins and nucleic acids with N- and C-terminal regions of other sucrose transporters, or nucleotide sequences coding for them, wherein these chimeric proteins or nucleic acids contain the central loop of SUT2.
  • the central cytoplasmic loop or loop has a biological activity as a regulator element and / or sensor and / or signal transducer.
  • the invention therefore relates to the aforementioned methods for modifying the activity of a sucrose transporter with low affinity for sucrose but high transport activity for sucrose in the context of which known or modified SUT4, SUT1 and / or SUT2-coding nucleotide sequences are used to achieve the modification and to obtain an improved transgenic plant.
  • the invention therefore also relates to methods for producing transgenic, modified plants which are modified Have activity of said sucrose transporter and, preferably stably integrated in the genome, contain modified SUT1, SUT2 and / or SUT4 nucleotide sequences.
  • the invention also relates to the transgenic plants, plant cells, organs or parts of organs and plants thus produced which are distinguished by the changed activity of the sucrose transporter mentioned and at least one of the nucleotide sequences mentioned selected from the group consisting of the nucleotide sequences, in particular genes for saccharide transporters, such as SUT and SUC genes, preferably for SUT1; SUT2; SUT4; SUT1 and SUT2; SUTl and SUT4; SUT2 and SUT4; SUTl and SUT2 and SUT4 included in a modified form.
  • the nucleotide sequences selected from the group consisting of the nucleotide sequences, in particular genes for saccharide transporters, such as SUT and SUC genes, preferably for SUT1; SUT2; SUT4; SUT1 and SUT2; SUTl and SUT4; SUT2 and SUT4; SUTl and SUT2 and SUT4 included in a modified form.
  • a modified nucleotide sequence is understood to mean a nucleotide sequence which differs from the wild-type sequence, in particular the wild-type gene, for example a deviation which is based on nucleotide insertions, inversions, deletions, exchanges, additions or the like.
  • modified nucleotide sequences also represent those genes which contain the coding nucleotide sequence of the wild-type, this coding nucleotide sequence being operatively in the sense or antisense orientation with a heterologous promoter, e.g. B. are linked to a tissue-specific or constitutively expressing promoter.
  • a modified nucleotide sequence can also be present if it corresponds exactly to the wild-type sequence, but is present in an additional copy number and / or at a different location in the genome than the naturally occurring sequence.
  • a modified nucleotide sequence is also present if the naturally endogenously occurring nucleotide sequence has been changed by mutagenesis, for example transposon mutagenesis.
  • modified genes are understood to mean those nucleotide sequences which have deviations in the nucleotide sequence of their regulatory and / or protein-coding regions, e.g. B.
  • Modified nucleotide sequences or modified genes can also be chimeric nucleotide sequences or genes, for example those protein-coding regions which are composed of two or more different naturally occurring nucleotide sequences, for example constructs which encode sequences as N-terminal nucleotide sequence SUT2 (SEQ ID No. have. 24) and as a central and 3 ⁇ -terminal region SUTl-coding sequences.
  • modified genes are but understood as 5 X - coding region sequences of the SUTl gene (for example, SEQ ID NO. 25) and a central portion o- the / 3 and region sequences of the SUT2 gene contained.
  • Modified genes can accordingly z. B. the wild-type coding sequences and heterologous promoters z. B. from other organisms or from other genes.
  • a gene is understood to mean a protein-coding nucleotide sequence which is under the operative control of at least one regulatory element.
  • the invention also relates to agents for modifying the transport of sucrose.
  • agents for modifying the transport of sucrose are nucleic acid molecules encoding a saccharide transporter with low saccharide affinity and high transport capacity for the saccharide or parts thereof, in particular sucrose, selected from the group consisting of
  • nucleic acid molecules which comprise the nucleotide sequence shown under SEQ ID No. 1, 2 or 27, a part or a complementary strand thereof, b) nucleic acid molecules which encode a protein with the amino acid sequence shown under SEQ ID No. 5, 6 or 28 and c) nucleic acid molecules which hybridize with one of the nucleic acid molecules mentioned under a) and b).
  • the saccharide transporter is a sucrose transporter, in particular SUT4, e.g. B. from Arabidopsis (Arabidopsis thaliana, At), tomato (Lycopersicon esculentum, Le) or potato (Solanum tuberosum, St).
  • SUT4 a sucrose transporter
  • the aforementioned nucleic acid molecules are also referred to as SUT4 coding sequences.
  • the invention also relates to nucleic acid molecules encoding a sensor and / or regulator for the sucrose transport in plants and with the properties of a low-affinity sucrose transporter with low transport rates or parts thereof, selected from the group consisting of
  • nucleic acid molecules which comprise the nucleotide sequence shown under SEQ ID No. 3, 4, 24, 26 or 29, a part or a complementary strand thereof, b) Nucleic acid molecules which contain a protein with the one under SEQ ID No. 7, 8 or 30 amino acid sequence shown encode and c) nucleic acid molecules that hybridize with one of the nucleic acid molecules mentioned under a) and b).
  • the saccharide sensor and / or regulator is a sucrose sensor and / or regulator, in particular SUT2, e.g. from potato, tomato or arabidopsis.
  • SUT2 a sucrose sensor and / or regulator
  • the aforementioned nucleic acid molecules are also referred to as SUT2 coding sequences.
  • nucleic acid molecules according to the invention or used according to the invention can be isolated and purified from natural sources, preferably from the potato, or they can be synthesized by known processes. Using common molecular biological techniques, it is possible to insert different types of mutations into the inventive or the already known insert inserted nucleic acid molecules, which results in the synthesis of proteins with possibly changed biological properties, which are also covered by the invention. Mutations in the sense of the invention also concern all deletion mutations which lead to shortened proteins. Other molecular mechanisms such as insertions, duplications, transpositions, gene fusion, nucleotide exchange as well as gene transfer between different microorganism strains and others can lead to modifications of the activity and / or regulation of the protein, for example.
  • mutant proteins which have an altered transport capacity or sucrose affinity and / or which are no longer subject to the regulatory mechanisms normally present in the cells or in an altered form.
  • mutant proteins according to the invention can be produced which have a changed stability, substrate specificity or a changed effector pattern or a modified activity, temperature, pH value and / or concentration profile.
  • teaching according to the invention relates to proteins which have a changed active protein concentration, pre- and post-translational modifications, for example signal and / or transport peptides and / or other functional groups.
  • the invention also relates to nucleic acid molecules which hybridize with the aforementioned nucleic acid molecules according to the invention.
  • hybridization means hybridization and conventional hybridization conditions, as described in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 1989), preferably under stringent conditions.
  • one speaks of a hybridization if, after washing for 15 minutes with 2 ⁇ SSC and 0.1% SDS at 52 ° C., preferably at 60 ° C. and particularly preferably at 65 ° C., in particular for 15 minutes in 0, 5 x SSC and 0.1% SDS at 52 ° C, preferably at 60 ° C and particularly preferably at 65 ° C a positive hybridization signal is observed.
  • a nucleotide sequence which hybridizes under such washing conditions with one of the nucleotide sequences specified in the sequence listing is a nucleotide sequence according to the invention.
  • nucleic acid molecules can be identified and isolated using the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the complementary strand.
  • nucleic acid molecules can be used as the hybridization sample which have exactly or essentially the nucleotide sequences shown under SEQ ID No. 1, 2, 3 or 4 or parts of this sequence.
  • the fragments used as the hybridization sample can also be synthetic fragments which are produced using conventional synthesis techniques and whose sequence essentially corresponds to that of a nucleic acid molecule according to the invention.
  • the molecules hybridizing with the nucleic acid molecules according to the invention also include fragments, derivatives and al lelic variants of the nucleic acid molecules described above, which encode a protein according to the invention.
  • “Fragments” are understood to mean parts of the nucleic acid molecules that are long enough to encode the protein described.
  • the term “derivative” in the context of the invention means that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleic acid molecules described above at one or more positions, but have a high degree of homology to these sequences.
  • Homology means a sequence identity of at least 70%, in particular an identity of at least 75%, preferably over 80% and particularly preferably over 90%, 95%, 97% or 99% at the nucleic acid level.
  • the proteins encoded by these nucleic acid molecules have a sequence identity to the amino acid sequence given in SEQ ID No.
  • the deviations from the nucleic acid molecules described above may have arisen, for example, through deletion, substitution, insertion or recombination.
  • These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other organisms, or mutations, whereby these mutations can have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis (UV or X-rays, chemical agents or others).
  • the variations can be synthetically produced sequences.
  • the allelic variants can be both naturally occurring variants yours, as well as synthetically produced or recombinant DNA techniques.
  • the proteins encoded by the different variants of the nucleic acid molecules according to the invention have certain common characteristics, such as activity, active protein concentration, post-translational modifications, functional groups, molecular weight, immunological reactivity, conformation and / or physical properties, such as running behavior in gel electrophoresis, chromatographic behavior, sedimentation coefficient , Solubility, spectroscopic properties, stability, pH optimum, isoelectric pH, temperature optimum and / or others.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be both DNA and RNA molecules.
  • DNA molecules according to the invention are, for example, genomic DNA or cDNA molecules.
  • the invention further relates to vectors which contain nucleic acid molecules according to the invention.
  • vectors can e.g. B. plasmids, liposomes, cosmids, viruses, bacteriophages, shuttle vectors and other vectors common in genetic engineering.
  • the vectors can also have further functional units which bring about or contribute to stabilization and / or replication of the vector in a host organism.
  • the vectors are also detected according to the invention in which the nucleic acid molecule contained therein is operatively linked to at least one regulatory element which ensures the transcription and synthesis of translatable nucleic acid molecules in pro- and / or eucaryotic cells.
  • regulatory elements can be promoters, enhancers, operators and / or transcription termination signals.
  • the vectors can also antibiotic resistance genes, herbicide resistance genes z. B. selection markers included.
  • the invention also relates to the aforementioned vectors, which in addition to the nucleic acid sequences which are under the control of at least one regulatory element and which encode the SUT4 and / or SUT2 according to the invention, also comprise a nucleic acid sequence which is likewise under the control of at least one regulatory element, encoded the SUTl.
  • a vector thus has the genetic information for at least two proteins involved in the transport of sucrose.
  • Such vectors make it possible in a particularly simple manner to modify the system of the sucrose transport in a plant in a targeted and comprehensive manner.
  • the invention also relates to host cells which contain one of the nucleic acid molecules according to the invention or one of the vectors according to the invention stably integrated or transiently or are transformed with it and are preferably capable of SUT4 and optionally SUT1 and / or To express SUT2.
  • the invention further relates to host cells which are derived from a host cell transformed with the nucleic acid molecules according to the invention or the vectors according to the invention.
  • the invention thus relates to host cells which contain the nucleic acid molecules or vectors according to the invention, a host cell being understood to mean an organism which is capable of taking up recombinant nucleic acid molecules in vitro and, if appropriate, of synthesizing the proteins coded by the nucleic acid molecules of the invention.
  • the invention relates to microorganisms which contain the vectors, derivatives or parts of the vectors according to the invention which enable them to synthesize proteins with sucrose transport activity.
  • the host cell according to the invention can also be characterized in that the introduced nucleic acid molecule according to the invention is either heterologous with respect to the transformed cell, that is to say naturally does not occur in this cell, or is located at a different location or a different number of copies in the genome than the corresponding naturally occurring sequence.
  • this host cell is therefore a procaryotic cell, preferably a gram-negative procaryotic cell, particularly preferably an enterobacterial cell.
  • the transformation of procaryotic cells with exogenous nucleic acid sequences is familiar to a person skilled in the field of molecular biology.
  • the cell according to the invention can also be a eucaryotic cell, such as a plant cell, a fungal cell, for example yeast or an animal cell. Methods for the transformation or transfection of eucaryotic cells with exogenous nucleic acid sequences are familiar to the person skilled in the field of molecular biology.
  • the invention also relates to cell cultures or callus tissues which have at least one of the host cells according to the invention, the cell culture or callus according to the invention being in particular able to produce a protein with sucrose transport activity.
  • the nucleotide sequence used according to the invention is linked in the vector to a nucleic acid molecule which encodes a functional signal sequence for forwarding the protein to different cell compartments or the plasma membrane.
  • This modification can consist, for example, of an addition of an N-terminal signal sequence of a higher plant, but also any other modification which leads to the fusion of a signal sequence to the encoded protein is the subject of the invention.
  • nucleic acid molecules according to the invention in procaryotic cells, for example in Escherichia coli, or in eucaryotic cells, for example in yeast, is interesting in that z. B. a more precise characterization tion of the activities of the proteins encoded by these molecules.
  • Another embodiment according to the invention are, preferably purified and isolated peptides or proteins, coded by the nucleotide sequences according to the invention, in particular with the amino acid sequences of SEQ ID Nos. 5 to 8, 23 to 26, 28 or 30, preferably with the activity of a sucrose transporter, in particular a sucrose transporter with low affinity for sucrose and a high transport capacity for sucrose, or with the activity of a sensor or regulator of sucrose transport, and methods for their production, wherein a host cell according to the invention is cultivated under conditions which allow the synthesis of the protein and then that Protein is isolated from the cultured cells and / or the culture medium.
  • the invention further relates to the monoclonal or polyclonal antibodies which react specifically with these proteins.
  • nucleic acid molecules according to the invention it is possible, using genetic engineering methods, to modify the sucrose transport in the tissues of any plant, as is done by conventional, e.g. B. breeding measures in plants was not possible, and to change it so that there is a targeted change in sucrose concentration in certain tissues of a plant.
  • increasing the activity of the proteins according to the invention For example, by overexpressing corresponding nucleic acid molecules, or by providing mutants that are no longer subject to the cell's regulatory mechanisms and / or have different temperature dependencies in relation to their activities, there is the possibility of increasing the yield in correspondingly genetically modified plants.
  • nucleic acid molecules used according to the invention in plant cells in order to increase the activity of the corresponding sucrose transporters, or to express them in cells which do not normally express this protein. Furthermore, it is possible to modify the nucleic acid molecules used according to the invention by methods known to the person skilled in the art in order to obtain proteins according to the invention which are no longer subject to the cell's own regulatory mechanisms or which have changed temperature dependencies or substrate or product specificities.
  • the invention also provides that the synthesized protein can be located in any compartment or in the plasma membrane of the plant cell. In order to achieve localization in a particular compartment or the plasma membrane, the coding region may have to be linked to DNA sequences which ensure the localization in the respective compartment or the plasma membrane.
  • the present invention thus also relates to transgenic plant cells which have been transformed with one or more nucleic acid molecule (s) according to the invention or used according to the invention, and to transgenic plant cells which are derived from such transformed cells.
  • Such cells contain one or more nucleic acid molecules (s) used or according to the invention, these (s) preferably being linked to regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells, in particular with a promoter.
  • the invention also relates to transgenic plant cells whose genome contains at least two stably integrated modified genes from the family of the SUT and / or SUC genes.
  • Such cells can be distinguished from naturally occurring plant cells in that they contain at least one nucleic acid molecule according to the invention or used according to the invention which does not naturally occur in these cells, or in that such a molecule is integrated at a location in the genome of the cell where it is does not occur naturally, ie is in a different genomic environment or in a number other than the natural number of copies.
  • the transgenic plant cells can be regenerated into whole plants using techniques known to those skilled in the art.
  • the plants obtainable by regeneration of the transgenic plant cells according to the invention are also the subject of the present invention.
  • the invention also relates to plants which contain at least one, but preferably a multiplicity, of cells which the cells according to the invention or those used according to the invention Contain vector systems or derivatives or parts thereof, and which are capable of synthesizing proteins due to the inclusion of these vector systems, derivatives or parts of the vector systems, which bring about modified sucrose transport activity, in particular SUT4 activity.
  • the invention thus makes it possible to provide plants of the most diverse types, genera, families, orders and classes which have the abovementioned characteristics.
  • the transgenic plants can in principle be plants of any plant species, ie both monocotyledonous and dicotyledonous plants, such as Graminae, Pinidae, Magnoliidae, Ranunculidae, Caryophyllidae, Rosidae, Asteridae, Aridae, Liliidae, Arecidae and Commelinidae as well as Gymnospermae, algae, mosses, ferns or also Calli, plant cell cultures etc., as well as parts, organs, tissues, harvesting or propagation materials thereof. It is preferably useful plants, in particular starch-synthesizing or starch-storing plants, such as. B.
  • the invention also relates to other plants such as tomato, arabidopsis, pea, rapeseed, sunflower, tobacco, rye, oats, cassava, lettuce, spinach, wine, apple, coffee, tea, banana, coconut, palm trees, beans, pine, poplar, Eucalyptus etc.
  • the invention also relates to propagation material and harvest products of the plants according to the invention, for example flowers, fruits, seeds, bulbs, roots, leaves, rhizomes, seedlings, cuttings, etc.
  • any promoter active in plants for example a promoter which constitutively expresses, or only in a certain tissue, at a certain time in plant development or at a time, is suitable external influences determined point in time.
  • the promoter can be homologous or heterologous to the plant. Promoters that can be used are e.g. B.
  • the promoter of the 35S RNA of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) and the ubiquitin promoter from maize for a constitutive expression particularly preferably the patatin gene promoter B33 (Rocha-Sosa et al., Loc. Cit.)
  • the patatin gene promoter B33 (Rocha-Sosa et al., Loc. Cit.)
  • a promoter that ensures expression only in photosynthetically active tissues e.g. B. the ST-LS1 Pro otor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 7943-7947, Stockhaus et al., EMBO J.
  • HMG promoter from wheat
  • USP promoter the phaseolin promoter or promoters of zein genes from maize.
  • a termination sequence can also be present in the vector, which serves to correctly terminate the transcription and to add a poly-A tail to the transcript in order to stabilize it.
  • Such elements are described in the literature (Gielen et al., EMBO J. (1989) 8, 23-29) and are interchangeable. Further promoters are described above.
  • a large number of cloning vectors are available for the introduction of foreign genes into higher plants, which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, Ml3mp series, pACYCl ⁇ l etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of z.
  • Transformed E. coli cells are grown in a suitable medium, then harvested and lysed.
  • the plasmid is recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained.
  • the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences.
  • Each plasmid DNA sequence can be cloned into the same or different plasmids.
  • a variety of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as the transformation agent, the fusion of protoplasts, the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method and others Possibilities.
  • Simple plasmids such as e.g. B. pUC derivatives can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, a selectable marker should be present.
  • SUT1, SUT2 and / or SUT4 coding nucleotide sequences into the plant cell, additional DNA sequences may be required.
