WO2001067867A2 - Ionenkanal-bildende peptaibole als resistenzinduktoren - Google Patents

Ionenkanal-bildende peptaibole als resistenzinduktoren Download PDF

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WO2001067867A2
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Thorsten Jabs
Eberhard Ammermann
Reinhard Stierl
Gisela Lorenz
Wilhelm Boland
Juergen Engelberth
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins

Definitions

  • the invention relates to the use of ion channel-forming compound for controlling harmful fungi, bacteria, Vi ren, nematodes and insects by means of resistance induction in crop protection.
  • the invention further relates to the use of ion channel-forming compounds for combating harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects, the compounds being characterized by the following structural features:
  • the ammosaic chain contains the non-protemogenic amino acid ⁇ -aminobutyric acid.
  • the invention relates specifically to the use of alamethicin, bergofungm, chrysospermm or ampullosporm for combating harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects by means of resistance induction in crop protection.
  • the invention also relates to plants which are characterized in that they express biosynthetic genes coding for the synthesis of ion channel-forming compounds and thus protect the plant from attack by harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects.
  • the invention relates to methods for inducing resistance to attack by harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects, characterized in that compounds which form ion channels or agents which contain compounds which form ion channels are applied to plants, agents comprising ion channels -forming compounds for inducing resistance to infestation with fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects in crop protection, and the use of microorganisms which produce ion channel-forming compounds for combating harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects by means of resistance induction in crop protection.
  • Microorganisms and herbivorous insects induce characteristic local and / or systemic defense reactions in many plants. These include the de novo biosynthesis of phytoalexms and - typical of insect feeding - the emission of fragrances, which act as kairomones for interactions with other organisms can serve over long distances (PW Pare and JH Tumlinson, Plant Physiol. 121 (1999), 325-331).
  • the molecular basis of the detection of infection processes or feeding damage by the plant organism is only incompletely known. Apart from mechanical damage, the low and high molecular components of the attacking organism are of particular importance as elicitors of defense reactions.
  • the object of the present invention was to provide a simple and efficient method for controlling harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects by means of resistance induction for crop protection.
  • Alamethicin which is produced and excreted by Trichoderma viride, a widespread soil fungus, as a complex mixture of homologous peptaibols, was chosen as the model compound with pronounced ion channel-forming properties.
  • the main components contain eight ⁇ -aminoisobutyric acids and zyei prolines.
  • the N-terminus is acylated, the C-terminus forms phenylalaninol, see Table 1.
  • Alamethicin forms voltage-dependent ion channels with high conductivity as octamer in (bio) membranes (Cafiso, 1994; M.S.P. Sansom, 1993).
  • the course corresponds to the previously described ethylene emission from leaves of Phaseolus lunatus after treatment with the protein elicitor cellulysin (Piel et al., 1997) or jasmonic acid. Further monitoring of the gas phase by absorption of volatile components on activated carbon in a closed system (T. Koch et al., Plant Physiol.
  • Jasmonic acid itself induces a significantly more complex fragrance pattern (Boland, 1995).
  • the alamethicin-induced emission of volatile compounds is concentration-dependent and ends at a limit concentration of 0.5 ⁇ M.
  • the elicitor activity of the peptaibol alamethicin is not limited to the lima bean, but is also found in other plants.
  • the worm fern (Dryopte ⁇ s filix-mas) reacts with a very pronounced emission of a complex mixture of sesquiterpenes
  • the bee venom mellitin is known in principle as an ion channel former (AW Bernheimer and B. Rudy, Biochim. Biophys. Acta 864 (1986), 123-141), but also does not cause any fragrance emission in the lima bean. This also applies to a typical ion transporter such as the K ⁇ -selective valinomycin (DW Urry, Top. Curr. Chem. 128 (1985), 175-218).
  • Biologically active peptides (Table 1), the effect of which is mediated via specific receptors, such as the neuropeptide "Substance P" (MM Klavdieva, Front. Neuroendocrin.
  • Ion channel formers such as alamethicin are therefore particularly suitable as model compounds for the simulation and analysis of the early interactions between plants and harmful organisms under controlled conditions.
  • Initial studies of salivar secretions of herbivorous insects also suggest ion channel active ingredients.
  • Membrane depolarization by means of ion channel-forming substances is therefore also of crucial importance in the induction of plant defense reactions by insects.
  • Ion channel-forming compounds which act as resistance inducers consist of 5 to 100 linearly linked amino acids. They preferably contain 10 to 50 linearly linked amino acids, particularly preferably 15 to 20 amino acids.
  • protemogenic L-amino acids can be naturally occurring protemogenic L-amino acids, but modified or artificial, non-protemogenic amino acids or D-amino acids can also be incorporated.
  • non-protemogenic amino acids can also be incorporated.
  • ⁇ -ammoisobutyric acid or IVal are incorporated as non-protemogenic amino acids.
  • Compounds which form ion channels and act as resistance inductors in plants contain 1 to 20 molecules of ⁇ -ammoisobutyric acid. These compounds preferably contain 2 to 13 molecules of ⁇ -ammoisobutyric acid, particularly preferably 3 to 9 molecules of ⁇ -ammoisobutyric acid.
  • the N-termmus of the linear ammosaur chains is acylated.
  • linearly linked ammosaur chains with action as resistance inducers in plants whose N-termmus is not N-acylated.
  • the C terminus of the linear ammosaic chains which act as resistance transducers in plants, contains the L-amino acid reduced to the corresponding ⁇ -amino alcohol instead of a naturally occurring L-amino acid.
  • the C-terminus can also be occupied by a natural L-amino acid.
  • the invention also relates to a plant which exp ⁇ m exposes biosynthesis genes coding for the synthesis of ion channel-forming compounds for resistance induction and thus protects the plant from attack by harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects.
  • the invention also relates to a method for inducing resistance to attack by harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects, characterized in that compounds forming ion channels or agents containing compounds forming ion channels are applied to plants.
  • the invention further relates to pesticides containing ion channel-forming compounds for inducing resistance to attack by harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects in plants.
  • pesticides containing ion channel-forming compounds for inducing resistance to attack by harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects in plants.
  • These agents can additionally include insecticides, growth regulators, herbicides, fungicides, fertilizers and formulation auxiliaries which, for example, Improve the effect or the stability of the ion channel-forming compounds.
  • the invention also relates to the use of microorganisms which produce ion channel-forming compounds for combating harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects by means of resistance induction in crop protection, such as, for example, Trichoderma viridis, Emericellopsis donezkii, Sepedonium ampullosporum or Apiocrea chrysosperma.
  • Ion channel-forming compounds and their agriculturally useful salts are suitable both as isomer mixtures and in the form of the pure isomers - as resistance inducers.
  • crops such as wheat, rice, corn, soybeans and cotton
  • the resistance inducers work against harmful fungi, bacteria, viruses, nematodes and insects without harming the crop plants.
  • the compounds forming the ion channel or agents containing them can also be used in a further number of crop plants.
  • the following crops are considered, for example:
  • the ion channel-forming compounds can also be used in cultures which have been changed in their phenotype or genotype by breeding or genetic engineering methods.
  • the compounds or the compositions containing them can be sprayed, for example in the form of directly sprayable aqueous solutions, powders, suspensions, including high-strength aqueous, oily or other suspensions or dispersions, emulsions, oil dispersions, pastes, dusts, sprinkles or granules. Nebulization, dusting, scattering or pouring can be used.
  • the application forms depend-making purposes by the USAGE ⁇ ; in any case, they should ensure the finest possible distribution of the active compounds according to the invention.
  • compositions contain an effective amount of at least one ion channel-forming compound or an agriculturally useful salt of this compound and auxiliaries customary for the formulation of crop protection agents.
  • ion-channel forming compounds for Induk ⁇ suitable tion of the resistance in plants against attack following harmful fungi:
  • Botrytis cinerea (gray mold) on strawberries, vegetables, ornamental plants and vines
  • Anastrepha ludens Ceratitis capitata, Contarinia sorghicola, Dacus cu- curbitae, Dacus oleae, Dasineura brassicae, Hylemyia platura, Liriomyza sativae, Liriomyza trifolii, Oscomya hyitia frit Phorbia antigua, Phorbia brassicae, Phorbia coarctata, Rhagoletis cerasi, Rhagoletis pomonella, Tipula oleracea, Tipula paludosa.
