JP2001218539A - Ｎａｉｐトランスジェニック動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト・アポトーシス抑制タンパク質ＮＡＩＰ
を発現するトランスジェニック動物を提供する。 【解決手段】 ヒト・アポトーシス抑制蛋白質ＮＡＩＰ
をコードするポリヌクレオチドを導入した全能性細胞を
個体発生して得られる非ヒト動物およびその子孫動物で
あって、染色体中に上記ポリヌクレオチドを保有し、体
細胞においてＮＡＩＰを発現することを特徴とするトラ
ンスジェニック動物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、ヒト・ア
ポトーシス抑制タンパク質ＮＡＩＰをコードするポリヌ
クレオチドを導入したトランスジェニック動物に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】アポトーシス（apoptosis）
は、プログラムされた細胞死の一種であり、周囲の細胞
との接触の欠乏、細胞質の濃縮化、エンドヌクレアーゼ
の活性に関連したクロマチンの凝縮および核凝縮、核の
断片化、膜被包性球状小体化、隣接するマクロファージ
もしくは上皮細胞などによる球状小体の貪食、またはエ
ンドヌクレアーゼ活性によりＤＮＡのヌクレオソーム単
位が180〜200塩基長のＤＮＡに断片化するといった現象
が観察され、このような現象が認められるアポプティッ
ク体細胞の最終断片が隣接する細胞により貪食される機
構として論じられている（例えば、Immunology Today
7:115-119, 1986； Science 245:301-305, 1989）。

【０００３】このアポトーシスを制御する遺伝子として
しては、例えば、1985年に胞性Ｂ細胞腫から発見された
ガン遺伝子のひとつであるbcl-2遺伝子が知られてい
る。このbcl-2遺伝子は、免疫系や神経性の細胞で高頻
度に発現しており、この遺伝子の発現産物はこれら細胞
のアポトーシスを抑制することによって、ヒトの免疫機
能や神経系機能の恒常性を維持していると考えられてい
る。また、このbcl-2遺伝子は、胎児では特に広範囲に
は発現していることから、個体発生の際の形態形成にも
重要な役割を果たしていると考えられてもいる。

【０００４】一方、この出願の発明者等は、家族性の遺
伝病である脊髄性筋萎縮症候群（Spinal Muscular Atro
phy：ＳＭＡ）の原因遺伝子として、ヒト染色体5q13.1
領域より神経細胞アポトーシス抑制蛋白質（Neuronal A
poptosis Inhibitory Protein：ＮＡＩＰ）遺伝子を単
離し（Roy et al., Cell 80: 167-178, 1995）、また特
許出願している（PCT/CA95/00581）。すなわち、このＮ
ＡＩＰ遺伝子の変異またはコピー数の減少が脊髄ニュー
ロンのアポトーシスを生じさせ、これがＳＭＡ発症の原
因となると想定されている。また、このＮＡＩＰ遺伝子
を種々の培養細胞に導入し、アポトーシスを誘起させる
刺激を細胞に与えたところ、その細胞死が抑制されるこ
とが明らかにされ（Liston et al., Nature 379:349-35
3, 1996）、ＮＡＩＰが神経細胞だけではなく、体細胞
全体のアポトーシス抑制因子であることが明らかにされ
ている。

【０００５】そしてこの出願の発明者等は、ＮＡＩＰを
コードするｃＤＮＡを単離し、既に特許出願している
（特開平11-116599号公報）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】以上のとおり、ＮＡＩ
ＰはＳＭＡをはじめとする各種アポトーシス性疾患に関
与する蛋白質であり、それらの疾患の発症メカニズムの
解明、発症の危険性の診断、発症の予防もしくは病態の
改善、治療のための医療技術および薬剤の開発等のため
には、ＮＡＩＰの発現レベルと細胞アポトーシスとの関
係を個体レベルで解析可能なモデル動物の存在が不可欠
である。

【０００７】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであって、体細胞においてヒトＮＡ
ＩＰを発現するトランスジェニック動物を提供すること
を課題としている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この出願は、上記の課題
を解決するための発明として、ヒト・アポトーシス抑制
蛋白質ＮＡＩＰをコードするポリヌクレオチドを導入し
た全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物および
その子孫動物であって、染色体中に上記ポリヌクレオチ
ドを保有し、体細胞においてＮＡＩＰを発現することを
特徴とするトランスジェニック動物を提供する。

