WO2001072993A1 - Inhibiteur de liaison entre le recepteur de type toll et cd14 - Google Patents

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WO2001072993A1
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human
cells
polypeptide
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Shouji Furusako
Sadao Mori
Kamon Shirakawa
Tomohiro Takahashi
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Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
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    • A61P31/04—Antibacterial agents
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to an anti-CD14 antibody having a function of inhibiting the binding of CD14 to Toll Liquid Receptor (hereinafter referred to as TLR), a fragment thereof, a hybridoma producing the antibody or the fragment, and a peptide.
  • TLR Toll Liquid Receptor
  • the present invention relates to a method for preparing an antibody, a polypeptide having a CD14 variant, a method for screening a therapeutic agent for sepsis, and a pharmaceutical composition for sepsis.
  • CD14 is a glycoprotein consisting of 356 amino acids, and is derived from macrophages, monocytes, Kupffer cells, neutrophils and glycoproteins by glycosylphosphanazirileinositoli and glycosylphosphylphosphatatidylinosito1 (GPI). Part Anchored on the membrane of B cells.
  • Human CD14 includes soluble CD14 (hereinafter also referred to as sCD14 or soluble CD14) in addition to membrane-bound CD14 (hereinafter also referred to as mCD14). It has been reported that a plurality of sCD14 having different molecular weights exist in blood (LaetaMO: Eur.J.Immuno 1., 23: 2144, 1993).
  • Human CD14 is known as the LPS receptor for Gram-negative bacillus endotoxin ( Wryght et al .: Science, 249: 1431, 1990), and receive LPS from blood LBP (LPS binding protein) to form a complex.
  • LPS receptor for Gram-negative bacillus endotoxin ( Wryght et al .: Science, 249: 1431, 1990)
  • LBP LPS binding protein
  • Macrophages and the like expressing mCD14 are activated by a complex of LPS and sCD14, and induce the production of inflammatory cytodynamics (Hai 1 mann E et al .: J. Immunol 1. , 156: 4384, 1996).
  • SCD14ZLPS vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells that do not express mCD14, sCD14 and LPS complex
  • Cytokine production of cells via CD14 such as LPS or LTA has a damaging effect on the living body and causes sepsis.
  • the initial symptoms of sepsis include chills, hyperhidrosis, fever, and weakness, etc., followed by hypotension, neutropenia, generalized intravascular coagulation, and adult respiratory distress syndrome that cause shock.
  • Serious clinical symptoms occur, such as respiratory failure and renal organ failure.
  • N-terminal 1-152 is a region essential for the functional expression of CD14 Yes (Ju an TS et al .: J. Biol. Chem., 270: 1382, 1995), and the 7th to 14th and 57th to 64th are essential parts for binding to LPS (Ju an TS: J. Biol. Chem., 270, 29: 17 237 (1995) and Juan TS: J. Biol. Chem., 270, 10: 5219 (1995)).
  • TLR To 11 like r e c e p t o r
  • TLR4 is responsible for signaling Gram-negative bacterial cell components to cells and TLR2 is responsible for signaling Gram-positive bacterial cell components to cells
  • TLR4 is involved in signal transduction of LPS into cells, that TLR4 directly reacts with LPS on the cell surface, and that the response is enhanced in the presence of CD14.
  • TLR4 is involved in signal transduction of LPS into cells, that TLR4 directly reacts with LPS on the cell surface, and that the response is enhanced in the presence of CD14.
  • MD2 that binds to TLR4 was discovered (Rintaro Shimazu: J. Exp. Med., 189, 1777, 1999).
  • TLR4 performs LPS signaling only in the presence of MD2 in mouse cells.
  • the exact role of MD2 in LPS signaling is unclear, but is thought to contribute to the stabilization of the TLR4 or TLR4 dimer structure (Alan Ad erem, Nature , 406, 782, 2000).
  • antibodies recognizing the complex of mouse TLR4 and MD2 specifically inhibit LPS-induced production of TNF- ⁇ and nitric oxide (Akasi S., J. Immunol. 164, 3471, 1999).
  • mice In mice, a soluble TLR4 splice variant of TLR4 was reported. It has been reported that the soluble TLR4 consisting of 86 amino acid residues showed an activity of suppressing cell activation by LPS. (I warn i KI, J. Immunol, 165, 6682, 2000.)
  • CD14 directly binds to the TLR or to a complex of the TLR and accessory molecules, a low molecular weight substance whose other functions have not been elucidated.
  • the binding region of the stitch 014 is completely unknown.
  • a human anti-CD14 antibody that controls signaling of LPS through human CD14 As a human anti-CD14 antibody that controls signaling of LPS through human CD14, a 3C10 antibody that binds to the 7th to 14th positions of human 014 (Steinman: J. Exp. Med., 158) : 126 (1983) and Juan TS: J. Biol. Chem., 270: 29, 17237 (1995)) and MEM-18 antibodies (Bazi 1: Eur. J. Immunol., 16: 1583 (1986) and Juan TS: J. Biol. Chem., 270, 10) , 5219 (1995)), and its application to a therapeutic agent for sepsis is disclosed.
  • an antibody that recognizes the binding region of LPS or an antibody that suppresses the binding of LPS cannot be expected to have the effect of suppressing the signal transmission of LPSZCD14 that has already been formed.
  • the recognition site of the 18E12 antibody for CD14 has not been clarified, and the mechanism by which cytokine release is suppressed is unknown.
  • An anti-inflammatory peptide that focuses on the binding site of human CD14 to LPS is an anti-inflammatory peptide based on amino acids 7-10, 11-14, and 57-64 from the N-terminus of CD14. Hei 10—51 1954) is disclosed. Since these peptides have the ability to bind to LPS, they remove LPS and do not suppress the signal transduction of CD14 LPS already formed into cells.
  • an anti-inflammatory peptide in which the binding site to LPS of human CD14 has been modified it has an amino acid that differs from the natural sequence at the 7th to 10th positions from the N-terminus of CD14, or 1 amino acid from the N-terminus of CD14.
  • An anti-inflammatory polypeptide (Table 10-512142) including a soluble CD14-related polypeptide in which the 14th to 14th positions have been deleted has been disclosed. These peptides suppress the transmission of LPS signals into cells because the binding site to LPS is modified. However, it does not suppress intracellular signaling of the already formed CD14ZLPS.
  • conventional substances that suppress the function of CD14 are substances that inhibit the binding of specific bacterial cell components to CD14, and it is difficult to inhibit the binding to other bacterial cell components. Moreover, the effect of suppressing the signal transduction of CD14ZLPS already formed cannot be expected.
  • An object of the present invention is to provide a substance having a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR, which can regulate intracellular signal transmission even if the CD14 ZL PS is already formed, a method for producing the same, and a method for treating sepsis. It is to provide a drug screening method and a pharmaceutical composition for sepsis. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to overcome the above-mentioned conventional problems, and provide an anti-CD14 antibody that inhibits the binding between CD14 and TLR.
  • the present invention provides a method for producing an antibody using the specific region by specifying a recognition region required for the anti-CD14 antibody to perform the action in human CD14.
  • the present invention provides a CD14 variant polypeptide that inhibits the binding between CD14 and TLR. Also provided is a method for producing the CD14 variant polypeptide.
  • the present invention provides the following anti-CD14 antibodies (1) to (11).
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 has any one of amino acids 1 to 6 at the N-terminus and has any amino acid sequence at amino acids 246 to 306 at the C-terminus;
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 has any one of amino acids 1 to 6 at the N-terminus, any one of amino acids 269 to 356 at the C-terminus, and any one of the amino acids 269 to 307.
  • the above has the amino acid sequence substituted with another amino acid.
  • the above-mentioned modified CD14 polypeptide may be a modified CD14 polypeptide, or may be chemically synthesized or artificially expressed by genetic engineering. It is not limited to a manufacturing method.
  • the C-terminus is any one of positions 269 to 356, and at least one of the amino acids 269 to 307 is Leu, Ala, Cys or G1.
  • CD14 low molecular species having a molecular weight of 36 ⁇ 5 kDa that can be obtained from plasma.
  • An inhibitor of binding between CD14 and TLR including an antibody, an antibody fragment, a polypeptide or a CD14 low molecular species.
  • CD14 and a test substance are brought into contact with TLR-expressing cells created by the genetic recombination method to detect changes in specific indices, and the test substance becomes a candidate for a therapeutic agent for sepsis.
  • a method for screening for a therapeutic agent for sepsis comprising the step of determining whether or not to obtain the drug.
  • FIG. 1 is a graph showing luciferase-inducing activity of LPSZs CD14 in human TLR4-expressing cells.
  • HEK293 is a cell that does not express TLR4, and HEKT4-14 is a recombinant HEK293 cell that constantly expresses human TLR4.
  • FIG. 2 is a graph showing that the F1024-1-3 antibody inhibits LPSZCD14-mediated TNF4-mediated activation of NF- ⁇ B.
  • the inhibitory activity was calculated as follows.
  • Luciferase activity without antibody added X 100
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of LPSZCD14 on the suppression of IL-6 production in endothelial cells by the F1024-1-3 antibody.
  • conA indicates control rat IgG.
  • FIG. 4 is a graph showing the inhibitory effect of the F1024-13 antibody on IL-16 production in endothelial cells after formation of the LPSZCD14 complex.
  • FIG. 5 is a chart showing that F1024-1-3 antibody does not inhibit the binding of FITC-LPS to CD14-expressing cells.
  • FIG. 6 is a diagram showing a peptide having an activity of inhibiting the binding of the F1024-1-3 antibody to CD14 (1-356).
  • FIG. 7 shows the binding activity of the F1024-1-3 antibody to various CD14 deletion variants.
  • Figure 8 shows the binding of F1024-1-3 antibody to various CD14 amino acid substitution variants. It is a figure showing synthetic activity.
  • FIG. 9 shows that the molecular weight of the human soluble CD14 C-terminal deletion variant polypeptide was determined using an anti-human CD14 antibody (3C10 and MEM-18).
  • FIG. 10 shows the IL-6 production inhibitory activity of endothelial cells by CD14 modified polypeptide lacking the amino acid at the C-terminal side of human CD14 and LPSZCD14, a serum-derived soluble CD14 low molecular species. It is a graph.
  • s CD14 (1-356) indicates full-length human soluble CD14.
  • sCD14 (1-307), sCD14 (1-285), sCD14 (1-246), sCD14 (1-183) and sCD14 (1-152) are human CDs, respectively.
  • Serum-derived soluble CD14 low molecular species is healthy serum
  • the purified product of the 3C10 column was further purified using an F1033-3-1 column and an F1025-3-1 column, and the concentrated sample is shown.
  • FIG. 11 is a graph showing the activity of LP SZCD14, a CD14-modified polypeptide in which the amino acid of sCD14 (1-307) has been substituted, to inhibit the production of IL-6 from endothelial cells.
  • s CD 14 (1-307) D284A, s CD 14 (1-307) S 286 A and S CD 14 (1-307) C 287 A are the 284th from the N-terminal of s CD 14 (1-307), respectively.
  • the CD14-modified polypeptide in which the amino acid Asp is substituted with A1a, the Ser at the 286th position from the N-terminus with A1a, and the amino acid Cys at the 287th position from the N-terminus with A1a is shown.
  • FIG. 12 is a graph showing the activity of LP SZCD14 to inhibit IL-16 production of endothelial cells by a modified CD14 polypeptide in which the 286th amino acid Ser from the N-terminus of SCD14 (1-307) has been substituted. .
  • S 286A, s CD 14 (1-307) S 286 C and s CD 14 (1-307) S 286 G are the 286th from the N terminal of s CD 14 (1-307), respectively.
  • 1 shows a CD14-modified polypeptide in which the amino acid Ser of SEQ ID NO: 1 has been substituted with A1a, Cys, and Gly.
  • FIG. 13 is a graph showing the activity of CD14-modified polypeptide to inhibit TNF ⁇ ; production of peripheral macrophages by LPS.
  • FIG. 14 is a graph showing the inhibitory effect of sCD14 (1-307) S286C, a CD14 variant polypeptide, on NF-kB activation.
  • the method for calculating the inhibitory activity is the same as in FIG.
  • Fig. 15 shows the binding amount when the LPSZCD14 / TLR4-COS complex was formed using BIACORE3000, and the effect of suppressing binding of TLR4-COS when F1024-113 antibody was bound.
  • FIG. The response is a Biacore index, and is a graph showing the binding amount of 1.2 ng for 1000 RU.
  • Fig. 16 shows LPSZCD I AZTLRA-
  • FIG. 3 is a graph showing the binding amount when a COS complex is formed, and the binding inhibitory effect when CD14 (s286c) is reacted with TLR4-COS cells.
  • the response is a Biacore index, and is a graph showing the amount of 1.2 ng bound to 1 000 shaku11.
  • FIG. 17 shows the results showing the binding ability of CD14-modified polypeptide (SCD14 (1-307) S286A) to LPS.
  • FIG. 18 is a graph showing the results of Western B1 otting obtained by measuring the molecular weight of human serum-derived CD14 polypeptide using an anti-human CD14 antibody (3C10 and MEM-18).
  • Lane 1 is a sample purified from healthy human serum using a 3 C 10 column
  • Lane 2 is a purified 3 C 10 column purified from healthy human serum, followed by F 1033-3-1 column and F 1025-3-1 This is the result of a sample purified and concentrated on a column.
  • FIG. 19 is a graph showing the cytotoxicity-inhibitory activity of CD14 polypeptide derived from human serum by LP SZCD14.
  • the serum-derived soluble CD14 low molecular species refers to a purified product obtained by further purifying a purified 310-column healthy human serum with an F1033-3-1 column and an F1025_3-1 column.
  • FIG. 20 is a graph showing the inhibitory effects of F1024-1.3 and sCD14 (1-307) S286C on the induced production of IL-18 in HEKT4-14.
  • the inhibitory activity was calculated as follows. (Production amount of IL-18 without addition of bovine or recombinant)-Production amount of IL-18 when antibody or recombinant is added X Production amount of IL-18 without antibody or recombinant added X 100
  • FIG. 21 shows the CD14 modified polypeptide in which the amino acid of SCD14 (1-307) was substituted, the Staphylococcus au reuscellsusp endion on CD14 of the 3C10 antibody and the F1024-1-3 antibody.
  • 4 is a graph showing the activity of inhibiting the production of IL-6 of the U-373MG cell line by U-373MG.
  • FIG. 22 is a graph showing the cross-reactivity of the F1024_1-3 antibody with soluble CD14 in dogs, lizards, squid, monkeys, and humans.
  • FIG. 23 is a chart showing the results obtained by examining the binding of the F1024-1-3 antibody to the egret CD14 by the F1uorocytomtry method.
  • FIG. 24 is a graph showing that TNF production is suppressed by pre-administration of the F1024-113 antibody in an LPS-loaded heron sepsis model.
  • FIG. 25 is a graph showing that leukocytopenia is improved by pre-administration of the F1024-1_3 antibody in a LTAZP epG-administered egret sepsis model.
  • FIG. 26 is a graph showing that the values of ALT and creatinine are improved by post-administration of the F1024-1-3 antibody in an LPS-loaded heron sepsis model.
  • the black marks indicate the groups to which the antibody was administered, and the open circles indicate the groups to which the saline was administered.
  • FIG. 27 is a graph showing the effect of the CD14-modified polypeptide on a mouse endotoxin shock model.
  • the first embodiment of the present invention specifically recognizes an epitope containing a part of the region from human No. 269 to No. 315 of human CD14 set forth in SEQ ID NO: 1, and specifically recognizes CD14 and TLR An anti-CD14 antibody having a function of inhibiting the binding of and.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of human CD14.
  • the protein consisting of 356 amino acids described in SEQ ID NO: 1 is the full length of human CD14.
  • epitope is an antigenic determinant and refers to a structural site that specifically binds to an antibody.
  • the regions recognized by antibodies are not limited to those that recognize consecutive amino acid residues on the primary sequence.
  • Some antibodies have an epitope that recognizes the three-dimensional structure of a protein (antibody protein engineering; 4 pages, edited by Keizaburo Miki et al. Kodansha Scientific 1991).
  • an antibody that recognizes a discontinuous amino acid residue in the primary sequence has a three-dimensional structure in which the discontinuous amino acid residue is located at a distance close enough to be recognized by the antibody.
  • Discontinuous amino acid residues may be referred to as epitopes.
  • Epitope containing a part of the region from human CD14 at positions 269 to 315 refers to an epitope that exists at positions 269 to 315 of the amino acid sequence of human CD14.
  • the epitope includes a part of continuous amino acids in the region, but also includes the discontinuous amino acids in the region as described above.
  • a set of continuous or discontinuous amino acids or two or more positions where continuous or discontinuous amino acids are scattered The amino acid set is also included in "a part of the region from human CD14 at positions 269 to 315.”
  • the antibody of the present invention also includes an antibody that recognizes an epitope containing a region other than the region from position 269 to position 315.
  • an antibody that recognizes an epitope containing a region other than the region from position 269 to position 315 For example, the specificity of the epitope formed by one or more amino acid residues in the region from position 269 to 315 of human CD14 and several amino acid residues in the region other than region 269 to 315 of human CD14 Antibodies that are recognized by this are also included.
  • the epitope recognized by this antibody is a single amino acid residue in the region of human CD14 from position 269 to position 315, it recognizes and binds to this amino acid residue, and recognizes and binds to it. This is because it is possible to change the specific function of the region up to the above.
  • the antibody of the present invention specifically recognizes an epitope containing a part of the region of human CD14 from position 269 to position 315, and binds to human CD14.
  • the human CD14 is not limited to sCD14 or mCD14.
  • sCD14 is present in blood
  • mCD14 is present in macrophages.
  • an epitope containing a part of the region from 269 to 315 of human CD14 means, for example, as described in Example 6 described below, that It can be determined by binding to the soluble polypeptide having the 315th amino acid (SCD14 (1-315)) but not to sCD14 (1-268).
  • the antibody of the present invention has a function of inhibiting the binding between CD14 and the TLR by specifically recognizing an epitope containing a part of the region from the 269th position to the 315th position of human CD14.
  • CD14 binds to bacterial cell components, and the bound CD14Z bacterial cell component complex binds to TLRs, transmits signals to cells, and activates cells. When the cells are activated by these signal transmission mechanisms, inflammatory cytotoxicity is released from the cells, and inflammation such as cell damage and sepsis is induced.
  • the antibody of the present invention suppresses cell activation by bacterial components by having a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR, and suppresses inflammation such as cell damage and sepsis.
  • the “binding between CD14 and TLR” is described in detail as the binding between CD14 and a bacterial cell component complex of CD14 and a bacterial cell component and TLR.
  • Bacterial cell components include LPS, LTA, peptide darican (PGN), lipoarabinomannan, and mycoplasma.
  • LPSZCD14 which is a complex of LPS and CD14, transmits signals to cells by associating with TLRs, particularly TLR2 or TLR4.
  • TLRs particularly TLR2 or TLR4.
  • TLR2 or TLR4 When a signal is transmitted into the cell by the TLR, the cell is activated by activation of NF_ ⁇ B via MyD88, IRAK and NIK, and the like.
  • the antibody of the present invention inhibits the binding of LPSZCD14 to TLR.
  • “Has a function of inhibiting the binding of CD14 to TLR” is not limited as long as it has a function of inhibiting the binding of R14 to T14, but for example, Examples 2, 13, 14 or It can be measured and judged by 20 systems. Further, the antibody of the present invention is preferably an antibody that suppresses cell activation of TLR-expressing cells by 30% or more.
  • NF of TLR-expressing cells in the presence of 1 ⁇ gZml of LPS, 0.5 g / m1 of exogenous CD14 at an antibody concentration of 10 wg / m1 or less Antibodies that inhibit ⁇ B activation or IL-18 production by 30% or more are preferred. More preferably, it is an antibody that suppresses 40% or more. More preferably, the antibody suppresses 50% or more. Particularly preferred is an antibody that suppresses 70% or more.
  • the antibody of the present invention is preferably an antibody that suppresses the production of endothelial cell cytokines by exogenous LPSZCD14 to 60% or less. More specifically, IL-16 production of endothelial cells in the presence of 300 ngZm1 of exogenous CD14 at 10 [181111] ⁇ ? Antibodies that suppress to below% are preferred. More preferably, the antibody is suppressed to 40% or less.
  • the binding between CD14 and TLR includes direct binding, binding through another factor, or binding activated by another factor.
  • binding may occur in the presence of animal-derived serum.
  • the binding may occur when the structure of TLR4 or the dimer of TLR4 is stabilized in the presence of MD2.
  • the antibody of the present invention only needs to have a function of inhibiting binding in any case.
  • an anti-CD14 antibody having a function of inhibiting the binding of CD14 to TLR in the presence of animal-derived serum is mentioned.
  • the reason that the antibody of the present invention has a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR is as follows. This is because the region is associated with the binding of CD14 to the TLR. Therefore, an antibody that specifically recognizes an epitope that includes a portion of the region from position 269 to position 315 of human CD14 has the function of inhibiting the binding of CD14 to the TLR by altering the function of that region. Having.
  • an antibody in which the region to be used as an epitope is completely contained in human CD14 at positions 269 to 315 is preferable.
  • a more preferred region to be an epitope is a region from human No. 285 to No. 315 of human CD14 in terms of having an epitope similar to that of the F1024-1-3 antibody of Example. Also preferably, it is a region from human CD14 at positions 269 to 307.
  • the antibody of the present invention is preferably an antibody in which a part of the antigen region contained as an epitope is at least 6 amino acids. More preferably, it is at least 8 amino acids. More preferably, an antibody that specifically recognizes a continuous amino acid as an epitope is preferable.
  • the antibody of the present invention specifically has an epitope containing a part of the region from human No. 285 to 315 of human CD14 in that it has the same epitope as the F1024-1-3 antibody of Example. Recognizing antibodies are preferred.
  • the antibody recognizes an epitope present at the amino acid at position 315 from the amino acid at position 285 in the three-dimensional structure that can be generated when the amino acid at position 294 of CD14 is Pro.
  • Pro has an N atom bonded to the ⁇ -carbon incorporated into the ring structure to form a> ⁇ group, so the primary structure of the polypeptide is limited by the Pro skeleton, and the polypeptide has a three-dimensional structure. Affect. In other words, since Pro has no NH group, Elementary bond cannot be formed and ⁇ -helix cannot be formed (Protein Biotechnology, edited by F. Frank, Baifukan).
  • the antibody does not bind by pointing to the 294th Pro of CD14, but this is due to a change in the conformational structure of CD14. That is, the antibody recognizes an epitope that exists at the 315th amino acid from the 285th amino acid in the three-dimensional structure that can be generated when the 294th amino acid is Pro.
  • the antibody of the present invention is an anti-human CD14 antibody
  • an antibody against a region of a non-human mammal CD14 equivalent to this region exhibits the same effect as an anti-human CD antibody described later.
  • An antibody is included in the present invention.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is the 269th to 315th amino acid sequence of human CD14.
  • an antibody comprising a part or all of the amino acid sequence region of SEQ ID NO: 2 and prepared using a peptide having six or more consecutive amino acids as an immunogen is included in the antibody of the present invention.
  • it is an antibody comprising a part or the whole of the amino acid sequence of the region from position 285 to position 307 of human CD14 and prepared using a peptide having six or more consecutive amino acids as an immunogen.
  • an antibody prepared using a peptide having eight or more consecutive amino acids as an immunogen is preferable.
  • the antibody of the present invention has a function of inhibiting the binding between # 014 and 1 by specifically binding to CD14. What is CD 14? S CD 14 or m CD 14 It doesn't matter. Also included are antibodies having a function of inhibiting the binding of either CD14 to TLR. For example, an antibody having a function of inhibiting the binding of sCD14 present in blood to TLR or an antibody having a function of inhibiting binding of mCD14 present in macrophages and the like to TLR can be mentioned.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody is preferable.
  • the animal species from which the antibody of the present invention is derived is not particularly limited. Rats are preferred for ease of antibody production.
  • human antibodies are preferred.
  • Human antibodies also include human antibodies produced by immunizing human antibody-producing mice.
  • humanized antibodies, phage antibodies, chimeric antibodies and the like are also included in the antibodies of the present invention.
  • a humanized antibody is an antibody in which the constant region and the framework region are human, and the complementarity-determining regions are non-human.
  • a phage antibody is an antibody produced by fusing an antibody to the coat protein of a filamentous phage and displaying the antibody on the surface of a phage particle, and is mainly composed of a single-chain Fv (scFv) form or Fab form.
  • scFv single-chain Fv
  • Used for A chimeric antibody is an antibody comprising a variable region of a monoclonal antibody of a mammal other than human, for example, mouse, and a constant region of a human antibody.
  • the molecular species of the antibody of the present invention is not particularly limited. Immunoglobulins classified into any class, subclass and isotype may be used. Also, antibody fragments such as biologically active Fab, Fab ', and (Fab') 2 are included in the present invention.
  • the antibody of the present invention can be prepared by using a known technique. For example, monochrome A null antibody can be prepared by the following method.
  • Immune cells of a mammal immunized with the entire protein of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a peptide consisting of 6 or more contiguous regions in the region from 269 to 315 as an immunogen are fused with myeloma cells.
  • the antibody of the present invention can be prepared by selecting a clone from the hybridoma by the screening method of the twelfth embodiment of the present invention described below. Further, the antibody of the present invention can be prepared even if a clone that binds to SCD14 (1-315) but does not bind to SCD14 (1-268) is selected.
  • an immunogen is a peptide consisting of six or more contiguous regions in the region from 285 to 307. Also preferably, a peptide consisting of 8 or more consecutive amino acids, more preferably 10 or more consecutive amino acids, particularly preferably 15 or more consecutive amino acids is used as the immunogen.
  • the mammal to be immunized is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the myeloma cells used for cell fusion, and is preferably a mouse, a rat, or a hamus.
  • the myeloma cells various known cells can be used. This includes myeloid cells such as P3, P3U1, SP2Z ⁇ , NS_1, YB20, and Y3-Ag1,2,3.
  • Immunization can be performed by a known method.
  • the antigen is administered intraperitoneally, subcutaneously, intravenously or in a footpad. This antigen may be administered in combination with an adjuvant, and is preferably administered more than once.
  • the immune cells are preferably spleen cells or lymph node-derived cells removed several days after the final administration of the antigen, for example, three days later. Fusion of immune cells and myeloma cells can be performed using a known method such as the method of Milstein et al. (Methods in Enzymol. 73: 3). For example, a method using polyethylene glycol (PEG) as a fusing agent or an electrofusion method can be mentioned.
  • PEG polyethylene glycol
  • the mixing ratio of the immune cells and the myeloma cells is not limited as long as they can be fused, but it is preferable to use 1Z10 or more equivalents of myeloma cells to the immune cells.
  • the PEG concentration is not particularly limited, but preferably 50%.
  • An auxiliary such as dimethyl sulfoxide (DMSO) may be added as a fusion efficiency promoter.
  • Fusion is initiated by adding the heated PEG solution in step 37 to the mixed cells, and after 1-5 minutes of reaction, ending by adding medium.
  • the hybridoma formed by this fusion is cultured for 1 to 7 days in a selection medium such as a medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin (HAT medium) for 1 to 7 days, and separated from unfused cells.
  • a selection medium such as a medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin (HAT medium) for 1 to 7 days, and separated from unfused cells.
  • HAT medium aminopterin
  • ELISA method the agglutination reaction method, and the radioimmunoassay method are mentioned.
  • the established hybridoma is cultured by a known method, and the culture supernatant is used to prepare a monoclonal antibody. Antibody can be obtained.
  • the hybridoma can be proliferated by administering the hybridoma to a mammal having compatibility with the hybridoma, and can be obtained from the ascites.
  • the antibody can be purified using a known purification means such as a salting-out method, a gel filtration method, an ion-exchange chromatography method or an affinity chromatography method.
  • a known purification means such as a salting-out method, a gel filtration method, an ion-exchange chromatography method or an affinity chromatography method.
  • T c mice Trans-chromosome mice were prepared by microcell fusion using the human chromosome 2 fragment (1 ⁇ light chain / and 14 chromosome fragment (Ig heavy chain)) according to the method of Ishida et al.
  • a chimeric mouse having both a human chromosome 2 fragment (Ig light chain ⁇ ) and a chromosome 14 fragment (Ig heavy chain) is produced.
  • Double K ⁇ mice in which endogenous Ig heavy chains and ⁇ chains were knocked out in accordance with the method of Capecchi et al. (Mol. Cell. Biol. 12: 2919-2923, 1992) Manufacture and human dye
  • a transgenic mouse containing a human chromosome 2 fragment (18 light chain ⁇ ) and a chromosome 14 fragment (Ig heavy chain) and knocking out endogenous Ig heavy and ⁇ chains The chromosome mouse is produced
  • the produced Tc mouse produces human-derived antibodies in the blood and some antibodies have a mouse chain, but mouse Ig ( ⁇ ) is not detected.
  • the chromosome is maintained in mice for several generations, and the progeny can be used to produce the following anti-CD14 human monoclonal antibodies.
  • the mixture After mixing 50 g of the purified CD14 antigen with Tc mouse and Thai Yuichi Max Gold (Titer Max Gold, Cyt Rx), the mixture is subcutaneously administered, and 3 weeks later, additional administration is performed in the same manner.
  • the diluted antiserum is reacted with the plate on which the antigen is immobilized, and then the human antibody in the bound serum is detected using an anti-human IgG antibody.
  • Cell fusion is performed 3 days after injecting 50 antigen into the peritoneal cavity of the mouse with increased antibody titer.
  • the collected splenocytes were mixed with mouse myeloma cells (SP2 / O-Ag14), fused with PEG4000 (Merck), and hybridomas were selected using HAT medium containing G418 (lmg / mL).
  • the emerging hybridomas are screened with anti-human IgG, anti-IgG, anti-IgG2, anti-IgG3, or anti-IgG4 antibodies as secondary antibodies, and hybrids that produce human antibodies that bind to CD14. Select a dormer.
  • the human CD14 antibody of the present invention can be obtained by the screening method of the twelfth aspect of the present invention described later.
  • a humanized antibody by the CDR graft method can be prepared using the method described in Nature, 321: 522, 1986.
  • a humanized antibody can be prepared using a mouse partially transfected with a human gene by the method described in J. Immunol 1. Methods 231: 11, 1999. Human mouse chimeric antibody was prepared by the method described in Proc. Natl. Accad. Sc 81: 6851, 1984. Antibody by phage display method was obtained by Annu Rev. Immunol, 12: 433, Using 1994, Di abody, Tri 130 ⁇ , and 6 trabody are ScFv 2, 3, and tetramers, respectively, using FEBS Letter 454: 90, 1999, and Proteine g. 10: 423, 19 97 and FEB Letters 453: 164, 1999.
  • Fab, Fab ', (Fab') 2, etc. which are fragments of the antibody of the present invention, can also be prepared by known methods (Eiji Ishikawa, ultra-sensitive enzyme immunoassay, Gakkai Shuppan Center).
  • Methods for producing antibodies include a method for producing antibodies in plants (Nature 342: 76, 1989) and a method for producing antibodies in mammalian cells such as CHO cells and mouse myeloma cells (S0) (Biotec hnology 36:35, 1994), a method of producing in milk (Na t. Biotechnol 17: 456, 1999), and a method of producing in Escherichia coli (Science 240: 1038, 1988).
  • the polypeptide can be prepared by purifying soluble CD14 in human serum by a known method. Methods using commonly used peptide synthesizers (Peptide Synthesizer-1432A, Perkin-Elma Japan), gene recombination methods (Cancer Research Division, Institute of Medical Science, The University of Tokyo, New Cell, Engineering experiment protocol, Shujunsha).
  • a peptide consisting of six or more consecutive amino acids in the region from No. 269 to No. 315 can be synthesized by the Fmoc method using a 432A peptide synthesizer, and after deprotection with TFA and cleavage from the resin, Purification using a C 18 HPLC column (Capcel Pak, Shiseido) enables preparation of the desired peptide.
  • a hybridoma F1024-1-3 obtained by cell fusion of immune cells and myeloma cells obtained by immunizing rats with CD14 protein purified from human serum as an antigen is produced.
  • Hybridoma F1024-1_3 was established on September 29, 2000 at 1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan by the Ministry of Economy, Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, (Deposit No. P-18061), and transferred from the original deposit to the international deposit on March 16, 2001 (Accession No. FERM BP-7511).
  • the antibody of the present invention has a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR, that is, is an inhibitor of the binding between CD14 and TLR.
  • This has the function of suppressing human CD14-mediated cell activation, and can be used for the treatment or prevention of diseases associated with bacterial infection.
  • diseases associated with bacterial infection For example, it is useful for treating or preventing inflammatory cytokines associated with diseases such as sepsis, especially symptoms associated with elevated TNF levels in blood, and more specifically fever, hypotension, leukopenia, thrombocytopenia It is useful for treating or preventing symptoms such as shock, multiple organ failure and the like.
  • the substance causing cell activation suppressed by the antibody of the present invention is not limited to LPS alone.
  • it suppresses cell activation of CD14 which has formed a complex with LTA, PGN or mycoplasma. That is, as described above, it is also useful for treating or preventing diseases caused by them.
  • the antibody of the present invention has a function of specifically recognizing an epitope including a part of the region from position 269 to position 315 of human CD14, and thus is useful as a tool for qualitatively or quantitatively determining human CD14.
  • this is a measurement method in which an antigen-antibody complex is formed by contacting a sample with the antibody of the present invention, and then the complex is detected or quantified.
  • the sample is exemplified by serum, urine, body fluid or culture supernatant. Examples of the method for detecting or quantifying the antigen-antibody complex include ELISA and RIA.
  • a second aspect of the present invention is a hybridoma that produces the monoclonal antibody of the present invention.
  • the hybridoma of the present invention can be prepared by the method described in the first embodiment of the present invention.
  • a preferred example of the hybridoma of the present invention is a hybridoma that produces a F1204-3-1-3 antibody, which is a preferred example of the antibody of the present invention. 0 6 1).
  • a third aspect of the present invention is a peptide comprising eight or more consecutive amino acids in the region from human number 26 9 to human number 3 15 of human CD14 shown in SEQ ID NO: 1.
  • it is a peptide containing eight or more consecutive amino acids in the region from No. 285 to No. 37.
  • it is preferably a peptide consisting of 10 or more consecutive amino acids, particularly preferably 15 or more consecutive amino acids.
  • the peptide of the present invention can be produced by the method described in the first embodiment of the present invention.
  • a fourth aspect of the present invention is a method for producing an antibody, comprising using the peptide of the third aspect of the present invention as an immunogen.
  • Preferred examples of peptides used as immunogens are examples of preferred peptides of the third aspect of the present invention.
  • peptides are usually not immunogenic due to their small molecular weight. Therefore, the peptide is bound to the carrier using a functional group on the side chain contained in the amino acid of the peptide to form an immunogen.
  • a carrier bovine serum albumin, keyhole limb hemocyanin (KLH), thyroglobulin, or apoalbumin is used. It is preferable that the antibody produced by the method of the present invention has a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR.
  • a fifth aspect of the present invention is a modified CD14 polypeptide which has a function of inhibiting the binding of CD14 to TLR, and is one of the following (1) or (2).
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 has any one of amino acids 1 to 6 at the N-terminus and has any amino acid sequence at amino acids 246 to 306 at the C-terminus;
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 has any one of amino acids 1 to 6 at the N-terminus, any one of amino acids 269 to 356 at the C-terminus, and any one of the amino acids 269 to 307.
  • the above has the amino acid sequence substituted with another amino acid.
  • the following mainly describes the amino acid sequence of the human CD14 polypeptide, and the amino acid sequence of human CD14 may be simply referred to as the amino acid sequence of CD14.
  • CD 14 is a non-human species of CD 14 poly. It may be a peptide.
  • CD14 variant polypeptide is a polypeptide in which a part of the CD14 polypeptide has been deleted, a polypeptide in which a part of the amino acids of the CD14 polypeptide has been substituted, or an amino acid in the CD14 polypeptide. And a polypeptide to which is added. Also included are variant polypeptides in which these modifications are combined.
  • the polypeptide of the present invention has a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR.
  • the details of the function of inhibiting the binding between CD14 and TLR are as described in the first embodiment of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention is preferably a polypeptide that suppresses cell activation of TLR-expressing cells by 30% or more.
  • the polypeptide concentration should be less than 10;
  • a polypeptide that suppresses NF- ⁇ B activation or IL-8 production of TLR-expressing cells in the presence of 5, 0.5 gZm1 of exogenous CD14 by 30% or more is preferable. More preferably, it is a polypeptide that suppresses by 40% or more. More preferably, it is a polypeptide that suppresses 50% or more. Particularly preferred are polypeptides that inhibit more than 70%.
  • the CD14 variant polypeptide of the present invention is preferably a polypeptide which does not itself induce endothelial cell cytokines in the presence of LPS.
  • a polypeptide that does not induce IL-6 production of endothelial cells in the presence of 1 OngZml of LPS when the concentration of the polypeptide is 300 ng / ml or less is preferable.
  • No induction means that the measured IL-6 is lower than the detection limit in the Atsushi system. For example, in measuring IL-16 production,
  • the detection limit or less is 5 OpgZml or less.
  • modified CD14 polypeptide of the present invention is preferably a polypeptide that suppresses the production of cytokines of endothelial cells by exogenous LPSZCD14 to 60% or less.
  • a polypeptide concentration of 300 ng / m1 or more, in the presence of 10 ngZm1 of LPS and 300 ngZm1 of exogenous CD14 is preferred. More preferably, it is a polypeptide that suppresses it to 40% or less.
  • LPSZCD 14 is a complex in which LPS and CD 14 bind.
  • a CD14 variant polypeptide having a C-terminal at any of positions 246 to 285 is preferable.
  • the low molecular weight CD14 of the present invention described below has a C-terminal at any of positions 246 to 285 from the viewpoint of molecular weight, and has the same function as the modified CD14 polypeptide of the present invention. .
  • the C-terminus is any one of positions 269 to 356, and at least one of the amino acids 269 to 286 is at least one of other amino acids.
  • Preferred is a CD14 variant polypeptide substituted for 1.
  • the C-terminus is any one of positions 284 to 356, and at least one of the amino acids 284 to 286 is another amino acid, such as Leu, Ala, ⁇ 5 or.
  • 1 is a CD14 variant polypeptide substituted for 1.
  • the polypeptide of the present invention binds to bacterial cell components.
  • LPS CD 14 The binding sites are 7th to 14th and 57th to 64th, and the sequence of that site is the same as that of the polypeptide of the present invention.
  • polypeptide of the present invention maintains its function
  • 1 to 6 amino acids at the N-terminal may be deleted, substituted, inserted or added.
  • a polypeptide having Met added to the N-terminus is also included in the polypeptide of the present invention.
  • the intermediate amino acid sequence may have one or several amino acids deleted, substituted, inserted or added.
  • the polypeptide of the present invention may be subjected to any modification as long as its characteristics are not lost.
  • the modification include a translation process or a post-translational modification and a chemical modification of a polypeptide which may be subjected to a process in which the protein is produced by culturing animal cells or eukaryotic cells such as yeast.
  • sugar additions to proteins include, for example, addition of methionine and sugar chains, and N-glycosylation, monoglycosylation and non-enzymatic sugar addition are known as sugar additions to proteins.
  • This polypeptide may or may not have any sugar chains.
  • the number, length, or sugar composition and sequence of sugar chains are not particularly limited because they vary depending on the composition of the medium used for culturing the host, and the like. Other natural modifications include lipid binding.
  • polypeptide can be further variously modified.
  • the position that can be modified is an N-terminal or C-terminal amino acid residue or a functional group of a side chain, for example, a synthetic polymer such as polyethylene glycol, styrene / maleic acid copolymer, dextran, pyran copolymer, or polylysine.
  • a synthetic polymer such as polyethylene glycol, styrene / maleic acid copolymer, dextran, pyran copolymer, or polylysine.
  • Lipids natural molecules such as polysaccharides, physiologically active molecules such as hormones, inorganic substances such as magnesite, etc. Natl. Accad. Sci. USA, 84, 1487-1491, 1981); and Biochemi. stry, 28, 6619—624, 1989
  • modified polypeptides include, for example, aliphatic esters of carbonyl groups, amides of carboxyl groups by reaction with ammonia or primary or secondary amines, and acyl residues (eg, alkanols or carboxyl alloys). N-acyl derivatives of free amino groups of amino acid residues formed by amino acid residues, or ⁇ -acyl derivatives of free hydroxyl groups formed by amino acid residues (for example, hydroxyl groups of serine or threonine residues). Included.
  • polypeptide of the present invention can also be modified as described above by a combination of known methods as described above. Therefore, the polypeptide of the present invention includes those modified as long as the characteristics are not lost. In addition, these modifications can modify or improve the activity or function of the polypeptide of the present invention, impart another activity or function, or combine them.
  • the activity or function may include stability, solubility, pharmacokinetics, or directivity to a particular cell, tissue or organ.
  • modified polypeptides are also included in the scope of the present invention.
  • the polypeptides of the present invention also include those that exist in the form of salts.
  • the “salt” means both a salt of a lipoxyl group of a protein molecule and an acid addition salt to an amino group.
  • Salts of carboxyl groups include inorganic salts such as sodium, calcium, ammonium, trivalent iron or zinc salts, and organic salts. For example, salts formed by triethanolamine, arginine or lysine, piperidine, proforcein and the like are included.
  • Acid addition salts include, for example, salts with mineral acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids such as acetic acid or oxalic acid.
  • polypeptide of the present invention can be applied to medicines, in such a case, it is preferable that the above-mentioned modification and the like maintain pharmaceutical acceptability.
  • the polypeptide of the present invention has a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR, that is, is a binding inhibitor between CD14 and TLR.
  • This has the function of suppressing human CD14-mediated cell activation, and can be used for treatment or prevention of diseases associated with bacterial infection.
  • diseases such as sepsis, particularly symptoms associated with elevated TNF levels in the blood, and more specifically fever, hypotension, leukopenia, thrombocytopenia, It is useful for treating or preventing symptoms such as shock and multiple organ failure.
  • the substance causing cell activation suppressed by the polypeptide of the present invention is not limited to LPS alone.
  • the method for producing the polypeptide of the present invention is not particularly limited, and may be artificially synthesized using a commonly used chemical synthesizer (Peptide Synthesizer 430A type, Perkin-Elmer Japan). It may be obtained by a genetic recombination method. Further, precursor polypeptides separated and purified therefrom are obtained by deletion or fragmentation by appropriate chemical treatment, for example, treatment with an enzyme, and those obtained by chemically binding them. And multimerized ones.
  • the protein is produced by genetic engineering in terms of the amount of production, the homogeneity or purity of the produced protein, for example, because it does not contain other contaminating proteins derived from humans. Specific examples will be described in detail in Examples.
  • a sixth aspect of the present invention is a gene encoding the polypeptide of the fifth aspect of the present invention.
  • the DNA triplet (codon) of the gene encoding the amino acid exists in one to six types depending on the type of the amino acid. Therefore, the triplet (codon) of the gene encoding the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention is known.