  • Thrips From the order of the thrips (Thysanoptera), for example, Frankliniella fusca, Frankliniella occidentalis, Frankliniella tritici, Scirtothrips citri, Thrips oryzae, Thrips palmi, Thrips tabaci.
  • From the order of the hymenoptera for example Athalia rosae, Atta cephalotes, Atta sexdens, Atta texana, Hoplo - campa minuta, Hoplocampa testudinea.
  • Heteroptera From the order of the bugs (Heteroptera), for example, Acrosternum hilare, Blissus leucopterus, Cyrtopeltis notatus, Dysdercus cingulatus, Dysdercus intermedius, Eurygaster integriceps, Eu- schistus impictiventris, Leptoglossus phyllopus, Lygus lineola- ris, Lygus parsatidis, Lygus parsatidis, Lygus prairisensis , Solubea insularis, Thyanta perditor.
  • suckers for example Acyrthosiphon onobrychis, Adelges laricis, Aleurothrixus flocco-sus, Aphidula nasturtii, Aphis fabae, Aphis pomi, Aphis sambuci, Bemisia tabaci, Brachycaudus carduie Dreia, Drevodesiaiaiaiae, Brevicitriaiaiaica, Brevodesiaiaiaica, Brevodesiaiaiaiaica piceae, pseudosolani Dysa- phis radicola, Dysaulacorthum, Empoasca fabae, Lao Delphax striatellus, Macrosiphum avenae, Macrosiphum euphorbiae, macrosiphon rosae, Megoura viciae, Metopolophium dirhodum, My
  • Orthoptera From the order of the straight-wingers (Orthoptera), for example, Gryllotalpa gryllotalpa, Locusta migratoria, Melanoplus bivittaus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus mexicanus, Melanoplus sanguinipes, Melanoplus spretus, Nomadacris septemfasciata, Schi- stocerca americana, Schistocerca peregrina, Stauronotus maroccanus, Tachycines asynamorus.
  • Orthoptera for example, Gryllotalpa gryllotalpa, Locusta migratoria, Melanoplus bivittaus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus mexicanus, Melanoplus sanguinipes, Melanoplus spretus, Nomadacris septemfasciata, Schi- stocerca americana, Schistocerca peregrina, Stau
  • arachnids such as Amblyomma americanum, Amblyomma variegatum, Argas persicus, Boophilus annulatus, Boophilus decoloratus, Boophilus ml - croplus, Brevipalpus phoenicis, Bryobia praetiosa, Dermotoretronus, vari Paratetranychus pilosus, Phyllocoptruta oleivora, Polyphagotarsonemus latus, Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus kanzawai, Tetranychus pacificus, Tetranychus telarius, Tetranychus urticae.
  • Amblyomma americanum such as Amblyomma americanum, Amblyomma variegatum, Argas persicus, Boophilus annulatus, Boophilus decoloratus, Boophilus ml - croplus, Brevipalpus phoenicis, Bryobia
  • root gall nematodes e.g. Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, cyst-forming nematodes, e.g. Globodera rostochiensis, Heterodera avenae, Heterodera glycines, Heterodera schach- tii, Heterodera trifolii, stick and leaf wholes, e.g.
  • root gall nematodes e.g. Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, cyst-forming nematodes, e.g. Globodera rostochiensis, Heterodera avenae, Heterodera glycines, Heterodera schach- tii, Heterodera trifolii, stick and leaf wholes, e.g.
  • Belonolai- mus longicaudatus Ditylenchus destructor, Ditylenchus dipsaci, Heliocotylenchus multicinctus, Longidorus elongatus, Radopholus similis, Rotylenchus robustus, Trichodorus primitivus, Tylenchor - hynchus claytoni, Tylenchorhynchus tubus negchate, Prychatatusus, Pruschatatususus, Pruschatatusus, Pruschatatususus, Pruschatatususus, Pruschatatususus, Pruschatatususus, Prylchusatusus, Pruschitatusus, Pruschatatusus, Prol.
  • Plants treated with ion channel-forming compounds also showed increased resistance to, for example, attack by Erwinia amylovora and other phytopathogenic bacteria.
  • the most important phytopathogenic bacteria can be found in the publication "European Handbook of Plant Diseases", Eds. Smith, I.M., Dunez, J., Lelliott, R.A. Phillips, D.H. and Archer, S.A. Blackwell Scientific Publications, 1988.
  • the application of the ion channel-forming compounds on crop plants can take place both as a spray application and as a watering application.
  • the application rates of the compounds forming the ion channel when used to protect crop plants, are from 2 to 0.1 kg / ha, preferably from 1.25 to 0.2 kg / ha, in particular from 0.75 to 0, depending on the nature of the desired effect , 3 kg / ha.
  • the application rates are preferably 1 to 0.01 kg / ha, preferably 0.5 to 0.02 kg / ha, in particular 0.25 to 0.03 kg / ha for compounds forming ion channels.
  • application rates of 0.1 to 100 g / 100 kg of seed preferably 0.5 to 50 g / 100 kg of seed, in particular 1 to 10 g / 100 kg of seed, are generally used.
  • the lima bean plant was grown as described in Example 1. After 14 days of incubation, the plants were cut off and incubated in 10 ml of tap water containing 10 ⁇ g / ml of alamethicin in a chamber. The exhaust air from this chamber was continuously passed into a flow cell and the ethylene formation was measured by means of photoacoustic spectroscopy (Beßler et al., 1998).
  • Figure 2a shows the time course of ethylene formation
  • the lima bean plant was grown as described in Example 1. After 14 days of incubation, the plants were cut off and incubated in 10 ml of tap water containing 10 ⁇ g / ml alamethicin or 10 ⁇ g / ml of a single compound mentioned in Table 1. The incubation was carried out in a desiccator with a chamber volume of 750 ml. The air in this chamber was circulated and continuously passed through an activated carbon filter.
  • This process is based on a closed circuit system in which the air contained in the system is guided through the activated carbon filter by rotary vane pumps. Volatile analytes contained in the air are adsorbed there and can be desorbed by suitable solvents (here dichloromethane) and passed to the analysis after the end of the test period, see Donath, J.
  • suitable solvents here dichloromethane
  • the compounds were separated under the following conditions: 50 degrees Celsius for 1 min; then 10 degrees per minute to 180 degrees Celsius, then 35 degrees Celsius per minute to 280 degrees Celsius.
  • Device MS Finnigan GC-MS; Electronic ionization 70 eV; GC interface 265 degrees Celsius; Ion source 180 degrees Celsius; Scan ranks 35-300 Daltons.
  • Alamethicin F - commercially available Alamethicin is a mixture of homologous peptides Ac-Aib-Pro-Aib-Ala-Aib-Ala-Gln-Aib-Val-Aib-Gly-Leu-Aib-Pro-Val-Aib-Aib-Gln-Gln -Pheol
  • Ampullosporin A Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Aib-Aib-Gln-Leu-Aib-Gln-Leu-Aib-Gln-Leuol
  • Chrysospermin A a mixture of the Chrysospermine A-D Ac-Phe-Aib-Ser-Aib-Aib-Leu-Gln-Gly-Aib-Aib-Ala-Ala-Aib-Pro-Aib-Aib-Aib-Gln-Trpol was used
  • aqueous active ingredient preparation which was prepared with a stock solution of 10% active ingredient, 63% cyclohexanone and 27% emulsifier, until dripping wet or for 1,2,3,5 or placed in this active ingredient preparation for 7 days.
  • the plants or parts of plants were cultivated in the greenhouse at temperatures between 22 ° and 24 ° C. and 60 to 80% relative atmospheric humidity for one week.
  • the treated plant material was milled in liquid nitrogen and poured into a vessel with 10 ml of bidistilled water and resuspended for 30 seconds with a vortex.
  • the furanocoumarme were extracted twice with 2 volumes (20 ml) of dichloromethane from the water supernatant of the subsequent centrifugation.
  • the organic phase was evaporated to dryness under reduced pressure.
  • the residue was taken up with 100 ⁇ l of methanol.
  • This methanol extract was spotted on a silica gel 60 TLC plate and m ei ner thin-layer chromatography chamber with the eluent mixture toluene / ethyl formate / formic acid (5: 4: 1; v / v / v) analyzed.
