JPH022346A - 遺伝子導入真核生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は、遺伝子導入真核生物に関するものである。

さらに詳しくは、この発明は、病態モデル動物、有用動
物、実験生物等として有用な、遺伝子導入によって改変
作出してなる遺伝子導入真核生物に関するものである。

（背景技術） 生物は農業、畜産業、工業等種々の分野において利用さ
れているか、それら生物をより有用なものとするため、
新しい遺伝形質を導入、固定する生物の遺伝的改良がす
すめられている。

このような生物の遺伝的改良方法としては、従来より交
配と優良個体の選抜とを繰り返す方法、あるいは突然変
異を誘起しその突然変異を利用する方法等が知られてい
る。

しかしながら、交配と優良個体の選抜とを繰り返す従来
の方法は新たな遺伝形質の固定に長期間を必要とし、ま
た、突然変異を利用する方法は、偶然に起こる’ａ（入
子の変異を利用するものなので、特定の、かつ、所望の
形質は確率論的にしか得ることができない。

このような従来の方法に対して、近年、分子生物学、遺
伝子工学等の発展により、人為的に生物の遺伝子を制御
し、その発現を改変することが可能になってきた。当初
この遺伝子工学的手法の研究は単細胞微生物に対して広
く行われてきたが、今日では高等生物に対してらすすめ
られており、その形質の改変が様々なアプローチによっ
て試みられている。

たとえば、外来性遺伝子ＤＮＡを染色体の一部に安定的
に組み込んだ遺伝子導入動物 （ｔｒａｎｓａｅｎｉｃ　ａｎｉｌａｌ　　）がカート
ンらにより報告（Ｐｒｏｃ、Ｎａ口、へｃａｄ、ｓｃｉ
、Ｕｓ＾、７７巻、７３８０頁、１９８０年）されて以
来、種々の遺伝子導入動物が報告されている。

また、特頭昭６０−１３４４５２号（特開昭６ｌ−８１
７４３）には、活性化Ｉｌ！１８瘍逍伝子配列を有する
′ｉｉ伝子導子導入動物示されてもいる。

これらの遺伝子導入動物は、宿主動物の全能性細胞（潜
在的に全ての細胞に分化する能力を有する細胞）として
の生殖系細胞、特に受精卵に、外来遺伝子ＤＮＡを導入
し、それを信組の子宮にもどして正常な発生を続けさせ
ることにより産出させるものである。こうして産出させ
た遺伝子導入動物は、導入した外来性遺伝子をメンデル
の法則に従って子孫に伝達すると期待されるので、形質
改良生物として注目されている。

このような遺伝子導入動物の産出に用いる遺伝子として
は、受精卵を通してβ−グロビン等の遺伝子を導入した
例（Ｔ、Ｅ、Ｉ４ａｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、　７８巻
、５０１６頁、１９８１年）に見られるようなゲノム遺
伝子そのものと、マウスメタロチオネイン■のプロモー
ターにラットの成長ホルモン遺伝子を結合し導入した例
（１？、　Ｄ。

Ｐａ１ｌｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　３
００巻、６１１頁、１９８２年）に見られるような異種
プロモーターと構造遺伝子からなる人工的組換え遺伝子
とが知られている。

しかしながら、これらの遺伝子を用いることにより特定
の形質を発現させることはできるようになるが、内在性
遺伝子の働きを人為的に制御し、所要の効果を発現させ
るようにすることには成功していない。

一方、内在性遺伝子の働きを制御する方法として、近、
年、アンチセンス遺伝子を利用することが提案されてい
る。

このアンチセンス遺伝子とは、特定の機能を持つ遺伝子
（ＤＮＡ）から転写されるＲＮＡ　（センスＲＮＡ）と
一部または全部にわたって相補的な塩基配列を持つＲＮ
Ａ　（アンチセンスＲＮＡ）か潜在的に転写されるよう
にした遺伝子（ＤＮＡ）である。