  • the DNA base sequence is not limited to one type. Therefore, as long as it is a gene containing a base sequence encoding the polypeptide of the present invention, any gene consisting of any base sequence is included in the scope of the present invention.
  • Preferred nucleotide sequences of the DNA of the gene of the present invention are shown in SEQ ID NOs: 4 to 6.
  • the present invention also relates to a DNA encoding a polypeptide having a function of hybridizing with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 to 6 under stringent conditions and inhibiting the binding of CD14 to TLR.
  • a DNA encoding a polypeptide having a function of hybridizing with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 to 6 under stringent conditions and inhibiting the binding of CD14 to TLR.
  • Stringent conditions include, for example, 50% formaldehyde, 50 times the concentration of standard citric acid solution (SSC), 5 OmM phosphate buffer (pH 6.5-6.9), 40 g salmon sperm DNA, 4 times Hybridization is performed at a temperature 25 ° C lower than the Tm determined by the nucleotide sequence of DNA in a solution of Denhardt's solution (Funakoshi) at a concentration.
  • SSC standard citric acid solution
  • 5 OmM phosphate buffer pH 6.5-6.9
  • 40 g salmon sperm DNA 4 times Hybridization is performed at a temperature 25 ° C lower than the Tm determined by the nucleotide sequence of DNA in a solution of Denhardt's solution (Funakoshi) at a concentration.
  • Sambrook J. Standard citric acid solution
  • 5 OmM phosphate buffer pH 6.5-6.9
  • 40 g salmon sperm DNA 4 times Hybridization is performed at a temperature 25 ° C lower than the T
  • the gene of the invention may be cDNA, chromosomal DNA and combinations thereof, as well as cDNA containing an appropriately spliced intron.
  • the DNA of the present invention is cDNA because of the ease of handling by genetic engineering.
  • RNA corresponding to the DNA of the novel gene of the present invention or DNA and RNA containing sequences complementary to the DNA of the novel novel gene are also provided.
  • the DNA of the novel gene of the present invention and its complementary DNAs and RNAs may complementarily bind to each other to form a double strand or a triple strand.
  • the nucleic acid base may have a universal base such as inosine.
  • the gene of the present invention may be obtained by any method. For example, it may be chemically synthesized, or may be obtained from an appropriate DNA library. (Polymerase Chain Reaction) method. Also, the gene or a fragment thereof obtained by these methods can be prepared by annealing and ligation as necessary.
  • the DNA of the gene of the present invention can be chemically synthesized as follows. Specifically, the DNA of the gene of the present invention is divided into fragments of about 20 to 30 bases and synthesized as a plurality of fragments using a DNA chemical synthesizer (for example, Model 394, manufactured by Applied Biosystems). Then, if necessary, the 5 'end of each fragment is phosphorylated to anneal each fragment, and ligated to obtain the desired DNA.
  • a DNA chemical synthesizer for example, Model 394, manufactured by Applied Biosystems.
  • the gene of the present invention can also be obtained by the PCR method using a genomic library or a cDNA library or the like as type III.
  • a sense primer and an antisense primer were designed which were designed in combination with a restriction enzyme recognition sequence and the like as necessary.
  • Any known method for DNA library, etc. (Michael AI. Etc., Polymerase
  • the DNA library described above is not particularly limited as long as it contains the DNA of the gene of the present invention or a part thereof. Therefore, a commercially available DNA library may be used, and appropriate cells such as lymphocytes obtained from human peripheral blood, human cell lines, or hybridomas may be used if necessary. After activation with an activator, cDNA may be prepared and used according to the method of Sambrook J. et al. In addition, a polypeptide having a human CD14 signal sequence consisting of 19 amino acids as described below and having the peptide sequence of SEQ ID NO: 1 starting from 1 at the N-terminus and 1 at the C-terminus of the leucine No.
  • the transformant containing DNA encoding the polypeptide consisting of the peptide sequence of 307 lysine at the C-terminus and serine 286 replaced by alanine is dated March 14, 2000. Deposited with Biotechnology, Industrial Technology Research Institute, 1-3-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan (Accession No. P-17777 and Accession No.P-17778, respectively). The deposit was transferred to the international deposit (accession number FERM BP-7479 and accession number F ERM BP-7480, respectively).
  • the gene of the present invention can be used for producing the recombinant vector of the seventh aspect of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention can be homogenized. And can be used for mass production. This makes it possible to provide the polypeptide of the present invention as a main component of a therapeutic agent to the field of medicine or to use it as a diagnostic agent.
  • the method for producing the polypeptide of the present invention using the DNA of the gene of the present invention is described in the description of the ninth embodiment of the present invention.
  • a seventh aspect of the present invention is a recombinant vector containing the gene of the sixth aspect of the present invention.
  • the recombinant vector of the present invention may be in any form, such as circular or linear, single-stranded or double-stranded, and a complex thereof, and may be appropriately selected depending on the purpose. From the viewpoint of easiness in handling and incorporation into a host, it is preferably a circular form, and from the viewpoint of stability and the like, it is preferably a double-stranded form.
  • the recombination vector of the present invention is a recombinant vector in which one or more bases are added to one or both of the 5 ′ end and the 3 ′ end of the DNA base sequence of the gene of the present invention. There may be.
  • the base added here may be any base as long as it does not cause a coding frame shift in the DNA of the gene of the present invention.
  • a base sequence encoding an adapter sequence, a linker sequence, and a signal sequence Base sequences encoding other polypeptides such as 3-galactosidase, or sequences added for the purpose of increasing the detection sensitivity when preparing DNA probes and the like.
  • the recombinant vector of the present invention preferably contains other base sequences as necessary, in addition to the gene of the present invention.
  • other base sequence refers to the sequence of the enhancer, the sequence of the promoter, the sequence of the ribosome binding site, the base sequence used to amplify the copy number of DNA, the translation initiation codon, and the signal peptide.
  • Nucleotide sequence a nucleotide sequence encoding another polypeptide, a translation termination codon, a poly-A additional sequence, a splice sequence, a replication origin, a gene sequence serving as a selection marker, and the like.
  • the recombinant vector preferably contains at least the sequences of a translation initiation codon, a termination codon, a replication origin, and a selectable marker gene in addition to the gene of the present invention, and further contains a promoter sequence that functions in a host.
  • Those containing are more preferred.
  • those containing a signal peptide-encoding sequence in addition to these sequences are preferable because host cells can be transformed so as to secrete and express the polypeptide of the present invention.
  • the 5 'end of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing starts from adenine 174, the 3' end DNA consisting of any sequence from 722 thymine to 109 adenine, or the 5 'end starts from 174 adenine.
  • the 3 'end is a DNA consisting of any of the sequences from 980th guanine to 1241 cytosine, and a part of the triplet encoding the amino acid of the 978th cytosine to 1094 guanine sequence is replaced with GCT or GCG ( DNA replaced with A1a codon), GGT (G1y codon), CTT (Le u codon) or TGT (Cys codon)
  • GCT or GCG DNA replaced with A1a codon
  • GGT G1y codon
  • CTT Le u codon
  • TGT Cys codon
  • a recombinant vector connected downstream of a signal sequence encoding a fernal peptide is prepared in the vector and used to transform an appropriate host.
  • a CD14 variant polypeptide in which the C-terminus of the polypeptide of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is any of positions 183 to 306, or the C-terminal of which is in the position 269 to
  • the signal sequence to be connected can be selected as appropriate, but the human CD14 metG1uArgAlaSerCys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu LeuPro Leu Va1His A signal sequence encoding the signal peptide of the sequence of V a1 Ser Ala (Goyer et al., Numeric Acid Research, 16, 4173, 1988) is preferred.
  • Escherichia coli When Escherichia coli is expressed as an inclusion body using Escherichia coli as a host, it is preferable to add methionine or a peptide containing methionine at the N-terminus.
  • the selection marker gene examples include an ampicillin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a neomycin resistance gene, a thymidine kinase gene, and the like.
  • a recombinant vector containing at least two selection markers can be used.
  • a sequence used for the purpose of amplifying the copy number a sequence of the dehydrofolate reductase gene (dhfr) or the like can be used.
  • Promoter sequences that function in the host include the trp motor or 1ac promoter or T7 polymerase when the host is E. coli, and the eukaryotic cells such as yeast or COS cells when the host is E. coli.
  • a preferred example of the recombinant vector of the present invention is one that transforms a eukaryotic cell such as an animal cell or yeast so as to express the polypeptide of the present invention from the viewpoint of a host. Therefore, the recombinant vector of the present invention comprises at least a translation initiation codon, a termination codon, a poly-addition sequence in addition to a selectable marker gene, and a promoter of SV40 functioning in animal cells, a promoter of EF1 ⁇ , Promoter of SRa A promoter having an A ⁇ X1 promoter that functions overnight or in yeast, and a promoter having a replication starting point of SV40 and the like are mentioned as preferred examples of the recombinant vector of the present invention.
  • the recombinant vector of the present invention can be prepared by a method of ligating the DNA of the gene of the present invention to another DNA fragment having an arbitrary nucleotide sequence, or a method of introducing DNA into an arbitrary vector (Sambr. ook J. et al., Mo lecular C l on ing, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Laboratory, New York, 1989).
  • DNA and vector are each digested with an appropriate restriction enzyme, and each obtained fragment may be ligated using DNA ligase.
  • the vector may be any vector such as a plasmid vector, a phage vector, and a virus vector, and commercially available products may be used. Representative vectors include pUC118, pBR322, pSV2-dhfr, pBluescriptll, PHILSI, ⁇ ZapII, ⁇ gt10, pAc700, YRP17, p EF—BOS, pEFN_II and the like.
  • the recombinant vector of the present invention may be used for any purpose. For example, it may be used for industrially producing the polypeptide of the present invention, or may be used for amplifying and mass-producing the novel DNA of the present invention. Further, the recombinant vector of the present invention can be used for producing the transformant of the fourth aspect of the present invention.
  • An eighth aspect of the present invention is a transformant characterized by being transformed with the recombinant vector of the present invention. That is, the transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell or microorganism.
  • the transformant of the present invention may be a transformant of a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • Prokaryotic cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • Examples of eukaryotic cells include mammalian cells such as COS cells, CHO cells, HeLa cells, and Namalwa cells, as well as insect cells such as Sf cells and yeast. This Among them, transformants obtained by transforming Escherichia coli, mammalian cells, and yeast are preferred because they are easy to handle and high expression levels can be expected.
  • gene copy number can be increased,
  • yeasts since the secretory production of foreign proteins is large, yeasts of the genus Pichia or Schizosaccharromy cespombe, which has additional sugar chains similar to mammals, should be used as hosts. Is preferred.
  • the vector used for preparing the recombinant vector of the present invention must be of a type suitable for the host cell.
  • examples of preferable combinations of the vector and host used in the recombinant vector include PUC118 and E. coli, and host E. coli having pET and T7 RNA polymerase expression system (Majerle A. et al .: Protain Exp. r. Purif., 17:96, 1999), p EF—B ⁇ S and COS cells or C
  • a promoter, a base sequence encoding a signal peptide, a marker gene and the like included in the recombinant vector are also suitable for the host.
  • the recombinant vector in order to obtain a transformant that expresses the polypeptide of the present invention, the recombinant vector must have a sequence necessary for expression such as an appropriate promoter.
  • a recombinant vector suitable for the above-mentioned production of the present invention is provided, which is a recombinant vector suitable for the above-mentioned production.
  • the host cell may be transformed with a recombinant vector containing the nucleotide sequence encoding
  • Methods for introducing the recombinant vector of the present invention into host cells include electroporation, protoplast method, alkali metal method, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, microinjection method, and method of influencing using virus particles.
  • Any suitable method for the host or recombinant vector may be selected from other known methods (see Special Issue on Experimental Medicine, Genetic Engineering Handbook, Yodosha, 1991, etc.).
  • Use of the calcium phosphate method or the DAE_Dextran method enables efficient transformation of mammalian cells. Therefore, when the host cell is a mammalian cell, it is preferable to use these methods.
  • the transformant of the present invention is preferably a transformant that expresses the polypeptide of the present invention, and particularly preferably one that expresses the polypeptide and secretes it into the culture supernatant.
  • the use of such a transformant makes it easy to produce the polypeptide of the present invention in large quantities.
  • the transformant of the present invention may be used for any purpose, the transformant of the present invention or the recombinant DNA molecule of the present invention can be produced in large quantities, or the polypeptide of the present invention can be produced industrially. It can be used for the purpose of efficient production.
  • a ninth aspect of the present invention is a method for producing the polypeptide of the present invention, comprising a step of culturing the transformant of the present invention.
  • the method for producing the transformant of the present invention is as described above.
  • the transformant of the present invention is cultured, and if necessary, gene amplification or expression induction is performed.
  • the culture mixture is then collected, concentrated, solubilized, dialysed, and
  • the polypeptide of the present invention is purified by appropriately combining various operations such as chromatography.
  • “Culture mixture” refers to a transformant, a medium containing the transformant, or a culture supernatant or lysate of cells.
  • the polypeptide can be purified from the culture supernatant.
  • cells suitable for the host cell are appropriately selected from lysozyme treatment, detergent treatment, freeze-thaw, pressurization, ultrasonic treatment and other methods. After dissolving or crushing the polypeptide, the polypeptide is recovered as a soluble fraction or an insoluble fraction by a method such as centrifugation or filtration, and purified.
  • virus key (Wi11 sky) (J. B acterio 1.1, 127, 595) — 609, 197 6) can be employed to recover the polypeptide.
  • Culture of the transformant can be performed by a general method with reference to various publications (for example, “Microbial Experiment Method” edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Chemical Co., Ltd., 19 92, see).
  • an appropriate drug is selected and used depending on the incorporated promoter.
  • 3 ⁇ -indoleacrylic acid is used when the trp promoter is incorporated
  • dexamethasone is used for the MMT V promoter
  • methanol is used for the ⁇ 1 promoter.
  • a typical example of a method for amplifying a gene includes a method using methotrexate when a dh fr-deficient CH ⁇ cell is used as a host and a vector having dh fr is used.
  • the transformant used in the production method is not limited as long as it is the transformant of the present invention.
  • the transformant is any one of mammalian cells such as COS cells and CHO cells, yeast, or Escherichia coli. It is preferable that the transformant uses a cell selected from the above as a host.
  • the cells are pre-cultured with L-broth and adjusted to a volume of 150 with respect to the M9-CA medium. Inoculate and culture at 37 ° C. A few hours after the start of culture, when the OD550 value of the medium reaches 1 to 4 (that is, logarithmic growth phase), 3 / 3-indoleacrylic acid is added to a final concentration of 10 // gZm1 to induce expression. I do. By further culturing for about 1 to 2 days, a culture mixture containing the target protein can be obtained.
  • yeast of the genus Pichia transformed with a recombinant vector having the A ⁇ X1 promoter pre-culture in BMGY medium for about 2 days, replace the medium, and induce expression by adding methanol. . Furthermore, culturing is performed at 30 for about 1 to 2 days to obtain a culture mixture containing the target protein.
  • a transformant obtained by transforming a mammalian cell such as a CHO cell with a recombinant vector having an EF1 ⁇ promoter is a DME containing 10% fetal bovine serum. Incubate in M medium. The cells are implanted at a concentration of about 1 to 10 ⁇ 10 4 cells Zm 1 and cultured under the conditions of 37, 5% carbon dioxide, and Z 95% air. Usually, the medium becomes confluent after 2-3 days, at which point the medium is replaced with serum-free D-MEM. Subsequently, by culturing for 2 to 3 days, a culture mixture containing the target protein can be obtained. When the production amount of the target protein is small, it is possible to increase the production amount by amplifying the gene with methotrexate as described above.
  • an appropriate method is appropriately selected from methods usually used for purifying polypeptides. Specifically, salting-out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, various affinity chromatography such as antibody chromatography, etc. Appropriate methods may be appropriately selected and combined from commonly used methods such as chromatofocusing, adsorption chromatography and reverse phase chromatography, and purification may be performed using an HPLC system or the like as necessary.
  • the polypeptide of the present invention may be expressed as a fusion protein with Escherichia coli / 3-galactosidase or another polypeptide.
  • any of the purification steps In this case, it is necessary to perform an operation of treating the fusion protein with a chemical substance such as bromocyan or hydroxylamine or an enzyme such as protease to cut out the protein.
  • the transformant used is Escherichia coli and the protein is produced as an inclusion body, which is an insolubilized protein
  • the steps of solubilizing, denaturing, and refolding the inclusion body may be performed at an appropriate purification step (Thomas E et al., J. Mo 1 ecu 1 ar Biol ogy, 87, 563-577). , 1974). Specifically, first, the cells are disrupted and centrifuged to collect the pellet.
  • a solubilization buffer containing an appropriate amount of urea or guanidine hydrochloride, a surfactant, reduced glucanthione, and oxidized dalbanion for example, 5 M guanidine hydrochloride, 0.005% Tween 80 50 mM Tris hydrochloride ( pH 8.0), 5mM EDTA, 2mM reduced daltuthione, 0.02mM oxidized daltathione
  • the solution from which guanidine hydrochloride has been removed is dialyzed and refolded. When expressed as a fusion protein, after these operations, unnecessary protein portions are cleaved with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as protease, and then appropriate chromatography is performed.
  • the polypeptide of the present invention can be industrially mass-produced uniformly with high efficiency.
  • a tenth aspect of the present invention is a CD14 low molecular weight species having a molecular weight of 36 soil and 5 kDa, which can be obtained from plasma.
  • the low molecular weight CD14 of the present invention has a molecular weight of about 36 ⁇ 5 kDa.
  • the CD14 low molecular species of the present invention can be obtained from plasma.
  • the term "obtainable from plasma” refers to a molecule that can actually be obtained from plasma, and the actual method of preparation is not limited. As long as the molecule can be obtained from plasma, for example, a molecule actually obtained from plasma, a molecule obtained from a source other than plasma, or a molecule obtained by genetic modification included. For example, molecules obtained from body fluids such as urine or milk are also included.
  • the CD14 low molecular species of the present invention can be substantially purified as follows.
  • Soluble CD14 all molecular species polypeptides are bound by affinity chromatography using an anti-CD14 antibody that recognizes the amino terminus, and eluted to form soluble CD14 molecules in blood. A seed polypeptide is obtained. Next, only the soluble CD14 high molecular weight polypeptide in blood was absorbed using an anti-CD14 antibody that was confirmed to bind only to high molecular weight species among all soluble CD14 molecular species. By removing, the CD14 low molecular species can be substantially purified.
  • anti-CD14 antibody that recognizes the amino terminal
  • anti-CD14 antibodies that have been confirmed to bind only to high molecular species
  • Transformants producing F1033-3-1 and F1025-3-1 plants were as of February 9, 2001 and March 30, 2001, Tsukuba, Ibaraki, Japan. ⁇ Higashi 1-chome No. 1-3, deposited at the Biotechnology Research Institute (accession number P-17209 and accession number P-17350, respectively) .From September 11, 2000, the original deposit was changed to an international deposit. Transfer (accession number FERM BP-7295 and accession number FERM BP-7296, respectively).
  • an appropriate method from the methods usually used for purifying polypeptides from all molecular species of CD14. Specifically, salting out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, other affinity chromatography, chromatofocusing method, Adsorption chromatography and reversed-phase chromatography Appropriate methods can be appropriately selected and combined from commonly used methods such as filtration, and if necessary, purification can be performed using an HP LC system or the like.
  • the low molecular species of CD14 of the present invention has a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR, that is, is an inhibitor of the binding between CD14 and TLR.
  • This has the function of suppressing human CD14-mediated cell activation and can be used for the treatment or prevention of diseases associated with bacterial infection.
  • diseases associated with bacterial infection For example, it is useful for treating or preventing inflammatory cytokines associated with diseases such as sepsis, particularly symptoms associated with elevated TNF levels in the blood, and more specifically fever, hypotension, leukopenia, and platelets It is useful for treating or preventing symptoms such as hypoxia, shock and multiple organ failure.
  • the substance causing cell activation suppressed by the polypeptide of the present invention is not limited to LPS alone.
  • cell activation of CD14 complexed with LTA, PGN or mycoplasma is suppressed. In other words, it is useful for treating or preventing diseases caused by these as described above.
  • the CD14 low molecular species of the present invention has a part of the amino acid sequence of CD14, as can be seen from the above purification method. That is, it has a portion that matches the amino acid sequence of the polypeptide of the fifth aspect of the present invention.
  • the molecular weight is between s CD (1-285) and s CD (1-246). This indicates that the low molecular species of CD14 has an N-terminus of CD14 around 1-6 and a C-terminus of around 246-285.
  • the low molecular weight CD14 of the present invention has a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR. Furthermore, CD14 itself does not induce endothelial cell cytoin in the presence of LPS, and suppresses the production of cytokines in endothelial cells by exogenous LPSZCD14. I do.
  • An eleventh aspect of the present invention is a binding inhibitor between CD14 and TLR, including an antibody, an antibody fragment, a polypeptide or a CD14 low molecular species.
  • the binding inhibitor of CD14 and TLR of the present invention includes any antibody, polypeptide or CD14 low molecular weight species that inhibits the binding of CD14 to TLR.
  • the binding inhibitor of the present invention between CD14 and TLR is an agent that inhibits the direct binding of CD14 to TLR, or that CD14 binds to TLR via a third substance to form a complex or the like.
  • an inhibitor that suppresses cell activation of TLR-expressing cells by 30% or more is preferable as the inhibitory ability.
  • TLR expression in the presence of 1 ?? 3 of 18/1111 and 0.5 gZm1 of exogenous CD14 at inhibitor concentrations of 1 ⁇ g / ml or less are preferred. More preferably, it is an inhibitor that suppresses at least 40%. More preferably, the inhibitor suppresses 50% or more. Particularly preferred are inhibitors that suppress 70% or more.
  • binding inhibitor between CD14 and TLR of the present invention include the antibody, the antibody fragment of the first aspect of the present invention, the polypeptide of the fifth aspect of the present invention, and the tenth aspect of the present invention.
  • CD 14 low molecular species.
  • the binding inhibitor of CD14 and TLR of the present invention inhibits the binding of CD14 to TLR, thereby inhibiting the signal transmission from CD14 to TLR. It blocks signal transduction after R, suppresses cell activation, and has a therapeutic effect on sepsis.
  • the binding inhibitor of CD14 and TLR of the present invention is useful for treating or preventing a disease associated with bacterial infection.
  • a disease associated with bacterial infection For example, sepsis, rheumatoid arthritis, AIDS, autoimmune disease, hemolytic anemia, tumor, atopic disease, allergic disease, sarcoidosis, malaria, psoriasis, fever, hypotension, ischemic heart disease, leukopenia, thrombocytopenia It is useful for shock and multiple organ failure.
  • it is useful for treating or preventing inflammatory cytokines associated with these diseases, particularly symptoms associated with an increase in blood TNF concentration.
  • a twelfth aspect of the present invention is a method for screening a therapeutic agent for sepsis, which comprises the step of contacting CD14 and a test substance with a TLR-expressing cell prepared by a genetic recombination method. .
  • the screening method for a therapeutic agent for sepsis is a method for examining whether a test substance is a therapeutic agent for sepsis or a candidate therapeutic agent for sepsis. It is also a method of selecting a therapeutic agent for sepsis or a candidate therapeutic agent for sepsis from a plurality of test substances.
  • the screening method of the present invention generates a TLR created by a genetic recombination method. Contacting the resulting cells with CD14 and a test substance, detecting changes in specific indices to determine whether the test substance is a candidate for a therapeutic agent for sepsis.
  • Examples of the CD14 source in the screening method of the present invention include CD14 expressed in cells, sCD14 present in blood or the like, and sCD14 produced by a genetic recombination method.
  • CD14 expressed in cells may be expressed in cells by genetic recombination.
  • sCD14 may be a variant as long as it contains at least 269 to 315 of human CD14. In terms of maintenance of the three-dimensional structure of CD 14, it is preferably the full length of CD 14.
  • Cells expressing the TLR produced by the gene recombination method are not particularly limited as long as they are cells expressing the TLR produced by the gene recombination method.
  • a TLR source a cloned TLR described in the prior art can be used for a gene recombination method.
  • TLR2 and TLR4 are used.
  • Cells expressing TLR may also have a source of CD14.
  • CD14 activator In the step of contacting CD14 and a test substance with a TLR-expressing cell prepared by a genetic recombination method, it is preferable to simultaneously contact a CD14 activator. This is because activated CD 14 is easily bound to TLR by the CD 14 activator.
  • the CD14 activator is not particularly limited as long as it has a function of forming a complex by binding to CD14 and activating CD14.
  • a cell component such as LPS or LTA, mycoplasma and the like can be mentioned.
  • the step of bringing CD14 and a test substance into contact with TLR-expressing cells prepared by a genetic recombination method is not particularly limited, as long as they are in contact with each other.
  • contact directly in a solution, fix cells expressing CD14 or TLR produced by genetic recombination on a plate, etc., mix the others in a solution and add to the plate, or add CD14 or TLR Others may be added to the culture solution of the expressing cell.
  • the order in which CD14 and the test substance are brought into contact with the TLR-expressing cells prepared by the genetic recombination method is not particularly limited. For example, contacting them at the same time, contacting the CD14 activator and CD14 first, and contacting the CD14 activator and CD14 with a TLR-expressing cell produced by genetic recombination. Examples include the order in which the CD 14 activator and the test substance are brought into contact with CD 14.
  • the screening method of the present invention can include other steps as long as the screening method is not inhibited.
  • the order of the adding steps is not particularly limited.
  • a step of contacting serum derived from an animal is included.
  • Animal-derived serum is not limited as long as it is animal.
  • Preferred examples include mammals including humans.
  • humans, rodents, egrets, and magpies are preferred.
  • the binding between CD14 and TLR includes direct binding, binding through other factors, or binding activated by other factors, and CD14 is activated in the presence of these sera. The reason is that there is a bond between TLR and TLR.
  • the order of the steps of contacting the animal-derived serum is not particularly limited. This can be performed simultaneously with other steps, or brought into contact with the TLR in advance.
  • test substance is not particularly limited.
  • antibodies such as anti-CD14 antibody, Examples thereof include polypeptides such as modified polypeptides, low molecular weight compounds, and the like.
  • the screening method of the present invention a therapeutic agent for sepsis can be easily selected. That is, the screening method of the present invention is useful as a simple and convenient method for screening for an effective component of a pharmaceutical composition for sepsis.
  • TLR is constantly expressed in HEK293 cells by genetic recombination, and a certain amount of LPS and soluble CD14 (1-356) are added, followed by the test substance. After culturing for a certain period of time, the test substance is determined and screened by measuring the amount of cytodynamic force produced in the culture supernatant. Alternatively, instead of measuring the amount of cytodynamic force, a method of measuring the activation of NF- ⁇ B in the cell using a repo overnight gene assay or the like may be used.
  • a method of directly detecting the binding between CD14 and cells expressing the TLR produced by the gene recombination method using an interaction detection device utilizing the ELISA method or the surface plasmon resonance method may be used.
  • a device such as BIACORE (Biacore) may be used.
  • CD14 is immobilized on a plate or a chip of a BIACORE device, and LPS, TLR-expressing cells produced by a genetic recombination method, and a test substance are added thereto.
  • the amount of the TLR-expressing cells produced by the genetic recombination method that binds to CD14 can be measured by using a labeled antibody or the like in the ELISA method or directly by using a device such as BI ACORE to detect the test substance. Judge and screen.
  • TLR is a membrane protein.
  • the screening method of the present invention which utilizes cells that can be expressed on the membrane in full length, is excellent in that the problem can be avoided.
  • the determination of whether or not the test substance is a therapeutic agent for sepsis is not particularly limited. For example, by directly observing the binding between CD14 and TLR, if the test substance inhibits the binding, or is determined or selected as a therapeutic agent for sepsis according to the degree of inhibition of the binding, or Judgment or selection can be made by measuring the activation of cells expressing CD14 or TLR.
  • the polypeptide showing an example of a substance that can be determined as a therapeutic agent for sepsis by the screening method of the present invention may be a CD14 variant in which part or all of the amino acids 269 to 315 of CD14 are modified, or a modification thereof.
  • An example is a peptide comprising a portion of a CD14 variant comprising a portion.
  • CD14 variants N-terminal deletion, C-terminal deletion, N- and C-terminal deletions, intermediate deletions, amino acid substitutions, amino acid additions, amino acid modifications, or modified combinations of these Genetic manipulation of plasmids (peptides in which CD14 has been partially modified) (New Cancer Engineering Protocol, Shujunsha, The Institute of Medical Science, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo, Shujunsha) and transfection into COS-1 cells using a standard method to express the CD14 variant. , Can be obtained.
  • Examples of the antibody include an antibody that recognizes SCD14 (269-315), an antibody that recognizes sCD14 (1-315), but does not recognize SCD14 (1-269). These can be obtained by the method for producing an antibody of the present invention.
  • a peptide can be designed in advance by drug.
  • a therapeutic agent for sepsis By performing the screening of the present invention using a low molecular compound as a test substance, a therapeutic agent for sepsis can be selected.
  • test substance is not particularly limited. Randomly derived test substances may be used. For example, drug design in advance as described below is preferable for screening efficiency.
  • the binding mode between CD14 and TLR or the binding inhibition mode between CD14 and TLR of the polypeptide of the present invention or the antibody of the present invention can be obtained as steric interaction information, and drug design can be performed. .
  • the three-dimensional interaction information can be obtained from the X-ray structure analysis of the co-crystal of CD14 and TLR, the co-crystal of the polypeptide of the present invention and CD 14 or TLR, or the co-crystal of the co-crystal of the antibody of the present invention and CD 14 Alternatively, it can be determined by synchrotron radiation structure analysis. In addition, it can be determined by methods such as NMR, electron microscope, and computer simulation.
  • the peptide region in which CD14 and TLR are found to interact with each other from the three-dimensional interaction information may be itself an agonist and an agonist. Furthermore, peptides with enhanced activity can be searched using techniques such as phage display and combinatorial synthesis. Further, by inferring the active conformation of the peptide from the crystal structure, a peptide mimic-like synthesis can be carried out to reduce the molecular weight.
  • a compound matching the shape or properties of the CD14 or TLR protein can be identified on a computer, for example, DOCK (UniversitoyofCalifornia, SanFrancinisco,
  • Screening can be performed using software such as CA), FlexX (Tripos, Inc. St. Louis, MO).
  • a plurality of compounds obtained by the above-described drug design or the like and determined to be therapeutic agents for sepsis or candidate therapeutic agents for sepsis by the screening method of the present invention, polypeptides of the present invention or antibodies of the present invention By acquiring the features common to the above three-dimensionally, it is possible to obtain a steric pharmacophore of a substance having an action of inhibiting the binding between CD14 and TLR.
  • the drug design can be performed more precisely.
  • the CDR of the antibody of the present invention can be reduced in molecular weight by mimicking itself, and a compound having a function similar to that of a neutralizing antibody can be drug-designed.
  • Compounds obtained by such a search are not limited to polypeptides or low molecular weight compounds.
  • Low molecular weight compounds are considered to be useful because they have advantages such as oral absorption.
  • the screened low molecular weight compounds are useful as therapeutic agents for sepsis. Also The present description provides a method for screening a binding inhibitor between a low molecular weight compound CD14 and TLR.
  • the molecular weight of the low molecular weight compound inhibitor for binding between CD14 and TLR is not particularly limited.
  • the low molecular weight compound generally includes a compound having a molecular weight of about 100 to a compound having a molecular weight of about 10,000 such as an antibiotic.
  • the present invention also discloses a method of screening for a substance that interacts with the region from position 269 to position 315 of human CD14 shown in SEQ ID NO: 1.
  • Screening of a substance that interacts with regions 269 to 315 of human CD14 refers to whether or not the test substance interacts with the regions 269 to 315 of human CD14. How to consider. Further, the screening method of the present invention, which is a method for selecting a substance that interacts with the region from No. 269 to No. 315 of human CD14 from a plurality of test substances, includes the following steps 1 and 2.
  • Step 1 A test substance is brought into contact with a polypeptide containing 6 or more amino acids in the region from position 269 to position 315 of human CD14.
  • Step 2. Determine whether the test substance interacts with the region from human CD14 at positions 269 to 315.
  • the polypeptide containing 6 or more amino acids in the region from 269 to 315 of human CD14 is not particularly limited as long as it contains 6 or more amino acids in the region from 269 to 315 of human CD14.
  • the peptide of the present invention can be mentioned. It may also contain an amino acid sequence other than the region. This interacts with an amino acid sequence outside the region using a polypeptide consisting only of the amino acid sequence outside the region. This is because it is sufficient to further confirm whether or not this is the case.
  • the step of bringing the polypeptide into contact with a test substance is not particularly limited as long as the step is a step in which these are brought into contact.
  • the two substances may be added to a solution to bring them into contact, or the polypeptide may be immobilized on a plate or the like, and the test substance may be added to the plate.
  • the step of determining whether the test substance interacts with the region 269 to 315 of human CD 14 is a step of determining whether the substance interacts with the region 269 to 315 of human CD 14 If it is, there is no particular limitation.
  • the determination may be made by measuring the binding between the polypeptide and a test substance.
  • a substance that interacts with the region of human CD14 at positions 269 to 315 can be easily selected.
  • the region from position 269 to position 315 of human CD14 is a region recognized by the antibody of the present invention as described in the first embodiment of the present invention, and is a region capable of interacting with other proteins of CD14.
  • the substance that interacts with the region can be a substance that regulates the interaction between CD14 and other proteins.
  • the other protein is TLR
  • the substance that interacts with the region inhibits the interaction or binding between CD14 and TLR.
  • Such a substance that regulates the function of CD14 is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition for sepsis. That is, the screening method of the present invention is useful as a simple and convenient method for screening an effective component of a pharmaceutical composition for sepsis.
  • Method I First, immobilize SCD14 (1-356) on a plate, mix a liquid such as culture supernatant containing the test antibody, and a synthetic peptide prepared from the 269-315th 47 amino acids and add. I do. Antibodies recognizing the 269-315 region can inhibit the binding of the synthetic peptide to sCD14 (1-356) on the solid phase, so that it can interact with the region from 269 to 315 of human CD14. It is determined that it works. Method (1): Immobilize the synthetic peptide having the 269-315 sequence of CD14 on a plate, and add a liquid such as culture supernatant containing the test antibody. An antibody that recognizes region 269-315 binds to the synthetic peptide and is therefore determined to interact with human CD14 at regions 269-315.
  • Method 3 Synthetic peptide having the sequence at positions 1 to 268 of CD14 and synthetic peptide having the sequence at position 1315 of CD14 are respectively immobilized on a plate, and a liquid such as a culture supernatant containing the antibody to be tested. Is added.
  • the antibody that recognizes region 269-315 does not bind to the synthetic peptide having the sequence at position 11-268, but binds to the synthetic peptide having the sequence at position 11-315. It is determined that there is an interaction in the region from No. to 315.
  • the resulting low molecular weight compound may be CD 14 agonist activity or It is desirable to have activity.
  • Method 1 Separately immobilize sCD14 (1-268) and sCD14 (1-315) separately on a chip of BIACORE 2000 (Biacore), and add the test low molecular compound. It does not bind to CD 14 (1-268) and S CD 14 (1—
  • test substance means that the test substance interacts with the region of human CD14 from position 269 to position 315. This indicates that the low molecular weight compound that binds to SCD14 (1-315) has strong affinity for the region from amino acids 269 to 315.
  • Whether or not the substance obtained by the screening method of the present invention inhibits the function of CD14 can be confirmed by the method described in Example 2 or the like. Further, by the screening method of the present invention, whether or not the drug is a therapeutic agent for sepsis can be confirmed.
  • the present invention also discloses a method for screening a CD14 variant having a CD14 antagonist function or a CD14 agonist function.
  • CD14 with CD14 antagonist function or CD14 agonist function Variant screening is a method for examining whether a test substance has a CD14 antagonistic function or a CD14 agonist function.
  • CD14 has a function of binding to LPS, signaling cells, and activating cells. At present, it is unclear whether the randomly modified CD14 variant has an agonist effect or an engonist effect, and according to this screening method, a variant having an engonist action and no agonist effect Alternatively, it is possible to screen for a variant having an agonist action and not having an antagonistic action.
  • the screening method of the present invention includes the following steps 1 and 2.
  • Step 1. Contact LPS or test substance with cells that do not express CD14.
  • Step 2. Contact LPS, test substance, and CD14.
  • the cells in which CD14 is not expressed include, for example, endothelial cells.
  • the presence or absence of agonist action can be determined by contacting LPS and a test substance with, for example, endothelial cells and measuring the amount of cytokin in produced from the endothelial cells.
  • examples of the CD14 source include CD14 expressed in cells, sCD14 present in blood or the like, and sCD14 produced by a genetic recombination method.
  • CD14 expressed in cells may be expressed in cells by genetic recombination. s In the case of CD14, further contact cells that do not express CD14.
  • a test substance having no agonist action in step 1 and having an angina gonist action in the step 2 can be used as a CD14 angina gonist as an active ingredient of a therapeutic agent for sepsis or a therapeutic agent for sepsis Useful.
  • a twelfth aspect of the present invention is an anti-CD14 antibody, a modified CD14 or a low-molecular compound obtained by the screening method of the eleventh aspect of the present invention.
  • the anti-CD14 antibody, CD14 variant or low molecular weight compound of the twelfth aspect of the present invention has been obtained by the screening method of the eleventh aspect of the present invention.
  • the anti-CD14 antibody, CD14 variant or low-molecular compound according to the twelfth aspect of the present invention has been selected by screening as a therapeutic agent for sepsis as described in the eleventh aspect of the present invention. It is useful as a therapeutic agent for sepsis or as an active ingredient of a therapeutic agent for sepsis.
  • a thirteenth aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for sepsis, comprising as an active ingredient an inhibitor of the binding between CD14 and TLR.
  • the binding inhibitor of CD14 and TLR contained in the pharmaceutical composition of the present invention is an agent that inhibits binding of CD14 directly to TLR, or a complex in which CD14 binds to TLR via a third substance.
  • the agent is not particularly limited as long as it is an agent that inhibits the formation of etc. In addition, its inhibition mechanism is not limited.
  • the binding inhibitor of CD14 and TLR contained in the pharmaceutical composition of the present invention preferably has a titer that suppresses cell activation of TLR-expressing cells by 30% or more.
  • the concentration of the inhibitor should not exceed 10 g / m 1, and should be 18/1111. 3.
  • a titer that suppresses NF- ⁇ activation or IL_8 production of TLR-expressing cells in the presence of 0.5 gZm1 of exogenous CD14 by 30% or more is preferable.
  • the titer is 40% or more. More preferably, the titer is 50% or more. Particularly preferred is a titer that suppresses 70% or more.
  • the molecular form of the binding inhibitor of CD14 and TLR contained as an active ingredient in the pharmaceutical composition for sepsis of the present invention is not particularly limited. Examples include antibodies, antibody fragments, polypeptides, proteins, low molecular weight compounds, and the like.
  • Antibodies, antibody fragments, polypeptides and proteins are exemplified by the binding inhibitor of the eleventh aspect of the present invention.
  • the low molecular compound is the low molecular compound described in the twelfth aspect of the present invention.
  • a CD14-TLR binding inhibitor inhibits CD14-TLR signaling by inhibiting CD14-TLR binding Therefore, signal transduction after TLR is blocked, cell activation is suppressed, and a therapeutic effect for sepsis is exhibited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for treating or preventing a disease associated with bacterial infection.
  • a disease associated with bacterial infection For example, sepsis, rheumatoid arthritis, AIDS, autoimmune disease, hemolytic anemia, tumor, atopic disease, allergic disease, sarcoidosis, malaria, psoriasis, fever, hypotension, ischemic heart disease, leukopenia, thrombocytopenia It is useful for diseases, shock and multiple organ failure. In particular, it is useful for treating or preventing inflammatory sites associated with these diseases, particularly symptoms associated with an increase in blood TNF concentration.
  • CD14 and TLR may contain various pharmaceutically acceptable additives.
  • carriers, excipients, stabilizers, lubricants, coloring agents, disintegrants, preservatives, isotonic agents, stabilizers, dispersants, antioxidants, interference agents, preservatives, suspending agents It may optionally contain an emulsifier, commonly used suitable solvents (eg, sterilized water or vegetable oil), and a physiologically acceptable solubilizing agent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain an antibiotic, a steroid, various cytotoxic antibodies, an anticoagulant factor, or the like. These show an additive effect or a synergistic effect with the antibody of the present invention, which is an active ingredient, and can be a more effective pharmaceutical composition.
  • the dose when the pharmaceutical composition of the present invention is administered as a drug is not particularly limited.
  • the dose is preferably 0.1 mgZkg or more. More preferred is a dosage of 1-1 OmgZkg.
  • the dosage form is preferably a suppository, an inhalant, particularly an injection.
  • parenteral administration is preferred. Examples of parenteral administration include injections such as intravenous administration, intraarterial administration, subcutaneous administration, and intramuscular administration, and also include rectal administration, transdermal absorption, and transmucosal absorption.
  • the timing or frequency of administration also depends on the condition of the patient, and examples include prophylactic administration, single administration or continuous administration, and the like.
  • TLR4 may be described as TOLL4 (To114).
  • the resin was bound according to the manual of (Hitrap NHS-activated) (Amersham-Pharmacia) to prepare a 3C10-bound affinity column.
  • the soluble CD14 was added to the column prepared with human serum (purchased from Nippon Biotest) lO OmL, followed by washing with phosphate buffer (PH7.4) (hereinafter referred to as PBS).
  • human serum purchased from Nippon Biotest
  • lO OmL phosphate buffer (PH7.4)
  • the column was eluted from the column with 0.1 M daricin hydrochloride buffer (pH 3.0), and concentrated using Diaflo® (Daleis Japan).
  • Wistar rats purchased from SLC
  • Female A mixture of 100 g of purified soluble CD14 and Freund's complete adjuvant (Difco) in a one-to-one ratio is administered to an 8-week-old footpad, and after 3 weeks, the iliac bone Lymph nodes were removed and lymphocytes were aseptically collected.
  • lymphocytes are mixed with mouse myeloma cells SP 20—Ag 14 (ATCC) at a ratio of 5: 1, and using polyethylene glycol 1500 (Sigma).
  • Tamie Ando and Chiba Takeshi “Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures” Cell fusion was performed according to page 83, 1991 (Kodansha). After fusion, the cells are suspended in 10% fetal serum ZRPMI 1640 containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine, and 96-well plate
  • the cells were cultured under 5% C ⁇ 2 , 37 ", and the medium was replaced with a medium without aminopterin when proliferating hybridomas were confirmed.
  • the culture supernatant was sampled, and a hybridoma producing an antibody that binds to CD14 was screened on a plate on which purified soluble CD14 was immobilized. That is, purified soluble CD14 was immobilized on a plate (Maxiso, unc) at 1 gZmL, and blocked with PBS containing 0.1% sialbumin.
  • the culture supernatant was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour, followed by washing with 0.9% physiological saline containing 0.05% Tween-20.