  • the coumarin derivatives were detected under UV light at 366 nm.
  • the parsley phytoalexins formed belong to the substance class of furanocoumarins (psoralen, xanthotoxin, bergapten, isopimpinellin, umbelliferon, marmesin).
  • a cell suspension culture of parsley (Petroselinum crispum L.) in modified Gamborg's B5 medium with 1 mg / ml 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid was shaken in the dark at 26 ° C. (100 rpm) and transferred to fresh medium every 7 days.
  • Three day old cell suspension cultures were treated with alamethicin. After 24 hours, these batches and untreated control batches were mixed with 10 nM of the peptide detector Pep-13 of the sequence VWNQPVRGFKVYE and incubated for a further 24 hours.
  • the cell suspension culture sensitized by alamethicin produces phytoalexins and other substances of the plant pathogen defense upon contact with the signal substance Pep-13.
  • the phytoalexins of parsley of the furancoumarins type were quantified fluorimetrically in the culture medium of the cells (excitation wavelength 355 nm; emission wavelength 410 nm).
  • Bush bean plants of the "Fori” variety are treated with the active ingredient alamethicin and inoculated with bean rust (Uromyces phaseoli UROMAP) after an induction interval of several days. The infestation is evaluated after the incubation period.
  • Bush bean plants of the "Primel” variety were prepared as follows: Directly - sow in 8 cm round pots in a compost / uniform earth mixture, cultivated at 20 ° C, age of the plants at the start of the test 11 days, 5 plants per test variant.
  • the active ingredient was described as follows: preparation of the active ingredient with DMSO, dilution in aqueous solution with LF 700 additive (100 ppm), and spray application in the spray booth until shortly before the point of runoff.
  • the inoculation with fungal spores from Uromyces phaseoli was carried out by spray inoculation of the underside of the primary leaves with glass chromatography sprayer with a spore density of 30 mg spores / 50 ml, addition of 250 ppm Tween 20 to the spore suspension for better distribution of the spores in the Solution.
  • the bean rust Uromyces phaseoli developed so strongly on the leaves within 8 days that it was possible to assess the proportion of leaf area affected.
  • the affected leaf area was determined in% during the evaluation:
  • alamethicin was examined for its resistance-inducing effect.
  • a spray application with 100 ppm active ingredient and a subsequent induction interval of 3 days led to an infection reduction to a few percent residual infestation.

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Abstract

Ionenkanal-bildende Peptaibole aus Pilzen repräsentieren eine neue Klasse hochwirksamer Elicitoren des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels, der Spiralisierung von berührungsempfindlichen Ranken sowie der induzierten Resistenz gegen schädliche Pilze, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten.

Description

Ionen anal-bildende Peptaibole als Resistenzinduktoren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindung zur Bekämpfung von schädlichen Pilzen, Bakterien, Vi ren, Nematoden und Insekten mittels Resistenzinduktion im Pflanzenschutz. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen zur Bekämpfung von schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten, wobei die Verbindungen gekennzeichnet sind durch folgende Strukturmerkmale:
A peptidisch linear verknüpfte Ammosaurekette, B. wobei der N-Termmus acyliert st,
C. wobei der C-Termmus aus einer naturlich vorkommenden L-Ami nosaure, die zum entsprechenden α-Aminoalkohol reduziert ist, besteht und
D. die Ammosaurekette die nicht-protemogene Aminosäure α-Ami noisobuttersaure enthalt.
Daruberhmaus betrifft die Erfindung speziell die Verwendung von Alamethicin, Bergofungm, Chrysospermm oder Ampullosporm zur Bekämpfung von schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten mittels Resistenzinduktion im Pflanzenschutz. Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Biosynthesegene codierend für die Synthese von Ionenkanal-bildenden Verbindungen exprimieren und somit die Pflanze vor Befall mit schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten schützen. Daruberhmaus betrifft die Erfindung Verfahren zur Induktion der Resistenz gegen Befall mit schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten dadurch gekennzeichnet, daß Ionenkanal-bildende Verbindungen oder Mittel, die Ionenkanal-bildende Verbindungen enthalten, auf Pflanzen aufge- bracht werden, Mittel enthaltend Ionenkanal-bildende Verbindungen zur Induktion der Resistenz gegen Befall mit Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten im Pflanzenschutz, sowie die Verwendung von Mikroorganismen, die Ionenkanal-bildende Verbindungen produzieren, zur Bekämpfung von schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten mittels Resistenzinduktion im Pflanzenschutz .
Mikroorganismen und herbivore Insekten induzieren in vielen Pflanzen charakteristische lokale und/oder systemische Abwehr- reaktionen. Dazu zahlen die de novo Biosynthese von Phytoalexmen und - typisch für Insektenfraß - die Emission von Duftstoffen, die als Kairomone für Wechselwirkungen mit anderen Organismen über weite Distanzen dienen können (P.W. Pare und J.H. Tumlinson, Plant Physiol. 121(1999), 325-331). Die molekularen Grundlagen der Erkennung von Infektionsvorgangen oder Fraßschaden durch den pflanzlichen Organismus sind nur unvollständig bekannt. Abgesehen vom mechanischen Schaden kommt vor allem den nieder- und hochmolekularen Komponenten des attackierenden Organismus Bedeutung als Elicitoren von Abwehrreaktionen zu. Letztere vermögen direkt oder rezeptorvermittelt die Ionenpermeabilitat der Plasmamembran zu verändern und ein komplexes Netzwerk intrazellularer Folgereak- tionen auszulosen (T. Jabs et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 94(1997), 4800-4805); am Ende steht die de novo Synthese von Abwehrsubstanzen. Ebenso induzieren Oligogalakturonide (Y. Matthieu et al., Plant J. 1(1991), 333-343) über Ionenkanale die Biosynthese von Phytoalexmen m Tabakzellkulturen. Für einige Protein - elicitoren wurde an artiflziellen Lipidmembranen die Fähigkeit zur Ionenkanalbildung nachgewiesen (B. Klusener und E.W. Weiler, FEBS Lett. 459(1999), 263-266).
Neben makromolekularen Elicitoren sind auch niedermolekulare, peptidische Antibiotika mit ausgeprägt membrandepolarisierenden Eigenschaften bekannt (D.S. Cafiso, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23(1994), 141-165). Charakteristisch für den Aufbau überwiegend pilzlicher Verbindungen aus der Gruppe der Peptaibole ist ein N-acylierter Terminus, der Einbau von α-Ammoisobuttersaure (AIB) und ein zum α-Aminoalkohol reduzierter C-Terminus. Besonders häufig sind Peptaibole mit 18 bis 19 Ammosaureresten wie Alamethicin ( Cafiso, 1994 ), Ampullospor (M. Ritzau et al . , J. Antibiotics 50(1997), 722-728) oder Chrysosperm (K.-J. Dornber- ger et al . , J. Antibiotics 48(1995), 977-989).
Kleinere Peptide wie das Antiamoebin (R.C. Pandey et al . , J. Am. Chem. Soc. 99(1977), 8469-8483) mit 15 bzw. 16 Ammosaureresten sind ebenfalls bekannt. Ihre antibiotische Wirkung beruht auf der Fähigkeit, α-helicale Strukturen auszubilden, die sich m biolo- gischen Membranen als Oligomere zu spannungs (un) abhangigen Kanälen beziehungsweise Poren aggregieren ( Cafiso, 1994 ; M.S.P. Sansom, Quart. Rev. Biophys. 26(1993), 365-321).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein einfaches und ef - fizientes Verfahren zur Bekämpfung von schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten mittels Resistenzinduktion für den Pflanzenschutz bereitzustellen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß speziell Ionenkanal-bil- dende Verbindungen in Pflanzen Resistenz gegen pflanzenschädliche Pilze, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten induzieren. Experimentell wurde erstmals gezeigt, daß fungale Peptaibole als hochwirksame Elicitoren die Freisetzung von Ethylen, die Bildung von flüchtigen Duftsubstanzen (Kairomone) , die Spiralisierung von Ranken sowie in Pflanzen die Resistenzinduktion gegen Pilzbefall bewirken.