【０００９】このトランスジェニック動物においては、
非ヒト動物がマウスであることを好ましい態様としてい
る。また、この出願は、前記のトランスジェニック動物
から単離された細胞を提供する。

【００１０】さらにこの出願は、前記の動物または細胞
を対象として、アポトーシス抑制剤または促進剤をスク
リーニングする方法を提供する。以下、これらの発明に
ついて、実施形態を詳しく説明する。

【００１１】

【発明の実施の形態】この発明のトランスジェニック動
物は、公知のトランスジェニック動物作製法（例えば、
Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77;7380-7384, 1980）に
従って作成することができる。すなわち、ＮＡＩＰをコ
ードするポリヌクレオチド（以下、「導入遺伝子」と記
載することがある）を非ヒト動物の全能性細胞に導入
し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に
導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって
目的とするトランスジェニック動物を作製することがで
きる。非ヒト動物としては、技術的には全ての動物種を
対象とすることが可能であるが、特に近交系が多数作出
されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が
整っているマウスが最適である。

【００１２】導入遺伝子は、ＮＡＩＰをコードするポリ
ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片である。このポリヌクレ
オチドは公知のＮＡＩＰｃＤＮＡ（特開平11-116599号
公報）の任意部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレオ
チドを合成し、これをプローブとして用いてヒトｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングする方法や、目的とす
るｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチドを合成し、これをプライマーとして用いてヒ
ト細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により
調製することもできる。また、導入遺伝子には、その発
現を制御するためのプロモーター配列やエンハンサー配
列を連結する。このプロモーター／エンハンサー配列の
選択によって、ＮＡＩＰを全身性に発現させることもで
き、また特定の組織で選択的に発現させることもでき
る。

【００１３】このような導入遺伝子は、前記のポリヌク
レオチドやプロモーター／エンハンサー配列を、導入遺
伝子の発現調節に有効な位置関係となるように環状ベク
ターＤＮＡに挿入連結することによって構築することが
できる。そして、このベクターＤＮＡを開列して直鎖状
にした後、全能性細胞に導入する。

【００１４】遺伝子を導入する全能性細胞としては、マ
ウスの場合、受精卵や初期胚を用いることができる。ま
た培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニ
ック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効
率を考慮した場合、ＤＮＡの物理的注入（マイクロイン
ジェクション）法が最適である。

【００１５】遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵
管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につ
けて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例
えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰ
ＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認する。導入遺伝子
の存在が確認された個体を初代（Founder）とすれば、
導入遺伝子はその子（Ｆ１）の50%に伝達される。さら
に、このＦ１個体を野生型動物または他のＦ１動物と交
配させることにより、２倍体染色体の片方（ヘテロ接
合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体
（Ｆ２）を作成することができる。

【００１６】このようにして作出されたトランスジェニ
ック動物は、全ての体細胞または特定の組織においてヒ
トＮＡＩＰを過剰発現する。このため、アポトーシス抑
制剤や促進剤をスクリーニングするモデル動物として有
用である。例えば、一時的な脳虚血による海馬ニューロ
ン等のアポトーシスに対する抑制効果を判定することに
よって、ヒト神経変性疾患（老化、脳血管障害、ＳＭＡ
等）の治療薬剤を特定することができる。また、ＮＡＩ
Ｐは生殖系や造血系組織で発現し、機能することが知ら
れているので、排卵の制御剤や白血病治療薬等のスクリ
ーニングに使用することもできる。あるいはまた、この
トランスジェニック動物は、特定の細胞に細胞死を多発
するような疾患モデル動物との交配により、個体レベル
での解析に用いることもできる。