  • DAK0 peroxidase-labeled anti-rat immunoglobulin antibody
  • the absorbance of the plate was measured at a wavelength of 450 nm, and a well having an absorbance of 0.2 or more was selected as an anti-CD14 antibody-producing hybridoma.
  • the selected hybridomas were cloned by the limiting dilution method (introduction to the monoclonal antibody experimental procedure, written by Tamoe Ando and Takeshi Chiba, Kodansha), and screened 10 days later in the same manner to obtain anti-CD14 antibody-producing hybridomas. 17 clones were obtained.
  • the hybridomas were cultured in RPMI 1640 containing 10% fetal calf serum, and the cells were collected and antibody production was performed using Hybridoma-SFM (Gibco) to obtain a culture supernatant containing a monoclonal antibody. . After removing the cells from the culture supernatant with a filter paper, the cells were purified with a protein G column (Prosep-G, Millipore) to obtain 17 types of purified human CD14 antibodies.
  • Hybridoma-SFM Hybridoma-SFM
  • Human TLR4 cDNA has a translated region of about 2.5 kb (Genbank accession on No. AF 17765). Cloning of TLR4 cDNA separates 1 lkb at the 5 'end and 2.3 kb at the 3' end. I went to.
  • Human TLR4 cDNA was cloned by the following method. Human TLR4 From the nome sequence (Gen Bank: accession No. AF 177765), sense primer 1 (SEQ ID NO: 7), sense primer 2 (SEQ ID NO: 8), antisense primer 1 (SEQ ID NO: 9), and antisense primer 2 ( Column number 10) was designed. First, using human primer 1 and antisense primer 1, human lung cDNA (CLONTECH) was type II, and Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) was used at 98 ° C for 10 seconds at 55 A 1 minute cycle was repeated 30 times at 72 for 30 seconds to perform a PCR reaction.
  • human lung cDNA CDNA
  • TaKaRa Pyrobest DNA Polymerase
  • PCR was performed on human spleen c DNA (CLONTE CH) using the sense primer-1 and antisense primer-2.
  • the obtained DNA fragments of about 1.1 kb and about 2.3 kb were phosphorylated at the 5 'end with T4pol ynucleotidekinase (TaKa Ra).
  • pBluescript llSK (+) (STRATGENE) as a vector was digested with EcoRV, and then dephosphorylated to prepare, and the above PCR products were each isolated at 1 igation.
  • transfection is performed using a competent cell JM109 (TaKaRa) according to a standard method, and the plasmid (pT45F) containing the 5 'fragment of TLR4 cDNA and the 3' fragment is contained.
  • a plasmid (pT43F) was obtained.
  • PT45F was subjected to XhoI and EcoRI and pT43F to EcoRI and Hindffl for dou 1 edigestion, respectively, and inserted into the XhoIZH indill site of pBluescript ll SK (+) ( three way 1 igati on).
  • the plasmid pBTLR4 containing the full length human TLR4 cDNA was obtained by transfection of JM109.
  • pBTLR When the inserted sequence of 4 was confirmed, it was consistent with the eXon sequence of the human TLR4 genomic sequence.
  • human TLR4 cDNA was cut out from PBTLR4 using Hindill and inserted into the Hindill site of pcDNA3.1 (1) (In Vitrogen). . Transformation of JM109 yielded a plasmid pcDNAT4 that expressed human TLR4 in mammalian cells.
  • the expression plasmid pCDNAT4 prepared in 1) was transfected into a human embryonic kidney-derived cell line HEK293 by the following method. That is, 25 l of FuGENE6 (Roche's Diagnostics) and 6.3 g of Pc DNAT4 were mixed according to the attached protocol, and then added to HEK 293 cells grown in a semi-confluent in a 75 cm 2 roux flask. did. The next day, the cells were detached from the roux flask, and re-wound 250 cells sZwel 1 on a 96we 11-plate.
  • G-418 with a final concentration of 1.2 mg Zm 1 was added, and the medium was replaced every 3 to 4 days with a medium containing 1.2 mg Zml of G-418, followed by selective culture for 20 days.
  • the response to 35 ⁇ 014 was examined.
  • Each of the 24 clones was inoculated into 24 we11-piate at 2.0x i 0 cells / well. After culturing overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 , a mixed solution of 50 ng of PNF KB—Luc (CLNTECH) and 11 FuGENE 6 per lwell was added, and the cells were further cultured for 24 hours.
  • 0.5 gZm 1 s CD 14 (1--356) was stimulated by adding a mixture of 1 gZm 1 and LPS. Six hours later, the culture supernatant was removed, the cells were washed with PBS, and the cells were lysed with Passivelysis Buffer (Promega) 1001 / we11. Luciferase activity in the cell extract 201 was measured using Luciferase Assay Substrate (Promega). 14 for measurement
  • HEKT4-14 cells are suspended in DMEM medium containing 10% inactivated FBS, seeded in 24 well_p late with 1 ⁇ 10 cells Zwell, and 5% CO 2 ,
  • the cells were cultured under the conditions of 37: for 24 hours. Then, using Fu GENE 6, 100 ng / we 11 of Lipo-Yuichi Gene pNF ⁇ B-Luc (CLONTECH) was introduced, and the culture was further continued for 24 hours. LPS with final concentration l ⁇ gZml (E.co 1 i 055: B5, Difco), s C D 1 with final concentration 0.5 g / m 1
  • soluble CD14 was removed from healthy human serum using anti-CD14 antibody.
  • RPM11640 medium containing 2% serum (Asahi Techno Glass Co., Ltd.) (hereinafter referred to as 2% CD14wZoHSZRPMI), and cultured with 5 ⁇ 10 4 cells ZWe11 (501 / We11) for 96 ⁇ El plates planting Ekomi 37: and cultured for 24 hours under the conditions of 5% C0 2.
  • the culture supernatant 1001 was transferred to an IL-6 antibody-immobilized plate, and incubated at 37 for 60 minutes. Thereafter, the reaction solution was removed, and the plate was washed four times with Wash Buffer 2 of 400 ⁇ 1 ZWe 11, and an anti-human IL-6 antibody was added in 100 1 wells, followed by incubation at 37 for 30 minutes. After removing the reaction solution, washing 4 times with Wash Buffer 2 of 400 1 ZWe11, adding 1001 / We11 of peroxidase-labeled streptavidin solution, and further incubating for 37 and 30 minutes .
  • Figure 3 shows the results.
  • the amount of IL-16 produced when no antibody was added was defined as 100%.
  • F1024-1-3 antibody and 3C10 antibody showed IL-6 production inhibitory activity.However, compared to IL-6 production when the control antibody was added, the F1024-1-3 antibody showed 0. The 3 agZmL inhibits 50% production, whereas the 3C10 antibody inhibits 10% of the production.
  • the F1024-l-3 antibody inhibits endothelial cell inflammatory site production more effectively than the 3C10 antibody. It turned out to be excellent.
  • Example 2 it has been clarified that the substance selected in the screening in Example 2 actually suppresses cell cytokinin.
  • Human vascular endothelial cells HUVEC (Sanko Junyaku Co., Ltd.) were suspended in the same manner as in Example 3, and 5 ⁇ 10 4 cells / We 11 (50 1 / We 11) were implanted into a 96-well plate 37: 5% They were cultured for 24 hours under the conditions of C0 2.
  • 10 1 RPMS 1640 medium containing 14% human serum from which soluble CD 14 has been removed 120 ng / ml LPS (E.co 1 i 055: B5, Difco) 101, 3.
  • 10 1 of 6 ng / 1 serum-derived soluble CD14 was mixed and incubated for 1 hour under 37 to form LPSZCD14 complex.
  • 900 ng / ml of F1024-1-3 antibody or 3C10 antibody 401 was added to the LPSZCD14 mixture and added to the cells. After further culturing for 20 hours, IL-16 in the culture supernatant was measured using a human IL-6 EIA kit (Applied Biosystems).
  • IL-6 was measured according to the protocol attached to the human IL-16EIA kit.
  • control antibodies rat IgG (conAb) and 3CIO antibodies were purified.
  • Fig. 4 shows the results.
  • the amount of IL-16 produced when no antibody was added was set to 100%.
  • the F1024_1_3 antibody showed IL-6 production inhibitory activity, but the 3C10 antibody was comparable to the control antibody, indicating that the IL-16 production inhibitory effect was low after LPS / CD14 complex formation. I was not able to admit.
  • the F1024-1-3 antibody has an inhibitory effect on inflammatory cytokine production even after the formation of LPS / CD14 complex in endothelial cells, and therefore, patients after LPS has already entered the body, Patients can be expected to improve their symptoms even after blood Was.
  • the effect of anti-CD14 antibody on the binding between CD14 and LPS on the cell membrane was analyzed by flow cytometry (F 1 ow cytome try) method using human monocyte cell line THP-1 at 40 ng / m2. 1 1 ⁇ , 25-dihydroxybiamine (Dyndroxyvitamin) D3 (Funakoshi) for 48 hours, and after inducing differentiation, 10 g / m1 of anti-CD14 antibody (3 The plate was incubated at 37 ° C for 30 minutes in a medium (PMI 1640 containing 10% to 83) with or without C10 or F1024-1-3 antibody.
  • a medium PMI 1640 containing 10% to 83
  • FITC-labeled LPS (Sigma) was added at a final concentration of 1 ng / ml and incubated at 37 for a further 15 minutes. Immediately thereafter, an equal volume of ice-cold RPMI 1640 medium was added, and the fluorescence intensity was measured using FACSCalibur (BD).
  • Fig. 5 shows the results. As shown in FIG. 5, the specific fluorescence observed by CD14 binding of LPS was completely suppressed by the 3C10 antibody, but was only partially suppressed by F1024-1-3, and F1024-1-3. — It was shown that the 1-3 antibody did not inhibit the binding of LPS to CD14.
  • peptide E SEQ ID NO: 15 was synthesized. That is, a peptide is synthesized using a peptide synthesizer (432A, Applied Biosystems) according to the usage, deprotected and cut out according to a standard method, and purified by HPLC using a C18 column (CAPCELL-PAK, Shiseido). did. The purified fraction was collected, lyophilized, weighed, and dissolved in distilled water to 10 mg / ml.
  • sCD14 (1 — 307) has the amino acids 1 to 307 at the N-terminal of CD14 described in SEQ ID NO: 1.
  • Plasmids that express soluble polypeptides in mammalian cells were introduced into COS-1 cells to obtain various human soluble forms.
  • Plasmids for expressing 180-234, ⁇ 235_282 and ⁇ 180-282 in mammalian cells were prepared in the same manner as in Example 9- (1), construction of an amino acid substitution modified polypeptide expression plasmid.
  • the primers used for 77-11 were sense primer 1 (SEQ ID NO: 16) and antisense primer 3 (SEQ ID NO: 17), and sense primer 4 (SEQ ID NO: 18) and antisense primer 4 (SEQ ID NO: 19), sense primer 13 and antisense primer 5 (SEQ ID NO: 20) and sense primer 5 (SEQ ID NO: 21) and antisense primer 4 for ⁇ 57-64, and sense primer 1 for ⁇ 180-234.
  • sense primer 6 SEQ ID NO: 22
  • sense primer 6 SEQ ID NO: 23
  • antisense primer 4 sense primer No.
  • the expression level of the CD14 variant was measured by EIA using an anti-human CD14 antibody. . That, pH 8. 3 of l OmM N a HC 0 3 anti CD 14 antibody diluted 200-fold with buffer MEM- 18 (MONOS A company) 96 ⁇ El plate (M ax isorp, Nunc, Inc.) to 50/1 / We11 was added and left at 4 ° C overnight. Thereafter, the substrate was washed with pure water and blocked with 83% containing 0.5% 858 (still at room temperature for 60 minutes).
  • the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured, and the production amount of the CD14 variant polypeptide of the sample was calculated.
  • the molecular weight of the CD14 variant was determined using an anti-human CD14 antibody (3C10 and MEM_18).
  • 3C10 and MEM_18 was confirmed by Western blotting. That is, 30 ng / lane of each modified CD14 was electrophoresed on SDS-polyacrylamide gel (5-20% ATTO), and the protein was transferred to a PVDF membrane (Millipore Japan). Perform a blocking reaction for 1 hour at room temperature with 30 ml of PBS containing 5% skim milk. And MEM-18 diluted 100 times was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • a human sCD14 (1-307) amino acid-substituted variant polypeptide in which the 283rd amino acid Leu from the N-terminus of sCD14 (1-307) is substituted with A1a is used.
  • SCD14 (1-307) L283A was described, and other human SCD14 (1-307) amino acid substitution variant polypeptides were similarly described.
  • a human sCD14 (1-307) amino acid-substituted variant obtained by introducing one or two amino acid mutations at various positions of human CD14 (1-307) was used in a mammal. Plasmids to be expressed in cells were introduced into COS-1 cells, and various human CD14 amino acid substitution variants were prepared.
  • the culture supernatant containing the obtained CD14 variant was purified as necessary. That is, the antibody was selectively adsorbed on an affinity purification column (Hi Trap column, Amersham Pharmacia Biotech) to which an anti-human CD14 antibody (3C10) was bound, and was selectively adsorbed. Was eluted. The obtained eluted fraction was immediately neutralized with a 1M HE PES buffer solution at pH 8.0 to make the pH neutral. Each fraction was assayed by the EIA method using HRP-conjugated 3C10, and a fraction containing the CD14 variant polypeptide was selected. (4) [Inhibition experiment with peptide]
  • F1024-1-3 antibody was weakly blocked by peptides A and B, but not by peptides C and D and the irrelevant peptide E used as a control. It was estimated that the region recognized by the 1024-1-3 antibody was between the 283rd amino acid and the 283rd amino acid.
  • a plate (Maxisorp, Nuunc) was immobilized with 10 g / ml of 3 C 10 cells or MEM-18 antibody diluted 100-fold, and blocked with 0.5% BSAZPBS. Next, the blocking solution was removed, and each CD14 deletion variant whose concentration was measured was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing, 10% RSZ 0.1%
  • Tween add peroxidase-labeled F1024-1-3 antibody or peroxidase-labeled 3C10 antibody diluted to a concentration of 1 xgZml in 20ZPBS. Similarly, the reaction was carried out at room temperature for 1.5 hours. After washing, H 2 0 2 ZTMB solution quenched with 0. 5 M sulfuric acid After color development was measured using a with N J-2100 (Japan Intermed) plates Photometer absorbance by a wavelength of 450 nm.
  • CD14 deletion mutant used in this study was used. Of these, CD14 ( ⁇ 7-11) does not bind to 3C10, and CD14 ( ⁇ 57-64) does not bind to MEM-18, but binds to other CD14 deletions . Therefore, by analyzing the results of the three types of sandwich ELISA systems, 3C 10 / F 1024-1-3, MEM-18 / F 1024-1-3, and MEM-18Z3C10, The binding activity of the antibody can be analyzed.
  • F1024-1-3 antibody showed binding activity from SCD14 (1-356) to SCD14 (1-307), It also binds to CD14 ( ⁇ 7-11) lacking the binding site of 3C10 and CD14 ( ⁇ 57-64) lacking the binding site of MEM-18, and further binds sCD14 ( ⁇ 57-64). Binding activity was also observed with CD14 ( ⁇ 180-282), which deleted the 282nd amino acid from the 180th amino acid of 1-307). This revealed that the F1024-1-3 antibody was different from the 3C10 and MEM-18 antibodies, and that the binding region was located at the C-terminal side from position 285. Since the SCD14 (1-307) binding activity was weaker than that of other CD14 deletion mutants, it is indicated by (+).
  • the F1024-1-3 antibody does not convert a linear peptide composed of 10 amino acids into an epitope, but recognizes an epitope caused by a three-dimensional structure. From these facts, it can be seen that the binding region of the F1024-1-3 antibody is located at the 315th amino acid from the 285th amino acid of CD14 of SEQ ID NO: 1 and that the 294th amino acid is Pro. It became clear that they were aware of possible three-dimensional structures. That is, it was revealed that the antibody recognizes an epitope present in the amino acid at position 315 from the amino acid at position 285 in the three-dimensional structure that can be generated when the amino acid at position 294 of CD14 is Pro.
  • the BLOCKS database is a database in which multiple alignments are made to align motifs, similarity scores are calculated again including the surrounding residues, and only highly conserved regions are extracted without insertion or deletion. was searched for a profile for human CD14. Furthermore, analysis was performed using various secondary structure prediction methods (Le v, GOR I V, PREDATOR).
  • sequence from position 287 to the C-terminal side of this region did not have high homology with LRR (PDB-ID: 1 A4Y: A).
  • the region was a region where a loop could be formed under physiological conditions, and was a site capable of interacting with other proteins.
  • One region ranged from human CD14 at positions 269 to 315.
  • CD14 variant polypeptide lacking the amino acid at the C-terminal side of human CD14 (human soluble CD14 C-terminal deletion variant polypeptide)
  • a plasmid pMl650 for expressing mCD14 in mammalian cells was constructed. From the plasmid pUCH14P-4 described in W098 / 39438, Xb Approximately 1.4 kb DNA fragment containing human CD14 cDNA was excised by aI and HindIII, and pcDNA3.1 (1), a mammalian cell expression vector (InVitrogen) At the Xba I ZH ind III site. Then, after transforming E. coli Competent Cells (JM109 cells, TaKaRa) according to the attached protocol, the resulting colonies are confirmed by PCR, and a plasmid (pM1650) expressing the desired mCD14 is obtained.
  • sCD14 (1-307) Recombinant deletion of 173, 204 amino acids (hereinafter sCD14 (1-307) , S CD 14 (1—300), s CD 14 (1—295), s CD 14 (1—290), s CD 14 (1—285), s CD 14 (1—246), s CD 14 (
  • the plasmids pM1658, pM1674, pM1675, pM1676, pM1659, pM1660, pMl662 and pMl661, which express 1-183), sCD14 (1-152)) in mammalian cells, are constructed by the following method. did.
  • the plasmid pMl656 prepared in 1) was used as type I, and the cycle was repeated 30 times with Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) for 30 cycles at 98 for 10 seconds, 55 for 30 seconds, and 72 t for 1 minute. The reaction was performed.
  • TaKaRa Pyrobest DNA Polymerase
  • the amplified DNA fragment was subjected to doubu1edigestion with XhoI and Hindill, and separated and purified by 1% agarose gel electrophoresis.
  • pM1656 was similarly digested and purified with XhoI and Hindlll, and the obtained DNA fragment of about 5.8 kb and the above-mentioned PCR fragment were subjected to 1 igation.
  • the resulting colonies were confirmed by PCR, and plasmids expressing the desired CD14 variant polypeptide (pM1658, pM1674, pM1675, pM1676, pM1659, pM1660, pM1662) And p M 1661).
  • the plasmids ⁇ 1656, ⁇ 1658 to ⁇ 1662 and pMl 674 to ⁇ 1676 prepared in (1) and (2) were introduced into COS-1 cells by the following method. , SCD14 (1—356), sCD14 (1—307), sCD14 (1—300), sCD14 (1—295), sCD14 (1—290), sCD14 ( 1-285), sCD14 (1-246), sCD14 (1-183) and sCD14 (1-152) were expressed. That is, COS-1 cells obtained by mixing Fu GENE 6 (Roche Diagnostics) 501 with 12.5 g of each of the above plasmid DNAs according to the attached protocol, and growing semiconfluent in a 150 cm 2 flask. Was added. After culturing for 72 hours under the conditions of 5% C ⁇ 2 and 37 :, the culture supernatant was recovered to obtain the desired CD14 variant polypeptide.
  • the expression level of the CD14 variant polypeptide was measured by EIA using an anti-human CD14 antibody. That is, the anti-CD14 antibody MEM—18 (MONOSAN) diluted 200-fold with 10 mM NaHCOa buffer at pH 8.3 was added to a 96 ⁇ plate (Maxisorp, Nunc) at 501 / we11. , 4 and left overnight. After that, wash with pure water and include 0.5% 83 Blocking was performed at room temperature (standing at room temperature for 60 minutes).
  • the anti-CD14 antibody MEM—18 diluted 200-fold with 10 mM NaHCOa buffer at pH 8.3 was added to a 96 ⁇ plate (Maxisorp, Nunc) at 501 / we11. , 4 and left overnight. After that, wash with pure water and include 0.5% 83 Blocking was performed at room temperature (standing at room temperature for 60 minutes).
  • the culture supernatant containing the CD14 variant polypeptide obtained in (3) was purified using an affinity purification column (HiTrap column Amhersh am Pha) to which an anti-human CD14 antibody (3C10) was bound. rmacia Biotech)) to selectively adsorb and elute with a pH gradient.
  • the obtained eluted fraction was immediately neutralized with a 1 M HEPES buffer solution at pH 8.0 to neutralize the pH.
  • Each fraction was assayed by the EIA method using HRP-conjuga ted 3C10, and a fraction containing the CD14 variant polypeptide was selected.
  • the molecular weight of the modified CD14 polypeptide was confirmed by Western blot using an anti-human CD14 antibody (3C10 and MEM-18). That is, each CD14 variant polypeptide 30 ng gZl ane was electrophoresed on SDS_po 1 yac l ami lami degr adient gel (5-20% ATTO) and the protein was transferred to a PVDF membrane (Nippon Millipore). 0.5%
  • a human sCD14 (1-307) amino acid-substituted modified polypeptide obtained by substituting Ala for the 283rd amino acid Leu from the N-terminal of sCD14 (1-307) is used.
  • SCD14 (1-307) L283A was described, and other human sCD14 (1-307) amino acid substitution variant polypeptides were similarly described.
  • Plasmid pM 1673 expressing sCD14 (1-307) K279A was constructed using sense primer 3 and antisense primer 18 (SEQ ID NO: 38) or sense primer 10 (SEQ ID NO: 39) and antisense primer 1-4.
  • EXAMPLE 8 Plasmid pMl658 prepared in (2)
  • Lys is encoded in antisense primer 18 and sense primer 10 Instead of the sequence, the sequence GCT encoding A1a (the antisense primer was AGC) was used. The DNA fragments amplified by these PCRs were separated and collected by 1% agarose gel electrophoresis, and the ends of the DNA fragments were blunt-ended using K1enow Fragment (TaKaRa).
  • Antisense primers 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 and 29 SEQ ID NOs: 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 and 50
  • sense primers 11, 12, 13, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, and 21 SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 and 61
  • AGA Asp codon sequence GAT (the antisense primer was ATC) and the sense primer 22 (SEQ ID NO: 62) and the antisense primer 30
  • plasmids were prepared which expressed the variants in which Ser at position 286 was replaced with Cys, Gly, Thr, and Leu, respectively.
  • the construction method is the same as that for the construction of the sCD14 (1-307) S286A expression plasmid.
  • Cys substitution use the sense primer 23 (SEQ ID NO: 64) and the antisense primer 31 (SEQ ID NO: 65).
  • sense primer 24 SEQ ID NO: 66
  • antisense primer 32 SEQ ID NO: 67
  • sense primer 25 SEQ ID NO: 68
  • antisense primer 33 SEQ ID NO: 68
  • No. 69 is replaced with the sense primer 26 (SEQ ID NO: 70) and antisequence in the case of Leu substitution.
  • the construction was performed using Primer-34 (SEQ ID NO: 71).
  • CD14 (1-307) P300A did not show any expression in the supernatant.
  • CD14 (1-307) modified polypeptides other than sCD14 (1-307) S286L, which had low expression levels, were prepared from COS-1 culture supernatants obtained by transfection of each plasmid. 8- Purified by the same method as (4). 3) Detection of human SCD 14 (1 -307) amino acid substitution variant polypeptide Detection of each CD 14 variant polypeptide is performed in the same manner as detection of soluble CD 14 C-terminal deletion variant polypeptide. Performed by rn b 1 otting. All of the human sCD14 (1-307) amino acid substitution variant polypeptides exhibited the same molecular weight as sCD14 (1-307). (Example 10)
  • Example 3 The procedure was as described in Example 3 except that instead of adding 401 ng of F 1024-1-3 antibody of 900 ng / m 1, 401 of the modified polypeptide of 014 of 900 n 8/1111 was added.
  • the IL-6 production inhibitory activities were 67.5, 45.4, and 42.6% for sCD14 (1-285), sCD14 (1-246), and sCD14 (1-183), respectively.
  • the variant CD14 polypeptide that showed strong inhibitory activity was sCD14 (1-285).
  • S 286 G has the strongest inhibitory activity of the 286th Ser modification
  • S CD 14 (1-307) S 286C has s CD 14 (1-307) S It showed almost the same inhibitory activity as 286A.
  • HUVEC cells were rolled into a 96-well plate in the same manner as in Example 10 and cultured for 24 hours.
  • RPMI 1640 medium containing 7% human serum from which 4 has been removed 20 ⁇ 1, 120 ng / m 1 LPS (E. coli 055: B5, Difco) 101 and 900 ng gZm 1 CD 14 Variant polypeptide 401 was added to the wells.
  • IL-6 in the culture supernatant was measured using a hum an IL-6 EIA kit (PE Biosystems).
  • Example 10 The results are shown in Table 3. In Example 10, sCD14 (1-356), sCD14 (1-307) and sCD14 (1-152) which did not show IL-6 inhibitory activity, and SCD14 (1 -183) and SCD14 (1-307) C287A were confirmed to induce IL-6 production.
  • IL-6 production was below the detection limit of the measurement (50 pgZm1). That is, S CD 14 (1 -246), s CD 14 (1-285), s CD 14 (1 -307) D284A, s CD 14 (1-307) S 286A and s CD 14 (1-307) S It was revealed that 286C did not induce IL-16 production in the presence of LPS, and inhibited IL-6 production by a complex of serum-derived soluble CD14 and LPS. 0 0
  • Peripheral macrophages and monocytes were isolated from peripheral blood of healthy subjects by the following method. First, 20 Oml of human peripheral blood to which heparin had been added was diluted 2-fold with PBS_, and each layer was overlaid with 21 ml of FicoylPaque (AmershamPharmaciaBiotech) at 28 ml. After centrifugation at 1500 rpm for 30 minutes at room temperature, a mononuclear cell fraction was collected. Next, macrophages and monocytes were isolated using the MACS system (Daiichi Pure Chemicals).
  • CD 14 positive cells were separated using Ram RS + (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.). Positive selection.
  • peripheral macrophages and monocytes were suspended in 2% CD 14w / oHS 'RPM I, 0. 5 xi 0 at 5 cells / well (50 1 / wel 1) implanted in 96 ⁇ El plates, 37, 5% They were cultured for 24 hours under the conditions of C_ ⁇ 2.
  • peptide 13 The sequence from position 316 to position 328 described in SEQ ID NO: 1 was selected as a CD14-specific peptide having a high molecular weight of 49 kDa and used for immunization (hereinafter referred to as peptide 13).
  • cysteine was inserted at the C-terminus in order to bind the selected peptide to the carrier protein via the SH group at the C-terminus.
  • Peptide synthesis was performed using an ABI 432 A peptide synthesizer (Applied). The peptide was excised from the resin by a conventional method, and the peptide was purified using C18 reverse-phase HPLC (CAPCELL_PAK, Shiseido).
  • the peptide prepared in (1) was dissolved in 1 OmgZmL with distilled water, and mixed with an equal amount of Mosyanin (KLH, PIERCE) in 1 Omg / mL of maleimidated keyhole limpet. After reacting at room temperature for 2 hours, the mixture was desalted with a NAP-10 column (Pharmacia) to obtain a peptide 13 carrier antigen (hereinafter referred to as peptide 13-KLH). The protein concentration was obtained by dividing the used KLH amount by the liquid amount.
  • the recombinant human CD14 protein purified with a 0.01M carbonate buffer (pH 9.5) was diluted to 1 / gZmL, and 50 L was added to each well of an immunoplate (Maxisorb, NUNC). After reacting for 1 hour at 37, the plate was washed 5 times with ion-exchanged water, and 100 L of PBS containing 0.5% BSA was added to each well to perform blocking. Next, the culture supernatant sampled from the selected hybridoma was added to each well, reacted at 37 for 1 hour, and washed three times with a saline solution containing 0.05% Tween 20.
  • Peroxidase-labeled anti-rat immunoglobulin antibody containing 10% ⁇ egret serum? It was diluted 1000 times with 83 and added to each well at 50 // L. After reacting for 1 hour at 37, the wells were washed 5 times in the same manner, and a tetramethylbenzidine solution containing 0.01% hydrogen peroxide was added to each well. After the reaction at room temperature for 10 minutes, the reaction was stopped with a 0.5 M sulfuric acid solution, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate spectrophotometer (NJ-2100, Nippon Intermed). As a result, a well (F1025-4-1) containing a hybridoma that reacted with a high molecular weight CD14 protein was selected and cloned by the limiting dilution method.
  • DAKO Peroxidase-labeled anti-rat immunoglobulin antibody
  • Peroxidase was mixed with each antibody in the same amount and reacted at 25 for 2 hours. 4 mgZmL of sodium borohydride was added, and the mixture was further reacted at 4 ° C for 2 hours. The reaction solution was dialyzed against PBS to obtain a peroxidase-labeled antibody. The amount of the solution was measured, and the antibody concentration was calculated from the amount of the used antibody.
  • COS-1 cells (ATCC: CRL 1150) were inoculated into 3 ⁇ 10 5 eel 1 s / 75 cm 2 flasks and cultured overnight at 37% under 5% strain 2 . The next day, using the plasmid PCDNAT4 described in Example 2 (1) and mixing according to the protocol described in FuGENE6 (Roche) at a ratio of 6.25 g DNA: 25 ⁇ 1 FuG ENE6, 1% FBSZDMEM (S i gma, high glucose) was added to the flask was added 15 mL, and cultured 37 ⁇ 5% hundred 2 under 48 hours. In addition, COS-1 cells that were similarly operated without the plasmid were used as negative controls.
  • TLR4-COS Discard supernatants of COS-1 cells expressing TLR4 molecule on the cell membrane (hereinafter referred to as TLR4-COS) and non-expressed COS-1 cells, and use PBS- (Sigma).
  • the cells were washed twice. Next, add 5 ml of 1% EDTAZPBS-solution, stir gently, and use a cell scraper (COSTAR).
  • COSTAR cell scraper
  • the cells were peeled off from the culture flask and collected in a 5 OmL centrifuge tube. The flask was further washed with 5 mL of PBS, added to a 5 OmL centrifuge tube, centrifuged for 10 minutes at l OOO rpm to precipitate the cells, and the supernatant was discarded.
  • washed washed.
  • washed cells were filtered with a 40-m cell strainer (FALCON), and the number of cells was counted.
  • the mixture was centrifuged once, diluted with PBS to a concentration of 5 x 10 5 eel 1 sZmL, and stored at 4 ° C.
  • FITC—LPS Sigma, Serotype Ollll: B4
  • PBS— (pH 7.4) and the recombinant sCD14 (1-356) 300/300 prepared in Example 8 gZmL was mixed 1: 1 and left at 37 ° C for 30 minutes to form a complex.
  • the formation of the complex was confirmed by an ELISA system using the anti-FITC antibody-immobilized plate and the peroxidase-labeled anti-CD14 antibody (F1025-4-1) prepared in (1). That is, the anti-FITC antibody is immobilized on a plate with 10 X gZmL and blocked with 0.5% bovine serum albumin ZPBS. did.
  • the prepared three samples of FITC-LPS / CD14 complex, FITC-LPS and sCD14 were added to the antibody-immobilized well, and reacted at 37 ° C for 1 hour. After washing each well, react with peroxidase-labeled anti-CD14 antibody diluted to 1 wg / mL. After washing, react with TMB chromogenic substrate solution (BioFix, Funakoshi) to obtain appropriate color development. Then, the reaction was stopped with sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured. As a result, no increase in absorbance was observed with FITC_LPS and sCD14 alone, whereas the absorbance increased only with FITC-LPSZCD14 complex, confirming that a complex was formed.
  • the prepared FI TC-LPSXCD14 complex was bound on the chip, and then the antibody was bound to immobilized CD14 using the F1024-1-3 antibody diluted to 130 gZmL with HBS-EP buffer as an injector. .
  • TLR4-COS cells and COS cells as a control were added, and the amounts of TLR4-COS cells and COS cells bound were measured.
  • the results are shown in Figure 15, where the height of the bar graph indicates the amount bound on the cell. That is, an increase in response was observed due to the binding of the LP SZCD 14 complex to the cells. Next, no binding was observed in the COS cells since no response was observed.
  • the inhibition rate was calculated as follows: (Response of TLR4-COS (TOLL 4-COS) cells without F1024-1-3 antibody)- ⁇ (Response of TOL L4-COS cells when F1024-1-13 antibody bound) ) ⁇ (Response of COS cells when F1024_1-3 antibody is bound) ⁇ I (Response of TOLL4-COS cells without F1024_1-3 antibody) XI 00 (%).
  • sCD14 (1-356) To immobilize sCD14 (1-356) on the cell on the chip used for the analysis of BI ACORE 3000, activate the cell with NHSZEDC solution (Biacore) for 14 minutes according to the Biacore manual, and then adjust the pH to 4.0.
  • SCD14 (1-356) diluted to 200 gZmL with an acetate buffer was added by manual injection to immobilize sCD14 (1-356), and then blocked with ethanalamine. Untreated cells were used as references.
  • the prepared chip was placed in BI ACORE 3000, and the sensorgram was started at a flow rate of 10 L / min using HBS-EP buffer (Biacore) according to the Biacore manual.
  • S CD 14 (1—307) (S 286 C) 10 ⁇ g / mL, (03 cells 1.7 x 10 5 eel I s mL, Toll 4_ COS cells
  • 5 sZmL of cell 1.7 xi 0 5 cells were injected into each, no binding to sCD14 (1-356) was observed in any of the three.
  • LPS (Sigma, Serrotyp e055: B5) was injected and bound to the sCD14 (1-356) cell at a flow rate of 1 LZmL for 30 times, followed by 1% human serum (possible).
  • the soluble CD14 was removed by the method described in Example 3), and 5 ⁇ L of To114-COS cells prepared in 1.7 ⁇ 10 5 cell sZmL with PBS—injected 5 L to form the LPSZCD14ZTLR4 complex. The binding was confirmed. ( Figure 16). _
  • sCD14 (1-356), sCD14 (1-307) or sCD14 (1-307) S286A (20 gZml each final concentration) with LPS (100 gZml final concentration). Incubated at ° C for 16 hours. These reactions The solution was electrophoresed on a 7.5% SDS-free po 1 yacry 1 am idegel (ATTO) at 300 V constant pressure for 5 hours, and then the protein was transferred to a PVDF membrane. Then, the Westernb was treated in the same manner as in Example 8. One otting was performed, and a band of sCD14 was detected.
  • S286A 20 gZml each final concentration
  • LPS 100 gZml final concentration
  • the anti-CD14 antibody was rat serum obtained by administering sCD14 in purified healthy human serum to the rat as an antigen, that is, rat anti-human CD14 antiserum, and the secondary antibody was HRP_con A jugated anti-rat Ig antibody (DAKO) was used.
  • a soluble serum-derived CD14 purified by the method shown in Example 8_ (4) was applied to an affinity purification column (Hi Trap column, Am ersh column) to which the F1024-1-3 antibody was bound. amPharmaciaBiotech) to remove soluble CD14 of the Water molecular species.
  • the obtained unadsorbed fraction was concentrated by a freeze-drying method, and the concentration was determined by an EIA method using an anti-CD14 antibody described in Example 8.
  • the ratio of serum-derived soluble CD14 low molecular species to the total soluble CD14 in serum was less than 5%.
  • the CD14 low molecular weight polypeptide is located between SCD14 (1-285) and SCD14 (1-246) of the CD14 variant polypeptide (FIG. 9) prepared in Example 8. It was confirmed that. In addition, it can be seen from the binding to the 3C10 antibody that the seventh and subsequent amino acids of CD14 are maintained. From these results, it was found that in the low molecular species of CD14, the N-terminus of CD14 is 1 to 6, and the C-terminus is between 246 and 285.
  • the 36 kDa molecule was not detected in human serum-derived soluble CD14 (Lane 1) compared to the 49 kDa and 55 kDa molecules, compared with the 36 kD in human serum-derived soluble CD14. This is because the molecule of a is trace.
  • the obtained serum-derived soluble CD14 low-molecular-weight polypeptide 100 ng Zlane was electrophoresed on SDS_polyacrylamide amide gel (5-20% ATTO) and 2D- _Silver staining reagent ⁇ II Silver staining of proteins was performed using “Daiichi” Kit (Daiichi Kagaku).
  • soluble CD14 low-molecular-weight polypeptide derived from human serum was slightly broadened at 36 ⁇ 5 kDa. As a single band, and it was confirmed that it was substantially purified.
  • HUVEC Human vascular endothelial cells HUVEC (Sanko Junyaku Co., Ltd.) were detached by the method described in Example 3, suspended in 2% CD14w / oHS / RPMI, and suspended at 5 ⁇ 10 4 cells / we 11 (50 1 / we 1 1) at 96 ⁇ El plate implantation 3 7: and cultured for 24 hours under the conditions of 5% C0 2.
  • Figure 10 shows the results.
  • the IL-16 production inhibitory activity of CD14 low molecular species was 86.7%.
  • Example 2 (1) The HE KT 4-14 obtained in Example 2 (1) was seeded into a 24 well plate with 0.8 X 10 5 eel 1 s / we 11 and F1024-1 11 was used in the same manner as in Example 2 (2). 3 or s CD 14 (1-307) S 286 C present or absent Stimulated with LPSZs CD 14 below. After 20 hours, the culture supernatant was collected, and the amount of IL-8 produced in the supernatant was confirmed by EIA. As a result, both F 1024-1-3 and s CD 14 (1 -307) S 286 C showed inhibitory activity in a concentration-dependent manner. (Fig. 20)
  • the human kidney-derived cell line U-373MG (ATCC) was detached with PBS containing 0.05% T yp sin, 0.53 mM EDTA, and suspended in RPMI 1640 medium (Asahi Techno Glass Co., Ltd.). The cells were seeded with 0 4 cell sZwell (100 lZwe11) in a 96-well plate, and cultured for 24 hours under the conditions of 37 V and 5% CO 2.
  • RPMI 1640 medium 701, 1 g / m1 (wZv) Staphylococcus au reuscellsuspendion (Sigma) 10 1, 5 gZm1 sCD14 (1-356) 10 1 And 10 g / m1 of the CD14 variant polypeptide or F1024-1-3 antibody 1 n1 were added to the wells, and the cells were further cultured for 20 hours. The measurement was performed using an L-6 EIA kit (IL-6Eli-pair: GI BCO BRL). As a control, S CD 14 (1-356) was added instead of the CD 14 variant polypeptide, F1024-1-3 antibody.
  • IL-16 was measured according to the protocol attached to the human IL-6 EIA kit. That is, 4 times dilution with 1% (w / v) BSAZPBS (-) Transfer the culture supernatant 50 1 to the IL-6 antibody-immobilized plate,
  • the IL-16 production inhibitory activity of the 24-1-1_3 antibody was 48.1% and 55.2%, respectively.
  • the cells were suspended in 1 mL of 5% bovine serum / 1% EDTAZPBS- and preincubated with 275 ng of F1024-1-3 antibody and human SCD14 (1-356) F1024-1-13.
  • the antibody and rat IgG were added to a final concentration of 1 ag mL, respectively, and reacted at 4 t for 1 hour.
  • 0.25% bovine cell suspension After washing three times with serum ZPBS, the cells were resuspended in a 1000-fold diluted FITC-labeled anti-rat antibody (DAK0) and reacted with 4 for 30 minutes. The cells were washed again, and the FACS analysis was performed using FACS CaI ibur (BD) to measure the fluorescence intensity. As shown in Fig. 23, egret monocytes were stained with the F1024-1-3 antibody and human
  • the LPS-loaded heron sepsis model was prepared using LPS (Salmonella minnesota Re595, Sigma) according to the method of Sch imke et al. (Proc. Nat. 1. Ad. Sci. USA, 95: 13875, 1998). ) was prepared by injecting 5 gZkg via the ear vein every 0, 5, and 24 hours into New Zealand white seeds (2. 1-2. 4 kg, Kitayama Labes). The protocol of the pre-administration group was to administer 2.5 mg Zkg of the F1024-113 antibody every 1, 4, and 23 hours from the ear vein. The control group was administered a saline solution instead of the antibody.
  • the animals were divided into groups according to body weight, and five birds were selected from each group, and pre-bleeding was performed 11 hours later.
  • blood was collected every 1, 3, 5, 7, 23, 25, 28, and 48 hours, and the body weight, white blood cell count, serum GPT, serum creatinine, and serum TNFa were measured.
  • the leukocyte count was measured by Sysmex F-280 (Toa Medical Electronics), and the serum GPT value and serum creatinine value were measured by DRI-CHEM5000 (FUJ IFI LM).
  • TNF ⁇ is determined by the method of D avid et al. (JournalofImmuniologicacalMethods, 68: 167, 1984).
  • 929 cells (ATCC) are stripped with 0.2% 25% trypsin ZPBS and 5.5X
  • the efficacy of the F1024-1-3 antibody was determined based on the survival rate after 48 hours.
  • the amount of TNF production in the serum was suppressed by administration of the F104-1-1-3 antibody, and in vivo, as in vitro, the production of inflammatory cytokines was reduced. It was clarified that the F1024- 1-3 antibody was suppressed.
  • Table 4 shows the improvement in mortality and the various parameters over time in the LPS-loaded ⁇ heron sepsis model of F1024-1-1_3 antibody.
  • an LPS-loaded 2 heron sepsis model was prepared.
  • the protocol of the post-administration group administered the F1024-1_3 antibody at 2.5 mg / kg every 4 to 23 hours via the ear vein, and the control group received a saline solution instead of the antibody.
  • SCD14 (1-356) was used in Example 8. 11.6 mg from 1.15 L of the culture supernatant, and 11.2 mg from 7.8 L of the culture supernatant as described in Example 9 for sCD14 (1-307) S 286C was prepared respectively. The purity of each polypeptide was confirmed by the silver staining method as a single band.
  • each polypeptide 1 O OngZlane is electrophoresed with SDS-polyacryl 1 ami degradient gel (5-20% ATTO), and 2D-silver staining reagent II II Daiichi Silver staining of proteins was performed using a kit (Daiichi Pure Chemicals). As a result, only the calculated size band of each polypeptide was stained.
  • mice Six-week-old B a 1 bZc male mice (manufactured by Charles River Japan Co., Ltd.) were divided into 5 groups (10 mice per group) based on body weight. Then s CD14 (1-307) S 2 86C from 3mgZkg to 10mgZkg, sCD14 (1-356) 10mgZkg, physiological saline (for negative control, Otsuka Pharmaceutical) or sol medrol 10mgZkg (for positive control) A single injection from the tail vein Gave.
  • LPS Symone lla mine sota Re 595, SI GMA
  • galactosamine D—Ga1 actos amine Hydrochloride, Wako Pure Chemicals
  • S286C Analysis of the N-terminal amino acid sequence of sCD14 (1-307) S286C, one of the CD14 variant polypeptides, was performed using the Proteinse quencer Procise TM 494c LCP roteinse quenci ng syst em (Applied (Biosyst ems Japan). As a result, only 5 residues of ThrThrProG1uPro were confirmed as the N-terminal amino acid sequence. No other amino acid sequence was confirmed Thus, it was found that the N-terminus of SCD14 (1-307) S286C is the first amino acid.