Als ModellVerbindung mit ausgeprägt Ionenkanal-bildenden Eigenschaften wurde Alamethicin gewählt, das von Trichoderma viride, - einem weitverbreiteten Bodenpilz - als komplexe Mischung homo- loger Peptaibole produziert und ausgeschieden wird. Die Hauptkomponenten enthalten acht α-Aminoisobuttersäuren und zyei Proline. Der N-Terminus ist acyliert, den C-Terminus bildet Phenylalani- nol, siehe Tabelle 1. Alamethicin bildet in (Bio)membranen als Oktamer spannungsabhängige Ionenkanäle mit hoher Leitfähigkeit (Cafiso, 1994 ; M.S.P. Sansom, 1993).
Wird ein frisch geschnittener Trieb der Limabohne (Phaseolus lu- natus) als Modellsystem in eine Lösung mit Alamethicin (5 μM) eingestellt, lässt sich als erste Reaktion der Pflanze bereits nach ca. 3 Stunden mittels Photoakustikspektroskopie eine deutliche Emission von Ethylen feststellen (B. Beßler et al . , Planta 205(1998), 140-144; J. Piel et al . , FEBS Lett. 416(1997), 143-148) . Sie erreicht nach 7.5 h ihr Maximum und klingt im Verlauf von weiteren 5 h bei Messungen in einer Durchflusszelle wie- der ab, siehe Abbildung 2a. Der Verlauf entspricht der bereits früher beschriebenen Ethylenemission aus Blättern von Phaseolus lunatus nach Behandlung mit dem Proteinelicitor Cellulysin ( Piel et al . , 1997) oder der Jasmonsäure. Weitergehende Überwachung der Gasphase durch Absorption flüchtiger Komponenten an Aktivkohle in einem geschlossenen System ( T. Koch et al . , Plant Physiol.
121(1999), 153-162) gefolgt von Desorption und massenspektrosko- pischer Analyse macht deutlich, daß durch Alamethicin auch die Biosynthese terpenoider und aromatischer Komponenten angeregt wird. So zeigt das Gaschromatogramm (Abbildung 2b) neben 4, ll-Dimethylnona-l,3,7-trien (DMNT) (5%) und Methylsalicylat (MeSA) die Bildung von 4 , 8 , 12-Trimethyltrideca-l, 3 , 7 , 11-tetraen (TMTT) (91%) als Hauptkomponente an. Ein vergleichbares Duftprofil (ohne MeSA) wurde bereits nach Behandlung der Limabohne mit 12-Oxophytodiensäure (12-OPDA) , einem biosynthetischen Vorläufer der Jasmonsäure beobachtet ( Koch, 1999). Jasmonsäure selbst induziert ein deutlich komplexeres Duftmuster ( Boland, 1995) . Die Alamethicin-induzierte Emission flüchtiger Verbindungen ist konzentrationsabhängig und endet bei einer Grenzkonzentration von 0.5 μM. Aufgrund der Präsenz von Methylsalicylat und Jasmonsaure- du zierbaren Terpenen in der Gasphase wurde m den induzierten Pflanzen der Gehalt von endogener Jasmonsäure und Salicylsaure zeitabhängig quantifiziert. Wie Abbildung 1 gezeigt wird die 5 Biosynthese beider Phytohormone stimuliert. Jasmonat zeigt einen charakteristischen transienten Anstieg innerhalb der ersten 80 mm (20-facher Anstieg) , wahrend endogene Salicylsaure erst nach etwa zwei h ansteigt und nach sechs h ein Plateau erreicht (ca. 200-facher Anstieg) . Unbehandelte Kontrollpflanzen produzieren
10 erwartungsgemäß weder Duftstoffe, noch zeigen sie einen Anstieg der beiden Phytohormone Jasmonsäure und Salicylsaure. Werden Blatter der Limabohne mit Inhibitoren des Oktadecanoid-Signalwegs vorbehandelt (Phenidon: C. Cucurou et al . , Biochemistry 30(1991), 8964-8970; Aristolochiasaure : M.D. Rosenthal et al . , Biochim.
15 Biophys. Acta, 1001(1989), 1-8) unterbleibt die Biosynthese von Duftstoffen. Umgeht man den Block der Inhibitoren durch exogene Zugabe von Jasmonsäure, kann wieder das ursprüngliche Duftmuster beobachtet werden. Eine Beteiligung des Octadecanoid-Signalwegs ist damit sicher nachgewiesen.
20
Die Elicitoraktivitat des Peptaibols Alamethicin ist nicht auf die Limabohne beschrankt, sondern wird auch bei anderen Pflanzen gefunden. Der Wurmfarn (Dryopteπs filix-mas) reagiert mit sehr ausgeprägter Emission einer komplexen Mischung von Sesquiterpenen
25 ( Boland, 1995). Terpenoide Verbindungen dominieren auch im Duftmuster Alamethicm-mduzierter Mungbohnen (Vigna radiata) , der Baumwolle (Gossypium hirsutum) oder im Mais (Zea mays) ( Pare, 1999; Boland, 1995). Die Gartenbohne (Phaseolus vulgaris) produziert ein der Limabohne vergleichbares Substanzprofll , siehe Ab-
30 bildung 2b.
Ranken von Bryonia dioica reagieren auf Jasmonsäure, MeSA und 12-OPDA mit einer Krummungsreaktion, die jener der mechanischen Reizung entspricht ( E.W. Weiler et al . , Phytochemistry 32(1993),
35 591-600) . Da m der Limabohne der Octadecanoid-Signalweg durch Alamethicin stimuliert wird (Abbildung 1) , wurde geprüft, ob Alamethicin auch die Spiralisierung von Ranken induzieren kann. Dazu wurden frisch geschnittene Ranken von Bryonia dioica, Pisum sati- vum oder Lathyrus sp. in eine Losung von Alamethicin (50 μM) em-
40 gestellt und nach 20 h ihr Krummungsgrad bestimmt. Alternativ wurde entsprechend dem Rankenkrummungstest nach Weiler verfahren (B. Klusener et al . , EMBO J. 14(1995), 2708-2714). Alle Testpflanzen zeigten nach Behandlung mit Alamethicin eine schnell einsetzende Spiralisierung. Eine Depolarisierung der Zellmembran
45 durch einen Porenbildner scheint für die Induktion der Rankenbildung auszureichen ( Klusener, 1995) . Neben Alamethicin sind weitere Peptaibole und Peptide als Ionen- kanalbildner oder lonentransporter bekannt. Um zu prüfen, ob die beobachteten Effekte auf lonenkanalbildung oder Ionentransport zurückzuführen sind, wurden neben Alamethicin als weitere Ionen- kanalbildner Ampullosporin A (M. Ritzau et al . , J. Antibiotics 50 (1997), 722-728), Bergofungin A, B und C (A. Berg et al . , J. Antibiotics 52 (1999), 666-669) sowie Chrysospermin A (Dornberger et al., J. Antibiotics 48 (1995), 977-989), aber auch kationen- komplexierende lonentransporter getestet. Wie Tabelle 1 zu ent- nehmen ist, wirken nur Peptaibole stimulierend. Unabhängig von der Aminosäuresequenz des getesteten Peptaibols wird von Blättern der Limabohne stets dasselbe Duftmuster freigesetzt, so daß auf Membrandepolarisierung als ein gemeinsames Wirkprinzip geschlossen werden kann.
Das Bienengift Mellitin ist zwar prinzipiell als Ionenkanalbild- ner (A.W. Bernheimer und B. Rudy, Biochim. Biophys. Acta 864(1986), 123-141) bekannt, verursacht in der Limabohne aber ebenfalls keine Duftemission. Dies gilt auch für einen typischen lonentransporter wie das Kτ-selektive Valinomycin (D.W. Urry, Top. Curr. Chem. 128(1985), 175-218). Biologisch aktive Peptide (Tabelle 1) , deren Wirkung über spezifische Rezeptoren vermittelt wird, wie etwa das Neuropeptid "Substanz P" (M.M. Klavdieva, Front. Neuroendocrin. 17(1996), 155-179), das Nonapeptid Bradyki- nin (Urry, 1985) oder das Systemin, ein hochwirksames Signalpep- tid der Tomate (A. Schaller und CA. Ryan, Proc. Natl . Acad. Sei. USA 91(1994), 11802-11806 ), zeigen ebenfalls keine Stimulierung der Duftbiosynthese.
lonenkanalbildung und die damit verbundene Membrandepolarisierung müssen deshalb -als ursächlich für die Elicitierung angesehen wer¬ den.
