WO2017055286A1 - Méthode pour améliorer la capacité d'un composé à traverser les membranes - Google Patents

Méthode pour améliorer la capacité d'un composé à traverser les membranes Download PDF

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WO2017055286A1
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peptide
formula
groups
function
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PCT/EP2016/073002
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Nicolas Inguimbert
Khoubaib BEN HAJ SALAH
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Universite De Perpignan Via Domitia
Universite De Montpellier
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the stability of a compound carrying at least one amine function and its ability to cross cell membranes, thus the stabilized compounds thus obtained have a better stability and a better ability to cross the membranes. cell.
  • Peptides are amino acid polymers having many biological functions and finding biotechnological applications, particularly in the pharmaceutical and phytosanitary fields. Peptides have several advantages over other conventionally used molecules since they are generally water soluble, have high efficacy and selectivity for their biological targets and are associated with fewer side effects.
  • pepta ⁇ bols have shown increasing pharmacological interest, because these peptides of fungal origin have antibacterial activity. This makes these peptides, for example alamethicine, good antibiotic candidates.
  • peptides are generally degraded by the very acidic gastric environment and by proteases. Thus the peptides have in the body a half-life time too short that does not allow them to reach their biological target. Their mode of administration requires the use of intravenous injection, which is a constraint for patients and affects their quality of life.
  • the current challenge for peptide development for both human health and crop protection is to increase their interaction with cell membranes to facilitate their uptake and to protect against degradation by peptidases.
  • Another approach is to simultaneously associate with these peptides a lipophilic compound contributing to better bioavailability and PEG to increase resistance to proteolysis. Injectable forms of insulin have been developed by this approach. This method nevertheless has the disadvantage of adding two new entities on the parent molecule which can reduce its affinity for its target.
  • a third approach is to replace at least one amide bond with an isosteric function.
  • These isosteres are supposed to have physicochemical properties similar to the amide function. Since the atoms of the amide bond do not necessarily intervene in the recognition phenomenon, the modified peptides retain a good affinity with the biological target while being more resistant to enzymatic degradation and the extended conformation of the peptide is retained.
  • 1,2,3-triazole-1,4-disubstituted heterocycle has proved particularly interesting.
  • Valverde and Mindt (Chimia (Aarau) 2013: 67 (4): 262-6.) Describe that the 1,2,3-triazole heterocycle has a structure similar to the peptide bond and is stable with respect to enzymatic degradation.
  • Valverde et al. (Angew Chem Int., 2013, 52, 8957 - 8960) have described nine BBN peptide analogs (7-14) each having at least one 1,2,3-triazole group in the main chain.
  • the first aspect of the invention therefore aims to provide a method for improving the stability of a compound carrying at least one amino function and its ability to cross cell membranes.
  • Said method consists in fixing on at least one amino function of said compound, a unit of formula (I):
  • R 2 and R 3 are chosen independently of one another from a hydrogen atom and (C 1 -C 4 ) alkyl groups, especially a methyl group.
  • the invention is based on the surprising effect produced by the unit of formula (I) which makes it possible to significantly increase the biological activity of a peptide.
  • this motif when this motif is attached to alumethine, which is peptaibol, it increases the antimicrobial activity of this peptide by almost 10-fold.
  • the unit of formula (I) improves both the resistance of a peptide to enzymatic degradation and its membrane integration.
  • These advantages could be related to the fact that the unit of formula (I) does not disturb the peptide conformation, in particular the helical secondary structure of the peptide, which makes it possible to preserve the biological activities thereof.
  • (C 1 -C 4) alkyl is meant a linear or branched alkyl radical of 1 to 4 carbon atoms, such as the methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl and tert-butyl radicals.
  • the substituent Ri of the unit of formula (I) is chosen from the following groups:
  • the unit-attached unit has the formula ( ⁇ )
  • R 2 and R 3 are chosen independently of each other from a hydrogen atom and (C 1 -C 4) alkyl groups, in particular a methyl group,
  • either one is chosen from the fluorine atom and the -CF3 group, the other being a hydrogen atom
  • the motif attached to a compound corresponds to formula (Ia)
  • R 2 and R 3 are chosen independently of each other from a hydrogen atom and (C 1 -C 4) alkyl groups, especially a methyl group.
  • the motif attached to a compound corresponds to the formula
  • said compound carrying at least one amino function may be a peptide, a pseudopeptide or a compound with therapeutic activity bearing at least one amine function, said aforementioned unit of formula (I), in particular of formula ( ⁇ ), (la), (Ib), (le) or (Id), being fixed on:
  • peptide means a polymer having at most 50 amino acids, advantageously at least 3 amino acids and at most 50 amino acids, more preferably at least 4 amino acids and at most 50 amino acids, linked together by peptide bonds.
  • polypeptide is meant a synthetic molecule similar in functionality or overall configuration to a peptide having a biological activity and capable of interacting with the receptor (s) or target (s) of said peptide.
  • a therapeutically active compound bearing at least one amine function is preferably a therapeutically active compound whose molecular weight does not exceed 5000.
  • peptide bond and "amide bond” are interchangeable within the meaning of the present invention, when it relates to the -CONH- bond in a peptide.
  • Said peptide may comprise proteinogenic amino acids and / or nonproteinogenic amino acids and / or non-natural amino acids.
  • Amino acids are the amino acids incorporated into proteins when translating messenger RNA through ribosomes. There are a total of 22 protein amino acids, namely Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Pyl, Salt, Ser, Thr.
  • Non-proteinogenic amino acids are those amino acids that can not be incorporated into proteins when translating messenger RNA through ribosomes. These amino acids can be acids natural amines.
  • non-proteinogenic amino acids there may be mentioned ⁇ -aminoisobutyric acid (Aib), isovaline (Iva), homoserine (Hse), dihydro-2-aminobutyric acid (Dhb) , 2,4-diaminobutyric acid (Dab) or sarcosine (Sar).
  • Non-natural amino acids are amino acids that can not be naturally produced by a living organism.
  • the peptide may be a peptide extracted from a biological organism or an artificially synthesized peptide.
  • the invention relates to a method for improving the stability of a peptide and its capacity to cross the cell membrane, in which the unit of formula I as described above, in particular of formula ( ⁇ ) , (Ia), (Ib), (Ie) or (Id), is attached to the amino function of the amino acid placed at the N-terminus or, when said peptide comprises at least one lysine, to the function amine of the side chain of said at least one lysine.
  • said unit replaces the amino acid in the N-terminal position of said peptide.
  • Another aspect of the invention relates to compounds that can be obtained by the method of the invention.
  • These compounds are analogs of compounds carrying at least one amino function, especially analogs of peptides, pseudopeptides or compounds with therapeutic activity. These analogs have better stability and ability to cross the cell membrane compared to the molecules from which they were prepared.
  • such an analogue comprises a unit of formula I:
  • - Ri is chosen from a phenyl group substituted with one to three identical or different substituents chosen independently of one another from the fluorine atom and the -CF3 or -OCF3 groups and, the biphenyl, pyrenyl, naphthyl and phenanthrenyl groups, optionally substituted with a substituent selected from -
  • R2 and R3 are chosen independently of each other from a hydrogen atom and (C1-C4) alkyl groups, in particular a methyl group,
  • said unit being attached to at least one amino function of said compound, in particular, said pattern being fixed on:
  • the invention relates to the analogs of a peptide represented by formula II
  • Said peptide contained in said analog of formula II is linked to the -CO group of the unit of formula I by the amino function of its amino acid in the N-terminal position or, when it comprises at least one lysine, by an amino function of the side chain of said at least one lysine
  • said peptide is peptaibol.
