WO2001069237A1 - Specimen avec capacite de separation de composant solide - Google Patents

Specimen avec capacite de separation de composant solide Download PDF

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WO2001069237A1
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Kaoru Hirai
Satoshi Yonehara
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Arkray, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a test strip suitable for detecting a test substance in blood, and mainly belongs to the technical field of chemical analysis of biological material. Background art
  • a series of analytical processes such as absorption, diffusion, reaction, and detection of the sample solution are usually required.
  • a blood test using blood containing a blood cell component and a plasma component (hereinafter, also referred to as “whole blood”), when detecting and quantifying glucose in a plasma component as a test substance, the blood cell component is used.
  • whole blood blood containing a blood cell component and a plasma component
  • the blood cell component is used.
  • the blood cell component and the plasma component are separated from the whole blood, and the test is performed on the separated plasma component.
  • Various proposals have been made for techniques for detecting substances.
  • a test device using a specific gravity difference between a blood cell component and a plasma component and having a blood cell separation mechanism by centrifugal separation is known.
  • this test device requires a centrifugal separator, which makes the device for detecting the test substance complex and large-scale, and the reagents and the like to be used may be complicated. May not be preferred.
  • test strip which separates blood cell components in whole blood and detects a test substance in a plasma component using a coloring reagent which develops a color with respect to the test substance.
  • This test piece is superior to the above-described test device in that the test substance can be detected only by spotting whole blood on the test piece.
  • test piece examples include an asymmetric membrane, a glass filter, or a blood cell separation layer having a porous structure formed by solidifying polymer particles with an organic polymer;
  • a laminated test piece obtained by laminating a reagent layer containing a coloring reagent that develops a color on a test substance on a light-transmissive support for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 49-53888, And the polymer particles are solidified with an organic adhesive or the like to form a layer containing an appropriate particle gap and containing the coloring reagent to separate blood cell components.
  • Test pieces for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-160063 which attempt to develop plasma components and detect test substances are known.
  • the laminated test piece whole blood easily spreads on the blood cell separation layer, and the blood cell component and the plasma component are separated in the vertical direction mainly using their own weight.
  • a blood cell layer is formed on the uppermost part of the separation layer. Therefore, for example, when the test substance is quantified by transmitted light measurement, even if the test substance is colored by the coloring reagent, the measurement light is blocked by the blood cell layer, and the transmitted light cannot be measured. There is.
  • detection and measurement may be performed while supplying oxygen to the test substance.
  • a blood cell layer is easily formed on the blood cell separation layer. Therefore, oxygen permeability is poor, and it is necessary to provide an oxygen supply means such as an oxygen permeable membrane between the reagent layer and the support in order to supply oxygen. It is difficult to provide an oxygen supply means such as an oxygen permeable membrane on the laminated test piece, and it increases the production cost of the test piece.
  • a test piece in which a polymer particle is solidified with an organic polymer to form a blood cell separation layer is formed, and the organic polymer absorbs moisture and swells. In some cases, the interparticle gap becomes small, and a sufficient amount of plasma components may not spread to the reagent layer.
  • the plasma component is vertically moved by capillary action. It can be deployed not only in the horizontal direction but also in the horizontal direction.
  • the blood cell component easily spreads on the reagent layer as in the case of the above-mentioned laminated test piece, deterioration of oxygen permeability due to shading of the blood cell layer and formation of the blood cell layer in transmitted light measurement is as follows. Challenges remain. Also, in this test piece, when the plasma component spreads in the layer, the dye and the like generated by the reaction with the coloring reagent may further develop, and the distribution concentration of the detected test substance may be biased. May occur.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and is capable of measuring a test substance by transmitted light measurement, has a high oxygen permeability, and is a test capable of measuring the test substance with higher accuracy.
  • the task is to provide pieces.
  • the present invention has the following configuration as means for solving the above problems.
  • the present invention provides a test piece having a solid component separation ability capable of separating a solid component from a sample containing a solid component and a liquid component and detecting a test substance contained in the liquid component, comprising beads, An inorganic gel, and a reagent layer having a porous structure containing a reagent that causes a detectable reaction with the test substance; and a support for supporting the reagent layer, wherein the beads are adhered to each other by the inorganic gel.
  • a test piece characterized in that a particle gap for trapping the solid component is formed between beads.
  • the sample is blood (whole blood) containing a blood cell portion and a plasma portion
  • the support has a hydrophilic portion on the surface, and the reagent layer is supported by the hydrophilic portion.
  • the particle diameter of the beads is 0.5 to 10; zm, and the content of the beads is 1 to 30% by weight in final concentration, and the inorganic gel is formed. It is preferable that the content of the inorganic gelling agent is 0.1 to 3% by weight at the final concentration.
  • the reagent reacts with a test substance to cause an optical change, and the support is preferably formed of a light-transmitting substance.
  • the test strip of the present invention includes a reagent layer and a support for supporting the reagent layer.
  • the reagent layer has a porous structure containing beads, an inorganic gel, and a reagent that causes a detectable reaction with a test substance.
  • the beads are adhered to each other by an inorganic gel, and a particle gap is formed between the beads to collect solid components in the sample.
  • the beads may be any as long as they can collect solid components in the gap between particles. However, it is preferable that the beads have a narrow particle size distribution in the range of the particle size in separating the solid components. When using beads with a wide particle size distribution or beads with a relatively large particle size, use beads containing particles with a relatively small particle size of 10 ⁇ or less. Is preferred for forming a suitable particle gap.
  • the preferred particle size of the beads depends on the size of the solid component to be collected in the particle gap (for example, the blood cell component, etc.). Depending on the use conditions of the beads, beads with a particle size of about 30 m are used. However, it is preferably 0.5 to 10 ⁇ , more preferably 3 to 8 ⁇ m. If the particle size of the beads is smaller than the above range, the liquid component may not be developed smoothly.If the particle size of the beads is larger than the above range, the solid component may not be sufficiently collected. There is.
  • the preferred content of beads in the reagent layer depends on the desired development distance of the liquid component and the preferred thickness of the reagent layer, but is preferably 1 to 30% by weight in the final concentration. If the content of the beads is smaller than the above range, the layer thickness of the reagent layer may be insufficient. If the content of the beads is too large, the layer thickness of the reagent layer may be unnecessarily large. There is.
  • the beads have a shape closer to a sphere in order to form a good particle gap.
  • beads satisfying the above-mentioned conditions can be suitably used regardless of the type of beads.
  • examples of such beads include inorganic beads such as glass beads, polymerized beads such as latex beads, and the like.
  • polymer beads that can easily control the particle size, particle shape, and particle size distribution in production.
  • Such a polymerized bead can be obtained by purchasing a commercial product, and can also be produced according to a conventional method such as a suspension polymerization method or an emulsion polymerization method.
  • the inorganic gel is used for bonding the beads to each other to make the reagent layer a porous structure. Things. Inorganic gels are generally less likely to swell when absorbing water than organic gels. For example, when measuring a test substance by transmission light measurement, the cell length (reagent layer thickness) is kept constant. There is an advantage that the particle gap of the reagent layer is easily kept constant during the development of the liquid component.
  • the inorganic gelling agent that forms an inorganic gel is generally easy to adsorb a compound having a polar substituent or a dye, it adsorbs the reagent or a reaction product (a dye, etc.) between the reagent and the test substance.
  • This method has the advantage that the distribution of the detected test substance is less likely to be biased.
  • the inorganic gel when the inorganic gel is a gel exhibiting thixotropic properties, it has excellent fluidity at the time of the inorganic sol, and is solidified (gelled) by standing, so that it is difficult to form a reagent layer on the support. Is preferred.
  • the inorganic gel becomes transparent by the addition of water in order to detect a test substance by an optical change.
  • the preferred content of the inorganic gelling agent in the reagent layer varies depending on the amount of beads used and the properties (gel forming ability, etc.) of the inorganic gelling agent used, but is preferably 0 at the final concentration. 1-3% by weight. If the content of the inorganic gelling agent is less than the above range, adhesion between beads may be insufficient and a reagent layer may not be formed. If the content of the inorganic gelling agent is too large, excess inorganic The gelling agent may fill the particle gap and adversely affect the development of the liquid component.
  • inorganic gelling agent commonly used inorganic gelling agents can be used.
  • Rabonite series manufactured by Nippon Silica Kogyo Co., Ltd.
  • Lucentite SWN manufactured by SWF
  • thixotropic W Kyowa Chemical Industry Co., Ltd.
  • Smetaton SA Kunipia (Kunimine Industry Co., Ltd.)
  • Multigen Toyojun Mining Co., Ltd.
  • the reagent is a compound such as a dye precursor that produces an optically detectable substance such as a dye or a fluorescent dye by an oxidation-reduction reaction, an acid-base reaction, a condensation reaction, a complex formation reaction, or the like, or is electrochemically detected. It can be found widely in oxidized or reduced forms of possible electron mediators or compounds that form complex compounds.
  • a reagent that generates an optically detectable substance will be specifically described.
  • the dye precursor a compound having a conjugated system such as an aromatic ring is preferable. Couplers and hydrogen donors such as 4-amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-one (hereinafter abbreviated as "4-AA") Reagents that generate quinone-based dyes by oxidative condensation with the body, dye precursors that generate oxidized chromogenic dyes such as ortho-tolidine and benzidine, and dye precursors that develop color when oxidized, such as the leuco-form of the dye Reagents that generate fluorescent substances when oxidized, luminescent substances such as chemiluminescent substances, reagents that generate dyes by reduction, such as tetrazolium salts, and azo dyes that change in pH Diazonium salts that produce chromogenic substances, reagents for color reaction, reagents for producing
  • the hydrogen donor is a compound such as phenol which condenses with 4-AA or 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone to form a quinone dye in the presence of an oxidizing agent.
  • ortho-tolidine and benzidines examples include ortho-tolidine, dianisidine, 3,3 'diaminobenzidine, 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, and N- (3-snolehop Gpi / re). 1, 3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine and the like.
  • the leuco body is a colorless dye precursor that is oxidized to form a dye and develop color.
  • the dyes whose oxidized body is oxidized include 2,6-dichloro-4-[(4-hydroxypheninole) imino] —2,5-cyclohexadiene-one, 2,6-dichloro- Mouth-one 4-([3-Chloro-1-4-hydroxyphenyl) imino] — 2,5-cyclohexadiene-one, 7— (getylamino) -13-imimino 8-Methyl-13H-phenoxazine salt , 3- (Jethylamino) -17-amino-5-phenylphenazine salt, 3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine-15-dium salt, 1-hydroxy-5-methylphenazine salt, 7-h Droxy 3 H—phenoxazine-13-one-10-oxide; leuco forms include 4,4,1-benzylidenebis (N, N-dimethylaniline) and 4,4′-bis [N-ethyl
  • dye precursors that are oxidized to produce color include 4-methoxyphenol, 4-ethoxyphenol, 2-ethoxyphenol, 1- (2-hydroxy-5-methoxyphenol) ethanone, 2- Hydroxy-5-methoxybenzoic acid, 2-hydroxy-5-methoxybenzanoledehyde, 2-hydroxy-5-methoxybenzoate methinole, 4-methoxy-1-2-nitrophenol, 2-Chloro-4-methoxypheno ⁇ ⁇ 4-Hydroxy-3-Methoxybenzaldehyde, 4-Hydroxoxy-3-Methoxybenzoic acid.
  • 2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine 4,5-diamino-16-hydroxypyrimidine
  • 4-amino-2,6-dihydroxypyrimidine '6-hydroxy2,4,5-triaminopyrimidine
  • 4,5-diamino2,6-dihydroxypyrimidine 4-amino-6-hydroxy-2-methylpyrimidine
  • 4-amino-16-hydroxy-12-methoxypyrimidine and the like 2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine, 4,5-diamino-16-hydroxypyrimidine, 4-amino-2,6-dihydroxypyrimidine, '6-hydroxy2,4,5-triaminopyrimidine, 4,5-diamino2,6-dihydroxypyrimidine, 4-amino-6-hydroxy-2-methylpyrimidine, 4-amino-16-hydroxy-12-methoxypyrimidine and the like.