Ionenkanalbildner wie Alamethicin eignen sich deshalb besonders gut als Modellverbindungen zur Simulation und Analyse der frühen Wechselwirkungen zwischen Pflanze und Schadorganismus unter kontrollierten Bedingungen. Erste Untersuchungen von Salivarsekreten herbivorer Insekten lassen auch hier auf Ionenkanal-aktive Inhaltsstoffe schließen. Mithin kommt der Membrandepolarisierung durch Ionenkanal-bildende Substanzen auch bei der Induktion von pflanzlichen Abwehrreaktionen durch Insekten entscheidende Bedeutung zu . Ionenkanal-bildende Verbindungen mit Wirkung als Resistenzinduktoren bestehen aus 5 bis 100 linear verknüpften Aminosäuren. Vorzugsweise enthalten sie 10 bis 50 linear verknüpfte Aminosäuren, besonders bevorzugt 15 bis 20 Aminosäuren.
Dabei kann es sich um natürlich vorkommende protemogene L-Aminosäuren handeln, es können jedoch auch modifizierte oder artifi- zielle, nicht -protemogene Aminosäuren oder D -Aminosäuren einge baut werden. Als nicht -protemogene Aminosäuren werden beispiel- haft α-Ammoisobuttersaure oder iVal eingebaut.
Ionenkanal-bildende Verbindungen mit Wirkung als ResistenzInduktoren in Pflanzen enthalten 1 bis 20 Molek le α Ammoisobutter- saure. Vorzugsweise enthalten diese Verbindungen 2 bis 13 Mole- kule α-Ammoisobuttersaure, besonders bevorzugt 3 bis 9 Moleküle α-Ammoisobuttersaure .
Der N-Termmus der linearen Ammosaureketten ist acyliert. Es können jedoch auch linear verknüpfte Ammosaureketten mit Wirkung als Resistenzinduktoren m Pflanzen eingesetzt werden, deren N- Termmus nicht N-acyliert ist.
Der C -Terminus der linearen Ammosaureketten mit Wirkung als Re sistenzmduktoren m Pflanzen enthalt anstelle einer natürlich vorkommenden L-Ammosaure die zum entsprechenden α-Ammoalkohol reduzierte L-Ammosaure. Der C -Terminus kann auch mit einer natürlichen L-Ammosaure besetzt sein.
Die Erfindung betrifft auch eine Pflanze, die Biosynthesegene co dierend für die Synthese von Ionenkanal-bildenden Verbindungen zur Resistenzinduktion expπmiert und somit die Pflanze vor Befall mit schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten schützt.
Die Erfindung betrifft auch em Verfahren zur Induktion der Resistenz gegen Befall mit schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten, dadurch gekennzeichnet, daß Ionenkanal-bildende Verbindungen oder Mittel, die Ionenkanal-bildende Verbindungen enthalten, auf Pflanzen aufgebracht werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin Pflanzenschutzmittel enthaltend Ionenkanal-bildende Verbindungen zur Induktion von Resistenz gegen Befall von schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten m Pflanzen. Diese Mittel können zusatzlich Insekti- zide, Wachstumsregulatoren, Herbizide, Fungizide, Dunger sowie Formulierungshilfsmittel, die beispielsweise die Aufnahme bzw. Wirkung oder die Stabilität der Ionenkanal-bildenden Verbindungen verbessern.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus die Verwendung von Mikroor- ganismen, die Ionenkanal-bildende Verbindungen zur Bekämpfung von schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten mittels Resistenzinduktion produzieren, im Pflanzenschutz, wie beispielsweise Trichoderma viridis, Emericellopsis donezkii, Sepedo- nium ampullosporum oder Apiocrea chrysosperma.
Ionenkanal-bildende Verbindungen und deren landwirtschaftlich brauchbaren Salze eignen sich sowohl als Isomerengemische als auch in Form der reinen Isomeren - als Resistenzinduktoren. In Kulturen wie Weizen, Reis, Mais, Soja und Baumwolle wirken die Resistenzinduktoren gegen schädliche Pilze, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten ohne die Kulturpflanzen zu schädigen.
In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können die Ionenkanal-bildende Verbindungen bzw. sie enthaltenden Mittel noch in einer weiteren Zahl von Kulturpflanzen eingesetzt werden. In Betracht kommen beispielsweise folgende Kulturen:
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus offici- nalis, Beta vulgaris spec. altissi a, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus , Brassica napus var. napobrassica,
Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinc- torius, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Cof - fea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica) , Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineensis, Fragaria ve- sca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium) , Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgäre, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec, Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec, Nicotiana tabacum (N.rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec, Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus commu- nis, Ribes sylvestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgäre), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera und Zea mays .
Darüber hinaus können die Ionenkanal-bildenden Verbindungen auch in Kulturen, die durch Züchtung bzw. gentechnische Methoden in ihrem Phänotyp oder Genotyp verändert sind, eingesetzt werden. Die Verbindungen bzw. die sie enthaltenden Mittel können beispielsweise in Form von direkt versprühbaren wäßrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen oder Dispersionen, Emulsionen, Öldisper- > sionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwen¬ dungszwecken; sie sollten in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe gewährleisten.
Die Mittel enthalten eine wirksame Menge mindestens einer Ionenkanal-bildenden Verbindung oder eines landwirtschaftlich brauchbaren Salzes dieser Verbindung sowie für die Formulierung von Pflanzenschutzmitteln übliche Hilfsmittel.
Speziell eignen sich Ionenkanal-bildende Verbindungen zur Induk¬ tion der Resistenz in Pflanzen gegen Befall folgender Schadpilze:
Al ternaria-Aτten an Gemüse und Obst, Botrytis cinerea (Grauschimmel) an Erdbeeren, Gemüse, Zierpflanzen und Reben,
Cercospora arachidicoia an Erdnüssen,
Erysiphe cichoracearum und Sphaerotheca fuliginea an Kürbis¬ gewächsen, Erysiphe graminis (echter Mehltau) an Getreide,
Fusarium- und Verticilli um-Arten an verschiedenen Pflanzen,
Helminthosporium-Arten an Getreide,
Mycosphaerella- rten an Bananen,
Phytophthora infestans an Kartoffeln und Tomaten, Plasmopara vi ticola an Reben,
Podosphaera leucotricha an Äpfeln,
Pseudocercosporella herpotrichoides an Weizen und Gerste, Pseudocercosporella-Arten an Hopfen und Gurken, Pseudoperonospora-Arten an Hopfen und Gurken, Puccinia-Arten an Getreide, Pyricularia oryzae an Reis, i-hizoctonia-Arten an Baumwolle, Reis und Rasen, Septoria nodorum an Weizen, Uncinula neca tor an Reben, Us tilago-Arten an Getreide und Zuckerrohr, sowie Ven turia inaequalis (Schorf) an Äpfeln
sowie einer Vielzahl weiterer phytopathogener Pilze im Kultur - pflanzenanbau.
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chus ovatus, Phaedon cochleariae, Phyllotreta chrysocephala, Phyllophaga sp . , Phyllopertha horticola, Phyllotreta nemorum, Phyllotreta striolata, Popillia japonica, Sitona lineatus, Sito- philus granaria.
Aus der Ordnung der Zweiflügler (Diptera) beispielsweise Anastre- pha ludens, Ceratitis capitata, Contarinia sorghicola, Dacus cu- curbitae, Dacus oleae, Dasineura brassicae, Hylemyia platura, Li- riomyza sativae, Liriomyza trifolii, Oscinella frit, Pegomya hy- socyami, Phorbia antigua, Phorbia brassicae, Phorbia coarctata, Rhagoletis cerasi, Rhagoletis pomonella, Tipula oleracea, Tipula paludosa.
Aus der Ordnung der Thripse (Thysanoptera) beispielsweise Fran- kliniella fusca, Frankliniella occidentalis , Frankliniella tritici, Scirtothrips citri, Thrips oryzae, Thrips palmi, Thrips tabaci .