一般に、転写の際に、遺伝子の片方のＤＮＡ鎖から、セ
ンスＲＮＡが転写され、翻訳されて特定の蛋白質が産生
されるのに対して、相補鎖からはアンチセンスＲＮＡが
転写、翻訳されることはない、実際、自然界の真核生物
においては、ウィルスゲノムを除いてはアンチセンスＲ
ＮＡが転写、翻訳されたという例はこれまでに見出ださ
れていない。

これに対して、近年、アンチセンス遺伝子を人為的に細
胞に導入してアンチセンスＲＮＡを産出させ、そのアン
チセンスＲＮＡによりセンスｍＲＮＡの発現を選択的に
制御するという研究がすすめられている。

たとえば、特定の遺伝子とそれに対応するアンチセンス
遺伝子を共に細胞に導入し、センスｍＲＮＡの発現を抑
制した例としては、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂらが、チミジン
キナーゼ活性欠損（ＴＫ　　）マウスＬ　（ＬＴＫ　　
）　ＡＩ胞にヘルペスウィルスのセンス３Ｘ！ｉ伝子と
アンチセンスＴＫ３ｆｌ伝子を１：１００ちしくは１：
２００の割合で導入した場合に、センス’Ｔ’　Ｋ遺伝
子の発現を通して見られるＬ’Ｔ’Ｋ　　４［１１胞の
生存率がアンチセンスＲＮＡに阻害されること　　（Ｊ
、７．］ｚａｎｔ　　ａｎｄ　　Ｗａｉｎｔｒａｕｂ、
Ｃｅ１ｌ、３６　　巻　、　　１００７頁、１９８４年
）、原核生物由来のタロラムフェニコールアセチル転移
酵素遺伝子の発現による酵素活性がそのアンチセンス遺
伝子の導入により抑制されること（１４ｅｉｎｔｒａｕ
ｂ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｒｅｎｄｓ　１ｎＧｅｎｅｔｉｃ
ｓ、１巻、２２頁、１９８５年）、さらには、β−グロ
ビンのセンスｍＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとをカエル
の卵細胞内に導入することによりセンスｍＲＮＡとアン
チセンスＲＮＡとの間に二重鎖を形成しβ−グロビンの
合成が抑制されること（口、八、Ｈｅ１ｔｏｎ、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８２巻、１４４頁、１９８５年）等が報告さ
れている。

さらに、特定の遺伝子とそれに対応するアンチセンス遺
伝子を共に細胞に導入するのではなく、アンチセンス遺
伝子のみを細胞に導入し、内在性遺伝子の発現を抑制し
た例としては、弁上らが大腸菌の細胞外膜蛋白であるＯ
ｎｐ　Ｆについて、アンチセンスＯ＋ａｐ　Ｆと想定さ
れる１７０塩基からなる配列（ｎ＋ｃＦ）を染色体中に
見出だし、そのｎｉｃ　Ｆを多コピープラスミドにクロ
ーニングし、大腸菌に導入することにより、Ｏｎｐ　Ｆ
の合成を阻害したという例（Ｔ、Ｈｉｚｕｎｏ　ｅｔ　
ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１巻、１９６６頁、１９８４年）　
、Ｐａ５ｔｋａらが大腸菌のＩａｃ　Ｚオペロン酵素の
合成を阻害できることを示した例（Ｓ、Ｐｅ５ｔｋａ　
ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ｔｌｓＡ、８１８．７５２５頁、１
９８４年）が報告されている。これらの例においては、
アンチセンス遺伝子はセンス遺伝子の５′末ｆ！ＮＡｆ
ｆｌＩをカバーすることが重要であり、また、アンチセ
ンス遺伝子は数十塩基であってもセンス３Ｘ！ｉ伝子の
発現を抑制できることが注目される。

しかしながらこのようなアンチセンス遺伝子の導入によ
る内在性遺伝子の発現の抑制は、いずれら原核生物に対
してなされたものであり、遺伝子の発現系か異なる真核
生物に対しては成功していない。