  • z. B. for the transformation of the plant cell uses the Ti or Ri plasmid, at least the right border sequence, but often the right and left border sequence of the Ti and -Ri plasmid T-DNA as the flank region must be linked to the genes to be introduced , If agrobacteria are used for the transformation, the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate vector or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria by means of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria.
  • the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens using a helper plasmid.
  • Binary vectors can replicate in both E. coli and agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border regions. They can be transformed directly into the agrobacteria (Holsters et al., Mol. Gen.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region. Additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • the use of T-DNA for the transformation of plant cells is described in EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters. BV, Alblasserdarn (1985), Chapter V, Fraley et al. , Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 and An et al. EMBO J. (1985) 4, 277-287.
  • plant explants can be co-cultivated with Agrobacterium tu efaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Agrobacterium tu efaciens or Agrobacterium rhizogenes From the infected plant material z. B. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells can then be regenerated again in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells, whole plants.
  • the plants thus obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Other possibilities of introducing foreign DNA using the biolistic method or by protoplast transformation are known (Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants, In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (HJ Rehm, G. Reed, A.
  • the invention also relates to identification and screening methods for modulators of sucrose metabolism, preferably potential pesticides and herbicides, SUT4 and / or SUT2-expressing cells or tissues, in particular host cells or plants according to the invention, for example yeast or plant cells according to the invention in contact with the one to be examined brought potential modulator, for example pesticide or herbicide and the effect, in particular the inhibitory effect of the potential modulator, for example pesticide or herbicide, on the activity of SUTl, SUT2 and / or SUT4 is quantitatively or qualitatively demonstrated.
  • SUT2 and / or SUT4 can also be used to develop systems that enable improved pesticide mobilization.
  • Inhibitors can be identified by screening chemical libraries for substances which specifically block the growth of yeasts which express low-affinity sucrose transporters such as SUT4, or the combinations of other sucrose transporters, for example SUT4 and SUT2 or SUT2 and SUT1 or SUT4 and SUT1 , These inhibitors could be used as herbicides or as precursors for new herbicides. On the basis of the tests, potential pesticides can also be identified, which are mobilized in the plant via these transporters and can thus better reach their destination. ',
  • the invention also includes influencing ki eraplasty, ie influencing the activity of transporters in the plant by using mixed oligonucleotides, thereby increasing the activity the sucrose transporter is either increased, decreased or its biochemical properties are changed.
  • influencing ki eraplasty ie influencing the activity of transporters in the plant by using mixed oligonucleotides, thereby increasing the activity the sucrose transporter is either increased, decreased or its biochemical properties are changed.
  • the invention therefore also relates to the use of SUT2-coding nucleotide sequences or of SUT2 for the identification of modulators, in particular inducers, activators or inhibitors of sucrose transport, in particular the sensor system and / or regulation of sucrose transport in a plant, the activity of the protein encoded by the SUT2-encoding nucleotide sequences in the presence and absence of a potential modulator. It can also be provided that not the activity of SUT2, but a sucrose transporter regulated by SUT2, e.g. Evidence of SUTl or SUT4.
  • the invention also relates to the use of SUTl-coding nucleotide sequences, in particular SEQ ID No. 22 and / or of SUT4-coding nucleotide sequences and / or of SUTl and / or SUT4 for the identification of modulators of sucrose transport activities in a plant, in particular an inhibitor the low-affinity, high-capacity loading of the phloem with sucrose, the activity of a protein encoded by the SUT4 nucleotide sequences in the presence of the absence and absence of the potential modulator is demonstrated.
  • SUTl-coding nucleotide sequences in particular SEQ ID No. 22 and / or of SUT4-coding nucleotide sequences and / or of SUTl and / or SUT4 for the identification of modulators of sucrose transport activities in a plant, in particular an inhibitor the low-affinity, high-capacity loading of the phloem with sucrose, the activity of a protein encoded by the SUT
  • the invention also relates to the use of the SUT1, SUT2 and SUT4 nucleotide sequences according to the invention for the identification of homologous genes in other plants, e.g. from cDNA or genomic banks.
  • the invention also relates to the use of the genes and the surrounding regions as molecular markers for crossing programs.
  • SUT2 and SUT4 loci are located in regions of QTL loci for high carbohydrate content and high yield in potato tubers. Therefore, both are suitable for crossing suitable chromosome fragments in breeding programs from wild forms or high-performance varieties and thus producing plants with improved yields.
  • SEQ ID No. 1 the coding DNA sequence of the SUT4 gene from Arabidopsis thaliana.
  • SEQ ID No. 2 the coding DNA sequence of the SUT4 gene from Lycopersicon esculentum.
  • SEQ ID No. 3 the coding DNA sequence of the SUT2 gene from Arabidopsis thaliana.
  • SEQ ID No. 4 the coding DNA sequence of the SUT2 gene from Lycopersicon esculentum.
  • SEQ ID No. 5 the amino acid sequence of SUT4 from Arabidopsis thaliana.
  • SEQ ID No. 6 the amino acid sequence of SUT4 from Lycopersicon esculentum.
  • SEQ ID No. 7 the amino acid sequence of SUT2 from Arabidopsis thaliana.
  • SEQ ID No. 8 the amino acid sequence of SUT2 from Lycopersicon esculentum.
  • SEQ ID No. 9 a T-DNA specific primer.
  • SEQ ID No. 10 a SUT4-specific primer.
  • SEQ ID No. 11 a SUT4-specific primer.
  • SEQ ID No. 12 to 15 represent further SUT4 primers.
  • SEQ ID Nos. 16 and 17 represent the amino acid sequence of sections of LeSUT4.
  • SEQ ID No. 18 to 21 represent cloning pri er.
  • SEQ ID No. 22 the coding DNA sequence of the SUT1 gene from Solanum tuberosum.
  • SEQ ID No. 23 the amino acid sequence of SUTl from Solanum tuberosum.
  • SEQ ID No. 24 the DNA sequence of SEQ ID No. 3 coding for the N-terminal region of SUT2 with nucleotides 1 to 239.
  • SEQ ID No. 25 the DNA sequence of SEQ ID No. 22 coding for the N-terminal region of SUT1 with nucleotides 1 to 149.
  • SEQ ID No. 26 the DNA sequence from SEQ ID No. 3 coding for the central loop with nucleotides 843 to 1130.
  • SEQ ID No. 27 the coding DNA sequence of the SUT4 gene from Solanum tuberosum.
  • SEQ ID No. 28 the amino acid sequence of SUT4 from Solanum tuberosum.
  • SEQ ID No. 29 the coding DNA sequence of the SUT2 gene from Solanum tuberosum.
  • SEQ ID No. 30 the amino acid sequence of SUT2 from Solanum tuberosum.
  • FIGS 1 to 4 show schematically the structure of gene constructs used according to the invention.
  • FIGS. 5 and 6 show graphic representations of the protein activities of SUT 4.
  • FIG. 7 shows chimeras SUT2 and SUT1 gene constructs according to the invention.
  • Genomic sequence AtSUT4 AC000132
  • a cDNA was amplified from an Arabidopsis seedling bank using PCR (Minet et al., Plant J. (1992) 2, 417-422). Primers based on the genomic sequence (5 '-Gactctgcagcgagaaatggctacttccg SEQ ID No. 12, 5' -taacctgcaggagaatctcatgggagagg SEQ ID No. 13) were designed. The primers each contain a PstI restriction site (underlined) and are designed so that the entire coding sequence of AtSUT4 is amplified.
  • AtSUT4 was subcloned into the PstI site of pDR196.
  • the AtSUT4 cDNA in pDR196 was sequenced in both directions. Ecotype differences between the SUT4 gene in Columbia and Landsberg erecta were verified by sequencing AtSUT4 from Landsberg erecta.
  • a tomato (Lycopersicon esculentum cv. UC82b) cDNA library (flowers) was treated with a 300 bp Eco-RIBglll fragment of the genomic tobacco clone NtSUT3 (Lemoine et al., FEBS Lett. (1999) 454, 325-330). through the reduced stringency.
  • Three independent clones different from LeSUT1 were isolated and designated LeSUT4. With primers of the LeSUT4 sequence, the orthologous sequence was isolated from potato by RT-PCR and designated StSUT4.
  • StSUT4 was cloned as a Pstl / Notl fragment in pBC SK- (Stratagene) and subcloned as an XhoI / SacII fragment into the yeast expression vector pDR195, which contains a URA3 marker, PMAl promoter and ADHl terminator (Rentsch et al., FEBS Lett. (1995) 370, 264-268).
  • Genomic sequence AtSUT2 AC004138
  • Primers based on the genomic sequence (5'-TACGAGAATTCGATCTGTGTGTTGAGGACG, SEQ ID No. 20, 5'-AGAGGCTCGAGTGGTCAAAAAGAATCG, SEQ ID No. 21) were designed.
  • the primers contain an EcoRI or an Xhol restriction site (underlined) and are designed to amplify the entire AtSUT2 coding sequence.
  • a product with the expected size of 1785 bp was cut with EcoRI and Xhol and ligated directionally into the vector pDR19 ⁇ .
  • the yeast strain SUSY7 / ura3 is a modified version of SUSY7 (Riesmeier et al., EMBO J. (1992) 11, 4705-4713), which contains a deletion of part of the URA3 gene and thereby enables selection for uracil auxotrophy.
  • sucrose medium media were used which contain 1.7 g / 1 yeast nitrogen base without amino acids (Difco), 2% sucrose, 20 mg / 1 tryprophan and 1.5% agarose, pH 5.0 included.
  • At-SUT4 and StSUT4 proved to be functional sucrose transporters.
  • the time course of the uptake of 14 C-sucrose from the yeast expressing AtSUT4 or StSUT4 is shown in FIG. 5A. There is a significant difference to the vector controls.
  • FIG. 5C shows the stimulation of the uptake of 14 C-sucrose via SUT4 by glucose and the inhibition by an electron transport inhibitor (antimycin A and the protonophores CCCP.
  • FIG. 6 shows the pH optimum of SUT4-mediated sucrose transport.
  • T-DNA mutagenized Arabidopsis plants were obtained from Dupont Co. and from Arabidopsis Biologi- cal Resource Center (ABRC), Ohio State University. The plants were examined in groups of 100. The plants were grown in sterile culture and genomic DNA isolated. The DNA from the 140 groups of 100 plants each was combined into 14 supergroups (superpool) and according to the method of Krysan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8145-8150), using gene-specific and T-DNA-specific primers. A PCR was carried out using the Superpool DNA as a template, a T-DNA-specific primer (LB, left border region SEQ ID No.
  • PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and transferred to a charged nylon membrane.
  • the membrane was hybridized with a PCR product of 2.46 kb in length, prepared from WS (Wassilewskija) genomic DNA as a template and the primers AtSUT4r2 (see above) and AtSUT4f2 (ATGGCTACTTCCGATCAAGATCGCCGTC SEQ ID No. 11). This probe was labeled with 32 P-CTP.
  • a super pool was identified by hybridizing the labeled probe with the blot.
  • DNA from the pools of 100 plants that form the superpool were then screened in the same way: PCR was carried out using DNA from pools of 100 as a template and AtSUT4r2 and LB as a primer, DNA blot hybridization was carried out using the AtSUT4 genomic probe ( 2.46 kb) carried out for the detection of amplified products.
  • Preimmune serum was purified by the same method, except that Protein A Sepharose (BioRad) was used instead of peptide affinity chromatography.
  • the slides were incubated for 30 seconds in acetone, rehydrated over an ethanol series and blocked for 1 hour with 2% BSA in PBS (100 mM sodium phosphate, pH 7.5, 100 mM NaCl). After overnight incubation with affinity-purified antibodies to LeSUT4, the slides were washed twice in PBS-T (PBS with 0.1% Tween) and once with PBS, followed by incubation with anti-rabbit conjugate IgG-FITC (fluorescinisothio-cyanate) for one hour ) washed. After three washing steps with PBS-T, PBS and distilled water, pictures were taken with a fluorescence phase microscope (Zeiss, Axiophot) and an excitation light of 450-490 nm.
  • PBS-T PBS with 0.1% Tween
  • IgG-FITC immunofluorescinisothio-cyanate
  • AtSUT2 cDNA was amplified by PCR - the product was 1,785 bp long in accordance with the coding range according to the invention from ATG (position 1) to TGA (position 1785).
  • the fragment was cloned in a sense orientation into a 35S promoter Expression cassette (pBinAr35S), which was isolated as an EcoRI / HindIII fragment from pBinAr (Höfgen and Willmitzer, Plant Sc. (1990) 66, 221-230).
  • This construct was cut with HindIII and EcoRI and cloned into the HindIII / EcoRI-cut pGTPV bar (Becker et al., Loc. Plant Mol. Biol. (1992) 20, 1195-1197). Plants were transformed.
  • AtSUT2 antisense construct ( ⁇ AtSUT2 35s )
  • AtSUT2 cDNA (ATTS5034EST accession number) was cut with SacI and BamHI and cloned into the pBinAr35S expression cassette in antisense orientation. This construct was cut with HindIII and EcoRI and cloned into the HindIII / EcoRI-cut pGPTV bar (Becker et al., Op. Cit.). Plants were transformed.
  • AtSUT4 overexpression construct (oAtSUT4 AtS uc2)
  • AtSUT4 cDNA was amplified.
  • the 1,533 bp fragment begins by means of PCR at position 1 of the AtSUT4cDNA sequence according to the invention and ends at TAG position 1533.
  • the SUC2 promoter was separated from Arabidopsis (Columbia ecotype) genomic DNA using the following primers: (reverse 5'-ATGGCTGACCAGATTTGAC; SEQ ID No. 18 and forward 5'- GTTTCATATTAATTTCAC; SEQ ID No. 19).
  • the 1.533 kb fragment was cloned in the sense orientation behind the At-SUC2 promoter (X79702). This construct was cut with Hindlll and EcoRI and cloned into the Hindlll / EcoRI-cut pGPTV-bar (loading cker et al., loc. cit.). Plants were transformed.
  • LeSUT4 antisense construct ( ⁇ LeSUT4 35s )
  • the LeSUT4 cDNA was cut with BamHI to give a 1.3 kb fragment which was smoothed and cloned into the Smal site of pBinAR (Bevan, Nucleic Acids Research (1983) 12, 8711-8721).
  • FIGS. 1 to 4 represent the aforementioned constructions.
  • AtSUT2 The open reading frame of AtSUT2 was isolated from Arabibopsis thaliana (Columbia Ecotyp) leaves by RT-PCR and cloned into the yeast expression sector pDR196 (Barker et al., (2000) Plant Cell 12: 1153-1164).
  • the open reading frame of StSUT1 was amplified by the StSUTl cDNA in pDRl95 (Riesmeier et al., (1993) op. Cit.), Using primers with the restriction sites for Smal and Xhol.
  • the open reading frame was ligated into the yeast expression vector pDRl96.
  • StSUTl / AtSUT2-N has the nucleotides 1 to 239 from SEQ ID No. 3 fused to the nucleotides 150 to 1548 from StSUTl, shown in SEQ ID No. 22, the construct being a ' nucleotide due to cloning conditions d exchange from t to c.
  • the fusion region of the construct is shown in sequence below, the small letters being the sequences of SUT2 and the large letters being the sequences of SUT1 (upper line: without exchange, lower line: with exchange):
  • AtSUT2 / StSUTl-N has nucleodides 1 to 149 of StSUT1, shown in SEQ ID No. 22, fused to nucleotides 240 to 1785 of AtSUT2 in SEQ ID No. 3. Due to technical cloning conditions, the construct has 3 nucleotide changes compared to the wild-type sequence.
  • the fusion area is shown below, in the upper line the theoretically obtainable construct and in the lower line the fusion area actually produced.
  • the upper case letters refer to sequences from SUT1 and the lower case letters to sequences from SUT2:
  • chimeric constructs were produced in which the central cytoplasmic area, in particular loop, of AtSUT2, which is shown in SEQ ID # 26, was exchanged with the smaller cytoplasmic area, in particular loop, of StSUT1 and vice versa. Restriction interfaces were used by means of PCR within conserved areas of the transmembrane regions VI and VII.
  • the N-terminal half, the cytoplasmic loop and the C-terminal half of the open reading frame were amplified by PCR using Pfu polymerase (Stratagene) and cloned into the yeast expression vector by ligating the first three fragments using Sac I and Bcll / Bglll for AtSUT2 with the StSUTl loop and Sacl and BamHI / Bglll for StSUTl with the AtSUT2 loop.
  • the chimeric DNA was then ligated into the yeast expression vector pDR196 using Smal and Xhol. These chimeric constructs are still called AtSUT2 / StSUTl-Loop and StSUTl / AtSUT2-Loop designated and shown in Figure 7.
  • AtSUT2 / StSUTl-Loop has nucleotides 1 to 842 from AtSUT2 (SEQ ID No. 3), 750 to 893 from StSUT1 (SEQ ID No. 22) and nucleotides 11.31 to 1785 from AtSUT2 (SEQ ID No. 3).
  • the upper and lower case representation used in the following corresponds to the aforementioned use.
  • the upper line represents the sequence of the theoretically obtainable construct and the respective lower line represents the sequence of the construct actually achieved on the basis of cloning conditions.
  • StSUTl / AtSUT2-Loop has nucleotides 1 to 749 from StSUTl (SEQ ID No. 22), nucleotides 843 to 1130 from AtSUT2 (SEQ ID No. 3) and nucleotides 894 to 1548 from StSUTl (SEQ ID No. 22) on .
  • the yeast strain SEY6210 (Banakaitis (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) 83, 9075-9070), which had the corresponding cDNAs in the expression vector pDR196, was used for sucrose uptake tests.
  • the uptake of 14-C-sucrose was carried out as described ( Weise et al., (2000) Plant Cell 12: 1345-1355)
  • Expression analysis of the proteins in yeast revealed comparable amounts for all proteins examined.
  • sucrose uptake by AtSUT2 was pH-dependent, the highest uptake rates being measured at a pH of 4.0.
  • the sucrose uptake dropped sharply at alkaline pH values and at a pH value of 6 no more sucrose uptake could be measured.
  • the sucrose uptake (1 mM sucrose) was competitively measured with other sugars and sugar alcohols.
  • sucrose maltose, isomaltulose, glucomannitol, glucosorbitol, raffinose, galactose, lactose, mannitol, sorbitol, glucose
  • sucrose competed and to a lesser extent maltose significantly with 1 C-sucrose.
  • Sucrose transport by AtSUT2 could be inhibited by CCCP and by the mitochondrial ATP formation inhibitor, Antimycin A.