  • Examples of the reagents that are oxidized to generate a fluorescent substance include 4-hydroxyphenylacetic acid, (4-hydroxy-13-methoxyphenyl) acetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, and 4-hydroxy ( 2-aminoethyl) phenol, 4-hydroxydroxy N, N, N-trimethylenobenzene metaminium, anoreffaminopalladroxydroxyhydric acid, 4-hydroxydroxyphenethylamine, N- (4-hexyl) Droxifuel) acetanilide, 2,7-dichlorofluorescein acetate, and the like.
  • an oxidizing agent such as hydrogen peroxide or an oxidizing enzyme such as peroxidase is preferably used as an oxidizing agent involved in the oxidation reaction.
  • the oxidizing agent involved in the oxidation reaction is not limited to these, and various known oxidizing agents and oxidizing enzymes may be used.
  • Examples of the luminescent substance such as the chemiluminescent substance include firefly luciferin, firefly luciferin, aequorin, lucigenin derivative, luminol derivative, ataridinium ester, persulfuric acid ester and the like.
  • tetrazolium salt examples include 2,3,5-triphenyltetrazolium salt, 2,5-diphenyl-13- (1-naphthyl) -12H-tetrazolium salt, 3,3— [3,3,1 Dimethoxy (1,1,1biphenyl) 1,4,4'-diyl] bis [2- (4-ditophenyl) -1,5-phenyl-1 2H-tetrazolium] salt, 3,3- [3 , 3'-Dimethoxy-1 (1,1, -biphenyl) 1-4,4'Jil] -Bis [2,5-diphenyl2H-tetrazolium] Salt, 2- (4-Feodofenii) 1) 3- (4-Nitrophenyl) 1-5-phenyl 1-2H-tetrazolium salt, 2- (4-hydrophenyl) 1-3- (412-trophenyl) 15- (2,4-disulfophenyl) 1 2 H—te
  • Examples of the compound which is reduced to produce a dye include reductants such as 1,1′-dimethyl-1,4,4,1bivilillium salt and 1,1′-dibenzyl-1,4,4,1bivilillium salt.
  • reductants such as 1,1′-dimethyl-1,4,4,1bivilillium salt and 1,1′-dibenzyl-1,4,4,1bivilillium salt.
  • 7-hydroxy-3H-phenoxazine-13-10-10-oxide and the like are reduced to generate a fluorescent dye.
  • nicotinamide adenine dinucleotide NAD
  • nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or the like is preferably used as a reducing agent involved in the reduction reaction.
  • the reducing agent involved in the reduction reaction is not limited to these, and may be various known reducing agents.
  • Examples of the compound that develops or changes color due to the change in pH include sulfonephthalein dyes such as Promocresol Nore Green, Bromophenolone Resley, Phenonolerede, Bromopyrogallo monoledo Red, and Pyrogallol Red, Malachite Green, and Rozolic Acid.
  • Quinoline dyes such as triphenylmethane dyes, quinaldine red, N- (parahydroxyphenyl) 1-2,6-dichloroparabenzoquinoneimine, 7-hydroxy-3H-phenoxazine-13-one-10-oxide, etc.
  • Oxazone dyes coumarin dyes such as 6,7-dihydroxy-14-methylcoumarin, and conductive polymer compounds such as a-line oligomers.
  • diazonium salts examples include 2-methoxyl 4-morpholinobenzenediazo-dum salt, which forms an azo dye by coupling with indoxyl, and perobilino .
  • 2-methoxyl 4-morpholinobenzenediazo-dum salt forms an azo dye by coupling with indoxyl, and perobilino .
  • ⁇ by one Gen coupling 3 for generating a zone-based dye 3 'Jime Tokishibifue two Le - 4, 4' - like Jiazoniumu salts.
  • a reagent in this category there is a reagent involved in a reaction for producing a diazodium salt.
  • a reagent examples include 4-aminobenzenearsonic acid, which forms a diazodium salt in the presence of nitrite, and N-, which forms an azo-based dye by coupling with 4-aminobenzenearsonic acid or its diazo-dum salt.
  • 4-aminobenzenearsonic acid which forms a diazodium salt in the presence of nitrite
  • N- which forms an azo-based dye by coupling with 4-aminobenzenearsonic acid or its diazo-dum salt.
  • 1-naphthylethylenediamine and the like 2,4-dichloroaniline, N, N-getyl-N, 11-naphthylnaphthylethylenediamineoxalate (Tsuda reagent), which forms azo dyes by force-pressing in the presence of nitrite, may be mentioned. You.
  • nitrite may be used.
  • Reagents for the color reaction include hydrogen peroxide and 1,4-diaminobenzene for detecting aldehyde, and 2,3-dimethyl-2,3-bis (hydroxyamino) for detecting aldehyde.
  • Reagents for the reaction for producing the fluorescent substance include 2-hydroxy-1,2-diphenylethanone for detecting a guanidino compound, orthophthalaldehyde for detecting histamine, and ortho for detecting spermidine.
  • Examples include 1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzene in the detection of phthalaldehyde and alpha keto acid, but are not limited to these.
  • Enzyme substrates that react with the enzyme to produce dyes and fluorescent substances include N-tosyl-1-L-phenylalanine-12-methylacridone, a substrate for chymotrypsin, and L-alanine, a substrate for aminopeptidase.
  • the enzyme or enzyme substrate may be chemically bound to, for example, an antibody or a fragment thereof.
  • the compound that forms a complex and changes color or discoloration is a compound such as a ligand that forms a complex with a metal ion panion through a coordinate bond zion bond to generate a dye or a fluorescent substance.
  • Compounds that form a complex with a metal ion to form a color and discoloration include compounds known as metal indicator metal ionophores and compounds that form a complex with a colored transition metal ion to color.
  • ethylenediaminetetraacetic acid, 2,2-biviridine, 1-hydroxy-12- (2-hydroxyphenylenazo) benzene, dibenzo-18-crown-16, dicyclohexynole-18-crown-16 , Cyclic polyamines, elixir [4] arenes, 3- [N, N-bis (carboxymethyl) aminomethyl] 1-1,2-dihydroxyxanthraquinone, 5 ', 5 "-dibu-Lomopyrogallo Noresnorefonephthalein, 2-hydroxy-1- (1-hydroxy-2-naphthinoreazo) -1-6-nitro-1-4-naphthalene sulfonate, 2,6-dichloro-1--4 ' Droxy 3 ', 3 "-Dimethylfuxone-1 5', 5" -Dicanoleponic acid, 3,3,1-bis [N, N-bis (carboxymethyl) aminomethyl] fluorescein,
  • compounds that form a colored complex with a monovalent cation include tetrakis [3,5-bis (trifluoromethyl) phenyl] borate salt and tetraphenylphospho-dim salt.
  • compounds that form a fluorescent complex with calcium ions and the like include
  • tetraphenylarsonium salts that form colored complexes with anions, and the fluorescence intensity decreases when they form a complex with chloride ions, ⁇ -ethoxycarbonylmethyl-6-methoxyquinolinium, boron 8-hydroxy-1- (salicylideneamino) -1,6-naphthalenedisulfonate, which forms a complex with the compound.
  • the reagent for the test substance include, for example, when the test substance is glucose, glucose oxidase, peroxidase, 4-—, and ⁇ -methyl-1- ( 2-Hydroxy_3-sulfopropyl) 1,3,5-dimethinorea diphosphate, and when the test substance is cholesterol, cholesterol oxidase, peroxidase, 4- ⁇ , and ⁇ — Methyl- ⁇ — (2-hydroxy If the test substance is lactate, lactate dehydrogenase, NAD +, diaphorase, and tetrazolium uv oleate are used. In the case where the test substance is alkaline phosphatase, examples thereof include p-two-mouth phenyl phosphate.
  • Electrochemically detectable reagents include, for example, oxidized or reduced forms of electron mediators, and ligands that form complex compounds by ionic or coordinate bonding to specific ions. No. ⁇
  • An electron mediator is a chemical substance that oxidizes or reduces a test substance with an enzyme or the like and, at that time, directly or indirectly accepts or gives an electron from or to the test substance.
  • the test substance can be quantified from the electrochemical response when the reduced or oxidized form of the electron transfer substance is oxidized or reduced at the electrode.
  • the electron mediator include 1,1,1-dimethyl-4,4'-bibiridylium salt, 1,1'-dibenzyl-4,4'-bibiridylium salt, 1,4-di-minobenzene, and 2-methyl- 1,4-naphthoquinone, N-methylphenazine salt, 1-hydroxy-5-methylphenazine salt, 1-methoxy-5-methylphenazine salt, 9-dimethylaminobenzoalphaphenoxazine 7-dium salt, phenoctene derivative, hexacyanoiron (II) salt, 7-hydroxy-3H-phenoxazine-13-one-10-oxide, 3,7-diamino-5-phenylphenazidinium salt, 3 — (Jethylamino) 1-7-amino-5-feyulfene nadinium salt, 1,4-benzenediolone, 1,4-dihydroxy-1,2,3,5-trimethylbenzene,
  • ligands that form complexes with anions include tetraphenylarsonium salts and 6-methoxy N- (3-sulfopropyl) quinolinium salts.
  • the reagent contained in the reagent layer has been specifically described above.
  • the reagent layer also has a solid component separation ability of the reagent layer, a test substance and a reagent. Additives ordinarily used may be added as long as the reaction is not inhibited.
  • a suitable additive to be used in such a case is, for example, a buffer prepared from bis-tris buffer (bis. (2-hydroxyxethyl) imino tris (hydroxymethyl) methane and hydrochloric acid. ), A buffer such as a phosphate buffer, a citrate buffer, a ⁇ - (2-acetamido) iminodiacetic acid buffer, and a neutral salt such as sodium chloride.
  • a support made of a light-transmitting substance is used as the support, and as an additive, a powder of titanium oxide or the like that enhances the reflection efficiency of the measurement light by reflecting or scattering the measurement light is exemplified. be able to.
  • Surfactants can also be used as additives to enhance the development of liquid components.
  • examples of such a surfactant include sugar alkyl ethers such as n-octyl-1-D-darcopyranoside, ⁇ -octyl- ⁇ -D-thioglucopyranoside, ⁇ -heptyl-1- ⁇ -D-thiodarcoviranoside, and the like.
  • Sugar ester N, N-bis (3-D-dalconamide propyl) deoxycolamide, and the like.
  • the layer thickness of the reagent layer affects the developing distance of the liquid component, and as the layer thickness increases, the developing distance of the liquid component also increases, and as the layer thickness decreases, the developing distance of the liquid component tends to decrease.
  • the preferred layer thickness of the reagent layer depends on the desired development distance of the liquid component, but is preferably 5 to 130 ⁇ , more preferably 30 to 100 ⁇ , and More preferably, it is 50 to 90 ⁇ m. If the thickness of the reagent layer is smaller than the above range, the liquid component may not be sufficiently developed, which may hinder accurate detection and measurement of the test substance, and the thickness of the reagent layer is larger than the above range. Too much may require a large amount of sample to detect the analyte.
  • the shape and material of the support are not particularly limited as long as the support can support the reagent layer. However, it is preferable that the support has a hydrophilic portion on its surface and the hydrophilic portion supports the reagent layer. It is considered that the reason for this is that the hydrophilic portion greatly affects the development of the liquid component after the sample is spotted on the reagent layer.
  • the liquid component develops in the reagent layer by developing in the vertical direction due to its own weight, and developing in the vertical and horizontal directions by a capillary action.
  • the hydrophilic portion has good affinity with water and weakens the surface tension of the water-soluble liquid component. Therefore, it is considered that the hydrophilic portion acts on the liquid component in the reagent layer so as to flow in the lateral direction, and the liquid component develops obliquely downward by the action of the hydrophilic portion.
  • the action in the lateral direction by the hydrophilic portion has a large area of action and works only in the lateral direction, It is considered that this greatly contributes to the development of the liquid component in the lateral direction as compared to the above-mentioned kyaryrical action. For this reason, when a test substance in whole blood is measured by transmitted light measurement or the like, the test substance is measured at a position more distant in the lateral direction of the reagent layer than at a portion where blood cell components adhere to the detection of the test substance. A test substance can be detected, which is more preferable for performing transmitted light measurement.
  • the support preferably has a hydrophilic portion and a hydrophobic portion, and the hydrophilic portion has an appropriate shape (for example, a square shape, a square shape, a circular shape, an oval shape, or a shape formed by combining these shapes). Etc.) is preferable because the size of the reagent layer can be made appropriate.