その理由は、原核生物か細胞内に膜構造を持たず、その
遺伝子は細胞内の部位によって異なることなく一様に存
在すること、そこでセンスｍＲＮＡの翻訳の抑制に関し
てはアンチセンスＲＮＡとセンスｍＲＮＡとの量比が重
要であると考えられることに対して、真核生物では細胞
の膜構造が重要なｌｌ！能を果たしており、遺伝子の発
現過程が原核生物のように単純なものではない、〜ｉど
による。

すなわち、真核生物の細胞においては、ｍＲＮＡは細胞
内の核や小胞体に局在し、しかも、核内に存在するｍＲ
ＮＡは転写され、スプライシングを受けたのち細胞質内
に移行し、主として小胞体で翻訳がなされる。また、多
細胞生物では細胞や組織ごとに内在性遺伝子の発現量も
異なる。このため原核生物に導入したような単純な構造
の遺伝子を導入しても、真核生物においては内在性遺伝
子の発現を良好に抑制することはできないのである。

そこで、真核生物においてもアンチセンス遺伝子の導入
により内在性遺伝子の発現の制御をできるようにするこ
とが望まれていた。

（発明の目的） この発明は、以上のような事情に鑑みてなされたもので
あり、従来の内在性遺伝子の発現の制御に関する課題を
解決し、アンチセンス遺伝子を導入して内在性遺伝子の
発現を制御してなる遺伝子導入真核生物とその作出方法
を提供することを目的としている。

（発明の開示） 上記の目的を実現するため、この発明の遺伝子導入真核
生物は、アンチセンス遠１云子を真核生物の分化全能性
を有する細胞に導入し、内在性Ｗ転子の発現を制御して
なることを特徴としている。

アンチセンス遺伝子導入真核生物を産出するのに使用す
るアンチセンス遺伝子としては、この発明は、特に、真
核生物に導入することにより内在性遺伝子の発現するＲ
ＮＡに対して全部または部分的に相補的であるアンチセ
ンスＲＮＡを発現するアンチセンス遺伝子を提供する。

また、この発明のアンチセンス遺伝子は、単に内在性遺
伝子と相補的な配列を有しているだけではなく、真核生
物において有効に発現するように内在性遺伝子が発現し
ている組織または細胞と同所性に働くプロモーターおよ
び／またはエンハンサ−を有していることも特徴として
いる。このようなアンチセンス遺伝子は、たとえばマウ
スのミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）センス遺伝子に対
するアンチセンス（ＭＢＰアンチセンス）遺伝子として
形成できる。アンチセンス遺伝子は、プロモーターおよ
び／またはエンハンサ−とともにイントロン領域および
転写開始部位を有するように形成することが好ましい。

この発明のアンチセンス遺伝子を真核生物の分化全能性
を有する細胞、特に動物の場合には卵細胞等の生殖系列
の細胞に導入することにより、アンチセンス遺伝子かヘ
ミ接合あるいはホモ接合で保持された、内在性遺伝子の
発現を制御した真核生物を得ることができる。その改変
された表現型は、真核生物の子孫に至るまで安定に伝達
されるようにすることができる。

次に、この発明の実施例を示す、以下の実施例において
は、アンチセンス遺伝子の導入により発現を抑制する真
核生物の内在性遺伝子をマウスのＭ　Ｂ　Ｐ　３肯１云
子としな。

まず、このマウスのＭＢＰ遺伝子について説明すると、
このＭＢＰＩｔ伝子はマ転子１８番染色体上にあり、ミ
エリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）を産出させる内在性遺伝
子である。