  • Example 8 The coding region of CD14 was excised from the SCD14 (1-285) expression plasmid pM1659 prepared in (2) using NcoI and Hindlll. Next, this DNA fragment was inserted into Ncol and Hindill of a plasmid pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech) for expression of Escherichia coli having a Trp promoter, and JM109 competent cells were transfected according to a standard method. The plasmid pTrc1659 was obtained.
  • the obtained plasmid was converted into type I using a sense primer 27 (SEQ ID NO: 72) and an antisense primer-35 (SEQ ID NO: 73) with Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) at 98 for 10 seconds, 551: The cycle was repeated 30 times for 30 seconds and for 1 minute at 72 to perform PCR. Next, this PCR product was digested with XhoI. In addition, pTrc1659 was digested with Nc ⁇ , blunt-ended with kle now fragment (TaKaRa), digested with XhoI, and ligated with the PCR product described above.
  • JM109 competent cell was subjected to transcription, and an sCD14 (1-285) E. coli expression plasmid pTrcl659-1 was obtained.
  • JM109 containing pT rcl 659-1 is a LB medium (B) containing ampicillin (D [-]--Amino benzylp en ici 11 in; Sigma) at a final concentration of 50 / gZmL. (IO 101 company) until the absorbance at 600 nm becomes 1, and the final concentration of 1 mM I PTG (Isopropyl j3-D-Thioga1 actopy ranoside; Sigma was added to the medium, and the cells were further cultured for 3 hours.
  • the cells recovered by centrifugation are suspended in TE buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 0.5% Triton-X100 (Sigma), freeze-thawed and sonicated. After disruption, the CD14 polypeptide was solubilized. When the expression level of the polypeptide was measured by the method described in Example 8- (5), an expression level of about 8 ⁇ g / mL was obtained per 1 mL of the E. coli culture solution.
  • a substance having a function of inhibiting the binding between CD14 and TLR which can regulate intracellular signal transmission even if CD14ZL PS is already formed, a method for producing the same, and a therapeutic agent for sepsis And a pharmaceutical composition for sepsis.

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Description

明 細 書
TLR/CD 14結合阻害剤 技術分野
本発明は、 CD 14と To l l L i ke Re c e t o r (以下 TLRと いう） との結合を阻害する機能を有する抗 CD 14抗体及びその断片、 該抗体ま たは断片を産生するハイプリドーマ、 ペプチド、 抗体の作成方法、 CD 14改変 体ポリぺプチド、 敗血症治療薬のスクリ一二ング方法並びに敗血症用医薬組成物 に関する。 背景技術
CD 14は、 356個のアミノ酸からなる糖蛋白であり、 グリコシルホスファ ナジリレイノシ卜ーリレ 、g l yc o s y l pho s ph a t i dy l i n o s i t o 1 ： GP I) によりマクロファージ、 単球、 クッパー細胞、 好中球および一部 B細胞の膜上にアンカリングされて存在する。
ヒト CD 14は、 膜結合型 CD 14 (以下 mCD 14ともいう） のほかに可溶 型 CD 14 (以下 s CD 14または可溶性 CD 14ともいう） がある。 そして血 中には分子量の異なる複数の s CD 14が存在することが報告されている （L a e t a MO ： E u r . J . I mmu n o 1. ， 23 ： 2144, 1993 ) 。
ヒト CD 14は、 グラム陰性桿菌内毒素の LP S受容体として知られており （ Wr i gh tら： S c i enc e, 249 ： 1431, 1990) 、 血中の LB P (LPS b i nd i ng p r o t e i n ) から L P Sを受け取り、 複合体 を形成する。
mCD 14を発現しているマクロファージ等は、 LP Sと s CD 14の複合体 により活性化され、 炎症性サイト力インの産生を誘導する （Ha i 1 mann Eら： J. I mmn o 1. , 156 : 4384, 1996) 。
mCD 14を発現していない血管内皮細胞や血管平滑筋細胞は、 s CD 14と LPSの複合体 （以下 S CD14ZLPSともいう） により炎症性サイト力イン の産生が誘導される （Loppnow H ら： I n f e c t i on & Im mun i t y, 63 : 1020， 1995) 。
また、 グラム陰性菌ばかりでなくグラム陽性菌の菌体成分やマイコバクテリア にも反応し、 リポ夕ィコ酸 （LTA) 、 ペプチドダリカン （Pe pG) 等の受容 体として機能し、 細胞の炎症性サイトカインの産生を誘導する （C 1 e V e 1 a n d MGら ： I n f e c t i mmu n i t y, 64 : 1906, 1 99 6) 。
LP Sまたは LTA等の CD 14を介する細胞のサイトカイン産生は、 生体に 障害的な作用を及ぼし、 敗血症を引き起こす。 一般に、 敗血症の初期症状には悪 寒、 多汗、 発熱、 衰弱等がみられ、 引き続いてショックを起こす低血圧、 好中球 減少症、 汎発性血管内血液凝固症候群、 成人性呼吸窮迫症候群、 呼吸不全、 多臓 器不全等、 重篤な臨床症状が生じる。
ヒト CD 14の LP Sのシグナルを細胞に伝達する機能は、 その領域が一部明 らかになつている。 N末端 1〜152番目が CD 14の機能発現に必須な領域で あり （J u an TS ら： J. B i o l . Che m. ， 270 : 1382, 1 995) 、 また 7〜14番目および 57〜64番目が LPSとの結合に必須な部 分である （J u an TS ： J. B i o l. Che m. , 270, 29 : 17 237 ( 1995) および J u a n TS ： J. B i o l . Ch e m. ， 2 70， 10 : 5219 (1995) ) 。
しかし、 ヒト CD 14の N末端 153番以降の有する機能については、 まった く明らかになっていない。
また、 CD 14_ LP Sの細胞へのシグナル伝達における To 1 1 l i ke r e c e p t o r (TLR) の関与が近年研究されている。 現在までにヒト T LR 1、 2、 3、 4及び 5 (F e r n a n d R ： P r oc. Na t l . A c ad. S c i. USA, 95 : 588， 1998 ) 、 TLR6 (T a k e u c h i 〇： Ge ne, 231 : 59, 1999) 、 TLR 7、 8、 9および 偽遺伝子 （Chu ang TH： E u r . Cy t ok i ne Ne tw. , 1 1 ： 372, 2000) の合計 10種の TLR f am i 1 y遺伝子がクロ一二 ングされている。
TLR 2若しくは TLR 4を欠損したマウスによる研究により、 TLR4がグ ラム陰性菌菌体成分の細胞へのシグナル伝達を、 TLR 2がグラム陽性菌菌体成 分の細胞へのシグナル伝達を担っている可能性があることが報告されている （T a k e u c h i Oら： I mmu n i t y, 11 : 443, 1999) 。 また T L R 4が L P Sの細胞内へのシグナル伝達に関与すること、 さらに T L R 4が細 胞表面上で LPSに直接反応すること、 CD 14存在下では反応が増強されるこ とが報告されている （Ru e y— B i n g Y ： Na t u r e, 395 : 28 4, 1998 ；) 。 また最近 TLR 4と結合する MD 2が発見された （R i n t a r o S h i ma z u ： J. Exp. Me d. , 189, 1777, 199 9) 。 MD 2は 160アミノ酸からなる分泌蛋白質であるが、 マウス細胞では T L R 4は MD 2存在下ではじめて L P Sシグナル伝達を行うことが報告されてい る。 MD 2の L P Sシグナル伝達における正確な役割は未解明であるが TL R 4 もしくは TLR4の 2量体の構造の安定化に寄与していると考えられている （ A l an Ad e r em, Na t u r e, 406, 782, 2000) 。 またマウ ス TLR4と MD2の複合体を認識する抗体は LPSによる TNF— αや一酸化 窒素の産生を特異的に抑制することも報告されている （Ak a s i S. ， J. Immuno l . 164, 3471, 1999) 。
またマウスにおいては TLR 4のスプライスバリアントの可溶性 TLR 4が報 告された。 そしてこの 86アミノ酸残基からなる可溶性 TLR 4は LPSによる 細胞の活性化を抑制する活性を示したことが報告されている。 （ I warn i K I ， J. Immuno l, 165, 6682, 2000. )
しかしながら CD 14と TLRとの相互作用において、 CD 14が TLRもし くは TLRと他の機能の解明されていない低分子物質であるアクセサリー分子の 複合体と直接結合するか否かは明らかになっておらず、 さらに丁し尺とじ014 の結合領域もまったく未知である。
LPSのヒト CD 14を介するシグナル伝達を制御するヒト抗 CD 14抗体と して、 ヒトじ014の7〜14番目に結合する 3 C 10抗体 （S t e i nman ： J. Exp. Me d. ， 158 : 126 (1983) および J u a n TS ： J. B i o l . C h em. ， 270 ： 29, 17237 ( 1995) ) およ び 57〜64番目に結合する MEM— 18抗体 （B a z i 1 ： Eu r. J. I mmu n o l . ， 16 : 1583 (1986) および J u a n TS : J . B i o l . Ch em. ， 270, 10, 5219 ( 1995) ) が知られており、 敗血症治療薬への応用が開示されている。
さらに、 LPSの結合を抑制し、 サイト力インの放出を抑制する 28 C 5抗体 および 23G4抗体、 並びに LPSの結合は一部しか抑制せず、 サイト力インの 放出を抑制する 1 8 E 1 2抗体 （特表平 8— 5 1 0909号） が開示されて いる。
また、 グラム陽性細菌及びマイコバクテリアとの作用に対する抗 CD 14抗体 も開示されている （特表平 10_ 505839号） 。
しかし敗血症治療薬として用いる場合、 LPSの結合領域を認識する抗体、 ま たは LPSの結合を抑制する抗体は、 すでに形成した LP SZCD 14のシグナ ル伝達を抑制する効果は期待できない。 また、 LPSの CD 14への結合を特異 的に阻害するため、 グラム陽性菌の菌体成分及びマイコプラズマ等によるシグナ ル伝達を抑制する効果も期待できない。 また、 18 E 12抗体は CD 14の認識 部位が明らかになっておらず、 サイトカインの放出を抑制する機序も不明で ある。
ヒト CD 14の LPSとの結合部位に着目した抗炎症性べプチドとして、 CD 14の N末端から 7〜 10、 11〜 14及び 57〜64番目のアミノ酸をベース とする抗炎症性ペプチド （特表平 10— 51 1954) が開示されている。 これ らのぺプチドは L P Sと結合能を有するため L P Sを除去するものであり、 既に 形成されている CD 14 LPSの細胞内へのシグナル伝達は抑制しない。 また、 ヒト CD 14の LPSとの結合部位を改変した抗炎症性ペプチドとして 、 CD 14の N末端から 7〜10番目に天然型配列とは異なるアミノ酸を有する か、 または CD 14の N末端から 1〜14番目が欠失している可溶性 CD 14関 連ポリぺプチドを含む抗炎症性ポリぺプチド （特表平 10— 512142) が開 示されている。 これらのペプチドは、 LPSとの結合部位が改変されているため 、 LPSのシグナルの細胞内への伝達を抑制するものである。 しかし、 既に形成 されている CD 14 ZL P Sの細胞内へのシグナル伝達は抑制しない。
すなわち、 従来における CD 14の機能を抑制するものは特定の細菌菌体成分 と CD 14との結合を阻害する物質であり、 これらは他の細菌菌体成分との結合 を阻害することは難しく、 また既に形成された CD 14ZLPSのシグナル伝達 を抑制する効果は期待できない。
また上記のとおり、 CD 14 /LPSの細胞へのシグナル伝達における TLR の関与が知られているが、 この関与を阻害する物質が、 シグナル伝達を調節する ことが可能か否かは定かではなく、 また阻害する物質はまったく知られてい ない。
本発明の課題は、 すでに形成された CD 14 ZL PSであっても細胞内へのシ グナル伝達を調節しうる CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有する物質 、 その作成方法、 敗血症治療薬のスクリーニング方法、 敗血症用医薬組成物を提 供することである。 発明の開示
発明者らは、 上記のような従来の問題点を克服するため鋭意検討を行い、 CD 14と TLRとの結合を阻害する抗 CD 14抗体を提供する。 また抗 CD 14抗 体が該作用をするために必要な認識領域のヒト CD 14における特定により、 そ の特定領域を用いた抗体の作成方法を提供する。
さらに CD 14と TLRとの結合を阻害する CD 14改変体ポリペプチドを提 供する。 またこの CD 14改変体ポリペプチドの作成方法を提供する。
また CD 14と被検物質との接触を TLRの存在下に行う新規な敗血症治療薬 のスクリーニング方法、 および CD 14と TLRとの結合を阻害する物質を有効 成分とする敗血症用医療組成物を提供する。
すなわち本発明では、 下記 （1) 〜 （1 1) の抗 CD 14抗体が提供される。
(1) 配列番号 1に記載のヒト CD 14の 269番から 315番までの領域の一 部を含むェピトープを特異的に認識し、 CD 14と To 1 1 L i k e R e c e p t o r (TLR) との結合を阻害する機能を有する抗 C D 14抗体。
(2) モノクローナル抗体である （1) の抗体。
(3) 上記 （2) の抗体の F a b、 F a b' または （F a b' ) 2 である断 片。
(4) ハイプリドーマ F 1024- 1 -3 (受託番号 P— 18061) により産 生される F 1024- 1一 3モノクローナル抗体。
(5) 上記 （2) 〜 （4) のいずれかに記載の抗体若しくは抗体の断片を産生す る八イブリドーマ。
(6) 配列番号 1に記載のヒト CD 14の 269番から 315番までの領域のァ ミノ酸を連続して 8個以上含むぺプチド。
(7) 上記 （6) に記載のペプチドを免疫原として用いる抗体の作成方法。
(8) CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有し、 以下①または②のいず れかである CD 14改変体ポリペプチド：
①配列番号 1に記載のアミノ酸配列の N末端が 1〜 6番目のいずれかであり、 C末端が 246〜306番目のいずれかのアミノ酸配列を有する、
②配列番号 1に記載のアミノ酸配列の N末端が 1〜 6番目のいずれかであり、 C末端が 269〜356番目のいずれかであり、 かつ 269〜 307番目のアミ ノ酸のいずれか一つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。 いうまでもないが、 上記の CD 14改変体ポリペプチドは、 CD 14ポリぺプ チドが改変されたものでもよいが、 化学的に合成されたものでも、 遺伝子工学的 に人工的に発現されたものでもよく、 その製造方法には限定されない。
(9) 上記 （8) ①において、 C末端が 246〜285番目のいずれかである （ 8) に記載の CD 14改変体ポリペプチド。
(10) 上記 （8) の②において、 C末端が 269〜356番目のいずれかであ り、 かつ 269〜307番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が L e u、 A l a, Cy sまたは G 1 yに置換された （8) の CD 14改変体ポリペプチド。
(1 1) 上記 （8) 〜 （10) のいずれかに記載の CD 14改変体ポリペプチド のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入若しくは 付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ CD 14と TLRとの結合を阻害する機 能を有する C D 14改変体ポリぺプチド
(12) 上記 （8) 〜 （1 1) のいずれかに記載の CD 14改変体ポリペプチド をコードする遺伝子。
(13) 以下の①または②の DNAからなる遺伝子。
①配列番号 4〜 6のいずれかに記載の D N A
②配列番号 4〜 6のいずれかに記載の DNAとストリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、 かつ CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有するポリべ プチドをコードする DN A
(14) 上記 （12) または （13) の遺伝子を含有する組換えベクター。
(15) 上記 （14) に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
(16) 上記 （15) 形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする上記 （ 8) 〜 （11) のいずれかに記載の CD 14改変体ポリペプチドの製造方法。
(17) 血漿から得られうる分子量 36± 5 kDaの CD 14低分子種。
(18) 抗体、 抗体断片、 ポリペプチドまたは CD 14低分子種を含む CD 14 と TLRとの結合阻害剤。
(19) 遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞に、 CD 14及 び被検物質を接触させ、 特定の指標の変化を検出して、 被検物質が敗血症用治療 薬の候補となり得るか否かを判定する工程を含む敗血症治療薬のスクリーニング 方法。
(20) 上記 （18) または （19) のスクリーニング方法で得られた抗 CD 1 4抗体、 C D 14改変体若しくは低分子化合物。
(21) CD 14と TLRとの結合阻害剤を有効成分として含む敗血症用医薬組 成物。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ヒト TLR4発現細胞における LPSZs CD 14によるルシフエ ラーゼ誘導活性を示すグラフである。
HEK293は TLR 4を発現していない細胞で、 HEKT4— 14はヒト T LR4を恒常的に発現させた組換え HE K293細胞である。
第 2図は、 F 1024— 1— 3抗体が LPSZCD 14による TLR4を介す る NF— κ Bの活性化を抑制することを示しているグラフである。
尚、 阻害活性は下記の通り算出した。
(抗体未添加時のルシフエラーゼ活性一抗体添加時のルシフェラーゼ活性） 抗 体未添加時のルシフェラーゼ活性 X 100
第 3図は、 F 1024— 1— 3抗体の LPSZCD 14による内皮細胞での I L— 6産生抑制効果を示すグラフである。 c o n Aはコントロールのラット I g Gを示している。
第 4図は、 F 1024— 1一 3抗体の LPSZCD 14複合体形成後の内皮細 胞における I L一 6産生抑制効果を示すグラフである。
第 5図は、 CD 14発現細胞への F I TC- L P Sの結合を F 1024- 1 - 3抗体が阻害しないことを示しているチヤ一卜である。
第 6図は、 F 1024- 1- 3抗体の CD 14 (1— 356) への結合を阻止 する活性をもつぺプチドを示している図である。
第 7図は、 F 1024- 1- 3抗体の各種 CD 14欠失改変体との結合活性を 示している図である。
第 8図は、 F 1024- 1- 3抗体の各種 CD 14アミノ酸置換改変体との結 合活性を示している図である。
第 9図は、 ヒト可溶型 CD 14 C末端欠失改変体ポリペプチドの分子量を抗ヒ ト CD 14抗体 （3 C 10および MEM— 18) を用いて行った We s t e r n
B 1 o t t i n gの結果を示す図である。
L an e 1より L an e 6までそれぞれ、 s CD 14 (1— 356) 、 s CD 1 4 (1— 307) 、 s CD 14 (1— 285) 、 s CD 14 (1— 246) 、 s CD 14 (1— 183) 、 s CD 14 (1— 152) を 3C 10カラムにて精製 した標品を示す。
第 10図は、 ヒト CD 14の C末端側のアミノ酸を欠失した CD 14改変体ポ リペプチド及び血清由来可溶型 CD 14低分子種の LPSZCD 14による内皮 細胞の I L— 6産生阻害活性を示すグラフである。
s CD 14 (1— 356) は全長型ヒト可溶性 C D 14を示す。
s CD 14 (1— 307) 、 s CD 14 (1— 285) 、 s CD 14 (1— 2 46) 、 s CD 14 (1- 183) 及び s CD 14 (1— 152) は、 それぞれ ヒト CD 14の N末端 1〜307番目、 N末端：！〜 285番目、 N末端 1〜24 6番目、 N末端 1〜183番目、 N末端 1〜152番目のアミノ酸を有する CD 14改変ポリペプチドを、 血清由来可溶型 CD 14低分子種は健常人血清の 3 C 10カラム精製品をさらに F 1033— 3— 1カラム及び F 1025— 3— 1力 ラムにて精製し， 濃縮した標品を示す。
第 1 1図は、 s CD 14 (1 -307) のアミノ酸を置換した CD 14改変ポ リペプチドの LP SZCD 14による内皮細胞の I L— 6産生阻害活性を示すグ ラフである。 s CD 14 (1 -307) D284A、 s CD 14 (1— 307) S 286 A 及び S CD 14 (1 - 307) C 287 Aはそれぞれ s CD 14 (1— 307) の N末端から 284番目のアミノ酸 As pを A 1 aに、 N末端から 286番目の S e rを A 1 aに、 及び N末端から 287番目のアミノ酸 Cy sを A 1 aに置換 した C D 14改変ポリぺプチドを示す。
第 12図は、 S CD 14 (1 - 307) の N末端から 286番目のアミノ酸 S e rを置換した CD 14改変ポリペプチドの L P SZCD 14による内皮細胞の I L一 6産生阻害活性を示すグラフである。
s CD 14 (1 -307) S 286A、 s CD 14 (1— 307) S 286 C 及び s CD 14 (1 -307) S 286 Gはそれぞれ s CD 14 (1— 307) の N末端から 286番目のアミノ酸 S e rを A 1 a, Cy s , 及び G l yに置換 した C D 14改変ポリぺプチドを示す。
第 13図は、 CD 14改変ポリペプチドの LPSによる末梢マクロファージの TNF α;産生阻害活性を示すグラフである。
第 14図は、 CD 14改変体ポリペプチドである s CD 14 (1— 307) S 286 Cの NF— kB活性化に対する抑制効果を示したグラフである。
阻害活性の計算方法は図 2と同様である。
第 15図は、 B IACORE3000を用いて LPSZCD 14/TLR4- COS複合体を形成させたときの結合量、 F 1024— 1一 3抗体を結合したと きの TL R 4— CO Sの結合抑制効果を示した図である。 レスポンスはビアコア 社の指標であり、 1000 RUが 1. 2 n gの結合量を示すグラフである。 第 16図は、 B IACORE3000を用いて LPSZCD I AZTLRA— COS複合体を形成させたときの結合量、 CD 14( s 286 c) を TLR4— COS細胞と反応させたときの結合抑制効果を示した図である。 レスポンスはビ ァコア社の指標であり、 1 000尺11が1. 2 n gの結合量を示すグラフで ある。
第 17図は、 CD 14改変ポリペプチド （S CD 14 (1— 307) S 286 A) の LPSとの結合能を示した結果を示す図である。
第 18図は、 ヒト血清由来の CD 14ポリペプチドの分子量を抗ヒト CD 14 抗体 （3 C 10及び MEM— 18) を用いて行った We s t e r n B 1 o t t i n gの結果を示す図である。
L a n e 1は健常人血清より 3 C 10カラムによって精製した標品を、 L a n e 2は健常人血清の 3 C 10カラム精製品をさらに F 1033—3— 1カラム及 び F 1025— 3—1カラムにて精製し、 濃縮した標品の結果である。
第 19図は、 ヒト血清由来の CD 14ポリペプチドの LP SZCD 14による 細胞傷害抑制活性を示すグラフである。
血清由来可溶型 CD 14低分子種は、 健常人血清の 310カラム精製品をさらに F 1033— 3— 1カラム及び F 1025 _ 3— 1カラムにて精製し、 濃縮した 標品を示す。
第 20図は、 HEKT4— 14における I L一 8の誘導産生に対する F 102 4— 1—3及び s CD 14 (1 - 307) S 286 Cの抑制効果を示したグラフ である。
尚、 阻害活性は下記の通り算出した。 (坊体あるいは組換え体未添加時の I L一 8産生量一抗体あるいは組換え体添加 時の I L一 8産生量） Z抗体あるいは組換え体未添加時の I L一 8産生量 X 100
第 21図は、 S CD 14 (1 -307) のアミノ酸を置換した CD 14改変ポ リぺプチド、 3 C 10抗体及び F 1024- 1-3抗体の S t aphy l o c o e c u s au r e u s c e l l s u s p end i on CD 14による U -373MG細胞株の I L— 6産生阻害活性をグラフで示すグラフである。 第 22図は、 F 1024_ 1— 3抗体のィヌ、 ァカゲサル、 力二クイサル、 ゥ サギ、 ヒトの可溶型 CD 14との交差反応性を示しているグラフである。
第 23図は、 F 1024— 1— 3抗体のゥサギ CD 14との結合を F 1 u o r o c y t omt r y法で検討した結果を示すチヤ一トである。
第 24図は、 LP S負荷ゥサギ敗血症モデルにおける F 1024— 1一 3抗体 前投与により TNFの産生が抑制されることを示すグラフである。
第 25図は、 LTAZP e p G投与ゥサギ敗血症モデルにおける F 1024- 1 _ 3抗体前投与により白血球減少症が改善されることを示すグラフである。 第 26図は、 LPS負荷ゥサギ敗血症モデルにおける F 1024- 1- 3抗体 後投与により A L T、 クレアチニンの数値が改善されることを示すグラフである 。 黒印は抗体投与群、 白丸印は生食投与郡を示す。
第 27図は、 マウスエンドトキシンショックモデルでの CD 14改変ポリぺプ チドの効果を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態 ' 以下に、 より詳細に本発明を説明する。
本発明の第一の態様は、 配列番号 1に記載のヒト C D 1 4の 2 6 9番から 3 1 5番までの領域の一部を含むェピトープを特異的に認識し、 C D 1 4と T L Rと の結合を阻害する機能を有する抗 C D 1 4抗体である。
配列番号 1に記載のアミノ酸配列はヒト C D 1 4のアミノ酸配列である。 また 配列番号 1に記載される 3 5 6アミノ酸からなる蛋白質はヒト C D 1 4の全長で ある。
ここで 「ェピトープ」 とは抗原決定基であり、 抗体と特異的に結合する構造部 位をいう。
抗体が認識する領域は一次配列上連続したアミノ酸残基を認識するものとは限 らず、 蛋白質のとる立体構造を認識するェピ卜一プを有する抗体もある （抗体の 蛋白工学、 1〜4頁 三木敬三郎等編 講談社サイエンティフィック 1991年） 。 例えば、 一次配列上不連続なアミノ酸残基を認識している抗体は、 該不連続な アミノ酸残基が立体構造的には、 抗体が認識するのに十分近い距離に存在するた めに、 該不連続なアミノ酸残基をェピトープとする場合がある。
「ヒト C D 1 4の 2 6 9番から 3 1 5番までの領域の一部を含むェピトープ」 とは、 ヒト C D 1 4のアミノ酸配列の 2 6 9番から 3 1 5番に存在するェピ] プをいう。 例えばェピト一プとして、 該領域の一部の連続したアミノ酸が挙げら れるが、 上記したように、 該領域の不連続なアミノ酸も含まれる。 すなわちヒト C D 1 4の 2 6 9番から 3 1 5番までの領域に存在する限り、 連続若しくは不連 続なアミノ酸の集合または連続若しくは不連続なアミノ酸が点在した 2ケ所以上 のアミノ酸の集合も 「ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域の一部」 に含まれる。
また本発明の抗体は、 269番から 315番以外の領域を含むェピトープを認 識する抗体も含まれる。 例えば、 ヒト CD 14の 269番から 315番までの領 域の 1以上のアミノ酸残基と、 ヒト CD 14の 269番から 315番まで以外の 領域の数アミノ酸残基により形成されるェピトープを特異的に認識する抗体も含 まれる。
本抗体の認識するェピトープがヒト CD 14の 269番から 315番までの領 域においては一アミノ酸残基であっても、 そこを認識して結合することにより、 ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域が有する特定の機能を変化させ ることができるからである。
本発明の抗体は、 ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域の一部を含 むェピトープを特異的に認識し、 ヒト CD 14と結合する。 ヒト CD 14とは s CD 14または mCD 14を問わない。 また、 どちらか一方の CD 14の 269 番から 315番までの領域の一部を含むェピト一プを特異的に認識する抗体も含 まれる。 例えば s CD 14は、 血中に存在し、 mCD 14はマクロファージに存 在する。
ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域の一部を含むェピト一プを特 異的に認識するとは、 例えば、 後述する実施例 6の方法と同様に、 ヒト CD 14 の N末端 1〜315番目のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド （S CD 14 ( 1-315) ) とは結合するが s CD 14 (1 -268) と結合しないことによ り、 判断できる。 本発明の抗体は、 ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域の一部を含 むェピトープを特異的に認識することにより、 CD 14と TLRとの結合を阻害 する機能を有する。
CD 14は細菌菌体成分と結合し、 その結合した CD 14Z細菌菌体成分複合 体が TLRと結合し、 シグナルを細胞に伝達し、 細胞を活性化する。 これらのシ グナル伝達機構により細胞が活性化されると、 細胞から炎症性サイ卜力インが放 出され、 細胞障害、 敗血症等の炎症が惹起される。
本発明の抗体は、 菌体成分による細胞活性化を CD 14と TLRとの結合を阻 害する機能を有することにより抑制し、 細胞障害、 敗血症等の炎症を抑制す る。
「CD 14と TLRとの結合」 を詳細に説明すると、 CD 14と細菌菌体成分 とが結合した CD 14ノ細菌菌体成分複合体と TLRとの結合である。 細菌菌体 成分には、 LPS、 LTA若しくはペプチドダリカン （PGN) 若しくはリポア ラビノマンナン等、 マイコプラズマ等が挙げられる。 例えば LPSと CD 14が 結合した複合体である LP SZCD 14は TLR、 特に T L R 2若しくは T L R 4、 と会合することにより、 細胞へシグナルを伝達する。 TLRにより細胞内へ シグナルが伝達されると、 MyD88、 I RAK及び N I Kを経由して NF_ κ Bが活性化される等により、 細胞の活性化が起こる。 本発明の抗体はこの過程に おいて、 LP SZCD 14と TLRとの結合の結合を阻害する。
「CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有する」 とは、 じ014と丁し Rとの結合を阻害する機能を有する限り限定はされないが、 例えば後述する実施 例 2、 13、 14または 20の系により測定し判断することができる。 また、 本発明の抗体は、 TLR発現細胞の細胞活性化を 30%以上抑制する抗 体が好ましい。
より具体的なアツセィ系においては、 抗体の濃度が 10 w g/m 1以下で、 1 ^gZmlの LPS、 0. 5 g/m 1の外因性の CD 14存在下での TLR発 現細胞の N F— κ Bの活性化若しくは I L一 8産生を 30 %以上抑制する抗体が 好ましい。 より好ましくは、 40%以上抑制する抗体である。 さらに好ましくは 50 %以上抑制する抗体である。 特に好ましくは 70 %以上抑制する抗体で ある。
また、 本発明の抗体は、 外因性の LPSZCD 14による内皮細胞のサイト力 インの産生を 60%以下に抑制する抗体が好ましい。 より具体的には、 抗体の濃 度が 1 gZm 1以上で、 10]18 1111の]^?3、 300 n gZm 1の外因性 の CD 14存在下での内皮細胞の I L一 6産生を 60%以下に抑制する抗体が好 ましい。 より好ましくは、 40%以下に抑制する抗体である。
また、 CD 14と TLRとの結合には、 直接的な結合、 他の因子を介する結合 または他の因子により活性化される結合が挙げられる。 血中若しくは i n v i t r oでは動物由来の血清存在下で結合する場合が挙げられる。 例えば、 MD2 存在下で、 TLR4若しくは TLR4の 2量体の構造が安定した時に結合する場 合が挙げられる。 本発明の抗体は、 いずれかの場合の結合を阻害する機能を有し ていればよい。 例えば血中若しくは i n V i t r oでは動物由来の血清存在下 で、 CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有する抗 CD 14抗体が挙げら れる。
本発明の抗体が CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有するのは、 該領 域が CD 14と TLRとの結合に関連がある領域であるからである。 このためヒ ト CD 14の 269番から 315番までの領域の一部を含むェピトープを特異的 に認識する抗体は、 該領域の機能を変化させることにより CD 14と TLRとの 結合を阻害する機能を有する。
また、 CD 14と TLRとの結合に関連がある領域として、 ェピトープとする 領域が、 ヒト CD 14の 269番から 315番までに完全に含まれる抗体が好ま しい。 より好ましいェピトープとする領域は、 実施例の F 1024— 1— 3抗体 と同様のェピトープを持つという面において、 ヒト CD 14の 285番から 31 5番までの領域である。 また好ましくは、 ヒト CD 14の 269番から 307番 までの領域である。
該領域の機能を変化させるという面では、 本発明の抗体は、 ェピトープとして 含まれる抗原の領域の一部が 6アミノ酸以上である抗体が好ましい。 より好まし くは 8アミノ酸以上である。 さらに好ましくは、 連続したアミノ酸をェピトープ として特異的に認識する抗体が好ましい。
また、 本発明の抗体は、 実施例の F 1024— 1—3抗体と同様のェピトープ を持つという面において、 ヒト CD 14の 285番から 315番までの領域の一 部を含むェピトープを特異的に認識する抗体が好ましい。 該抗体は CD 14の 2 94番目のアミノ酸が P r oであることによって生じ得る立体構造の 285番目 のアミノ酸より 315番目のアミノ酸に存在するェピトープを認識する。
P r oは他のアミノ酸と異なり α炭素に結合した N原子が環構造に組み込まれ >ΝΗ基になっているため、 ポリペプチドは P r o骨格により 1次構造が制限さ れ、 蛋白質の立体構造に影響を与える。 すなわち、 P r oは NH基がないため水 素結合を形成できず、 α—へリクスを形成できない （プロテインバイオテクノロ ジ一、 F. フランク編、 培風館） 。 該抗体が CD 14の 294番目の P r οをポ イントミユーテーションすることにより結合しなくなるが、 これは CD 14の立 体構造が変化したことが原因である。 すなわち、 該抗体は、 294番目のァミノ 酸が P r oであることによって生じ得る立体構造の 285番目のアミノ酸より 3 15番目のアミノ酸に存在するェピトープを認識する。
また、 本発明の抗体は抗ヒト CD 14抗体であるが、 該領域と同等のヒト以外 の哺乳動物の CD 14の領域に対する抗体であっても、 後述する抗ヒト CD抗体 と同等の効果を示す抗体であれば、 本発明に含まれる。
配列番号 2に記載のアミノ酸配列は、 ヒ卜 CD 14の 269番目から 315番 目のアミノ酸配列である。
この配列番号 2に記載のアミノ酸配列の領域の一部若しくは全部からなり、 連 続した 6以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成される抗体は、 本 発明の抗体に含まれる。 好ましくはヒト CD 14の 285番目から 307番目ま での領域のアミノ酸配列の一部若しくは全部からなり、 連続した 6以上のアミノ 酸を有するぺプチドを免疫原として作成された抗体である。 またべプチドが立体 構造をとることを考慮すると、 連続した 8以上のアミノ酸を有するペプチドを免 疫原として作成される抗体が好ましい。 さらに好ましくは連続した 10以上、 よ り好ましくは連続した 15以上のアミノ酸を有するペプチドを免疫原として作成 される抗体である。
本発明の抗体は、 CD 14と特異的に結合することにより、 〇014と丁し1 との結合を阻害する機能を有する。 CD 14とは s CD 14または m CD 14を 問わない。 また、 どちらか一方の C D 1 4と T L Rとの結合を阻害する機能を有 する抗体も含まれる。 例えば、 血中に存在する s C D 1 4と T L Rとの結合を阻 害する機能を有する抗体若しくはマクロファージ等に存在する mC D 1 4と T L Rとの結合を阻害する機能を有する抗体が挙げられる。
本発明の抗体はポリクローナル抗体であっても、 モノクローナル抗体であって もよい。 抗体の有する機能を明確にするため、 若しくは明確に発揮させるために は、 モノクローナル抗体が好ましい。
本発明の抗体が由来する動物種は特に限定されない。 抗体作成の容易さの面で は、 ラットが好ましい。 医薬品組成物の構成物とされる場合は、 ヒト抗体が好ま しい。 ヒト抗体には、 ヒト抗体産生マウスに免疫して作製したヒト抗体も含まれ る。 この他にもヒト化抗体、 ファージ抗体若しくはキメラ抗体等も本発明の抗体 に含まれる。 ヒト化抗体は、 定常領域と、 フレームワーク領域がヒト由来で、 相 補性決定領域が非ヒト由来である抗体である。 ファージ抗体は繊維状ファージの コート蛋白質に抗体を融合させることによってファージ粒子表面上に抗体を提示 させ、 作製する抗体であり、 単鎖 F v ( s c F v ) フォームあるいは F a bフォ ームが主に使用される。 キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 マウスの モノクローナル抗体の可変領域と、 ヒト抗体の定常領域とからなる抗体であ る。
本発明の抗体はその分子種は特に限定されない。 いずれのクラス、 サブクラス 及びイソタイプに分類される免疫グロブリンであってもよい。 また、 生物学的に 活性のある F ab、 F ab' 、 ( F ab' ) 2 等の抗体断片も、 本発明に含まれる。 本発明の抗体は公知技術を用いることにより作製できる。 例えば、 モノクロ一 ナル抗体は下記の方法で作製できる。
配列番号 1に示されるアミノ酸の配列の全部の蛋白質または 269番から 31 5番までの領域の連続した 6個以上からなるペプチドを免疫原として免疫した哺 乳動物の免疫細胞をミエローマ細胞と融合させてハイプリドーマを作製し、 この ハイプリドーマの中から、 後述する本発明の第十二の態様のスクリーニング方法 により、 クローンを選択することにより、 本発明の抗体を作製することができる 。 また、 S CD 14 (1-315) と結合し、 S CD 14 (1— 268) とは結 合しないクローンを選択しても、 本発明の抗体を作成することができる。 好まし くは、 285番から 307番までの領域の連続した 6個以上からなるペプチドを 免疫原とすることである。 また好ましくは連続した 8個以上、 より好ましくは連 続した 10個以上、 特に好ましくは連続した 15個以上のアミノ酸からなるぺプ チドを免疫原とすることである。
免疫する哺乳動物は、 特に限定されないが、 細胞融合に使用するミエローマ細 胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、 マウス、 ラットまたはハムス 夕一等が好ましい。 ミエローマ細胞は、 公知の種々の細胞が使用可能である。 こ れには P 3、 P 3U1、 SP 2Z〇、 NS_ 1、 Y B 2ノ 0及び Y 3— A g 1 , 2, 3等の骨髄種細胞が含まれる。
免疫は公知の方法により行なうことができる。 例えば、 抗原を腹腔内、 皮下、 静脈内またはフットパッド内に投与して行なう。 この抗原の投与はアジュバント を併用してもよく、 また複数回投与することが好ましい。 免疫細胞は抗原の最終 投与の数日後、 例えば 3日後に摘出した脾細胞またはリンパ節由来の細胞が好ま しい。 免疫細胞とミエローマ細胞との融合は、 Milstein等の方法 （Methods in Enzym ol.，73巻 3頁） 等の公知の方法を用いて行なうことができる。 例えば、 融合剤と してポリエチレングリコール （PEG) を使用する方法または電気融合法等が挙 け'られる。
免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、 それらが融合できる比率であれば限 定されないが、 免疫細胞に対し、 ミエ口一マ細胞を 1Z10量ないし等量を使用 することが好ましい。
細胞融合を PEG (平均分子量 1, 000〜4， 000) を使用して行なう方 法では PEG濃度は特に限定されないが 50%で行なうことが好ましい。 また、 融合効率促進剤としてジメチルスルフォキシド （DMSO) 等の補助剤を添加し てもよい。
融合は 37でに加温した P E G溶液を混合した細胞に添加することにより開始 し、 1〜 5分間反応後、 培地を添加することにより終了する。
この融合により形成されたハイプリドーマをヒポキサンチン、 チミジン及びァ ミノプテリンを含む培地 （HAT培地） 等の選択培地で 1日〜 7日間培養し、 未 融合細胞と分離する。 得られたハイプリドーマをその産生する抗体により更に選 択する。 選択したハイプリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し 、 単一クローン性抗体産生ハイプリドーマとして樹立する。
ハイプリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は公知の方法を使用する ことができる。 例えば EL I SA法、 凝集反応法、 ラジオィムノアッセィ法が挙 げられる。
樹立したハイプリドーマを公知の方法で培養し、 その培養上清よりモノクロナ ール抗体を得ることができる。 また、 ハイブリーマをこれと適合性を有する哺乳 動物に投与して増殖し、 その腹水より得ることができる。