  • peptaibol refers to a class of linear peptides acetylated at the N-terminus and having antibacterial and antifungal activity, the peptaibols being characterized, on the one hand, by a high number of non-proteionogenic amino acids essentially the acid a- aminoisobutyric acid (Aib) or isovaline (Iva) and, on the other hand, the presence of the C-terminal side of an aminoalcohol, phenylalaninol and leucinol being the most common.
  • Aub acid a- aminoisobutyric acid
  • Iva isovaline
  • Peptibols consist essentially of 7 to 21 encoded and uncoded amino acids. With the exception of the Aib and Gly residues which do not have asymmetric carbon, these amino acids are of (L) configuration except isovaline which can be found in the form (D).
  • pepta ⁇ bols mention may be made, for example, of alamethicine or bergofungine D.
  • the invention relates to analogs of an alamethicin.
  • Alamethicine is a family of several tens of 20 amino acid peptides classified into two main groups: alamethicin F30 and alamethicin F50, the two groups being distinguished by the amino acid in position 18, a glutamic acid (Glu) for F30 alamethicins and glutamine (Gin) for F50 alamethicins.
  • Glu glutamic acid
  • Gin glutamine
  • Alamethicin F30 / 5 is represented by the amino acid sequence hereinafter: ## STR1 ##
  • Alamethicin F50 / 5 is represented by the amino acid sequence: AcUPUAUAQUVUGLUPVUUQQFol (SEQ ID NO: 2).
  • the invention relates to the analogs of alamethicine, corresponding to the formula (IIa)
  • R 2 and R 3 are independently selected from hydrogen and methyl
  • Pepl is the peptide of sequence SEQ ID NO: 3 (PUAUAQUVUGLUPVUUEQFol) or the peptide of sequence SEQ ID NO: 4 (PUAUAQUVUGLUPVUUQQFol).
  • the Pepl peptide is linked to the -CO group of the unit of formula (Ia) or (Ib) by the amino function of the amino acid in the N-terminal position.
  • the invention relates to an alamethicin analog F50 / 5 of formula (Ile)
  • Another object of the invention is to provide a method for the preparation of the above analogs, in particular analogs of a compound bearing at least one amino function, in particular analogs of a peptide, a pseudopeptide or a compound with therapeutic activity carrying at least one amino function.
  • Said method comprises the following steps:
  • R2 and R3 are chosen independently of each other from a hydrogen atom and (C1-C4) alkyl groups, especially a methyl group,
  • Ri is chosen from:
  • a phenyl group substituted with one to three identical or different substituents chosen independently of one another from the fluorine atom and the -CF3 or -OCF3 groups and, the biphenyl, pyrenyl, naphthyl and phenanthrenyl groups, optionally substituted with a substituent selected from - OCHs, fluorine atom, -CF 3 or -OCFs
  • Ri is chosen from:
  • a phenyl group substituted with one to three identical or different substituents chosen independently of one another from the fluorine atom and the groups -CF3 or -OCF3 and, biphenyl, pyrenyl, naphthyl and phenanthrenyl groups,
  • R2 and R3 are chosen independently of each other from a hydrogen atom and (C1-C4) alkyl groups, in particular a methyl group, - Re is the hydroxyl group or a chlorine,
  • step (ii) reacting, optionally in the presence of at least one coupling agent, between a compound of formula III obtained in step (i) and at least one amino group of a compound to be stabilized to obtain an analogue of said compound .
  • This reaction is carried out between a precursor carrying the alkyne function and a precursor bearing the azide function in the presence of a catalyst. It makes it possible to produce 1,2,3-triazoles-1-4-disubstituted at room temperature while increasing the kinetics of reaction.
  • the hydroxyl group of a compound of formula (III) can form an activated ester by reactions with different coupling agents known in the art or be converted into acyl chloride. All these techniques are known to those skilled in the art.
  • FIGS. 1A, 1B, 1C and 1D respectively illustrate the analytical HPLC results for alumethicin F50 / 5 (FIG. 1A) and the alamethicin F50 / 5 analogs, namely compound 5 (FIG. 1B), the compound 6 (figure
  • FIGS. 2A, 2B and 2C respectively illustrate the spectra of
  • Figure 3 shows the chemical shifts of proton amide resonances for each amino acid between compound 6 or 7 and alamethicin.
  • Figure 4 shows the circular dichroism spectra of alamethicin and compounds 6 and 7.
  • HPLC High-performance liquid chromatography (high performance liquid chromatography)
  • the analysis is carried out on a PhenomenexKinetex C-18 column (100 ⁇ 300 mm) using a gradient consisting of buffer A (aqueous solution A comprising 0.1% AF) and buffer B (ACN comprising 0 , 1% AF).
  • the elution is carried out at a flow rate of 0.5 ml / min with 10% of buffer B up to 100% of the buffer B in 30 min followed by a return to 10% of the buffer B in 7 min.
  • Analytical HPLC is performed by the Waters® 2695 HPLC system with a Vydac® 218MS 5 ⁇ M C-18 column (250 x 4.6 mm) from Grace and a light scattering detector.
  • the eluents used are buffer A (0.1% FA in water) and buffer B (0.1% FA in MeOH).
  • Imidazole-1-sulfonyl azide hydrochloride (36mmol) is added to ⁇ -aminoisobutyric acid (Aib) (30mmol), K2CO3 (90mmol) and CUSO4.5H2O (0.3mmol) in MeOH (300ml) .
  • the mixture is stirred at ambient temperature for 12 hours.
  • the mixture is concentrated and then diluted with diethyl ether (100 mL) and extracted with saturated NaHCO3 (3x50 mL).
  • the remaining aqueous phase is acidified to pH 1 with 1M HCl solution and extracted three times with ethyl acetate (3 x 50 mL).
  • the organic extract is washed with saturated NaCl solution (2 x 30 mL) and dried with MgSO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure to obtain an oily yellowish product. This product is used in the next step without further purification.
  • R 4 and R 5 are both hydrogen (compound 2); either R 4 and R 5 are both fluorine (compound 3); either R 4 is the group -CF 3 and R 5 is the hydrogen atom.
  • step 1.4 The compound 1 obtained in step 1.4. (1 mmol) and the respective alkynes (1 mmol) are dissolved in degassed acetonitrile (10 mL). 2,6-lutidine (2 mmol) and diisopropylethylamine (2 mmol) are added to this solution under argon. The copper iodide (0.1 mmol) is then added to this solution. The reaction is carried out under stirring under argon for 6 h. The mixture is diluted with EtOAc (150 mL). The solution is washed with a mixture of saturated NH 4 CI and NH 4 OH with a proportion of 9: 1.
  • 2,4-difluorophenyl Aib-OH (compound 3): A white solid of 2.5 g (80%) is obtained by reacting 1.5 g (11.6 mmol) ) of compound 1 and 1.6 g (11.6 mmol) of 1-ethynyl-2,4-difluorobenzene. Rf 0.5 (cHex / EtOAc / AcOH 4.9: 4.9: 0.2 (v / v)).
  • Solid phase peptide synthesis is performed by an automated peptide synthesizer (CEM liberty one, Orsay, France) using Fmoc / O-tbutyl chemistry. All the amino acids protected by Fmoc, DIC, Oxyma, the 2-chlorotrityl chloride resin preloaded with phenylalaninol (loaded 0.67 mmol / g or 0.36 mmol / g) come from the company Iris Biotech (Germany). DCM, DMF, CHex, DIEA, AC2O, TFA, TIS, FA, CAN and piperidine for peptide synthesis are obtained from Aldrich (USA). The synthesis of peptides in the solid phase is carried out according to the known methods (Ben Haj Salah et al., Org Lett 2014, 16, 1783-1785).
  • Alamethicin F50 / 5 and its compound analogs 5, 6 and 7 are synthesized by this method.