ＭＢＰは、多層の膜（ラメラ）構造を形成して神経軸索
を取り巻き、神経情報の伝達を促進させるミエリンの主
要構成物質の一つである。なお、ミエリンは、中枢神経
系においては稀突起膠細胞（オリゴデンドロサイト）が
突起を神経細胞の軸索に伸長しそれらを取り巻きミエリ
ン鞘を形成する際に産生じ、末梢神経系においてはシュ
ワン細胞か産生ずる。またマウスの成体の中枢神経系の
ミエリンには、少なくともそれぞれ２１５００．１８０
（）０．１７５００．１４０００ダルトンの分子量を持
つ４種の異なる構造のＭＢＰの亜をが、１：１０：３．
５：３５の量比で存在する。これらのＭＢＰは、いずれ
も単一のＭＢＰ３ｆｉ伝子から転写された初期転写産物
が異なった形にスプライシングされた結果できる別々の
ｍＲＮＡが翻訳され産出されるものである。

このようなＭＢＰを産出させるマウスのＭＢＰ遺伝子の
場合には劣性突然変異としてシバラー変異が生じる。こ
のシバラー変異をホモ接合型にもつマウスは、ＭＢＰの
欠損と、はとんど全ての中枢神経系におけるミエリン形
成不全という特徴を持っている。このマウスは、誕生後
２週間目明から神経障害である企図振戦症を呈し、週齢
が進むにしたがって強烈な痙撃を起こし、正常なマウス
よりも早く死亡するという特徴を有している。

そこで、以下に示す実施例においては、マウスにＭＢＰ
アンチセンス遺伝子を導入してＭＢＰ欠損を起こさせ、
シバラー変異による企図振戦症と同様の症状を発現させ
る。

実施例　１：マウスのＭＢＰアンチセンス遺伝子の作成 マウスのＭＢＰアンチセンス逍伝子転子成過程を第１図
に示す。

まず、（ａ）マウスのＭＢＰの酋小分子種に対応するｃ
ＤＮＡがクローン化されているｐＭＢＰ２（Ｈｌに１ｌ
ｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｎ、、４
４巻、６９２頁、１９８５年）を制限酸素Ｐｓｔ　Ｉで
処理し、得られた場所から電気泳動によりＭ　Ｂ　Ｐ遺
伝子をコードする領域を含む１．２ｋｂ　（ｋｂ　：　
１０００塩基）の断片で早耳し、この両端を７４ＤＮＡ
ポリメラーゼで消化して平滑末端にした。一方、（ｂ） ｃＤＮＡの発現ベクターであるｐＫＣＲＨ２（旧５ｈｉ
ｎａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３０７巻、６０４
頁、１９８４年）のβ−グロビン遺伝子領域をｔｌｉｎ
ｄｌ［で処理し、Ｋｌｅｎｏｗ酸素で断端の相補鎖を合
成して平滑木端にした後に、（ｃ）上記ＭＢＰ遺伝子を
コードする断片の平滑末端化したものと平滑末端結合（
ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。こ
の際に、ＭＢＰのｃＤＮＡが本来の読み取り方向に対し
て逆向きのアンチセンスに配向するように結合したクロ
ーンを選択した。

（ｄ）このクローンを分離した後に、ＭＢＰアンチセン
スｃＤＮＡ領域を含むＢａｎ　Ｈｌ−３ａｔ断片を切り
出し、ｐ　Ａ　Ｔ　１５３　（Ａ、Ｊ、Ｔｗｉ（］（ｌ
　ａｎｄＤ、Ｓｃｔ＋ｅｒｒａｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ、２
８３巻、２１６頁、１９８０年）のＢａＩＩＨＩ　−３
ａｔ　Ｉ領域と入れ換える（ｐＡＴ１５３Ｂｓ）。

（ｅ）一方、マウスのミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ＞
遺伝子のプロモーター領域１．３ｋｂを含む３．６ｋｂ
のＭＢＰ３ｆｌ伝子がクローン化されているｐＭ　Ｐ　
１を制限酵素Ｎｃｏ　Ｉで処理し、ベクターを含む断片
を精製したあと、ＤＮＡ分解酵素Ｂａｌ　３１で末端か
ら翻訳開始コドンを削りとり、Ｂａｍ　ＨＩリンカ−を
接続し、さらに制限酵素ｔｌｉｎｄ■およびＢａｎ　Ｈ
■で切断する。