  • K M values for sucrose of the StSUT1 and AtSUT2 sucrose transporters and chimeric proteins in which the N-terminal regions or central cytoplasmic loops were exchanged between the two transporters The values are given as the mean ⁇ standard error determined from at least three different measurements. Different letters indicate significant differences (p ⁇ 0.05).
  • the chimeric protein encoded by the chimeric construct AtSUT2 / StSUTl-N shows a significantly lower K M value for sucrose of 3.4 + 1.6 mM

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die einen Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transporter codieren, Vektoren und Wirtzellen, die diese Nucleinsäuremoleküle enthalten sowie mit den beschriebenen Nucleinsäuremolekülen und Vektoren transformierte Pflanzenzellen und Pflanzen. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Modifizierung des Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transports, in Pflanzen.

Description

Verfahren zur genetischen Modifizierung einer Pflanze
Besehreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsauremolekule, die einen Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transporter codieren, Vektoren und Wirtszellen, die diese Nucleinsauremolekule enthalten sowie mit den beschriebenen Nucleinsäure olekülen und Vektoren transformierte Pilze, Pflanzenzellen und Pflanzen. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Modifizierung des Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transports, in Pflanzen.
Höhere Pflanzen weisen heterotrophe Gewebe auf, die von autotrophen Geweben mit Kohlenhydraten versorgt werden. Die Haupttransportform der Kohlenhydrate stellt die Saccharose und ihre Derivate dar. Die Versorgung der heterotrophen Gewebe erfolgt über das Phloem, das die Organe, welche Photoassimilate, also Kohlenhydrate, im Überschuss zur Verfügung stellen und die diese exportieren können, also sogenannte Source-Organe mit Organen, die in ihrer Nettobilanz Photoassimilate importieren müssen, also sogenannte Sink-Organe, verbindet. Source-Organe sind beispielsweise ausgewachsene Blätter und keimende Samen. Sink-Organe stellen beispielsweise junge Blätter, junge Knollen, Wurzeln, Früchte, Blüten und sonstige reproduktive Organe dar. Das Phloem ist aus verschiedenen Zelltypen wie Siebelementen, Geleitzellen, Parenchymzellen und Bündel- scheidenzellen aufgebaut. In den Siebelementen bewegt sich der Translokationsstrom der Photoassimilate von Orten des Exports zu Orten des Imports. Sowohl die Beladung des Phloems mit Photoassimila- ten als auch die Entladung kann dabei grundsätzlich auf apoplastischem und symplastischem Wege erfolgen, wobei eine Vielzahl von Faktoren wie osmoti- sche Verhältnisse, Konzentrationsgefälle, zu passierende Plasmamembranen etc. Einfluss auf die Be- und Entladung nehmen. Sowohl die Beladung des Phloems als auch die Versorgung der Sink-Organe mit Photoassimilaten sind de gemäss hochkomplexe Vorgänge, die offensichtlich eine Vielzahl von eng miteinander verknüpften und regulierten Transportschritten umfassen. Diese Transportschritte verlaufen unter Beteiligung unterschiedlicher Plasmamembranproteine, insbesondere von Transportproteinen. So sind z. B. aus Pflanzen unterschiedlicher Familien jeweils mehrere Mitglieder aus der Familie der Saccharose-Transporter bekannt, z. B. SUT1 (sucrose transporter) . Die SUT-Gene codieren hydrophobe Proteine, die 12 Transmembrandomänen aufweisen und deutlich von den Mitgliedern der Hexose- Transporterfamilie unterschieden werden können. La- londe et al . (The Plant Cell (1999) 11, 707-726) lässt vermuten, dass die Mitglieder der SUT-Familie hohe Affinität für Saccharose aufweist. Es wird dabei angenommen, dass insbesondere der Saccharose- Transporter SUT1 aus Lycopersicon esculentum, Nico- tiana tabacum und Solanum tuberosu für den Langstreckentransport im Phloem zuständig ist (Riesmeier et al., Plant Cell (1993) 5, 1591-1598). Die WO94/00574 offenbart die DNA- und Aminosäuresequenzen von SUT1 aus Spinat und Kartoffel. Dieser in der Plasmamembran der Siebelemente des Phloems lokalisierte Saccharose-Transporter stellt eine essentielle Komponente für den Langstreckentransport von Saccharose im Phloem dar, wie sich beispielsweise in Antisense-Inhibitionsexperimenten in transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen zeigt (Riesmeier et al . , EMBO J (1994) 13, 1-7) (Lalonde et al . , a. a. O.) . Das Expressionsmuster von SUT1, insbesondere die Expression im gesamten Phloem belegt, dass SUT1 an der Aufrechterhaltung des Konzentrationsgradienten von Saccharose zwischen Be- und Entladungszonen (Blättern, respektive Sink- Organen) verantwortlich ist. SUT1 scheint daher weniger für die (erstmalige) Beladung des Phloems in Source-Organen als vielmehr für die Rückführung aus dem Phloem abgewanderter Saccharose verantwortlich zu sein. Diese Funktion wird weiterhin durch die relativ hohe Affinität und die damit verbundene niedrige Transportkapazität bestätigt. SUT1 kann also sehr geringe Mengen Saccharose aus dem Apoplasten in das Phloem (zurück) importieren und hält somit die apoplastischen Konzentrationen niedrig. Da er bei diesen geringen Konzentrationen arbeitet, kann er nicht für hohe Transportraten verantwortlich sein. Die Kinetiken der Saccharose- Aufnahme in Blattscheiben zeigen deutlich diese beschriebene hochaffine (Km 2.7 M) Aufnahme mit niedriger Kapazität (V ax 0.7 nmol cm"2 min" x) (Delrot & Bonnemain, Plant Physiol . (1981) 67, 560-564) . Dieses System wird auch als HAS (high af- finity/low capacity System) bezeichnet. Die Einbindung von SUTl in das gesamte Transport- und Regulationssystem des Saccharose-Transports ist jedoch völlig unklar (Ward et al . , Int. Rev. Cytology (1998) 178, 41-71, Kühn et al . , J. Exp . Bot. (1999) 50, 935-953) . Dies gilt ebenfalls für die Identifizierung eines (Erst-) Beladungscarriers, der für eine eventuell vorhandene zweite kinetische Komponente HCS (high capacity/low affinity System) verantwortlich ist. Hinzu kommen aller Wahrscheinlichkeit nach vorliegende große Unterschiede in den Saccharose-Transportmechanismen zwischen den unterschiedlichen Pflanzenspezies (Lalonde et al . , a. o. 0.) und die Vielzahl potenzieller Regulationsmechanismen sowie Einflussfaktoren auf transcriptionel- ler und post-transcriptioneller Ebene (Kühn et al . , Science (1997)275, 1298-1300). In Lalonde et al .
(a. o. O.) wird gemutmaßt, dass neben den Saccharose-Transportern weitere funktionelle Elemente am Saccharose-Transport beteiligt sind, beispielsweise Regulator- und Sensorelemente. Die außerordentliche Komplexität des Saccharose-Transportsystems erlaubt bisher jedoch keine gezielte Zuordnung von Strukturen zu Funktionen und eine Vorhersage von deren Wechselwirkungen in einer Art und Weise, die es ermöglicht, gezielte Eingriffe in den Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transport mit dem Ziel vorzunehmen, hinsichtlich bestimmter Eigenschaften verbesserte Pflanzen zu erhalten. Dies lässt sich am deutlichsten daran erkennen, dass eine Überexpression von SUT1 keine Änderungen in der Allokati- on von Assimilaten erbrachte, sondern lediglich einen Einfluss auf das Blühverhalten zeigte (US 6,025,544; P 44 39 748.8) .
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht also darin, Verfahren und Mittel für die Herstellung einer gentechnisch modifizierten Pflanze bereitzustellen, die es erlauben, gezielt in die Saccharid-, insbesondere Saccharose-Transportströme der Pflanze dergestalt einzugreifen, dass eine Pflanze mit verbesserten Eigenschaften, z. B. höheren Zuckergehalten in Sink-Organen, insbesondere in den Ernteorganen, erzeugt werden kann.
Die Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Modifizierung des Saccharid-Fluxes und/oder der Saccharid- Konzentration, insbesondere Saccharose-Flux und/oder -konzentration in Geweben einer Pflanze, gemäß dem in einer Pflanze eine modifizierte Aktivität eines Saccharid-Transporters mit geringer Saccharid-Affinitat, aber hoher Saccharid- Transportkapazität erzeugt wird. Die erfindungsgemäße Lehre stellt erstmals Mittel und Verfahren zur Verfügung, ganz gezielt den Saccharid-Flux und die Saccharid-Konzentration in den verschiedenen Geweben der Pflanze durch Modifizierung der Aktivität eines Saccharid-Transporters mit niedriger Saccharid-Affinität und hoher Saccharid-Transport- kapazität zu beeinflussen, d. h. zu modifizieren, wobei im Verlauf • dieses Verfahrens eine modifizierte Pflanze hergestellt wird. Die vorliegende Erfindung stellt erstmals ein HCS-System, also ein Saccharose-Transportsystem mit hoher Transportkapazität für Saccharose, aber niedriger Affinität zu Saccharose, bereit das, insbesondere in Mikrovenen einer Pflanze, exprimiert wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Modifizierung der Aktivität des Saccha- ridtransports, insbesondere eines Saccha- ridtransporters eine gegenüber der Wildtyp- Aktivität erfolgte Veränderung der normalerweise vorliegenden Aktivität verstanden, z. B. eine vollständige Unterdrückung, Reduzierung oder Aktivitätssteigerung. Diese Aktivitätssteigerung kann auf eine veränderte Aktivität des Proteins selbst zurückzuführen sein, bewirkt z. B. durch posttransc- riptionelle Modifikationen wie Phosphorylierungen oder Dephosphorylierungen. Sie kann aber auch auf eine geänderte Expressionsrate des codierenden Gens, eine geänderte Stabilität oder Translationsrate der gebildeten mRNA oder ähnliches, also auch auf eine geänderte Menge vorhandenen Saccharid- Transporters in einem Gewebe zurückgehen. Die Modifizierung der Aktivität des Saccharid-Transporters kann auch durch die Modifizierung der Aktivität eines die Aktivität des Saccharid-Transporters kontrollierenden oder regulierenden Elements, z.B. eines Sensor- oder Regulatorproteins erfolgen.
Unter einem Saccharid wird in bevorzugter Ausführungsform Saccharose und unter einem Saccharid- Transporter ein Saccharose-Transporter, insbesondere, falls nicht anders angegeben, SUT4 (Sucrose transporter 4) verstanden, also ein Transporter mit geringer Affinität zu Saccharose und hoher Transportkapazität für Saccharose.
Geringe oder niedrige Affinität im Sinn der vorliegenden Erfindung ist eine Affinität, die unterhalb der SUTl-Affinität liegt, z.B. um 50%, vorzugsweise 80 %, 100 %, 200 %, 300 % oder 400 % unterhalb der von SUT1 liegt, z.B. eine Affinität Km > 2,7 mM, vorzugsweise > 4 mM, > 6 mM, > 8 mM, > 10 mM, > 15 mM, > 20 mM und bevorzugt > 25, insbesondere 26 mM. Hohe Transportkapazität im Sinn der vorliegenden Erfindung ist eine oberhalb der Transportkapazität von SUT1 liegende Transportkapazität, z.B. um 50 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % oder 500 % oberhalb der von SUT1. Bevorzugt ist eine Transportkapazität Vmχ von > 0,7, insbesondere > 1, > 1.5, > 2, > 3, > 3,5 insbesondere 3,6 n ol cm-2 in^1.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis und die daraus abgeleitete Lehre zugrunde, mit technischen, insbesondere gentechnischen, Mitteln, eine gegebenenfalls nur endogen vorhandene Aktivität des genannten Saccharid-Transporters zu beeinflussen oder eine solche Aktivität in eine Pflanze neu einzuführen .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff Sink-Organe Organe oder Gewebe von Pflanzen verstanden, die in ihrer Nettobilanz Photoassimilate importieren müssen. Derartige Pflanzenorgane oder Gewebe sind junge Blätter, Knollen, Früchte, Wurzeln, Blüten, reproduktive Organe, Holz, Markgewebe, Knospen, Samen, Rüben etc.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff Source-Organ Organe oder Gewebe von Pflanzen verstanden, die in ihrer Nettobilanz Photoassimilate im Überschuss aufweisen und diese exportieren können. Source-Organe sind z. B. ausgewachsene Blätter und keimende Samen, Knollen und Zwiebeln. Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expressionsrate des erfindungsgemäß modifizierten Saccharid-Transporters beziehungsweise eine erhöhte Transportrate beispielsweise in Geleitzellen und/oder Siebelementen die Saccharid-, insbesondere Saccharose-Beladung des Phloems, insbesondere unter hoher Lichtintensität oder CO2 Konzentration, beträchtlich erhöht, wodurch vorteilhafterweise Pflanzen mit Ernteorganen erhalten werden können, die einen erhöhten Saccharose-Gehalt aufweisen. Die Erfindung löst das Problem also insbesondere durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Modifizierung des Saccharid-Fluxes und/oder der Saccharid-Konzentration in Geweben einer Pflanze, wobei die Aktivität eines Saccharid-Transporters mit niedriger Affinität zum Saccharid und hoher Transportkapazität für das Saccharid modifiziert wird durch das Transformieren mindestens einer Pflanzenzelle mit mindestens einem Vektor, der die Modifizierung des Saccharid-Transporters ermöglichende Nucleotidsequenzen enthält, und wobei die diese Nucleotidsequenzen stabil integriert enthaltende Pflanzenzelle zu einer Pflanze regeneriert wird, in deren Gewebe ein modifizierter Saccharid- Flux und/oder eine modifizierte Saccharid- Konzentration, jeweils im Vergleich mit einer Wildtyp-Pflanze, also einer nicht erfindungsgemäß transformierten Pflanze, vorhanden ist. Die Erfindung stellt also die Lehre bereit, einen Saccharid- Transporter mit hoher Transportkapazität für das Saccharid und mit niedriger Affinität zu dem Saccharid gezielt zu modifizieren, wobei dies mittels einer gentechnischen Manipulation der Pflanze geschieht. Erfindungsgemäß kann dies geschehen, indem eine Pflanzenzelle mit mindestens einem die codierenden Nucleotidsequenzen des Saccharid-Transporters enthaltenden Vektor transformiert wird, der vorzugsweise nach stabiler Integration der Nucleotidsequenzen in das Genom der transformierten Zelle eine- Überexpression des Saccharid-Transporters in transformiertem Gewebe ermöglicht.
Die Überexpression der erfindungsgemäß eingesetzten Nucleotidsequenz des genannten Saccharid- Transporters, z . B. in Siebelementen oder Geleitzellen, führt zu einer verstärkten Saccharose- Beladung des Phloems. Mittels der erfindungsgemäßen Verfahrensweise hergestellte Pflanzen weisen z. B. einen höheren Kohlenhydratgehalt in Sink-Organen, beispielsweise Wurzeln, Früchten, Knollen, Blüten oder Samen auf. In vorteilhafter Weise ergibt sich ein höherer Kohlenhydratgehalt insbesondere in Ernteorganen der Pflanze, die häufig Sink-Organe sind. Wird die erfindungsgemäße Verfahrensweise in einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung bei ölhaltigen Pflanzen, z. B. Raps, eingesetzt, kann ein erhöhter Ölgehalt in den Ernteorganen festgestellt werden. Als besonders vorteilhaft erweist sich die Beobachtung, dass die Anzahl der Ernteorgane pro Pflanze gesteigert und auch deren Gewicht vergrößert werden kann.
Die erfindungsgemäß vorgesehene Überexpression des Saccharid-Transporters der genannten Art in Source- Organen kann vorteilhafterweise auch dazu führen, dass die Blütezeit der transformierten Pflanze verändert wird. Da der Transport von Zucker im Phloem häufig reziprok mit dem Aminosäuretransport im Phloem gekoppelt ist, kann durch die erfindungsgemäß vorgesehene Erhöhung des Saccharid-Gehaltes im Phloem der unerwünschte Aminosäuregehalt in Sink-Organen, z. B. Kartoffelknollen oder Pfahlwurzeln der Zuckerrübe, gesenkt werden. Schließlich ermöglicht es die erfindungsgemäße Verfahrensweise, die Glycosylie- rungsrate endogen in Pflanzen vorhandener Substanzen oder auch exogen applizierter Substanzen wie Xenobiotika, z. B. Herbizide oder Pestizide, zu erhöhen und so deren Mobilität zu steigern.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die vorstehend beschriebene Überexpression in Source-Organen dadurch erreicht, dass SUT4-codierende Nucleotidsequenzen unter der Kontrolle Source-spezifischer Promotoren, also insbesondere blattspezifischer und/oder ge- leitzellenspezifischer Promotoren, in einen Vektor cloniert, in mindestens eine Pflanzenzelle transformiert und, vorzugsweise stabil, in das Genom der Pflanzenzelle integriert werden.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann vorgesehen sein, konstitutiv exprimierende Promotoren wie den 35SCaMV-Promotor, den geleitzellenspe- zifischen rolC-Pro otor aus Agrobakterium oder den Enhanced PMA4-Promotor (Morian et al . , Plant J (1999) 19, 31-41) einzusetzen.
Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, die Modifizierung des Saccha- rid-Transports dadurch vorzunehmen, dass die Akti- vität des Saccharid-Transporters durch Überexpression in Blattmesophyllgewebe und/oder Blattepider- mis modifiziert wird. Die spezifische Expression SUT4-codierender Nucleotidsequenzen in diesen Geweben führt zu einem kompetitiven Effekt hinsichtlich des endogenen in den Siebelementen aktiven Saccharose-Transporters, so dass der Kohlenhydrat-Gehalt in den Blättern erhöht wird. Die auf diese Weise hergestellten Pflanzen haben größere Blätter, die überdies ein verbessertes Schutzpotential gegenüber Pathogenen aufweisen. Dies liegt unter anderem daran, dass Gene mit Abwehrfunktion durch einen erhöhten Zuckergehalt aktiviert werden. Zudem ergibt sich eine dickere Cuticula und ein höherer Gehalt an Sekundärmetaboliten, die unter anderem als Vorläufer für die Herstellung bioabbaubarer Kunststoffe wie PHA (Polyhydroxyalkanoate) dienen. Die in dieser bevorzugten Ausführungsform vorgesehene Expression in Blattmesophyll und -epidermis kann durch die in einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorgesehene Verwendung des StLSl/L700 Promotors (Stockhaus et al . , Plant Cell (1989) 1, 805-813), anderer epidermisspezifischer Promotoren oder des PFP-Promotors (Palisaden-Parenchym) (WO 98/18940) zur Expression der SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen erreicht werden.