  • the crude almethicin F50 / 5 is purified by semi-preparative HPLC using a linear gradient of 50% to 100% of buffer B in buffer A for 35 min at a flow rate of 3 mL / min to obtain alamethicin F50 / 5.
  • purified 89 mg, 45% yield,> 98% purity).
  • Compound 5 is an analogue of alamethicin F 50/5 having the following sequence: ⁇ ⁇ [ ⁇ ⁇ ] ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ ⁇ 36 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ ⁇ £ ⁇ ⁇ 3 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 6 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the crude compound 6 is purified by semi-preparative HPLC using a linear gradient of 20% to 70% of buffer B in buffer A for 40 min at a flow rate of 3 mL / min to obtain compound 6 (85 mg, 42%). yield,> 98% purity).
  • Compound 7 corresponds to formula (IId) and is represented by the following sequence:
  • Alamethicin and its analogs 5, 6 and 7 are all analyzed respectively by analytical HPLC according to the protocol described in section 1.2. using a gradient of 10% to 100% of buffer B with a flow rate of 0.9 mL / min for 50 min.
  • Circular dichroism spectra are measured according to the protocol described in Biopolymers. 2015 Mar 18. doi: 10.1002 / beep.22641. [Epub ahead of print]).
  • KB cells (ATCC CCL 17 human oral epidermoid carcinoma,
  • the trypsinized cells were suspended at 2 ⁇ 10 5 cells / ml suspended in supplemented BME and then 50 ⁇ l of this suspension was deposited in each well of a 96-well microplate, (Nunclon delta). ground, Thermo Scientific Nunc). After a 48 h incubation, 50 ⁇ L of each sample (alamethicin F50 / 5, compounds 5, 6 and 7) was added to the 5 ⁇ of initial cell suspension. These samples were tested at a final 5% (v / v) methanol content in supplemented BME at concentrations ranging from 3 to 400 ⁇ g / mL.
  • a methanoic solution at 5% (v / v) in the BME was used as a control.
  • the cell viability was evaluated by the colorimetric MTT colorimetric (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium, Sigma-Aldrich) test. All technical and biological in vitro assays were performed three times.
  • a sequential dilution culture assay was performed to compare the activity of the alamethicin analogs, compounds 5, 6 and 7 to alumethine F50 / 5 using concentrations of: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.1, 1.5 ⁇ g / mL.
  • the bacterial strains of Bacillus subtilis (CIP 103406) and Staphylococcus aureus were cultured and maintained in LB culture medium and tryptic soy agar at 28 ° C. Growth phase exponential culture in LB medium (after incubation for 6 h in fresh medium) was diluted to 1x10 4 CFU / ml in LB medium.
  • Alamethicin F50 / 5 and analogs 5, 6 and 7 are respectively analyzed by analytical HPLC according to the protocol described in section 1.2. above. The results show that these synthesized compounds are purified to a satisfactory level by semi-preparative HPLC.
  • Tables 2, 3, 4, 5, 6 and 7 below show respectively the chemical shifts of * H, 13 C for alamethicin F50 / 5, compound 6 and compound 7.
  • Table 8 shows the coupling constant of 3 _7 (HN, Ha) of alamethicin, compound 6 and compound 7 in Hz.
  • Table 1 Results of the tests of compounds 5, 6 and 7 on the cell growth of KB cells and two gram-positive bacteria.
  • the compounds of the invention listed in Table 9 below are synthesized according to the method described in the application and analyzed by LC-MS according to the protocol described in Part 1.1. above. The results of LC-MS confirm that these analogs are pure and present the mass expected molecular.
  • the compounds listed in Table 9 below are tested on Bacillus subtilis. The respective MIC (minimum inhibitory concentration) value of these compounds with respect to this bacterium is also found in Table 9.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode d'amélioration de la stabilité d'un composé portant au moins une fonction amine et de sa capacité à traverser les membranes cellulaires, ainsi les composés stabilisés ainsi obtenus présentent une meilleure stabilité et une meilleure capacité à traverser les membranes cellulaires.

Description

„
METHODE POUR AMELIORER LA CAPACITE D'UN COMPOSE A TRAVERSER LES MEMBRANES
La présente invention concerne une méthode d'amélioration de la stabilité d'un composé portant au moins une fonction aminé et de sa capacité à traverser les membranes cellulaires, ainsi les composés stabilisés ainsi obtenus présentent une meilleure stabilité et une meilleure capacité à traverser les membranes cellulaires.
Les peptides sont des polymères d'acides aminés possédant de nombreuses fonctions biologiques et trouvant des applications biotechnologiques, en particulier dans les domaines pharmaceutiques et phytosanitaires. Les peptides présentent plusieurs avantages par rapport aux autres molécules traditionnellement utilisées, puisqu'ils sont généralement solubles dans l'eau, possèdent une efficacité et une sélectivité importante vis-à-vis de leurs cibles biologiques et sont associés à moins d'effets secondaires.
Par exemple, depuis une décennie les peptaïbols ont montré de plus en plus d'intérêt pharmacologique, car ces peptides d'origines fongiques possèdent une activité antibactérienne. Cela fait de ces peptides, par exemple l'alaméthicine, de bons candidats antibiotiques.
Malgré leurs nombreux avantages, l'utilisation thérapeutique des peptides est difficile car ils présentent une faible biodisponibilité par voie orale. Les peptides sont généralement dégradés par l'environnement gastrique très acide et par des protéases. Ainsi les peptides présentent dans l'organisme un temps de demi-vie trop court qui ne leur permet pas d'atteindre leur cible biologique. Leur mode d'administration nécessite d'avoir recours à une injection intraveineuse, ce qui constitue une contrainte pour les patients et affecte leur qualité de vie.
L'enjeu actuel pour le développement de peptides tant pour la santé humaine que pour la protection des cultures repose sur l'augmentation de leur interaction avec les membranes cellulaires afin de faciliter leur absorption et sur leur protection contre la dégradation par les peptidases.
Plusieurs techniques ont été développées pour proposer une solution à ces problèmes. De nombreux médicaments peptidiques développés par l'industrie pharmaceutique présentent une protection au niveau de l'extrémité N- terminale qui permet de protéger ces peptides contre la dégradation et d'améliorer leur biodisponibilité et leur passage à travers les membranes cellulaires. Ces modifications consistent souvent en une simple acétylation et ne permettent pas d'obtenir des résultats satisfaisants.
Une autre approche consiste à associer simultanément à ces peptides un composé lipophile contribuant à une meilleure biodisponibilité et un PEG pour accroître la résistance à la protéolyse. Des formes injectables d'insuline ont été développées par cette approche. Cette méthode présente néanmoins l'inconvénient d'ajouter deux nouvelles entités sur la molécule parente ce qui peut réduire son affinité pour sa cible.
Une troisième approche consiste à remplacer au moins une liaison amide par une fonction isostère. Ces isostères sont supposés avoir des propriétés physicochimiques similaires à la fonction amide. Les atomes de la liaison amide n'intervenant pas nécessairement dans le phénomène de reconnaissance, les peptides modifiés conservent une bonne affinité avec la cible biologique tout en étant plus résistants vis à vis de la dégradation enzymatique et la conformation étendue du peptide est conservée.
Parmi les motifs considérés comme isostère de la liaison amide, l'hétérocycle l,2,3-triazole-l,4-disubstitué s'est montré particulièrement intéressant. Valverde et Mindt (Chimia (Aarau). 2013 ; 67(4) : 262-6.) décrivent que l'hétérocycle 1, 2, 3-triazole possède une structure similaire à la liaison peptidique et est stable à l'égard de la dégradation enzymatique. Valverde et al. (Angew. Chem. Int., 2013, 52, 8957 - 8960) ont décrit neuf analogues d'un peptide BBN (7-14), chacun comportant au moins un groupe 1, 2, 3-triazole dans la chaîne principale.