（ｆ　）ｐＡＴ１５３ＢＳを制限酵素ＢａｎＨＩおよび
Ｈ＋ｎｄｌＪで切り開き、その位置にＭＢＰ３ｍ伝子の
プ転子−ター領域を含む１．３ｋｂの１ｌｉｎｄ　　Ｉ
［ＩＲａｎ　ＨＩ断片を挿入する（ｐＭＤＰ３０２Ａｓ
）。

このｐＭＢＰ３０２Ａｓの基本構造を示したものが第２
図である。

この第２図に示すように、ｐＭＢＰ３０２Ａｓの基本Ｍ
造は、キャップ付加部位を含むＭＢＰ３！ｉ伝子プロモ
ーター領域と、ＭＢＰアンチセンス遺伝子転子ＮＡを有
し、さらに転写産物のスプライシングを行わせるために
、ウサギβ−グロビン遺伝子の第２イントロン領域、ま
たポリＡ付加を行わせるために同遺伝子の３′下流域お
よびＳＶ４０の３′下流域を配置し、転写開始部位を残
している。また、導入したＭＢＰアンチセンスのｃＤＮ
Ａは、さらにρＡＴ１５３由来の２７６ｂｐの配列が付
属している。

なお、マウスの受精卵に注入するＭＢＰアンチセンス遺
伝子には、ｐＭＢＰ３０２Ａｓがら切り出した４、２ｋ
ｂ　ｔｌｉｎｄ　　ｍ　−３ａｔ　Ｉ直鎖上断片を用い
た。

実施例２：遺伝子導入動物の作成 遺伝子を導入する宿主として企図転戦症の遺伝形質をヘ
テロに持つマウス（ｓｈｉ／＋　）を用いた。

なお、企図転戦症の遺伝子をヘテロ接合で保持している
マウス（ｓｈｉ／＋）の小脳におけるＭＢＰｍＲＮＡの
量は、野生型（＋／＋）に対して半分であルコトが知ら
れている（Ｅ、Ｂａｒｂａｒｅｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｃｈｅｌ、　、　４０巻、　１６８０頁、１
９８３年）。

この遺伝子導入動物の作成方法は、基本的にはガードン
らの方法（Ｊ、１４．Ｇｏｒｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、７７巻、　７３
８０頁、　１９８０年）に準じて行った。すなわち、シ
バラー（ｓｈｉ／ｓｈｉ　）マウスの卵管からｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏで未受精卵を採取し、次いで、Ｆｌ　（Ｃ５７
ＢＬ／６ｘＢＡＬＢ／ｃ）の精子で体外受精を行った。

その後、受精卵の雄性前核に２〜１０■／μ」の実施例
１で作成したＭＢＰアンチセンス逍伝子転子紋小ガラス
ピペツトで約２μｍ注入しな。これらの操作卵を予め偽
妊娠状態にしておいた雌マウス（ＩＣＲ：ＨｔｌＣ，フ
レア■）の卵管に移植してＭＢＰアンチセンス遺伝子導
入マウスを産出させた。マウスは２０日後に誕生した。

