WO2001070016A1 - Animaux a forte production d'histamine - Google Patents

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Hiroshi Ohtsu
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Definitions

  • the invention of this application relates to a histamine-producing animal. More specifically, the invention of this application relates to a transgenic animal in which an exogenous histamine synthase gene has been introduced into a somatic cell chromosome, and relates to an individual animal that produces histamine excessively in the body.
  • Histamine is a type of biologically active substance that acts in the living body (a kind of codon ⁇ autacoids). In the living body, histamine is widely distributed in the skin, lungs, digestive tract, etc. It is released during regi and anaphylaxis and is involved in the development of urticaria-inflammation and blood changes. In gastric mucosa, it is also known to be involved in the development of gastric ulcer because it is present in enterochromin cells and plays an important role in promoting secretion of gastric juice. As described above, histamine is involved in various diseases and physical condition changes in humans, and elucidation of the mechanism of its action is indispensable for the development of therapeutic methods and therapeutic agents for histamine-related diseases and the like.
  • the present invention relates to a non-human animal obtained by ontogenizing a totipotent cell into which a polynucleotide encoding histidine decarboxylase has been introduced and an offspring of the same, as an invention for solving the above-mentioned problems. And a histamine-producing animal having the polynucleotide in a cell chromosome and producing histamine at a high level in somatic cells.
  • the non-human animal is a mouse.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a gene transfer vector used in Examples.
  • Figure 2 shows the results of Southern analysis confirming the presence of the transgene.
  • Figure 3 shows the results of confirming the expression of the transgene in the Northern analysis.
  • the transgenic animal of the present invention is prepared according to a known transgenic animal production method (for example, Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77: 7380-7384, 1980). be able to. That is, a polynucleotide encoding a histidine decarboxylase (L-Histidine decarboxylase: HDC) (hereinafter sometimes referred to as a “transgene”) is introduced into a totipotent cell of a non-human animal.
  • a transgenic animal of interest can be produced by generating an individual and selecting an individual in which the transgene has been incorporated into the somatic cell genome.
  • the transgene is a DNA fragment containing a polynucleotide encoding HDC.
  • polynucleotides include known mouse HDC cDNA (FEBS Lett. 276: 214-218, 1990) and rat HDC cDNA (Pro. Natl. Acad. Sci. USA 87: 733-737, 1990). Can be used.
  • HDC cDNA of origin can also be obtained.
  • a promoter sequence and a enhancer sequence for controlling its expression are linked to the introduced gene. By selecting this promoter sequence, HDC can be expressed systemically or selectively in specific tissues.
  • Such a transgene can be constructed by inserting and linking the polynucleotide ⁇ promoter Z enhancer sequence to a circular vector DNA so as to be in a positional relationship effective for regulating the expression of the transgene. it can.
  • the cells After opening and linearizing, the cells are introduced into totipotent cells.
  • a totipotent cell into which a gene is introduced in the case of a mouse, a fertilized egg or an early embryo can be used.
  • the physical injection (microinjection) method of DNA is the best method for introducing genes into cultured cells, considering the yield rate of transgenic animals and the efficiency of transgene transfer to the next generation. .
  • the fertilized egg into which the gene has been injected is then transplanted into the fallopian oviduct, and the animals that have developed and bred to the individual are fostered and reared, and then a part of the body (in the case of mice, for example, the tail Extract the DNA from the tip and confirm the presence of the transgene by Southern analysis or PCR. If the individual in which the presence of the transgene is confirmed is the first generation (Founder), the transgene is transmitted to 50% of its offspring (F1). Furthermore, by crossing this F1 individual with a wild-type animal or another F1 animal, an individual (F2) having a transgene in one (heterozygous) or both (homozygous) diploid chromosomes is created. be able to.
  • the transgenic animals thus produced overexpress foreign HDC in all somatic cells or specific tissues, and as a result produce high levels of histamine.