Cependant, les études récentes ont montré que la présence de l'hétérocycle l,2,3-triazole-l,4-disubstitué dans un peptide peut perturber la structure hélicoïdale de ce peptide et affecter, par conséquent, son activité biologique.
Afin d'améliorer les activités biologiques et la biodisponibilité des médicaments peptidiques, il y a toujours un besoin de développer une nouvelle technique permettant de minimiser le changement de conformation de peptide, et d'améliorer à la fois la stabilité d'un peptide et sa capacité à traverser les membranes cellulaires.
Le premier aspect de l'invention a donc pour objet de proposer une méthode pour améliorer la stabilité d'un composé portant au moins une fonction aminé et sa capacité à traverser les membranes cellulaires.
Ladite méthode consiste à fixer sur au moins une fonction aminé dudit composé, un motif de formule (I) :
Figure imgf000004_0001
éventuellement substitués par un substituant choisi parmi - OCH3, l'atome de fluor, -CF3 ou -OCF3,
- R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (Ci-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle.
L'invention repose sur l'effet surprenant produit par le motif de formule (I) qui permet d'augmenter significativement l'activité biologique d'un peptide. Par exemple, lorsque ce motif est fixé à l'alaméthicine, qui est un peptaïbol, il permet d'augmenter presque 10 fois l'activité antimicrobienne de ce peptide.
En effet, il s'avère que le motif de formule (I) améliore à la fois la résistance d'un peptide à la dégradation enzymatique et son intégration membranaire. Ces avantages pourraient être liés au fait que le motif de formule (I) ne perturbe pas la conformation de peptide, notamment la structure secondaire hélicoïdale du peptide, ce qui permet d'en préserver les activités biologiques. Ladite méthode peut être appliquée à tout composé portant une fonction aminé, car la fixation dudit motif sur un composé est effectuée par la formation d'une liaison amide, entre le groupe -C=0 du motif de formule (I) et un groupe aminé du composé à stabiliser.
Par (Ci-C4)alkyle, on entend un radical alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 4 atomes de carbone, tel que les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, sec-butyle et tert-butyle.
Dans un mode de réalisation avantageux, le substituant Ri du motif de formule (I) est choisi parmi les groupes ci-après:
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000006_0001
Dans un mode de réalisation plus avantageux, le motif fixé à composé répond à la formule (Γ)
Figure imgf000006_0002
dans laquelle :
- R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle,
- R4 et R5 :
- soit représentent tous les deux un atome de fluor,
- soit représentent tous les deux un groupe -CF3,
- soit l'un est choisi parmi l'atome de fluor et le groupe -CF3, l'autre étant un atome d'hydrogène
Dans un mode de réalisation encore plus avantageux, le motif fixé à un composé répond à la formule (la)
Figure imgf000007_0001
( la),
ou à la formule (Ib)
Figure imgf000007_0002
(Ib),
dans lesquelles R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle.
Lorsque les substituants R2 et R3 sont différents, le carbone qui les porte est asymétrique et les composés peuvent être en configuration R ou S.
Encore plus avantageusement, le motif fixé à un composé répond à la formule (le)
Figure imgf000007_0003
(le),
ou à la formule (Id)
Figure imgf000007_0004
(Id) Conformément à la présente invention, ledit composé portant au moins une fonction aminé peut être un peptide, un pseudopeptide ou un composé à activité thérapeutique portant au moins une fonction aminé, ledit susdit motif de formule (I), notamment de formule (Γ), (la), (Ib), (le) ou (Id), étant fixé sur :
- au moins une fonction aminé dudit composé à activité thérapeutique ou dudit pseudopeptide, ou
- sur la fonction aminé de l'acide aminé à l'extrémité N-terminal dudit peptide ou, lorsque ledit peptide comporte au moins une lysine, sur le groupe aminé de la chaîne latérale de ladite au moins une lysine.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « peptide » un polymère ayant au maximum 50 acides aminés, avantageusement au minimum 3 acides aminés et au maximum 50 acides aminés, plus avantageusement au minimum 4 acides aminés et au maximum 50 acides aminés, liés entre eux par des liaisons peptidiques.
On entend par « pseudopeptide », une molécule synthétique similaire en termes de fonctionnalité ou de configuration globale à un peptide ayant une activité biologique et pouvant interagir avec le(s) récepteur(s) ou le(s) cible(s) dudit peptide.
Dans le cadre de la présente invention, un composé à activité thérapeutique portant au moins une fonction aminé est préférentiellement un composé à activité thérapeutique dont le poids moléculaire ne dépasse pas 5000.
Les termes « liaison peptidique » et « liaison amide » sont interchangeables au sens de la présente invention, lorsqu'il s'agit de la liaison -CONH- dans un peptide.
Ledit peptide peut comporter des acides aminés protéinogènes et/ou des acides aminés non protéinogènes et/ou des acides aminés non naturels.
Les acides aminés sont les acides aminés incorporés dans les protéines lors de la traduction de l'ARN messager par les ribosomes. Il existe en tout 22 acides aminés protéinogènes, à savoir Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Pyl, Sel, Ser, Thr.
Les acides aminés non protéinogènes sont les acides aminés qui ne peuvent pas être incorporé dans les protéines lors de la traduction de l'ARN messager par les ribosomes. Ces acides aminés peuvent être des acides aminés naturels. A titre d'exemple des acides aminés non protéinogènes, on peut notamment citer l'acide α-aminoisobutyrique (Aib), l'isovaline (Iva), l'homosérine (Hse), l'acide dihydro-2-aminobutyrique (Dhb), l'acide- 2, 4- diaminobutyrique (Dab) ou la sarcosine (Sar).
Les acides aminés non naturels sont les acides aminés qui ne peuvent pas être produits naturellement par un organisme vivant.
Ledit peptide peut être un peptide extrait d'un organisme biologique ou un peptide synthétisé artificiellement.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode pour améliorer la stabilité d'un peptide et sa capacité à traverser la membrane cellulaire, dans laquelle le motif de formule I telle que décrit ci- dessus, notamment de formule (Γ), (la), (Ib), (le) ou (Id), est fixé à la fonction aminé de l'acide aminé placé à l'extrémité N-terminale ou, lorsque ledit peptide comporte au moins une lysine, à la fonction aminé de la chaîne latérale de ladite au moins une lysine.
Dans un mode de réalisation plus avantageux, ledit motif remplace l'acide aminé en position N-terminale dudit peptide.
Un autre aspect de l'invention a pour objet des composés susceptibles d'être obtenus par la méthode de l'invention. Ces composés sont des analogues de composés portant au moins une fonction aminé, notamment des analogues de peptides, de pseudopeptides ou de composés à activité thérapeutique. Ces analogues possèdent une meilleure stabilité et une meilleure capacité à traverser la membrane cellulaire par rapport aux molécules à partir desquels ils ont été préparés.
Conformément à l'invention, un tel analogue comporte un motif de formule I :
Figure imgf000009_0001
(I)
dans laquelle :
- Ri est choisi parmi - un groupe phényle substitué par un à trois substituants identiques ou différents choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome de fluor et les groupes -CF3 ou -OCF3 et, les groupes biphényle, pyrènyle, naphtyle, et phénanthrènyle, éventuellement substitués par un substituant choisi parmi -
OCHs, l'atome de fluor, -CF3 ou -OCFs
- R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle,
ledit motif étant fixé sur au moins une fonction aminé dudit composé, notamment, ledit motif étant fixé sur :
- au moins une fonction aminé dudit médicament ou dudit pseudopeptide, ou
- sur la fonction aminé de l'acide aminé à l'extrémité N-terminale dudit peptide ou, lorsque ledit peptide comporte au moins une lysine, sur une fonction aminé de la chaîne latérale de ladite au moins une lysine.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention porte sur les analogues d'un peptide, représentés par la formule II
Figure imgf000010_0001
dans laquelle les substituants Ri, R2, et R3 sont définis tels que ci-dessus.