実施例　３：導入ＭＢＰアンチセンス遺伝子の検定 実施ρＪ２より得た誕生から約４週間後の離乳期の子マ
ウスの尾を切断する。尾の細胞から抽出したＤＮＡにつ
いて、注入ＤＮＡが子マウスの染色体に組み込まれてい
るか否かをサザンハイプリタイゼーション法（Ｅ、５ｏ
ｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、、９８巻、５０
３頁、１９７５年）によって調べた。すなわち、マウス
の尾の細胞から高分子量のＤＮＡをｖＩ製しくＮ、ＢＩ
ｉｎ　ａｎｄ　Ｄ、ｔ４．５ｔａｆｆｏｒｄ、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓ、　、　３巻、２３０３頁、１
９７６年）、制限酵素ＥｃｏＲ■で消化した後、５μｇ
のＤＮＡを０．７％アガロースゲル電気泳動で展開し、
ナイロン膜（ＭＳＩ：Ｎ０４ＨＹ３１２Ｆ５、Ｓ＆Ｓ社
製）に転写した。次に転写したＤＮＡをフォルムアミド
緩衝液中で３２Ｐで標識した１、２ｋｂのＭ　Ｂ　Ｐ　
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ領のプローブとハイブリダイズした（Ａ
、Ｐ、ｒｅｉｎｂｅｒ（ｌ　ａｎｄＢ、八、ＶＯｇｅｌ
ＳｔＯｉｎ、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｎ、、　１３２巻
、６頁、１９８３年）、ハイブリダイゼーション後、ナ
イロン膜を室温で１５分間２ＸＳＳＰＥ溶液で２回洗浄
し、次いで、６５℃で１５分間２ＸＳＳＰＥと０．５％
ＳＤＳの混合溶液で１回洗浄したのち、６５°Ｃで１５
分間０．５ＸＳＳＰＥと０．５％ＳＤＳの混合溶液で１
回洗浄し、コダック社製Ｘ線フィルム（ＸＲＰ−５）で
２日間露光した。その結果、第３図に示したように、使
用した受精卵１２８より１５匹のマウスが誕生し、その
うちから５匹の遺伝子導入マウスを得た。また、導入さ
れたＭＢＰアンチセンス遺伝子は２〜５０コピ一程度で
あったが、これらのマウスは第４図に示したように見掛
は上正常な表現型を示していた。

実施例　４：３ｆｉ伝子導入動物系の作成実施Ｓ２で得
た遺伝子導入マウスのうちの１匹の雄［ＡＳｌｏｏ（ｓ
ｈｉ／＋）］をＢ　６　ｃ　Ｆ　１マウス（十／−ト）
と交配させ、５０匹の子孫（ＡＳ１００１〜ＡＳ１００
−５０）を得た。この５０匹について、前述のサザンハ
イプリダイゼーション法に従って、ＡＳｌｏｏからの導
入ＭＢＰアンチセンス遺伝子を受継ぐ子孫を２１匹選別
しな。これら２１匹の子孫については、企図転戦症の遺
伝形質についてヘテロ接合のもの（ｓｈｉ／＋）とツｆ
生型のものＣ＋／＋　）がある、ヘテロ接合については
、シバラー突然変異の染色体にしか存在しない制限酵素
断片の存在によって確かめた。導入ＭＢＰアンチセンス
遺伝子を受継ぐ２１匹の遺伝子導入マウスのうち１０匹
は、誕生後２週間頃より程度は異なるが、企図転戦の症
状を呈し始め、徐々に企図転戦症特有の表現型を示すよ
うになってきた。

これらの遺伝子導入マウスの企図転戦症の遺伝形質と表
現型との相関を示したものが表１である４遠伝子導入マ
ウスの遺伝的背景と企図転戦（表現型）との相関企図ｘ
戦 正　　常 ｓｈｉ　　ニジバラ−突然変異、＋：野生型実施例　５
：アンチセンス遺伝子を受継ぐ遺伝子導入動物の脳にお
けるＭＢＰの検出 遺伝子導入マウスおよび正常マウスから摘出した脳の半
分を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、パラフィン
包埋した。各プレパラート切片について、マウスＭＢＰ
に対するウサギ抗体を第一反応に、ホースラデイツシュ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ　）標識抗ウサギＩｇＧを第
二反応にした組織免疫染色を行った。

その結果、第５図に示したように、正常マウスの小脳で
は、白質は一様に染色されているが、導入ＭＢＰアンチ
センス遺伝子を受継ぐ遺伝子導入マウス（ＡＳｌｏｏ−
１４）の小脳では白質の重要な部分は染色されず小脳組
織でＭＢＰのモザイクが見られるなど企図転戦症に認め
られる組織像がモザイク状に認められた。