  • the support having a hydrophilic portion and a hydrophobic portion may be produced by subjecting a hydrophilic material to a hydrophobic treatment, for example, by applying a hydrophobic substance such as silicon or oil to a hydrophilic material, Alternatively, it may be produced by subjecting a hydrophobic material to a hydrophilic treatment.
  • the support is made of a light-transmitting substance, because measurement of transmitted light becomes possible when the test substance is detected by optical change.
  • the light transmissive substance include an inorganic compound such as glass and an organic polymer compound such as transparent plastic.
  • organic polymer compounds such as transparent plastics can be hydrophilized by ultraviolet irradiation, silanol treatment, etc., even if they are hydrophobic polymers.
  • Transparent plastic can be suitably used as a support.
  • organic polymer compound include polyolefin resins such as polyethylene, polypropylene, and polyphenylene ethylene, and easily available organic high molecular compounds such as polystyrene and polyethylene terephthalate.
  • the test piece of the present invention comprises an inorganic sol (colloid solution in which an inorganic gelling agent is dispersed) in which the reagent is uniformly dispersed or dissolved and the beads are uniformly dispersed, on the support. It can be manufactured by forming a layered structure.
  • the beads may be dispersed in an inorganic sol, or an inorganic gelling agent powder and beads are preliminarily mixed, and water or the reagent is uniformly dispersed or dissolved in the mixed powder. It may be dispersed in the inorganic sol by adding a medium.
  • the reagent includes The reagent may be uniformly dispersed or dissolved in the mechanical sol, or may be uniformly dispersed or dissolved in an aqueous dispersion medium before the addition of the inorganic gelling agent.
  • the layer formation of the inorganic sol on the support can also be performed by a commonly used method.
  • the layer can be formed by applying a uniform and predetermined layer thickness with a doctor knife or the like. Good, but if a hydrophilic part patterned in a predetermined shape is provided on the support and an appropriate amount of inorganic sol according to the area of the hydrophilic part is supplied to the hydrophilic part, the inorganic sol spreads on the hydrophilic part, and a uniform layer is formed. It is preferable because a thick reagent layer can be formed on the support.
  • the reagent layer can be formed by removing water from the inorganic sol supplied on the support to such an extent that the properties of the inorganic gel for bonding the beads are not impaired.
  • the removal of water from the inorganic sol may be carried out by drying under conditions that prevent denaturation of the reagent and do not affect the detection result of the test substance, and drying conditions vary depending on the type of reagent used, etc. For example, drying at 25 ° C, drying at 40 to 50 ° C, drying under reduced pressure, drying under low temperature conditions (for example, around 5 ° C), or a combination thereof And drying under the same conditions.
  • drying under low-temperature conditions for example, around 5 ° C
  • the test strip of the present invention spots a sample containing at least a test substance in a liquid component at an appropriate position on the reagent layer, and detects a reaction between the test substance and the reagent developed in the reagent layer. As a result, the test substance can be detected.
  • the test sample of the present invention may be a sample containing only a liquid component that does not contain a solid component, but the test sample of the present invention separates a solid component from a sample to obtain a liquid component. Since it has a solid component separation ability capable of detecting a test substance, it is more preferably used for analysis of a sample containing a solid component and a liquid component. Examples of such a sample include, as described above, blood (whole blood) containing a blood cell component as a solid component and a plasma component as a liquid component.
  • the test strip of the present invention can be used not only for whole blood but also for biological materials such as urine (biological samples), foods, medicines, trace substances existing in the natural environment, industrial chemical substances, and trace amounts in waste. It can be used for analysis of substances.
  • whole blood is used as a sample
  • the state of the test strip of the present invention during sample analysis will be described.
  • the reagent layer in the test strip of the present invention has a porous structure formed by the beads, the inorganic gel, and the reagent, the whole blood is spotted on the reagent layer to form a reagent layer on the reagent layer.
  • the blood cell component remains, and the plasma component spreads laterally from the spotted portion in the reagent layer.
  • the reagent layer contains an inorganic gel, whole blood spotted on the reagent layer does not easily spread on the reagent layer, and blood cell components do not easily spread on the reagent layer.
  • the test substance in the plasma component can be detected at a position on the reagent layer that spreads laterally from the portion where the blood cell component adheres, and the measurement light is not blocked by the blood cell component. Can be measured by transmitted light measurement.
  • the blood cell layer is not easily formed on the reagent layer because the blood cell component is unlikely to spread on the reagent layer, and the reagent layer is excellent in oxygen permeability because it has a porous structure. In the reagent layer, the blood cell component is unlikely to spread on the reagent layer, and the plasma component also spreads in the reagent layer in the horizontal direction. Substances can be detected.
  • the beads in the reagent layer are bonded to each other by the inorganic gel to form a porous structure, the reagents in the reagent layer and the reaction products of the reagent and the test substance are easily adsorbed by the inorganic gel. Further development of the reagents and reaction products is suppressed, and the distribution concentration in these reagent layers is easily kept constant. Therefore, more accurate measurement of the test substance can be performed.
  • the test substance in the present invention is not particularly limited as long as it is present in the liquid component and can be detected by the reagent.
  • Examples of the test substance when the specimen is a biological sample include glucose and cholesterol. , Lactic acid, alkaline phosphatase and the like.
  • the liquid component may be water-soluble or non-water-soluble, but is generally water-soluble in many cases, and is preferably water-soluble in the present invention.
  • the method for detecting the test substance is not particularly limited as long as it can detect the reaction between the reagent and the test substance.
  • the method is caused by the reaction between the reagent and the test substance.
  • a method of detecting a test substance from an electrochemical change caused by the reaction can be exemplified.
  • these methods for detecting a test substance when reagents that react quantitatively with the test substance are used as the reagent, not only the test substance is detected, but also optical changes, electrochemical changes, etc. are measured. Thus, the test substance can be quantified.
  • a support made of a light-transmitting substance is used, and the test substance is detected by measuring the optical change by, for example, measuring a transmitted light or a reflected light. Can be detected.
  • the optical change can generally be exemplified by a color-forming reaction due to a reaction between a test substance and the above-mentioned reagent.
  • the measurement of the optical change using a generally used absorptiometer or a fluorometer, Raman spectroscopy, or the like can be applied.
  • Examples of the method for detecting a test substance from the electrochemical change include a method using an oxidation-reduction reaction, and a method using a complex compound generated from this ion when the test substance is an ion.
  • a commonly used electrode such as a carbon electrode
  • an oxidized or reduced form of the reagent generated by an oxidation-reduction reaction with a test substance is used as the electrode.
  • the method is to reduce or oxidize at a potential within the measurable range (normally 1.1 V to 111.0 V for carbon electrodes) and measure the potential at this time to quantify the test substance.
  • a potential within the measurable range normally 1.1 V to 111.0 V for carbon electrodes
  • the oxidation-reduction reaction may be a reaction in which a test substance and a reagent directly transfer electrons, or a reaction in which electrons are transferred indirectly.
  • a liquid membrane electrode having a porous polymer layer or the like provided on the surface of the electrode is used, and the liquid membrane electrode is impregnated with the reagent, and the reagent is coated.
  • a test substance is selectively bound to a test substance by a coordination bond or an ionic bond, moves in a polymer layer, and a membrane potential generated at that time is measured to determine the test substance.
  • FIG. 1 is a diagram showing a test piece manufactured in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a state where 1 ⁇ L of whole blood is spotted on the reagent layer of the test piece of FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing a state in which 0.5 ⁇ L of whole blood is spotted on the reagent layer of the test piece of FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing a state in which 0.1 ⁇ L of whole blood is spotted on the reagent layer of the test piece of FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Example 1 a test piece using blood (whole blood) as a specimen and glucose (Glc) in the blood as a test substance will be described as an example of the present invention.
  • a test piece using blood (whole blood) as a specimen and glucose (Glc) in the blood as a test substance will be described as an example of the present invention.
  • distilled water produced by a pure water production apparatus Autostill WG 220 (manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) is treated by a treatment apparatus Milli—QL abo (manufactured by Nippon Millipore). Milli-Q water was used.
  • the transparent polystyrene plate is washed with ethanol and 1 mm Q water, dried, and then irradiated with ultraviolet light (PL 16-110, light source: low-pressure mercury lamp 110 W, both manufactured by Sen Special Light Source). UV light was applied for 1 to 30 minutes (preferably 3 minutes), and the surface of the transparent polystyrene plate was subjected to a hydrophilic treatment to obtain a support 1.
  • the shape of the hydrophilic portion of the support 1 was a honey-tan type in which two circles having a diameter of 5 mm were connected.
  • Inorganic gelling agents Rabonite X LG, bis-tris buffer (pH 6.5), POD (phenolic oxidase), GOD (gunolecosoxidase), 4-AA (4-aminoantipyrine) 4-amino-1,2-dihydro-1,5-dimethyl-2-phenyl-3H-virazol-3-one)), TOO S (N-ethyl-N- (2-hydroxy-1-3-sulfo) Propyl) -13-methylaline) and latex bead OTG-2 (average particle size: 4.5 ⁇ ) were added to the final concentrations shown in Table 1 below. The mixture was mixed with Milli-Q water to obtain a colloid solution (sol) of Rabonite XLG.
  • sol colloid solution
  • the inorganic sol obtained by the above operation was spotted on the hydrophilic portion of the support 1 obtained by the above operation by 10 ⁇ L, and dried at 4 ° C. for 1 hour, as shown in FIG. Reagent layer 2 was prepared.
  • Fresh whole blood (fingertip blood) was spotted at 1, 0.5, 0.1 / L on the tip of the hyotan type in the reagent layer 2 of each test piece.
  • Figures 2 to 4 show the appearance of the test piece when whole blood was spotted.
  • the part wetted by the plasma component is colored light red, and can be confirmed visually. This is primarily due to color development of the TOO S (X ma 5 5 5 nm).
  • glucose in plasma components can be detected by spotting a very small amount of whole blood. Further, the test piece of the present example can be easily manufactured as described above.
  • the amount of Rabonite XLG and other reagents used was fixed, and the amount of beads used was changed according to Table 2 below. Prepared. Then, the expected thickness of the reagent layer was measured. Note that the expected film thickness is a film thickness ( ⁇ ) obtained by observing and calculating fragments of the reagent layer by SEM.
  • the moving distance is the distance (mm) from the point at which the separated plasma component moved to the head at 5 seconds after the whole blood was spotted.
  • test pieces were prepared in the same manner as in Example 1 described above using each reagent so that the final concentrations described in Table 3 below were obtained. Then, in the same manner as in Example 2 described above, the expected film thickness of the reagent layer in each test piece was measured, whole blood was spotted on the reagent layer, and the moving distance of the plasma component at this time was measured. Table 3 shows the reagent formulation for each test piece, and Table 4 shows the measured results of the expected film thickness and the moving distance.
  • the plasma component migration distance depends on the amount of beads used, i.e., the thickness of the reagent layer, if the pH is constant even if the amount of reagent used is slightly changed.
  • Example 5 a test piece was prepared in the same manner as in Example 1 described above using each reagent so that the final concentration described in Table 5 below was obtained.
  • “beads having different particle diameters” 4.5111 and 6.6111
  • Table 5 shows the reagent formulation for each test piece
  • Table 6 shows the measured results of the expected film thickness and the moving distance.
  • Example 1 was the same as in Example 1 except that HPC-M (hydroxyshethyl propylcellulose: a product of Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), a kind of organic gelling agent, was used in place of Laponite XLG at a final concentration of 2% by weight. Similarly, a reagent layer and a test piece were prepared. Fresh whole blood (fingertip blood) was spotted on the reagent layer of the obtained test piece, but the plasma component did not penetrate into the reagent layer, and the spotted whole blood could not be separated.
  • HPC-M hydroxyshethyl propylcellulose: a product of Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
  • a kind of organic gelling agent was used in place of Laponite XLG at a final concentration of 2% by weight.
  • a reagent layer and a test piece were prepared. Fresh whole blood (fingertip blood) was spotted on the reagent layer of the obtained test piece, but the plasma component did not penetrate
  • the solid component in detecting a test substance from a sample composed of a solid component and a liquid component and containing the test substance in the liquid component, the solid component is formed by the beads and the inorganic gel and collected.