抗体の精製は、 塩析法、 ゲル濾過法、 イオン交換クロマト法またはァフィニテ ィークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。
また、 ヒト抗体は石田らが開発した方法 （PNAS，97:722，2000) を用いて作製で きる。 すなわち、 まず、 T r a n s— c h r omo s ome) (T c) マウスは 石田らの方法に従い、 ヒト 2番染色体断片 （1 §軽鎖/ と 14番染色体断片 （ I g重鎖） をミクロセル融合法によりマウス ES細胞に導入し、 J oyn e rら の方法 （ジーン 夕ーゲティング、 実験法シリーズ、 メディカル 'サイエンス ' インターナショナル） にしたがい、 それぞれの染色体断片を有するキメラマウス を作製する。 次に、 作製した 2種類のキメラマウスを交配することによりヒト 2 番染色体断片 （ I g軽鎖 κ) と 14番染色体断片 （ I g重鎖） の両者を有するキ メラマウスを作製する。 マウス由来の内因性のマウス抗体の産生を失わせる為、 Cap e c c h iらの方法 （Mo l . Ce l l . B i o l . 12 : 2919-2 923、 1992) に従い内因性の I g重鎖と κ鎖をノックアウトしたダブル K 〇マウスを作製し、 ヒト染色体断片を導入したキメラマウスと交配させ、 ヒト 2 番染色体断片 （18軽鎖《) と 14番染色体断片 （I g重鎖） を含み、 内因性の I g重鎖と κ鎖をノックアウトしたトランスクロモソームマウスを作製する。 作 製した Tcマウスは血中にヒト由来の抗体を産生し、 一部マウスァ鎖を有する抗 体も存在するが、 マウス I g (κ) は検出されない。 得られた Tcマウスは数代 経っても染色体は維持され、 その子孫を以下の抗 CD 14ヒトモノクローナル抗 体の作製に使用できる。 Tcマウスに精製した CD 14抗原 50 gを、 タイ夕一マックスゴールド （ T i t e r Max Go l d, Cy t Rx 社） と混合後、 皮下に投与し、 3週間後同様に追加投与を行う。 抗体価の上昇は、 抗原を固相化したプレートに 希釈した抗血清を反応させ、 続いて抗ヒト I gG抗体を用いて結合した血清中の ヒト抗体を検出する。 細胞融合は、 抗体価の上昇したマウスの腹腔に抗原を 50 投与し、 3日後に行う。 具体的には、 採取した脾細胞をマウスミエローマ細 胞 （S P 2/O-Ag 14) と混合後、 PEG4000 (Merck ) により融合し 、 G418 (lmg/mL) を含む HAT培地によりハイプリドーマを選択する 。 出現したハイプリドーマを抗ヒト I gGK抗体、 抗 I gG抗体、 抗 I gG2抗 体、 抗 I gG3抗体または抗 I gG4抗体を 2次抗体としてスクリーニングし、 CD 14と結合するヒト抗体を産生するハイプリドーマを選択する。 さらに後述 する本発明の第十二の態様のスクリーニング方法により、 本発明のヒト CD 14 抗体を得ることができる。
また、 CDRグラフト法によるヒト化抗体は N a t u r e, 321 : 522， 1986に記載の方法を用いて作製できる。 またヒト化抗体はヒト遺伝子を一部 導入したマウスを用いて J . I mmu n o 1. Me t hod s 231 : 1 1、 1999に記載の方法を用いて作製できる。 ヒト マウスのキメラ抗体は P r o c. Na t l . Ac ad. S c に 81 : 6851、 1984に記載の方法を 用いて、 ファージ提示法による抗体は An n u Rev. Immuno l , 1 2 : 433, 1994を用いて、 D i abody、 T r i 130 <^ 及び丁6 t r a b odyは S c F vの 2、 3及び 4量体を用いて、 それぞれ F E B S Le t t e r 454 : 90、 1999、 P r o t e i n e g. 10 : 423、 19 97及び FEB S Le t t e r 453 : 164、 1999に記載の方法を用 いて作製できる。
本発明の抗体の断片である Fab、 Fab' 、 (Fab' ) 2 等も公知の方法 （石川 栄治、 超高感度酵素免疫測定法、 学会出版センター） で作製できる。
抗体を産生させる方法として、 植物で産生する方法 （Na t u r e 342 : 76、 1989) 、 CHO細胞、 マウスミエローマ細胞 （S 0) 等の哺乳細胞で 産生する方法 （B i o t e c hno l ogy 36 : 35、 1994) 、 ミルク 中への産生させる方法 （Na t. B i o t e c hno l 17 : 456、 199 9) 及び大腸菌で産生させる方法 （Sc i e nc e 240 : 1038、 198 8) 等が挙げられる。
ポリペプチドは、 ヒト血清中の可溶型 CD 14を公知の方法により精製して調 製することができる。 また、 一般的に使用されるペプチド合成機 （ペプチドシン セサイザ一 432A型、 パーキン一エルマ一ジャパン） 等を用いた方法、 遺伝子 組換え法 （東京大学医科学研究所 制癌研究部編、 新細胞工学実験プロトコール 、 秀潤社） 等が挙げられる。
例えば、 269番から 315番までの領域の連続した 6個以上のアミノ酸から なるペプチドは 432 A型ペプチド合成機を用いて Fmo c法により合成でき、 TFAによる脱保護、 樹脂からの切断の後、 C 18 HPLCカラム （Capcel卜 pak , 資生堂） を用いて精製し、 目的のペプチドを調製することができる。 本発明の抗体の好適な例として、 ラットにヒト血清中より精製した CD 14蛋 白質を抗原として免疫した免疫細胞とミエローマ細胞を細胞融合して取得した八 ィブリドーマ F 1024— 1— 3が産生する F 1024— 1— 3抗体が挙げられ る。 ハイブリドーマ F 1024- 1 _ 3は平成 12年 9月 29日付けで日本国茨 城県つくば市東 1丁目 1番 3号の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技 術研究所 （以下、 生命工学工業技術研究所という） に寄託し （受託番号 P— 18 061) 、 さらに平成 13年 3月 16日付で原寄託から国際寄託に移管した （受 託番号 FERM BP— 751 1) した。
本発明の抗体は、 CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有する、 すなわ ち CD 14と TLRとの結合阻害剤である。 このことにより、 ヒト CD 14を介 する細胞活性化を抑制するという機能を有するので、 細菌の感染と関連する疾患 の治療または予防に用いることができる。 例えば、 敗血症などの疾患に伴う炎症 性サイトカイン、 特に血中の TNF濃度の上昇に伴う症状の治療または予防に有 用であり、 より具体的には発熱、 低血圧、 白血球減少症、 血小板減少症、 ショッ ク及び多臓器不全などの症状の治療または予防に有用である。 また、 本発明の抗 体が抑制する細胞活性化の原因物質は LPSのみとは限定されない。 例えば、 L TA、 PGN若しくはマイコプラズマ等と複合体を形成した CD 14の細胞活性 化を抑制する。 すなわち、 これらを原因とする疾患においても、 上記に記載のと おり、 治療または予防に有用である。
本発明の抗体は、 ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域の一部を含 むェピトープを特異的に認識するという機能を有するので、 ヒト CD 14を定性 若しくは定量するツールとして有用である。 例えば、 検体と本発明の抗体を接触 させ、 抗原抗体複合体を形成させた後、 該複合体を検出または定量する測定方法 である。 検体は血清、 尿、 体液または培養上清等が例示される。 抗原抗体複合体 の検出または定量法は EL I S A法または R I A法等が例示される。 本発明の第二の態様は、 本発明のモノクロナール抗体を産生するハイプリドー マである。 本発明のハイプリドーマは本発明の第一の態様に記載した方法により 作製することができる。
本発明のハイプリドーマの好ましい例は、 本発明の抗体の好ましい例である F 1 0 2 4 - 1— 3抗体を産生するハイプリドーマ F 1 0 2 4 - 1 - 3 (受託番号 P - 1 8 0 6 1 ) である。
本発明の第三の態様は、 配列番号 1に記載のヒト C D 1 4の 2 6 9番から 3 1 5番までの領域のアミノ酸を連続 8個以上含むペプチドである。 好ましくは 2 8 5番から 3 0 7番までの領域のアミノ酸を連続 8個以上含むペプチドである。 ま た、 好ましくは連続 1 0個以上、 特に好ましくは連続 1 5個以上のアミノ酸から なるペプチドである。
本発明のぺプチドは本発明の第一の態様に記載した方法により作製することが できる。
本発明の第四の態様は、 本発明の第三の態様のぺプチドを免疫原として用いる ことを特徴とする抗体の作成方法である。 免疫原として用いるペプチドの好まし い例は、 本発明の第三の態様の好ましいぺプチドの例である。
本発明の方法の詳細は、 本発明の第一の態様に記載したとおりである。
ただし、 ペプチドは分子量が小さいため、 通常免疫原性を持たない。 したがつ て、 ぺプチドのアミノ酸に含まれる側鎖の官能基を利用してキヤリァ一と結合さ せて、 免疫原とする。 キャリア一としては牛血清アルブミン、 キーホールリンべ ッ卜へモシァニン （K L H) 、 サイログロブリンまたはアポアルブミン等が用い られる。 本発明の方法により作成された抗体が CD 14と TLRとの結合を阻害する機 能を有することが好ましい。
本発明の第五の態様は、 CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有し、 以 下①または②のいずれかである CD 14改変体ポリペプチドである。
①配列番号 1に記載のアミノ酸配列の N末端が 1〜 6番目のいずれかであり、 C末端が 246〜306番目のいずれかのアミノ酸配列を有する、
②配列番号 1に記載のアミノ酸配列の N末端が 1〜 6番目のいずれかであり、 C末端が 269〜356番目のいずれかであり、 かつ 269〜307番目のアミ ノ酸のいずれか一つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。 以下には、 ヒト CD 14ポリペプチドのアミノ酸配列を主として説明し、 ヒト CD 14のアミノ酸配列を単に CD 14のアミノ酸配列と称することもあるが、 ヒト以外の哺乳動物の CD 14であってヒト CD 14の 269番目から 307番 目のアミノ酸に相当する機能を有する部位が同様に改変され、 本発明の改変体と 同等の効果を示す範囲であれば、 CD 14はヒト以外の種の CD 14ポリべプチ ドであってもよい。
「 C D 14改変体ポリペプチド」 とは、 C D 14ポリぺプチドの一部が欠失し たポリペプチド、 CD 14ポリペプチドのアミノ酸の一部が置換したポリべプチ ド及び CD 14ポリペプチドにアミノ酸を付加したポリペプチドが含まれる。 ま た、 これらの改変が組み合わさった改変体ポリペプチドも含まれる。
本発明のポリペプチドは CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有する。 CD 14と TLRとの結合を阻害する機能についての詳細は、 本発明の第一の態 様に記載したとおりである。 また、 本発明のポリペプチドは、 TLR発現細胞の細胞活性化を 30%以上抑 制するポリぺプチドが好ましい。
より具体的なアツセィ系においては、 ポリペプチドの濃度が 10;UgZml以 下で、 1 8 11 1のし？5、 0. 5 gZm 1の外因性の CD 14存在下での TLR発現細胞のNF—κBの活性化若しくはI L— 8産生を 30 %以上抑制す るポリペプチドが好ましい。 より好ましくは、 40%以上抑制するポリペプチド である。 さらに好ましくは 50%以上抑制するポリペプチドである。 特に好まし くは 70%以上抑制するポリペプチドである。
また、 本発明の CD 14改変体ポリペプチドは、 該ポリペプチド自身では LP S存在下で内皮細胞のサイトカインを誘導しないポリペプチドが好ましい。 より 具体的なアツセィ系においては、 このポリペプチドの濃度が 300 n g/m 1以 下で、 1 OngZmlの LP S存在下での内皮細胞の I L— 6産生を誘導しない ポリペプチドが好ましい。
「誘導しない」 とは、 そのアツセィ系において、 測定される I L— 6が検出限 界以下であることである。 たとえば、 I L一 6産生の測定において、 human
I L- 6 E I A k i t (PE B i o s y s t ems社） を使用する場合 は、 検出限界以下とは 5 O p gZml以下である。
また、 本発明の CD 14改変体ポリペプチドは、 外因性の LP SZCD 14に よる内皮細胞のサイトカインの産生を 60%以下に抑制するポリペプチドが好ま しい。
より具体的なアツセィ系においては、 ポリペプチドの濃度が 300 n g/m 1 以上で、 10 n gZm 1の L P S、 300 n gZm 1の外因性の CD 14存在下 での内皮細胞の I L一 6産生を 60%以下に抑制するポリペプチドが好ましい。 より好ましくは、 40%以下に抑制するポリペプチドである。
「LPSZCD 14」 とは、 LP Sと CD 14とが結合した複合体である。 この活性の点においては、 前記①のポリペプチドのうちでも、 C末端が 246 番目〜 285番目のいずれかである CD 14改変体ポリペプチドが好ましい。 後 述する本発明の CD 14低分子種は、 分子量の面から、 C末端が 246番目〜 2 85番目のいずれかであり、 本発明の CD 14改変体ポリペプチドと同じ機能を 有している。 このことは、 好ましい例である C末端が 246番目〜 285番目の いずれかである CD 14改変体ポリペプチドはいずれも同じ機能を有している根 拠となる。 さらに好ましくは、 C末端が 246番目または 285番目であるポリ ペプチドである。
またこの活性の点においては、 前記②のポリペプチドのうちでも、 C末端が 2 69〜356番目のいずれかであり、 かつ 269〜286番目のアミノ酸のいず れか一つ以上が、 他のアミノ酸である L e u、 A 1 a, 〇 5または。 1 に置 換された CD 14改変体ポリペプチドが好ましい。 より好ましくは、 C末端が 2 84〜356番目のいずれかであり、 かつ 284〜 286番目のアミノ酸のいず れか一つ以上が、 他のアミノ酸である L e u、 A l a、 〇 5または。 1 に置 換された CD 14改変体ポリペプチドである。 さらには C末端が 307番であり 、 かつ 284〜 286番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が L e u、 A l a、 C y sまたは G 1 yに置換された CD 14改変体ポリペプチドが好ましい。
また、 細菌菌体成分をポリペプチド自身が除去するという面で、 本発明のポリ ペプチドは細菌菌体成分と結合することが好ましい。 例えば、 LPSの CD 14 の結合部位は 7〜1 4番目及び 5 7〜 6 4番目であり、 その部位の配列はは本発 明のポリペプチドは維持されている。
本発明のポリペプチドは機能を維持していれば、 N末端のアミノ酸 1〜 6個が 欠失、 置換、 挿入または付加されていてもよい。 例えば N末端にさらに M e tが 付加されたポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。 また、 途中のアミ ノ酸配列は、 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入または付加されていて ちょい。
本発明のポリペプチドは、 その特徴を失わない限り、 いかなる修飾を受けても よい。 修飾としては、 その蛋白質が動物細胞または酵母等の真核細胞の培養によ り産生される過程で受ける可能性のあるポリペプチドの翻訳過程または翻訳後の 修飾及び化学的修飾等がある。
これらは、 例えばメチォニンや糖鎖の付加等があげられ、 蛋白質に対する糖付 加としては、 N—グリコシレーシヨン、 〇一グリコシレーシヨンおよび非酵素的 な糖付加などが知られており、 本発明のポリペプチドは、 何れの糖鎖を有してい ても有していなくてもよい。 また、 糖鎖の数、 長さ、 または糖鎖の糖組成および 配列はこれら宿主の培養時の培地組成などによっても異なるため、 特に限定され ない。 その他の天然の修飾としては、 脂質の結合等がある。
また、 ポリペプチドをさらに様々に修飾することが可能である。 修飾可能な部 位としては、 N末端もしくは C末端のアミノ酸残基または側鎖の官能基であり、 例えば、 ポリエチレングリコール、 スチレン一マレイン酸コポリマ一、 デキスト ラン、 ピランコポリマー、 ポリリジン等の合成高分子、 脂質、 多糖類等の天然分 子、 ホルモン等の生理活性分子、 マグネ夕イト等の無機物質等をポリペプチドに 結合させることができ、 さらに、 側鎖にはペプチドも結合させることができる （ P r oc. Na t l. Ac ad. S c i . USA, 84, 1487— 1491、 1981) ； B i oc h emi s t r y, 28， 6619— 6624、 1989
) o
その他にも、 修飾を受けたポリペプチドとして、 例えば、 力ルポキシル基の脂 肪族エステル、 アンモニアまたは一級若しくは二級ァミンとの反応によるカルボ キシル基のアミド、 ァシル残基 （例えばアルカノィルまたはカルボキシルァロイ ル基） によって形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基の N—ァシル誘導体、 あ るいはァシル残基によって形成された遊離ヒドロキシル基 （例えばセリンまたは スレオニン残基のヒドロキシル基） の〇—ァシル誘導体が包含される。
本発明のポリぺプチドも上述のような公知の方法の組み合わせによって上述の ような修飾が可能である。 従って、 本発明のポリペプチドには、 その特徴を失わ ない限り、 このような修飾を受けたものも含まれる。 また、 それらの修飾によつ て、 本発明のポリペプチドの活性または機能を修飾または向上させたり、 別の活 性または機能を付与したり、 組み合わせることも可能である。 例えば、 活性また は機能としては、 安定性、 溶解性、 体内動態または特定の細胞、 組織もしくは臓 器への指向性等が含まれる。 そのような修飾を受けたポリぺプチドも本発明の範 囲に含まれる。
また、 本発明のポリペプチドは、 塩の形で存在するものも包含する。 ここで、 「塩」 とは、 蛋白質分子の力ルポキシル基の塩およびアミノ基への酸付加塩の両 者を意味するものである。 カルボキシル基の塩は、 無機塩、 たとえばナトリウム 、 カルシウム、 アンモニゥム、 三価の鉄または亜鉛の塩等、 および有機塩たとえ ばトリエタノールァミン、 アルギニンもしくはリジン、 ピぺリジン、 プロ力イン 等によって形成される塩を包含する。 酸付加塩には、 たとえば塩酸もしくは硫酸 のような鉱酸との塩、 および有機酸たとえば酢酸もしくはシユウ酸との塩が包含 される。
本発明のポリぺプチドは医薬への応用が可能であるが、 その場合には上記の修 飾等は医薬的許容性を維持するものであることが望ましい。
本発明のポリペプチドは、 C D 1 4と T L Rとの結合を阻害する機能を有する 、 すなわち C D 1 4と T L Rとの結合阻害剤である。 このことにより、 ヒト C D 1 4を介する細胞活性化を抑制するという機能を有するので、 細菌の感染と関連 する疾患の治療または予防に用いることができる。 例えば、 敗血症などの疾患に 伴う炎症性サイトカイン、 特に血中の T N F濃度の上昇に伴う症状の治療または 予防に有用であり、 より具体的には発熱、 低血圧、 白血球減少症、 血小板減少症 、 ショック及び多臓器不全などの症状の治療または予防に有用である。 また、 本 発明のポリぺプチドが抑制する細胞活性化の原因物質は L P Sのみとは限定され ない。 例えば、 L TA、 P G N、 リポアラビノマンナン若しくはマイコプラズマ 等と複合体を形成した C D 1 4の細胞活性化を抑制する。 すなわち、 これらを原 因とする疾患においても、 上記に記載のとおり、 治療または予防に有用であ る。 また、 本発明のポリペプチドの生産方法は特に限定されず、 一般的に使用され る化学合成機 （ペプチドシンセサイザー 4 3 0 A型、 パーキン一エルマ一 ジャパン） などを用いて人工合成してもよく、 遺伝子組換え法により得たもので あってもよい。 またそれ等から分離精製された前駆体ポリぺプチドを適切な化学 的処理、 例えば酵素を用いて処理することによって、 欠失または断片化させて得 られるもの、 及びそれらを化学的に結合させたものおよび多量体化させたもので もよい。
上記のうち、 生産量、 生産されたタンパク質の均一性または純度の面、 例えば、 ヒト由来の他の夾雑タンパク質を含まないこと等から遺伝子工学的に生 産されたものであることが好ましく、 その具体的な例は実施例で詳述する。
本発明の第六の態様は本発明の第五の態様のポリべプチドをコ一ドする遺伝 子である。
一般に、 アミノ酸をコードする遺伝子の D N Aのトリプレット （コドン） は、 アミノ酸の種類によって 1種類から 6種類まで存在することが知られているので 、 本発明のポリペプチドのァミノ酸配列をコードする遺伝子の D N Aの塩基配列 は 1種類には限定されない。 従って、 本発明のポリペプチドをコードする塩基配 列を含有する遺伝子である限り、 いかなる塩基配列からなるものであっても、 本 発明の範囲内に含まれる。 好ましくは、 本発明の遺伝子は、 本発明のポリべプチ ドをコードする塩基配列のうち、 配列表の配列番号 3の 5 ' 端は 1 7 4番ァデニ ンから始まり 3 ' は 7 2 2番チミンから 1 0 9 1番ァデニンまでの配列からなる D N Aの遺伝子、 または配列表の配列番号 2の 5 ' 端は 1 7 4番アデニンから始 まり 3 ' は 9 8 0番グァニンから 1 2 4 1番シトシンまでの配列からなる D NA の遺伝子であり、 978番シトシンから 1094番グァニンまでの配列のァミノ 酸をコードするトリプレツトの一部を GCTもしくは GCG (A 1 aのコドン） 、 GGT (G l yのコドン） 、 CTT (Le uのコドン） または TGT (Cy s のコドン） で置換した DNAの遺伝子である。
好ましい本発明の遺伝子の DN Aの塩基配列を配列番号 4〜 6に示す。 また、 配列番号 4〜 6の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし、 かつ CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有するポリべプチ ドをコードする DN Aも本発明の遺伝子に含まれる。
ストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 50%ホルムアルデヒド、 50倍濃度 の標準クェン酸溶液 （SSC) 、 5 OmMリン酸緩衝液 （pH6. 5〜6. 9) 、 40 gサケ精子 DNA、 4倍濃度のデンハルト溶液 （フナコシ） の溶液中で 、 DN Aの塩基配列により求められるの Tmより 25 °C低い温度でハイブリダィ ズを行うことである。 その他、 サムブルック J. (S amb r ook J. ) らの方法 (Mo l e c u l a r C l on i ng : A Labo r a t o r y
Manu a l , 2nd e d . , Co l d Sp r i ng Ha r bo r
L abo r a t o r y, ニューヨーク （New Yo r k) , 1989年 ) に記載の条件も使用できる。
本発明の遺伝子は c DNA、 染色体 DNAおよびそれらの組合せならびに適当 にスプライシングされうるィントロンを含む c DNAであってもよい。 しかし、 遺伝子工学的な取扱いの容易さから、 本発明の D N Aは c D N Aであることが好 ましい。
本発明によれば、 本発明の新規遺伝子の DNAに対応する RNA、 または本発 明の新規遺伝子の DNAと相補的な配列を含有する DNA及び RN Aも提供され る。 本発明の新規遺伝子の DN Aとそれに相補的な DN A及び RN Aとが、 互い に相補的に結合して 2本鎖、 あるいは 3本鎖を形成していても良い。 また本発明 の新規遺伝子の DN Aと雑種形成 （ハイブリダィズ） しうる塩基配列を含有する DNA及び RNAも提供される。 さらには該ハイブリダィズも提供される。 この 場合においてもそれらが互いに結合して 2本鎖、 あるいは 3本鎖を形成していて も良い。 以上の場合、 核酸塩基として、 イノシンのようなユニバーサルベースを 有していてもよい。
本発明の遺伝子は、 いかなる方法で得られたものであってもよい。 例えば、 化 学合成されたものであってもよく、 適当な DN Aライブラリーから得たものであ つても、 CD 14の全長または部分をコードする遺伝子の DNAを含む DNAを 铸型として PC R (Po l yme r a s e Ch a i n Re a c t i on) 法 で得たものであってもよい。 また、 これらの方法で得た遺伝子またはその断片を 必要に応じてァニ一リング、 ライゲーションして作製することもできる。
本発明の遺伝子の DN Aは、 以下のようにして化学合成をすることができる。 具体的には、 本発明の遺伝子の DNAを約 20 - 3 0塩基からなる断片に 分けて、 DNA化学合成機 （例えば、 394型、 アプライドバイオシステムズ社 製） を用いて、 複数の断片として合成し、 その後、 必要に応じて各断片の 5' 末 端をリン酸化して各断片をァニーリングし、 ライゲーシヨンして目的の DNAを 得る。
また本発明の遺伝子は、 ゲノムライブラリーもしくは c D N Aライブラリ一等 を铸型とする PC R法によっても得ることができる。 PCR法を用いる場合、 公 知の塩基配列および本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の DNA等の塩基 配列をもとに、 また必要に応じて制限酵素認識配列等組み合わせて設計した、 セ ンスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製し、 任意の DN Aライブラリ 一等に対して公知の方法 （M i c h a e l A I . 等編、 Po l yme r a s e
Ch a i n Re a c t i on, PCR P r o t o c o l s, a gu i d e t o me t hod s and app l i c a t i on s, 1990、 A c ad emi c P r e s s、 参照） に準拠して行うことによって得ることがで きる。 典型的な例は、 実施例において述べる。
上述した DNAライブラリ一は、 本発明の遺伝子の DNAまたはその一部を含 むものであればよく、 特に限定されない。 したがって、 市販の DN Aライブラリ 一を使用してもよく、 ヒトの末梢血などから得たリンパ球、 ヒトの株化細胞、 ま たはハイプリドーマなどといった適当な細胞を、 必要があれば適当な活性化剤で 活性化し、 サムブルック J. らの方法に準拠して cDNAを作製して使用して もよい。 なお、 後述する 19アミノ酸からなるヒト CD 14シグナル配列を有し 配列表の配列番号 1の N末端が 1から始まり C末端が 285番ロイシンのぺプチ ド配列からなるポリペプチド、 または N末端は 1から始まり C末端が 307番ロ イシンのペプチド配列からなるポリペプチドで、 286番セリンをァラニンに置 換したポリペプチドをコードする DN Aを含む形質転換体は、 平成 12年 3月 1 4日付けで、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の生命工学工業技術研究所 に寄託し （それぞれ受託番号 P— 17777および受託番号 P— 17778) 、 さらに平成 13年 3月 16日付で原寄託から国際寄託に移管 （それぞれ受託番号 FERM B P— 7479および受託番号 F ERM BP— 7480) した。 本発明の遺伝子は、 本発明の第七の態様の組換えベクターの作製に使用するこ とができ、 この組換えべクタ一によって宿主を形質転換させることにより、 本発 明のポリペプチドを均一にかつ大量に生産するために使用することができる。 これによつて、 本発明のポリペプチドを治療薬の主成分として医薬の分野に提 供したり、 診断薬として利用することが可能になる。 本発明の遺伝子の D N Aを 用いて本発明のポリぺプチドを産生する方法は、 本発明の第九の態様の説明に記 載する。
本発明の第七の態様は本発明の第六の態様の遺伝子を含有することを特徴とす る組換えべクタ一である。
本発明の組換えベクターは、 環状または直鎖状等、 1本鎖または 2本鎖ならび にその複合した鎖等、 いかなる形態のものであってもよく、 目的に応じて適宜選 択しうるが、 取り扱いの容易さや宿主中への組み込みの容易さからは、 環状であ ることが好ましく、 安定性等からは 2本鎖であることが好ましい。
本発明の組換えべクタ一は、 本発明の遺伝子の D N Aの塩基配列の 5 ' 末端、 あるいは 3 ' 末端のいずれか一方、 もしくはその両方に任意の 1つ以上の塩基が 付加されたものであってもよい。
ここで付加される塩基は、 本発明の遺伝子の D NAに、 コーディングフレーム のずれを生じさせない限りいかなるものであってもよく、 例えば、 アダプター配 列、 リンカ一配列、 シグナル配列をコードする塩基配列、 ]3—ガラクトシダーゼ 等の他のポリぺプチドをコ一ドする塩基配列、 もしくは D N Aプローブ等を作製 する際にその検出感度の増加を目的として付加される配列等を挙げることができ る。 本発明の組換えベクターは、 本発明の遺伝子に加えて、 必要により他の塩基配 列を含有していることが好ましい。 ここでいう 「他の塩基配列」 とは、 ェンハン サ一の配列、 プロモーターの配列、 リボソーム結合部位配列、 DNAのコピー数 の増幅を目的として使用される塩基配列、 翻訳開始コドン、 シグナルペプチドを コードする塩基配列、 他のポリペプチドをコードする塩基配列、 翻訳終止 コドン、 ポリ A付加配列、 スプライス配列、 複製開始点、 選択マーカ一となる遺 伝子配列等をいう。
どのような塩基配列が必要となるかは、 作製する組換えべクタ一の使用目的に よって定まるが、 好ましくは本発明のポリぺプチドを産生するように宿主細胞を 形質転換できるものであり、 したがって、 当該組換えベクターは少なくとも、 本 発明の遺伝子に加えて翻訳開始コドン、 終止コドン、 複製開始点および選択 マーカー遺伝子の配列を含有していることが好ましく、 さらに宿主内で機能する プロモーター配列を含有しているものがより好ましい。 特に、 これらの配列に加 えて、 シグナルペプチドをコードする配列を含有するものは、 本発明のポリぺプ チドを分泌発現するように、 宿主細胞を形質転換できるので好ましい。
配列表の配列番号 2の 5' 端は 174番ァデニンから始まり 3' 端は 722番 チミンから 1 09 1番ァデニンまでのいずれかの配列からなる DNA、 また は 5' 端は 174番ァデニンから始まり 3' 端は 980番グァニンから 1241 番シトシンまでのいずれかの配列からなる DN Aであり、 978番シトシンから 1094番グァニンまでの配列のアミノ酸をコードするトリプレツ卜の一部を G CTもしくは GCG (A 1 aのコドン） 、 GGT (G 1 yのコドン） 、 CTT ( Le uのコドン） または TGT (Cy sのコドン） で置換された DNAを適当な ベクター中でシダナルぺプチドをコードするシグナル配列の下流に接続した組換 えベクターを作製し、 これを用いて適当な宿主を形質転換させると、 ここで得ら れた形質転換体の培養時にはその培養上清中に配列表の配列番号 1に記載のアミ ノ酸配列のポリペプチドの C末端が 183〜306番目のいずれかである CD 1 4改変体ポリペプチドまたは C末端が 269〜356番目のいずれかであり、 か つ 269〜307番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が他のアミノ酸に置換され た CD 14改変体ポリペプチドを分泌させることができる。 接続するシグナル配 列は、 適宜選択することが可能であるが、 ヒト CD 14の Me t G 1 u A r g A l a S e r C y s Le u Leu Le u Leu Leu L e u P r o Leu Va 1 H i s V a 1 S e r A l aの配列のシグナ ルペプチドをコードするシグナル配列 （Goye rら、 Nu c l i c Ac i d Re s e a r c h、 16巻、 4173頁、 1988年） が好ましい。
その他に、 TNFまたは G— CS Fのシグナルペプチド、 大腸菌のアルカリフ ォスファターゼのシグナルペプチド、 酵母の PH〇 1のシグナルペプチドおよび 酵母の α—ファクター （a— f a c t o r) のシグナルペプチドをコードする配 列等から使用する宿主および条件に応じて適したものを選択して利用することが できる。
また大腸菌を宿主として封入体として発現させる場合には、 メチォニンもしく はメチォニンを N末端に含むぺプチドを付加することが好ましい。
選択マ一力一遺伝子としては、 アンピシリン耐性遺伝子、 カナマイシン耐性遺 伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子、 チミジンキナーゼ遺伝子等を挙げることが でき、 少なくとも 2つの選択マ一カーが含まれている組換えベクターが、 酵母や 哺乳動物細胞を宿主にする場合に、 目的遺伝子で形質転換されたクローンを容易 に選択できるという理由から好ましい。 コピー数の増幅を目的として使用される 配列としては、 デヒドロ葉酸レダク夕一ゼ遺伝子 （dh f r) の配列等を使用す ることができる。
宿主内で機能するプロモー夕一配列としては、 宿主が大腸菌の場合は t r pプ 口モーターまたは 1 a cプロモー夕一または T 7ポリメラーゼであり、 宿主が酵 母や COS細胞などの真核細胞の場合はアルコールォキシダーゼ 1 (AOX 1) のプロモ一夕一、 ポリヘドリンプロモーター、 SV40のプロモーター、 SRひ のプロモ一夕一、 またはヒトェロンゲ一シヨンファクタ一 1 a (EF 1 α) のプ 口モーター、 サイトメガロウィルス （CMV) のプロモーターなどの配列を挙げ ることができる。
本発明の組換えべクタ一の好ましい例は、 宿主の観点からすると、 本発明のポ リペプチドを発現するように動物細胞または酵母等の真核細胞を形質転換させる ものである。 従って、 本発明の組換えべクタ一は、 少なくとも、 翻訳開始コドン 、 終止コドン、 選択マーカ一遺伝子に加えてポリ Α付加配列を、 さらに動物細胞 で機能する SV40のプロモーター、 EF 1 αのプロモーター、 SRaのプロモ 一夕一または、 酵母で機能する A〇X 1のプロモーターならびに、 SV40の複 製開始点等を有するものが本発明の組換えベクターの好適な例として挙げら れる。
本発明の組換えべクタ一は、 本発明の遺伝子の DN Aを任意の塩基配列を有す る他の DNA断片とライゲ一ションする方法、 または任意のベクターに導入する 力法 (S amb r ook J. 等、 Mo l e c u l a r C l on i ng, a Labo r a t o r y Manu a l 2 nd e d . , Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y, New Yo r k, 1 989、 参照） 等で得ることができる。
具体的には、 DNAとべクタ一とをそれぞれ適当な制限酵素で消化して、 得ら れた各断片を DN Aリガーゼを用いてライゲーシヨンさせればよい。 ベクターと しては、 プラスミドベクター、 ファージベクタ一、 ウィルスベクタ一等いかなる ものでもよく、 市販品を利用してもよい。 ベクターの代表的なものとしては、 p UC 1 18、 p BR 322, p S V 2 - d h f r, pB l ue s c r i p t l l 、 PH I L-S I, λ Z a p I I , λ g t 10, pAc 700、 YRP 17、 p EF— BOS、 p EFN_ I I等が挙げられる。
また、 本発明の組換えベクターは、 いかなる用途に使用されるものであっても よい。 例えば、 本発明のポリペプチドを工業的に産生させる際に用いるものであ つてもよいし、 本発明の新規 DN Aを増幅させ量産するために用いるものであつ てもよい。 また、 本発明の組換えべクタ一は、 本発明の第四の態様の形質転換体 を作製するために使用できる。
本発明の第八の態様は本発明の組換えべクタ一で形質転換されたことを特徴と する形質転換体である。 すなわち、 本発明の形質転換体は、 本発明の組換えべク 夕一を、 宿主となる細胞や微生物に導入する事によって得ることができる。 本発明の形質転換体は、 原核細胞、 真核細胞のいずれを形質転換したものであ つてもよい。 原核細胞としては、 大腸菌、 枯草菌などを挙げることができる。 真 核細胞としては COS細胞、 CHO細胞、 He L a細胞、 Nama lwa細胞等 の哺乳動物細胞の他、 S f細胞等の昆虫細胞や酵母を挙げることができる。 この うち、 大腸菌、 哺乳動物細胞、 酵母を形質転換して得られた形質転換体は扱いや すく、 高発現量が期待できるので好ましい。
哺乳動物細胞の中では、 遺伝子のコピー数を増加させることができるため、 C
HO細胞の dh f r欠損株を宿主とすることが好ましい。 また、 酵母の中では、 外来タンパク質の分泌生産量が多いために、 ピキア （P i c h i a) 属の酵母や 付加糖鎖が哺乳類と類似している S c h i z o s a c c ha r omy c e s p omb eを宿主とすることが好ましい。
また、 本発明の組換えベクターの機能を充分に発揮させるためには、 本発明の 組換えベクターの作製に使用するべクタ一は、 宿主細胞に適した種類のものでな ければならない。 組換えべクタ一に使用したベクターと宿主との好ましい組合わ せの例としては、 PUC 1 18と大腸菌、 pETとT7RNAポリメラ一ゼ発現 系を持つ宿主大腸菌 （Ma j e r l e A. ら： P r o t a i n Exp r. P u r i f. ， 17 : 96, 1999) 、 p E F— B〇 Sと C O S細胞あるいは C
HO細胞、 Yacと酵母、 AcNPVと S f細胞等 （実験医学臨時増刊、 遺伝子 工学ハンドブック、 羊土社、 1991、 参照） を挙げることができる。 同様に、 組換えベクターに含まれるプロモーター、 シグナルペプチドをコードする塩基配 列、 マーカー遺伝子等も宿主に適したものを使用する。
また、 本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を得るためには、 当該組換 えベクター中には、 適当なプロモーター等発現に必要な配列を有している必要が ある。
本発明のポリペプチドを分泌生産する形質転換体を得るには、 本発明の上記生 産に適した組換えベクターであって、 本発明の遺伝子の上流にシダナルぺプチド をコードする塩基配列を含有する組換えベクターで、 宿主細胞を形質転換させれ ばよい。
宿主細胞に、 本発明の組換えベクターを導入する方法としては、 エレクトロボ レーシヨン法、 プロトプラスト法、 アルカリ金属法、 リン酸カルシウム法、 D E A E—デキストラン法、 マイクロインジェクション法、 ウィルス粒子を用いてィ ンフエクシヨンさせる方法、 その他の公知方法 （実験医学臨時増刊、 遺伝子工学 ハンドブック、 羊土社、 1 9 9 1、 参照） 等から、 宿主または組換えベクターに 適したものを選択すればよい。 リン酸カルシウム法や D E A E _デキストラン法 を使用すると、 哺乳動物細胞の形質転換が効率よく行われるので、 宿主細胞が哺 乳動物細胞である場合には、 これらの方法を使用することが好ましい。
本発明の形質転換体は、 好ましくは、 本発明のポリペプチドを発現する形質転 換体がよく、 特に好ましくは、 該ポリペプチドを発現し、 培養上清中に分泌する ものがよい。 このような形質転換体を使用すれば、 本発明のポリペプチドを大量 に生産することが容易になるからである。
本発明の形質転換体は、 いかなる目的で使用するものであってもよいが、 本発 明の D N Aまたは本発明の組換え D N A分子を大量に製造する目的や、 本発明の ポリぺプチドを工業的に製造する目的等に使用できる。
本発明の第九の態様は、 本発明の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴 とする本発明のポリペプチドの製造方法である。
本発明の形質転換体の作製方法については上述した通りである。 本発明の製造 方法においては、 本発明の形質転換体を培養し、 必要に応じて遺伝子の増幅や発 現誘導を行う。 次いで培養混合物を回収し、 必要に応じて濃縮、 可溶化、 透析、 各種のクロマトグラフィ一等の操作を適宜組み合わせて、 本発明のポリぺプチド の精製を行う。
「培養混合物」 とは、 形質転換体、 形質転換体を含む培地、 もしくは培養上清 または細胞のライセートを意味する。 本発明の製造方法において、 産生された本 発明のポリぺプチドが細胞培養上清中に分泌される場合は、 培養上清から該ポリ ペプチドを精製できる。 一方、 該ポリペプチドが形質転換体内に蓄積される場合 には、 リゾチーム処理、 界面活性剤処理、 凍結融解、 加圧、 超音波処理その他の 方法から宿主細胞に適したものを適宜選択して細胞を溶解または破砕した後、 遠 心分離、 濾過等の方法により可溶性画分または不溶性画分として該ポリぺプチド を回収し、 精製する。
宿主細胞が大腸菌であって、 本発明のポリペプチドがペリブラズムに蓄積され る場合には、 ウィルスキー （W i 1 1 s k y ) 等の方法 （ J . B a c t e r i o 1 . ， 1 2 7 , 5 9 5— 6 0 9、 1 9 7 6 ) を採用して該ポリペプチドを回収す ることができる。
形質転換体の培養は、 各種の成書を参考にして、 一般的な手法で行うことがで きる （例えば、 「微生物実験法」 社団法人日本生化学会編、 株式会社東京化学同 人、 1 9 9 2、 参照） 。
遺伝子の発現誘導を行う場合には、 組み込まれたプロモーターによって適当な 薬剤を選択して使用する。 例えば、 t r pプロモーターが組み込まれている場合 には 3 β—インドールァクリル酸を用い、 MMT Vプロモー夕一の場合にはデキ サメタゾンを、 また Α〇Χ 1プロモーターの場合にはメタノールをそれぞれ使用 するとよい。 遺伝子の増幅方法の代表的な例としては、 dh f r欠損 CH〇細胞を宿主とし 、 dh f rを有するベクターを使用した際にメトトレキセートを用いる方法等が 挙げられる。
当該製造方法で使用する形質転換体は、 本発明の形質転換体であれば、 限定さ れないが、 好ましくは、 COS細胞および、 CHO細胞等の哺乳動物細胞もしく は酵母、 もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とした形質転換体 であることが好ましい。
以下に、 形質転換体として大腸菌、 CHO細胞等の哺乳動物細胞、 ピキア （P i c h i a) 属酵母を使用した場合の培養および発現誘導の例を示す。
t r pプロモーターを有する組換え DNA分子で形質転換された大腸菌では、 L一ブロース （L— B r o t h) で菌体を前培養し、 それを M9— CAの培地に 対して 1 50量となるように植え込み、 37°Cで培養を行う。 培養開始数時間 後に培地の OD 550値が 1〜4 (すなわち対数増殖期） に達した時点で 3 /3— ィンドールァクリル酸を終濃度 10 // gZm 1となるように添加し発現誘導を行 う。 さらに約 1〜2日の培養を行うことにより、 目的蛋白質を含む培養混合物を 得ることができる。
A〇X 1プロモーターを有する組換えベクターで形質転換されたピキア （P i c h i a) 属の酵母を用いる場合には、 BMGY培地で約 2日間前培養し、 培地 交換後、 メタノールを加えて発現誘導する。 さらに、 30 で約1〜2日間の培 養を行い、 目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。
EF 1 αのプロモーターを有する組換えべクタ一で CHO細胞等の哺乳動物細 胞を形質転換して得られた形質転換体は、 10%ゥシ胎児血清を含有する DME M培地で培養する。 細胞は、 約 1〜 1 0 X 1 0 4 細胞 Zm 1の濃度で植え込み、 3 7 、 5 %炭酸ガス Z 9 5 %空気の条件で培養を行う。 通常、 2〜3日後にコ ンフルェントな状態になるので、 その時点で培地を、 血清不含の D— M E Mに交 換する。 さらに引き続き、 2〜3日間の培養を行うことにより目的蛋白質を含む 培養混合物を得ることができる。 なお、 目的蛋白質の産生量が少ない場合には前 述したようにメトトレキセートにより遺伝子を増幅し、 産生量を増加させること も可能である。
上述の培養混合物から本発明のポリペプチドを精製する方法としては、 通常ポ リペプチドの精製に使用されている方法のなかから適当な方法を適宜選択して行 う。 具体的には、 塩析法、 限外濾過法、 等電点沈澱法、 ゲル濾過法、 電気泳動法 、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィ ゃ抗体クロマトグ ラフィ一等の各種ァフィ二ティークロマトグラフィー、 クロマトフォーカシング 法、 吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、 通常使用される 方法の中から適切な方法を適宜選択し組み合わせ、 必要により H P L Cシステム 等を用いて精製を行えば良い。
当該製造方法において、 本発明のポリペプチドは、 大腸菌の /3—ガラクトシダ ーゼや、 他のポリペプチドとの融合蛋白質として発現させてもよいが、 この場合 には、 精製工程のいずれかのステップにおいて、 融合蛋白質をブロムシアンまた はヒドロキシルァミン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵素で処理して当該蛋白 質を切り出す操作が必要になる。