In einer weiteren .bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, eine Überexpression des Saccharid-Transporters spezifisch in sink-Zellen oder Organen, insbesondere sich entwickelnden Samen einer Pflanze vorzusehen. Dadurch kann unter anderem eine verbesserte Keimungsrate erzielt werden, da sowohl der Kohlenhydrat- als auch insbesondere der Ölgehalt der Samen erhöht wird.
Die in dieser Ausführungsform bevorzugt einzusetzenden gewebespezifischen Promotoren für die Expression der SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen in Samengewebe sind z.B. der Vicilin-Promoter aus Pi- sum sativum (Newbigin et al., Planta (1990) 180, 461-470) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein vorgenanntes Verfahren vorgesehen, wobei eine Überexpression des Saccharid-Transporters durch Verwendung gewebespezifischer regulatorischer Elemente für Epidermis und Parenchym von Sink-Organen vorgesehen ist. Die verstärkte Expression des erfindungsgemäß eingesetzten Saccharid-Transporters in Sink-Organen erhöht deren Saccharid-Aufnahmekapazität und den Saccharid-Flux in das Sink-Gewebe. Erfindungsgemäß hergestellte Pflanzen weisen daher beispielsweise größere, farbigere und/oder eine höhere Zahl von Blüten, größere Samen, größere Knollen oder größere Pfahlwurzeln auf. Die Sink-Organe können sich ferner durch einen höheren Kohlenhydrat- und Ölgehalt, eine verbesserte Struktur, insbesondere Festigkeit, ein schnelleres Wachstum und/oder gegebenenfalls verbesserte Kältetoleranz aufgrund des höheren Gehalt osmotisch aktiver Substanzen auszeichnen. Zudem ist es möglich, die Blütezeit und -dauer ebenso wie die Entwicklung der Früchte zu beeinflussen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, für die vorgenannte Über- expression in Sink-Epidermis und -Parenchym den AAP-1 (Aminosäurepermease 1) -Promotor, z.B. den A- rabidopsis-Promoter AtAAPl (Expression in Endosperm und während früher Embryoentwicklung) oder AtAAP2 (Expression in Phloem des Funiculus) (Hirner et al., Plant J. (1998) 14, 535-544, den B33 (Pata- tin) -Promotor (Rocha-Sosa et al . , EMBO J. (1998) 8, 23-29) (Zugangsnummer: X14483; alle hier genannten Zugangsnummern beziehen sich auf folgende Genbank, falls nicht anders angegeben: National Center for Biotechnology Information, National Library of Me- dicine, Bethesda, MD 20894, USA), insbesondere für Knollen und Pfahlwurzeln, den Vicilin (Speicherprotein) -Promotor aus Pisum sativum (Newbigin et al . , Planta (1990) 180, 461-470) (Zugangsnr. M73805) und/oder Samen- und Blüten-spezifische Promotoren einzusetzen .
Die Erfindung betrifft auch die Modifizierung der Saccharid-Transport-Aktivität in Geweben einer Pflanze, wobei die Aktivität eines Saccharid- Transporters, insbesondere Saccharose-Transporters, mit hoher Transportkapazität für Saccharose und niedriger Affinität zu Saccharose unterdrückt oder reduziert, insbesondere inhibiert oder cosuppri- miert wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Aktivität des Saccharid-Transports dadurch unterdrückt bzw. reduziert werden, dass Pflanzenzellen mit Vektoren transformiert werden, die den erfindungsgemäß eingesetzten Sacc arid-Transporter- codierende Nucleotidsequenzen oder für eine Anti- sense-Repression ausreichende Teile davon in Anti- sense-Orientierung zu einem Promotor aufweisen und vorzugsweise stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert werden. Die Expression dieser Antisense- RNA unterdrückt bzw. reduziert die Bildung des genannten endogen vorhandenen Saccharid-Transporters, sodass der durch diesen Transporter bewirkte Sac- charid-Flux manipuliert werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, die Aktivität dieses Saccharid- Transporters durch in die Pflanze, eingeführte Co- suppressionseffekte zu reduzieren bzw. zu unterdrücken. Zur Erzielung dieser Cosuppressionseffekte werden in bevorzugter Ausführungsform mehrere Kopien eines Vektors in mindestens eine Pflanzenzelle, insbesondere stabil in deren Genom, eingebracht, der den Saccharid-Transporter-codierende Nucleotidsequenzen oder Teile davon aufweist und wobei diese Kopien im Genom integriert werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, die Aktivität des Saccharid-Transporters dadurch zu unterdrücken bzw. zu reduzieren, dass, vorzugsweise gewebespezifisch, endogen vorhandene, also im nicht-transformierten Wildtyp bereits vorliegende Nucleotidsequenzen des erfindungsgemäß eingesetzten Saccharid-Transporters mutagenisiert werden, beispielsweise durch Transposonmutagenese .
Schließlich kann erfindungsgemäß vorgesehen sein, die Aktivität oder Expression des Saccharose- Transporters durch RNA-Doppelstrang-Inhibierung zu reduzieren oder zu unterdrücken. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die vorgenannten Techniken zur Unterdrückung oder Reduzierung der Aktivität des Saccharid-Transporters mit geringer Affinität zu Saccharose, aber hoher Saccharose- Transportkapazität eingesetzt, um beispielsweise in Source-Geweben, z. B. Blättern, einen höheren Gehalt an Kohlenhydraten, insbesondere Saccharose, aufzubauen. Dies kann in besonderer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch vorstehend beschriebene Reduzierung oder Unterdrückung der Sac- charid-Transportkapazität in Source-Organen geschehen. Dadurch wird die Struktur und Festigkeit von Sink-Organen reduziert, während der Saccharosebzw. Kohlenhydratgehalt in Source-Organen ansteigt. Hierdurch kann eine höhere Süße von Ernteorganen bestimmter Pflanzen erreicht werden, deren Blätter als Nahrungsmittel dienen, z. B. Salat oder Spinat. Zudem können -durch Kompetition erzielte- Vorteile erreicht werden, wie sie vorstehend bereits für die Überexpression des Saccharid-Transporters in Blattmesophyll und Epidermis beschrieben wurden. Schließlich kann durch den reduzierten Saccharose- Flux in den Stamm einer Pflanze dessen Länge reduziert werden, was insbesondere für die Herstellung von Zwergvarianten von Pflanzen, z. B. bei bestimmten Apfelsorten, oder ähnlichem wünschenswert ist.
In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, die Aktivität des Saccharid-Transporters in den Schließzellen zu unterdrücken oder zu reduzieren, beispielsweise durch in Schließzellen vorgenommene Mutagenese endogen vorhandener Nucleotidsequenzen, die den Saccharid-Transporter codieren, durch Cosuppressions-Effekte, RNA-Doppelstrang- Inhibierung oder durch Verwendung von Antisense- Konstrukten. Durch die Modifizierung von Saccharid- Transportvorgängen und den damit verbundenen Veränderungen in der Bereitstellung von Energie und os- motisch aktiven Stoffen in Schließzellen kann die Kapazität zur Öffnung oder zum Schließen der Stomata geändert werden, insbesondere erhöht oder reduziert werden. Eine höhere Öffnungsrate der Stomata erlaubt eine verbesserte Zufuhr für C02, so dass die Photosyntheserate verbessert wird. Wird erfindungsgemäß das Öffnen der Stomata verhindert oder in seiner Frequenz reduziert, kann eine erhöhte Trockenresistenz der Pflanze erzielt werden. In besonders bevorzugter Weise wird für die Erzielung der vorgenannten Effekte ein Vektor verwendet, in dem den erfindungsgemäß eingesetzten Saccharid- Transporter-codierende Nucleotidsequenzen in Senseoder Antisense-Orientierung z. B. unter der Kontrolle eines Schließzellen-spezifischen Promotors, z. B. des KATl-Promotors (Nakamura et al . , Plant Physiol. (1995) 109, 371-374) stehen.
Da der Saccharidtransporter SUT4 auch in sink- Organen exprimiert wird, kann vorgesehen sein, den Saccharid-Import in die sink-Zellen oder Organe oder bevorzugt in bestimmte sink-Zellen oder Organe, besonders bevorzugt in die Blüte zu reduzieren. Dadurch kann erreicht werden, daß in Source-Zellen oder Organen Kohlenhydrate akkumulieren, die für andere Synthesewege nützlich sind und es kann die relative Aktivität einzelner sink-Zellen zugunsten anderer verschoben werden um somit die Erträge qualitativ und quantitativ zu verbessern. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ferner vorgesehen, die vorgenannten Verfahren durchzuführen, wobei zusätzlich zu den oder anstelle der den erfindungsgemäß eingesetzten Saccharid-, insbesondere Saccharose- Transporter, besonders bevorzugt SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen weitere Nucleotidsequenzen zur Transformation verwendet werden, die im funktionel- len Zusammenhang mit der Saccharose-Konzentration und dem Saccharose-Flux in Geweben eine Pflanze stehen .
In besonders bevorzugter Ausführungsform sind dies Nucleotidsequenzen, die SUT1 oder SUT2 codieren, z. B. genomische oder cDNA-Nucleotidsequenzen.
SUT1 genomische und cDNA-Sequenzen sind z. B. aus der WO94/00574 (Kartoffel, Spinat), Riesmeier et al . , a. a. 0. (Kartoffel), Riesmeier et al . , (EMBO J. (1992)11, 4705-4713 (Spinat)), Bürkle et al . ,
(Plant Physiol. (1998)118, 59-68 (Tabak)), Hirose et al., (Plant Cell Physiol. (1997)38, 1389-1396
(Reis)), Weig und Komor (J. Plant Physiol.
(1996)147, 685-690 (Ricinus)), Weber et al . , (The Plant Cell (1997)9, 895-908 (Vicia faba) ) , Shakya und Sturm (Plant Physiol. (1998)118, 1473-1480
(Karotte)), Tegeder et al . (The Plant Journal
(1999) Plant J. (1999) 18,151-161 (Pisu sativum) ) , Noiraud et al . (Poster abstract llth Inter. Workshop on Plant Membrane Biology, Cambridge, UK
(1998) (Apium graveolens) ) , Picaud et al . , (Poster abstract llth Inter. Workshop on Plant Membrane Biology, Cambridge, UK (1998) (Vitis vinifera) ) und Zuckerrübe (Zugangsnummer: X83850) bekannt, die hinsichtlich der Nucleotidsequenzen, der Aminosäuresequenz von SUTl und deren Gewinnung vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen sind und für die im Zusammenhang mit der vorliegenden Lehre auch Schutz begehrt wird. Erfindungsgemäß eingesetzte SUTl-codierende Nuclei- otidsequenzen ebenso wie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 22 und 23 sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. SUTl stellt einen Saccharose-Transporter mit hoher Affinität zu Saccharose, aber geringer Transportkapazität für Saccharose dar. Eine Coexpression von Saccharose-Transportern mit unterschiedlichen Affinitäten zu Saccharose in ein und demselben Gewebe, z.B. in Siebelementen, erlaubt eine regulierte und den tatsächlichen in der Pflanze vorhandenen Gegebenheiten gerecht werdende Manipulation des Saccharose-Fluxes .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor zur Transformation der mindestens einen Pflanzenzelle verwendet, der SUT2-codierende Nucleotidsequenzen aufweist. SUT2 fungiert erfindungsgemäß insbesondere als Regulator und Sensor. SUT2 weist überdies die biologische Aktivität eins niedrig affinen Saccharose-Transports auf. Die Transport-Raten von SUT2 sind ebenfalls niedrig. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, ist SUT2 ein Regulator und/oder Sensor des Saccharose-Transporters, der insbesondere seine eigene Transportaktivität feststellen und gegebenenfalls weiter vermitteln kann. Seine Transportaktivität kann einerseits als funktionaler Bestandteil seiner Sensoraktivität und andererseits kann seine Sensoraktivität als funktionaler Bestandteil seiner Transportaktivität angesehen werden. SUT2 mit seiner niedrigen Affinität für Saccharose ist erfindungsgemäß ein Flux-Sensor, der möglicherweise ein Substrat, nämlich Saccharose, transportiert und eine Signalkaskade verwendet beziehungsweise Bestandteil selbiger darstellt, die die Transportrate misst. Die Affinität von SUT2 für Saccharose ist geringer als die von SUT4. Erfindungsgemäß konnte in besonders bevorzugter Ausführungsform gezeigt werden, dass die N-Termini von Proteinen der SUT/SUC-Genfamilie eine modifizierte Affinität gegenüber ihrem Substrat, insbesondere Saccharose vermitteln. Insbesondere die N-Termini von SUT2, aber auch von SUTl vermitteln eine modifizierte Saccharose-Affinität, im Fall von SUT2 niedrige und im Fall von SUTl hohe Affinität für Saccharose .
Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von N-Termini von Saccharose-Transportern beziehungsweise diese codierender Nucleotidsequenzen, insbesondere pflanzlichen Saccharose-Transportern zur Modifizierung des Saccharose-Transports oder des Saccharose-Sensings in Pflanzen, insbesondere zur Herstellung modifizierter Saccharose- Transporter und -Sensoren mit modifizierter Affinität für Saccharose in Pflanzen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von SUT2 und/oder SUT2-codierenden DNA-Sequenzen, insbesondere des SUT2-loops als Regulator und Sensor des Saccharose-Transports, insbesondere zur Regulation der SUT4- und/oder SUTl-Aktivität z.B. in Pflanzen- oder Pilzzellen. Überdies konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, dass SUT2 durch Saccharose induzierbar ist. SUT2 reguliert die relative Aktivität von in demselben Zelltyp, z. B. in den Siebelementen, vorhandenen Saccharose-Transportern. Insbesondere reguliert SUT2 die Aktivität des Saccharose- Transporters SUTl, der hohe Saccharose-Affinität, aber geringe Transportkapazität aufweist und den SUT4-Saccharose-Transporter mit hoher Transportkapazität, aber geringer Saccharose-Affinität. Diese Regulation kann über die Kontrolle der Expression, der Proteinaktivität, z. B. durch Proteinmodifikation oder der turnover-Rate von mRNA oder Protein erfolgen und in einer Aktivitätssteigerung oder -reduzierung resultieren. SUT2 wird in Pflanzen insbesondere in den großen Blattadern ausgewachsener Blätter, Blüten und Sink-Organen exprimiert.
Die Erfindung betrifft daher auch die vorgenannten N-Termini und Zentralschleifen beziehungsweise Loops von Proteinen aus der SUT/SUC-Genfamilie, insbesondere von SUTl, SUT2 und/oder SUT4 sowie die diese Bereiche codierenden Nucleotidsequenzen. Diese sind in bevorzugter Ausführungsform dargestellt in SEQ ID Nr. 24, 25 und 26. Die N-Termini von LeSUT2 (Lycopersicon esculentum) und StSUT2 (Sola- num tuberosum) umfassen die ersten 62 Aminosäuren des Proteins und sind codiert durch die Nucleotide 1 bis 186 von SEQ ID Nr. 4 (Lycopersicon esculentum) beziehungsweise Nr. 29 (Solanum tuberosum). Die Zentralschleife von LeSUT2 wird durch die Nucleotide 844 bis 1131 von SEQ ID Nr. 4 und von StSUT2 durch die Nucleotide 847 bis 1134 von SEQ ID Nr. 29 codiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, die, vorzugsweise in einem Vektor, angeordneten SUTl-, SUT4- und/oder SUT2-codierenden Sequenzen in Sense- oder Antisense-Orientierung zu mindestens einem regulatorischen Element, insbesondere einem Promotor, z. B. je nach gewünschter Ge- webespezifität einen der vorgenannten Promotoren, in Pflanzenzellen zu transformieren, wobei nach Integration im Genom und Expression des Produktes die Aktivität von cotransformierten und/oder endogen vorhandenen SUT4 modifiziert wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein vorgenanntes Verfahren, wobei ein Vektor in die Pflanzenzelle transformiert wird, welcher SUT2- codierende Nucleotidsequenzen enthält, vorzugsweise in Sense- oder Antisenseorientierung unter der operativen Kontrollen eines regulatorischen Elementes, insbesondere eines Promotors. Es kann dabei vorgesehen sein, den die SUT2-codierenden Nucleotidsequenzen enthaltenden Vektor ohne weitere Vektoren, die z. B. SUT4- oder SUTl-codierende Nucleotidsequenzen enthalten, zu transformieren. Die Transformation, Integration und Expression der SUT2- codierenden Nucleotidsequenzen führt aufgrund der erfindungsgemäßen Lehre, dass SUT2 insbesondere ein Saccharosekonzentrations-Sensor und -regulator mit den vorstehend genannten Transportereigenschaften sowie Saccharose-Flux-Sensor und -regulator ist, zu einer Modifizierung der Aktivität des Saccharosetransports in der transformierten Pflanze, insbesondere der endogen vorhandenen Saccharose- Transporter, nämlich SUT4 oder/und SUTl. Diese Re- gulation kann auf transkriptionellem oder posttranskriptionelle Niveau erfolgen, beispielsweise durch direkte Proteininteraktion oder indirekt über Signaltransduktion.
Selbstverständlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung der SUT2-codierenden Nucleotidsequenzen oder von Teilen davon, insbesondere der den N- terminalen Proteinbereich codierenden Nukleotidse- quenz, zur Transformation von Pflanzenzellen, wobei diese zusammen mit SUTl- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen transformiert werden können. Auch in einem solchen Fall kann die Überexpression, Cosuppression oder Antisense-Repression von SUT2 die Aktivität von SUTl und/oder SUT4 modifizieren, z. B. erhöhen oder reduzieren. In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen sein, Teile der SUT2-codierenden Nucleotidsequenzen, insbesondere die den N- terminalen Proteinbereich codierenden Nucleotidsequenzen von SUT2 (SEQ ID Nr. 24) oder die den zentralen, cytoplasmatischen Loop-codierenden Nucleotidsequenzen (SEQ ID Nr. 26) im Rahmen von chimären Genkonstrukten einzusetzen, die Proteine mit der biologischen Aktivität eines Saccharose- Transporters codieren und zum Beispiel als N- Terminus beispielsweise die SUT2 codierenden Nucleotidsequenzen sowie im Zentralbereich und am C- terminalen Ende Nucleotidsequenzen eines anderen Saccharose-Transporters, zum Beispiel von SUTl oder SUT4 aufweisen. Derartige SUT2-Nucleotidsequenzen, die SUT2, oder Teile von SUT2 enthalten, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch als modifizierte SUT2-Nucleotidsequenzen bezeichnet. Als Regulator interagiert SUT2 mit anderen Proteinen, insbesondere mit Regulatoren, Signaltransduk- tionsfaktoren und anderen Saccharosetransportern. Daher können unter Nutzung von SUT2 durch Interak- tionsklonierung weitere Regulatoren identifiziert werden, für die ebenfalls Schutz begehrt wird.