Aus der Ordnung der Hautflügler (Hymenoptera) beispielsweise Athalia rosae, Atta cephalotes, Atta sexdens, Atta texana, Hoplo - campa minuta, Hoplocampa testudinea.
Aus der Ordnung der Wanzen (Heteroptera) beispielsweise Acroster- num hilare, Blissus leucopterus, Cyrtopeltis notatus, Dysdercus cingulatus, Dysdercus intermedius, Eurygaster integriceps, Eu- schistus impictiventris, Leptoglossus phyllopus, Lygus lineola- ris, Lygus pratensis, Nezara viridula, Piesma quadrata, Solubea insularis, Thyanta perditor.
Aus der Ordnung der Pflanzensauger (Homoptera) beispielsweise Acyrthosiphon onobrychis, Adelges laricis, Aleurothrixus flocco- sus, Aphidula nasturtii, Aphis fabae, Aphis pomi , Aphis sambuci, Bemisia tabaci, Brachycaudus cardui, Brevicoryne brassicae, Dia- leurodes citri, Dreyfusia nordmannianae, Dreyfusia piceae, Dysa- phis radicola, Dysaulacorthum pseudosolani, Empoasca fabae, Lao- delphax striatellus, Macrosiphum avenae, Macrosiphum euphorbiae, Macrosiphon rosae, Megoura viciae, Metopolophium dirhodum, , Myzo- des persicae, Myzus cerasi, Nilaparvata lugens , Pemphigus bursa- rius, Perkinsiella saccharicida, Phorodon humuli, Psylla mali, Psylla piri, Rhopalomyzus ascalonicus, Rhopalosiphum maidis,
Schizaphis graminum, Schizoneura lanuginosa, Trialeurodes vapora- rioru , Viteus vitifolii.
Aus der Ordnung der Geradflügler (Orthoptera) beispielsweise Gryllotalpa gryllotalpa, Locusta migratoria, Melanoplus bivitta- tus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus mexicanus, Melanoplus sanguinipes, Melanoplus spretus, Nomadacris septemfasciata, Schi- stocerca americana, Schistocerca peregrina, Stauronotus marocca- nus, Tachycines asynamorus .
Aus der Klasse der Arachnoidea beispielsweise Spinnentiere (Aca- rina) wie Amblyomma americanum, Amblyomma variegatum, Argas per- sicus, Boophilus annulatus, Boophilus decoloratus, Boophilus ml - croplus, Brevipalpus phoenicis, Bryobia praetiosa, Dermacentor silvarum, Eotetranychus carpini, Eriophyes sheldoni, Paratetrany- chus pilosus, Phyllocoptruta oleivora, Polyphagotarsonemus latus, Tetranychus cinnabarinus , Tetranychus kanzawai, Tetranychus paci- ficus, Tetranychus telarius, Tetranychus urticae.
Aus der Klasse der Nematoden beispielsweise Wurzelgallennemato- den, z.B. Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Zysten bildende Nematoden, z.B. Globodera rostochien- sis, Heterodera avenae, Heterodera glycines, Heterodera schach- tii, Heterodera trifolii, Stock- und Blattälchen, z.B. Belonolai- mus longicaudatus , Ditylenchus destructor, Ditylenchus dipsaci, Heliocotylenchus multicinctus , Longidorus elongatus, Radopholus similis, Rotylenchus robustus, Trichodorus primitivus, Tylenchor - hynchus claytoni, Tylenchorhynchus dubius, Pratylenchus neglec- tus, Pratylenchus penetrans, Pratylenchus curvitatus, Pratylenchus goodeyi .
Pflanzen, die mit Ionenkanal-bildenden Verbindungen behandelt wurden, zeigten auch eine erhöhte Widerstandkraft beispielsweise gegen Befall mit Erwinia amylovora und anderen phytopathogenen Bakterien. Die wichtigsten phytopathogenen Bakterien können aus der Publikation "European Handbook of Plant Diseases", Eds . Smith, I.M., Dunez, J. , Lelliott, R.A. Phillips, D.H. and Archer, S.A. Blackwell Scientific Publications , 1988, entnommen werden.
Nach Applikation von Ionenkanal-bildenden Verbindungen auf Kulturpflanzen kann auch eine Induktion der Resistenz gegen Befall mit pflanzenpathogenen Viren festgestellt werden.
Die Applikation der Ionenkanal-bildenden Verbindungen auf Kulturpflanzen kann sowohl als Spritz- aber auch als Gießapplikation erfolgen.
Die Aufwandmengen der Ionenkanal-bildenden Verbindungen liegen bei der Verwendung zum Schutz von Kulturpflanzen je nach der Art des gewünschten Effektes bei 2 bis 0,1 kg/ha, vorzugsweise 1,25 bis 0,2 kg/ha, insbesondere 0,75 bis 0,3 kg/ha. Die Aufwandmengen liegen dabei vorzugsweise für Ionenkanal-bildende Verbindungen bei 1 bis 0,01 kg/ha, vorzugsweise 0,5 bis 0,02 kg/ha, insbesondere 0,25 bis 0,03 kg/ha.
Bei der Saatgutbehandlung werden im allgemeinen Aufwandmengen von 0,1 bis 100 g/100 kg Saatgut, vorzugsweise 0,5 bis 50 g/100 kg Saatgut, insbesondere 1 bis 10 g/100 kg Saatgut verwendet.
Beispiel 1
Quantifizierung der endogenen Jasmonsäure und Salicylsaure nach Alamethicin Behandlung
Aus Samen der Limabohne Phaseolus lunatus ferrimorse var. Jackson wonder bush wurden 8-10 cm hohe Pflanzen mit Primarblattern auf normaler Erde, bei 23°C, 60 % Luftfeuchtigkeit, 270 μE/m2 sec und einem hell/dunkel Wechsel von 16 Stunden Tageslicht und 8 Stunden Dunkelheit gezogen. Pflanzen mit gut ausgebildeten Primarblattern wurden komplett abgeschnitten und m 10 ml Leitungswasser m Ge- genwart von 10 μg/ml Alamethicin mkubiert.
Die Quantifizierung der endogenen Jasmonsäure und Salicylsaure erfolgte nach der Methode von McCluod et al . (1997) . Behandelte Blatter (lg) wurden dazu in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend mit flussigem Stickstoff gemόrsert. Das resultierende Pulver wurde m einer Lösung bestehend aus Aceton und 50 mM Zitronensäure (70:30, V:V) aufgenommen. Als interne Standards wurden [9, 10"2H2] -9 , 10 -dihydro- JA (146 ng) und [3 , 4 , 5 , 6 2H4] SA (500 ng) zugegeben. Das Lösungsmittel wurde über Nacht abgedampft (bei RT) . Die verbleibende wassrige Losung wurde .gefiltert und mit 3 x 10 ml Diethylether ausgeschüttelt. Die gesammelten Extrakte wurden anschließend auf eine SPΞ Saure gegeben und nach einem Waschschritt mit Trichlormethan und 2-Propanol (2:1, V/V) mit 10 ml Diethylether und Essigsaure (98:2; V/V) eluiert. Nach Evaporierung des Lösungsmittels und Veresterung durch einen Überschuß an Diazomethan wurden die Proben in 50 μl Dichlormethan aufgenommen und mittels GC/MS analysiert. Die Quantifizierung erfolgte anhand einer Eichkurve.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt. (■) Salicylat (SA); (^) Jasmonat (JA); (-•-) SA oder JA in unbehandelten Kontrollpflanzen.
Jasmonat zeigt einen charakteristischen transienten Anstieg in- nerhalb der ersten 80 mm (20-facher Anstieg), während endogene Salicylsaure erst nach etwa zwei h ansteigt und nach sechs h ein Plateau erreicht (ca. 200-facher Anstieg). Unbehandelte Kontroll- pflanzen produzieren erwartungsgemäß weder Duftstoffe, noch zeigen sie einen Anstieg der beiden Phytohormone Jasmonsäure und Salicylsaure. Beispiel 2
Quantifizierung der Ethylenabgabe nach Alamethicin Behandlung
Die Anzucht der Limabohnenpflanze erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Pflanzen wurden nach 14-tägiger Inkubation abge- schnittel und in 10 ml Leitungswasser enthaltend 10 μg/ml Alamethicin in einer Kammer inkubiert. Die Abluft dieser Kammer wurde kontinuierlich in eine Durchflußzelle geleitet und die Ethylen- bildung mittels Photoakustikspektroskopie (Beßler et al . , 1998) gemessen.