  • the test substance is also measured by transmitted light measurement c which can be can, good oxygen permeability, and provides a test strip 'capable of measuring analyte at a higher accuracy

Description

明細書 固体成分分離能を有する試験片 技術分野
本発明は、 血液中の被検物質の検出に好適な試験片に関し、 主に生物学的材料 の化学分析の技術分野に属する。 背景技術
血液や尿、 又は脳脊髄液等の生体試料に含まれる任意の成分を検出する場合で は、 通常、 試料液の吸収、 拡散、 反応、 検出等の一連の分析プロセスが必要とさ れる。 特に、 血球成分と血漿成分とを含む血液 （以下、 「全血」 ということもあ る） を用いる血液検査において、 血漿成分中のグルコースを被検物質として検出、 定量する場合等では、 血球成分が様々な影響を及ぼし、 測定結果に誤差を生じや すいことが知られている。 このため、 全血を用いる血液検査では、 血球成分と血 漿成分とを分離することが望まれており、 全血中から血球成分と血漿成分とを分 離し、 分離した血漿成分中の被検物質を検出するための技術については、 様々な 提案がなされている。
前述した技術としては、 例えば、 血球成分と血漿成分との比重差を利用し、 遠 心分離による血球分離機構を有する試験具が知られている。 しかし、 この試験具 は、 遠心分離器が必要であり、 被検物質検出のための装置が複雑かつ大がかりに なるとともに、 使用される試薬等も複雑なものとなることがあり、 実用面におい て好ましくない場合がある。
一方で、 前述した技術としては、 全血中の血球成分を分離し、 被検物質に対し 発色する発色試薬によって血漿成分中の被検物質を検出する試験片が知られてい る。 この試験片は、 全血を試験片に点着するだけで被検物質を検出することがで きる点で、 前述した試験具よりも優れている。
前記試験片としては、 例えば、 非対称膜やガラスフィルタ、 またはポリマー粒 子を有機ポリマーで固めることにより形成される多孔質構造の血球分離層と、 被 検物質に対し発色する発色試薬を含む試薬層とを、 光透過性の支持体上に積層し た積層型試験片 （例えば、 特開昭 4 9一 5 3 8 8 8号公報や、 特開昭 5 5— 9 0 8 5 9号公報等） や、 ポリマー粒子を有機系の接着剤等で固め、 適度な粒子間隙 を有するとともに前記発色試薬が含まれる層を形成し、 血球成分の分離と血漿成 分の展開、 及ぴ被検物質の検出を行おうとする試験片 （例えば特開昭 5 7 - 1 6 0 0 6 3号公報等） が知られている。
しかし、 前記積層型試験片では、 血球分離層上で全血が拡がりやすく、 また、 血球成分と血漿成分との分離が主にこれらの自重を利用する縦方向への分離であ るため、 血球分離層の最上部に血球層が形成されてしまう。 このため、 例えば、 被検物質を透過光測定によって定量しようとした場合に、 被検物質が発色試薬に よって発色しても、 前記血球層によって測定光が遮られ、 透過光測定を行えない 場合がある。
また、 被検物質によっては、 被検物質に酸素を供給しつつ検出、 測定する場合 があるが、 このような場合に前記積層型試験片では、 血球分離層上に血球層が形 成されやすいことから酸素透過性が悪く、 酸素供給を行うために酸素透過膜等の 酸素供給手段を試薬層と支持体との間に設ける必要がある。 酸素透過膜等の酸素 供給手段を前記積層型試験片に設けることは、 困難であるとともに、 試験片の作 製コストを增加させる原因となる。
また、 前記積層型試験片では: 血球分離層上で全血が拡がりやすく、 かつ主に 縦方向への分離であるため、 被検物質を試薬層に十分に展開させるためには、 血 球分離層へ十分量の血液を点着する必要があり、 一回の測定により多くの量の検 体が必要となる。
また、 前記積層型試験片のうち、 ポリマ一粒子を有機ポリマーで固めて血球分 離層が形成される試験片では、 有機ポリマーが水分を吸って膨潤しゃすく、 血漿 成分の展開に際して血球分離層の粒子間隙が小さくなり、 十分量の血漿成分が試 薬層に展開しない場合がある。
また、 特開昭 5 7 - 1 6 0 0 6 3号公報等に開示される前記試験片では、 層中 に適度な粒子間隙が形成されていることから、 キヤピラリー的作用によって血漿 成分が縦方向のみならず横方向へも展開することができ、 前述した透過光測定を 行う上で有利だが、 前記積層型試験片と同様に試薬層上で血球成分が拡がりやす いことから、 透過光測定における血球層の遮光や血球層の形成に伴う酸素透過性 の悪化については、 課題が残されている。 また、 この試験片は、 血漿成分が層中 を展開する際に、 発色試薬との反応によって生成した色素等がさらに展開してし まうことがあり、 検出される被検物質の分布濃度に偏りが生じてしまうことがあ る。
また、 この試験片は、 適度な粒子間隙を形成するようにポリマー粒子を接着剤 等で固定化することから、 その製造が複雑かつ困難である。 発明の開示
本発明は、 前記事項に鑑みなされたもので、 被検物質を透過光測定によっても 測定することができ、 酸素透過性が良く、 かつより高い精度で被検物質を測定す ることのできる試験片を提供することを課題とする。
本発明は、 前記課題を解決するための手段として、 以下のような構成とするこ ととした。
すなわち本発明は、 固体成分と液体成分とを含む検体から固体成分を分離して 液体成分に含まれる被検物質を検出することができる固体成分分離能を有する試 験片であって、 ビーズ、 無機ゲル、 及ぴ前記被検物質と検出しうる反応を起こす 試薬を含む多孔質構造の試薬層と、 この試薬層を支持する支持体とを含み、' 前記 ビーズ同士は前記無機ゲルによって接着され、 ビーズ間には前記固体成分を捕集 する粒子間隙が形成されていることを特徴とする試験片である。
また、 本発明は、 好ましくは前記検体が血球部分と血漿部分とを含む血液 （全 血） であり、 前記支持体が表面に親水部分を有し、 この親水部分に前記試薬層が 支持されていることが好ましい。 '
また、 本発明は、 前記ビーズの粒径が 0 . 5〜 1 0 ;z mであり、 かつビーズの含 有量が最終濃度で 1〜3 0重量％であることが好ましく、 前記無機ゲルを形成す る無機ゲル化剤の含有量が最終濃度で 0 . 1〜 3重量％であることが好ましい。 また、 本発明は、 前記試薬が被検物質と反応して光学的変化を起こす試薬であ ることが好ましく、 支持体が光透過性物質で構成されていることが好ましい。 本発明の試験片は試薬層と、 この試薬層を支持する支持体を含む。
試薬層は、 ビーズ、 無機ゲル、 及ぴ被検物質と検出しうる反応を起こす試薬を 含む多孔質構造を有する。 試薬層において、 ビーズ同士は無機ゲルによって接着 され、 ビーズ間には検体中の固体成分を捕集する粒子間隙が形成される。
前記ビーズは、 固体成分を粒子間隙で捕集できるものであれば良いが、 前記粒 径の範囲において粒度分布の狭いものであると、 固体成分を分離する上で好まし い。 また、 粒度分布の広いビーズを使用する場合や、 比較的粒径の大きなビーズ を使用する場合では、 粒径が 1 0 μ πι以下の比較的粒径の小さな粒子を含むビー ズを使用することが、 好適な粒子間隙を形成する上で好ましい。
ビーズの好適な粒径は、 粒子間隙で捕集しょうとする固体成分 （例えば前記血 球成分等） の大きさによって異なり、 ビーズの使用条件等によっては粒径が 3 0 m程度のビーズを使用することが可能だが、 好ましくは 0 . 5〜1 0 μ πιであり、 より好ましくは 3〜8； u mである。 ビーズの粒径が前記範囲よりも小さすぎると 液体成分の展開が円滑に行われないことがあり、 ビーズの粒径が前記範囲よりも 大きすぎると固体成分の捕集が十分に行われないことがある。
試薬層におけるビーズの好適な含有量は、 液体成分の所望の展開距離や試薬層 の好適な層厚によって異なるが、 好ましくは最終濃度で 1〜 3 0重量％である。 ビーズの含有量が前記範囲よりも小さすぎると試薬層の層厚が不十分となること があり、 ビーズの含有量が前記範囲よりも大きすぎると試薬層の層厚が必要以上 に大きくなることがある。
また、 前記ビーズは、 より球形に近い形状であると、 良好な粒子間隙を形成す る上で好ましい。 本発明では、 前述した条件を満たすビーズであればビーズの種 類を問うことなく好適に使用することができる。 このようなビーズとしては、 例 えば、 ガラスビーズ等の無機ビーズや、 ラテックスビーズ等の重合ビーズ等を例 示することができる。 これらの中でも、 製造にあたって粒径、 粒子形状や粒度分 布を制御しやすい重合ビーズを使用することがより好適である。 このような重合 ビーズは、 市販品を購入することによって入手することが可能であり、 また、 懸 濁重合法や乳化重合法等の常法に則って製造することも可能である。
前記無機ゲルは、 前記ビーズ同士を接着して試薬層を多孔質構造にするための ものである。 無機ゲルは、 有機ゲルに比べて一般に水を吸っても膨潤しにくいこ とから、 例えば、 被検物質を透過光測定によって測定する場合にセル長 （試薬層 の層厚） が一定に保たれやすい利点や、 液体成分の展開中における試薬層の粒子 間隙が一定に保たれやすい利点などがある。
また、 無機ゲルを形成する無機ゲル化剤は、 極性置換基を有する化合物や色素 等を一般に吸着しやすいことから、 前記試薬や、 試薬と被検物質との反応生成物 (色素等） を吸着しやすく、 検出された被検物質の分布濃度の偏りを生じにくい 利点がある。
さらに、 無機ゲルは、 チキソトロピー性を示すゲルであると、 無機ゾル時の流 動性に優れ、 かつ静置によって固化 （ゲル化） することから、 前記支持体上に試 薬層を形成する上で好適である。 また、 無機ゲルは、 水の添加によって透明にな ることが、 光学的変化によって被検物質を検出する上で好適である。
前記試薬層における無機ゲル化剤の好適な含有量は、 使用されるビーズの量や、 使用される無機ゲル化剤の性状 (ゲル形成能力など) によって異なるが、 好まし くは最終濃度で 0 . 1〜3重量％である。 無機ゲル化剤の含有量が前記範囲よりも 小さすぎるとビーズ同士の接着が不十分となり試薬層を形成できないことがあり、 無機ゲル化剤の含有量が前記範囲よりも大きすぎると余剰の無機ゲル化剤が前記 粒子間隙を埋めてしまい液体成分の展開に悪影響を及ぼすことがある。
前記無機ゲル化剤としては、 一般に使用される無機ゲル化剤を使用することが でき、 例えば、 ラボナイ トシリーズ （日本シリカ工業製） 、 ルーセンタイ ト S W N、 S W F (コープケミカル製） .、 チキソピー W (協和化学工業 （株） 製） 、 ス メタ トン S A、 クニピア （クニミネ工業 （株） 製） 、 マルチゲン （豊順鉱業 (株） 製） 等を例示することができる。
前記試薬は、 酸化還元反応、 酸塩基反応、 縮合反応、 錯体形成反応等により、 色素や蛍光色素等の光学的に検出可能な物質を生成する色素前駆体等の化合物や、 電気化学的に検出可能な電子伝達物質の酸化体又は還元体、 あるいは錯体化合物 を生成する化合物等において、 幅広く見出すことができる。