  • the transformer Jie nick animals by producing histamine at a high level, since this c exhibiting various symptoms of the disease histamine are involved (allergy and gastric ulcer), for the development of therapeutic drugs and therapy for these diseases Useful as an animal model for Hereinafter, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
  • Example Example 1 Creation of a mouse producing high histamine.
  • a mouse cDNA library was screened using a human ribonucleotide probe synthesized based on the cDNA sequence of mouse HDC (FEBS Lett. 276: 214-218, 1990). I got This cDNA was inserted into a plasmid vector, pCAGGS, to construct an introduction vector pCAGGS-HDC (FIG. 1).
  • the HDC cDNA is placed under the control of the nitrile gamma actin promoter, and the HDC cDNA is expressed in various tissues of transgenic mice.
  • This gene transfer vector was digested with restriction enzymes Sail and Hindlll to remove a fragment of the vector to make it linear, and then injected into a fertilized oocyte of a BDF1 mouse by microinjection.
  • the transgenic fertilized eggs were turned into fine oviducts as described above, developed into individuals, and born.
  • transgenic mice were selected by Southern analysis according to a standard method using a ligated nucleotide fragment consisting of a partial sequence of mouse HDC cDNA as a probe. . The results are as shown in FIG.
  • Example 2 Measurement of the amount of histamine in transgenic mice
  • the amount of histamine and HDC activity in various organs were measured.
  • the amount of histamine was measured according to a known method combining high performance liquid chromatography and fluorescence measurement ( ⁇ Chromatog, 344: 115-123, 1985). That is, each tissue was crushed with a homogenizer X, treated with perchloric acid, centrifuged, a part of the supernatant was separated by high performance liquid chromatography, and the fluorescent dye 0-phthalaldehyde was added under alkaline conditions.
  • the amount of histamine was measured using the fluorescence intensity of the reaction product as an index.
  • HDC activity was measured by a histamine synthesis reaction using histidine as a substrate, according to a known method ( ⁇ Blochem. 107: 834-839, 1990). That is, each organ was crushed by sonication in a buffer for HDC reaction, and the crushed product was centrifuged. Then, the supernatant was separated and dialyzed overnight against a buffer for HDC reaction. After dialysis, histidine was added as a substrate, and histamine produced by reacting at 37 ° C. for 2 hours was measured by the above-mentioned method to determine the amount of HDC activity.