Abbildung 2a zeigt den Zeitverlauf der Ethylenbildung :
— unbehandelte Kontrolle
-•- Ethylenemission Alamethicin -behandelter Pflanzen
Nur die mit Alamethicin behandelten Pflanzen zeigen eine deutli¬ che Ethylenemission.
Beispiel 3
Peptaibole, Peptide und lonophoren als Elcitoren der Biosynthese von DuftStoffen der Limabohne
Die Anzucht der Limabohnenpflanze erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Pflanzen wurden nach 14-tägiger Inkubation abge- schnitten und in 10 ml Leitungswasser enthaltend 10 μg/ml Alamethicin bzw. 10 μg/ml einer einzelnen in Tabelle 1 genannten Verbindung inkubiert. Die Inkubation erfolgte in einem Exsikkator mit einem Kammervolumen von 750 ml. Die Luft dieser Kammer wurde im Kreis gefahren und kontinuierlich über einen Aktivkohlefilter geleitet.
Dieses als 'closed loop stripping' bekannte Verfahren beruht auf einem abgeschlossenen Kreislaufsystem, bei dem die im System enthaltene Luft durch Drehschieberpumpen über den Aktivkohlefilter geführt wird. In der Luft enthaltene flüchtige Analyten werden dort adsorbiert und können nach Ablauf der Versuchszeit durch geeignete Lösungsmittel (hier Dichlormethan) desorbiert und der Analytik zugeführt werden, siehe Donath, J. und Boland, W. , Phy- tochemistry 39 (1995), 785-790. Das Sammeln und die Analytik der in die Gasphase abgegebenen flüchtigen Substanzen wurde wie folgt durchgeführt: Die emittierten flüchtigen Verbindungen werden durchgehend über einen Zeitraum von 24 h auf 1,5 mg Aktivkohlefiltern (Fa. Le Rusisseau de Montbrun, F-09350 Daumazan sur Arize, France) gesammelt und mit 2x15 μl Dichlormethan eluiert. Die so gewonnenen Extrakte werden sofort mittels GC-MS analysiert: Säule "fused silica capillary Opti a 5", 15 m x 0.25 mm (Fa. Machery & Nagel, Düren, Deutschland), Helium als Trägergas mit 40 cm pro Minute. Die Auftrennung der Verbindungen erfolgte unter folgenden Bedingungen: 50 Grad Celsius für 1 min; dann 10 Grad pro Minute bis 180 Grad Celsius, anschließend 35 Grad Celsius pro Minute bis 280 Grad Celsius. Gerät: MS Finnigan GC-MS; Elektronische Ionisation 70 eV; GC inter- face 265 Grad Celsius; Ionenquelle 180 Grad Celsius; Scan ränge 35-300 Dalton.
Abbildung 2b zeigt beispielhaft das gaschromatographische Profil der flüchtigen Verbindungen nach Applikation von Alamethicin. Die Intensität der Signale ist verstärkt, um Nebenprodukte sichtbar zu machen. Quantitative Zusammensetzung: 4 , 11 -Dimethyl- nona- 1, 3 , 7 - trien (DMNT) 5 %, Methylsalicylat (MeSA) 4 %, 4,8,12-Trimethyltrideca-l,3,7,ll-tetraen (TMTT) = 91 %. Unbehan- delte Kontrollpflanzen zeigen keine Emission flüchtiger Verbindungen .
In Tabelle 1 werden folgende Abkürzungen verwendet: Aib: 2-Amino-2-methylpropionsäure, Argol : Argininol, Hyp : Hydro- xyprolin, Hylva: α-Hydroxyisovaleriansäure, Lac: Milchsäure, Leuol : Leucinol, Pheol : Phenylalaninol , Trpol: Tryptophanol . Ami - nosäuren haben L-Konfiguration, wenn nicht anders indiziert.
Die getesteten Substanzen wurden erhalten:
Ampullosporin A, Bergofungin A-C und Chrysospermin - Prof. U.
Gräfe , Hans-Knöll-Institut für Naturstoffforschung, Jena Systemin - Dr. T. Nürnberger , Institut für Pflanzenbiochemie, Halle
Alamethicin, Melittin und Valinomycin - Sigma-Aldrich, 82041 Dei- senhofen, Germany Bradykinin und Substanz P - Calbiochem, 65796 Bad Soden, Germany
Wie Tabelle 1 zu entnehmen ist, wirken nur Peptaibole stimulierend. Unabhängig von der Aminosäuresequenz des getesteten Peptai- bols wird von Blättern der Limabohne stets dasselbe Duftmuster freigesetzt, so daß auf Membrandepolarisierung als ein gemeinsa- mes Wirkprinzip geschlossen werden kann. Tabelle 1 Peptaibole, Peptides und lonophore als Elicitoren der Biosynthese von Duftstoffen
Peptaibole und Peptide Bildung von Duftstoffen (P. lunatus)
Alamethicin F - kommerziell erhältliches Alamethicin ist eine Mischung homologer Peptide Ac-Aib-Pro-Aib-Ala-Aib-Ala-Gln-Aib-Val-Aib-Gly-Leu-Aib-Pro-Val-Aib-Aib-Gln-Gln-Pheol
Ampullosporin A Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Aib-Aib-Aib-Gln-Leu-Aib-Gln-Leuol
Bergofungine - (A. Berg et al., Antibiotics 52(1999), 666-669)
(A) Ac-Val-Aib-Aib-Aib-Val-Gly-Leu-Aib-Aib-Hyp-Gln-iVal-Hyp-Aib-Pheol +
(B) Ac-Val-Aib-Aib-Aib-Val-Gly-Leu-Val-Aib-Hyp-Gln-iVal-Hyp-Aib-Pheol +
(C) Ac-Val-Aib-Aib-Aib-Val-Gly-Leu-Aib-Aib-Hyp-Gln-Aib-Hyp-Aib-Pheol +
Chrysospermin A - eingesetzt wurde eine Mischung der Chrysospermine A-D Ac-Phe-Aib-Ser-Aib-Aib-Leu-Gln-Gly-Aib-Aib-Ala-Ala-Aib-Pro-Aib-Aib-Aib-Gln-Trpol
Melittin
Gln-Gln-Arg-Lys-Arg-Lys-Ile-Try-Ser-Ile-Leu-Ala-Pro-Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Val-Lys-Leu-Val-
Ala-Gly-Ile-Gly
Valinomycin - Cyclo [-L-Val-D-Hylva-D-Val-L-Lac] 3
Bradykinin - Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Argol
Systemin - AIa-Val-Gln-Ser-Lys-Pro-Pro-Ser-Lys-Arg-Asp-Pro-Pro-Lys-Met-Gln-Thr-Asp
Beispiel 4
Systemische Wirksamkeit gegen Colletotπchum lagenarium an Gurken
Gurken der Sorte "Chinesische Schlange" wurden bis zum Zweiblatt- Stadium Einheitserde kultiviert. Dann wurde vorsichtig die Erde ausgewaschen und die Pflanzen wurden mit Wurzeln eine Hy drokultur mit Hoagland-Losung transferiert. Dieser wurde am glei- chen Tag eine wäßrige Wirkstoffaufbereitung, die aus einer Stamm losung bestehend aus 10 % Wirkstoff, 85 % Dimethylsulfoxid und 5 % Emulgiermittel angesetzt wurde, zugesetzt. Anschließend wurden die Versuchspflanzen im Gewachshaus bei Temperaturen zwischen 22° und 24° C und 60 bis 80 % relativer Luftfeuchtigkeit für 6 Tage kultiviert, bevor sie mit einer wäßrigen Sporensuspension von
Colletotπchum lagenarium, dem Erreger der Brennfleckenkrankheit der Gurke, inokuliert wurden. Anschließend wurden die Pflanzen im Gewachshaus bei Temperaturen zwischen 24° und 28° C und knapp 100 % relativer Luftfeuchtigkeit für eine Woche kultiviert. Dann wurde das Ausmaß der Krankheitsentwicklung auf den Blattern vi suell als %-Befall der Blattflache ermittelt.