Ledit peptide contenu dans ledit analogue de formule II est lié au groupement -CO du motif de formule I par la fonction aminé de son acide aminé en position N-terminale ou, lorsqu'il comporte au moins une lysine, par une fonction aminé de la chaîne latérale de ladite au moins une lysine
Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit peptide est un peptaïbol.
Le terme « peptaïbol » se réfère à une classe de peptides linéaires acétylés à l'extrémité N-terminale et possédant une activité antibactérienne et antifongique, les peptaïbols étant caractérisés, d'une part, par un nombre élevé d'acides aminés non protéionogènes essentiellement l'acide a- aminoisobutyrique (Aib) ou l'isovaline (Iva) et, d'autre part, par la présence du côté C-terminal d'un amino-alcool, le phénylalaninol et le leucinol étant les plus communs.
Les peptaïbols se composent essentiellement de 7 à 21 acides aminés codés et non codés. A l'exception des résidus Aib et Gly qui ne possèdent pas de carbone asymétrique, ces acides aminés sont de configuration (L) sauf l'isovaline qui peut être trouvée sous la forme (D).
Parmi les peptaïbols, on peut citer à titre d'exemple l'alaméthicine ou la bergofungine D.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne les analogues d'une alaméthicine.
L'alaméthicine est une famille de plusieurs dizaines de peptides de 20 acides aminés classés en deux groupes principaux : les alaméthicines F30 et les alaméthicines F50, les deux groupes se distinguant par l'acide aminé en position 18, un acide glutamique (Glu) pour les alaméthicines F30 et une glutamine (Gin) pour les alaméthicines F50.
L'alaméthicine F30/5 est représenté par la séquence d'acides aminés ci-après : AcUPUAUAQUVUGLUPVUUEQFol (SEQ ID NO : 1).
L'alaméthicine F50/5 est représenté par la séquence d'acides aminés : AcUPUAUAQUVUGLUPVUUQQFol (SEQ ID NO : 2).
Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne les analogues de l'alaméthicine, répondant à la formule (Ha)
Figure imgf000011_0001
(Ilb), dans lesquelles :
R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi un hydrogène et un méthyle, et
Pepl est le peptide de séquence SEQ ID NO : 3 (PUAUAQUVUGLUPVUUEQFol) ou le peptide de séquence SEQ ID NO : 4 (PUAUAQUVUGLUPVUUQQFol).
Le peptide Pepl est lié au groupement -CO du motif de formule (la) ou (Ib) par la fonction aminé de l'acide aminé en position N-terminale.
Plus particulièrement, l'invention concerne un analogue de l'alaméthicine F50/5 de formule (Ile)
Figure imgf000012_0001
ou de formule (Ild)
Figure imgf000012_0002
(Ild)
dans lesquelles Pepl est tel que défini ci-dessus.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une méthode de préparation des susdits analogues, notamment des analogues d'un composé portant au moins une fonction aminé, notamment des analogues d'un peptide, d'un pseudopeptide ou d'un composé à activité thérapeutique portant au moins une fonction aminé.
Ladite méthode comprend les étapes suivantes :
(i) la formation par une réaction de cycloaddition azide-alcyne catalysée par du cuivre (copper(I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC)) entre un composé de formule A
Figure imgf000013_0001
(A)
dans laquelle R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle,
et un composé de formule B
R1— -ΞΞΞΞΞ (B)
- dans laquelle Ri est choisi parmi :
- un groupe phényle substitué par un à trois substituants identiques ou différents choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome de fluor et les groupes -CF3 ou -OCF3 et, les groupes biphényle, pyrènyle, naphtyle, et phénanthrènyle, éventuellement substitués par un substituant choisi parmi - OCHs, l'atome de fluor, -CF3 ou -OCFs
pour obtenir un composé de formule III
Figure imgf000013_0002
(III)
dans laquelle
- Ri est choisi parmi :
- un groupe phényle substitué par un à trois substituants identiques ou différents choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome de fluor et les groupes -CF3 ou -OCF3 et, les groupes biphényle, pyrènyle, naphtyle, et phénanthrènyle,
- R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle, - Re est le groupe hydroxyle ou un chlore,
(ii) la réaction, éventuellement en présence d'au moins un agent de couplage, entre un composé de formule III obtenu à l'étape (i) et au moins un groupe aminé d'un composé à stabiliser pour obtenir un analogue dudit composé.
Le principe de la réaction CuAAC (Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition) est connu de l'homme du métier (Rostovstsev et al., Angew. Chem. Int. Ed.2002, 41(14), 2596-2599, Torn0e et al.,. J. Org. Chem. 2002, 67 (9), 3057-3064.)
Cette réaction est effectuée entre un précurseur portant la fonction alcyne et un précurseur portant la fonction azoture en présence d'un catalyseur. Elle permet de produire des l,2,3-triazoles-l-4- disubstitués à température ambiante tout en augmentant la cinétique de réaction.
Afin de réagir avec une aminé, le groupe hydroxyle d'un composé de formule (III) peut former un ester activé par réactions avec différents agents de couplage connus dans l'art antérieur ou être transformé en chlorure d'acyle. Toutes ces techniques sont connues de l'homme du métier.
La présente invention est illustrée plus en détail par les figures et les exemples ci-après.
Figures
Les figures 1A, 1B, 1C et 1D illustrent respectivement les résultats de HPLC analytique pour l'alaméthicine F50/5(figure 1A) et les analogues de l'alaméthicine F50/5, à savoir le composé 5 (figure 1B), le composé 6 (figure
1C), et le composé 7 (composé 1D).
Les figures 2A, 2B et 2C illustrent respectivement les spectres de
ESI-MS obtenus par LC-MS pour le composé 5 (figure 2A), le composé 6
(figure 2B), et le composé 7 (figure 2C).
La figure 3 montre les déplacements chimiques de résonnances de protons amides pour chaque acide aminé entre le composé 6 ou 7 et l'alaméthicine.
La figure 4 montre les spectres de dichroïsme circulaire de l'alaméthicine et des composés 6 et 7. Exemples
I. Matériels et méthode Abréviations:
DIC : Ν,Ν'-diisopropylcarbodiimide
Oxyma : Ethyl cyano(hydroxyimino)acétate, Ethyl cyanoglyoxylate- 2-oxime
DCM : Dichlorométhane
DMF : Ν,Ν'-diméthylformamide
MeOH : méthanol
cHex : Cyclohexane
DIEA : Diisopropyléthylamine
Ac20: Anhydride acétique
TFA: Acide trifluoroacétique
TIS: Triisopropylsilane
AF: Acide formique
ACN : Acétonitrile
HPLC: High-performance liquid chromatography (chromatographie en phase liquide à haute performance)
LC-MS: liquid chromatography mass spectrometry (chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse)
ELSD: evaporative light scattering detector (détecteur à diffusion de lumière)
SPPS: solid phase peptide synthesis (synthèse peptidique en phase solide)
1.1. LC-MS:
L'analyse est mise en œuvre par le système Thermo Fisher Scientific™ LC-MS Accela HPLC couplé à LCQ Fleet™ équipé d'une source d'ionisation par électronébulisation (ESI) et une trappe à ions en 3D. L'analyse est effectuée sur une colonne PhenomenexKinetex C-18 (100 x 300 mm) en utilisant un gradient constitué d'un tampon A (Solution aqueuse A comprenant 0,1 % de AF) et d'un tampon B (ACN comprenant 0,1 % de AF). L'élution est effectuée à un débit de 0,5mL/min avec 10% du tampon B jusqu'à 100% du tampon B en 30 min suivi d'un retour à 10% du tampon B en 7 min. Ces conditions standards sont appliquées à toutes les analyses LC- MS, sauf spécification contraire. 1.2. HPLC Analytique:
HPLC analytique est effectué par le système Waters® 2695 HPLC avec une colonne Vydac® 218MS 5 μΜ C- 18 (250 x 4,6 mm) de la société Grâce et un détecteur à diffusion de lumière. Les éluants utilisés sont le tampon A (0,1% de FA dans l'eau) et le tampon B (0,1% de FA dans MeOH).