Die Erfindung betrifft auch, vorzugsweise isolierte und gereinigte, Regulatorproteine und Sensorproteine sowie diese codierende Nucleotidsequenzen, die die zentrale cytoplasmatische Schleife von SUT2 enthalten, insbesondere chimäre Proteine und Nukleinsäuren mit N- und C-terminalen Bereichen von anderen Sacharosetransportern, beziehungsweise diese codierende Nucleotidsequenzen, wobei diese chimären Proteine beziehungsweise Nucleinsäuren die Zentralschleife (loop) von SUT2 enthalten. Dem zentralen cytoplasmatischen Loop oder Schleife kommt eine biologische Aktivität als Regulatorelement und/oder Sensor und/oder Signaltransduktor zu.
Die Erfindung betrifft in einer Ausführungsform also die vorgenannten Verfahren zur Modifizierung der Aktivität eines Saccharose-Transporters mit niedriger Affinität zu Saccharose, aber hoher Transportaktivität für Saccharose im Rahmen dessen bekannte bzw. modifizierte SUT4-, SUTl- und/oder SUT2- codierende Nucleotidsequenzen eingesetzt werden, um die Modifizierung zu erreichen und eine verbesserte transgene Pflanze zu erhalten.
Die Erfindung betrifft also in einer weiteren Ausführungsform auch Verfahren zur Herstellung trans- gener, modifizierter Pflanzen, die eine veränderte Aktivität des genannten Saccharose-Transporters aufweisen und, vorzugsweise stabil im Genom integriert, modifizierte SUTl-, SUT2- und/oder SUT4- Nucleotidsequenzen enthalten. Die Erfindung betrifft auch die so hergestellten transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen, Organe oder Teile von Organen und Pflanzen, die sich durch die veränderte Aktivität des genannten Saccharose-Transporters auszeichnen und mindestens eine der genannten Nucleotidsequenzen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Nucleotidsequenzen, insbesondere Genen für Sac- charid-Transporter, wie SUT- und SUC-Genen, vorzugsweise für SUTl; SUT2; SUT4; SUTl und SUT2; SUTl und SUT4; SUT2 und SUT4; SUTl und SUT2 und SUT4 in modifizierter Form enthalten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer modifizierten Nucleotidsequenz eine von der Wildtyp- Sequenz, insbesondere dem Wildtypgen, abweichende Nucleotidsequenz verstanden, beispielsweise eine Abweichung, die auf Nucleotidinsertionen, inversionen, -deletionen, -austauschen, -additionen oder ähnlichem beruhen. Beispielsweise stellen modifizierte Nucleotidsequenzen auch solche Gene dar, die die codierende Nucleotidsequenz des Wildtypes enthalten, wobei diese codierende Nucleotidsequenz operativ in Sense- oder Antisense-Orientierung mit einem heterologen Promotor z. B. einem gewebespezifischen oder konstitutiv exprimierenden Promotor verknüpft sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann eine modifizierte Nucleotidsequenz auch dann vorliegen, wenn sie exakt der Wildtyp-Sequenz entspricht, jedoch in zusätzlicher Kopienzahl oder/und an einem anderen Ort im Genom als die natürlicherweise vorkommende Sequenz vorliegt. Eine modifizierte Nucleotidsequenz liegt auch dann vor, wenn die natürlicherweise endogen vorkommenden Nucleotidsequenz durch Mutagenese, beispielsweise Transposon-Mutagenese, geändert wurde. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter modifizierten Genen also solche Nucleotidsequenzen verstanden, die in der Nucleotidsequenz ihrer regulatorischen und/oder Protein-codierenden Bereiche Abweichungen, z. B. Insertionen, Additionen, Dele- tionen, Austausche oder ähnliches gegenüber der Wildtypsequenz enthalten, also auch als Mutanten, Derivate oder funktionelle Äquivalente bezeichnet werden können. Modifizierte Nucleotidsequenzen beziehungsweise modifizierte Gene können auch chimäre Nucleotidsequenzen oder Gene sein, also beispielsweise solche Protein codierende Bereiche, die sich aus zwei oder mehreren unterschiedlichen natürlicherweise nicht zusammen vorkommenden Nucleotidsequenzen zusammensetzen, beispielsweise Konstrukte, die als N-terminale Nukleotidsequenz SUT2 codierende Sequenzen (SEQ ID Nr. 24) und als Zentral- und 3 λ-terminalen Bereich SUTl-codierenden Sequenzen aufweisen. Erfindungsgemäß werden unter modifizierten Genen aber auch solche verstanden, die als 5X- codierenden Bereich Sequenzen des SUTl-Genes (zum Beispiel SEQ ID Nr. 25) und als Mittelbereich o- der/und 3 -Bereich Sequenzen des SUT2-Gens enthalten .
Modifizierte Gene können demgemäss z. B. die Wild- typ-codierenden Sequenzen und heterologe Promotoren z. B. aus anderen Organismen oder von anderen Genen enthalten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Gen eine unter der operativen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes stehende Protein-codierende Nucleotidsequenz verstanden.
Die Erfindung betrifft auch Mittel zur Modifizierung des Saccharose-Transports . Diese Mittel sind Nucleinsauremolekule, codierend einen Saccharid- Transporter mit niedriger Saccharid-Affinität und hoher Transportkapazität für das Saccharid oder Teile davon, insbesondere Saccharose, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID Nr. 1, 2 oder 27 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen, eines Teils oder eines komplementären Strangs davon, b) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter SEQ ID Nr. 5, 6 oder 28 dargestellten Aminosäuresequenz codieren und c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem der unter a) und b) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Saccharid-Transporter ein Saccharose- Transporter, insbesondere SUT4, z. B. aus Arabi- dopsis (Arabidopsis thaliana, At) , Tomate (Lycopersicon esculentum, Le) oder Kartoffel (Solanum tuberosum, St) . Die vorgenannten Nucleinsauremolekule werden auch als SUT4-codierende Sequenzen bezeichnet . Die Erfindung betrifft auch Nucleinsauremolekule, codierend einen Sensor und/oder Regulator für den Saccharose-Transport in Pflanzen und mit den Eigenschaftes eines niedrig affinen Saccharose- Transporters mit niedrigen Transport-Raten oder Teile davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID Nr. 3, 4, 24, 26 oder 29 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen, eines Teils oder eines komplementären Strangs davon, b) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter SEQ ID Nr. 7, 8 oder 30 dargestellten Aminosäuresequenz codieren und c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem der unter a) und b) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Saccharid-Sensor und/oder -Regulator ein Saccharose-Sensor und/oder Regulator, insbesondere SUT2, z.B. aus Kartoffel, Tomate oder Arabidopsis . Die vorgenannten Nucleinsäuremolekülen werden auch als SUT2 codierende Sequenzen bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß eingesetzten Nucleinsauremolekule können aus natürlichen Quellen isoliert und gereinigt werden, vorzugsweise aus der Kartoffel, oder sie können nach bekannten Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken ist es möglich, verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen oder die bereits bekannten erfindungsgemäß ein- gesetzten Nucleinsauremolekule einzufügen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt, die ebenfalls von der Erfindung erfasst werden. Mutationen im Sinne der Erfindung betreffen auch alle Deleti- onsmutationen, die zu verkürzten Proteinen führen. Durch andere molekulare Mechanismen wie Insertio- nen, Duplikationen, Transpositionen, Genfusion, Nucleotidaustausch aber auch durch Gentransfer zwischen verschiedenen Mikroorganismenstämmen und andere kann es beispielsweise zu Modifikationen der Aktivität und/oder der Regulierung des Proteins kommen. Auf diese Weise können beispielsweise mut- ante Proteine hergestellt werden, die eine veränderte Transportkapazität oder Saccharose-Affinität besitzen und/oder den normalerweise in den Zellen vorliegenden Regulationsmechanismen nicht mehr oder in veränderter Form unterliegen. Des weiteren können erfindungsgemäß mutante Proteine hergestellt werden, die eine veränderte Stabilität, Substrat- Spezifität oder ein verändertes Effektorenmuster oder ein modifiziertes Aktivitäts-, Temperatur-, pH-Wert- und/oder Konzentrations-Profil aufweisen. Weiterhin bezieht sich die erfindungsgemäße Lehre auf Proteine, die eine veränderte aktive Proteinkonzentration, prä- und posttranslationelle Modifikationen zum Beispiel Signal- und/oder Transport- peptide und/oder andere funktionelle Gruppen aufweisen .
Die Erfindung betrifft auch Nucleinsauremolekule, die mit den vorgenannten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren. Hybridisierung bedeutet im Rahmen der Erfindung eine Hybridisierung un- ter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, wie sie in Sambrook et al . (Molecular Cloning. A labo- ratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe, 1989) beschrieben sind, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen. Gemäß vorliegender Erfindung spricht man von einer Hybridisierung, wenn nach Waschen für 15 Minuten mit 2 x SSC und 0,1% SDS bei 52°C, vorzugsweise bei 60°C und besonders bevorzugt bei 65°C, insbesondere für 15 Minuten in 0,5 x SSC und 0,1 % SDS bei 52°C, vorzugsweise bei 60°C und besonders bevorzugt bei 65°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer der in den Sequenzprotokollen angegebenen Nucleotidsequenzen hybridisierende Nucleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsauremolekule kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsauremolekule oder von Teilen dieser Moleküle beziehungsweise des komplementären Stranges erfolgen. Als Hybridisierungspro- be können zum Beispiel Nucleinsauremolekule verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 4 dargestellten Nucleotidsequenzen oder Teile dieser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt werden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nuclein- säuremoleküls übereinstimmt. Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und al- lelische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsauremolekule, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der Nucleinsauremolekule verstanden, die lang genug sind, um das beschriebene Protein zu codieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet im Zusammenhang mit der Erfindung, dass sich die Sequenzen dieser Moleküle von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsauremolekule an einer oder mehreren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, insbesondere eine Identität von mindestens 75 %, vorzugsweise über 80 % und besonders bevorzugt über 90 %, 95 %, 97 % oder 99 % auf Nukleinsäureebene . Dabei weisen die durch diese Nucleinsauremolekule codierten Proteine eine Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 5, 6, 7 oder 8 angegebenen Aminosäuresequenz von mindestens 80 %, vorzugsweise 85 % und besonders bevorzugt von über 90 %, 95 %, 97 % und 99 % auf Aminosäureebene auf. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese (UV- oder Röntgenstrahlen, chemische Agenzien oder andere) eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten han- dein, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten. Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsauremolekule codierten Proteine weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf, wie Aktivität, aktive Proteinkonzentration, posttranslationelle Modifikationen, funktionelle Gruppen, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation und/oder physikalische Eigenschaften, wie das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, pH-Wert-Optimum, isoelektrischer pH-Wert, Temperatur-Optimum und/oder andere.
Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA- als auch um RNA- Moleküle handeln. Erfindungsgemäße DNA-Moleküle sind beispielsweise genomische DNA oder cDNA- Moleküle.
Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, die erfindungsgemäße Nucleinsauremolekule enthalten.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können Vektoren z. B. Plasmide, Liposomen, Cosmide, Viren, Bacteriophagen, Shuttle-Vektoren und andere in der Gentechnik übliche Vektoren sein. Die Vektoren können noch weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einem Wirtsorganismus bewirken oder dazu beitragen. In einer besonderen Ausführungsform werden erfindungsgemäß auch die Vektoren erfasst, bei denen das in ihnen enthaltene Nucleinsäuremolekül mit mindestens einem regulatorischen Element operativ verbunden ist, das die Transcription und Synthese trans- latierbarer Nucleinsauremolekule in pro- und/oder eucaryotischen Zellen gewährleistet. Derartige regulatorische Elemente können Promotoren, Enhancer, Operatoren und/oder Transcriptionsterminations- signale sein. Selbstverständlich können die Vektoren auch Antibiotikum-Resistenzgene, Herbizidresistenzgene also z. B. Selektionsmarker, enthalten.
Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform auch die vorgenannten Vektoren, wobei diese neben der unter Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes stehenden Nucleinsäurese- quenzen, welche das erfindungsgemäße SUT4 und/oder SUT2 codieren, eine ebenfalls unter der Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes stehende Nucleinsäuresequenz enthält, die SUTl codiert. Ein derartiger Vektor weist also die genetische Information für mindestens zwei mit dem Saccharose- Transport befasste Proteine auf. Solche Vektoren erlauben es in besonders einfacher Weise, gezielt und umfassend das System des Saccharose-Transports in einer Pflanze zu modifizieren.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die eines der erfindungsgemäßen Nucleinsauremolekule oder einen der erfindungsgemäßen Vektoren stabil integriert oder transient beinhalten beziehungsweise mit diesem transformiert sind und vorzugsweise in der Lage sind, SUT4 und gegebenenfalls SUTl und/oder SUT2 zu exprimieren. Weiterhin betrifft die Erfindung Wirtszellen, die von einer mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen oder den erfindungsgemäßen Vektoren transformierten Wirtszelle abstammen. Die Erfindung betrifft also Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nucleins uremolekule oder Vektoren enthalten, wobei unter einer Wirtszelle ein Organismus verstanden wird, der in der Lage ist, in vi tro rekombinante Nucleinsauremolekule aufzunehmen und gegebenenfalls die von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierten Proteine zu synthetisieren. Vorzugsweise sind dies pro- caryotische oder eucaryotische Zellen. Vor allem betrifft die Erfindung Mikroorganismen, die die erfindungsgemäßen Vektoren, Derivate oder Teile der Vektoren enthalten, die diese zu einer Synthese von Proteinen mit Saccharose-Transportaktivität befähigen. Die erfindungsgemäße Wirtszelle kann auch dadurch gekennzeichnet sein, dass das eingeführte erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül entweder hetero- log in bezug auf die transformierte Zelle ist, das heißt natürlicherweise nicht in dieser Zelle vorkommt, oder aber an einem anderen Ort oder einer anderen Kopienzahl im Genom lokalisiert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist diese Wirtszelle also eine procaryotische Zelle, vorzugsweise eine gram-negative procaryotische Zelle, besonders bevorzugt eine Enterobakterienzelle. Die Transformation procaryotischer Zellen mit exogenen Nucleinsäuresequenzen ist einem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eucaryotische Zelle sein, wie eine Pflanzenzelle, eine Pilzzelle, zum Beispiel Hefe oder eine tierische Zelle. Verfahren zur Transformation beziehungsweise Transfektion eucaryotischer Zellen mit exogenen Nucleinsäuresequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig.
Die Erfindung betrifft auch Zellkulturen oder Kal- lusgewebe, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Wirtszellen aufweisen, wobei die erfindungsgemäße Zellkultur oder des Kallus insbesondere in der Lage ist, ein Protein mit Saccharose- Transportaktivität zu produzieren.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die erfindungsgemäß eingesetzte Nucleotidsequenz im Vektor verknüpft mit einem Nucleinsäuremolekül, das eine funktionale Signalsequenz zur Weiterleitung des Proteins an unterschiedliche Zellkompartimente oder die Plasmamembran codiert. Diese Modifikation kann beispielsweise in einer Addition einer N- terminalen Signalsequenz einer höheren Pflanze bestehen, aber auch jede andere Modifikation, die zur Fusion einer Signalsequenz an das codierte Protein führt, ist Gegenstand der Erfindung.
Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsauremolekule in procaryotischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli, oder in eucaryotischen Zellen, z.B. in Hefe, ist insofern interessant, als dass auf diese Weise z. B. eine genauere Charakterisie- rung der Aktivitäten der Proteine, die von diesen Moleküle codiert werden, ermöglicht wird.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sind, vorzugsweise gereinigte und isolierte Peptide oder Proteine, codiert durch die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen, insbesondere mit den Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 5 bis 8, 23 bis 26, 28 oder 30, vorzugsweise mit der Aktivität eines Saccharose-Transporters, insbesondere eines Saccharose- Transporters mit geringer Affinität gegenüber Saccharose und hoher Transportkapazität für Saccharose, beziehungsweise mit der Aktivität eines Sensors oder Regulators des Saccharosetransports sowie Verfahren zu deren Herstellung, wobei eine erfindungsgemäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins erlauben und anschließend das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.