実施例　６：内在性ＭＢＰｆｆｉ伝子および転子ＭＢＰ
アンチセンス逍伝子転子現量 のａ判定 誕生後６５０目の子孫遺伝子導入マウスと１００日日の
ＡＳｌｏｏから摘出した脳の半分からＣｈｉｒｇｗｉｎ
らの方法（Ｊ、Ｈ，Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｌｌｌｉｓｔｒｙ、　１８巻、５２９４頁
、１９７９年）に従って、全ＲＮＡを抽出した。その２
．５μｇのＲ，ＮＡ試料をクリオキサールで変性させた
後（Ｇ、に、ＨＣＨａＳｔｅｒａｎｄ　　Ｇ、Ｇ、Ｃａ
ｒｌ＋ｃｈａｅｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ、７４巻、４８３５頁、１９７７年）、０
．９％アガロースゲル電気泳動で展開し、ナイロン膜（
ＭＳ　Ｉ　：　Ｎ０４ＨＹ３１２Ｆ５、Ｓ　＆　Ｓ　社
’Ｍ　）　ニ転写１．り。

その後、まず、内在性ＭＢＰ遺伝子の発現量を測定する
ために、３２Ｐで標識した１、２ｋｂのＭＢＰｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａ　６ｎ域のプローブをハイブリダイズした。

その後、ナイロン膜を室温で５分間２ＸＳＳＣ１０，１
％ＳＤＳ溶液で２回洗浄し、次いで、６５°Ｃで９０分
間２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ／　０　、　Ｉ　Ｓ　Ｄ　Ｓ溶液
で１回洗浄後、コタンク社製Ｘ線フィルム（ＸＲ，Ｐ−
５＞で２日間露光した。

次に、導入ＭＢＰアンチセンス遺伝子の発現量を測定す
るために、内在性ＭＢＰ遺伝子の発現量の測定に用いた
ナイロン膜からプローブを脱ハイブリタイセーションし
た後、ＳＰ’６ボリメラーゼシステム（ＰｒｏＩｌｅｇ
ａ製）で合成したＭＢＰアンチセンスＲＮＡとのみハイ
ブリダイズする３２Ｐで標識した一本鎖のセンスＭ　Ｂ
　Ｐ　ＲＮ　Ａとハイブリダイズさせた。その後、ナイ
ロンＩ摸を室温で５分間２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ溶
液で２回洗浄し、次いで、室温で３０分間ＲＮａｓｅＡ
処理２　μｔｒ　／　μ、Ｑ　　（２ＸＳＳＣ１０，１
％ＳＤＳ溶液中）を行ったあと、６５℃で９０分間２Ｘ
ＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ溶液で１回洗浄し、コダック社
製Ｘ線フィルム（ＸＲＰ−５）で２日間露光した。

その結果、表２、第６図（Ａ）に示すように、内在性Ｍ
　Ｂ　Ｐ　ｍ　Ｒ，Ｎ　Ａの発現量は遺伝子導入マウス
であるＡＳｌｏｏ（３１１１／十）　、ＡＳｌｏｏ−１
１（＋／モ）　、ＡＳｌｏｏ　−１２（ｓｈｉ／＋　）
　、　ＡＳｌｏｏ　−１４（Ｓｈｉ／”）では全て、遺
伝子導入動物でない同腹の子孫ＡＳ１００−１０　（＋
／十）と比べて、それぞれ、４０％、５０％、３０％、
２０％に減少していた。また、遺伝子導入マウスでない
ヘテロ接合（ｓｈｉ／十）のマウス（ＡＳｌｏｏ−７、
ＡＳｌｏｏ−９）はどちらもＡＳｌｏｏ−１０に対して
ＭＢＰｍＲＮＡが５０％に減少していた。また、３ｆｆ
ｆ　導子導入マウスの脳内の導入ＭＢＰアンチセンス遺
伝子から発現したアンチセンスＲＮＡの解析では、第６
図（Ｂ）に示すように遺伝子導入動物の個体間でＲＮＡ
量は異なるが、遺伝子導入動物では全て転写ＲＮＡのバ
ンドとして期待される１、９ｋｂのサイズのところにバ
ンドが認められた。