まず、 光学的に検出可能な物質を生成する試薬について具体的に説明する。 前記色素前駆体等としては、 好ましくは芳香族環等の共役系を有する化合物が 用いられ、 例えば、 4—アミノー 1， 2—ジヒ ドロー 1， 5—ジメチルー 2—フエ 二ルー 3 H—ピラゾールー 3—オン （以下、 「4— A A」 と略す） に代表される カプラーと水素供与体とにより酸化縮合によってキノン系色素を生成する試薬類 や、 オルト トリジン、 ベンジジン類などの酸化発色体色素を生成する色素前駆体 や、 色素のロイコ体等、 酸化されることによって発色する色素前駆体や、 酸化さ れて蛍光物質を生成する試薬類や、 化学発光物質などの発光物質や、 テトラゾリ ゥム塩等、 還元されて色素を生成する試薬類や、 p Hの変化によってァゾ色素を 生成するジァゾニゥム塩類や、 呈色反応用の試薬や、 蛍光物質の生成反応用の試 薬や、 酵素によって反応し色素や蛍光物質を生成する酵素基質や、 錯体を形成し 発色又は変色する化合物、 等を例示することができる。
前記水素供与体とは、 酸化剤の共存下で、 4—A Aや 3—メチルー 2—べンゾ チアゾリノンヒ ドラゾンと縮合してキノン系色素を生成するフエノール等の化合 物であり、 具体的にはジクロ口フエノール、 オルトメ トキシフエノール、 1， 2， 3— トリ ヒ ドロキシベンゼン、 ジメチノレア二リ ン、 N—ェチノレー N—スノレホプロ ピ^^メタァニシジン、 N—ェチノレ一 N—スノレホプロピノレアエリン、 N—ェチノレー N - ( 3—スノレホプロピル） - 3 , 5—ジメ トキシァ-リン、 N—ェチル一 N— ( 3—スノレホプロピル） 一 3， 5—ジメチノレア二リ ン、 N—ェチル一N—スルホ プロピルメタ トノレイジン、 N—ェチノレ一 N— （ 2—ヒ ドロキシ一 3—スルホプロ ピノレ） メタァニシジン、 N—ェチルー N— ( 2—ヒ ドロキシー 3—スノレホプロピ ノレ） ァニリン、 N—ェチノレ一 N— （ 2—ヒ ドロキシ一 3—スノレホプロピル） 一 3， 5ージメ トキシァニリン、 N— ( 2—ヒ ドロキシ一 3—スルホプロピル） 一 3 , 5 —ジメ トキシァニリン、 N—ェチル一 N— ( 2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピ ル） 一 3， 5—ジメチノレア二リン、 N—ェチルー N— ( 2—ヒ ドロキシ一 3—ス ルホプロピル） メタ トルイジン、 N— ( 3—スルホプロピル） ァニリン等が挙げ られる。'
前記オルト ト リジン、 ベンジジン類と しては、 オルト トリジン、 ジァニシジン、 3， 3 ' ージァミノべンジジン、 3 , 3 ' ， 5 , 5 ' ーテトラメチルベンジジン、 N - ( 3 —スノレホプ Gピ /レ） 一 3， 3 ' ， 5 , 5 ' —テトラメチルベンジジン等 が挙げられる。 前記ロイコ体とは酸化されて色素となり発色する無色の色素前駆体である。 口 ィコ体が酸化された色素としては、 2， 6—ジクロロー 4— [ ( 4—ヒ ドロキシ フエ二ノレ） ィ ミノ] — 2 , 5—シクロへキサジェン一 1 一オン、 2， 6—ジクロ 口一 4一 [ ( 3—クロ口一 4—ヒ ドロキシフエニル） ィミノ] — 2， 5—シクロ へキサジェン一 1 一オン、 7— (ジェチルァミノ） 一 3—イ ミノー 8—メチル一 3 H—フエノキサジン塩、 3— (ジェチルァミノ） 一 7 -ァミノ一 5—フエニル フエナジニゥム塩、 3， 7—ビス （ジメチルァミノ） フエノチアジン一 5—ィゥ ム塩、 1ーヒ ドロキシー 5—メチルフエナジニゥム塩、 7—ヒ ドロキシー 3 H— フエノキサジン一 3—オン一 1 0—ォキシドが挙げられ、 ロイコ体としては、 4， 4， 一ベンジリデンビス （N， N—ジメチルァニリン） 、 4， 4 ' —ビス [ N— ェチル一 N— ( 3—スルホプロピルァミノ） 一 2， 6—ジメチルフエニル] メタン、 1一 （ェチルアミノチォカルボニル） 一 2— （ 3， 5—ジメ トキシ一 4—ヒ ドロ キシフエ二ノレ） 一 4， 5 -ビス （4ージェチルァミノフエニル） イミダゾール、 4， 4， 一ビス （ジメチノレアミノ） ジフエニノレアミン、 N— (カルボキシメチル ァミノカルボニル） 一 4 , 4 ' —ビス （ジメチルァミノ） ジフエニルァミン塩、 1 0 - (カルボキシメチルァミノカルボニル） 一 3， 7—ビス （ジメチルァミノ） フ エノチアジン塩、 等が挙げられる。
酸化されて発色する色素前駆体としては、 そのほかに、 4—メ トキシフエノー ル、 4—エトキシフエノール、 2—エトキシフ 'ェノール、 1— ( 2—ヒ ドロキシ — 5—メ トキシフエ二ル） エタノン、 2—ヒ ドロキシー 5—メ トキシ安息香酸、 2—ヒ ドロキシ一 5—メ トキシベンズァノレデヒ ド、 2—ヒ ドロキシー 5—メ トキ シ安息香酸メチノレ、 4—メ トキシ一 2—ニトロフエノーノレ、 2—クロロー 4—メ トキシフエノー Λ\ 4—ヒ ドロキシー 3—メ トキシベンズアルデヒ ド、 4—ヒ ド 口キシー 3—メ トキシ安息香酸などが挙げられる。
また、 3— （4ーヒ ドロキシフエ二 — 2—プロペン酸、 2—ヒ ドロキシフ ェニル酢酸、 3—ヒ ドロキシフエエル酢酸、 4ーヒ ドロキシフヱニル酢酸、 3— ヒ ドロキシ安息香酸、 4ーヒ ドロキシ安息香酸、 2—ァミノ安息香酸、 3—アミ ノ安息香酸、 4—ァミノ安息香酸、 3， 4ージァミノ安息香酸、 3 , 5—ジァミノ 安息香酸、 4一アミノー 2—クロ口安息香酸、 4一アミノー 3—メチル安息香酸、 4一アミノー 3—メ トキシ安息香酸、 4—アミノフタル酸などが挙げられる。 また、 2, 4—ジアミノー 6—ヒ ドロキシピリ ミジン、 4， 5—ジァミノ一 6— ヒ ドロキシピリ ミジン、 4一アミノー 2， 6—ジヒ ドロキシピリ ミジン、' 6—ヒ ド ロキシ 2， 4， 5— トリアミノビリ ミジン、 4, 5—ジァミノー 2， 6—ジヒ ドロキ シピリ ミジン、 4一アミノー 6—ヒ ドロキシー 2—メチルピリ ミジン、 4一アミ ノ一 6—ヒ ドロキシ一 2—メ トキシピリ ミジンなどが挙げられる。
前記酸化されて蛍光物質を生成する試薬類としては、 4—ヒ ドロキシフヱニル 酢酸、 （4—ヒ ドロキシ一 3—メ トキシフヱニル） 酢酸、 3— (4—ヒ ドロキシ フエニル） プロピオン酸、 4—ヒ ドロキシー （2—アミノエチル） フエノール、 4ーヒ ドロキシー N, N， N—ト リメチノレベンゼンメタミニゥム、 ァノレファアミ ノパラヒ ドロキシヒ ドロケィ皮酸、 4ーヒ ドロキシフエネチルァミン、 N— (4 ーヒ ドロキシフエエル） ァセトァニリ ド、 2， 7—ジクロロフルォレツセインジ ァセテ一ト等が挙げられる。
前述したような色素を生成する酸化反応において、 酸化反応に関与する酸化剤 として、 過酸化水素等の酸化剤や、 ペルォキシターゼ等の酸化酵素が好ましく用 いられる。 しかし、 前記酸化反応に関与する酸化剤はもちろんこれらに限定され るものではなく、 種々の公知の酸化剤や酸化酵素であっても良い。
前記化学発光物質など発光物質と'して.は、 ホタルルシフェリン、 ゥミホタルル シフェリン、 ェクオリン、 ルシゲニン誘導体、 ルミノール誘導体、 アタリジニゥ ムエステル、 過シユウ酸エステル等が挙げられる。
前記テトラゾリゥム塩としては、 2， 3， 5—トリフエニルテトラゾリゥム塩、 2, 5—ジフエニル一 3— （1一ナフチル） 一 2 H—テトラゾリゥム塩、 3, 3 — [3, 3， 一ジメ トキシ一 （1， 1， 一ビフエニル） 一4， 4 ' ージィル] 一 ビス [2— (4—二ト口フエニル） 一 5—フエニル一 2H—テトラゾリ ゥム] 塩、 3， 3 - [3 , 3 ' —ジメ トキシ一 （1， 1， ービフエニル） 一4， 4 ' ージィ ル] —ビス [2， 5—ジフエ二ルー 2 H—テ トラゾリ ゥム] 塩、 2— （4—ョー ドフエ二ル） 一 3— (4—ニトロフエニル） 一 5—フエニル一 2 H—テ トラゾリ ゥム塩、 2— （4一ョードフエニル） 一 3— （4一二トロフエニル） 一 5— (2， 4—ジスルホフエエル） 一 2 H—テトラゾリ ゥム塩、 2— (4—ョードフエ二 ノレ） 一 3— ( 2， 4ージニトロフエ二ノレ） 一 5— （2， 4一ジスルホフエ二ノレ） 一 2 H—テトラゾリゥム塩、 3， 3， 一 （1， 1， 一ビフエ二ルー 4 , 4， ージ ィル） 一ビス （2， 5—ジフエニル一 2 H—テトラゾリゥム） 塩、 3— ( 4， 5 —ジメチルー 2—チアゾリル） 一 2 , 5—ジフエ二ルー 2 H—テトラゾリゥム塩 等が挙げられる。
また、 還元されて色素を生成する化合物としては、 1， 1 ' ージメチル一 4， 4， 一ビビリジリウム塩、 1， 1 ' —ジベンジル一 4， 4， 一ビビリジリウム塩 等の還元体が挙げられる。 また 7—ヒ ドロキシー 3 H—フエノキサジン一 3—ォ ンー 1 0—ォキシドなどが還元されて蛍光色素を生成するが、 このような蛍光色 素を生成する試薬としては、 7—ヒ ドロキシー 3 H—フエノキサジン一 3—オン - 1 0—ォキシド、 5—シァノ一 2， 3—ビス （4—メチルフエ-ル） 一 2 H—テ トラゾリゥム塩、 2， 3—ビス （4—シァノフエニル） 一 5—シァノ一 2 H—テト ラゾリゥム塩等が還元されて生成する蛍光物質等が挙げられる。
このような色素を生成する還元反応において、 還元反応に関与する還元剤とし て、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （N A D ) や、 ニコチンアミ ドアデ ニンジヌクレオチドホスフェート等が好ましく用いられる。 しかし、 前記還元反 応に関与する還元剤はもちろんこれらに限定されるものではなく、 種々の公知の 還元剤た還元酵素であっても良い。
前記 p Hの変化によって発色または変色する化合物としては、 プロモクレゾー ノレグリーン、 ブロモフエノーノレブスレー、 フエノーノレレッ ド、 ブロモピロガロ一ノレ レッド、 ピロガロールレツ ドなどのスルホンフタレイン系色素、 マラカイ トグリ ーン、 ロゾリックァシドなどのトリフエニルメタン系色素、 キナルジンレッ ド、 N— (パラヒ ドロキシフエニル） 一 2， 6—ジクロロパラべンゾキノンィミンな どのキノリン系色素、 7—ヒ ドロキシー 3 H—フエノキサジン一 3—オン一 1 0 —ォキシドなどのォキサゾン系色素、 6， 7—ジヒ ドロキシ一 4—メチルクマリ ンなどのクマリン系色素、 ァ-リンオリゴマーなどの導電性高分子化合物が挙げ られる。
前記ジァゾニゥム塩類としては、 ィンドキシルとカツプリングしてァゾ系色素 を生成する 2—メ トキシー 4一モルホリノベンゼンジァゾ -ゥム塩、 ゥロビリノ 一ゲンとカップリングしてァ.ゾ系色素を生成する 3， 3 ' ージメ トキシビフエ二 ル—4， 4 ' —ジァゾニゥム塩などが挙げられる。 またこの範疇にある試薬とし ては、 ジァゾ二ゥム塩を生成する反応に関与する試薬がある。 そのような試薬と しては、 亜硝酸塩の存在下にジァゾ二ゥム塩を生成する 4—アミノベンゼンアル ソン酸やそのジァゾ -ゥム塩とカツプリングしてァゾ系色素を生成する N— 1― ナフチルエチレンジアミンなどが挙げられる。 また亜硝酸塩の存在下に力ップリ ングしてァゾ系色素を生成する 2 , 4—ジクロロア二リン、 N， N—ジェチルー N ， 一 1—ナフチルナフチルエチレンジアミンシユウ酸塩 （津田試薬） が挙げられ る。 また、 亜硝酸塩が挙げられる。