1.3. Purification par HPLC semi-préparative:
La purification semi-préparative de peptides est effectuée par le système Waters® 1525 chromatographie équipé d'un détecteur d'absorbance Waters® 2487 pour une détection à 214 nm et à 254 nm. La purification est mise en œuvre en éluant le solvant A (d'eau) avec 0,1% de TFA et le solvant B (ACN) avec 0,1% de TFA sur une colonne Vydac® 218MS510 C-18 (250 x 10 mm 5um) de la société Grâce à un débit de 3mL/min. 1.4. Préparation de l'acide 2-azido-2-méthylpropanoïque (composé 1):
Le chlorhydrate d'azoture d'imidazole-l-sulfonyle (36mmol) est ajouté à l'acide α-aminoisobutyrique (Aib) (30mmol), K2CO3 (90mmol) et CUSO4.5H2O (0,3mmol) dans MeOH (300 ml). Le mélange est agité à température ambiante pendant 12H. Le mélange est concentré et ensuite dilué par l'éther diéthylique (100 mL) et extrait par NaHC03 saturé (3x 50 mL). La phase aqueuse restée est acidifiée à pH 1 par une solution HCI de 1M et est extraite trois fois par l'acétate d'éthyle (3 x 50 mL). L'extrait organique est lavé par une solution NaCI saturée (2 x 30 mL) et séché par MgS04, filtré et concentré sous une pression réduite pour obtenir un produit jaunâtre huileux. Ce produit est utilisé dans l'étape suivante sans purification supplémentaire.
Les résultats analytiques obtenus sont identiques à ceux décrits dans littérature (2,5g, 65%). Ή NMR (400 MHz, CDCIs) δ 1.53 (s, 6H).13C NMR (100 MHz, CDCIs) δ 178.8, 62.9, 24.3. 1.5. Préparation des composes 2, 3, 4
Le composé 2 (Ph< J[Tz]Aib-OH), le composé 3 (2,4-difluoro-
ΡηΨ[Τζ]Αϊ -ΟΗ) et le composé 4 (p-CF3-PhMJ[Tz]Aib-OH) sont synthétisés selon les étapes de réaction illustrées ci-après.
Figure imgf000017_0001
Dans la formule (Illa), soit R4 et Rs sont tous les deux l'atome d'hydrogène (composé 2); soit R4 et Rs sont tous les deux l'atome de fluor (composé 3) ; soit R4 est le groupe -CF3 et Rs est l'atome d'hydrogène.
Le compose 1 obtenu à l'étape 1.4. (1 mmol) et les alcynes respectifs ( 1 mmol) sont dissous dans l'acétonitrile dégazé ( 10 mL). La 2,6- lutidine (2 mmol) et la diisopropyléthylamine (2 mmol) sont ajoutés dans cette solution sous argon. L'iodure de cuivre (0, 1 mmol) est ensuite ajouté dans cette solution . La réaction est effectuée sous agitation sous argon pendant 6 h . Le mélange est dilué par EtOAc ( 150 mL) . La solution est lavée par un mélange de NH4CI saturé et de NH4OH avec une proportion de 9 : 1. La solution est ensuite lavée par 1 M de HCI (3x50mL), une solution de NaCI saturé (2x50mL) et séchée par MgS04 et filtrée. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié sur une colonne de chromatographie (50/50% cHex /EtOAc) .
Ph>4J[Tz]Aib-OH (composé 2) : un solide de couleur blanche de 1 ,88 g (70%) est obtenu en faisant réagir 1,5 g ( 11,6 mmol) du composé 1 avec 1, 18g ( 11,6 mmol) de phényléthyne. Rf0,5 (cHex /EtOAc/ AcOH 4,9 : 4,9 : 0.2 (v/v) . ). *H N M R (400 M Hz, DMSO-c/e) δ 8.79 (s, 1 H), 7,91 - 7,85 (m, 1 H), 7,45 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 7,33 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1,88 (s, 6H) . 13C NM R ( 100 M Hz, DMSO-c/e) δ 173,52, 146,31, 131,32, 129,38, 128,35, 125,50, 121,20, 64,55, 25,76. ESI-MS (C12H14N3O2) [M + H]+m/z obtenu : 232,0, calculé : 232,1).
2,4-difluoro-Ph< J[Tz]Aib-OH (composé 3) : un solide de couleur blanche de 2,5 g (80%) est obtenu par en en faisant réagir 1,5 g (11,6 mmol) du composé 1 et 1,6g (11,6 mmol) de l-éthynyl-2,4-difluorobenzene. Rf0,5 (cHex /EtOAc/AcOH 4,9 :4,9 : 0,2 (v/v).).
*H NMR (400 MHz, DMSO-c/e) δ 8,52 (s, 1H), 8,13 (td, J = 8,8, 6,8 Hz, 1H), 7,46 - 7,39 (m, 1H), 7,23 (td, J = 8,5, 2,7 Hz, 1H), 1,91 (s, 6H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-c/e) δ 173,38, 139,46, 129,40, 122,92, 115,88, 115,78, 112,94, 112,72, 105,16, 64,90, 25,76. ESI-MS (C12H 12F2N3O2) [M + H]+m/z obtenu : 268.0, calculé : 268.1. p-CF3-Ph< J[Tz]Aib-OH (composé 4) : un solide de couleur blanche de 2,5g (92%) est obtenu en faisant réagirl,5g (11,6 mmol) du composé 1 et 2,0g (11,6 mmol) de 4-éthynyl-a,a,a-trifluorotoluene. Rf0.5 (cHex /EtOAc/AcOH 4,9 :4,9 : 0,2 (v/v).).
*H NMR (400 MHz, DMSO-c/e) δ 8,99 (s, 1 H), 8,11 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,82 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 1,90 (s, 6H).13C NMR (100 MHz, DMSO-c/e) δ 172.62, 144,93, 135,29, 128,57, 126,53, 126,19, 123,53, 122,69 , 65,02 , 25,72. ESI-MS (C13H 13F3N3O2) [M + H]+m/z obtenu : 300.0, calculé : 300.1.
1.6. Préparation de l'alaméthicine F50/5 et ses analogues composés 5, 6 et 7 par SPPS:
La synthèse de peptide en phase solide (SPPS) est effectuée par un synthétiseur de peptides automatisé (CEM liberty one, Orsay, France) utilisant la chimie de Fmoc/O-tbutyl. Tous les acides aminés protégés par Fmoc, DIC, Oxyma, la résine chlorure de 2-chlorotrityle préchargée avec phénylalaninol (chargée 0,67 mmol/g ou 0,36mmol/g) proviennent de la société Iris Biotech (Germany). DCM, DMF, cHex, DIEA, AC2O, TFA, TIS, FA, CAN et la pipéridine pour la synthèse de peptides sont obtenus de Aldrich (USA). La synthèse de peptides en phase solide est mise en œuvre selon les méthodes connues (Ben Haj Salah et al ., Org. Lett. 2014, 16, 1783-1785).