一方、遺伝子導入動物でない同腹の子孫では、いずれら
、長時間露光してもこのサイズのバンドは検出されなか
った０表２に示したようにＭＢＰｍＲＮＡの量の減少と
異常な表現型の現れかたには明瞭な相関があることがわ
かる。さらに、内在性のＭ［３ＰｍＲＮＡの減少量と金
画転戦症特有の企図転戦を示す表現型の程度ともよく一
致している。

表２、内在性ＭＢＰｍＲＮＡの発現量と企図転戦（表現
型）との相間ＨＢｐＨＲＮＡグｉ天μｍ」 ± ＋＋ ＋＋ Ｔｌ１ｌＮＡＱ現ｆｆ１（Ｘ） ゴ００ ＨＢＰの存在 ＋ ＋ ＋ ± （表現型） ± ＋ ＋：企図振転 戦：力ηｉカシｒ裕工］折圓攬 （発明の効果） この発明によれば、真核生物にアンチセンス遺伝子を導
入することにより、その内在性遺伝子の発現を抑制し、
制御してなる遺伝子導入真核生物を作成することができ
る。

また、この発明により真核生物の表現型をその子孫に至
るまで所望の形質に改変することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、マウスのＭＢＰアンチセンス逍伝子転子ヤ成
過程を示す工程図である。 第２図は、ＭＢＰアンチセンス遺伝子（ρＭＢＰ３０２
ＡＳ）の基本構造図である。 第３図は、遺伝子導入マウスの作成結果を表す受精卵数
と誕生マウスとの相関図である。 第４図は、マウスに導入されたＭＢＰアンチセンス遺伝
子のササンハイブリダイゼーションによる検定結果を表
す図面代用写真である。 第５図は、マウス小脳の免疫組織染色像を表す図面代用
写真である。 第６図（Ａ＞は、マウスに導入しなＭＢＰアンチセンス
遺伝子に基づく転写ＲＮＡの検出結果を表す図面代用写
真である。 第６図（Ｂ）は、マウスの内在性Ｍ　Ｂ　Ｐ　ｍ　ＲＮ
Ａの検出結果を表す図面代用写真である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）アンチセンス遺伝子を真核生物の分化全能性を有
   する細胞に導入し、内在性遺伝子の発現を制御してなる
   ことを特徴とする遺伝子導入真核生物。
2. （２）真核生物が哺乳動物である請求項（１）記載の遺
   伝子導入真核生物。
3. （３）アンチセンス遺伝子が発現するＲＮＡが内在性遺
   伝子の発現するＲＮＡに対してアンチセンスである請求
   項（１）記載の遺伝子導入真核生物。
4. （４）アンチセンス遺伝子が、内在性遺伝子が発現して
   いる組成または細胞と同所性に働くプロモーターおよび
   ／またはエンハンサーを有している請求項（３）記載の
   遺伝子導入真核生物。
5. （５）アンチセンス遺伝子が、プロモーターおよび／ま
   たはエンハンサー、イントロン領域および転写開始部位
   を有している請求項（３）記載の遺伝子導入真核生物。
6. （６）アンチセンス遺伝子が、ミエリン塩基性蛋白質セ
   ンス遺伝子の相補性ＤＮＡのアンチセンスである請求項
   （３）記載の遺伝子導入真核生物。
7. （７）アンチセンス遺伝子がヘミ接合で保持されている
   請求項（１）または（３）記載の遺伝子導入真核生物。
8. （８）アンチセンス遺伝子がホモ接合で保持されている
   請求項（１）または（３）記載の遺伝子導入真核生物。
9. （９）アンチセンス遺伝子を生殖系列の細胞に導入して
   なる請求項（１）記載の遺伝子導入真核生物。
10. （１０）請求項（１）記載の遺伝子導入真核生物から分
    離、取得した生物細胞。
11. （１１）アンチセンス遺伝子を真核生物の分化全能性を
    有する細胞に導入し、内在性遺伝子の発現を制御するこ
    とを特徴とする遺伝子導入真核生物の作出方法。