また、 使用する形質転換体が大腸菌であった場合に、 当該蛋白質を不溶化蛋白 質であるインクルージョンボディ一として産生させた場合には、 精製の際に、 ィ ンクルージョンボディーを可溶化し、 デネイチヤーし、 リフォールデイングする という操作を精製の適当なステップで行えばよい （Thoma s E等， J. M o 1 e c u 1 a r B i o l ogy, 87, 563- 577, 1974) 。 具体的には、 まず、 菌体を破碎し、 遠心分離してペレットを回収する。 次に、 尿素もしくはグァニジン塩酸、 界面活性剤、 還元型グル夕チオン、 酸化型ダル夕 チオンを適量含む可溶化バッファ一 （たとえば、 5Mグァニジン塩酸、 0. 00 5 %Twe e n 80 50 mMトリス塩酸 （ p H 8. 0) 、 5mM EDTA、 2mM還元型ダル夕チオン、 0. 02 mM酸化型ダルタチオンを含む緩衝液） を ペレットに加え、 2—メルカプトエタノールを加えてデネイチヤーし、 上記可溶 化バッファーからグァニジン塩酸を取り除いた溶液に対して透析してリフォール デイングする。 融合蛋白質として発現させている場合には、 これらの操作の後で 、 ブロムシアン等の化学物質もしくはプロテア一ゼ等の酵素で不要な蛋白質部分 を切断し、 その後、 適当なクロマトグラフィーを行う。
当該製造方法によれば、 本発明のポリぺプチドを均一にかつ高効率で工業的に 大量生産することができる。
本発明の第十の態様は、 血漿から得られうる分子量 36土 5 kD aの CD 14 低分子種である。
本発明の CD 14低分子種は分子量が約 36± 5 kDaである。
本発明の CD 14低分子種は血漿から得られうる。 「血漿から得られうる」 と は、 実際に血漿から得ることが可能な分子のことであり、 実際の作成法は限定さ れない。 血漿から得ることが可能な分子である限り、 例えば、 実際に血漿から得 られた分子、 血漿以外から得られた分子または遺伝子組み替えにより得た分子も 含まれる。 例えば、 尿若しくはミルク等の体液から得られた分子も含まれる。 本発明の CD 14低分子種は以下のように実質的に精製できる。
ァミノ末端を認識する抗 CD 14抗体を用いて可溶型 CD 14全分子種ポリべ プチドをァフィニティ一クロマトグラフィー法を用いて結合し、 溶出することに より血中の可溶型 CD 14全分子種ポリペプチドを得る。 次に、 可溶型 CD 14 全分子種の内の高分子種のみと結合することが確認されている抗 CD 14抗体を 用いて血中の可溶型 CD 14高分子種ポリペプチドのみを吸収除去することによ り、 CD 14低分子種を実質的に精製することができる。
ァミノ末端を認識する抗 CD 14抗体は、 例えば、 3C 10、 MEM— 18抗 体が挙げられる。 また、 高分子種のみと結合することが確認されている抗 CD 1 4抗体は、 F 1024— 1— 3、 F 1033— 3 - 1、 F 1025 _ 3 _ 1抗体 が挙げられる。 F 1033— 3— 1及び F 1025 - 3- 1坊体を産生する形質 転換体は、 平成 1 1年 2月 9日付け及び平成 1 1年 3月 30日付けで、 日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の生命工学工業技術研究所に寄託し （それぞれ受 託番号 P— 17209及び受託番号 P - 17350) 、 さらに平成 12年 9月 1 1日付で原寄託から国際寄託に移管 （それぞれ受託番号 FERM BP— 729 5及び受託番号 FERM B P- 7296) した。
また、 CD 14全分子種から通常ポリペプチドの精製に使用されている方法の なかから適当な方法を適宜選択して行うことも可能である。 具体的には、 塩析法 、 限外濾過法、 等電点沈澱法、 ゲル濾過法、 電気泳動法、 イオン交換クロマトグ ラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 他のァフィ二ティークロマトグラフィー 、 クロマトフォーカシング法、 吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトダラ フィ一等、 通常使用される方法の中から適切な方法を適宜選択し組み合わせ、 必 要により HP LCシステム等を用いて精製を行うこともできる。
本発明の CD 14低分子種は、 CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有 する、 すなわち CD 14と TLRとの結合阻害剤である。 このことにより、 ヒト CD 14を介する細胞活性化を抑制するという機能を有するので、 細菌の感染と 関連する疾患の治療または予防に用いることができる。 例えば、 敗血症などの疾 患に伴う炎症性サイトカイン、 特に血中の TNF濃度の上昇に伴う症状の治療ま たは予防に有用であり、 より具体的には発熱、 低血圧、 白血球減少症、 血小板減 少症、 ショック及び多臓器不全などの症状の治療または予防に有用である。 また 、 本発明のポリぺプチドが抑制する細胞活性化の原因物質は L P Sのみとは限定 されない。 例えば、 LTA、 PGN若しくはマイコプラズマ等と複合体を形成し た CD 14の細胞活性化を抑制する。 すなわち、 これらを原因とする疾患におい ても、 上記に記載のとおり、 治療または予防に有用である。
本発明の CD 14低分子種は上記精製法からもわかるように、 CD 14のアミ ノ酸配列の一部を有する。 すなわち、 本発明の第五の態様のポリペプチドのアミ ノ酸配列と一致した部分を有する。
また、 分子量は s CD (1 - 285) と s CD (1— 246) の分子量の間に ある。 このことより、 CD 14低分子種は CD 14の N末端は 1〜6付近であり 、 C末端は 246〜285付近の間である。
本発明の CD 14低分子種は、 CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有 する。 さらに該 CD 14自身では、 LPS存在下で内皮細胞のサイト力インを誘 導せず、 外因性の LP SZCD 14による内皮細胞のサイトカインの産生を抑制 する。
本発明の第十一の態様は、 抗体、 抗体断片、 ポリペプチドまたは CD 14低分 子種を含む CD 14と TLRとの結合阻害剤である。
本発明の CD 14と TLRとの結合阻害剤は、 CD 14と TLRとの結合を阻 害する抗体、 ポリペプチドまたは CD 14低分子種のいずれかを含む。
本発明の CD 14と TLRとの結合阻害剤は、 CD 14が直接 TLRに結合す ることを阻害する剤、 若しくは CD 14が第三物質を介して TLRに結合し複合 体等を形成すること等を阻害する剤であれば特に限定されない。 また、 その阻害 機構も限定されない。
本発明の医薬組成物に含まれる CD 14と TLRとの結合阻害剤はその阻害す る能力として、 TLR発現細胞の細胞活性化を 30%以上抑制する阻害剤が好ま しい。 より具体的なアツセィ系においては、 阻害剤の濃度が 1 Ο zg/ml以下 で、 1 8/1111の1^?3、 0. 5 gZm 1の外因性の CD 14存在下での T LR発現細胞の NF— κΒの活性化若しくは I L— 8産生を 30 %以上抑制する 阻害剤が好ましい。 より好ましくは、 40%以上抑制する阻害剤である。 さらに 好ましくは 50%以上抑制する阻害剤である。 特に好ましくは 70%以上抑制す る阻害剤である。
具体的な本発明の CD 14と TLRとの結合阻害剤の例として、 本発明の第一 の態様の抗体、 抗体断片、 本発明の第五の態様のポリペプチドまたは本発明の第 十の態様の CD 14低分子種が挙げられる。
本発明の CD 14と TLRとの結合阻害剤は CD 14と TLRとの結合を阻害 することにより、 CD 14から TLRへのシグナル伝達が阻害されるため、 TL R以降のシグナル伝達が遮断され、 細胞活性化を抑制し、 敗血症の治療効果を示 す。
すなわち、 本発明の C D 1 4と T L Rとの結合阻害剤は、 細菌の感染と関連す る疾患の治療または予防に有用である。 例えば、 敗血症、 関節リウマチ、 A I D S、 自己免疫疾患、 溶血性貧血、 腫瘍、 アトピー性疾患、 アレルギー疾患、 サル コィドーシス、 マラリア、 乾癬、 発熱、 低血圧、 虚血性心疾患、 白血球減少症、 血小板減少症、 ショック及び多臓器不全などに有用である。 特に、 これらの疾患 に伴う炎症性サイトカイン、 特に血中の T N F濃度の上昇に伴う症状の治療また は予防に有用である。 これらの疾患の中でも、 L P Sが関与するグラム陰性細菌 感染、 L TA若しくはペプチドグリカン等が関与するグラム陽性細菌感染、 また はマイコプラズマに伴う敗血症の治療または予防に有用である。 すなわち、 これ らの疾患の症状が表れたとき若しくは進行したときの治療効果のみならず、 血中 に L P S、 L T A若しくはマイコプラズマ等が高値である患者またはそのような 状況に置かれることが予想される細菌感染者に予防効果に有用である。
本発明の第十二の態様は、 遺伝子組換え法により作成された T L Rを発現する 細胞に、 C D 1 4及び被検物質を接触させる工程を含む敗血症用治療薬のスクリ 一二ング方法である。
敗血症用治療薬のスクリーニング方法とは、 被検物質が敗血症用治療薬若しく は敗血症用治療薬候補物質であるか否かを検討する方法である。 また、 複数の被 検物質から敗血症用治療薬若しくは敗血症用治療薬候補物質を選択する方法であ る。
本発明のスクリーニング方法は、 遺伝子組換え法により作成された T L Rを発 現する細胞に、 CD 14及び被検物質を接触させ、 特定の指標の変化を検出して 被検物質が敗血症の治療薬の候補となり得るか否かを判定する工程を含む。 本発明のスクリーニング方法の CD 14源としては、 細胞に発現している CD 14、 血中等に存在する s CD 14、 または遺伝子組換え法により作成される s CD 14が挙げられる。 細胞に発現している CD 14は、 遺伝子組換え法により 細胞に発現させてもよい。 また s CD 14は、 少なくともヒト CD 14の 269 番から 315番を含む s CD 14であれば、 改変体であってもよい。 CD 14の 立体構造の維持の点で、 好ましくは CD 14全長である。
遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞は、 遺伝子組換え法に より作成された TLRを発現する細胞である限り、 特に限定されない。 TLR源 としては、 先行技術に記載のクローニングされた TLRを遺伝子組換え法に用い ることができる。 好ましくは、 TLR2、 TLR 4である。
また TLRを発現する細胞に CD 14源があってもよい。
また、 遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞に、 CD 14及 び被検物質を接触させる工程において、 同時に CD 14活性化物質も接触させる ことが好ましい。 CD 14活性化物質により、 活性化された CD 14が TLRに 結合しやすいからである。
CD 14活性化物質は、 CD 14と結合することにより、 複合体を形成し、 C D 14を活性化する機能を有する物質であれば特に限定されない。 例えば L P S 若しくは LT A等の菌体成分、 マイコプラズマ等が挙げられる。
遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞に、 CD 14及び被検 物質を接触させる工程は、 これらが接触される工程であれば特に限定されない。 例えば溶液中において直接接触させる、 CD 14若しくは遺伝子組換え法により 作成された TLRを発現する細胞をプレート等に固定して、 他を溶液中に混合し プレートに添加する、 または CD 14若しくは TLRを発現する細胞の培養液中 に他を添加する等が挙げられる。
遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞に、 CD 14及び被検 物質を接触させる順番も特に限定されない。 例えばこれらを同時に接触させる、 CD 14活性化物質および CD 14を先に接触させる、 CD 14活性化物質およ び CD 14を遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞と接触させ る前に、 CD 14活性化物質および CD 14と被検物質を接触させる等の順番が 挙げられる。
また、 本発明のスクリーニング方法は、 そのスクリーニング方法を阻害しない 限り、 他の工程を加えることができる。 また加える工程の順番も特に限定されな い。
例えば、 動物由来の血清を接触させる工程が含まれる。 動物由来の血清とは動 物であれば限定されない。 ヒトを含む哺乳類が好ましく例示される。 さらに、 ヒ ト、 げっ歯類、 ゥサギ、 ゥシ等が好ましい。 CD 14と TLRとの結合には、 直 接的な結合、 他の因子を介する結合または他の因子により活性化される結合が挙 げられ、 これらの血清存在下で、 活性化される CD 14と TLRとの結合がある からである。
動物由来の血清を接触させる工程の順番は特に限定されない。 他の工程と同時 に行う、 TLRと事前に接触させる等が挙げられる。
被検物質は特に限定されない。 例えば、 抗 CD 14抗体等の抗体、 CD 14改 変ポリぺプチド等のポリぺプチド、 低分子化合物等が例示される。
本発明のスクリーニング方法により、 簡便に敗血症用治療薬が選択できる。 す なわち、 本発明のスクリーニング方法は、 簡便に、 敗血症用医薬組成物の有効成 分をスクリーニングする方法として有用である。
以下に具体的なスクリーニング方法を例示する。
(1) HEK293細胞等に遺伝子組み換え法により恒常的に TLRを発現さ せ、 一定量の LPSと可溶型 CD 14 (1 - 356) を添加し、 さらに被検物質 を添加する。 一定時間培養し、 培養上清中に産生されるサイト力イン量を測定す ることにより、 被検物質を判定し、 スクリーニングする。 また、 サイト力イン量 を測定する代わりに、 細胞内の NF— κ Bの活性化をレポ一夕一ジーンアツセィ 等により測定する方法でもよい。
(2) CD 14と遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞の結 合を EL I S A法または表面プラズモン共鳴法を利用した相互作用検出装置によ り直接検出する方法でもよい。 例えば B IACORE (ビアコア社） 等の装置が 挙げられる。
具体的には、 CD 14をプレートまたは B I ACORE装置のチップ上に固相 化し、 そこに LPS、 遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞及 び被検物質を添加する。 遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞 の CD 14への結合量を、 EL I S A法では標識抗体等を用いて測定するまたは B I ACORE等の装置では直接測定することにより、 被検物質を判定し、 スク リーニングする。
TLRは膜蛋白である。 その機能を解析する手段として細胞外領域を遺伝子ェ 学的に作製し研究に使用する方法も考えられるが、 細胞外領域のみで活性が維持 されるのかについては検討が必要となる。 このため、 全長で膜上に発現させるこ とが可能な細胞を利用する本発明のスクリーニング方法はその問題を回避できる 点で優れている。
被検物質が敗血症用治療薬であるか否かの判定は、 特に限定されない。 例えば 、 CD 14と TLRとの結合を直接観察し、 被検物質が結合を阻害していれば、 若しくはその結合阻害の程度に応じて、 敗血症用治療薬であると判定若しくは選 択する、 または CD 14若しくは TLRを発現する細胞の活性化を測定すること により判定若しくは選択する等が挙げられる。
例えば、 上記 （1) の系においては、 1 ^8 1111のし 3、 0. 5 u gXm 1の CD 14 (1— 356) 存在下での T L R発現細胞の N F— κ Bの活性化若 しくは I L— 8産生を、 10 /zgZml以下で、 30 %以上抑制する被検物質を 敗血症用治療薬であると判定する。
本発明のスクリーニング方法で敗血症用治療薬と判定されうる物質の例を示す ポリペプチドとしては、 CD 14の 269番目から 315番目のアミノ酸を一 部若しくは全部を改変した CD 14改変体、 若しくはその改変部分を含む CD 1 4改変体の一部を含むペプチドがその例である。 これらは、 競合阻害等により、 CD 14の TLRへの結合を阻害することにより、 敗血症用治療薬となる。
CD 14の改変体 （N末欠失体、 C末欠失体、 N末及び C末欠失体、 中間欠失 体、 アミノ酸置換体、 アミノ酸付加体、 アミノ酸修飾体若しくはこれらを複合し た改変体等、 CD 14の一部を改変したペプチド） のプラスミドを遺伝子操作法 (東京大学医科学研究所 制癌研究部編、 新細胞工学実験プロトコール、 秀潤社 ) により作製し、 定法を用いて COS— 1細胞へトランスフエクシヨンし CD 1 4改変体を発現させることにより、 入手することができる。
抗体としては、 S CD 14 (269 - 315) を認識する抗体、 s CD 14 ( 1-315) は認識するが S CD 14 (1 -269) は認識しない抗体等が挙げ られる。 これらは本発明の抗体の作成方法により入手することができる。
また、 下記に記載の通り、 予めペプチドをドラッグデザインすることも できる。
低分子化合物を被検物質として本発明のスクリ一二ングを行うことにより、 敗 血症治療薬を選択することができる。
ただし、 被検物質は特に限定されない。 ランダムにもたらされた被検物質を用 いてもよい。 例えば下記に記載のように予めドラッグデザインすることが、 スク リーニングの効率には好ましい。
CD 14と TL Rとの結合様式または本発明のポリぺプチド若しくは本発明の 抗体の CD 14と TLRとの結合阻害様式を、 立体的な相互作用情報として 求め、 ドラッグデザインを実施することができる。
立体的な相互作用情報は、 CD14と TLRとの共結晶、 本発明のポリべプチ ドと CD 14若しくは TLRとの共結晶、 または本発明の抗体と CD 14との共 結晶の X線構造解析若しくは放射光構造解析により求めることができる。 その他 には NMR、 電子顕微鏡、 コンピューターシミュレーション等の手法により求め ることができる。
立体的な相互作用情報から、 ドラッグデザインを実施する例を下記に記載 する。
立体的な相互作用情報から、 CD 14と TLRとが相互作用することが判明し たペプチド領域は、 そのペプチド領域自体がアン夕ゴニストゃァゴニストとにな りうる。 さらに、 ファージディスプレイ、 コンビナトリアル合成などの手法を用 いて、 活性を増強したペプチドを探索することができる。 また、 結晶構造からぺ プチドの活性コンフオメーションを推測することによって、 ペプチドミミック的 な合成を実施し、 低分子化させることができる。
また結合部位の構造を利用して、 CD 14若しくは TLRのタンパク質の形状 若しくは性状に合致する化合物をコンピュータ上で、 例えば DOCK (Un i v e r s i t y o f Ca l i f o r n i a, S an F r anc i s c o,
CA) 、 F l exX (Tr i po s, I nc. S t. Lou i s, M O) 等のソフトウェアを使用して、 スクリーニングすることができる。
さらに、 必要な活性残基の配置を利用し、 立体的ファーマコフォアを予測する ことも可能である。 このファーマコフォアを検索式として、 既存の Av a i 1 a b 1 e Chemi c a l s D i r e c t o r y (A CD) (MDL i n f o r m a t i on s y s t ems, I nc. , S an L e a n d r o ,
CA) などの化合物データベースを C a t a 1 y s t (Mo 1 e c u 1 a r S imu l a t i on s I nc. , S and i e go, CA) > Un i t y (Tr i po s, I nc. S t. Lou i s, MO) 等のソフトウェ ァを使用して検索することで、 低分子化合物のァゴニスト、 アンタゴニスト候補 のフォーカスドライブラリを設計可能であり、 効率よく薬理作用を発揮しうる化 合物を探索することができる。 その他の例として、 相互作用領域に対して、 例えば、 Lud i (Mo 1 e c u 1 a r S imu l a t i on s I n c. , S and i e go, CA) 、 Le apF r og (Tr i po s, I nc. S t. Lou i s, MO) 等のソフトウェアを使用して、 化合物を d e novo設計していくことも可能 である。
さらに上記のドラッグデザィン等により得られ、 本発明のスクリーニング方法 により、 敗血症用治療薬若しくは敗血症用治療薬候補物質であると判定された複 数の化合物、 本発明のポリぺプチド若しくは本発明の抗体に共通する特徴を 3次 元的に取得することにより、 CD 14と TLRとの結合を阻害する作用を有する 物質の立体的ファーマコフォアを得ることができる。
共通する特徴を 3次元的に取得する方法としては、 例えば、 Ca t a l y s t 等のソフトウェアにより行うことができる
また、 このようにして得られた阻害活性を有する化合物と、 CD 14、 TLR 、 若しくはその両方との共結晶構造の解析をすることにより、 ドラッグデザイン をより精密に行うこともできる。
また本発明の抗体の CD Rは、 それ自体をミミックすることで、 低分子化する ことも可能であり、 中和抗体同様の機能を有する化合物をドラッグデザィンする こともできる。
このように探索して得られる化合物は、 ポリべプチドまたは低分子化合物等に 限定されない。 経口吸収性などの利点を有することでは、 低分子化合物が有用で あると考えられる。
スクリーニングされた低分子化合物は、 敗血症治療薬として有用である。 また 、 本記載により、 低分子化合物の CD 14と TLRとの結合阻害剤のスクリー二 ング方法が示される。
低分子化合物の CD 14と TLRとの結合阻害剤の分子量は特に限定されない 。 低分子化合物には一般に分子量約 100の化合物から、 抗生物質等のように分 子量約 10、 000の化合物も含まれる。
また本発明は、 配列番号 1に記載のヒト CD 14の 269番から 315番まで の領域に相互作用する物質のスクリーニング方法も開示する。
ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域に相互作用する物質のスクリ 一二ングとは、 被検物質がヒト CD 14の 269番から 315番までの領域に相 互作用するか否かを検討する方法である。 また、 複数の被検物質からヒト CD 1 4の 269番から 315番までの領域に相互作用する物質を選択する方法である 本発明のスクリ一二ング方法は下記の工程 1及び 2を含む。
工程 1. ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域のアミノ酸を 6以上含 むポリぺプチドと被検物質を接触させる。
工程 2. 被検物質がヒト CD 14の 269番から 315番までの領域に相互作用 するか判定する。
ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域のアミノ酸を 6以上含むポリ ペプチドは、 ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域のアミノ酸を 6以 上含めば特に限定されない。 例えば、 本発明のペプチドが挙げられる。 また、 該 領域以外のアミノ酸配列を含んでいてもよい。 これは該領域以外のアミノ酸配列 のみからなるポリペプチドを用いて、 該領域以外のアミノ酸配列に相互作用する か否かをさらに確認すればよいからである。
該ポリペプチドと被検物質を接触させる工程は、 これらが接触される工程であ れば特に限定されない。 例えば、 溶液中に両物質を添加することにより接触させ る、 または該ポリペプチドをプレート等に固定して、 被検物質をプレートに添加 する等が挙げられる。
被検物質がヒト CD 14の 269番から 315番までの領域に相互作用するか 判定する工程は、 該物質がヒト CD 14の 269番から 315番までの領域に相 互作用するか判定できる工程であれば特に限定されない。 例えば、 該ポリべプチ ドと被検物質の結合を測定することにより判定する等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法により、 簡便にヒト CD 14の 269番から 31 5番までの領域に相互作用する物質が選択できる。 ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域は、 本発明の第一の態様に記載した通り、 本発明の抗体が認 識する領域であり、 CD 14の他の蛋白質と相互作用可能な領域であり、 該領域 と相互作用する物質は CD 14と他の蛋白質との相互作用を調節する物質と成る ことができる。 例えば、 他の蛋白質が TLRである場合、 該領域と相互作用する 物質は CD 14と TLRの相互作用若しくは結合を阻害する。 このように CD 1 4の機能を調節する物質は敗血症用医薬組成物の有効成分として有用である。 す なわち、 本発明のスクリーニング方法は、 簡便に、 敗血症用医薬組成物の有効成 分をスクリーニングする方法として有用である。
以下に具体的なスクリーニング方法の例示を示す。
(1) 抗体のスクリーニング
CD 14の 269番目から 315番目までの領域に相互作用する、 すなわち該 領域を認識する抗体のスクリーニング方法を記載する。
方法①：まず、 S CD 14 (1 -356) をプレートに固相化し、 被検抗体を 含む培養上清等の液体と、 269— 315番目の 47アミノ酸より調製した合成 ペプチドを混合し、 添加する。 269— 315番目の領域を認識する抗体は、 合 成ペプチドにより固相の s CD 14 (1 - 356) との結合が阻害されるので、 ヒト CD 14の 269番から 315番までの領域に相互作用すると判定する。 方法②： CD 14の 269—315番目の配列を持つ合成ペプチドをプレート に固相化し、 被検抗体を含む培養上清等の液体を添加する。 269— 315番目 の領域を認識する抗体は、 合成ペプチドに結合するので、 ヒト CD 14の 269 番から 315番までの領域に相互作用すると判定する。
方法③： CD 14の 1— 268番目の配列を持つ合成ペプチドと CD 14の 1 一 315番目の配列を持つ合成ペプチドをそれぞれプレートに固相化し、 被検抗 体を含む培養上清等の液体を添加する。 269— 315番目の領域を認識する抗 体は、 1一 268番目の配列を持つ合成ペプチドとは結合せず、 1一 315番目 の配列を持つ合成べプチドと結合するので、 ヒト CD 14の 269番から 315 番までの領域に相互作用すると判定する。
また、 上記①〜③の方法等により得られた抗体は、 本発明の実施例 2に記載し た方法等により、 CD 14の機能を阻害するか否かを確認することができる。 (2) 低分子化合物のスクリーニング
CD 14の 269番目から 315番目までの領域に相互作用する低分子化合物 のスクリ一ニング方法として以下のスタリーニング方法が挙げられる。
得られる低分子化合物は、 CD 14のァゴニスト活性若しくはアン夕ゴニスト 活性を有していることが望ましい。
方法①： B I ACORE 2000 (ビアコア社） のチップ上に s CD 14 ( 1 - 268) と s CD 14 (1-315) をそれぞれ別々に固相化し、 被検低分 子化合物を添加する。 CD 14 (1 - 268) とは結合せず、 S CD 14 (1—
315) とは結合する検体を、 被検物質がヒト CD 14の 269番から 315番 までの領域に相互作用すると判定する。 このことは、 S CD 14 (1-315) と結合する低分子化合物が 269番目から 315番目のアミノ酸の領域に強い親 和性を有することを示している。
方法②： CD 14の 269番目から 315番目までのアミノ酸を含む s CD 1
4 (1 - 356) をプレートに固相化し、 被検低分子化合物を添加し反応させる 。 反応終了後、 プレートを一度洗浄し、 結合しなかった低分子化合物を除去し、 次に F 1024— 1 _ 3抗体を添加し、 反応させる。 ヒト CD 14の 269番か ら 315番までの領域に相互作用する被検物質は、 S CD 14 (1— 356) へ の F 1024— 1— 3の結合を阻害するので、 被検物質がヒト CD 14の 269 番から 315番までの領域に相互作用すると判定する。
本発明のスクリーニング方法で得られた物質は実施例 2に記載した方法等によ り、 CD 14の機能を阻害するか否かを確認することができる。 また、 本発明の スクリーニング方法により、 敗血症治療薬であるか否かを確認することが できる。
さらに本発明は、 CD 14アン夕ゴニスト機能または CD 14ァゴニスト機能 を有する CD 14改変体のスクリーニング方法も開示する。
CD 14アンタゴニスト機能または CD 14ァゴニスト機能を有する CD 14 改変体のスクリーニングとは、 被検物質が CD 14アン夕ゴニスト機能または C D 14ァゴニスト機能を有するか否かを検討する方法である。
CD 14は LPSと結合し、 細胞にシグナル伝達し、 細胞を活性化する機能を 有している。 現在では、 ランダムに改変した CD 14改変体がァゴニスト作用を 有するか、 アン夕ゴニスト作用を有するかは不明であり、 本スクリーニング方法 により、 アン夕ゴニスト作用を有し、 ァゴニスト作用を有しない改変体またはァ ゴニスト作用を有し、 アンタゴニスト作用を有しない改変体をスクリ一ニングす ることができる。
本発明のスクリーニング方法は下記の工程 1及び工程 2を含む。
工程 1. LPS、 被検物質と、 CD 14が発現していない細胞とを接触させる。 工程 2. LPS, 被検物質、 CD 14を接触させる。
工程 1. において、 CD 14が発現しない細胞とは、 例えば内皮細胞が挙げら れる。 LPS、 被検物質とを例えば内皮細胞と接触させ、 内皮細胞からのサイト 力イン産生量を測定することにより、 ァゴニスト作用を有無が判定できる。 工程 2. において、 CD 14源としては、 細胞に発現している CD 14、 血中 等に存在する s CD 14、 または遺伝子組換え法により作成される s CD 14が 挙げられる。 細胞に発現している CD 14は、 遺伝子組換え法により細胞に発現 させてもよい。 s CD 14の場合は、 さらに CD 14が発現していない細胞とを 接触させる。 工程 1と同様に内皮細胞からのサイトカイン産生量を測定すること により、 アン夕ゴニスト作用を有無が判定できる。
両方の工程において、 サイト力イン産生量を測定することに限定されず、 遺伝 子組み替え細胞によるレポ一夕一アツセィによる測定でもよい。 本発明のスクリーニング方法により、 工程 1でァゴニスト作用を有せず、 工程 2でアン夕ゴニスト作用を有する被検物質は、 CD 14アン夕ゴニストとして敗 血症治療薬若しくは敗血症治療薬の有効成分として有用である。
本発明の第十二の態様は、 本発明の第十一の態様のスクリーニング方法で得ら れた抗 CD 14抗体、 CD 14改変体若しくは低分子化合物である。
本発明の第十二の態様の抗 CD 14抗体、 CD 14改変体若しくは低分子化合 物は本発明の第十一の態様のスクリーニング方法で得られたものである。 本発明 の第十二の態様の抗 CD 14抗体、 CD 14改変体若しくは低分子化合物は、 本 発明の第十一の態様に記載の通り、 敗血症治療薬としてスクリーニングされて選 択されたものであり、 敗血症治療薬若しくは敗血症治療薬の有効成分として有用 である。
本発明の第十三の態様は、 CD 14と TLRとの結合阻害剤を有効成分として 含む敗血症用医薬組成物である。
本発明の医薬組成物に含まれる CD 14と TLRとの結合阻害剤は、 CD 14 が直接 TLRに結合することを阻害する剤、 若しくは CD 14が第三物質を介し て TLRに結合し複合体等を形成すること等を阻害する剤であれば特に限定され ない。 また、 その阻害機構も限定されない。
本発明の医薬組成物に含まれる CD 14と TLRとの結合阻害剤は、 その力価 として、 TLR発現細胞の細胞活性化を 30%以上抑制する力価が好ましい。 よ り具体的なアツセィ系においては、 阻害剤の濃度が 10 g/m 1以下で、 1 8/1111のし？3、 0. 5 gZm 1の外因性の CD 14存在下での TLR発現 細胞の NF— κΒの活性化若しくは I L_8産生を 30%以上抑制する力価が好 ましい。 より好ましくは、 40%以上抑制する力価である。 さらに好ましくは 5 0%以上抑制する力価である。 特に好ましくは 70%以上抑制する力価である。 本発明の敗血症用医薬組成物に有効成分として含まれる CD 14と TLRとの 結合阻害剤の分子形態は特に限定されない。 抗体、 抗体断片、 ポリペプチド、 蛋 白質及び低分子化合物等が例示される。
抗体、 抗体断片、 ポリペプチド、 蛋白質は例えば本発明の第十一の態様の結合 阻害剤が例示される。 また、 低分子化合物は本発明の第十二の態様に記載した低 分子化合物である。
ヒト CD 14を介した細胞活性化による敗血症の経路において、 CD 14と T LRとの結合阻害剤は CD 14と TLRとの結合を阻害することにより、 CD 1 4から T L Rへのシグナル伝達が阻害されるため、 T L R以降のシグナル伝達が 遮断され、 細胞活性化を抑制し、 敗血症の治療効果を示す。
すなわち、 本発明の医薬組成物は、 細菌の感染と関連する疾患の治療または予 防に有用である。 例えば、 敗血症、 関節リウマチ、 A I DS、 自己免疫疾患、 溶 血性貧血、 腫瘍、 アトピー性疾患、 アレルギー疾患、 サルコイドーシス、 マラリ ァ、 乾癬、 発熱、 低血圧、 虚血性心疾患、 白血球減少症、 血小板減少症、 ショッ ク及び多臓器不全などに有用である。 特に、 これらの疾患に伴う炎症性サイト力 イン、 特に血中の TNF濃度の上昇に伴う症状の治療または予防に有用である。 これらの疾患の中でも、 LPSが関与するグラム陰性細菌感染、 LTA若しくは ペプチドダリカン等が関与するグラム陽性細菌感染、 またはマイコプラズマに伴 う敗血症の治療または予防に有用である。 すなわち、 これらの疾患の症状が表れ たとき若しくは進行したときの治療効果のみならず、 血中に LPS、 LTA若し くはマイコプラズマ等が高値である患者またはそのような状況に置かれることが 予想される細菌感染者に予防効果に有用である。
また、 C D 1 4と T L Rとの結合阻害剤を有効成分として含んでいれば、 製剤 学的に許容される各種添加物を含んでいてもよい。 例えば、 担体、 賦形剤、 安定 剤、 滑沢剤、 着色剤、 崩壊剤、 防腐剤、 等張化剤、 安定化剤、 分散剤、 酸化防止 剤、 干渉剤、 保存剤、 懸濁化剤、 乳化剤、 一般的に用いられる適当な溶媒の類 （ 滅菌水や植物油等） 、 さらには生理学的に許容しえる溶解補助剤などを適宜含ん でいてもよい。
また、 本発明の医薬組成物は、 抗生物質、 ステロイド、 各種サイト力イン抗体 若しくは抗凝固因子等を含んでいてもよい。 これらは、 有効成分である本発明の 抗体と相加効果若しくは相乗効果を示し、 より有効な医薬組成物と成ることがで さる。
本発明の医薬組成物を薬剤として投与するときの投与量は、 特に限定されない が、 例えば、 本発明の抗体を有効成分とするときには、 0 . l m gZ k g以上が 好ましい。 より好ましくは 1〜1 O m gZ k gの投与量である。 本発明の医薬組 成物を薬剤として用いるときの剤形は、 坐剤、 吸入剤、 特に注射剤等が好適であ る。 また種々の投与経路が可能であるが、 非経口投与が好ましい。 非経口投与と しては例えば、 静脈内投与、 動脈内投与、 皮下投与、 筋肉内投与等の注射が一般 的であり、 その他に直腸内投与、 経皮吸収、 経粘膜吸収等が挙げられる。 また、 投与時期若しくは回数は、 患者の状態にも依存するが、 予防投与、 単回投与若し くは連続投与等が例示される。
なお、 動物への 1 O m g Z k g投与では、 急性毒性がない。 実施例
以下に、 実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、 これらは一例とし て示すものであり、 本発明はこれらにより何等限定されるものではない。 また、 以下の記載において用いる略号は、 当該分野における慣用略号に基づくものであ る。 なお、 TLR4を、 TOLL4 (To 1 14) と記載することがある。
(実施例 1 )
抗ヒト CD 14抗体の作製
( 1 ) [投与抗原の調製]
精製抗ヒト CD 14モノクローナル抗体 3 C 10 (AT CCより購入し、 通常 の方法により調製し、 精製したもの） 5mgを、 ハイトラップ NHS活性化樹脂
(H i t r ap NHS- a c t i v a t e d) (アマシャム一フアルマシア） のマニュアルにしたがい樹脂に結合し、 3 C 10結合ァフニティ一カラムを調製 した。
可溶型 CD14は、 ヒト血清 （日本バイオテストより購入） l O OmLを調製 したカラムに添加し、 続けてリン酸緩衝液 （PH7. 4) (以下、 PBSと記載 する） にて洗浄した。
波長 280 nmの吸光度が低下したのを確認した後、 0. 1 Mダリシン塩酸緩 衝液 （pH3. 0) を用いてカラムから溶出し、 ダイアフロ一 （ダレ一スジャパ ン） を用いて濃縮した。
PBSで透析後、 タンパク濃度を波長 280 nmの吸光度 （係数： 1〇. D. = lmgZml) より算出した。 その結果、 精製可溶型 CD 14約 200 gを 得、 SDS— PAGE分析により約 55 kDのバンドを確認した。
(2) [抗 CD 14モノクローナル抗体の調製]
W i s t a rラット （SLCより購入） メス 8週令のフットパッドに 100 gの精製可溶型 CD 14とフロインド完全アジュバント （Difco ) とを 1対 1で 混合したものを投与し、 3週間後腸骨リンパ節を摘出し、 無菌的にリンパ球を採 取した。
得られたリンパ球をマウスミエローマ細胞 S P 2 0— Ag 14 (ATCC) と 5 対 1で混合しポリエチレングリコール 1500 (Sigma ) を用いて安東民衛 ·千 葉丈 著 「単クローン抗体実験操作入門」 83ページ、 1991年 （講談社） に したがって細胞融合を行った。 融合後、 細胞をヒポキサンチン、 アミノプテリン 、 チミジンを含む 10%胎児血清 ZRPMI 1640に懸濁し、 96穴プレート
(Nunc) に播種した。
5%C〇2 、 37" の条件下で培養し、 増殖してくるハイプリドーマが確認で きた段階でアミノプテリンを除いた培地に交換した。
細胞融合から 1週間後に培養上清をサンプリングし、 精製可溶型 CD 14を固 相化したプレートで CD 14に結合する抗体を産生するハイプリドーマをスクリ 一二ングした。 すなわち、 精製可溶型 CD 14を 1 gZmLでプレート （Maxi so卬、 unc) に固相化し、 0. 1%ゥシアルブミンを含む PBSでブロッキング した。 次に培養上清を添加し、 37 °Cで 1時間反応させた後、 0. 05%Twe e n— 20を含む 0. 9 %生理食塩水で洗浄した。
各ゥエルにペルォキシダ一ゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体 （DAK0) を添 加し、 37 °Cで 1時間反応させ、 洗浄後 0. 02%過酸化水素を含むテトラメチ ルペンジジン発色液を添加し、 1 0分間反応後 0. 5M硫酸で反応を停止 した。
プレートの吸光度を 450 nmの波長で測定し、 吸光度が 0. 2以上のゥエル を抗 CD 14抗体産生ハイプリドーマとして選択した。
選択したハイプリドーマは限界希釈法 （単クローン抗体実験操作法入門、 安東 民衛 ·千葉丈 Z著、 講談社） によりクローニングし、 10日後に同様にスクリー ニングを行い、 抗 CD 14抗体産生ハイプリドーマを 17クローン得た。
次にハイブリドーマを 10 %ゥシ胎児血清を含む RPM I 1640で培養した 後、 細胞を回収し Hybridoma- S FM (Gibco ) で抗体産生を行い、 モノクロ一ナ ル抗体を含む培養上清を得た。 培養上清からろ紙で細胞を除いた後、 プロテイン Gカラム （Prosep— G、 ミリポア） で精製し、 17種類の精製ヒト CD 14抗体 を得た。
(実施例 2 )
ヒト CD 14抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニング
(1) [スクリーニング系の作成]
①ヒト TLR4発現プラスミドの構築
ヒ卜 TLR4 c DNAは翻訳領域が約 2. 5 k bよりなるため （G e n b a n k a c c e s s i on No. AF 17765) TLR4 c DNAの クローニングは 5 ' 端側 1. l k bおよび 3 ' 端側 2. 3 k bを別々に行つ た。
ヒト TLR4の c DNAを下記の方法にてクローニングした。 ヒト TLR4ゲ ノム配列 （G e n B a n k : a c c e s s i o n No. AF 177765) より、 センスプライマー 1 (配列番号 7) 、 センスプライマー 2 (配列番号 8) 、 アンチセンスプライマー 1 (配列番号 9) 及びアンチセンスプライマー 2 (配 列番号 10) を設計した。 まず、 センスプライマ一 1とアンチセンスプライマー 1を用い、 human l ung c DNA (CLONTECH社） を铸型に、 P y r o b e s t DNA Po l yme r a s e (TaKaRa社） により 9 8°Cで 10秒、 55 で 30秒、 72でで 1分のサイクルを 30回繰り返し、 P CR反応を行った。 また、 同様にセンスプライマ一 2とアンチセンスプライマー 2を用いて、 human s p l e en c DNA (C LONTE CH社） を铸 型に PCRを行った。 得られたそれぞれ約 1. l kb、 約 2. 3 kbのDNA断 片を T 4 po l ynuc l e o t i d e k i n a s e (TaKa R a社） で 5 ' 末端をリン酸化した。 一方、 ベクターとして pB l ue s c r i p t llSK (+ ) (STRATGENE社） を Ec oRVにて消化後、 脱リン酸化を行って 調製し、 上記 PC R産物をそれぞれ 1 i g a t i onした。 その後、 コンビテン トセル J M 109 (TaKa R a社） を用い、 定法に従って T r a n s f o rm a t i onをし、 TLR4 c DNAの5' 側の断片を持つプラスミド （pT4 5 F) 及び 3' 側のフラグメントを含むプラスミド （pT43F) を得た。 次に PT45 Fを Xho lと Ec oR Iで、 pT43Fを Ec oR Iと H i ndfflに てそれぞれ d o u 1 e d i g e s t i onし、 pB l u e s c r i p t ll S K ( + ) の Xh o I ZH i n dillサイトに挿入した （ t h r e e way 1 i g a t i on) 。 JM109を t r a n s f o rma t i onすることによって ヒト TLR4 cDNA全長を含むプラスミドpBTLR4を得た。 pBTLR 4の挿入配列を確認したところ、 ヒト TLR4 ゲノム配列の e X on配列と一 致した。 さらにヒト TLR 4を哺乳動物細胞で発現させるために、 PBTLR4 より H i n dillにてヒト TLR4 cDNAを切り出し、 p cDNA3. 1 (一 ) ( I n V i t r o g e n社） の H i n dillサイ卜に挿入した。 JM109を t r a n s f o rma t i onしてヒト T L R 4を哺乳動物細胞で発現させるプラ スミド p c DNAT4を得た。
②ヒト T L R 4発現形質転換株の樹立
ヒト TLR4発現形質転換株を樹立するために、 ①で作製した発現プラスミド p CDNAT4をヒト胎児腎臓由来細胞株 HEK 293に下記の方法にて卜ラン スフエクシヨンした。 即ち、 25 lのFuGENE6 (ロッシュ 'ダイァグノ スティックス社） と 6. 3 gの P c DNAT4を添付プロトコールに従って混 合した後に、 75 cm2 のルーフラスコにセミコンフルェントに増殖した HEK 293細胞へ添加した。 翌日、 細胞をルーフラスコより剥離し、 96we 1 1 - p l a t eに 250 c e l l sZwe l 1ずつ捲きなおした。 さらにその翌日に 終濃度 1. 2mgZm 1の G— 418を添加し、 以降 3〜 4日毎に終濃度 1. 2 mgZmlの G— 418を含む培地で培地交換を行い、 20日間選択培養を行つ た。 得られた G— 418耐性クローン 24株について、 次にし？3 5〇014 に対する応答性を調べた。 24種の各クローンを 24 we 1 1— p i a t eへそ れぞれ 2. 0x i 0 c e l l s/we l lで植え込んだ。 37 °C、 5 % CO 2 で一昼夜培養した後、 lwe l lあたり 50ngの PNF K B— Lu c (CL ◦ NTECH社） と 1 1の FuGENE 6の混合液を添加し、 さらに 24時間 培養した。 0. 5 gZm 1の s CD 14 (1— 356) (作製方法は実施例 8 に記載） と 1 gZm 1の L P Sの混合物を添加して刺激を行った。 6時間後に 、 培養上清を除去し、 細胞を PBS— にて洗浄し、 P a s s i v e l y s i s B u f e r (P r ome g a社） 100 1 /we 1 1にて細胞を溶解した。 細胞抽出液 20 1中のルシフェラーゼ活性を L uc i f e r a s e A s s a y Sub s t r a t e (P r ome g a社） を用いて測定した。 測定には 14
20 ARVO s Xマルチラベルカウンタ一 （Wa 1 l a c社） を用いた。 その 結果、 細胞抽出液中にルシフヱラーゼ活性を示すクローン HEKT4— 14を得 た。 尚、 HEK293を用いて同様の実験を行ったが、 ルシフェラ一ゼ活性は確 認できなかった。 HEKT4— 14での LPSZs CD 14によるルシフェラー ゼ活性誘導は発現している TLR4に依存していた （図 1) 。
(2) [ヒト CD 14抗体に対する敗血症治療薬のスクリーニング]