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Description

明細害 ヒスタミン高産生動物
技術分野 この出願の発明は、 ヒスタミン高産生動物に関するものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 体細胞染色体に外来性のヒスタミン合成酵素遺伝子が導入され た卜ランスジエニック動物であって、 体内においてヒスタミンを過剰に産生する動 物個体に関するものである。
背棄技術 ヒスタミン （histamine) は、 生体内にて作用する生体内活性物質 （才一夕コィ ド ·· autacoids) の一種であり、 生体内では皮虜、 肺、 消化管等に多く分布し、 ァレ ルギ一やアナフィラキシー時に放出され、 じんま疹ゃ炎症等の発症、 血液変化など に関係している。 また胃粘膜ではェンテロクロマフィン細胞中に存在して胃液の分 泌促進に重要な役割を果たしていることから、 胃潰瘍の発症に関係していることも 知られている。 このように、 ヒスタミンはヒ卜の様々な疾患や体調変化に関係しており、 その作 用メカニズムを解明することは、 ヒスタミン関連疾患等の治療法や治療薬剤の開発 に必須である。 そしてそれらの疾患や体調変化は、 生体内の様々な組織、 器官め相 互作用によって顕在化することから、 モデル動物を用いた in vivo系におけるヒスタ ミン作用の検討が不可欠である。 このような観点から、 この出願の発明者らは、 ヒスタミン合成酵素遺伝子をノッ クアウトした動物 （ヒスタミン欠如動物） を既に発明し、 特許出願している （特願 平 11 -246315 号） 。 しかしながら、 従来、 ヒスタミンを過剰に発現することのでき る動物個体は知られていない。 このため、 ヒスタミン過剰状態における動物個体の種々の症状を体系的に解析す ることのできるモデル動物系の開発が強く望まれていた。 またこのようなモデル動 物は、 ヒスタミンが関係する各種疾患に対する治療薬剤等の開発のための強力なッ ールとなるものと期待されていた。 この出願は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、 体内において ヒスタミンを過剰に産生するヒスタミン高産生動物を提供することを課題としてい る。
発明の開 i この出願は、 前記の課題を解決するための発明として、 ヒスチジン脱炭素酵素を コードするポリヌクレオチドを導入した全能性細胞を個体発生させて得られる非ヒ 卜動物およびその子孫勤物であって、 細胞染色体中に上記ポリヌクレオチドを保有 し、 体細胞においてヒスタミンを高レベルで産生することを特徴とするヒスタミン 高産生動物を提供する。 またこの発明においては、 非ヒ卜動物が、 マウスであることを好ましい態様とし ている。
図面の簡単な説明 図 1は、 実施例に用いた遺伝子導入べクタ一の構造を示した模式図である。 図 2は、 サザン解析により導入遺伝子の存在を確認した結果である。 図 3は、 ノザン解析にょリ導入遺伝子の発現組織を確認した結果である,
発明を実施するための最良の形態 この発明のトランスジエニック動物は、 公知の卜ランスジエニック動物作製法 (例えば、 Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77:7380-7384， 1980) に従って作成すること ができる。 すなわち、 ヒスチジン脱炭素酵素 （L-Histidine decarboxylase： H DC) を コードするポリヌクレオチド （以下、 「導入遺伝子」 と記載することがある） を非 ヒ卜動物の全能性細胞に導入し、 この細胞を個体へと発生させ、 体細胞のゲノム中 に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とする卜ランスジェ ニック動物を作製することができる。 非ヒ卜動物としては、 技術的には全ての動物 種を対象とすることが可能であるが、 特に近交系が多数作出されてぉリ、 しかも受 精卵の培養、 体外受精等の技術が整っているマウスが最適である。 導入遺伝子は、 HDCをコードするポリヌクレオチドを含む DNA断片である。 この' ようなポリヌクレオチドは、 公知のマウス HDCの cDNA (FEBS Lett. 276:214-218, 1990) や、 ラット HDCの cDNA (Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:733-737, 1990) を用いることができる。 また、 これらのマウスまたはラッ卜 cDNA に基づいて合成 された才リゴヌクレオチドプローブを用いて他の動物由来の cDNA ライブラリーを スクリーニング方法や、 オリゴヌクレオチドプライマーを用いた RT-PCR等にょリ 他の動物由来の HDC cDNAを得ることもできる。 また、 導入遺伝子には、 その発現 を制御するためのプロモーター配列ゃェンハンサー配列を連結する。 