L'alaméthicine F50/5 et ses analogues composés 5, 6 et 7 sont synthétisés par cette méthode. L'alméthicine F50/5 brute est purifiée par HPLC semi-préparative utilisant un gradient linéaire de 50% à 100% du tampon B dans le tampon A pendant 35 min avec un débit de 3 mL/min pour obtenir l'alaméthicine F50/5 purifiée (89 mg, 45% de rendement, >98% de pureté).
ESI-MS: C92H152N23024 [M + H + ]; calculé : 1963,1, obtenu :
1963,4.
Le composé 5 est un analogue de l'alaméthicine F 50/5 ayant la séquence ci-après: Ρ Ψ [Τζ]Α^ΡΓθΑ^Αΐ3Α^Αΐ36ΙηΑ^ν3ΐΑ^σΐγί£υΑ^ΡΓον3ΐΑ^Α^6Ιησΐ η ΡΓΐοΙ .
Le composé 5 brut est purifié par HPLC semi-préparative utilisant un gradient linéaire de 20% à 70% du tampon B dans le tampon A pendant 40 min avec un débit de 3 mL/min pour obtenir le composé 5 (89 mg, 43% de rendement, >98% de pureté). ESI-MS: CgsHissINhsNaChs [M + Na + ]; calculé : 2071,1, obtenu : 2071,6.
Le composé 6 répond à la formule (Ile) et est représenté par la séquence ci-après:
2,4-F,F- Ρ Ψ [Τζ]Α^ΡΓθΑ^Αΐ3Α^Αΐ36ΙηΑ^ν3ΐΑ^σΐγί£υΑ^ΡΓον3ΐΑ^Α^6Ιησΐ η ΡΓΐοΙ .
Le composé 6 brut est purifié par HPLC semi-préparative utilisant un gradient linéaire de 20% à 70% du tampon B dans le tampon A pendant 40 min avec un débit de 3 mL/min pour obtenir le composé 6 (85 mg, 42% de rendement, >98% de pureté).
ESI-MS: C98Hi5iF2N25Na023 [M + Na + ]; calculé : 2107,1, obtenu :
2107,7.
Le composé 7 répond à la formule (Ild) et est représenté par la séquence ci-après:
p-CFs-
Ρ Ψ [Τζ]Α^ΡΓθΑ^Αΐ3Α^Αΐ36ΙηΑ^ν3ΐΑ^σΐγί£υΑ^ΡΓον3ΐΑ^Α^6Ιησΐ η ΡΓΐοΙ .
Le composé 7 brut est purifié par HPLC semi-préparative en utilisant un gradient linéaire de 30% à 70% du tampon B dans le tampon A pendant 40 min avec un débit de 3 mL/min pour obtenir le composé 7 (86 mg, 40% de rendement, >98% de pureté). ESI-MS: C99Hi52F3N25Na023 [ M + Na + ]; calculé : 2139,1, obtenu :
2139,7.
L'alaméthicine et ses analogues 5, 6 et 7 sont tous analysés respectivement par HPLC analytique selon le protocole décrit dans la partie 1.2. en utilisant un gradient de 10% à 100% du tampon B avec un débit de 0,9 mL/min pendant 50 min.
1.7. Expérience de résonance magnétique nucléaire (RMN)
5 mM d'alaméthicine F50/5 et des composés 6 et 7 sont dissous dans CD3OH pour préparer les échantillons pour RMN. Tous les spectres sont enregistrés par un spectromètre RMN Bruker AVANCE III de 600 MHz équipé d'une sonde quadruple de résonance ^Η, 13C, 15N, 31P) de 5 mm. Les spectres 2-D homonucléaires DQF-COSY, TOCSY (DIPSI2) et ROESY sont enregistrés. Les spectres hétéronucléaires 15N, 13C-HSQC et 13C-HMBC sont obtenus pour fixer les déplacements chimiques. Les spectres sont traités par Topspin (Bruker Biospin) et visualisés par Topspin ou NMRView sur un poste Linux. Les déplacements chimiques sont référencés au tetramethylsilane (TMS). Les expériences de RMN sont effectuées selon le protocole décrit dans Ben Haj Slah et al. (Biopolymers. 2015 Mar 18. doi : 10.1002/bip.22641. [Epub ahead of print]).
1.8. Etudes par dichroïsme circulaire
Les spectres de dichroïsme circulaire sont mesurés selon le protocole décrit dans Biopolymers. 2015 Mar 18. doi : 10.1002/bip.22641. [Epub ahead of print]).
1.9. Tests biologiques
1.9.1. Test de cytotoxicité sur cellules KB.
Des cellules KB (carcinome épidermoïde oral humain ATCC CCL 17,
American Type Culture Collection, Rockville, MD) ont été cultivées dans BME (Basai Médium de Eagle) additionné de 5% (v / v) de sérum de veau fœtal, 1% (v / v) de la glutamine 200 mM et 1% (v / v) de la streptomycine (10 mg / mL) / de la pénicilline (10 000 U) (tous de Sigma-AIdrich). Les cellules ont été cultivées dans des flacons en plastique (Greiner Bio One, F- Courtaboeuf) à 37 °C dans une atmosphère enrichie à 5% de CO2. Après une période d'incubation de 48 h, les cellules trypsinisées ont été suspendues à 2xl05 cellules / mL en suspension dans du BME supplémenté puis 50 uL de cette suspension ont été déposés dans chaque puits d'une microplaque 96 puits, (Nunclon delta du sol, Thermo Scientific Nunc). Après une incubation de 48 h, 50 uL de chaque échantillon (l'alaméthicine F50/5, composés 5, 6 et 7) ont été ajoutés au 5 μΙ_ de suspension cellulaire initiale. Ces échantillons ont été testés à une teneur finale de 5% (v /v) de méthanol dans du BME supplémenté à des concentrations allant de 3 à 400 pg / mL. Une solution méthanoïque à 5% (v / v) dans le BME a été utilisée comme témoin. Après 76 h d'incubation, la viabilité cellulaire a été évaluée par le test colorimétrique MTT colorimétrique (3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5- diphényltétrazolium, Sigma-AIdrich). Tous les essais techniques et biologiques in vitro ont été réalisés trois fois.
1.9.2. Test antibactérien sur Bascillus subtilis et Staphylococus aureus
Un essai en milieu de culture par dilution successive a été effectuée pour comparer l'activité des analogues de l'alaméthicine, à savoir les composés 5, 6 et 7 à l'alaméthicine F50/5 en utilisant des concentrations de : 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.1, 1.5 pg/mL. Les souches bactériennes de Bacillus subtilis (CIP 103406) et Staphylococus aureus ont été cultivées et maintenues dans un milieu de culture LB et la gélose tryptique de soja à 28 °C. Une culture en phase exponentielle de croissance dans un milieu LB (après 6 h d'incubation dans un milieu frais) a été diluée à lxlO4 CFU / mL dans du milieu LB.
20 uL de solutions de peptaïbols à analyser dans du DMSO (20 mg / ml) ont été dilués avec 980 uL de milieu LB stérile. Ces solutions diluées (400 ug /mL) ont ensuite été diluées successivement par deux avec du milieu stérile LB à 2% DMSO (v/v) puis ajoutées dans les puits d'une microplaque à 96 puits contenant 100 pL de solution de Bacillus subtilis. Un contrôle positif a été réalisé avec une solution de milieu de culture contenant Bacillus subtilis complétée avec 1% de DMSO et un contrôle négatif avec le milieu de culture seul à 1% DMSO. Tous peptaïbols à analyser ont été testés trois fois. Microplaques ont été incubées à 28 °C sous agitation pendant une nuit. La densité optique (DO) a été lue à 600 nm et comparée au contrôle négatif utilisé en tant que blanc. Le pourcentage d'inhibition a été déterminé en utilisant la formule suivante: I = 1- (ODp / ODo), où ODp est la densité optique obtenue avec une solution de peptaïbols et ODo la densité optique du contrôle positif.