Figure imgf000017_0001
Beispiel 5
Induktion der Phytoalex synthese an der Ganzpflanze
Es wurden voll entwickelte Blatter von Topfen gewachsenen Pe- tersil ekeimlmgen gezielt mit wäßriger Wirkstoffaufbereitung, die mit einer Stammlosung aus 10 % Wirkstoff, 63 % Cyclohexanon und 27 % Emulgiermittel angesetzt wurde, bis zur Tropfnaße besprüht bzw. für 1,2,3,5 oder 7 Tage in diese Wirkstoffaufberei - tung gestellt. Die Pflanzen bzw. Pflanzenteile wurden im Gewachs - haus bei Temperaturen zwischen 22° und 24° C und 60 bis 80 % relativer Luftfeuchtigkeit für eine Woche kultiviert. Das behandelte Pflanzenmaterial wurde in flussigem Stickstoff gemorsert und m em Gefäß mit 10 ml Aqua bidest gegeben und für 30 sec mit einem Vortex resuspendiert. Aus dem wassπgen Überstand der anschließenden Zentrifugation wurden die Furanocoumarme zweimal mit 2 Volumen (20 ml) Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde unter reduziertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Ruckstand wurde mit 100 μl Methanol aufgenommen. Dieser Methanol-Extrakt wurde auf eine Silicagel 60 TLC-Platte gespottet und m ei ner Dünnschichtchromatographie-Kammer mit dem Laufmittelgemisch Toluol/Ethylformiat/Ameisensäure (5:4:1; v/v/v) analysiert. Die Coumarinderivate wurden unter UV-Licht bei 366 nm detektiert.
Die gebildeten Phytoalexine der Petersilie gehören zur Substanz - klasse der Furanocoumarine (Psoralen, Xanthotoxin, Bergapten, Isopimpinellin, Umbelliferon, Marmesin) .
In diesem Test induziert Alamethicin die Synthese von Phytoalexi nen.
Beispiel 6
Induktion der Phytoalexinsynthese in Zellsuspensionskulturen
Es wurde eine Zellsuspensionskultur von Petersilie (Petroselinum crispum L.) in modifiziertem Gamborg's B5-Medium mit 1 mg/ml 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure im Dunkeln bei 26°C geschüttelt (100 U/min) und alle 7 Tage in frisches Medium überführt. Drei Tage alte Zellsuspensionskulturen wurden mit Alamethicin behandelt. Nach 24 Stunden wurden diese Ansätze sowie unbehandelte Kontoll - ansätze mit 10 nM des Peptidelicitors Pep-13 der Sequenz VWNQPVRGFKVYE versetzt und weitere 24 Stunden inkubiert. Die durch Alamethicin sensibilisierte Zellsuspensionskultur produ- ziert auf den Kontakt mit der Signalsubstanz Pep-13 Phytoalexine und andere Substanzen der pflanzlichen Pathogenabwehr . Die Phytoalexine der Petersilie vom Typ der Furancoumarine wurden im Kulturmedium der Zellen fluorimetrisch (Anregungswellenlänge 355 nm; Emissionswellenlänge 410 nm) quantifiziert.
Figure imgf000018_0001
Die Daten belegen, daß durch Alamethicin eine Erhöhung der elici- tor- induzierten Phytoalexinsynthese in Petersiliezellen hervorgerufen wird. Diese Sensibilisierung der Petersiliezellkultur für elicitorinduzierte Pathogenabwehrmechanismen ist ein Hinweis auf eine resistenzinduzierende Wirkung (Siegrist, J. et al. Physiol. Mol. Plant Pathol . 53 (1998), 223-238). Beispiel 7
Untersuchung der resistenzinduzierenden Wirkung an der Ganz - pflanze
Buschbohnenpflanzen der Sorte "Fori" werden mit dem Wirkstoff Alamethicin behandelt und nach einem mehrtägigen Induktionsintervall mit Bohnenrost (Uromyces phaseoli UROMAP) inokuliert. Nach der Inkubationszeit wird der Befall ausgewertet. Buschbohnen- pflanzen der Sorte "Primel" wurden wie folgt vorbereitet: Direkt - saat in 8cm-Rundtöpfe in Kompost/Einheitserde-Mischung, Anzucht bei 20 °C, Alter der Pflanzen bei Versuchsbeginn 11 Tage, 5 Pflanzen pro Versuchsvariante. Der Wirkstoff wurde wie folgt beschrieben: Ansetzen des Wirkstoffes mit DMSO, Verdünnen in wäßriger Lö- sung mit LF 700 Zusatz (100 ppm) , und Sprühapplikation in der Spritzkabine bis kurz vor dem ,point of runoff. Die Inokulation mit Pilzsporen von Uromyces phaseoli (UROMAP) erfolgte durch Sprühinokulation der Blattunterseite der Primärblätter mit Glas- Chromatographie-Sprüher bei einer Sporendichte: von 30 mg Sporen / 50 ml, Zusatz von 250 ppm Tween 20 zur Sporensuspension zur besseren Verteilung der Sporen in der Lösung.
Die Behandlung der Pflanzen erfolgte nach folgendem Schema:
0. Tag - Wirkstoffapplikation
3. Tag - Inokulation mit Pilzsporen 8. Tag - Auswertung
Figure imgf000019_0001
Der Bohnenrost Uromyces phaseoli (UROMAP) entwickelte sich auf den Blättern innerhalb von 8 Tagen so stark, daß eine Bonitur auf Anteil befallene Blattfläche möglich war. Bei der Auswertung wurde die befallene Blattfläche in % ermittelt:
Figure imgf000020_0001
In der vorliegenden Testung wurde Alamethicin auf seine resistenzinduzierende Wirkung untersucht. Eine Spritzapplikation mit 100 ppm Wirkstoff und einem anschließenden Induktionsinterval von 3 Tagen führte zu einer Befallsreduktion auf wenige Prozent Rest- befall.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen zur Resi- stenzinduktion im Pflanzenschutz.
2. Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindungen gekennzeichnet sind durch folgende Strukturmerkmale:
A peptidisch linear verknüpfte Aminosäurekette,
B. wobei der N-Terminus acyliert ist,
C. wobei der C-Terminus aus einer natürlich vorkommenden L- Aminosäure, die zum entsprechenden α-Aminoalkohol redu- ziert ist, besteht und
D. die Aminosäurekette die nicht-proteinogene Aminosäure α-Aminoisobuttersäure enthält.
3. Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen gemäß An- spruch 3, wobei die L-Aminosäure α-Aminoisobuttersäure 5 bis
10 mal in der Aminosäurekette enthalten ist.
4. Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen gemäß Anspruch 3, wobei die Aminosäurekette das Peptidmotiv L-Valin, L-Prolin oder L-Glutamin gefolgt von 2 α-Aminoisobuttersäu- ren, gefolgt von α-Aminoisobuttersäure oder L-Glutamin und gefolgt von L-Glutamin oder L-Valin enthält.
5. Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen gemäß An- spruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Alamethicin handelt.
6. Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen gemäß An¬ spruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Berg- ofungin handelt.
7. Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen gemäß An¬ spruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Chry- sospermin handelt.
8. Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen gemäß An¬ spruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Am- pullosporin handelt.
9. Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß sie Biosynthesegene co¬ dierend für die Synthese von Ionenkanal-bildenden Verbindungen nach Anspruch 2 exprimiert und somit die Pflanze vor Befall mit schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten geschützt wird.
10. Verfahren zur Induktion der Resistenz gegen Befall mit schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten, dadurch gekennzeichnet, daß Ionenkanal-bildende Verbindungen oder Mittel, die Ionenkanal-bildende Verbindungen enthalten, auf Pflanzen aufgebracht werden.
11. Mittel enthaltend Ionenkanal-bildende Verbindungen zur Induktion der Resistenz gegen Befall von Pflanzen mit schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten.
12. Verwendung von Mikroorganismen, die Ionenkanal-bildende Verbindungen nach Anspruch 2 produzieren, zur Bekämpfung von schädlichen Pilzen, Bakterien, Viren, Nematoden und Insekten mittels Resistenzinduktion im Pflanzenschutz.
13. Verwendung von Ionenkanal-bildenden Verbindungen gemäß Anspruch 2 als Fungizide im Pflanzenschutz.
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