このプロモー 夕一 ェン八ンサー配列の選択によって、 HDC を全身性に発現させることもでき、 また特定の組織で選択的に発現させることもできる。 このような導入遺伝子は、 前記のポリヌクレオチドゃプロモーター Zェンハンサ 一配列を、 導-入遺伝子の発現調節に有効な位置関係となるように環状べクタ一 DNA に挿入連結することによって構築することができる。 そして、 このベクター DNA を 開列して直鎖状にした後、 全能性細胞に導入する。 遺伝子を導入する全能性細胞としては、 マウスの場合、 受精卵や初期胚を用いる ことができる。 また培養細胞への遺伝子導入法としては、 卜ランスジエニック動物 個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、 DNA の物理的注 入 （マイクロインジェクション） 法が最適である。 遺伝子を注入した受精卵は、 次に仮親の卵管に移植され、 個体まで発生し出生し た動物を里親につけて飼育させたのち、 体の一部 （マウスの場合には、 例えば、 尾 部先端） から DNAを抽出し、 サザン解析や PCR法により導入遺伝子の存在を確認 する。 導入遺伝子の存在が確認された個体を初代 （Founder) とすれば、 導入遺伝子 はその子 （F1 ) の 50%に伝達される。 さらに、 この F1 個体を野生型動物または他 の F1 動物と交配させることによリ、 2倍体染色体の片方 （ヘテロ接合） または両方 (ホモ接合） に導入遺伝子を有する個体 （F2) を作成することができる。 このようにして作出された卜ランスジエニック動物は、 全ての体細胞または特定 の組織において外来性の HDCを過剰発現し、 その結果、 ヒスタミンを高レベルで産 生する。 そして、 このトランスジエニック動物は、 ヒスタミンを高レベルで産生すること によって、 ヒスタミンが関与する各種の疾患症状 （アレルギーや胃潰瘍） を呈する c このため、 これら疾患の治療薬や治療法の開発のための動物モデルとして有用であ る。 以下、 実施例を示してこの発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、'こ の発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例 実施例 1 ： ヒスタミン高産生マウスの作成 マウス HDCの cDNA配列 （FEBS Lett. 276:214-218, 1990) に基づいて合成した 才リゴヌクレオチドプローブを用いてマウス cDNA ライブラリ一をスクリーニング し、 マウス HDC cDNAを得た。 この cDNAをプラスミドベクタ一 pCAGGSに揷入し、 導入ベクター pCAGGS-HDC を構築した （図 1 ) 。 この導入ベクターにおいては、 HDC cDNA はニヮ卜リ ■ガンマァクチンのプロモーターの支配下に配置されており、 卜ランスジエニックマウスの様々な組織で HDC cDNAが発現するようになっている。 この遺伝子導入ベクターを制限酵素 Sailおよび Hindlllで切断し、 ベクタ一断片を除去して 直鎖状とした後、 マイクロインジェクション法により BDF1系マウスの受精卵雄に注入した。 遺伝子導入受精卵は 去に従って繊の卵管に^ し、 個体へと発生させ出生させた。 得られたマウス個体の尾部から DMA を抽出して EcoRI で消化した後、 マウス HDC cDNA の部分配列からなる才リゴヌクレオチド断片をプローブとして用い、 定 法に従ってサザン解析により 卜ランスジエニックマウスを選別した。 結果は図 2に 示したとおりである。 野生型 （WT) マウスでは内因性 HDC 断片 （約 8.0kb、 4.8kb) が検出されたのに対し、 卜ランスジエニックマウス （TG) では、 これらの内 因性遺伝子断片に加え、 約 2.0kbの導入 HDC断片が検出された。 以上の結果から、 マウス No. 641 および No. 642が導入遺伝子を染色体上に有する卜ランスジェニッ クマウスであることが確認された。 さらに、 これらのトランスジ; Lニックマウスについて導入遺伝子の組織発現をノ ザン解析により検討した。 結果は図 3に示したとおりであり、 卜ランスジエニック マウス （T) では検査したほとんど全ての組織 （腎臓、 肝臓、 脳、 胃、 肺） にお て 導入 HDC遺伝子の過剰発現が観察された。
実施例 2 ： 卜ランスジエニックマウスにおけるヒ.スタミン量の測定 実施例 1で作成した卜ランスジエニックマウスと野生型マウス （No. 646 および No. 647) について、 各種臓器 （大脳皮質、 中脳、 腎臓、 胃） におけるヒスタミン量 と、 HDC活性を測定した。 ヒスタミン量の測定は、 高速液体クロマトグラフィーと蛍光測定法を組み合わせ た公知の方法 （丄 Chromatogに 344:115-123， 1985) に準拠して行った。 すなわち、 各組織をホモジ Xナイザーで破砕後、 過塩素酸で処理し、 遠心分離した後、 その上 清の一部を高速液体クロマトグラフィーで分離し、 アルカリ条件下で蛍光色素 0- phthalaldehyde を加えて反応させ、 反応物の蛍光強度を指標としてヒスタミン量を 測定した。 また HDC活性は、 公知の方法 （丄 Blochem. 107:834-839, 1990) に基づき、 ヒス チジンを基質としたヒスタミンの合成反応により測定した。 