Ferner betrifft die Erfindung die mit diesen Proteinen spezifisch reagierenden monoclonalen oder po- lyclonalen Antikörper.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsauremolekule ist es möglich, mit Hilfe -gentechnischer Methoden den Saccharose-Transport in Geweben einer beliebigen Pflanze so zu modifizieren, wie es durch konventionelle, z. B. züchterische Maßnahmen bei Pflanzen nicht möglich war, und ihn dahingehend zu verändern, dass es zur gezielten Saccharose-Konzentrationsänderung in bestimmten Geweben einer Pflanze kommt. Durch eine Erhöhung der Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine, bei- spielsweise durch Überexpression entsprechender Nucleinsauremolekule, oder durch die Bereitstellung von Mutanten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen und/oder unterschiedlicher Temperaturabhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivitäten besitzen, besteht die Möglichkeit der Ertragssteigerung in entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzen. Möglich ist somit die Expression der erfindungsgemäß eingesetzten Nucleinsauremolekule in pflanzlichen Zellen, um die Aktivität der entsprechenden Saccharose-Transporter zu erhöhen, oder die Expression in Zellen, die dieses Protein normalerweise nicht exprimieren. Ferner ist es möglich, die erfindungsgemäß eingesetzten Nucleinsauremolekule nach dem Fachmann bekannten Methoden zu modifizieren, um erfindungsgemäße Proteine zu erhalten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen, bzw. veränderte Temperaturabhängigkeiten oder Substrat- bzw. Produktspe- zifitäten aufweisen. Die Erfindung sieht auch vor, dass das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment oder der Plasmamembran der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisierung in einem bestimmten Kompartiment bzw. der Plasmamembran zu erreichen, muss die codierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment bzw. der Plasmamembran gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al . , EMBO J. (1992)11, 3219-3227; Wolter et al . , Proc. Natl . Acad. Sei. USA (1988)85, 846-850; Sonnewald et al . , Plant S. (1991)1, 95- 106) . Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, die mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß eingesetzten Nucleinsäuremolekül (en) transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen, die von derartigen transformierten Zellen abstammen. Derartige Zellen enthalten ein oder mehrere erfindungsgemäß eingesetzte oder erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül (e), wobei diese (s) vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist/sind, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor. Die Erfindung betrifft auch transgene Pflanzenzellen, deren Genom mindestens zwei stabil integrierte modifizierte Gene aus der Familie der SUT- und/oder SUC-Gene enthält. Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, dass sie mindestens ein erfindungsgemäßes oder erfindungsgemäß eingesetztes Nucleinsäuremolekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt, oder dadurch, dass ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es natürlicherweise nicht vorkommt, d. h. in einer anderen genomischen Umgebung oder in einer anderen als der natürlichen Kopienzahl vorliegt. Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die mindestens eine, bevorzugt jedoch eine Vielzahl von Zellen enthalten, die die erfindungsgemäßen oder die erfindungsgemäß eingesetzten Vektorsysteme oder Derivate oder Teile davon enthalten, und die aufgrund der Aufnahme dieser Vektorsysteme, Derivate oder Teile der Vektorsysteme zu einer Synthese von Proteinen befähigt sind, die eine modifizierte Saccharose-Transportaktivität, insbesondere SUT4-Aktivität, bewirken. Die Erfindung ermöglicht also die Bereitstellung von Pflanzen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen, die die vorgenannten Charak- teristika aufweisen. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monocoty- le als auch dicotyle Pflanzen, wie Graminae, Pini- dae, Magnoliidae, Ranunculidae, Caryophyllidae, Ro- sidae, Asteridae, Aridae, Liliidae, Arecidae und Commelinidae ebenso wie Gymnospermae, Algen, Moose, Farne oder auch Calli, Pflanzenzellenkulturen etc., sowie Teile, Organe, Gewebe, Ernte- oder Vermehrungsmaterialien davon. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, insbesondere um stärkesynthetisierende bzw. stärkespeichernde Pflanzen, wie z. B. Weizen, Gerste, Reis, Mais, Topinambur, Zuckerrübe, Zuckerrohr oder Kartoffel. Die Erfindung betrifft aber auch andere Pflanzen wie Tomate, Arabidopsis, Erbse, Raps, Sonnenblume, Tabak, Roggen, Hafer, Maniok, Salat, Spinat, Wein, Apfel, Kaffee, Tee, Banane, Kokos, Palmen, Bohnen, Pinien, Pappel, Eukalyptus etc.. Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Blüten, Früchte, Samen, Knollen, Wurzeln, Blätter, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc. Zur Expression der erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß eingesetzten Nucleinsauremolekule in sense- oder antisense-Orientierung z. B. in pflanzlichen Zellen werden diese mit regulatorischen DNA- Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression der SUTl-, SUT2 und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen jeder in Pflanzen aktive Promotor in Betracht, z.B. ein Promotor, der konstitutiv exprimiert, oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Einsetzbare Promotoren sind z. B. der Promotor der 35S RNA des Cau- liflower Mosaic Virus (CaMV) und der Ubiquitin- Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, besonders bevorzugt der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al . , a.a.O.) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z. B. der ST-LS1- Pro otor (Stockhaus et al . , Proc. Natl . Acad. Sei. USA (1987)84, 7943-7947, Stockhaus et al . , EMBO J. (1989)8, 2445-2451) oder für eine endosperm- spezifische Expression der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais. Im Vektor kann zudem eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, um dieses zu stabilisieren. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (Gielen et al., EMBO J. (1989)8, 23-29) und sind beliebig austauschbar. Weitere Promotoren werden vorstehend beschrieben.
Für die Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für' derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, Ml3mp- Serien, pACYClδl usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von z. B. E . coli-Zellen verwendet. Transformierte E . coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA- Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden cloniert werden. Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die E- lektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Bei der Injektion und Elektroporati- on von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, sollte ein selektierbarer Marker vorhanden sein.
Je nach Einführungsmethode der SUTl-, SUT2- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Bordersequenz, häufig jedoch die rechte und linke Bordersequenz der Ti- und -Ri-Plasmid-T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri- Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Diese enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selekti- onsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Borderregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet . (1978)163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist beschrieben in EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters. B.V., Alblasserdarn (1985), Chapter V, Fraley et al . , Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 und An et al . EMBO J. (1985)4, 277-287. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate mit Agrobacterium tu efaciens oder Agrobacterium rhizo- genes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial z. B. Blattstücke, Stengelsegemen- te, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensi- ons-kultivierte Pflanzenzellen können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Pro- toplastentransformation sind bekannt (Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants, In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds . ) , Vol. 2, 627- 659, VCH Weinheim New York Basel Cambridge) . Alternative Systeme zur Transformation von monocotylen Pflanzen sind die elektrisch oder chemisch induzierten DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektro- poration von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikro- injektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA- Aufnahme in Embryonen durch Quellung (Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273). Während die Transformation dicotyler Pflanzen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefa- ciens etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, dass auch monocotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierter Vektoren zugänglich sind (Chan et al . , Plant Mol. Biol.
(1993)22, 491-506; Hiei et al., Plant J. (1994)6, 271-282; Bytebier et al . , Proc. Natl . Acad. Sei, USA (1987)84, 5345-5349; Raineri et al . , Bio/Technology (1990)8, 33-38; Gould et al . , Plant. Physiol. (1991)95, 426-434; Mooney et al . ; Plant, Cell Tiss. & Org. Cult . (1991)25, 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol. (1992)20, 1037-1048). Einige der genannten Transformationssysteme sind für verschiedene Getreide etabliert worden: die Elektropo- ration von Geweben, die Transformation von Protoplasten und der DNA-Transfer durch Partikel- Beschuss in regenerierbare Gewebe und Zellen (Jahne et al.; Euphytica 85 (1995), 35-44). Die Transformation von Weizen wird in der Literatur beschrieben
(Maheshwari et al . , Critical Reviews in Plant Science (1995)14(2), 149-178) und von Mais in Brettschneider et al . (Theor. Appl Genet . (1997)94, 737-748) und Ishida et al . (Nature Biotechnology
(1996)14, 745-750). Die Erfindung betrifft auch Identifizierungs- bzw. Screeningverfahren für Modulatoren des Saccharosestoffwechsels, bevorzugt potenzielle Pestizide und Herbizide, wobei SUT4 und/oder SUT2- exprimierende Zellen oder Gewebe, insbesondere erfindungsgemäße Wirtszellen oder Pflanzen, z.B. erfindungsgemäße Hefe- oder Pflanzenzellen in Kontakt mit dem zu untersuchenden potenziellen Modulator, z.B. Pestizid oder Herbizid gebracht und die Wirkung, insbesondere die inhibitorische Wirkung des potenziellen Modulators, z.B. Pestizids oder Herbizids, auf die Aktivität von SUTl, SUT2 und/oder SUT4 quantitativ oder qualitativ nachgewiesen wird. Ebenso kann SUT2 und/oder SUT4 zur Entwicklung von Systemen dienen, die eine verbesserte Mobilisierung von Pestiziden ermöglichen. Durch Durchmusterung chemischer Bibliotheken nach Substanzen, die spezifisch das Wachstum von Hefen blockieren, die niedrig affine Saccharosetransporter wie SUT4 exprimie- ren, oder die Kombinationen von anderen Saccharosetransportern z.B. SUT4 und SUT2 oder SUT2 und SUTl oder SUT4 und SUTl coexpri ieren, können Inhibitoren identifiziert werden. Diese Inhibitoren könnten als Herbizide eingesetzt werden oder als Vorstufen von neuen Herbiziden dienen. Auf Basis der Tests können auch potentielle Pestizide identifiziert werden, die über diese Transporter in der Pflanze mobilisiert und so besser zu ihrem Zielort gelangen können. ' ,
Die Erfindung umfasst auch die Beeinflussung der Ki eraplasty, d.h. die Beeinflussung der Aktivität der Transporter in der Pflanze durch Verwendung von gemischten Oligonukleotiden, wodurch die Aktivität der Saccharosetransporter entweder erhöht, erniedrigt oder deren biochemischen Eigenschaften verändert werden. Ein derartiges Verfahren ist in der WO99/07865 beschrieben, die hinsichtlich dieses Verfahrens vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Lehre mit einbezogen ist und für das im erfindungsgemäßen Kontext Schutz begehrt wird.
Die Erfindung betrifft also auch die Verwendung von SUT2-codierenden Nucleotidsequenzen oder von SUT2 zur Identifizierung von Modulatoren, insbesondere Induktoren, Aktivatoren oder Inhibitoren des Saccharose-Transportes, insbesondere der Sensorik und/oder Regulation des Saccharose-Transportes in einer Pflanze, wobei die Aktivität des von den SUT2-codierenden Nucleotidsequenzen codierten Proteins in Anwesenheit und Abwesenheit eines potenziellen Modulators nachgewiesen wird. Es kann dabei auch vorgesehen sein, nicht die Aktivität von SUT2, sondern eines von SUT2 regulierten Saccharose- Transporters z.B. SUTl oder SUT4 nachzuweisen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von SUTl codierenden Nucleotidsequenzen, insbesondere der SEQ ID Nr. 22 und/oder von SUT4-codierenden Nucleotidsequenzen und/oder von SUTl und/oder SUT4 zur Identifizierung von Modulatoren der Saccharose- Transportaktivitäten in einer Pflanze, insbesondere eines Inhibitors der niedrig-affinen, hochkapazitiven Beladung des Phloems mit Saccharose, wobei die Aktivität eines von den SUT4- Nucleotidsequenzen codierten Proteins in Anwesen- heit und Abwesenheit des potenziellen Modulators nachgewiesen wird.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen SUTl-, SUT2- und SUT4-Nucleotid- sequenzen zur Identifizierung von homologen Genen in anderen Pflanzen, z.B. aus cDNA- oder genomischen Banken.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Gene und der umgebenden Regionen als molekulare Marker für Kreuzungsprogramme. Sowohl SUT2 als auch SUT4 Loci liegen in Regionen von QTL-Loci für hohen Kohlenhydratgehalt und hohen Ertrag bei Kartoffelknollen. Daher sind beide geeignet, um in Züchtungsprogrammen aus Wildformen oder Hochleistungssorten geeignete Chromosomenfragmente einzukreuzen und so Pflanzen mit verbesserten Erträgen zu erzeugen.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Das Sequenzprotokoll enthält:
SEQ ID Nr. 1: die codierende DNA-Sequenz des SUT4- Gens aus Arabidopsis thaliana.
SEQ ID Nr. 2: die codierende DNA-Sequenz des SUT4- Gens aus Lycopersicon esculentum.
SEQ ID Nr. 3: die codierende DNA-Sequenz des SUT2- Gens aus Arabidopsis thaliana.
SEQ ID Nr. 4: die codierende DNA-Sequenz des SUT2- Gens aus Lycopersicon esculentum. SEQ ID Nr. 5: die Aminosäuresequenz von SUT4 aus Arabidopsis thaliana.
SEQ ID Nr. 6: die Aminosäuresequenz von SUT4 aus Lycopersicon esculentum.
SEQ ID Nr. 7: die Aminosäuresequenz von SUT2 aus Arabidopsis thaliana.
SEQ ID Nr. 8: die Aminosäuresequenz von SUT2 aus Lycopersicon esculentum.
SEQ ID Nr. 9: einen T-DNA-spezifischen Primer.
SEQ ID Nr. 10: einen SUT4-spezifischen Primer.
SEQ ID Nr. 11: einen SUT4-spezifischen Primer.
SEQ ID Nr. 12 bis 15 stellen weitere SUT4-Primer dar .
SEQ ID Nr. 16 und 17 stellen die Aminosäuresequenz von Abschnitten von LeSUT4 dar.
SEQ ID Nr. 18 bis 21 stellen Clonierungspri er dar.
SEQ ID Nr. 22: die codierende DNA-Sequenz des SUTl-Gens aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 23: die Aminosäuresequenz von SUTl aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 24: die den N-terminalen Bereich von SUT2 codierende DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 mit den Nucleotiden 1 bis 239. SEQ ID Nr. 25: die den N-terminalen Bereich von SUTl codierende DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 22 mit den Nucleotiden 1 bis 149.
SEQ ID Nr. 26: die die Zentralschleife codierende DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 mit den Nucleotiden 843 bis 1130.
SEQ ID Nr. 27: die codierende DNA-Sequenz des SUT4- Gens aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 28: die Aminosäuresequenz von SUT4 aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 29: die codierende DNA-Sequenz des SUT2- Gens aus Solanum tuberosum.
SEQ ID Nr. 30: die Aminosäuresequenz von SUT2 aus Solanum tuberosum.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und der dazugehörigen Figuren näher erläutert.
Die Figuren 1 bis 4 zeigen schematisch den Aufbau erfindungsgemäß eingesetzter Genkonstrukte .
Die Figuren 5 und 6 zeigen grafische Darstellungen der Proteinaktivitäten von SUT 4. Die Figur 7 stellt erfindungsgemäße Chimäre SUT2- und SUTl-Genkonstrukte dar.
Beispiel 1
Isolierung von SUT4 cDNA
In der Datenbank (Genbank) wurden bisher nicht cha- racterisierte Sequenzen identifiziert, die entfernte Homologie zu SUTl aufwiesen. Genomische Sequenz: AtSUT4 AC000132
Eine cDNA wurde von einer Arabidopsis Sämling-Bank mittels PCR amplifiziert (Minet et al . , Plant J. (1992) 2, 417-422) . Primer auf Basis der genomischen Sequenz (5' -gactctgcagcgagaaatggctacttccg SEQ ID Nr. 12, 5' -taacctgcaggagaatctcatgggagagg SEQ ID Nr. 13) wurden entworfen. Die Primer beinhalten jeweils eine Pstl-Restriktionsschnittstelle (unterstrichen) und sind so entworfen, dass die gesamte Codiersequenz von AtSUT4 amplifiziert wird. Ein Produkt mit der erwarteten Größe von 1566 bp wurde mit PstI geschnitten und in die Pstl-Stelle des Vektor pBC SK+ (Stratagene) ligiert. AtSUT4 wurde in die Pstl-Stelle von pDR196 subcloniert. Die AtSUT4- cDNA in pDR196 wurde in beide Richtungen sequenziert. Ecotyp-Unterschiede zwischen dem SUT4-Gen in Columbia und Landsberg erecta wurden durch die Sequenzierung von AtSUT4 aus Landsberg erecta verifiziert .
Eine Tomaten- (Lycopersicon esculentum cv. UC82b) cDNA-Bank (Blüten) wurde mit einem 300 bp Eco- RIBglll-Fragment des genomischen Tabakclons NtSUT3 (Lemoine et al . , FEBS Lett . (1999)454, 325-330) un- ter reduzierter Stringenz durchmustert. Drei unabhängige von LeSUTl verschiedene Clone wurden isoliert und als LeSUT4 bezeichnet. Mit Primern der LeSUT4-Sequenz wurde die orthologe Sequenz durch RT-PCR aus Kartoffel isoliert und als StSUT4 bezeichnet. StSUT4 wurde als Pstl/Notl-Fragment in pBC SK- (Stratagene) cloniert und als XhoI/SacII- Fragment in den Hefeexpressionsvektor pDR195 subc- loniert, welcher einen URA3-Marker, PMAl-Promotor und ADHl-Terminator (Rentsch et al . , FEBS Lett . (1995) 370, 264-268) aufweist. Für das Amplifizie- ren von StSUT4 (ORF, = cDNA sequenz) wurden verwendet : 5 ' -SÜT4-PS i 5' -GAGÄCTGCAGATGCCGGAGATAGAAAGGC- 3' (SEQ ID Nr. 14) 5'-SUT4-NotI 5'- TATGACAGCGGCCGCTCATGCAAAGATCTTGGG-3' (SEQ ID Nr. 15)
Beispiel 2
Isolierung von SUT2 cDNA
In der Datenbank (Genbank) wurden bisher nicht cha- racterisierte Sequenzen identifiziert, die entfernte Homologie zu SUTl aufwiesen. Genomische Sequenz: AtSUT2 AC004138
Es wurden auf der Basis von detaillierten Sequenzvergleichen andere bekannte homologe Primersequen- zen identifiziert, die eine Klonierung der potenziellen cDNA Sequenz über RT-PCR aus Blatt mRNA ermöglichen könnten.
Primer auf Basis der genomischen Sequenz (5'- TACGAGAATTCGATCTGTGTGTTGAGGACG, SEQ ID Nr. 20, 5'- AGAGGCTCGAGTGGTCAAAAAGAATCG, SEQ ID Nr. 21) wurden entworfen. Die Primer enthalten eine EcoRI- bzw. eine Xhol Restriktionsschnittstelle (unterstrichen) und sind so entworfen, dass die gesamte Codiersequenz von AtSUT2 amplifiziert wird. Ein Produkt mit der erwarteten Größe von 1785 bp wurde mit EcoRI und Xhol geschnitten und gerichtet in den Vektor pDR19β ligiert.
Beispiel 3
Funktionsanalyse des SUT4
Der Hefestamm SUSY7/ura3 ist eine modifizierte Version des SUSY7 (Riesmeier et al . , EMBO J. (1992) 11, 4705-4713) , welcher eine Deletion eines Teils des URA3-Gen enthält und dadurch eine Selektion für Uracil-auxotrophie ermöglicht. Für die Analyse von Hefewachstum auf Sacharose-Medium wurden Medien verwendet, die 1,7 g/1 Hefe-Stickstoffbase ohne A- minosäuren (Difco) , 2% Saccharose, 20 mg/1 Tryp- tophan und 1,5% Agarose, pH 5,0 enthielten.
Für die Saccharoseaufnahme-Tests wurde Hefe in flüssigem Minimalmedium, welches Glucose enthielt, bis zu einer ODg23 von = 0,8 kultiviert. Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, in 25 mM Natriumphosphatpuffer gewaschen (pH 5,5) und in selbigem Puffer zu einer OD623 von 20 suspendiert. Die Aufnahme-Tests wurden initiiert durch das Hinzufügen von Glucose bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zu den Hefezellen eine Minute vor dem Hinzufügen von 14C-Saccharose . Nach Inkubation bei 30° C unter Rühren wurden Zellen durch Vakuumfiltration auf Glasfaserfiltern gesammelt (1 - 5 Minuten) , zweimal mit 4 ml 10 mM Saccharose (um den Gefrierpunkt) gewaschen und Radioaktivität durch einen Flüssig- Szintillationszähler festgestellt. Die AtSUT4 Ex- pression erlaubte Hefe-Wachstum auf Saccharose. At- SUT4 und StSUT4 erwiesen sich als funktionale Saccharosetransporter. Der zeitliche Verlauf der Aufnahme von 14C-Saccharose der AtSUT4 oder StSUT4 exprimierenden Hefe ist in Figur 5A gezeigt. Es zeigt sich ein signifikanter Unterschied zu den Vektorkontrollen .