前記呈色反応用の試薬としては、 アルデヒ ドを検出するときの過酸化水素と 1， 4ージァミノベンゼン、 アルデヒ ドを検出するときの 2， 3ージメチルー 2 , 3 一ビス （ヒ ドロキシァミノ） ブタン、 アルデヒ ドを検出するときの 3—メチルー 2—ベンゾチアゾリノンヒ ドラゾンと酸化剤、 二級アミンを検出するときの 1 0 H—フエノチアジンと臭素、 チオールを検出するときの 2， 2 ' ージチォジピリ ジンなどが挙げられるが、 もちろんこれらに限定されるものではない。 ，
前記蛍光物質の生成反応用の試薬としては、 グァニジノ化合物を検出するとき の 2—ヒ ドロキシー 1， 2—ジフエニルエタノン、 ヒスタミンを検出するときの オルトフタルアルデヒ ド、 スペルミジンを検出するときのオルトフタルアルデヒ ド、 アルファケト酸を検出するときの 1 , 2—ジァミノー 4， 5—ジメ トキシべ ンゼンなどが挙げられるが、 もちろんこれらに限定されるものではない。
前記酵素によって反応し色素や蛍光物質を生成する酵素基質としては、 キモト リプシンの基質である N—トシル一 L—フエ二ルァラニン一 2—メチルァク リ ド ン、 アミノぺプチダーゼの基質である L—ァラニン一 2—メチルアタリ ドン、 ェ ステラーゼを測定するときの 7—ァセトキシー N—メチルキノリニゥム塩、 エス テラーゼの基質である 7—ァセトキシ一 3 H—フエノキサジン一 3—オン、 ホス ファタ一ゼの基質である 4ーメチルゥンベリフェリルリン酸塩、 ホスフオターゼ の基質である 5， 1 0， 1 5， 2 0—テトラキス （4一ホスホノォキシフエニル） ポ ルフィンなどが挙げられるが、 もちろんこれらに限定されるものではない。 なお、 酵素や酵素基質は例えば抗体やその断片に化学的に結合していてもよい。 前記錯体を形成し発色又は変色する化合物とは、 金属イオンゃァニオンと、 配 位結合ゃィオン結合で錯体を形成し、 色素あるいは蛍光物質を生成する配位子な どの化合物である。 金属イオンと錯体を形成し発色 ·変色する化合物としては、 金属指示薬ゃク口モイオノファとして知られている化合物のほか、 有色の遷移金 属イオンと錯体を形成して着色する化合物が含まれるが、 具体的にはエチレンジ アミン四酢酸、 2， 2 -ビビリジン、 1—ヒ ドロキシ一 2— (2—ヒ ドロキシフ ェニノレアゾ） ベンゼン、 ジベンゾ一 1 8—クラウン一 6、 ジシクロへキシノレ一 1 8—クラウン一 6、 環状ポリアミン類、 力リ ックス [4] ァレーン、 3— [N, N—ビス （カルボキシメチル） アミノメチル] 一 1 , 2—ジヒ ドロキシアンスラ キノン、 5 ' ， 5" —ジブ'ロモピロガローノレスノレホンフタレイン、 2—ヒ ドロキ シ一 1— ( 1—ヒ ドロキシー 2—ナフチノレアゾ） 一 6—二トロ一 4—ナフタレン スルホン酸塩、 2， 6—ジクロ口一 4 ' —ヒ ドロキシー 3 ' ， 3" —ジメチルフ クソン一 5 ' ， 5" —二カノレポン酸塩、 3， 3， 一ビス [N， N—ビス （カルボ キシメチル) アミノメチル] フルォレツセイン、 8一 [N, N—ビス (カルボキ シメチル） アミノメチル] — 4—メチルゥンベリフエロン、 2， 7—ビス （2— ァノレソノフエニノレアゾ） 一 1， 8—ジヒ ドロキシー 3， 6—ナフタレンジス/レホ ン酸、 5—クロロー 2—ヒ ドロキシー 3— (2, 4—ジヒ ドロキシフエニノレア ゾ） ベンゼンスルホン酸、 5— [ (へキサヒ ドロ一 2 , 4, 6— トリオキソ一 5 —ピリ ミジニル） ィミノ] — 2， 4， 6 ( 1 H, 3 H, 5 H) 一ピリ ミジントリ オン塩、 2— （ 5—ブロモー 2—ピリジルァゾ） 一 5— [N—プロピル一 N—
(3—スルホプロピル） ァミノ] ァニリン塩、 1， 8—ジヒ ドロキシー 2— (2 —ピリジルァゾ） 一 3， 6—ナフタレンジスルホン酸塩、 2—-トロソー 5—
[N—プロピル一N— (3—スルホプロピル） ァミノ] フエノール等が挙げられ る。
また特に一価のカチオンと有色錯体を生成する化合物としては、 テトラキス [3， 5—ビス （トリフルォロメチル） フエニル] ボレ一ト塩、 テトラフェニル ホスホ-ゥム塩等が拳げられる。
また特にカルシウムイオンなどと蛍光錯体を生成する化合物としては、 1 一
[2—アミノー 5— （2， 7—ジクロロー 6—ヒ ドロキシー 3—ォキシ一 9ーキ サンテュル) フエノキシ] —2— ( 2—アミノー 5—メチノレ'フエノキシ） ェタン — N， N, N， ， N' —四酢酸塩、 1— [2—ァミノ一 5— （2， 7—ジクロロ — 6—ヒ ドロキシー 3—ォキシ一 9ーキサンテニル） フエノキシ] —2— (2— ァミノ一 5—メチルフエノキシ） エタンー N， N, N， ， N， 一四酢酸ペンタァ セトキシメチルエステル、 1一 [6—ァミノ一 2— ( 5—カルボキシー 2—オギ ザゾィル） 一 5—ベンゾフラ二口キシ] 一 2— ( 2—ァミノ一 5—メチルフエノ キシ） エタンー N， N, N， ， N' —四酢酸塩、 1— [6—アミノー 2— （5— カルボキシ一 2—オギザゾィル） 一 5—ベンゾフラ二口キシ] — 2— （2—アミ ノ一 5—メチルフエノキシ） ェタン一 Ν， Ν， Ν' ， Ν， 一四酢酸ペンタァセト キシメチルエステル、 1— [2—アミノー 5— ( 6—カルボキシ一 2—インドリ ル） フエノキシ] — 2— ( 2—ァミノ一 5—メチルフエノキシ） ェタン一 Ν， Ν， Ν' ， Ν， 一四酢酸塩、 1— [2—ァミノ一 5— ( 6—カルボキシ一 2—インド リル） フエノキシ] - 2 - (2 _アミノー 5—メチルフエノキシ) ェタン一 Ν, Ν, N' ， N' —四醉酸ペンタァセトキシメチノレエステ/レ、 8—ァミノ一 2—
[ ( 2—アミノー 5—メチルフエノキシ） メチル] 一 6—メ トキシキノリ ン一 Ν, Ν, Ν， ， N' —四酢酸塩、 8—アミノー 2— [ ( 2—ァミノ一 5—メチルフエ ノキシ） メチル] — 6—メ トキシキノリン一 Ν， Ν， Ν， ， N' —四酢酸ペンタ ァセトキシメチルエステル、 3, 3， 一ビス [Ν， Ν—ビス （カルボキシメチ ル） アミノメチル] フルォレツセイン、 8— [Ν, Ν—ビス （カルボキシメチ ル） アミノメチル] —4—メチルゥンベリフエロンなどが挙げられる。
またァニオンと有色錯体を形成するテトラフヱニルアルソニゥム塩、 塩化物ィ オンと錯体を形成すると蛍光強度が減少する臭化 Ν—エトキシカルボニルメチル —6—メ トキシキノリニゥム、 ホウ素と錯体を形成する 8—ヒ ドロキシ一 1— (サリシリデンアミノ） 一 3, 6—ナフタレンジスルホン酸塩などが挙げられる。 被検物質に対する前記試薬の具体例としては、 例えば被検物質がグルコースで ある場合には、 グ^^コースォキシターゼと、 パ一ォキシターゼと、 4— ΑΑと、 Ν—メチル一 Ν— ( 2—ヒ ドロキシ _ 3—スルホプロピル） 一3， 5—ジメチノレア 二リンとを、 被検物質がコレステロールである場合には、 コレステロールォキシ タ一ゼと、 パーォキシターゼと、 4—ΑΑと、 Ν—メチルー Ν— （2—ヒ ドロキ シ一 3—スルホプロピル） 一 3 , 5—ジメチルァニリンとを、 被検物質が乳酸であ る場合には、 乳酸脱水素酵素と、 N A D +と、 ジァホラーゼと、 テトラゾリゥムヴ ア^オレッ トとを、 被検物質がアルカリフォスファターゼである場合には、 p— 二ト口フエニルフォスフェートを、 それぞれ例示することができる。
次に、 電気化学的に検出可能な物質を生成する試薬について具体的に説明する。 電気化学的に検出可能な試薬としては、 例えば、 電子伝達物質の酸化体又は還 元体や、 特定のイオンに対してイオン結合又は配位結合して錯体化合物を生成す る配位子等が挙げられる。 ·
電子伝達物質とは、 被検物質を酵素などによって酸化又は還元し、 その際被検 物質から、 又は被検物質に、 直接的あるいは間接的にに電子を受容又は供与する 化学物質である。 このような電子伝達物質の還元体又は酸化体を電極で酸化又は 還元するときの電気化学応答から被検物質を定量することができる。
電子伝達物質としては、 具体的には、 1 , 1， 一ジメチルー 4， 4 ' —ビビリ ジリウム塩、 1， 1 ' —ジベンジルー 4， 4 ' 一ビビリジリウム塩、 1， 4—ジ 了ミノベンゼン、 2ーメチルー 1， 4一ナフトキノン、 N—メチルフエナジニゥ ム塩、 1—ヒ ドロキシ一 5—メチルフエナジニゥム塩、 1ーメ トキシー 5—メチ ルフヱナジニゥム塩、 9—ジメチルァミノベンゾアルファフエノキサジン一 7— ィゥム塩、 フエ口セン誘導体、 へキサシァノ鉄 （II) 塩、 7—ヒ ドロキシー 3 H —フエノキサジン一 3—オン一 1 0—ォキシド、 3， 7—ジァミノ一 5—フエ二 ルフエナジニゥム塩、 3— (ジェチルァミノ） 一 7—ァミノ一 5—フエユルフェ ナジニゥム塩、 1， 4 -ベンゼンジォーノレ、 1， 4ージヒ ドロキシ一 2 , 3， 5— トリメチルベンゼン、 N， N , Ν， , Ν， ーテトラメチルー 1， 4—ベンゼンジ ァミン、 厶 2， 2， 一ビー 1， 3—ジチオール、 2， 6—ジメチルベンゾキノン、 2， 5—ジメチルベンゾキノン、 2， 3， 5， 6—テトラメチル一 2， 5—シク 口へキサジェン一 1， 4—ジオン、 2， 6—ジクロロ一 4— [ ( 4—ヒ ドロキシ フエニル） ィミノ] 一 2， 5ーシク口へキサジェン一 1一オン、 2， 6—ジクロ 口一 4— [ ( 3—クロ口一 4—ヒ ドロキシフエ-ノレ） ィミノ] — 2， 5—シクロ へキサジェンー 1一オン、 7— （ジェチルァミノ） — 3—イミノー 8—メチルー
3 Η—フエノキサジン塩、 3 , 7—ビス （ジメチルァミノ） フエノチアジンー 5 ーィゥム塩等が挙げられる。
前記配位子としては、 具体的には、 カチオンと錯体をつくる配位子として、 テ トラキス [3, 5—ビス (トリフルォロメチル) フエニル] ボレート塩、 テトラ フエニルホスホ-ゥム塩、 バリノマイシン、 シクロ （N， ， N' —ジォクチルー D—ァスパラギニル一 :^—プロリル一 L—ァラ ル） 2、 ビス （ベンゾ一 1 5—ク ラウンー 5) 、 ビス [ (ベンゾ一 1 5—クラウン一 5) 一 4—メチル] ピメレー ト、 ビス ( 1 2—クラウン一 4) 、 ビス [ (1 2—クラウン一 4) メチル] 一 2 —ドデシル一 2—メチルマロネート、 14—クラウン一 4、 ドデシルーメチルー 14—クラウン一 4、 6， 6—ジベンジルー 1, 4， 8， 1 1—テトラオキサシ クロテトラデカン、 ジベンゾー 18—クラウン一 6、 ジシクロへキシ^— 1 8— クラウン一 6、 4， 16—ジー N—ォクタデシルカルパモイルー 3—ォキサブチリ ルー 1, 7, 10, 1 3, 1 9一ペンタォキサ一 4, 16—等ジァザシクロへンィコサ ンが挙げられる。
またァニオンと錯体をつくる配位子として、 テトラフェニルアルソニゥム塩、 6—メ トキシー N— (3-スルホプロピル） キノリニゥム塩などが挙げられる。 以上、 試薬層に含まれる試薬について具体的に説明したが、 試薬層には、 前述 したビーズ、 無機ゲル、 及び試薬の他にも、 試薬層の固体成分分離能と、 被検物 質と試薬との反応とを阻害しない範囲であれば、 通常使用される添加剤等を添加 しても良い。