HEKT4- 14細胞を 10%非働化 FBSを含む DMEM培地に懸濁し、 1 X 10 細胞 Zw e l lで 24we l l _p l a t eに播き込み、 5 % C O 2 、
37 :の条件下で 24時間培養した。 その後、 Fu GENE 6を用いて、 リポ一 夕一ジーン pNF κ B— L u c (CLONTECH社） を 100 n g/we 1 1 導入し、 さらに 24時間培養を続けた。 終濃度 l ^gZmlの LPS (E. c o 1 i 055 : B 5、 D i f c o 社） 、 終濃度 0. 5 g/m 1の s C D 1
4 (1 -356) さらに抗 CD 14抗体 3 C 10あるいは実施例 1で得られた抗 CD 14抗体を終濃度 1〜1 O^gZml添加し、 6時間培養を続けた後に、 細 胞を P a s s i v e Ly s i s Bu f f e r (P r ome g a社） で溶解し 、 Lu c i f e r a s e活性を Lu c i f e r a s e As s ay Sub s t r a t e (P r ome g a社） を用いて添付のプロトコールにしたがって測定し た。 その結果、 活性を有する抗体として、 図 2に示すように、 10 8 1111の 抗体添加系で、 NF— κ Bの活性化を約 75 %阻止した F 1024- 1一 3抗体 を得た。
また F 1024— 1— 3抗体のアイソタイプを R a t MonoAB I DZ SPキット （ZYMED社） を用いてタイピングしたところ、 I gGlZ/iであ つた。
(実施例 3)
F 1024- 1 - 3抗体の I L— 6産生阻害活性
ヒト血管内皮細胞 HUVEC (三光純薬社） を 0. 05% トリプシン 0. 5 3mM EDT Aを含む PBS— で剥離後、 健常ヒト血清より抗 C D 14抗体を 用いて可溶型 CD 14を除去した血清を 2%含む RPM 1 1640培地 （旭テ クノガラス社） （以下、 2 %CD 14wZoHSZRPM Iと表記） にて懸濁し 、 5 X 104 細胞 ZWe 1 1 (50 1 /We 1 1) で 96ゥエルプレートに植 え込み 37 ：、 5 %C02 の条件下で 24時間培養した。
可溶型 CD 14を除去したヒト血清を 14%含む RPM I 1640培地を 10 1 , 120 n g/m 1の L P S (E. c o 1 i 055 : B 5、 D i f c o社 ) 10 1、 3. 6 g/m 1の血清由来可溶型 CD 14を 10 1、 及び 90 0 n g/m 1の F 1024— 1 _ 3抗体または 3 C 10抗体 40 1を加えて細 胞に添加した。 この混合液を 20時間培養を行った後、 培養上清中の I L一 6を ヒト I L— 6 E I Aキット （アプライド バイオシステムズ社） で測定 した。 I L— 6の測定はヒト I L— 6 E I Aキット添付のプロトコールに従い、 行 つた。 即ち、 培養上清 100 1を I L— 6抗体固相化プレートに移し、 37で で 60分間インキュベーションした。 その後、 反応液を除去し 400 ^ 1 ZWe 1 1の Wa s h Bu f f e r 2で 4回洗浄し、 100 1 ウエルで抗ヒト I L_ 6抗体を添加し 37で、 30分間インキュベーションを行った。 反応液を 除去、 400 1 ZWe 1 1の Wa s h Bu f f e r 2で 4回洗浄した後に ペルォキシダ一ゼを標識したストレプトアビジン溶液を 100 1 /We 1 1加 え、 さらに 37 、 30分間インキュベーションを行った。
洗浄後発色基質 （TMB) を 100 1 /We 1 1添加し室温で 15分間反応 させた後に、 停止液 100 lZWe 1 1を加え反応を停止した。 450 nmの 波長の吸光度を測定し、 サンプル中の I L— 6の産生量を算出した。 なお、 コン トロール抗体のラット I gGおよび 3C 10抗体は精製標品を使用した。
その結果を図 3に示す。 抗体を加えないときの I L一 6産生量を 100%とし た。 F 1024— 1— 3抗体及び 3 C 10抗体に I L— 6産生阻害活性が認めら れたが、 コントロール抗体添加時の I L— 6産生と比較して、 F 1024— 1— 3抗体は 0. 3 a gZmLで 50 %産生を阻害するのに対して 3 C 10抗体は 1 0%であり、 F 1024— 1—3抗体は内皮細胞の炎症性サイト力イン産生阻害 効果が 3C 10抗体よりも優れていることが明らかとなった。
また、 実施例 2のスクリーニングで選択された物質が、 実際に細胞のサイト力 ィンを抑制することが明らかとなつた。
(実施例 4) F 1024— 1— 3抗体の LPSZCD 14複合体系形成後の I L— 6産生抑 制測定
実施例 3と同様にヒト血管内皮細胞 HUVEC (三光純薬社） を懸濁し、 5 X 104 細胞/ We 1 1 (50 1 /We 1 1) で 96ゥエルプレートに植え込み 37 ：、 5%C02 の条件下で 24時間培養した。 可溶型 CD 14を除去したヒ ト血清を 14%含むRPM 1 1640培地を 10 1、 120n g/m 1の L P S (E. c o 1 i 055 : B 5、 D i f c o社） 10 1、 3. 6 n g/ 1 の血清由来可溶型 CD 14を 10 1混合し、 37 下 1時間インキュベーショ ンして LPSZCD 14複合体を形成させた。 その後 LPSZCD 14混合液に 900 n g/m 1の F 1024— 1— 3抗体または 3 C 10抗体 40 1を加え て細胞に添加した。 さらに 20時間培養を行った後、 培養上清中の I L一 6をヒ ト I L— 6 E I Aキット （アプライド バイオシステムズ社） で測定した。
I L— 6の測定はヒト I L一 6 E I Aキット添付のプロトコールに従い、 行 つた。 なお、 コントロール抗体のラット I gG (c onAb) および 3 C I O抗 体は精製標品を使用した。
その結果を図 4に示す。 抗体を加えないときの I L一 6産生量を 100%とし た。 F 1024 _ 1— 3抗体は I L— 6産生阻害活性が認められたが、 3 C 10 抗体はコントロール抗体と同程度であり、 LPS/CD 14複合体形成後では I L一 6の産生抑制効果が認められなかった。 以上の点より、 F 1024— 1— 3 抗体は内皮細胞の LPS /CD 14複合体形成後でも炎症性サイトカイン産生阻 害効果があり、 したがってすでに LP Sが体内に進入した後の患者、 すなわち敗 血症と判断された後の患者でも症状の改善効果が期待できることが明らかとなつ た。
(実施例 5)
F 1024— 1一 3抗体の LPSZCD 14複合体への結合試験
細胞膜上の CD 14と LPSの結合に対する抗 CD 14抗体の影響について、 フローサイトメトリ一 （F 1 ow c y t ome t r y) 法により解析を行った ヒト単球系細胞株 THP— 1を 40 n g/m 1の 1 α, 25—ジヒドロキシビ夕 ミン （d i hyd r oxyv i t am i n) D 3 (フナコシ社） で 48時間培養 し、 分化誘導させた後に、 10 g/m 1の抗 CD 14抗体 (3 C 10あるいは F 1024— 1—3抗体） を含むかまたは含まない培地 （10%?83を含む尺 PMI 1640) 中にて 37°C、 30分間インキュベーションした。 その後に、 F I TC標識 LPS (S i gma社） を終濃度 1 n g/m 1で添加し、 37 で さらに 15分間インキュベーションした。 その後、 直ちに等容量の氷冷した RP M I 1640培地を添加し、 FACSCa l i bu r (BD社） を用い蛍光強度 を測定した。
結果を図 5に示す。 図 5に示すように、 LPSの CD 14結合によって観察さ れる特異的蛍光が、 3 C 10抗体により完全に抑制されたが、 F 1024— 1— 3では部分的にしか抑制されず、 F 1024— 1— 3抗体は LP Sの CD 14へ の結合を抑制していないことが示された。
(実施例 6) F 1024- 1 - 3抗体の認識領域の解析
F 1024- 1— 3抗体が認識する領域を明らかにするため、 ペプチドによる 阻害実験、 CD 14 C欠失改変体による結合実験、 CD 14アミノ酸置換改変体 による結合実験を行なった。
(1) [CD 14ペプチドの調製]
配列番号 1に記載の CD 14アミノ酸配列に基づき、 ペプチド A (配列番号 1 1) 、 ペプチド B (配列番号 12) 、 ペプチド C (配列番号 13) 及びペプチド D (配列番号 14) の 4種類のペプチド及びコントロールとしてペプチド E (配 列番号 1 5) を合成した。 すなわち、 ペプチド合成機 （432A、 アプライドバ ィォシステムズ） を用いて、 使用法に従いペプチドを合成し、 定法に従って脱保 護、 切り出しを行い、 C 18カラム （CAPCELL- PAK、 資生堂） を用いて HPLC により精製した。 精製分画を回収し、 凍結乾燥後、 重量を測定し、 蒸留水で 10 mg/m 1に溶解した。
(2) ヒト CD 14のアミノ酸を欠失した CD 14改変体 （ヒト可溶型 CD 14 欠失改変体） の調製
後述する実施例 8に従った。
すなわち、 ヒト CD 14の C末端よりそれぞれ 49、 56、 6 1、 66、 7 1 、 1 10、 173、 204アミノ酸を^失させた組換え体 （以下 s CD 14 (1 — 307) 、 s CD 14 (1— 300) 、 s CD 14 (1— 295) 、 s CD 1 4 (1— 290) 、 s CD 14 (1— 285) 、 s CD 14 (1— 246) 、 s CD 14 (1 - 183) 、 s CD 14 (1 - 1 52) ) (s CD 14 (1— 30 7) は、 配列番号 1に記載の CD 14の N末端 1〜307番目のアミノ酸を有す る可溶性ポリペプチド、 以下同様） を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドを構 築し、 これらのプラスミドを COS— 1細胞に導入して、 各種ヒト可溶型を得た また、 S CD 14 (1—307) のアミノ酸配列より一部のアミノ酸を欠失さ せた各種ヒト可溶型 CD 14欠失改変体 （以下、 欠失部分を Δで示す） Δ 7— 1 1、 Δ 57— 64、 Δ 180— 234、 Δ235_282、 Δ 180— 282を 哺乳動物細胞で発現させるプラスミドは実施例 9一 (1) のアミノ酸置換改変体 ポリペプチド発現プラスミドの構築と同様に行った。 但し、 使用したプライマー は、 Δ 7— 11についてはセンスプライマ一 3 (配列番号 16) とアンチセンス プライマー 3 (配列番号 17) 及びセンスプライマー 4 (配列番号 18) とアン チセンスプライマー 4 (配列番号 19) を、 Δ 57— 64についてはセンスプラ イマ一 3とアンチセンスプライマー 5 (配列番号 20) 及びセンスプライマ一 5 (配列番号 21) とアンチセンスプライマー 4を、 Δ 180— 234については センスプライマ一 3とアンチセンスプライマ一 6 (配列番号 22) 及びセンスプ ライマー 6 (配列番号 23) とアンチセンスプライマー 4を、 Δ235— 282 についてはセンスプライマー 3とアンチセンスプライマー 7 (配列番号 24) 及 びセンスプライマ一 7 (配列番号 25) とアンチセンスプライマ一 4を、 Δ 18 0- 282についてはセンスプライマ一 3とアンチセンスプライマ一 8 (配列番 号 26) 及びセンスプライマ一 8 (配列番号 27) とアンチセンスプライマー 4 をそれぞれ用いた。 次に得られたプラスミドを実施例 9一 (2) に従い、 COS 一 1細胞に導入し、 ヒト可溶型 CD 14欠失改変体を得た。
CD 14改変体の発現量を、 抗ヒト CD 14抗体を用いた E I Aにて測定した 。 すなわち、 pH8. 3の l OmM N a H C 03 緩衝液にて 200倍希釈した 抗 CD 14抗体 MEM— 18 (MONOS A 社） を 96ゥエルプレート （M ax i s o r p, Nunc社） に 50 / 1 /We 1 1添加し、 4°Cにて一昼夜静 置した。 その後、 純水にて洗浄し、 0. 5%85八を含む 83— にてブロッキ ングを行った （室温で 60分間静置） 。
次にゥエル中の液を除去し、 トランスフエクシヨンした COS— 1の培養上清 を50 1 \ 6 1 1添加し、 25 °Cで 60分間インキュベーションした後に、 0. 1 % Twe e n 20を含む PBS— で 3回洗浄後、 1. 0 8 1111の？1 RP— c on j uga t e d 3 C 10抗体 50 1 ZWe 1 1を添加し、 25 X：で 60分間インキュベーションを行った。 0. 1% Twe e n 20を含む P BS— で 5回洗浄後、 発色基質 （TMB) を 50 1 /We 1 1添加し室温で 3 0分反応させた後に、 停止液 （1N硫酸） 50 1/We 1 1を加え反応を停止 した。
450 nmの波長の吸光度を測定し、 サンプルの CD 14改変体ポリペプチド の産生量を算出した。
次に、 ヒト可溶型 CD 14 C末端欠失改変体が目的の長さであるかを確認する ため、 CD 14改変体の分子量を抗ヒト CD 14抗体 （3 C 10および MEM_ 18) を用いたウェスタンブロッテイングにより確認した。 すなわち各 CD 14 改変体 30 n g /レーンを SDS— po l ya c r y l ami d e g r ad i e n t g e l (5-20% ATTO社） で電気泳動し、 PVDF膜 （日本 ミリポア社） にタンパクを転写した後、 0. 5% スキムミルクを含む PBS 30m lにて室温で 1時間ブロッキング反応を行い、 10 g/m 1の 3 C 10 および 100倍希釈の MEM— 18を添加して室温で 1時間反応させた。 さらに HRP— c on j uga t e d抗マウス I g抗体と室温で 30分間反応させた後 、 E C L干ッ卜 (Am e r s h am Ph a rma c i a B i o t e c h社) を用い、 検出した。 その結果、 各 CD 14改変体ポリペプチドの計算上の大きさ にバンドが検出された。
(3) ヒト CD 14アミノ酸置換改変体の調製
表中及び本明細書中において s CD 14 (1 - 307) の N末端から 283番 目のアミノ酸 L e uを A 1 aに置換したヒト s CD 14 (1 -307) アミノ酸 置換改変体ポリペプチドを 「s CD 14 (1 - 307) L 283A」 と記載し、 他のヒト S CD 14 (1 -307) アミノ酸置換改変体ポリペプチドも同様に記 載した。
後述する実施例 8に記載の方法に従い、 ヒト CD 14 (1 -307) の種々の 場所に 1あるいは 2アミノ酸変異を導入したヒト s CD 14 (1 - 307) アミ ノ酸置換改変体を哺乳動物細胞で発現させるプラスミドを COS— 1細胞に導入 し、 各種ヒト CD 14アミノ酸置換改変体を調製した。
得られた CD 14改変体を含む培養上清は、 必要に応じて精製した。 すなわち 、 抗ヒト CD 14抗体 (3 C 10) を結合したァフィ二ティー精製用カラム （H i T r a pカラム Ame r s h am Ph a rmac i a B i o t e c h社 ) ) に供して選択的に吸着させ、 pH勾配にて溶出した。 得られた溶出画分はた だちに pH8. 0の 1M HE PES緩衝液にて中和し、 pHを中性とした。 各 画分は HRP— c on j ug a t e d 3 C 10を用いた E I A法により検定し 、 CD 14改変体ポリペプチドの含まれる画分を選択した。 (4) [ペプチドによる阻害実験]
精製 S CD 14 (1 - 356) 1 g/m 1を炭酸緩衝液 （pH9. 5) に希 釈し、 プレート （Max i s o r p、 Nunc) に 37t：、 1時間で固相化した 後、 プレートを洗诤し、 0. 5 %BSAZPBSでブロッキングした。 ブロッキ ング液を除去し、 （1) で調製した各ペプチドを PBSで 10/ gZmlに希釈 し、 添加した。 続けて、 中根ら （J. H i s t o c hem. Cy t o c hem. 22 : 1084, 1974 ) の方法によりペルォキシダーゼで標識した F 10 24— 1—3抗体を 1 xgZmLで添加し、 37 X：で 1時間反応させた。
0. 9 %N a C 1 5 % Twe e n 20で 5回洗浄し、 H2 02 /TM B溶液を用いて発色させた後 0. 5M硫酸で反応を停止し、 結合した F 1024 — 1— 3抗体の量を測定した。
その結果、 図 6に示すように、 F 1024— 1— 3抗体はペプチド A、 Bでは 弱いながら阻止されたが、 ペプチド C、 D及びコントロールに用いた無関係なぺ プチド Eでは阻止されず、 F 1024— 1— 3抗体の認識する領域は 283番目 のアミノ酸より 318番目のアミノ酸の間にあることが推定された。
(5) [CD 14欠失改変体による抗体との結合実験]
プレ一ト （Max i s o r p、 Nun c) に、 10 g/m 1で 3 C 10坊体 または 100倍希釈した MEM— 18抗体を固相化し、 0. 5%BSAZPBS でブロッキングした。 次に、 ブロッキング液を除去し、 濃度を測定した各 CD 1 4欠失改変体を添加して室温で 1時間反応した。 洗浄後、 10%RSZ0. 1 %
Twe e n— 20ZPBSに 1 xgZmlの濃度で希釈したペルォキシダーゼ 標識 F 1024- 1— 3抗体またはペルォキシダーゼ標識 3 C 10抗体を添加し 、 同様に室温で 1時間半反応させた。 洗浄後、 H2 02 ZTMB溶液を用いて 発色させた後 0. 5 M硫酸で反応を停止し、 吸光度を 450 nmの波長により N J-2100 (日本インターメッド） プレート吸光度計で測定した。
固相に使用した 3 C 10及び MEM— 18抗体はそれぞれの結合サイトが 7— 1 1番目のアミノ酸、 57— 64番目のアミノ酸であることが明らかであるため 、 今回用いた CD 14欠失体のうち CD 14 (Δ 7 - 1 1) は 3 C 10と結合せ ず、 また CD 14 (Δ 57 - 64) は MEM— 18と結合しないが、 他の CD 1 4欠失体とは結合する。 したがって、 3C 10/F 1024— 1— 3系、 MEM — 18/F 1024— 1— 3系、 MEM—18Z3C 10系の 3種類のサンドィ ツチ EL I SA系の結果を解析することにより、 それぞれの抗体の結合活性を解 析できる。
得られた結果を解析したところ、 図 7に示すように、 F 1024— 1— 3抗体 は S CD 14 (1 -356) から S CD 14 (1— 307) までは結合活性が認 められ、 また、 3 C 10の結合サイトを欠失した CD 14 (Δ 7 - 1 1) 、 ME M— 18の結合サイトを欠失した CD 14 (Δ 57-64) とも結合し、 さらに s CD 14 (1— 307) の 180番目のアミノ酸より 282番目のアミノ酸を 欠失した CD 14 (Δ 180— 282) とも結合活性が認められた。 このことか ら、 F 1024— 1— 3抗体は 3 C 10、 MEM— 18抗体とは異なる抗体であ り、 また、 結合領域は 285番目より C末端側であることが明らかになった。 な お、 S CD 14 (1— 307) 結合活性は他の CD 14欠失体に比較して弱いた め、 表示を （+ ) で示した。
(6) [CD 14アミノ酸置換改変体による結合実験] 上記と同様な測定系を用いて CD 14アミノ酸置換改変体の結合活性を測定し た。 その結果、 図 8に示すように 294番目のアミノ酸を P r oから A 1 aに置 換することにより F 1024- 1— 3抗体の結合活性が失われ、 このような現象 は 3C 10、 MEM— 18抗体には認められなかった。 F 1024— 1—3抗体 が CD 14の 294番目のプロリンをポイントミュ一テーシヨンすることにより 結合しなくなることは、 CD 14の立体構造が変化したことが原因である。 した がって F 1024- 1— 3抗体は 294番目のアミノ酸が P r oであることによ つて生じ得る立体構造を認識していることが明らかとなった。
(7) [ペプチドマツピングによる結合実験]
F 1024— 1 _3抗体が認識するェピトープをさらに詳細に解析する目的で 、 SPOTS (GENOS YS) を用いて配列番号 1に記載の CD 14のァミノ 酸番号 246番目から 345番目までの間のアミノ酸配列に基づき、 2アミノ酸 ずつ C末側に配列をずらした 10アミノ酸残基のぺプチド 46種類をメンブレン 上に合成した。 次にプロトコールに基づき、 メンブレンをブロッキングし、 一次 抗体として F 1024— 1—3抗体を反応させ、 洗诤後二次抗体として) 3ガラク トシダ一ゼ標識抗ラット I gG F (ab' ) 2 抗体 (Am e r i c a n Qu a 1 e x An t i bod i e s) と反応させた。 洗浄後、 発色液を添加し青色 のスポッ卜が出現するのを確認したところ、 F 1024— 1— 3抗体由来のスポ ットは検出されず、 ペプチドマッピングにより抗体のェピトープを決定すること ができなかった。 このことは F 1024- 1— 3抗体が 10アミノ酸により構成 されるリニア一なペプチドをェピトープとはせず、 立体的な構造に起因するェピ トープを認識することを示唆している。 これらのことから、 F 1024— 1— 3抗体の結合領域は配列番号 1の CD 1 4の 285番目のアミノ酸より 315番目のアミノ酸に存在し、 294番目のァ ミノ酸が P r oであることによって生じ得る立体構造を認識していることが明ら かとなつた。 すなわち、 該抗体は CD 14の 294番目のアミノ酸が P r oであ ることによって生じ得る立体構造の 285番目のアミノ酸より 315番目のアミ ノ酸に存在するェピトープを認識することが明らかとなった。
(実施例 7)
抗 CD 14抗体のェピ！ ^一プの範囲の解析
抗 CD 14抗体が F 1024- 1— 3抗体と同じ機能を有するために必要な、 抗 CD 14抗体の CD 14上の認識部位の範囲を、 実施例 6で解析した F 102 4— 1— 3抗体のェピ] ^一プの周辺を中心に解析した。
モチーフを揃えるように多重整列した上で、 あらためてその周囲の残基を含め て類似性スコアを計算し、 挿入、 欠失なく保存度の高い領域のみを抽出したデー 夕ベースである BLOCKSデータべ一スを、 ヒト CD 14を対象として、 プロ ファイル検索した。 さらに、 各種二次構造予測法 （Le v, GOR I V， PREDATOR ) により解析した。
その結果、 BLOCKSデータベースのプロファイル検索より、 I L— 1 ( Ac c e s s i on NO. B L 005253 C) とその受容体の結合領域と 類似性がある領域を、 269番目から 307番までの 39アミノ酸残基と特定し た。 保存度が高いと推測されたアミノ酸残基 （残基番号） は、 Q (271) V ( 272) P (273) L (276) K (279) L (283) L (285) S ( 2 86) C (28 7) P (2 94) E (2 98) L (29 9) P (3 00) E (3 0 1) N (3 04) L (30 5) T (306) であった。
さらに、 この領域の 28 7番から C末端側の配列は、 LRR (PDB— I D : 1 A4Y： A) との相同性が高くなかった。
また各種二次構造予測法 （L e v， GOR I V, PREDATOR ) からは、 a—へリックス構造及び ]3—シート構造ともに一致した予測結果が得ら れないこと、 一般的にプロリンが多く存在する場合へリックス構造ゃシ一ト構造 をとりにくいこと、 304番ァスパラギンはモチーフデ一夕ベースの糖鎖結合モ チーフと一致し、 糖鎖結合可能部位であることから、 この領域は蛋白質の表面に 露出していることがわかった。
これらの解析より、 該領域は、 生理学的条件下では、 ループが形成可能な領域 であり、 他の蛋白質と相互作用可能な部位であった。
すなわち、 実施例 6の F 1 0 24- 1一 3抗体のェピト一プ及び、 上記解析よ り、 ヒト CD 14と TLRとの結合を阻害することができる抗 CD 1 4抗体のェ ピ! ^一プの範囲は、 ヒト CD 14の 2 6 9番から 3 1 5番までの領域であった。
(実施例 8)
ヒト CD 14の C末端側のアミノ酸を欠失した CD 14改変体ポリペプチド （ ヒト可溶型 CD 1 4 C末端欠失改変体ポリペプチド） の作製
(1) [全長型 s CD 14発現プラスミド （pM1 6 56) の構築]
まず、 mCD 14を哺乳動物細胞で発現させるプラスミド pM l 6 5 0を構築 した。 W09 8/3943 8に記載のプラスミド pUCH l 4 P— 4より、 Xb a I及び H i n d III によりヒト CD 14 cDNAを含む約 1. 4kbの DN A断片を切り出し、 哺乳動物細胞発現べクタ一である p cDNA 3. 1 (一） ( I n V i t r og e n社） の X b a I ZH i n d III サイ卜に挿入した。 その後 、 E. c o l i Compe t e n t Ce l l s (JM109細胞、 T a K a Ra社） を添付のプロトコールに従い形質転換した後、 生じたコロニーを PC R により確認し、 目的の mCD 14を発現するプラスミド （pM1650) を得た 次にヒト CD 14を可溶型タンパクとして発現させるため、 GP Iアンカーリ ングに必要なサイトである N末端から 326番目の As nと 328番目の G 1 y (配列番号 1参照） をそれぞれ G 1 n、 Va 1に置換した組換え体発現プラスミ ド pM 1656の構築を行った。 すなわち、 センスプライマ一 9 (配列番号 28 ) とアンチセンスプライマ一 9 (配列番号 29) を用い、 上記 PM1650を铸 型とし、 TaKaRa Ex T a q (TaKaRa社） により 94 で 30秒 、 55でで 30秒、 72でで 1分のサイクルを 30回繰り返し PCR反応を行つ た。 増幅した DNA断片を Xh o Iと Ap aL Iにより doub l e d i g e s t i onし、 pMl 650の Xh o I/Ap aL Iサイトに挿入した。 JM1
09細胞を形質転換した後、 生じたコロニーを PCRにより確認し、 目的の s C D 14を発現するプラスミド （pM 1656) を得た。
(2) [ヒト可溶型 CD 14 C末端欠失改変体ポリペプチド発現プラスミド （ pM1658〜pM1662および pM 1674〜pM1676) の構築] ヒト CD 14の C末端よりそれぞれ 49、 56、 61、 66、 71、 1 10、
173, 204アミノ酸を欠失させた組換え体 （以下 s CD 14 (1 - 307) 、 s CD 14 (1— 300) 、 s CD 14 (1 -295) 、 s CD 14 (1— 290) 、 s CD 14 (1—285) 、 s CD 14 (1— 246) 、 s CD 14 (1- 183) , s CD 14 (1- 152) ) を哺乳動物細胞で発現させるブラ スミド pM1658、 pM 1674, pM1675、 pM1676、 pM 165 9、 pM 1660, pMl 662及び pMl 661は以下の方法で構築した。 まず、 センスプライマ一 9とアンチセンスプライマ一 10、 1 1、 12、 13 、 14、 15、 16及び 17 (配列番号 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36及び 37) を用い、 （1) で作製したプラスミド pMl 656を铸型とし、 Py r obe s t DNA Po l yme r a s e (TaKaRa社） により 9 8 で 10秒、 55 で 30秒、 72tで 1分のサイクルを 30回繰り返し PC R反応を行った。
次に増幅した DNA断片を Xh o Iと H i n dill により d o u b 1 e d i ge s t i onし、 1 %ァガロースゲル電気泳動により分離精製した。 また pM 1656を同様に Xh o Iと H i ndlll で消化、 精製し、 得られた約 5. 8 k bの DNA断片と上記 PC R断片を 1 i g a t i onした。 JM109細胞を形 質転換した後、 生じたコロニーを PCRにより確認し、 目的の CD 14改変体ポ リペプチドを発現するプラスミド （pM1658、 pM 1674, pM 1675 、 pM 1676, pM 1659, pM1660、 p M 1662及び p M 1661 ) を得た。
(3) [COS— 1細胞での発現]
(1) 及び （2) で作製したプラスミド ρΜ1656、 ρΜ1658〜ρΜ1 662及び pMl 674〜ρΜ1676を COS— 1細胞に下記の方法で導入し 、 s CD 14 (1— 356) 、 s CD 14 (1— 307) 、 s CD 14 (1一 300) 、 s CD 14 (1— 295) 、 s CD 14 (1— 290) 、 s CD 14 (1— 285) 、 s CD 14 (1— 246) 、 s CD 14 (1— 183) 及び s CD 14 (1- 152) を発現させた。 すなわち Fu GENE 6 (ロシュ ·ダ ィァグノスティックス社） 50 1を上記プラスミド DNA各 12. 5 gと添 付プロトコールに従い混合し、 150 cm2 フラスコにセミコンフルェントに増 殖した COS— 1細胞に添加した。 5%C〇2 、 37 :の条件下で 72時間培養 した後に、 培養上清を回収し目的の CD 14改変体ポリペプチドを得た。
CD 14改変体ポリペプチドの発現量を、 抗ヒト CD 14抗体を用いた E I A にて測定した。 すなわち、 pH8. 3の 10mM N aHCOa 緩衝液にて 20 0倍希釈した抗 CD 14抗体 MEM— 18 (MONOSAN社） を 96ゥエルプ レート （Max i s o r p, Nunc社） に 50 1 /we 1 1添加し、 4 に て一昼夜静置した。 その後、 純水にて洗浄し、 0. 5%83八を含む？83— に てブロッキングを行った （室温で 60分間静置） 。
次に we 1 1中の液を除去し、 トランスフエクシヨンした COS— 1の培養上 清を50 1 6 1 1添加し、 25 で 60分間インキュベーションした後に 、 0. 1 %Twe e n 20を含む PBS— で 3回洗浄後、 1. 0 8 /!111の1^ RP— c on j ug a t e d 3 C 10抗体 50 1 /we 1 1を添加し、 25 °Cで 60分間インキュベーションを行った。 0. 1 %Twe e n 20を含む P B S一 で 5回洗浄後、 発色基質 （TMB) を 100 1 Zwe 1 1添加し室温で 3 0分反応させた後に、 停止液 （ 1 N塩酸） 100 ^ 1 Zwe 1 1を加え反応を停 止した。 450 nmの波長の吸光度を測定し、 サンプルの CD 14改変体ポリペプチド の産生量を算出した。
(4) [ ヒ卜可溶型 CD 14C末端欠失改変体ポリペプチドの精製]
(3) にて得られた CD 14改変体ポリペプチドを含む培養上清は、 抗ヒト C D 14抗体 （3C 10) を結合したァフィ二ティ一精製用カラム （H i Tr ap カラム Am e r s h am Pha rma c i a B i o t e c h社) ) に供し て選択的に吸着させ、 pH勾配にて溶出した。 得られた溶出画分はただちに pH 8. 0の 1 M HEPES緩衝液にて中和し、 pHを中性とした。 各画分は HR P-c on j uga t e d 3 C 10を用いた E I A法により検定し、 CD 14 改変体ポリぺプチドの含まれる画分を選択した。
(5) [ ヒト可溶型 CD 14 C末端欠失改変体ポリペプチドの検出]
CD 14改変体ポリペプチドの分子量を抗ヒト CD 14抗体 (3 C 10および MEM— 18) を用いた We s t e r n b 1 o t t i n gにより確認した。 す なわち各 CD 14改変体ポリペプチド 30n gZl aneを SDS_po 1 y a c ry l ami d e g r ad i e n t g e l (5-20% ATTO社） で 電気泳動し、 PVDF膜 （日本ミリポア社） にタンパクを転写した後、 0. 5%
Sk im M i l kを含む PBS— 30 m 1にて室温で 1時間ブロッキング 反応を行い、 10 g/m 1の 3 C 10および 100倍希釈の MEM— 18を添 加して室温で 1時間反応させた。 さらに HRP— c o n j u g a t e d抗マウス I g抗体と室温で 30分間反応させた後、 ECL k i t (Ame r s h am
Ph a rmac i a B i o t e c h社） を用い、 検出した。 その結果、 各 C D 14改変体ポリペプチドの計算上の大きさにバンドが検出された。 （図 9) (実施例 9)
ヒト CD 14ァミノ酸置換改変体ポリぺプチドの作製
(1) [ s CD 14 (1 - 307) のアミノ酸を置換した CD 14改変体ポリべ プチド （ヒト s CD 14 (1 -307) アミノ酸置換改変体ポリペプチド） 発現 プラスミドの構築]
表中及び本明細書中において s CD 14 (1 -307) の N末端から 283番 目のアミノ酸 L e uを A 1 aに置換したヒト s CD 14 (1— 307) アミノ酸 置換改変体ポリペプチドを 「s CD 14 (1— 307) L283A」 と記載し、 他のヒト s CD 14 (1— 307) アミノ酸置換改変体ポリペプチドも同様に記 載した。
ヒト CD 14 (1 - 307) の種々の場所に 1あるいは 2アミノ酸変異を導入 したヒト S CD 14 (1 -307) アミノ酸置換改変体ポリペプチドを作製する ために、 以下の方法で哺乳動物細胞発現プラスミドを作製した。
s CD 14 (1 - 307) K279 Aを発現するプラスミド pM 1673は、 センスプライマー 3とアンチセンスプライマー 18 (配列番号 38) あるいはセ ンスプライマー 10 (配列番号 39) とアンチセンスプライマ一 4を用い、 実施 例 8— (2) で作製したプラスミド pMl 658を铸型とし、 Py r obe s t
DNA Po l yme r a s e (TaKaRa社） により 98。Cで 10秒、 5 5°Cで 30秒、 72 °Cで 1分のサイクルを 30回繰り返し P C R反応を行つ た。
アンチセンスプライマー 18とセンスプライマ一 10には L y sをコードする 配列の代わりに A 1 aをコードする配列 GCT (アンチセンスプライマーは AG C) を用いた。 これらの PCRによって増幅された DNA断片を 1 %ァガロース ゲル電気泳動によって分離回収し、 K 1 e n ow F r agme n t (T aK aRa社） を用いて DNA断片の末端を平滑化した。
次にこれらの断片の m i X t u r eを铸型に、 センスプライマ一 3とアンチセ ンスプライマ一 4を用い、 上記と同様の条件で再度 PC R反応を行った。 2度目 の PCRで増幅された DNA断片を Xh o Iと H i n dill により d o u b 1 e d i ge s t i onし、 pM1656を Xho lと H i ndlll で消化するこ とにより得られる約 5. 8 kbの DNA断片と 1 i g a t i onした。 JM10 9細胞を形質転換した後、 生じたコロニーを PCRにより確認し、 目的の CD 1 4改変体ポリペプチドを発現するプラスミド （pMl 673) を得た。
また同様に、 N末端から 282番目の Va 1、 283番目のし611、 284番 目の As p、 285番目の Le u、 286番目の S e r、 287番目の Cy s、 289番目の Ar g、 294番目の P r o、 296番目の P r o、 294番目及 び 296番目の P r oあるいは 300番目の P r oをそれぞれ A 1 aへ置換した s CD 14 (1 -307) V282A、 s CD 14 (1— 307) L283A、 s CD 14 (1 -307) D284A、 s CD 14 (1— 307) L285A、 s CD 14 (1 - 307) S 286A、 s CD 14 (1— 307) C 287 A、 s CD 14 (1 -307) R 289A、 s CD 14 (1— 307) P 294A、 s CD 14 (1 - 307) P 296A、 s CD 14 (1— 307) P 294/2 96Aあるいは s CD 14 (1— 307) P 300 Aを発現するプラスミド （p M 1663、 pM 1677、 pM 1664, pM 1678、 pM 1665、 pM 1666、 pM 1667, pM1669、 pM 1670、 pM1671あるいは pMl 672) は、 それぞれ置換を導入するアミノ酸のコドン配列を A 1 aのコ ドン配列 GCTあるいは GCG (アンチセンスプライマ一は AG Cあるいは CG C配列） に変えたアンチセンスプライマー 19、 20、 21、 22、 23、 24 、 25、 26、 27、 28および 29 (配列番号 40、 41、 42、 43、 44 、 45、 46、 47、 48、 49及び 50) とセンスプライマー 1 1、 12、 1 3、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20および 21 (配列番号 51、 5 2、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60及び 61) を用い、 pM 1673と同様の方法で作製した。
さらに S CD 14 (1— 307) R289Dを発現させるプラスミド （pMl 668) も同様に構築した。 この際、 As pへの置換のため A r gのコドン配列
(AGA) を As pのコドン配列 GAT (アンチセンスプライマ一は ATC) に 変えたセンスプライマー 22 (配列番号 62) 及びアンチセンスプライマ一 30
(配列番号 63) を用いた。
さらに、 286番目の S e rを Cy s、 G 1 y、 Th r、 Le uにそれぞれ置 換した改変体を発現するプラスミドを作製した。 構築方法は s CD 14 (1— 3 07) S 286 A発現プラスミドの構築と同様で、 Cy s置換の場合はセンスプ ライマ一 23 (配列番号 64) 及びアンチセンスプライマー 31 (配列番号 65 ) を用いた。 G 1 y置換の場合はセンスプライマー 24 (配列番号 66) 及びァ ンチセンスプライマー 32 (配列番号 67) を、 Th r置換の場合はセンスブラ イマ一 25 (配列番号 68) 及びアンチセンスプライマー 33 (配列番号 69 ) を、 L e u置換の場合はセンスプライマ一 26 (配列番号 70) 及びアンチセ ンスプライマ一 34 (配列番号 71) を用いて構築を行った。
(2) [ ヒト S CD 14 (1 -307) アミノ酸置換改変体ポリペプチドの生産 及び精製]
ヒトアミノ酸置換 s CD 14 (1 - 307) 改変体ポリペプチドの COS— 1 細胞での生産及び上清中の発現量測定は実施例 8— (3) と同様の方法で行った 各 CD 14改変体ポリペプチドの発現量を表 1及び表 2に示す。
ヒト sCD14(1— 307)アミノ酸置換改変体ポリペプチドの COS細胞における発現量
C0S-1細胞培養上清中
Name での発現量
( g/ml) sCDHCl -356) 3.38 sCD1 (l -307) 2.99 sCD14(l -307)L283A 0.44 sCDHCl -307)D284A 0.46 sCDU(l -307)L285A 0.11 sCDHO 0.80 sCD14(l -307)C287A 2.44 sCDHO -307)画 A 0.11 sCDHCl ■307)R289A 0.51 sCD14(l -307)R289D 0.96 sCDHCl -307)P294A 0.69 sCDHCl ■307)P296A 0.60 sCD14(l- ■307)P294/296A 0.67 sCDHO- ■307)P300A 検出されず
2
ヒトアミノ酸置換 SCD14 (1-307) 改変体ポリペプチドの
COS細胞における発現量
Expression in
Name COS cells
Figure imgf000098_0001
sCD14(l- 307)S286A 0.80 sCD14(l- 307)S286C 4.36 sCD Cl- 307)S286G 0.178 sCD14(l- 307)S286T 6.05 sCDUCl- 307)S286L 0.076
s CD 14 (1 -307) P 300 Aでは上清中への発現が確認できなかった 。 さらに、 発現量の低かった s CD 14 (1 -307) S 286 L以外の CD1 4 (1 -307) 改変体ポリペプチドは各プラスミドをトランスフエクシヨンし た COS— 1培養上清中から実施例 8— （4) と同様の方法で精製した。 3) ヒト SCD 14 (1 -307) アミノ酸置換改変体ポリペプチドの検出 各 CD 14改変体ポリペプチドの検出は可溶型 CD 14 C末端欠失改変体ポリ ペプチドの検出と同様の方法で We s t e rn b 1 o t t i ngにより行った 。 ヒト s CD 14 (1 - 307) アミノ酸置換改変体ポリペプチドは全て s CD 14 (1 -307) と同じ分子量を示した。 (実施例 10)
CD 14改変体ポリペプチドの I L _ 6産生阻害活性
900 n g/m 1の F 1024— 1— 3抗体 40 1添加の代わりに 900 n 8/1111のじ014改変体ポリペプチド 40 1添加した以外、 実施例 3に記載 の方法と同様に行った。
その結果を図 10、 図 1 1及び図 12に示す。
I L— 6産生阻害活性は s CD 14 (1 -285) 、 s CD 14 (1-246 ) 及び s C D 14 (1- 183) でそれぞれ 67. 5、 45. 4、 42. 6%で 、 最も強い阻害活性を示した CD 14改変体ポリペプチドは s CD 14 (1 - 285) であった。
また、 S CD 14 (1 - 307) D284A、 s CD 14 (1— 307) S 2 86Aでそれぞれ 81. 3、 79. 6 %と強い阻害活性がみられた。 また s C D 14 (1 -307) C 287 Aでは 24. 4 %と弱い活性が確認された。
また、 286番目の S e rの改変体の阻害活性は s CD 14 (1 -307) S 286 Gが一番強く、 S CD 14 (1— 307) S 286Cは s CD 14 (1 - 307) S 286 Aとほぼ同等の阻害活性を示した。
(実施例 11 )
CD 14改変体ポリペプチドの I L— 6産生誘導活性
CD 14改変体ポリペプチドが HUV EC細胞に I L一 6産生誘導活性を示す か下記方法により確認を行った。 すなわち、 実施例 10と同一の方法で HUVE C細胞を 96ゥエルプレートに巻き込み、 24時間培養した後に、 可溶型 CD 1 4を除去したヒト血清を 7 %含む RPM I 1640培地を 20^ 1 , 120 n g /m 1の LPS (E. c o l i 055 : B 5、 D i f c o社） 10 1及び 9 00 n gZm 1の CD 14改変体ポリペプチド 40 1をゥエルに添加した。 さ らに 20時間培養を行った後、 培養上清中の I L— 6を hum an I L- 6 E I A k i t (PE B i o s y s t ems社） で測定した。
その結果を表 3に示す。 実施例 10で I L— 6阻害活性を示さなかった s CD 14 (1 -356) 、 s CD 14 (1— 307) 及び s CD 14 (1- 152) 並びに阻害活性を示した S CD 14 (1- 183) 及び S CD 14 (1-307 ) C287Aで I L— 6の産生誘導が確認された。
実施例 10で阻害活性を示した s CD 14 (1— 246) 、 s CD 14 (1— 285) 、 s CD 14 (1 -307) D 284 A及び s CD 14 (1— 307) S 286 Aでは、 I L _ 6の産生は測定の検出限界 （ 50 p gZm 1 ) 以下であ つた。 すなわち、 S CD 14 (1 -246) 、 s CD 14 (1— 285) 、 s C D 14 (1 -307) D284A、 s CD 14 (1— 307) S 286A及び s CD 14 (1— 307) S 286Cは LPS存在下で I L一 6産生を誘導せず、 血清由来可溶型 CD 14と LPSとの複合体による I L— 6産生を阻害すること が明らかになった。 0 0
3
[度 300ng mLでの IL-6産生量（pg mL) sCD14(1-356) 216 sCD14(1-307) 203 sCD14(1-285) 検出されず sCD14(1-246) 検出されず sCD14(1-183) 86.7 sCD14(1 - 152) 49 sCD14(1-307)D284A 検出されず sCD14(1-307)S286A 検出されず sCD14(1-307)S286C 検出されず sCD14(1-307)C287A 76.0 血清由来可溶型 CD14低分子種 検出されず (実施例 12)
末梢マクロファージ及び単球における CD 14改変体ポリペプチドの TN Fa 産生阻害活性
健常人末梢血より以下の方法で末梢マクロファージ及び単球を単離した。 まず 、 へパリンを添加したヒト末梢血 20 Omlを PBS_ で 2倍に希釈し、 F i c o i l P a q u e (Am e r s h am Pha rma c i a B i o t e c h 社） 21 m 1に 28 m 1ずつ重層した。 室温、 1500 r pmで 30分遠心分離 後、 単核球画分を回収した。 次に MACSシステム （第一化学薬品社） を用い、 マクロファージ及び単球を単離した。 すなわち、 比重遠心分離により回収した単 核球を抗 CD 14抗体磁気ビーズ （第一化学薬品社） と反応させた後に、 分離力 ラム RS+ (第一化学薬品社） を用い、 CD 14陽性細胞をポジティブセレクシ ヨンした。