Daten für die kinetische Analyse wurden für SUT4 aus einer nichtlinearen Regression der Aufnahmemessungen mit der Michaelis-Menten Gleichung erhalten. Der Km wurde als Durchschnitt von acht Bestimmungen unter Verwendung von drei unabhängigen Transforman- ten ± Standardabweichung dargestellt. Der ermittelte KM-Wert für Saccharose beträgt für SUT4 aus Arabidopsis 11,6 ± 0,6 mM (bei pH 5.5) und 5,9 + 0,8 mM (bei pH 4.0) . Für SUT4 aus Solanum tuberosum ergab sich ein KM-Wert von 6,0 + 1,2 mM (pH 4.0) (vergleiche Figur 5B) .
Die Stimulation der Aufnahme von 14C-Saccharose ü- ber SUT4 durch Glucose und die Inhibition durch einen Elektronen-Transportinhibitor (Antimycin A und den Protonophoren CCCP ist in Figur 5C gezeigt) . Figur 6 stellt das pH-Optimum von SUT4-vermitteltem Saccharose-Transport dar.
Beispiel 4
Herstellung einer SUT4-Insertionsmutanten (Arabidopsis thaliana)
Samen von 12.800 T-DNA-mutagenisierten Arabidopsis- Pflanzen (entsprechen 19.200 Insertionsvorgängen) wurden von Dupont Co. und von Arabidopsis Biologi- cal Resource Center (ABRC) , Ohio State Universität, erhalten. Die Pflanzen wurden in Gruppen von je 100 untersucht. Die Pflanzen wurden in steriler Kultur wachsen gelassen und genomische DNA isoliert. Die DNA aus den 140 Gruppen von je 100 Pflanzen wurde in 14 Übergruppen (superpool) zusammengefasst und nach der Methode von Krysan et al . (Proc. Natl . Acad. Sei. USA (1996) 93, 8145-8150) gescreent, wobei genspezifische und T-DNA-spezifische Primer verwendet wurden. Eine PCR wurde durchgeführt mit der Superpool-DNA als Template, einem T-DNA spezifischen Primer (LB, linke Borderregion SEQ ID Nr. 9) und einem genspezifischen Primer (AtSUT4r2 SEQ ID Nr. 10) . Die PCR-Produkte wurden durch Agarose- gelelektrophorese getrennt und auf eine geladene Nylonmembran überführt. Die Membran wurde mit einem PCR-Produkt von 2,46 kb Länge hybridisiert, hergestellt aus WS (Wassilewskija) genomischer DNA als Template und den Primern AtSUT4r2 (siehe oben) und AtSUT4f2 (ATGGCTACTTCCGATCAAGATCGCCGTC SEQ ID Nr. 11). Diese Sonde wurde mit 32P-CTP markiert.
Ein Superpool wurde durch Hybridisierung der markierten Sonde mit dem Blot identifiziert. DNA aus den Pools von 100 Pflanzen, die den Superpool bilden, wurden anschließend auf gleiche Weise durchmustert: PCR wurde durchgeführt mit DNA aus Pools von 100 als Template und AtSUT4r2 und LB als Primer, DNA-Blot-Hybridisierung wurde mit der AtSUT4 genomischen Sonde (2,46 kb) durchgeführt zur Detek- tion von amplifizierten Produkten.
Positive Hybridisierung wurde bei Pool CS2165 beobachtet, welcher 100 T-DNA mutagenisierte Linien umfasst. Einzelne Pflanzen von CS2165 wurden kultiviert und genomische DNA präpariert. Die DNA einzelner Pflanzen wurde wie dargestellt durchmustert. PCR wurde durchgeführt mit DNA der einzelnen Pflanzen als Template und AtSUT4r2 und LB als Primer. PCR-Produkte wurden auf Agarosegel durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Das PCR- Produkt wurde mit AtSUT4r2 und LB als Sequenzprimer sequenziert. Eine mit dem AtSUT4-Gen identische Sequenz deutet auf eine T-DNA-Insertion in dem At- SUT4-Gen hin.
In der Gruppe CS2615 (Ohio State University, ABRC) wurde eine Pflanze erhalten, die ein positives Ergebnis sowohl mit einem T-DNA-spezifischen Primer (LB 5'-GATGCACTCGAAATCAGCCAATTTTAGAC) (SEQ ID Nr.
9) als auch mit einem SUT4-spezifischen Primer (At- SUT4r2 5'-TCATGGGAGAGGGATGGGCTTCTGAATC) (SEQ ID Nr.
10) ergab. Einzelne Pflanzen wurden isoliert und die Insertionsstelle der T-DNA sequenziert, wobei gezeigt werden konnte, dass die linke Bordersequenz der T-DNA etwa 480 Basenpaare stromaufwärts des ATG des SUT4-Gens vorhanden war. Die Mutante wurde zweimal mit WS (Wassilewskija) zurückgekreuzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Kana ycin- Resistenz in einem Verhältnis 2,9:1 (427:147) segregierte, was die Anwesenheit eines einzelnen markierten Locus anzeigt. Homozygote Pflanzen wurden erhalten. Diese enthielten signifikant mehr Stärke als der WS-Wildtyp, was durch KI (Kaliumjo- did) -Färbung nachgewiesen werden konnte. Zudem zeigten die Pflanzen ein stärkeres Sprosswachstum unter Licht. Beide Ergebnisse zeigen deutlich, dass AtSUT4 beim Saccharose-Export aus Source-Organen, nämlich Blättern, eine bedeutende Rolle spielt. RT- PCR zeigt, dass die mRNA von SUT4 in der Mutante vorhanden ist und dass die Mutante demgemäss keine "Knockout"-Pflanze ist.
Beispiel 5
Isolation und RNase-Schutz-Analyse
RNA wurde von verschiedenen Organen einer im Gewächshaus kultivierten Tomate (L. esculentum, cv. Moneymaker) nach der Methode von Schwacke (Schwacke et al., Plant Cell (1999) 11, 377-392) isoliert. Reverse Transcription wurde durchgeführt mit dem MAXIscript™ SP6/T7 in vitro Transcription Kit (Ambion) , unter Verwendung von α-32P UTP. Ein 600 bp PCR-Produkt wurde von pSport erhalten, welches das 340 bp LeSUT4 Fragment enthielt. Dies wurde als Template verwendet. Die Sonde wurde nicht weiter aufgereinigt und 300.000 CPM wurden pro Probe hybridisiert. Hybridisierung wurde über Nacht mit 20 μg RNA bei 45 °C durchgeführt. Nach RNA-Verdau wurde die geschützte RNA auf einem 5% Polyacryla- idgel (13 x 15 cm) bei 150 mV aufgetrennt. Die Gele wurden getrocknet und Röntgenfilmen ausgesetzt.
Sowohl bei einer RNA-Blot-Analyse als auch bei der RNA-Schutz-Analyse wurde die stärkste Expression von SUT4 in Sink-Blättern, Stiel, Cotyledonen und unreifen Früchten gefunden. In Source-Blättern konnte nur geringe Expression nachgewiesen werden. Beispiel 6
Herstellung von anti-SUT4 Antiseren und Immunoloka- lisation
Kaninchen wurde immunisiert mit synthetischen mit KLH gekoppelten Peptiden, entsprechend entweder dem N-Terminus (MPEIERHRTRHNRPAIREPVKPR SEQ ID Nr. 16) oder dem zentralen Loop (GSSHTGEEIDESSHGQEEAFLW SEQ ID Nr. 17) von LeSUT4. Eine Affinitätsreinigung der Antisera wurde wie vorher beschrieben (Kühn et al . ,
(1997) a.a.O.) mittels synthetischer Peptide verbunden mit CNBr-aktivierten Sepharose-4B-Säulen
(Pharmacia) durchgeführt. Präimmunserum wurde durch die gleiche Methode gereinigt, mit Ausnahme, dass Protein A Sepharose (BioRad) anstatt der Peptidaf- finitätschromatographie verwendet wurde.
Fluoreszenz-Immunodetektion von SUT4 in Kartoffel und Tomate wurde durchgeführt wie beschrieben (Stadler et al . , Plant Cell (1995) 7, 1545-1554) mit den nachstehend beschriebenen Modifikationen. Von Hand geschnittene Abschnitte (1 mm) aus Tomaten- oder Kartoffelstiel wurden über Nacht im Vakuum in Mops-Puffer (50 mM Mops/NaOH pH 6,9, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl2) beinhaltend 0,1% Glutaraldehyd und 6% Formaldehyd fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit Mops-Puffer auf Eis wurden die Fragmente dehydriert durch Inkubation in einer Ethanolserie, gefolgt von zwei Inkubationen in 96% Ethanol . Nach Inkubation über Nacht in 1:1 Ethanol: Methylacry- latgemisch (75% [v/v] Butylmethylacrylat , 25% [v/v] Methylmethacrylat, 0,5% Benzoinethylether, 10 mM DTT) wurde das Material in 100% Methylacrylatge- misch eingebettet. Die Polymerisation fand über Nacht unter UV-Licht (365 nm) bei 4° C statt. Halbdünne Sektionen (1 μm) wurden auf vorgewärmte Histobond-Objektträger (Camon) aufgebracht und bei 50° C getrocknet.
Um das Methylacrylat von den Sektionen zu entfernen, wurden die Objektträger für 30 Sekunden in Aceton inkubiert, rehydriert über eine Ethanolserie und blockiert für 1 Stunde mit 2% BSA in PBS (100 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 100 mM NaCl) . Nach der Inbukation über Nacht mit affinitätsgereinigten Antikörpern gegen LeSUT4 wurden die Objektträger zweimal in PBS-T (PBS mit 0,1% Tween) und einmal mit PBS, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit Antikaninchen-Konjugat IgG-FITC (Fluorescini- sothio-cyanat) gewaschen. Nach drei Waschschritten mit PBS-T, PBS und destilliertem Wasser wurden Aufnahmen gemacht mit einem Fluoreszenzphasenmikroskop (Zeiss, Axiophot) und einem Erregerlicht von 450- 490 nm.
Fluoreszenzsignale konnten nur in Siebelementen nachgewiesen werden (Tomate und Kartoffel)
Beispiel 7
Herstellung von transgenen Pflanzen
Das AtSUT2 Überexpressionskonstrukt (oΑtSUT235s)
AtSUT2 cDNA wurde mittels PCR amplifiziert - das Produkt war 1.785 bp lang entsprechend dem erfindungsgemäßen Codierungsbereich von ATG (Position 1) bis TGA (Position 1785) . Das Fragment wurde in Sense-Orientierung cloniert in eine 35S-Promotor- Expressionskassette (pBinAr35S), welche als Eco- RI/Hindlll-Fragment von pBinAr (Höfgen und Willmit- zer, Plant Sc. (1990) 66, 221-230) isoliert wurde. Dieses Kontrukt wurde mit Hindlll und EcoRI geschnitten und in das Hindlll/EcoRI-geschnittene pGTPV-bar cloniert (Becker et al . , a.a.O. Plant Mol. Biol. (1992) 20, 1195-1197). Pflanzen wurden transformiert .
Das AtSUT2 Antisensekonstrukt (αAtSUT235s)
AtSUT2 cDNA (ATTS5034EST Zugangsnummer) wurde mit Sacl und BamHI geschnitten und in Antisense- Orientierung in die pBinAr35S-Expressionskassette cloniert. Dieses Konstrukt wurde mit Hindlll und EcoRI geschnitten und in das Hindlll/EcoRI- geschnittene pGPTV-bar cloniert (Becker et al . , a.a.O.). Pflanzen wurden transformiert.
Das AtSUT4 Überexpressionskonstrukt (oAtSUT4AtSuc2)
AtSUT4 cDNA wurde amplifiziert. Das 1.533 bp- Fragment beginnt mittels PCR bei Position 1 der erfindungsgemäßen AtSUT4cDNA-Sequenz und endet bei TAG Position 1533. Der SUC2-Promotor wurde aus Arabidopsis (Columbia-Ecotyp) genomischer DNA mittels der folgenden Primer getrennt: (reverse 5'- ATGGCTGACCAGATTTGAC ; SEQ ID Nr. 18 und forward 5'- GTTTCATATTAATTTCAC; SEQ ID Nr. 19). Das 1,533 kb- Fragment wurde in Sense-Orientierung hinter dem At- SUC2-Promotor (X79702) cloniert. Dieses Konstrukt wurde mit Hindlll und EcoRI geschnitten und in das Hindlll/EcoRI-geschnittene pGPTV-bar cloniert (Be- cker et al., a.a.O.). Pflanzen wurden transformiert .
LeSUT4 Antisense-Konstrukt (αLeSUT435s)
Die LeSUT4 cDNA wurde mit BamHI geschnitten, wobei ein 1,3 kb-Fragment erhalten wurde,' welches geglättet und in die Smal-Schnittstelle von pBinAR cloniert wurde (Bevan, Nucleic Acids Research (1983) 12, 8711-8721) .
Die Figuren 1 bis 4 stellen die vorgenannten Kon- strukte dar.
Beispiel 8
8.1. Herstellung eines chimären Proteins zwischen AtSUT2 und StSUTl
Das offene Leseraster von AtSUT2 wurde mittels RT- PCR aus Arabibopsis thaliana (Columbia Ecotyp) Blättern isoliert und in den Hefeexpressionssektor pDR196 (Barker et al . , (2000) Plant Cell 12: 1153- 1164) cloniert. Das offene Leseraster von StSUTl wurde von der StSUTl cDNA in pDRl95 (Riesmeier et al . , (1993) a.a.O.) amplifiziert, wobei Primer mit den Restriktionsschnittstellen für Smal und Xhol verwendet wurden. Das offene Leseraster wurde in den Hefeexpressionsvektor pDRl96 ligiert.
Es wurden chimäre Konstrukte hergestellt, in denen der N-terminus von AtSUT2, also der erfindungsgemäße N-terminale Bereich von SUT2 (codiert von SEQ ID Nr. 24) mit der entsprechenden N-terminalen Domäne von StSUTl (codiert von SEQ ID Nr. 25), also der erfindungsgemäße N-terminale Bereich von SUTl ausgetauscht wurden und umgekehrt, wobei mittels PCR Restriktionsschnittstellen innerhalb einer konservierten Region der ersten Transmembrandomäne von AtSUT2 und StSUTl hergestellt wurden. Anschließend wurden PCR-Fragmente des N-terminalen Bereichs und des Restes der Sequenz in den Hefeexpressionsvektor pDR196 cloniert, wobei die Schnittstellen Smal und PstI für die N-terminalen Bereiche und PstI (Sdal für AtSUT2) und Xhol für den restlichen Bereich des offenen Leserasters verwendet wurden. Diese chimären Konstrukte werden im Folgenden als At- SUT2/StSUTl-N und StSUTl/AtSUT2-N bezeichnet und sind in Figur 7 dargestellt.
Das Konstrukt StSUTl/AtSUT2-N weist die Nucleotide 1 bis 239 von SEQ ID Nr. 3 fusioniert zu den Nucleotiden 150 bis 1548 von StSUTl, dargestellt in SEQ ID Nr. 22 auf, wobei das Konstrukt aufgrund clonie- rungstechnischer Gegebenheiten einen ' Nucleoti- daustausch von t zu c aufweist. Im Folgenden ist der Fusionsbereich des Konstruktes sequenzmäßig dargestellt, wobei die kleinen Buchstaben die Sequenzen von SUT2 und die großen Buchstaben die Sequenzen von SUTl sind (obere Zeile: ohne Austausch, untere Zeile: mit Austausch) :
...tgggcattgca/GCTCTCTT...
...tgggcactgca/GCTCTCTT...
AtSUT2/StSUTl-N weist die Nucleodide 1 bis 149 von StSUTl, dargestellt in SEQ ID Nr. 22, fusioniert zu den Nucleotiden 240 bis 1785 von AtSUT2 dargestellt in SEQ ID Nr. 3 auf. Aufgrund clonierungstechni- scher Gegebenheiten weist das Konstrukt gegenüber der Wildtypsequenz 3 Nucleotidaustausche auf. Im Folgenden ist der Fusionsbereich dargestellt, in der oberen Zeile das theoretisch erhältliche Konstrukt und in der unteren Zeile der tatsächlich hergestellte Fusionsbereich. Die Großbuchstaben beziehen sich auf Sequenzen von SUTl und die Kleinbuchstaben auf Sequenzen von SUT2 :
...TGGGCTCTTCA/actttct ...TGGGCTCTGCA/ggtttct
Es wurden weiterhin chimäre Konstrukte hergestellt, in denen der zentrale cytoplasmatische Bereich, insbesondere Loop, von AtSUT2 , der in SEQ ID# 26 dargestellt ist, mit dem kleineren cytoplasmati- schen Bereich, insbesonder Loop, von StSUTl ausgetauscht wurden und umgekehrt. Dabei wurden Restriktionsschnittstellen mittels PCR innerhalb konservierter Bereiche der transmembranen Regionen VI und VII verwendet. Die N-terminale Hälfte, der cytoplasmatische Loop und die C-terminale Hälfte des offenen Leserasters wurden mittels PCR unter Verwendung der Pfu-Polymerase (Stratagene) amplifiziert und in den Hefeexpressionsvektor cloniert durch Ligieren der ersten drei Fragmente unter Verwendung von Sac I und Bcll/Bglll für AtSUT2 mit dem StSUTl-Loop und Sacl und BamHI/Bglll für StSUTl mit dem AtSUT2-Loop. Die chimäre DNA wurde dann in den Hefeexpressionsvektor pDR196 unter Verwendung von Smal und Xhol ligiert. Diese chimären Konstrukte werden weiterhin als AtSUT2/StSUTl-Loop und StSUTl/AtSUT2-Loop bezeichnet und in Figur 7 dargestellt .
Das Konstrukt AtSUT2/StSUTl-Loop weist die Nucleotide 1 bis 842 von AtSUT2 (SEQ ID Nr. 3), 750 bis 893 von StSUTl (SEQ ID Nr. 22) und Nucleotide 11.31 bis 1785 von AtSUT2 (SEQ ID Nr. 3) . Die im Folgenden verwendete Darstellung in Groß- und Kleinbuchstaben entspricht der vorgenannten Verwendung. E- benso stellt die obere Linie jeweils die Sequenz des theoretisch erhältlichen Konstruktes und die jeweilige untere Linie die tatsächlich aufgrund clonierungstechnischer Gegebenheiten erzielte Sequenz des Konstruktes dar.