例えば、 前記検体がヒ ト血液である場合では、 固体成分が血球成分となり、 液 体成分が血漿成分となる。 このとき、 血球成分中の赤血球の長径は、 等張時で 6 〜9 μ ιηであるが、 試薬の塩濃度や ρ Ηの変化によって赤血球の大きさや状態が 変化し、 試薬層の ρΗや塩濃度が不適当であると、 試薬層の粒子間隙で捕集する ことができなくなる場合もある。 このような場合に使用するのが好適な添加剤と しては、 例えば、 ビス一トリス緩衝液 （ビス. （2—ヒ ドロキシェチル） イミノ ト リス （ヒ ドロキシメチル） メタンと塩酸から調整された緩衝剤） 、 リン酸緩衝液、 クェン酸緩衝液、 Ν— （2—ァセトアミ ド） ィミノ二酢酸緩衝液等の緩衝剤や、 塩化ナトリ ゥム等の中性塩などを例示することができる。
また、 光学的変化を利用して被検物質を反射光測定で検出しょうとする場合で は、 支持体には光透過性物質で構成された支持体を使用し、 添加剤としては、 測 定光を反射又は散乱して測定光の反射効率を高める酸化チタン等の粉体を例示す ることができる。
また、 液体成分の展開を高めるために、 界面活性剤を添加剤として使用するこ とができる。 このような界面活性剤としては、 例えば、 n—ォクチル一 — D— ダルコピラノシドなどの糖アルキルエーテル類、 η—ォクチルー β—D—チォグ ルコピラノシド、 η—ヘプチル一 β— D—チォダルコビラノシドなどの糖アルキ ルチオエーテル類、 η—オタタノイノレー Ν—メチルダルカミ ド、 η—ノナノイノレ 一 Ν—メチルダルカミ ドなどの糖アミ ド類、 ]3— D—フラク トビラノシルー α— D—ダルコビラノシドモノデカノエートなどの糖エステル、 N， N—ビス （3—D —ダルコナミ ドプロピル） デォキシコラミ ドなどが挙げられる。
試薬層の層厚は、 液体成分の展開距離に影響し、 層厚が大きくなると液体成分 の展開距離も大きくなり、 層厚が小さくなると液体成分の展開距離も小さくなる 傾向が見られる。 従って、 試薬層の好適な層厚は、 液体成分の所望の展開距離に よって異なるが、 好ましくは 5〜1 3 0 μ πιであり、 より好ましくは 3 0〜1 0 0 μ πιであり、 より一層好ましくは 5 0〜 9 0 μ mである。 試薬層の層厚が前記 範囲よりも小さすぎると液体成分の展開が十分になされず被検物質の正確な検出 や測定に支障をきたすことがあり、 試薬層の層厚が前記範囲よりも大きすぎると 被検物質を検出するのに多量の検体が必要となることがある。
前記支持体は、 前記試薬層を支持することが可能であれば、 その形状や材質等 について特に限定されないが、 表面に親水部分を有し、 この親水部分で試薬層を 支持するものが好ましい。 その理由としては、 検体が試薬層に点着されたのちの 液体成分の展開に前記親水部分が大きく影響すると考えられている。
液体成分は、 自重による縦方向への展開と、 キヤピラリー的作用による縦方向 及び横方向への展開とによって試薬層中を展開する。 一方で前記親水部分は、 水 との親和性が良好で水溶性の液体成分の表面張力を弱める。 従って、 親水部分は、 試薬層中において液体成分には横方向に流れるよう作用し、 この親水部分の作用 によって液体成分が斜め下方に展開するものと考えられる。 また、 親水部分によ る横方向への作用は、 作用面積が大きく、 また、 横方向にのみ働くことから、 前 述したキヤビラリ一的作用に比べて液体成分の横方向への展開に大きく寄与して いると考えられる。 このため、 全血中の被検物質を透過光測定で測定する場合な どでは、 被検物質の検出を妨害する血球成分の付着部分よりも、 試薬層の横方向 においてより離れた位置で被検物質を検出することができ、 透過光測定を行う上 でより好ましい。
支持体は、 親水部分と疎水部分とを有するものであることが好ましく、 親水部 分は、 適当な形状 （例えば角形、 方形、 円形、 楕円形、 又はこれらの形状が組み 合わさって形成される形状等） や大きさに形成されると、 試薬層の大きさを適度 なものとすることができるので好ましい。 また親水部分と疎水部分とを有する支 持体は、 例えば、 シリコンや油脂等の疎水性物質を親水性素材に塗布するなど、 親水性素材を疎水化処理することによって作製しても良いし、 また、 疎水性素材 を親水化処理することによって作製しても良い。
また、 支持体は、 光透過性物質で構成されていると、 被検物質を光学的変化に よって検出する場合において、 透過光測定による測定が可能になることから好ま しい。 前記光透過性物質としては、 例えば、 ガラス等の無機化合物や、 透明ブラ スチック等の有機高分子化合物を例示することができる。
このうち、 透明プラスチック等の有機高分子化合物は、 疎水性のポリマーであ つても紫外線の照射や、 シラノール処理等によって表面を親水化処理することが でき、 このような親水化処理を行うことによって透明プラスチックを支持体とし て好適に使用することができる。 このような有機高分子化合物としては、 例えば、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリフノレオ口エチレン等のポリオレフイン系樹 脂や、 ポリスチレン、 ポリエチレンテレフタレート等、 容易に入手可能な有機高 分子化合物を例示することができる。
本発明の試験片は、 前記試薬が均一に分散、 又は溶解し、 前記ビーズが均一に 分散している無機ゾル （無機ゲル化剤が分散しているコロイ ド溶液） を、 前記支 持体上に層状に形成することによって作製することができる。 前記ビーズは、 無 機ゾル中に分散させても良いし、 無機ゲル化剤の粉体とビーズとを予め混合し、 この混合粉体に水、 又は前記試薬が均一に分散あるいは溶解した水系分散媒、 を 添加することにより、 無機ゾル中に分散しても良い。 また、 前記試薬は、 前記無 機ゾル中に前記試薬を均一に分散又は溶解させても良いし、 無機ゲル化剤添加前 の水系分散媒中に予め均一に分散又は溶解させても良い。
また、 前記無機ゾルの支持体上での層形成も、 通常用いられる方法によって行 うことができ、 例えば、 ドクターナイフ等によって均一かつ所定の層厚となるよ うに塗工して形成しても良いが、 支持体上に所定形状にパターユングされた親水 部分を設け、 親水部分の面積に応じた適量の無機ゾルを親水部分に供給すると、 無機ゾルが親水部分上に拡がり'、 均一な層厚の試薬層を支持体上に形成すること ができるので好ましい。
試薬層は、 前記支持体上に供給された無機ゾルから、 ビーズを接着する無機ゲ ルの性状が損なわれない程度に水分を除くことによって形成することができる。 無機ゾルからの水分の除去は、 試薬の変性等を防止し被検物質の検出結果に支障 を来さない条件の乾燥によって行われれば良く、 乾燥条件は使用される試薬の種 類等によって異なるが、 例えば、 2 5 °Cでの乾燥、 4 0〜5 0 °Cでの乾燥、 減圧 条件下での乾燥、 低温条件下 （例えば 5 °C前後等） での乾燥、 又はこれらが組み 合わされた条件での乾燥等を例示することができる。 使用される試薬が変性しや すいものである場合では、 低温条件下で無機ゾルを乾燥することが、 試薬の変性 を抑制する上で一般に好ましい。
本発明の試験片は、 試薬層上の適当な個所に、 少なく とも液体成分中に被検物 質を含む検体を点着し、 試薬層中に展開する被検物質と試薬との反応を検出する ことによって、 被検物質を検出することができる。
本発明の試験片の対象となる検体は、 固体成分が含まれない液体成分のみの検 体であっても良いが、 本発明の試験片は、 検体中の固体成分を分離して液体成分 中の被検物質を検出することができる固体成分分離能を有することから、 固体成 分と液体成分とが含まれる検体の分析に利用することがより好ましい。 このよう な検体としては、 例えば、 前述したように、 固体成分としての血球成分と液体成 分としての血漿成分とが含まれる血液 （全血） を例示することができる。 また、 本発明の試験片は、 全血の他にも、 尿等の生物学的材料 （生体試料） 、 食品、 医 薬、 自然環境に存在する微量物質、 産業化学物質、 廃棄物中の微量物質等の分析 に利用することができる。 ここで、 全血を検体とする一例を示し、 検体分析時における本発明の試験片の 様子を説明する。
本発明の試験片における試薬層は、 前記ビーズと前記無機ゲルと前記試薬とに よって形成される多孔質構造であることから、 試薬層上に全血を点着することに よって試薬層上に血球成分が残り、 試薬層中を血漿成分が点着部分から横方向へ も展開する。 このとき、 試薬層には無機ゲルが含まれることから、 試薬層上に点 着された全血が試薬層上で拡がりにくく、 血球成分が試薬層上に拡がりにくい。 このため、 試薬層上における血球成分の付着部分よりも横方向に展開した位置で 血漿成分中の被検物質を検出することができ、 血球成分によって測定光が遮られ ないことから、 被検物質を透過光測定によって測定することができる。 また、 試 薬層は、 血球成分が試薬層上に拡がりにくいことから試薬層上に血球層が形成さ れにく く、 かつ多孔質構造であることから、 酸素透過性に優れている。 また、 試 薬層は、 血球成分が試薬層上で拡がりにくく、 かつ血漿成分が試薬層中を横方向 にも展開することから、 前述した積層型試験片に比べて、 少量の検体で被検物質 を検出することができる。
また、 試薬層は、 ビーズが無機ゲルによって接着されて多孔質構造を形成する ことから、 試薬層中の試薬やこの試薬と被検物質との反応生成物などが無機ゲル によって吸着されやすく、 試薬や反応生成物などのさらなる展開が抑制され、 こ れらの試薬層中での分布濃度が一定に保たれやすい。 従って、 より精度の高い被 検物質の測定を行うことができる。
本発明における被検物質は、 前記液体成分中に存在し前記試薬によって検出し うる物質であれば特に限定されず、 例えば、 前記検体が生体試料である場合の被 検物質としては、 グルコース、 コレステロール、 乳酸、 アルカリフォスファタ一 ゼ等を例示することができる。 なお、 液体成分は、 水溶性であっても良いし非水 溶性であっても良いが、 一般には水溶性であることが多く、 また、 本発明では水 溶性であることが好ましい。
前記被検物質の検出方法は、 前記試薬と被検物質との反応を検出することがで きる方法であれば特に限定されず、 例えば、 前記試薬と被検物質との反応によつ て生じる光学的変化から被検物質を検出する方法や、 前記試薬と被検物質との反 応によって生じる電気化学的変化から被検物質を検出する方法等を例示すること ができる。 これら被検物質の検出方法では、 被検物質に対して定量的に反応する 試薬類を前記試薬に使用すると、 被検物質を検出するのみならず、 光学的変化、 電気化学的変化等を測定することによつて被検物質を定量することができる。 光学的変化から被検物質を検出する方法では、 光透過性物質により構成される 支持体を使用し、 前記光学的変化を例えば透過光測定、 反射光測定等の測定によ つて被検物質を検出することができる。 なお、 光学的変化とは、 一般に被検物質 と前記試薬との反応による発色反応を例示することができるが、 発色のみならず、 例えば変色、 蛍光、 発光等を例示することができる。 また、 被検物質を定量する 場合では、 例えば、 一般に使用されている吸光光度計や蛍光光度計等を利用した 前記光学的変化の測定や、 ラマン分光測定等を適用することが可能である。
前記電気化学的変化から被検物質を検出する方法では、 酸化還元反応を利用す る方法や、 被検物質がイオンである場合にこのイオンから生じる錯体化合物を利 用する方法等が挙げられる。