得られた末梢マクロファージ及び単球を 2% CD 14w/oHS 'RPM Iに 浮遊させ、 0. 5 x i 05 c e l l s /w e l l (50 1 /w e l 1 ) で 96 ゥエルプレートに植え込み、 37 、 5 %C〇2 の条件下で 24時間培養し た。
可溶型 CD 14を除去したヒト血清を 7%含む RPM 1 1640培地を 20 1、 120n g/m 1の LPS (E. c o l i 055 ： B 5, D i f c o社） 10 1及び種々の濃度の CD 14改変体ポリペプチド 40 1をゥエルに添加 しさらに 4時間培養を行った後、 培養上清中の TNF αを hTNF— ひ EL I S A SYSTEM (Ame r s h am Ph a rma c i a B i o t e c h 社） で測定した。 測定方法は K i t添付のプロトコールに従った。 すなわち、 適 切に希釈した培養上清 50 n 1を反応プレートに移し、 50 ^ 1のピオチン化抗 体溶液を加えて室温で 2時間静置した。 反応液を除去し 400 w lZwe 1 1の 洗浄液で 4回各ゥエルを洗浄した。 次に適切に希釈したペルォキシダーゼを標識 したストレプトアビジン溶液を 100 1加え、 さらに室温で 30分間静置した 。 洗浄後、 発色基質を 100 ^ 1を添加し室温で 15分間反応させた。 停止液 1
00 1を加え反応を停止し、 450 nmの波長の吸光度を測定し、 TNFa量 を算出した。
その結果、 実施例 10で I L一 6産生阻害活性の見られたヒト可溶型 CD 14 C末端欠失改変体ポリペプチドである s CD 14 (1 -285) 、 s CD 14 (
1 -246) 、 s CD 14 (1— 183) 及びヒト s CD 14 (1— 307) ァ ミノ酸置換改変体ポリペプチドである s CD 14 (1 - 307) D284A、 s CD 14 (1 - 307) S 286 Aで TNFひ産生阻害活性が確認された。 （図 13)
(実施例 13)
CD 14改変体ポリペプチドのヒト T L R 4発現形質転換株における N ¥~κ Β活性化阻害試験
実施例 2 (2) の記載と同様に、 S CD 14 (1 - 307) S 286 Cを用い て、 ヒト T L R 4発現形質転換株における N F— κ Β活性化阻害試験を行つた。 その結果、 S CD 14 (1 -307) S 286Cは、 添加濃度依存的に抑制活性 を示した。 （ 図 14) (実施例 14) '
蛋白質相互作用解析装置を用いた阻害機構の解析
(1) [49 kD a高分子量の CD 14蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製
]
① 49 kD a高分子量の CD 14蛋白質に特異的なペプチドの作製
配列番号 1に記載の 316番目から 328番目の配列を、 免疫に使用する 49 k Da高分子量の CD 14特異的なペプチド （以下、 ペプチド 13と記載） とし て選択した。
なお、 選択したペプチドを C末端で SH基を介してキャリア蛋白質と結合させ るため、 C末端にシスティンを挿入した。 ペプチドの合成は AB I 432 Aぺプ チド合成機 （アプライド） を用いて行った。 定法により樹脂よりペプチドの切り 出し、 C 18逆相HPLC (CAPCELL_PAK、 資生堂） を用いてぺプチ ドを精製した。
②合成べプチドを用いたぺプチドキヤリァ抗原の作製
①で作製したペプチドを蒸留水で 1 OmgZmLに溶解し、 1 Omgノ mLの マレイミド化キーホールリンペットへモシァニン （KLH、 P I ERCE) と等 量混合した。 室温で 2時間反応後、 NAP— 10カラム （フアルマシア） で脱塩 しペプチド 13キャリア抗原 （以下、 ペプチド 13— KLHと記載） を得た。 蛋 白質濃度は使用した KLH量を液量で割ったものを用いた。
③ 49 kD a高分子量の CD 14蛋白質特異的モノクローナル抗体の作製 ぺプチド 13— KLHI O O gを免疫源とし、 実施例 1 (1) に記載の方法 と同様に細胞融合を行った。 HAT培地 （G I BCO) によりハイプリドーマを 選択し、 1週間後、 組換えヒト CD 14蛋白質と反応する抗体を産生しているハ イブリドーマのスクリーニングを行った。
まず 0. 01M炭酸緩衝液 （pH9. 5) により精製した組換えヒト CD 14 蛋白質を 1 / gZmLに希釈し、 ィムノプレート （Max i s o r b、 NUNC ) の各ゥエルに 50 L添加した。 37 で 1時間反応後、 イオン交換水で 5回 洗浄し、 0. 5%BSAを含む PBSを各ゥエルに 100 L添加しブロッキン グを行った。 次に選択したハイプリドーマからサンプリングした培養上清を各ゥ エルに添加し 37でで 1時間反応させた後、 0. 05%Twe e n 20を含む生 理食塩水で 3回洗浄した。 ペルォキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体 (DAKO) を 10%ゥサギ血清を含む？83で1000倍に希釈し各ゥエルに 50//L添加した。 37でで 1時間反応後、 同様に 5回洗浄し 0. 01%過酸化 水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ゥエルに添加した。 室温で 10分間 反応後、 0. 5 M硫酸溶液で反応を停止し、 プレート分光光度計 （N J— 210 0、 日本インターメッド） で 450 nmの吸光度を測定した。 その結果、 高分子 量の CD 14蛋白質と反応したハイプリドーマを含むゥエル （F 1025— 4— 1) を選択し、 限界希釈法によりクローニングを行った。
選択したハイブリドーマを 10%FCSZRPMI— 1640培地 （G I BC O) で培養後、 Hy b r i d oma— S FM培地 （G I BCO) で培養し抗体を 産生させ、 P r o s e p— Gカラム （B i op r o s s e s i ng) を用いて抗 体を精製した。 精製した F 1025— 4— 1抗体のサブタイプはラット I gG 1 であった。
④ HRP標識抗体の作製 0. 5 mgのペルォキシダーゼ （東洋紡） を蒸留水に溶解し、 蒸留水で溶解し た 10 OmMの過ヨウ素酸を添加し 25°Cで 20分間反応した。 反応終了後 1. 5%エチレングリコールを添加し 25 で10分間反応後 1 mM酢酸緩衝液 （p H4. 4) に対して透析した。 精製 F 1025— 4— 1抗体を 1 OmM炭酸緩衝 液 （pH9. 5) で透析し、 0. 5mgに対して 1M炭酸緩衝液 （pH9. 5) を添加して活性化した 0. 5 mgのペルォキシダーゼをそれぞれの抗体.と等量に 混合し 25 で 2時間反応した。 4mgZmLの水素化ホウ素ナトリウムを添加 しさらに 2時間 4 °Cで反応した。 反応液を P B Sに透析しペルォキシダ一ゼ標識 抗体を得た。 液量を測定し使用した抗体量より抗体濃度を算出した。
(2) [ F 1024_ 1— 3抗体の阻害機構の解析]
①組み換え TLR 4の発現
COS- 1細胞 （ATCC： CRL 1 150) を 3 X 105 e e l 1 s / 75 cm2 のフラスコに接種し、 37で5%じ〇2 下で一昼夜培養した。 翌日、 実施 例 2 (1) 記載のプラスミド PCDNAT4を用いて FuGENE6 (Ro c h e) 記載のプロトコ一ルにしたがって 6. 25 g DNA : 25^ 1 FuG ENE6の比率で混合し、 1%FBSZDMEM (S i gma、 高グルコース） を 15mL添加したフラスコに加え、 37^5%〇〇2 下で 48時間培養した。 また、 プラスミドを含まないで同様に操作した COS— 1細胞をネガティブコン トロールとした。 TLR 4分子を細胞膜上に発現した COS— 1細胞 （以下、 T LR 4— COSと記載する） 、 及び発現していない COS— 1細胞の上清を廃棄 し、 PBS— (S i gma) で 2 回細胞を洗浄した。 次に 1%EDTAZPBS —溶液を 5m l添加し、 軽く攪拌後、 セルスクレイパー （COSTAR) を用い て細胞を培養フラスコより剥がし、 5 OmLの遠沈管に回収した。 フラスコをさ らに 5mLの PB S—で洗浄し、 5 OmL遠沈管に加え、 l O O O r pmで 10 分間遠心し、 細胞を沈殿させた後上清を廃棄し、 さらに 2回 PBS—で細胞を洗 浄した。 次に洗浄した細胞を 40 mのセルストレイナー （FALCON) でろ 過し、 細胞数をカウントした。 一度遠心し、 5 X 105 e e l 1 sZmLとなる ように P B S—で希釈し 4 °Cで保存した。
②抗 F I TC抗体固定化チップの調製
B I ACORE 3000 (B IACORE社） の解析に使用するチップ上のセ ルに抗 F I TCモノクローナル抗体 （OEMc o n c e p t社） を固定化するた め、 ビアコア社マニュアルに従い、 NHS/EDC溶液 （B IACORE社） に よりセルを 7分間活性化後、 pH6. 0の酢酸緩衝液で 5 に希釈し た抗体をマニュアルインジェクション法により添加し抗体を固定化後、 ェタナー ルァミンによりブロッキングを行った。 リファレンスは未処理セルを使用し た。
③ F I TC-LPS/CD 14複合体の調製
PBS— ( pH 7. 4) で 6 gZmLに希釈した F I TC— LPS (S i g ma、 S e r o t ype O l l l ： B 4) と実施例 8で調製した組み換え s CD 14 (1 - 356) 300 / gZmLを 1 ： 1 混合し、 37°Cで 30分間静置す ることにより複合体を形成した。 複合体の形成は抗 F I TC抗体固相化プレート と （1) で調製したペルォキシダ一ゼ標識抗 CD 14抗体 （F 1025— 4— 1 ) を用いた EL I S A系で確認した。 すなわち、 抗 F I TC抗体を 10 X gZm Lでプレートに固相化し、 0. 5%牛血清アルブミン ZPBS—でブロッキング した。 次に調製した F I TC— LPS/CD 14複合体、 F I TC— LPS、 s CD 14の 3種類のサンプルを抗体固相化ゥエルに添加し、 37°Cで 1時間反応 した。 各ゥエルを洗浄後、 1 wg/mLに希釈したペルォキシダーゼ標識坑 CD 14抗体と反応させ、 洗浄後 TMB発色基質溶液 （B i oF i x、 フナコシ） に より反応させ、 適度な発色が得られた段階で、 硫酸で反応を停止し、 450 nm の吸光度を測定した。 その結果、 F I TC_LPS、 s CD 14単独では吸光度 の上昇が見られないのに対して F I TC一 LPSZCD 14複合体でのみ吸光度 が上昇し、 複合体が形成されていることが確認された。
④阻害機構の解析
調製した F I TC-LPSXCD 14複合体をチップ上に結合し、 次に HBS — EP緩衝液で 130 gZmLに希釈した F 1024- 1— 3抗体をインジェ クとし固定化した CD 14に抗体を結合した。 次に TLR4— COS細胞、 コン トロールとして COS細胞を添加し、 TLR4— COS細胞、 COS細胞の結合 量を測定した。 図 15に結果を示したが、 棒グラフの高さはセル上に結合した量 を示している。 すなわち、 セルに LP SZCD 14複合体が結合することにより レスポンスの上昇が観察された。 次に COS細胞ではレスポンスが観察されなか つたことから結合が認められなかった。 一方、 TOLL4— COS細胞ではレス ポンスの上昇 （200 RU) が観察され、 結合が確認された。 LPSZCD 14 に抗体を反応させると同様にレスポンスの上昇が観察され、 結合が確認された。 さらに COS細胞、 TOLL 4—COS細胞を反応させると、 それぞれにレスポ ンスの上昇 （TOLL 4— COS細胞で 136RU、 〇5細胞で1 15RU) が観察された。 COS細胞のレスポンスの上昇は細胞と抗体の非特異的な結合に 由来するため、 以下の式を用いて阻害率を算出したところ、 阻害率は 90%であ つた。 このことは F 1024— 1 _ 3抗体が CD 14に結合することにより、 T LR4と CD 14の結合が阻害されたことを示しており、 F 1024— 1— 3抗 体の抑制機構が TLR 4の CD 14への結合阻害によることが明らかとなった。 阻害率の算出は （F 1024— 1— 3抗体なしでの TLR4— COS (TOLL 4— COS) 細胞のレスポンス） ― { (F 1024- 1一 3抗体結合時の TO L L4— COS細胞のレスポンス） ― （F 1024_ 1— 3抗体結合時の COS細 胞のレスポンス） ヽ I (F 1024— 1— 3抗体なしでの TOLL4— COS細 胞のレスポンス） X I 00 (%) により算出した。
(2) [ CD 14改変体ポリぺプチドの阻害機構の解析]
① CD 14チップの作製
B I ACORE 3000の解析に使用するチップ上のセルに s CD 14 ( 1— 356) を固定化するため、 ビアコア社マニュアルに従い、 NHSZEDC溶液 (ビアコア） によりセルを 14分間活性化後、 pH4. 0の酢酸緩衝液で 200 gZmLに希釈した s CD 14 ( 1— 356) をマニュアルインジェクション 法により添加し s CD 14 ( 1 -356) を固定化後、 ェタナールァミンにより ブロッキングを行った。 リファレンスは未処理セルを使用した。
② CD 14ZLP SZTLR4複合体の形成
調製したチップを B I ACORE 3000に設置し、 ビアコア社マニュアルに 従い、 HBS— EP緩衝液 （ビアコア） を用いて 10 L/m i nの流速でセン サーグラムを開始した。 まず、 S CD 14 (1— 307) ( S 286 C) 10 β g/ mL、 （ 03細胞1. 7 x 105 e e l I s mL、 To l l 4_ COS細 胞 1. 7 x i 05 c e l l sZmLをそれぞれ 5 インジェク卜したところ、 3者とも s CD 14( 1 -356) への結合は観察されなかった。 次に、 s CD 14 ( 1 - 356) セルに L P S (S i gma、 S e r o t yp e 055 ： B 5 ) を 1 LZmLの流速で 30 インジェクトし結合させ、 続けて 1%ヒト血 清 （可溶型 CD 14を実施例 3記載の方法により除去したもの） を含む PBS— で 1. 7 X 105 c e l l sZmLに調製した To 1 14— COS細胞を 5 L インジェクションし LPSZCD 14ZTLR4複合体の形成を行わせたところ 、 結合が確認された。 （図 16) 。 _
③阻害機構の解析
2 Mチォシアン酸溶液で複合体を解離後、 LPSを同条件で再度結合した。 次 に、 1. 7 X 105 c e 1 1 sZmLの To 1 14— COS細胞と 33 gノ m Lの S CD 14 (1 - 307) ( S 286 C) を混合し、 室温で 20分間反応さ せた。 LPSのインジェクション終了後、 その混合溶液を流速 10 LZm i n で 5 Lインジェクトしたところ、 S CD 14 (1— 307) ( S 286 C) 存 在下では To 1 14— COS細胞の s CD 14 ( 1— 356) ZL PS複合体へ の結合がほぼ 100 %抑制された。 （図 16 )
(実施例 15 )
LPS結合実験
s CD 14 (1— 356) 、 s CD 14 (1— 307) あるいは s CD 14 ( 1 - 307) S 286 A (各終濃度 20 gZml) と LPS (終濃度 100 gZm l) を混合し、 37 °Cで 16時間インキュベーションした。 これらの反応 液を 7. 5 %の SDS無添加 p o 1 y a c r y 1 am i d e g e l (ATT O社） にて 300V定圧で 5時間泳動した後に PVDF膜にタンパクを転写した その後、 実施例 8と同様の方法で We s t e r n b 1 o t t i n gを行い、 s CD 14のバンドを検出した。 ただし、 抗 CD 14抗体としては、 精製した健 常人血清中 s CD 14を抗原としてラッ卜に投与して得たラット血清、 すなわち ラット抗ヒト CD 14抗血清を、 また 2次抗体としては HRP_c on j uga t e d抗ラット I g抗体 （DAKO社） を用いた。
その結果、 s CD 14 (1 -356) 、 s CD 14 (1— 307) 及び s CD 14 (1— 307) S 286 Aの全てにおいて分子量の移動が見られ、 これらは LPSと結合することが確認された。 （図 17)
(実施例 16)
ヒト血中由来可溶型 CD 14低分子種ポリペプチドの調製
(1) [ ヒト血中由来可溶型 CD 14低分子種ポリペプチドの精製]
まず、 実施例 8_ (4) に示す方法で精製したヒト血清由来の可溶型 CD 14を 、 F 1024— 1—3抗体を結合したァフィ二ティー精製用カラム （H i Tr a pカラム， Am e r s h amP h a r m a c i aB i o t e c h社) に供して咼 分子種の可溶型 CD 14を除去した。 得られた未吸着画分は凍結乾燥法にて濃縮 し、 実施例 8に記載した抗 CD 14抗体を用いた E I A法により濃度を決定した 。 その結果、 血清由来可溶型 CD 14低分子種の血清中の可溶型 CD 14全体に 占める割合は 5 %未満であった。 (2) [ ヒト血清由来可溶型 CD 14低分子種ポリペプチドの検出]
(1) に示す方法で得られたヒト血清由来可溶型 CD 14の各分画の分子量を 抗ヒト CD 14抗体 （3 C 10および MEM— 18) を用いた We s t e r n b 1 o t t i ngにより確認した。 すなわちヒト血清由来可溶型 CD 14分画を実 施例 8 (5) に示す方法で分析した。 分析結果を図 18に示す。
その結果、 ヒト血清由来可溶型 CD 14は 49 kD a、 55 kD aの位置 （ Lane l) に、 ヒト血清由来可溶型 CD 14低分子種ポリペプチドは 36 kD aの位置にバンドが検出された （L a n e 2) 。
また、 CD 14低分子種ポリペプチドは実施例 8で作製した CD 14改変体ポ リペプチド （図 9) の S CD 14 (1— 285) と S CD 14 (1-246) の 間に位置していることが確認された。 また、 3C 10抗体と結合することより、 CD 14の 7番目以降のアミノ酸は維持されていることがわかる。 これらより、 CD 14低分子種は CD 14の N末端は 1〜 6であり、 C末端は 246〜285 の間にあることがわかった。
なお、 ヒト血清由来可溶型 CD 14 (Lane 1) において 36 kD aの分子 が検出されないのは 49 kD a、 55 kD aの分子に比べ、 ヒト血清由来可溶型 CD 14に含まれる 36 kD aの分子が微量のためである。
さらに、 得られた血清由来可溶型 CD 14低分子種ポリペプチド 100 n gZ l an eを SDS_po l ya c ry l ami d e g r ad i e n t ge l (5-20% ATTO社） で電気泳動し、 2D_銀染色試薬 · I I 「第一」 キ ット （第一化学薬品社） を用いて蛋白の銀染色を行った。 その結果、 ヒト血清由 来可溶型 CD 14低分子種ポリペプチドは 36 ± 5 kD aの位置にややブロード な単一バンドとして検出され、 実質的に精製されたことが確認できた。
(実施例 1 7)
CD 1 4低分子種の細胞傷害阻害活性
ヒト血管内皮細胞 HUVEC (三光純薬社） を実施例 3に示す方法で剥離し、 2 %CD 1 4w/oHS/RPM Iに懸濁して 5 x 1 04 c e l l s /we 1 1 (50 1 /we 1 1 ) で 96ゥエルプレートに植え込み 3 7 ：、 5 %C02 の 条件下で 24時間培養した。
36 n g/m 1の LPS (E. c o l i 0 5 5 ： B 5, D i f c o社） 1 0 (i 1 , これに 7. 2 gZm 1の組換え体可溶型 CD 14 (s CD 1 4 (1— 3 56) ) を単独で 50 , あるいはさらに 9. 6 n g/m 1のヒト血清由来可 溶型 CD 14低分子種ポリペプチドを加えた混合液 5 0 a 1を添加し、 可溶型 C D 1 4を除去したヒト血清を 14%、 及び Cy c l oh e x i m i d e (S i g ma社） を 144 8/11 1含む1^?^/11 1 640培地を 1 0 β 1添加して、 1 8時間培養した。
その後、 1 2 1の ΜΤΤ標識試薬 （ロシュ ·ダイァグノスティックス社） を 添加して 4時間さらに培養後、 1 2 0 1の可溶化溶液 （ロシュ ·ダイァグノス ティックス社） を加え、 1昼夜暗所に置き、 6 0 0 nmの吸光度を測定して細胞 傷害度を測定した。
その結果を図 1 9に示す。 S CD 1 4 (1 - 3 5 6) 単独では上記条件下にお いて 5 3%傷害活性を示したが、 CD 14低分子種ポリペプチドの添加により細 胞傷害活性は完全に阻害された。 (実施例 18 )
CD 14低分子種の I L一 6産生阻害活性
900 n g/m 1の F 1024_ 1— 3抗体 40 n 1添加の代わりに 900 n gZm lの CD 14低分子種 40 1添加した以外、 実施例 3に記載の方法と同 様に行った。
その結果を図 10に示す。 CD 14低分子種の I L一 6産生阻害活性は 86. 7 %であった。
(実施例 19)
CD 14低分子種の I L一 6産生誘導活性
900 n g/m 1の C D 14改変体ポリぺプチド 40 1添加の代わりに 90 0 n gZm 1の CD 14低分子種 40 1添加した以外、 実施例 11に記載の方 法と同様に行った。
その結果を表 3に示す。 C D 14低分子種の I L— 6の産生は測定の検出限界 (50 p g/m 1 ) 以下であった。
(実施例 20)
ヒト T L R 4発現形質転換株におけるサイトカイン産生阻害試験
実施例 2 (1) で得た HE KT 4— 14を 24we l l— p l a t eへ 0. 8 X 105 e e l 1 s /we 1 1で植え込み、 実施例 2 (2) と同様に F 1024 一 1一 3あるいは s CD 14 (1 - 307) S 286 Cの存在下もしくは非存在 下で LPSZs CD 14で刺激した。 20時間後に培養上清を回収し、 上清中の I L— 8産生量を E I Aによって確認した。 その結果、 F 1 024— 1— 3、 s CD 14 (1 -307) S 286 C共に、 添加濃度依存的に抑制活性を示した。 (図 20)
(実施例 21)
グラム陽性菌菌体成分に誘導される I L一 6産生阻害活性
ヒト腎由来細胞株 U— 373MG (ATCC) を 0. 05% T r yp s i n , 0. 53mM EDTAを含む PBS— で剥離後、 RPM I 1640培地 （旭 テクノガラス社） にて懸濁し、 3 x i 04 c e l l sZwe l l (100 lZ we 1 1) で 96ゥエルプレートに植え込み 37V, 5% CO 2の条件下で 24 時間培養した。 RPM I 1640培地を 70 1、 1 g/m 1 (wZv) の S t aphy l o c o c c u s au r e u s c e l l s u s p e nd i on (S i gma社） 10 1 , 5 gZm 1の s C D 14 (1 - 356) を 10 1及び 10 g/m 1の CD 14改変体ポリペプチド若しくは F 1024— 1— 3抗体 1 n 1をゥエルに添加し、 さらに 20時間培養を行った後、 培養上清中 の I L— 6を human I L- 6 E I A k i t ( I L- 6 E l i— p a i r : G I BCO BRL社） で測定した。 コントロールとして、 CD 14改変 体ポリぺプチド、 F 1024— 1— 3抗体の代わりに S CD 14 (1— 356) を添加した。
I L一 6の測定は human I L— 6 E I A k i t添付のプロトコール に従い、 行った。 すなわち、 1 % (w/v) BSAZPBS (-) にて 4倍希釈 した培養上清 50 1を I L— 6抗体固相化プレートに移し、 ピオチン化抗ヒト
1 L一 6抗体 50 1を加え 37 で 60分間インキュベーションした。 その後 、 反応液を除去し 400 1 /we 1 1の 0. 05 % (v/v) Twe e n- 2 OZPBS (-) で 3回洗浄し、 ペルォキシダ一ゼを標識したストレブトァビジ ン溶液を 100 1 /we 1 1加え、 さらに 37 ：、 20分間インキュベーショ ンを行った。 洗浄後発色基質 （TMB) を 100 1 /we 1 1を添加し室温で 15分間反応させた後に、 停止液 （1M HC 1 ) 100 w lZwe 1 1を加え 反応を停止した。 450 nmの波長の吸光度を測定し、 サンプル中の I L— 6の 産生量を算出した。
その結果を図 21に示した。 S CD 14 (1 - 307) S 286 C及び F 10
24— 1 _ 3抗体の I L一 6産生阻害活性はそれぞれ 48. 1%及び55. 2 % であった。
この結果より， CD 14改変体ポリペプチドおよび F 1024- 1 _ 3がダラ ム陽性菌菌体成分に誘導されるサイトカイン産生を抑制することが示された。
(実施例 22)
F 1024- 1一 3抗体の交差反応性の確認
敗血症動物モデルにおける F 1024- 1一 3抗体の有用性を明らかにする目 的で F 1024— 1—3抗体の各種動物由来 CD 14との交差反応性を検討した 。 まず、 ヒト S CD 14 (1 -356) を 50 n g ウエルでプレート （Maxiso 卬、 unc) に固相化し、 0. 5 %BSAZPBSでブロッキングした。
ィヌ （ビーグル） 、 サル （力二クイ、 ァカゲ） 、 ゥサギ （ニュージランド白色 種） 、 ヒト （ポジティブコントロール） 及びラット （ネガティブコントロール） の各血清を PBSで希釈したものを、 ペルォキシダーゼ標識 F 1024- 1 -3 抗体 1 gZmLと混合し、 ブロッキング液を除去したプレートに添加した。 プ レートを 37 で 1時間反応し、 洗浄液で 5回洗浄後、 0. 02%過酸化水素を 含むテトラメチルベンジジン発色液を添加し、 10分間反応後 0. 5M硫酸で反 応を停止した。 プレートの吸光度を 450 nmの波長で測定した。 4倍希釈血清 の結果を図 22に示す。
その結果、 F 1024— 1一 3抗体のヒト CD 14への結合はゥサギで 52 % 、 ィヌで 30%、 ァカゲで 44%、 力二クイで 57%、 ヒトで 83%阻害され、 F 1024— 1—3抗体はゥサギ、 ィヌ、 サルの CD 14と交差反応性を示した 次に、 ゥサギの CD 14との結合をフローサイトメトリー法を用いて検討した ゥサギ （ニュージランド白色種、 北山ラベス） ォス、 2. 2 kgの耳動脈より ゥサギ全血 lmLをへパリンで濡らしたシリンジで採血した。 100 Lに 10 mLの Tr i s/NH4 C 1溶液を加え、 溶血させ、 残った細胞分画を遠心して 回収した。 集めた細胞を 5 %牛血清 Z0. 1%EDTA/PBS—でブロッキン グし、 再度遠心し、 細胞を回収した。
次に細胞を lmLの 5 %牛血清/ 1 %EDTAZPB S—に懸濁し F 10 24— 1—3抗体、 ヒト S CD 14 ( 1 - 356) 275 n gでプレインキュべ ーションした F 1024- 1一 3抗体、 ラット I gGをそれぞれ最終濃度 1 a g mLとなるように添加し、 4tで 1時間反応した。 細胞懸濁液を 0. 25%牛 血清 ZPBS—で 3回洗浄後、 1000倍に希釈した F I TC標識抗ラット抗体 (DAK0) に再懸濁し、 4 で 30分間反応した。 再度、 細胞を洗浄し、 FACS 解析を FACS C a 1 i bu r (BD社） で行い、 蛍光強度を測定した。 図 23に示すように、 ゥサギ単球は F 1024— 1— 3抗体で染色され、 ヒト
CD 14で前処理することにより、 染色が阻害された。 また、 コントロール抗体 (ラット I gG) では染色されなかった。 したがって、 F 1024— 1— 3抗体 は単球上のゥサギ CD 14と結合することが確認された。
(実施例 23)
LPS負荷ゥサギ敗血症モデルにおける F 1024— 1— 3抗体の有効性 敗血症モデルにおける F 104- 1— 3抗体の有効性を確認する目的で、 L P S負荷ゥサギ敗血症モデルを作製し、 F 1024— 1 _ 3抗体の有効性を抗体前 投与及び後投与の 2種類のプロトコ一ルにより検討した。
(1) [F 1024- 1 -3抗体の前投与効果]
① LPS前投与
LP S負荷ゥサギ敗血症モデルは、 S c h imk eらの方法 （P r o c. N a t 1. Ac ad. S c i . USA, 95 : 13875, 1998) に準 じ、 LPS (Salmonella minnesota Re595, Sigma社） をニュージランド白色種 (2. 1-2. 4 kg, 北山ラベス） に 0、 5、 24時間毎に 5 gZk gを耳 静脈より投与することにより作製した。 前投与群のプロトコールは F 1024- 1一 3抗体を— 1、 4、 23時間毎に 2. 5mgZk gを耳静脈より投与し、 コ ントロール群は抗体の変わりに生食を投与した。 まず、 体重により群れ分けを行い、 各群 5羽を選択し、 一 1時間に前採血を行 なった。 次に、 1、 3、 5、 7、 23、 25、 28、 48時間毎に採血を行い、 体重、 白血球数、 血清 GPT値、 血清クレアチニン値、 血清 TNFa値を測定し た。 なお、 白血球数は Sy sme x F— 280 (東亜医用電子） により、 血 清 GPT値、 血清クレアチニン値は DR I—CHEM5000 (FUJ I F I LM ) により測定した。
また、 TNF αは D av i dらの方法 （J ou r na l o f I mmu n o l og i c a l Me t hod s, 68 : 167, 1984) に準じて、 L
929細胞 （ATCC) を 0.. 25%トリプシン ZPBS—で剥離後、 5. 5 X
105 細胞/ mLに再懸濁し、 5. 5 X 104 細胞ノウエルでプレートに播種し た。 37 、 5%C02 下で一晩培養後、 上清を除き TNF標準品 （ヒト TN F、 持田） または希釈した検体 100 Lを添加し、 続けて最終濃度
Lとなるようにァクチノマイシン D (Sigma ) を添加して、 37 ：、 5 %C02 下で 20時間培養した。
TNF量はプレートの培養上清を 10 O L除いた後、 WST— 1溶液 （同仁 化学） を I O L添加して、 3 7 で 40〜 9 0分間インキュベーション後、 4 5 Onmの吸光度を測定し、 産生された血清中の TNF量を吸光度の相対値とし て表示した。 さらに、 48時間後の生存率をもって、 F 1024— 1—3抗体の 有効性を判定した。
まとめを、 表 4に示す。 その結果、 F 1024— 1— 3抗体投与群では 48時 間後の生存率は 100% (5/5) であったのに対して、 生食投与群では 40% (2/5) であり、 F 1024— 1— 3抗体投与により生存率は有意に改善され た。 また、 2 8時間後の各パラメータの値も F 1 0 2 4— 1— 3抗体投与群で生 食投与群に比較して前値に近い値を示した。
さらに、 図 2 4に示すように血清中の T N Fの産生量は F 1 0 2 4— 1— 3抗 体投与により抑制され、 in vivo においても in vi tro同様、 炎症性サイト力イン の産生を F 1 0 2 4— 1—3抗体が抑制することが明らかとなった。
表 4は F 1 0 2 4— 1 _ 3抗体の L P S負荷ゥサギ敗血症モデルにおける前投 与での死亡率の改善、 各種パラメ一夕の改善を示している。
L 2 0
表 4
Figure imgf000121_0001
② LTAZP e pG前投与
さらに、 グラム陽性菌に対する効果を確認する目的で、 ①と同様に試験を行つ た. LPSの変わりに LTAZP e pGを投与し、 F 1024— 1— 3抗体の白 血球減少症の改善効果を検討した。 すなわち、 F 1024— 1一 3抗体 （2. 5mg/k g) または生食をニュージランド白色種 （2. 1-2. 4 kg, 北山 ラベス） に投与し、 1時間後 LTA (Sigma ) 及び P e pG (Fluka ) 1 Q 0 u g/mLを耳静脈より投与した。
LTA/P e p G投与直前を 0時間として、 毎時間採血し白血球数を測定した ところ、 図 2 5に示すように、 生食投与群では白血球数の減少が観察されたのに 対して、 F 1 024— 1— 3抗体投与群では白血球数の減少が観察されず、 F 1 024- 1一 3抗体が LTAZP e p Gに由来する白血球減少症に対しても効果 を示し、 グラム陽性菌に由来する敗血症に対しても有効性が確認された。
(2) [F 1 024- 1 - 3抗体の後投与効果]
(1) ①の方法にしたがって、 LP S負荷ゥサギ敗血症モデルを作製した。 後 投与群のプロトコ一ルは F 1 024— 1 _ 3抗体を 4、 2 3時間毎に 2. 5mg /k gを耳静脈より投与し、 コントロール群は抗体の変わりに生食を投与し た。
まず、 同様に群れ分けを行なったゥサギ、 各群 5羽をより、 — 1時間に前採血 を行なった。 次に、 プロトコールにしたがって LPSを投与し、 さらに 1、 3、 5、 7、 24、 2 6、 2 8、 48時間毎に採血を行い、 体重、 白血球数、 血清 G PT値、 血清クレアチニン値を同様に測定した。
まとめを、 表 5に示す。 その結果、 F 1 024— 1— 3抗体投与群では 48時 間後の生存率は 1 00 % (5/5) であったのに対して、 生食投与群では 8 0 % (4/5) と有意な差が認めれなかったが、 2 8時間後の各種パラメータでは F 1 024— 1一 3抗体投与群は正常値に近い値であり、 一方、 生食投与群は細胞 が傷害されたことを示す異常値であった。 また、 図 2 6に示すように血清中のク レアチニン値は経過観察中に大きな変動は認められず、 F 1 024— 1— 3抗体 に L P S負荷により惹起される組織傷害を抑制する効果があることが確認された 表 5は F 1 0 2 4— 1— 3抗体の L P S負荷ゥサギ敗血症モデルにおける後投 与での各種パラメ一夕の改善を示している。
表 5 前値 (n=10) F 1024-1- 3抗体 生食投与群
投与群
48時間後生存率 （％) 100% 80%
28時間後パラメ一夕 白血球数 (lOVmm3 ) 6. 6+/-0. 4 5. 3I/-0. 7 1. 6+/-0. 3
GPT (U/L) 27+Λ8 41+/-22 22+/- 13 クレアチニン （mg/dL) 0. 8+/-0. 04 0. 82+/-0. 09 2. 04+/- 1, 07
48時間後の体重 （kg) 2. 13+/- 0, 08 1. 98+/-0. 1 1. 92+/- 0. 06 (実施例 24)
マウス致死性 LP Sショックモデルにおける CD 14改変体ポリペプチドの有 効性
(1) [ i n V i V o試験に用いる s CD 14 (1— 356) 及び s CD 14 ( 1 - 307) S 286 Cの調製]
s CD 14 (1 -356) 及び S CD 14 (1— 307) S 286 Cを動物疾 患モデルに投与して薬理作用を確認するために、 S CD 14 (1 -356) は実 施例 8に示す方法で 1. 15 Lの培養上清から 17. 6mgを、 s CD 14 (1 - 307) S 286Cは実施例 9に示す方法で 7. 8 Lの培養上清から 1 1. 2 mgをそれぞれ調製した。 各ポリペプチドの純度は、 銀染色法により単一バンド であることにより確認した。 すなわち、 各ポリペプチド 1 O OngZl an eを SDS— po l ya c r y 1 ami d e g r ad i en t ge l (5— 20 % ATTO社） で電気泳動し、 2D—銀染色試薬 · I I 「第一」 キット （第一 化学薬品社） を用いて蛋白の銀染色を行った。 その結果、 各ポリペプチドの計算 上の大きさのバンドのみが染色された。
(2) [マウス致死性 LP Sショックモデルにおけるの s CD 14 (1 -307 ) S 286 Cの効果]
生後 6週齢の B a 1 bZc雄性マウス （日本チャールズリバ一社製） を、 体重 を元に 5群 （各群 10匹） に群分けした。 その後 s CD 14 (1 - 307) S 2 86Cを 3mgZkgから 10mgZkg、 s CD 14 (1— 356) を 10m gZkg、 生理食塩液 （陰性対照用、 大塚製薬） 若しくはソル ·メドロール 10 mgZkg (陽性対照用、 フアルマシア ·アップジョン社） を尾静脈より単回投 与した。
被験薬物投与の 2分後に、 LPS (S a lmone l l a mi nne s o t a Re 595, S I GMA社） 10 g/k gおよびガラクトサミン （D— G a 1 a c t o s am i n e Hyd r o c h l o r i d e, 和光純薬） 700m g/kgを尾静脈より投与し、 ショックを誘発した。 その後 24時間目まで経時 的に生存率を判定した。
その結果を図 27に示す。 陰性対照群である生理食塩液投与群ではショック誘 発後 8時間目までに全例死亡した。 また、 1 OmgZk gの s CD 14 (1— 3 56) を投与した群においてもショック誘発後 12時間目までに全例死亡した。 一方、 S CD 14 (1 - 307) S 286 C投与群では、 l Omg/kg投与群 では 24時間後でも 8例生存し、 3 m g Z k g投与群では 6例の生存が確認され た。 この結果より、 S CD 14 (1 - 307) S 286 Cの用量依存的な生存率 改善作用が確認された。
(実施例 25)
CD 14改変体ポリペプチドの N末端アミノ酸配列分析
CD 14改変体ポリペプチドの一つである s CD 14 (1 - 307) S 286 C の N末端アミノ酸配列分析を P r o t e i n s e qu e nc e r P r o c i s e™ 494 c L C P r o t e i n s e que n c i ng s y s t em (App l i e d B i o s y s t ems J a p a n株式会社） を用いて実施 した。 その結果、 N末端アミノ酸配列として Th r Th r P r o G 1 u P r oの 5残基のみが確認された。 その他のアミノ酸配列が確認されなかった事 から、 S CD 14 (1 -307) S 286 Cの N末端は、 1番目のアミノ酸であ る事がわかった。
(実施例 26)
大腸菌を用いた s CD 14 (1 -285) の発現
実施例 8— ( 2 ) で作製した S CD 14 (1 -285) 発現プラスミド p M 16 59より Nc o I及び H i ndlll を用いて CD 14のコーディング領域を切り 出した。 次にこの DNA断片を、 T r pプロモーターを持つ大腸菌発現用プラス ミド pTr c 99A (アマシャムフアルマシアバイオテック社） の Nc o l及び H i n dill にて挿入し、 定法に従って JM109コンビテントセルを t r an s f o rma t i o nし、 プラスミド pT r c 1 659を得た。 得られたプラス ミドを铸型にセンスプライマー 27 (配列番号 72) 及びアンチセンスプライマ 一 35 (配列番号 73) を用いて P y r o b e s t DNA Po l yme r a s e (TaKaRa社） により 98 で 10秒、 551：で 30秒、 72でで 1分 のサイクルを 30回繰り返し PCR反応を行った。 次にこの PCR産物を Xh o Iで消化した。 また、 pT r c 1659を Nc οΊで消化し、 k l e now f r a gme n t (TaKaRa社） により末端の平滑化を行った後に Xh o Iに て消化し、 前述の PC R産物を 1 i g a t i o nした。 定法に従って JM109 コンビテントセルを t r an s f o rma t i onし、 s CD 14 (1 -285 ) 大腸菌発現プラスミド pTr c l 659— 2を得た。 pT r c l 659— 2を 含む JM109は、 終濃度 50 / gZmLのアンピシリン （D [-] - - Am i no b e n z y l p en i c i 1 1 i n ; S i gma社） を含む LB培地 （B I O 101社） にて 600 nmの吸光度が 1になるまで培養し、 終濃度 1 mM の I PTG (I s op r opy l j3-D-Th i og a 1 a c t opy r an o s i d e ; S i gma社） を培地中に添加してさらに 3時間培養した。 遠心分 離法にて回収した菌体を 0. 5 %T r i t o n— X 100 (S i gma社） を含 む TEバッファー （和光純薬） に懸濁して凍結融解および超音波処理にて菌体を 破壊後、 CD 14ポリペプチドを可溶化した。 ポリペプチドの発現量を実施例 8 一 (5) に示す方法にて測定したところ、 大腸菌培養液 lmL当たり約 8^g/ mLの発現量が得られた。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 すでに形成された CD 14ZL PSであっても細胞内へのシ グナル伝達を調節しうる CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有する物質 、 その作成方法、 敗血症治療薬のスクリーニング方法、 敗血症用医薬組成物を提 供される。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列番号 1に記載のヒト CD 14の 269番から 315番までの領域の一 部を含むェピトープを特異的に認識し、 CD 14と To 1 1 L i k e Re c e p t o r (以下 TLRという） との結合を阻害する機能を有する抗 C D 14抗 体。
2. モノクローナル抗体である請求項 1に記載の抗体。
3. 請求項 2に記載の抗体の F a b、 Fab' または （Fab' ) 2 である断 片。
4. ハイブリドーマ F 1024— 1— 3 (受託番号 P— 18061) により産生 される F 1024— 1— 3モノク口一ナル抗体。
5. 請求項 2〜 4のいずれかに記載の抗体若しくは抗体の断片を産生するハイ プリドーマ。
6. 配列番号 1に記載のヒト CD 14の 269番から 315番までの領域のァ ミノ酸を連続 8個以上含むぺプチド。
7. 請求項 6に記載のペプチドを免疫原として用いる抗体の作成方法。
8. CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有し、 以下①または②のいず れかである C D 14改変体ポリぺプチド：
①配列番号 1に記載のアミノ酸配列の N末端が 1〜 6番目のいずれかであり、 C末端が 246〜306番目のいずれかのアミノ酸配列を有する、
②配列番号 1に記載のアミノ酸配列の N末端が 1〜 6番目のいずれかであり、 C末端が 269〜356番目のいずれかであり、 かつ 269〜307番目のアミ ノ酸のいずれか一つ以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。
9. 請求項 8の①において、 C末端が 246〜285番目のいずれかである請 求項 8に記載の CD 14改変体ポリペプチド。
10. 請求項 8の②において、 C末端が 269〜356番目のいずれかであり 、 かつ 269〜 307番目のアミノ酸のいずれか一つ以上が L e u、 A 1 a, C y sまたは G 1 yに置換された請求項 8に記載の CD 14改変体ポリペプチド。
1 1. 請求項 8〜 10のいずれかに記載の CD 14改変体ポリペプチドのアミ ノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換， 挿入若しくは付加さ れたアミノ酸配列からなり、 かつ CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有 する C D 14改変体ポリぺプチド
12. 請求項 8〜11のいずれかに記載の CD 14改変体ポリペプチドをコー ドする遺伝子。
13. 以下の①または②の DN Aからなる遺伝子。
①配列番号 4〜 6のいずれかに記載の D A
②配列番号 4〜 6のいずれかに記載の DN Aとストリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、 かつ CD 14と TLRとの結合を阻害する機能を有するポリべ プチドをコードする DNA
14. 請求項 12または 13に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
15. 請求項 14に記載の組換えべクタ一を含有する形質転換体。
16. 請求項 15に記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする 請求項 8〜1 1のいずれかに記載の CD 14改変体ポリペプチドの製造方法。
17. 血漿から得られうる分子量 36 ± 5 kD aの CD 14低分子種。
18. 抗体、 抗体断片、 ポリペプチドまたは CD 14低分子種を含む CD 14 と TLRとの結合阻害剤。
19. 遺伝子組換え法により作成された TLRを発現する細胞に、 CD 14及 び被検物質を接触させる工程を含む敗血症治療薬のスクリーニング方法。
20. 請求項 18または 19のいずれかに記載のスクリーニング方法で得られ た抗 CD 14抗体、 CD 14改変体若しくは低分子化合物。
21. CD 14と TLRとの結合阻害剤を有効成分として含む敗血症用医薬組 成物。
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