【００１７】さらに、薬物スクリーニングは、トランス
ジェニック動物を用いたin vivoの系で行うこともでき
るが、この動物から単離された細胞を対象として行うこ
ともできる。また、このトランスジェニック動物がブタ
等の大型の動物である場合には、単離された細胞は、例
えば移植等の生体材料としても利用できる。このような
生体材料としての細胞は、ＮＡＩＰを過剰発現している
ために、アポトーシスに対して抵抗性を示し、移植後に
も長期間生存することができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細
に説明するが、この発明は以下の例に限定されるもので
はない。 実施例１：トランスジェニックマウスの作製 ヒトＮＡＩＰｃＤＮＡのＣＤＳ領域を含むポリヌクレオ
チド（特開平11-116599号公報の配列番号３の位置180−
4950）を調製した。このポリヌクレオチドの5'端にウサ
ギβグロビンのイントロンカセットを連結し、さらにそ
の上流にラットのチロシン水酸化酵素遺伝子のプロモー
ター配列を連結した。また、ＮＡＩＰポリヌクレオチド
下流にはウサギβグロビンのポリアデニル化シグナルを
連結した（図１参照）。このようにして調製した導入遺
伝子をベクター（Bluescript IISK⁺）のクローニング部
位BssHII／BssHII）に挿入結合し、導入ベクターを構築
した。

【００１９】この遺伝子導入ベクターをBssHIIで切断
し、ベクター断片を除去して、図１の導入遺伝子断片を
得た。導入遺伝子断片は、マイクロインジェクション法
により系統Ｂ６マウスの受精卵前核に注入した。遺伝子
導入受精卵は定法に従って仮親の卵管に移植し、個体へ
と発生させ出生させた。

【００２０】得られたマウス個体の尾部からＤＮＡを抽
出し、ヒトＮＡＩＰｃＤＮＡの配列（特開平11-116599
号公報の配列番号３の位置3730−4946)を含むヌクレオ
チド断片をプローブとして用い、定法に従ってサザン解
析によりトランスジェニックマウスを選別した。2 μg
のＤＮＡを制限酵素SpeIにより切断し、アガロースゲル
電気泳動により展開した後、ナンロンメブレン上に転写
してハイブリザイゼーションを行った。プローブＤＮＡ
10 ngはランダムプライマーによる伸長反応によって^P32
アイソトープラベルした。ハイブリダンゼーションの条
件は、68℃１晩、メンブレンの洗浄は2XSSC、0.1%ＳＤ
Ｓ溶液を用いて65℃で行った。シグナルはＸ線フィルム
に感光して検出した。

【００２１】図２はサザンブロットの結果の一例であ
る。マウス番号１５Ｌから抽出したＤＮＡ（レーン８）
と正常マウスから同様に抽出したＤＮＡ（レーン７）、
さらに導入された遺伝子のコピー数を推定するために正
常マウスから同様に抽出したＤＮＡに導入遺伝子を一定
量混入した試料を用いた（レーン１から６）。この結果
から、１５Ｌは導入遺伝子をもつトランスジェニックマ
ウスであること、導入遺伝子の推定コピー数は約10であ
ることが確認された。

【００２２】実施実施例２：トランスジェニックマウス
の遺伝子発現の検討 例１で得たトランスジェニックマウス１５Ｌの副腎およ
び嗅球における導入遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲおよび
ウエスタンブロット解析により調べた。

【００２３】ＲＴ−ＰＣＲは次の方法で行った。10-30
mg程度の組織をとり、少量のＲＮＡ抽出システムRneasy
（Qiagen）を用いてＲＮＡ抽出を行った。得られたＲＮ
Ａ2μgをとり、First strand synthesis kit（GIBCO BR
L）を用いてｃＤＮＡを合成し、合成量の８分の１をＰ
ＣＲに用いた。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は各
々、導入遺伝子の構造（図１）のうちウサギβグロビン
イントロンカセットに含まれるエクソン配列の一部（配
列番号１）およびＮＡＩＰｃＤＮＡの配列の一部（配列
番号２）である。ＰＣＲ反応はrTaq polymerase（TaKaR
a）の手順書に従い、rTaq polymerase（ U）、各プ
ライマー0.25 μM、反応溶液50 μl、ＰＣＲプログラム
は[94℃／２分間]を１回、[94℃／20秒間、55℃／30秒
間、72℃／90秒間]を30回、[72℃／7分間]を１回、４℃
保温の条件で行った。得られたＰＣＲ産物はアガロース
ゲル電気泳動により展開し、エチジュウムブロマイド染
色を行って検出した。