前記酸化還元反応を利用する方法としては、 例えば、 カーボン電極等の通常使 用される電極を使用し、 被検物質との酸化還元反応によって生成する前記試薬の 酸化体又は還元体を、 前記電極の測定可能範囲内の電位 （カーボン電極では通常 一 1 . 2 V〜十 1 . 0 V) で還元又は酸化し、 このときの電位を測定することによ り被検物質を定量する方法が挙げられる。 なお、 前記酸化還元反応は、 被検物質 と試薬とが直接的に電子を授受する反応であっても良いし、 間接的に電子を授受 する反応であっても良い。
前記錯体化合物を利用する方法としては、 例えば、 電極の表面に多孔質の高分 子層などを設けた液膜電極を使用し、 この液膜電極に前記試薬を染み込ませ、 こ の試薬を被検物質と配位結合又はイオン結合によって選択的に結合させて高分子 層中を移動させ、 その際に生じる膜電位を測定することにより被検物質を定量す る方法が挙げられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の実施例 1で作製された試験片を示す図である。 図 2は、 図 1の試験片における試薬層に 1 μ Lの全血を点着したとき 様子を 示す図である。
図 3は、 図 1の試験片における試薬層に 0. 5 μ Lの全血を点着したときの様子 を示す図である。
図 4は、 図 1の試験片における試薬層に 0. 1 μ Lの全血を点着したときの様子 を示す図である。 発明の実施するための最良の形態
本発明の実施例を以下に示し、 本発明をより具体的に説明する。 なお、 本実施 例では、 血液 （全血） を検体とし、 血液中のグルコース （Glc) を被検物質とする 試験片を本発明の一例として説明する。 く実施例 1〉
まず、 支持体について説明する。 なお、 本発明の実施例では、 純水製造装置 A u t o s t i l l WG 2 2 0型 （ャマト科学社製） で製造した蒸留水を処理装 置 M i l l i — Q L a b o (日本ミリポア社製） で処理した水であるミリ Q水 を使用した。
まず、 透明ポリスチレン板をエタノール一ミリ Q水により洗浄し、 乾燥させた 後、 紫外線照射装置 （P L 1 6— 1 1 0、 光源： '低圧水銀灯 1 1 0 W、 ともにセ ン特殊光源製） 中で 1〜3 0分間 （好ましくは 3分間） 紫外線を照射し、 前記透 明ポリスチレン板の表面を親水化処理し、 支持体 1 とした。 支持体 1の親水部分 の形状は、 直径 5 mmの二つの円を連結したひようたん型とした。
次に、 試薬層の作製について説明する。
無機ゲル化剤であるラボナイ ト X LG、 ビス一トリス緩衝液 （p H 6. 5 ) 、 P OD (ぺノレォキシターゼ） 、 GOD (グノレコースォキシターゼ） 、 4— AA (4 一アミノアンチピリン （4—ァミノ一 1， 2—ジヒ ドロ一 1， 5—ジメチル一 2 - フエ二ルー 3 H—ビラゾル一 3—オン） ） 、 TOO S (N—ェチルー N— ( 2— ヒ ドロキシ一 3—スルホプロピル） 一 3—メチルァ-リ ン） 、 及ぴラテックスビ ーズである OT G— 2 (平均粒径： 4. 5 μ πι) を、 下記表 1に記載の最終濃度と なるようにミリ Q水に混合し、 ラボナイ ト X L Gのコロイ ド溶液 （ゾル） を得た c なお、 下記表 1における 「U」 は、 3 0°Cにおいて一分間に 1 m o 1 の基質 を生成物に転換する酵素活性の量を示す単位 （U :ユニット） である。 表 1 (試薬処方 A) メーカ' ラボナイ ト XLG 日本シリカ工業 （株） 0. 5重量％
B i s一 T r i s 同仁 （株） 0. 5 mmol/L
POD 東洋紡 （株） 7. 5 X 1 03U/L
GOD 東洋紡 （株） 2 5 X 1 03U/L
4一 AA 同仁 （株） 7. 5 iraol/L
TOOS 同仁 （株） 7. 5 jUmol/L
OTG— 2 (4. 5 ji ) 日本ペイント （株） 1 2. 5重量％
前記操作により得られた無機ゾルを、 前記操作により得られた支持体 1の親水 部分に 1 0 μ L点着し、 ' 4°Cにて 1時間乾燥させ、'図 1に示されるような試薬層 2を作製した。
次に、 前記操作によって得られた試験片による血液中のグルコースの検出につ いて説明する。
それぞれの試験片の試薬層 2におけるひようたん型の先端部に新鮮な全血 （指 先血） を 1、 0. 5、 0. 1 / L点着した。 全血を点着したときの試験片の様子を 図 2〜図 4に示す。
まず、 得られた血漿成分量に着目すると、 1 μ L点着した場合と 0. 5 L点着 した場合では、 図 2及ぴ図 3に示されるように、 直径 5 mmの試薬層 2を十分濡 らす血漿成分が 5秒以内に得られた。 また、 0. 1 ^ L点着した場合では、 図 4に 示されるように、 直径 5 mmの試薬層 2の約 2 / 3を濡らす血漿成分が得られた。 なお、 I L点着した場合では、 全血の点着部分に多くの血球成分及び血漿成分 が未だに残っていることが観察された。
次に、 グルコースに対する応答について着目すると、 血漿成分で濡れた部分が 淡赤色に着色しており、 十分に目視で確認できる。 これは、 主に TOO S (Xma 5 5 5 nm) の発色によるものである。
以上のことからわかるように、 本実施例の試験片によれば、 極少量の全血を点 着することによって血漿成分中のグルコースを検出することができる。 また、 本 実施例の試験片は、 前述したように、 簡単に作製することができる。 く実施例 2 >
次に、 ラボナイ ト X L G及ぴその他の試薬の使用量を固定し、 下記表 2に従つ てビーズの使用量を変化させ、 試薬層の層厚の異なる試験片を前述した実施例 1 と同様に作製した。 そして試薬層の予想膜厚を測定した。 なお、 予想膜厚は、 S EMにて試薬層の断片を観察し算定することによって得られる膜厚 （μπι) であ る。
試薬 ίの層厚の異なるそれぞれの試験片に全血を点着し、 血漿成分の移動距離 を測定した。 なお、 移動距離とは、 全血点着から 5秒後において、 分離した血漿 成分が点着位置から移動した先頭までの距離 （mm) である。
表 2 試薬処方 A A A A ビーズ量 X 1. 5 X 1 X 1/2 X 1/3
1 8. 75 1 2. 5 0 6. 2 5 4. 1 6 予想膜厚 ( ) 8 1 54 2 7 1 8 移動距離 (画） 8 5 4 2. 5 表 2からわかるように、 試薬層の層厚はビーズの使用量によって異なり、 また、 層厚の大きな試薬層では、 血漿成分の移動距離が大きくなることがわかる。 く実施例 3 >
次に、 下記表 3に記載の最終濃度となるように各試薬を使用して試験片を前述 した実施例 1同様に作製した。 そして、 前述した実施例 2と同様に、 それぞれの 試験片における試薬層の予想膜厚を測定し、 全血を試薬層に点着し、 このときの 血漿成分の移動距離を測定した。 それぞれの試験片における試薬処方を表 3に、 予想膜厚及び移動距離の測定結果を表 4に示す。
表 3 (試薬処方 B、 C)
試薬
処方 B 処方 C ラボナイ ト XLG 1 % 1. 5%
B i s— T'r i s lmmol/L(pH 6.5) 1. 5翻 ol/L(pH 6..5)
POD 1 5 X 1 03U/L 22. 5 X 1 03U/L
GOD 5 Q X 1 03U/L 7 5 X 1 03U/L
4-AA 1 5 /imol/L 22. 5 ymol/L
TOOS 1 5 jimol/ 22. 5 jiraol/L
OTG- 2 8. 32% 1 2. 5% 表 4
Figure imgf000026_0001
表 3及び表 4からわかるように、 血漿成分の移動距離は、 試薬の使用量を多少 変えても p Hが一定であればビーズの使用量、 すなわち試薬層の層厚に依存する ことがわかる。 く実施例 4 >
次に、 下記表 5に記載の最終濃度となるように各試薬を使用して試験片を前述 した実施例 1同様に作製した。 なお'、 本実施例では、 '異なる'粒径のビーズ '（4 . 5 111及ぴ6 . 6 111 ) を使用した。 そして、 前述した実施例 2と同様に、 それぞれ の試験片の試薬層に全血を点着し、 このときの血漿成分の移動距離を測定した。 それぞれの試験片における試薬処方を表 5に、 予想膜厚及び移動距離の測定結果 を表 6に示す。 表 5 (試薬処方 D、 E )
Figure imgf000027_0001
¾ 6
Figure imgf000027_0002
表 5及び表 6からわかるように、 ビーズの粒径が多少異なっても P Hが一定で あれば血漿成分の移動距離は変化しないことがわかる。 P Hの変化による血漿成 分の移動距離の変化については、 p Hの変化に伴って分離されるべき血球成分の 状態が変化し、 例えば血球成分の収縮等によつて試薬層中を血球成分が試薬層の より内部まで移動し、 試薬層中における血漿成分の移動性が低下したためと思わ れる。
<比較例 >
ラポナイ ト X L Gに代えて、 有機ゲル化剤の一種である H P C—M (ヒ ドロキ シェチルプロピルセルロース ：信越化学社製） を最終濃度で 2重量％使用した以 外は、 前述した実施例 1と同様に試薬層及び試験片を作製した。 得られた試験片 の試薬層に新鮮な全血 （指先血） を点着したが、 試薬層中に血漿成分が浸透する ことはなく、 点着された全血の分離ができなかった。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 固体成分と液体成分とからなり、 かつ液体成分中に被検物質 が含まれる検体から被検物質を検出するにあたり、 ビーズと無機ゲルとによって 形成され、 固体成分を捕集して液体成分と分離し、 かつ液体成分中の被検物質と 検出しうる反応を起こす試薬が含まれる試薬層を支持体上に形成することにより、 被検物質を透過光測定によっても測定することができ、 酸素透過性が良く、 かつ より高い精度で被検物質を測定することのできる試験片'を提供することができる c

Claims

請求の範囲
1 . 固体成分と液体成分とを含む検体から固体成分を分離して液体成分に含まれ る被検物質を検出することができる固体成分分離能を有する試験片であって、 ビーズ、 無機ゲル、 及び前記被検物質と検出しうる反応を起こす試薬を含む多 孔質構造の試薬層と、 この試薬層を支持する支持体とを含み、 前記ビーズ同士は 前記無機ゲルによって接着され、 ビーズ間には前記固体成分を捕集する粒子間隙 が形成されていることを特徴とする試験片。
2 . 前記検体が血球成分と血漿成分とを含む血液であることを特徴とする請求項 1記載の試験片。
3 . 前記支持体は表面に親水部分を有し、 この親水部分に前記試薬層が支持され ていることを特徴とする請求項 1記載の試験片。
4 . 前記ビーズの粒径が 0 . 5 ~ 1 0 mであり、 かつ前記ビーズの含有量が最終 濃度で 1 ~ 3 0重量％であることを特徴とする請求項 1記載の試験片。
5 . 前記無機ゲルを形成する無機ゲル化剤の含有量が最終濃度で 0 . 1〜 3重量％ であることを特徴とする請求項 1記載の試験片。
6 . 前記試薬が前記被検物質と反応して光学的変化を起こす試薬であることを特 徴とする請求項 1記載の試験片。
7 . 前記支持体が光透過性物質で構成されていることを特徴とする請求項 1記載 の試験片。
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