1. Fusionsstelle:
... tgctaaagagat/CCCGGAGA... ...tgctaaagagct/CCCGGAGA...
2. Fusionsstelle:
...GTTTGAACTG/gttatcctgg ...GTTTGAACTT/gatctcctgg
Das Konstrukt StSUTl/AtSUT2-Loop weist die Nucleotide 1 bis 749 von StSUTl (SEQ ID Nr. 22), Nucleotide 843 bis 1130 von AtSUT2 (SEQ ID Nr. 3) und Nucleotide 894 bis 1548 von StSUTl (SEQ ID Nr. 22) auf .
1. Fusionsstelle:
...AACGAGCT/tcctttta... ...AACGAGCT/ccctttta... 2. Fusionsstelle:
... ctcttacatg/GATCGCGT ... ...ctcttacatg/GATCTCGT...
8.2. Funktionale Analyse von AtSUT2 und σhi ärer Proteine
Für Saccharoseaufnahmetests wurde der Hefestamm SEY6210 (Banakaitis (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) 83, 9075 - 9070) verwendet, der die entsprechenden cDNAs im Expressionsvektor pDR196 aufwies. Die Aufnahme von 14-C-Saccharose erfolgte wie beschrieben (Weise et al . , (2000) Plant Cell 12: 1345-1355) . Expressionsanalyse der Proteine in Hefe ergab vergleichbare Mengen für alle untersuchten Proteine .
Es konnte gezeigt werden, dass die Saccharoseaufnahme durch Hefezellen, die AtSUT2 exprimieren, in den ersten fünf Minuten des Tests linear war. In dieser Zeit akkumulierten in 108 Zellen 0,1 nmol Saccharose. Die Saccharoseaufnahme durch AtSUT2 war signifikant (p < 0,05) höher als bei Hefezellen, die nur den leeren Vektor pDR196 exprimierten. Im Gegensatz dazu war die Transportrate bei StSUTl expri ierenden Zellen 400-fach höher als bei At- SUT2-exprimierenden Zellen. Kinetische Studien, offenbarten eine sehr geringe Affinität von AtSUT2 für Saccharose. Unter Verwendung der Michaelis- Menten-Gleichung und einer nicht-linearen Regressionsanalyse wurde ein KM-Wert von 11,7 + 1,2 mM (Vmax = 1,5 nmol • min"1 108 Zellen-1) für AtSUT2 bei einem pH-Wert von 4 bestimmt. Im Gegensatz dazu zeigte StSUTl einen 10-fach niedrigeren KM-Wert für Saccharose bei 1,7 mM (Vmax. = 210,2 nmol • min"1 108 Zellen"1) .
Die Saccharose-Aufnahme durch AtSUT2 war pH- abhängig, wobei die höchsten Aufnahmeraten bei einem pH-Wert von 4 , 0 gemessen wurden. Die Saccharose-Aufnahme fiel bei alkalischen pH-Werten stark ab und bei einem pH-Wert von 6 konnte keine Saccharose-Aufnahme mehr gemessen werden. Zur Bestimmung der Substratspezifität vom AtSUT2 wurde die Saccharose-Aufnahme (1 mM Saccharose) mit anderen Zuckern und Zuckeralkoholen kompetitiv gemessen. Von den getesteten Substraten (Saccharose, Maltose, Isomal- tulose, Glucomannitol, Glucosorbitol, Raffinose, Galactose, Lactose, Mannitol, Sorbitol, Glucose) kompetierte nur Saccharose und zu einem geringeren Ausmaß Maltose signifikant mit 1C-Saccharose . Der Saccharose-Transport durch AtSUT2 konnte durch CCCP und durch den Inhibitor der mitochondrialen ATP- Bildung, Antimycin A, inhibiert werden. Diese Daten sprechen für einen Protonen-gekoppelten Transportmechanismus von AtSUT2.
8.5. Saccharoseaufnahme-Kinetiken der Saccharose- Aufnahme chimärer Proteine
Die Ergebnisse für AtSUT2, StSUTl, und die chimären Proteine sind in der Tabelle dargestellt: Tabelle :
KM-Werte für Saccharose der Saccarosetransporter StSUTl und AtSUT2 sowie chimärer Proteine, in denen die N-terminalen Bereiche oder zentralen cytoplas- matischen Loops zwischen den beiden Transportern ausgewechselt wurden. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler bestimmt aus wenigstens drei unterschiedlichen Messungen angegegeben. Unterschiedliche Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede (p < 0, 05) an.
Figure imgf000066_0001
Das von dem chimären Konstrukt AtSUT2/StSUTl-N codierte chimäre Protein zeigt einen signifikant geringeren KM-Wert für Saccharose von 3,4 + 1,6 mM
(Vmax. = 0,3 nmol • min"1 108 Zellen"1) verglichen mit AtSUT2. Im Vergleich dazu zeigte das von dem chimären Konstrukt StSUTl/AtSUT2-N codierte chimäre Protein einen signifikant höheren KM-Wert für Saccharose von 8,08 + 1,4 mM (Vmax. = 72,9 nmol ■ min"1 108 Zellen"1) verglichen mit StSUTl. AtSUT2/StSUTl-Loop wies einen höheren KM-Wert (6,75 mM + 1,9) (Vmax. = 0,4 nmol • min"1 108 Zellen"1) für Saccharose auf, während StSUTl/AtSUT2-Loop einen niedrigen KM-Wert
(1,4 mM ± 0,3) (Vmax. = 5,5 nmol • min"1 108 Zellen"1) für Saccharose aufwies.
8.6. Bedeutung der N-Termini von Saccharose- Transportern
Die vorstehend beschriebenen Expressions- Experimente der chimären Proteine in Hefe erlauben folgende Rückschlüsse. Der Ersatz des N-Terminus des hoch-affinen Transporters StSUTl durch den des niedrig-affinen AtSUT2 führte zu einer Erhöhung des KM-Wertes von 1,7 mM auf 8,1 mM (p < 0,05). Der StSUTl N-Terminus verlieh hohe Affinität an AtSUT2, was sich an einem von 11,7 mM auf 3,4 mM verringerten KM-Wert ablesen lässt (p < 0,05). Strukturelle Unterschiede im N-Terminus zwischen StSUTl und At- SUT2 scheinen daher einen Großteil der Substrataffinitätsunterschiede zu bewirken. Wahrscheinlich, ohne durch die Theorie gebunden zu sein, beein- flusst der N-Terminus der Saccharose-Transporter die Affinität zur Saccharose durch intramolekulare Interaktionen mit anderen cytosolischen Domänen o- der durch Kontrolle der Position des ersten Transmembrandurchgangs .

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Modifizierung des Saccharid-Fluxes und/oder der Saccharid-Konzentration in Geweben einer Pflanze, wobei die Aktivität eines Saccharid- Transporters mit hoher Transportkapazität für das Saccharid und niedriger Affinität zu dem Saccharid modifiziert wird, indem mindestens eine Pflanzenzelle mit mindestens einem Vektor transformiert und daraus eine Pflanze regeneriert und erhalten wird, in deren Gewebe ein modifizierter Saccharid-Flux und/oder eine modifizierte Saccharid-Konzentration vorhanden ist und wobei der Vektor eine Nucleotidsequenz aufweist, deren Expression eine Modifizierung der Transportaktivität des Saccharid- Transporters bewirkt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vektor SUT4-codierende Nucleotidsequenzen, Teile davon o- der eine komplementäre Sequenz davon enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Vektor SUT2-codierende Nucleotidsequenzen, Teile davon oder eine komplementäre Sequenz davon enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Vektor SUTl-codierende Nucleotidsequenzen, Teile davon oder eine komplementäre Sequenz davon enthält .
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die codierenden Nucleotidsequenzen cDNA- oder genomische DNA-Sequenzen sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine blattspezifische Überexpression der codierenden Nucleotidsequenz gewährleistenden Vektor transformiert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Überexpression der codierenden Nucleotidsequenz in Schließzellen gewährleistenden Vektor transformiert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Expression oder Mutagenese der codierenden Nucleotidsequenzen in Schließzellen gewährleistenden Vektor transformiert und durch Co- suppression, Mutagenese, RNA-Doppelstrang-Inhi- bierung oder Antisense-Expression eine reduzierte Expression mindestens einer endogen vorhandenen SUTl-, SUT2- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenz erreicht wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Überexpression der codierenden Nucleotidsequenzen in Sink-Gewebe und/oder Parenchym gewährleistenden Vektor transformiert wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Expression oder Mutagenese der codierenden Nucleotidsequenzen in sink-Zellen gewährleistenden Vektor transformiert und durch Co- suppression, Mutagenese, RNA-Doppelstrang-Inhi- bierung oder Antisense-Expression eine reduzierte Expression mindestens einer endogen vorhandenen SUTl-, SUT2- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenz erreicht wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Expression oder Mutagenese der codierenden Nucleotidsequenzen in Blättern gewährleistenden Vektor transformiert und durch Cosuppressi- on, Mutagenese, RNA-Doppelstrang-Inhibierung oder Antisense-Expression eine reduzierte Expression mindestens einer endogen vorhandenen SUTl-, SUT2- und/oder SUT4-codierenden Nucleotidsequenz erreicht wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine Samen-spezifische Überexpression der codierenden Nucleotidsequenzen gewährleistenden Vektor transformiert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzenzelle mit mindestens einem, eine spezifische Überexpression der codierenden Nucleotidsequenzen in Blatt-Mesophyll und/oder Blattepi- der is gewährleistenden Vektor transformiert wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die codierenden Nucleotidsequenzen unter der operativen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes stehen, das die Expression einer RNA in pro- und/oder eukaryotischen Zellen gewährleistet .
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die codierenden Nucleotidsequenzen in Sense- oder Antisense- Orientierung unter der operativen Kontrolle des mindestens einen regulatorischen Elementes stehen.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das mindestens eine regulatorische Element ein Promotor ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Promotor der GAS, SUC2, SUTl, CaMV35S, rolC, enhanced PMA4 , KAT1, StLSl/L700, PFP, patatin-B33, AAPl oder Vici- lin-Promotor ist.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Saccharid Saccharose ist.
19. Nucleinsäuremolekül, codierend einen Saccharid- Transporter mit niedriger Saccharid-Affinität und hoher Transportkapazität für das Saccharid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID Nr. 1, 2 oder 27 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen, eines Teils oder eines komplementären Strangs davon,
b) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter SEQ ID Nr. 5, 6 oder 28 dargestellten Aminosäuresequenz codieren und c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einer der unter a) und b) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren.
20. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 19, wobei der Saccharid-Transporter ein Saccharose-Transporter, insbesondere SUT4, ist.
21. Nucleinsäuremolekül, codierend einen Regulator und/oder Sensor des Saccharid-Transports, insbesondere Saccharose-Transports in Pflanzen oder einem Teil davon, insbesondere SUT2, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID Nr. 3, 4, 24, 26 oder 29 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen, eines Teils oder eines komplementären Strangs davon,
b) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter SEQ ID Nr. 7, 8 oder 30 dargestellten Aminosäuresequenz codieren und
c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einer der unter a) und b) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren.
22. Nucleinsäuremolekül codierend wenigstens den N- terminalen Bereich von SUTl, dargestellt in SEQ ID Nr. 22 und 25.
23. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei das Molekül ein DNA- oder RNA-Molekül ist .
24. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 23, wobei das DNA-Molekül eine cDNA oder eine genomische DNA ist.
25. Nucleinsäuremolekül, das ein chimäres Protein codiert, wobei der 5λ-terminale Bereich der codierenden Region des Nucleinsäuremoleküls den N- terminalen Bereich des SUT2-Proteins und der Rest einen codierenden Bereich eines mit dem Saccharose- Stoffwechsel- und/oder -Transport in Verbindung stehenden Gens darstellt.
26. Nucleinsäuremolekül, das ein chimäres Protein codiert, wobei der 5Λ-terminale Bereich der codierenden Region des Nucleinsäuremoleküls den N- terminalen Bereich des SUTl-Gens und der Rest einen codierenden Bereich eines mit dem Saccharose- Stoffwechsel und/oder -Transport in Verbindung stehende Gens darstellt.
27. Nucleinsäuremolekül, welches ein chimäres Nucleinsäuremolekül darstellt und das für ein chimäres Protein codiert, dessen N-terminaler Bereich der N- terminale Bereich von SUT2 und dessen Rest codierende Sequenz von SUTl ist.
28. Nucleinsäuremolekül, welches ein chimäres Nucleinsäuremolekül darstellt und das für ein chimäres Protein codiert, dessen N-terminaler Bereich von SUTl und dessen Rest codierende Sequenz von SUT2 ist.
29. Nukleinsäuremolekül, welches ein chimäres Nucleinsäuremolekül darstellt und das für ein chimäres Protein codiert, dessen zentrale cytoplasmatische Domäne, die zwischen Membranspanne VI and VII liegt, von SUT2 codiert wird, und dessen andere Bereiche von einem anderen Saccharosetransporter-Gen, insbesondere von SUTl oder SUT4, codiert werden.
30. Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 19 bis 29.
31. Vektor nach Anspruch 30, enthaltend zusätzlich eine Saccharid-Transporter-codierende Nucleotidsequenz, einen Teil oder eine komplementäre Nucleotidsequenz davon.
32. Vektor nach einem der Ansprüche 30 bis 31, wobei das Nucleinsäuremolekül mit mindestens einem regulatorischen Element operativ verknüpft ist, das die Expression einer RNA in pro- und/oder eukaryo- tischen Zellen gewährleistet.
33. Vektor nach Anspruch 32, wobei das regulatorische Element ein Promotor ist.
34. Vektor nach Anspruch 33, wobei der Promotor der GAS, SUC2, SUTl, CaMV35S, rolC, enhanced PMA4, KAT1, StLSl/L700, PFP, patatin-B33, AAP1 oder Vici- lin-Promotor ist.
35. Vektor nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wobei das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 19 bis 29 und/oder eine Saccharid-Transporter- codierenden Nucleotidsequenzen oder Teile davon in operativer Antisense-Orientierung zu dem mindestens einen regulatorischen Element angeordnet sind.
36. Wirtzelle, enthaltend einen der Vektoren nach einem der Ansprüche 30 bis 35.
37. Wirtzelle nach Anspruch 36, die eine Pflanzenzelle, Bakterienzelle oder Hefezelle ist.
38. Saccharid-Transporter mit niedriger Saccharid- Affinität und hohem Saccharid-Transportu satz, codiert von einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 19 oder 20.
39. Protein mit der biologischen Aktivität eines Regulators und/oder Sensors des Saccharid- transports, codiert von einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 21.
40. Chimäres Protein codiert von einem der Nucleinsauremolekule nach einem der Ansprüche 25 bis 29.
41. Transgene Pflanzenzelle, die mit einem Nucleinsauremolekule nach einem der Ansprüche 19 bis 29 oder einem der Vektoren nach einem der Ansprüche 29 bis 34 transformiert wurde oder die von einer solchen Zelle abstammt.
42. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 41, die mit einem Vektor enthaltend eine ' SUT/SUC- codierende, bevorzugt eine SUTl-codierende Nucleotidsequenz transformiert wurde oder die von einer solchen Zelle abstammt.
43. Transgene Pflanzenzelle, deren Genom mindestens zwei stabil integrierte modifizierte Gene aus der SUT/SUC Genfamilie enthält.
44. Transgene Pflanzenzelle, deren Genom mindestens zwei stabil integrierte modifizierte Gene enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SUT1/SUT2; SUT1/SUT4, SUT2/SUT4 und SUT1/SUT2/SUT4.
45. Transgene Pflanze, enthaltend mindestens eine Pflanzenzelle nach Anspruch 41, 42, 43 oder 44 , o- der hergestellt nach einem der Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 18.
46. Transgene Pflanze nach Anspruch 45, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Unterklasse der Gra- minae, Pinidae, Magnoliidae, Ranunculidae, Cary- ophyllidae, Rosidae, Asteridae, Aridae, Liliidae, Arecidae und Commelinidae .
47. Transgene Pflanze nach Anspruch 45, wobei die Pflanze ausgewählt -ist aus der Gruppe bestehend aus Zuckerrübe, Zuckerrohr, Topinambur, Arabidopsis, Sonnenblume, Tomate, Tabak, Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Reis, Kartoffel, Raps, Maniok, Salat, Spinat, Wein, Apfel, Kaffe, Tee, Banane, Ko- kos, Palmen, Erbsen, Bohnen, Pinien, Pappel, Eukalyptus etc.
48. Vermehrungs- oder Erntematerial einer Pflanze nach einem der Ansprüche 45, 46 oder 47, enthaltend mindestens eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 41, 42, 43 oder 44.
49. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 19 oder 20 zum Identifizieren eines Modulators, insbesondere Inhibitors, des Saccharid- Transports in Pflanzen, insbesondere von SUT4.
50. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach einem der ' Ansprüche 19 oder 20 zum Identifizieren eines Interaktors, der wiederum zur Beeinflussung des Saccharid-Transports benutzt wird.
51. Verwendung nach Anspruch 49, wobei der Inhibitor die Phloembeladung in Source-Organen und/oder die Entladung in Sinkorganen inhibiert.
52. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach Anspruch 21 zum Identifizieren eines Modulators, insbesondere Inhibitors des Saccharid-Transports in Pflanzen, insbesondere von SUT2.
53. Verwendung nach Anspruch 52, wobei der Inhibitor die Regulation oder Sensorik des Saccharid- Transportsystems inhibiert.
54. Verwendung einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 19 bis 29 als molekularer Marker für Kreuzungsprogramme .
55. Verwendung einer 5 -terminalen Nucleotidsequenz eines Protein-codierenden Bereiches eines Gens aus der SUT/SUC-Genfamilie zur Modifikation der Affinität eines beliebigen Proteins, insbesondere aus der Familie der SUT/SUC-Proteine, gegenüber einem Substrat, insbesondere Saccharose.
56. Verwendung nach Anspruch 54, wobei das Gen SUTl, SUT2 oder SUT4 ist.
57. Verwendung nach Anspruch 54 oder 55, wobei die N-terminale Nucleotidsequenz die in SEQ ID-Nr. 24 oder 25 dargestellte Nucleotidsequenz ist.
58. Verwendung der zentralen cytoplasmatischen Schleife von SUT2 zur Regulation oder Signaltrans- duktion, insbesondere im Zuckerstoffwechsel.
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