【００２４】ウエスタンブロット解析には、10-30 mg程
度の組織をとり、8 M urea、1 mM EDTA、1 mM DTTを含
む50 mM Tris-HCl(pH 8.0)に溶解してホモジェネイトし
てタンパク溶解液を調製し使用した。調製試料の5 μg
を用いてSDSゲル電気泳動を行い、続いてPVDF膜上に転
写した。転写後のPVDF膜は、10%スキムミルク、0.05% T
ween 20を含むTBSで４℃で一晩処理後、0.05% Tween 20
を含むTBS(TBST)で洗浄し、抗NAIPポリクローナル抗体
をTBSTで２５０倍に希釈し、室温で２時間反応させた。
続いて、TBSTで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ
Igを室温で１時間反応させ、TBSTで洗浄し、ECL PLUS試
薬(Amasham-Pharmacia社製)で処理し、X線フィルムに露
光してシグナルを得た。

【００２５】結果は図３および図４に示したとおりであ
る。ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析で、マ
ウス１５Ｌの副腎および嗅球いずれにおいても、導入遺
伝子ＮＡＩＰに由来する特異的なシグナルが検出された
（図３レーン１、３および図４レーン１、２）。

【００２６】これらの結果から、得られたトランスジェ
ニックマウスで導入遺伝子が発現していることが確認さ
れた。

【００２７】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願に
よってヒトのアポトーシス抑制タンパク質ＮＡＩＰを発
現するトランスジェニック動物が提供される。このトラ
ンスジェニック動物は、アポトーシスのメカニズムやそ
れに対するＮＡＩＰの役割をより詳細に検討するたのめ
材料としてだけではなく、ヒト・アポトーシス性疾患の
治療薬のスクリーニングにも有用である。

【００２８】

【配列表】 <110> Japan Science and Technology Corporation <120> ＮＡＩＰトランスジェニック動物 <130> NP99306-YS <160> 2 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized oligonucleotide <400> 1 GATCCTGAGA ACTTCAGG 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized oligonucleotide <400> 2 GGCTACAGCA GAAGCACTGA 20

【図面の簡単な説明】

【図１】トランスジェニックマウスの作成に用いた導入
遺伝子の構成図である。

【図２】サザンブロットによるトランスジェニックマウ
スにおける遺伝子導入の確認と推定コピー数の解析結果
である。

【図３】ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子ｍＲＮＡの発現
の確認結果である。

【図４】ウエスタンブロットによるＮＡＩＰ発現の確認
結果である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/50 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 池田 穣衛 東京都目黒区上目黒５−31−１ (72)発明者 酒井 治美 神奈川県厚木市元町１−20 シャトレ・ス トンリバーＩＩ207 (72)発明者 権藤 洋一 神奈川県伊勢原市上粕屋246−１−507 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 BB60 CB01 CB17 DA36 DA80 GC30 4B024 AA11 CA04 DA02 EA04 GA12 GA18 4B065 AA90X AA93Y AC14 BA04 CA24 CA46 4C084 AA17 ZA022 ZA362 ZA812 ZA942 ZB212 ZB272

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト・アポトーシス抑制タンパク質ＮＡ
   ＩＰをコードするポリヌクレオチドを導入した全能性細
   胞を個体発生して得られる非ヒト動物およびその子孫動
   物であって、染色体中に上記ポリヌクレオチドを保有
   し、体細胞においてＮＡＩＰを発現することを特徴とす
   るトランスジェニック動物。
2. 【請求項２】 非ヒト動物がマウスである請求項１のト
   ランスジェニック動物。
3. 【請求項３】 請求項１または２のトランスジェニック
   動物から単離された細胞。
4. 【請求項４】 請求項１または２の動物に対して、出生
   前または出生後に候補物質を投与し、細胞アポトーシス
   の変化を指標としてアポトーシス抑制剤または促進剤を
   スクリーニングする方法。
5. 【請求項５】 請求項３の細胞の培養培地に候補物質を
   添加し、細胞アポトーシスの変化を指標としてアポトー
   シス抑制剤または促進剤をスクリーニングする方法。