すなわち、 各臓器を HDC 反応用の緩衝液内で超音波処理により破砕し、 この破砕物を遠心処理後、 上清 を分離し、 HDC 反応用の緩衝液で一晩透析した。 透析後、 し—ヒスチジンを基質と して加え、 2時間、 37°Cで反応させて生成されたヒスタミンを上記の方法により測 定し、 HDC活性量とした。 結果は表 1 (HDC 活性） および表 2 (ヒスタミン量） に示したとおりである。 測 定した全ての臓器において、 HDC 活性 （表 1の HDC act.および平均値 AVG) およ びヒスタミン量 （表 2の pmol/gおよび平均値 AVG) とも、 野生型マウスに比べ、 卜 ランスジエニックマウスにおいて増加していた。 この結果から、 実施例 1で作成し た HDC 卜ランスジエニックマウスが、 ヒスタミン高産生マウスであることが確認さ れた。 表 1
Histidine+ .Histidine - (+--) mg prot. HDC act. AVG TG/wild
641 cortex 640.4734 6.521087 646.9945 0.5103 10.56559 5.927722 20.79827
642 cortex 76.91173 2.708377 79.6201 0.5144 1.289854'
646 cortex 18.19627 1.402746 19.59902 •0.51145 0.319337 0.28501
647 cortex 9.672152 2.046287 11.71844 0.38955 0.250683
641 mid. 225.595 2.007538 227.6026 0.27435 6.913389 6.358457 17.59877
642 mid. 189.3318 1.488071 190.8199 0.274 5.803525
646 mid. 9.147402 1.345798 10.4932 0.2445 0.357641 0.361301
647 mid. 9.336193 2.116288 11.45248 0.2615 0.364961
641 kidney 2227.092 457.7291 2684.821 1.2995 17.21701 14.82442 0.977838
642 kidney 1703.095 382.4702 2085.565 1.398 12.43184
646 kidney 1997.341 499.9867 2497.327 1.1965 17.39328 15.16041
647 kidnev 1635.964 213.1143 1849.078 1.19195 12.92754
641 st. 1320.89 15.10884 1335.999 0.5609 19.84904 17.79592 30.04573
642 st. 850.4966 7.454651 857.9513 0.45415 15.7428
646 st. 22.22755 0 22.22755 0.4385 0.422416 0.592294
647 st. 40.06894 0 40.06894 0.4381 0.762173
表 2
Sample Area pmol/ml g pmol/g AVG TG/Wild
Cort-641 . 2960809 536.2428 0.20726 2587.295 1908.832 7.463778
Cort-642 1436794 260.2229 0.2115 1230.368
Cort-646 153844 27.86324 0.2039 136.6515 255.746
Cort-647 342526 62.03612 0.1655 374.8406
Mid-641 2033368 368.2706 0.12566 2930.691 2334.818 8.820128
Mid-642 967822 175.2857 0.1008 1738.946
Mid-646 130723 22.66251 0.0939 241.3472 264.7148
Mid-647 194921 33.79205 0.1173 288.0823
Kid - 641 46432775 8049.716 0.2889 27863.33 27671.44 2.137994
Kid - 642 68428289 11862.92 0.4317 27479.55
Kid - 646 27439878 4757.054. 0.2845 16720.75 12942.71
Kid— 647 14162296 2455.215 0.2679 9164.671
Stom-641 35450278 6420.527 0.14365 44695.63 40493.66 1.335019
Stom-642 44063738 7980.542 0.2199 36291.69
Stom-646 40388951 7314.988 -0.2175 33632.13 30331.9
Stom-647 18775969 3400.583 0.1258 27031.66

Claims

請求の範囲
1 . ヒスチジン脱炭素酵素をコードするポリ.ヌクレオチドを導入した全能性細胞 を個体発生させて得られる非ヒ卜動物およびその子孫動物であって、 細胞染色体中 に上記ポリヌクレオチドを保有し、 体細胞においてヒスタミンを高レベルで産生す ることを特徴とするヒスタミン高産生動物。
2 . 非ヒ卜動物が、 マウスである請求項 1のヒスタミン高産生動物。
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