II. Résultats
2.1. Purification de l'alaméthicine F50/5 et des analogues 5, 6 et 7
L'alaméthicine F50/5 et les analogues 5, 6 et 7 sont respectivement analysés par HPLC analytique selon le protocole décrit dans la partie 1.2. ci- dessus. Les résultats montrent que ces composés synthétisés sont purifiés à un niveau satisfaisant par HPLC semi-préparative.
2.2. Etudes structurales des analogues 5, 6 et 7
Les composés 5, 6 et 7 sont analysés par LC-MS (figures 2A, 2B, 2C). Ces résultats confirment que ces analogues de l'alaméthicine sont purs et présentent la masse moléculaire attendue. L'étude par dichroïsme circulaire des composés 6 et 7 a été entreprise pour déterminer l'impact de la substitution à l'extrémité N-terminale du résidu Aib par 2,4-F,F-Ph< J[Tz]Aib ou p-CF3-Ph< J[Tz]Aib. Dans le méthanol, les composés 6 et 7 montrent un spectre équivalent à celui de l'alaméthicine native caractéristique d'une hélice alpha avec un maximum à 190 nm et deux minima à 208 et 222 nm (figure 4).
Les tableaux 2, 3, 4, 5, 6 et 7 ci-après montrent respectivement les déplacements chimiques de *H, 13C pour l'alaméthicine F50/5, le composé 6 et le composé 7.
Ces résultats confirment la structure secondaire hélicoïdale des composés 6 et 7.
Le tableau 8 montre les constants de couplage 3_7(HN,Ha) de l'alaméthicine, du composé 6 et du composé 7 dans Hz.
Par ailleurs, les déplacements chimiques de résonnances de protons amides entre chaque acide aminé du composé 6 ou 7 et celui de l'alaméthicine sont comparés (figure 3). Les analyses par H PLC révèlent que les composés 6 et 7 ont des temps de rétention similaires et qu'ils sont une fois et demi plus hydrophobes que l'alaméthicine. Ainsi l'introduction du groupement phényltriazole ne modifie que légèrement la polarité de ces analogues par comparaison avec l'alaméthicine.
2.3. Analyse des propriétés biologiques des composés 6 et 7
Les composés 6 et 7 ont ensuite été testés sur les cellules KB et sur deux lignées de bactéries à gram positif, à savoir Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus. Le composé 5 portant uniquement sur le noyau triazole un groupement phényle est analysé en tant que témoin négatif. Il présente une CIso comparable à celle de l'alaméthicine. En revanche, l'introduction de groupement(s) fluoré(s) sur le noyau phényle s'accompagne d'un gain d'efficacité d'un facteur 7 pour la valeur CIso d u composé 7 vis-à-vis de Bacillus subtilis et d'un facteur 4,5 pour la valeur CIso du composé 6 vis-à-vis de cette bactérie (Tableau 1) .
Les résultats du tableau ci-après montrent que les composés 6 et 7 permettent d'améliorer significativement les propriétés biologiques de l'alaméthicine. Cette amélioration est liée à l'augmentation de l'intégration de peptide dans la membrane cellulaire.
Tableau 1 : Résultats des tests des composés 5, 6 et 7 sur la croissance cellulaire des cellules KB et de deux bactéries à gram positif.
Figure imgf000023_0001
2.4. Analyse de nouveaux composés de l'invention
Les composés de l'invention listés dans le tableau 9 ci-après sont synthétisés selon la méthode décrite dans la demande et analysés par LC- MS selon le protocole décrit dans la partie 1.1. ci-dessus. Les résultats de LC-MS confirment que ces analogues sont purs et présentent la masse moléculaire attendue. Les composés listés dans le tableau 9 ci-après sont testés sur Bacillus subtilis. La valeur MIC (minimum inhibitory concentration) respective de ces composés vis-à-vis de cette bactérie se trouve également dans le tableau 9.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Tableau 9
Tableau 2: Déplacements chimiques de ^ pour l'alaméthicine dans CD3OH à 298K
Résidus HN Ha Ηβ Ηγ Autre
Ac - - - - CH32,05
Aib 1 8,59 - 1,46 ; 1,54
Pro2 - 4,25 1,78 ; 2,34 1,96 ; 2,08 Ηδ 3,49 ; 3,94
Aib 3 7,62 - 1,53
Ala4 7,56 4,09 1,49
Aib 5 7,92 1,55
Ala6 7,89 4,02 1,53
Gin 7 7,99 3,92 2,14; 2,28 2,34; 2,53 NH26,74; 7,41
Aib 8 8,06 1,51; 1,58
Val 9 7,48 3,59 2,23 1,00; 1,12
Aib 10 8,20 1,55
Gly 11 8,32 3,67; 3,94
Leu 12 8,08 4,46 1,58; 1,94 1,92 Ηδ 0,92
Aib 13 8,38 1,54; 1,61
Pro 14 - 4,38 1,81; 2,32 1,99; 2,07 Ηδ3,73; 3,87
Val 15 7,63 3,73 2,33 0,98; 1,06
Aib 16 7,59 - 1,54
Aib 17 7,80 - 1,54
Gin 18 7,78 4,02 2,25 2,42; 2,61 NH26,75; 7,41
Gin 19 7,86 4,16 2,02 2,19; 2,33 NH26,59 ; 7,31
Pho 20 7,30 4,15 2,73 ; 2,93 CH23,61 ; OH 7,42
Tableau 3: Déplacements chimiques de 13C pour l'alaméthicine dans CD3OH à 298K
Résidus N Ca Autre
Ac CH321,0; CO 171,1 Aib 1 137,1 56,0 22.5 ; 25,2 CO 174,2
Pro2 64,4 28,4 25,7 C548,6; CO 174,2 Aib 3 124,4 56,0 21,8 ; 25,8 CO 177,2
Ala4 117,2 52,7 15,7 CO 175,9
Aib 5 127,6 55,9 21.6 ; 25,6 CO 176,6
Ala6 115,3 52,5 15,7 CO 176,7
Gin 7 115,3? 56,8 25,9 31,2 NH2106,1; CO(l) 176,0; CO 174,5 Aib 8 127,6 56,2 21,7; 25,9 CO 176,9
18,2,
Val 9 113,7 64,4 29,2 CO 174,0
19,5
Aib 10 129,7 56,2 21,7; 25,5 CO 177,7
Gly 11 100,1 43,7 CO 171,7
Leu 12 117,7 52,7 40,2 24,3 C519,9; 22,0
Aib 13 132,9 56,7 21,8; 25,2 CO 174,5
Pro 14 63,3 28,7 25,7 C549,2; CO 175,1
18,0,
Val 15 115,3 62,9 29,1 CO 174,1
18,8
Aib 16 129,1 56,1 21,8; 25,9 CO 176,4
Aib 17 124,1 56,2 21,8; 26,0 CO 177,5
Gin 18 113,2 55,6 26,7 31,9 NH2106,1; CO 174,4 Gin 19 115,2 54,4 26,7 31,6 NH2105,8 ; CO 172,7 Pho 20 119,2 53,1 36,7 CH263,4
Tableau 4: Déplacements chimiques de ^ pour le composé 6 dans CD3OH à 298K
Résidus HN Ha Ηβ Ηγ autre
SD12 CHtrazole 8,85 Aib 1 1,98; 2,08
Pro2 4,45 1,88; 2,27 1,88 Ηδ2,62; 3,26 Aib 3 7,98 1,58
Ala4 7,61 4,12 1,49
Aib 5 7,76 1,54
Ala6 7,76 4,05 1,52
Gin 7 7,98 3,95 2,25; 2,14 2,34; 2,49 NH26,75; 7,43 Aib 8 7,96 1,58
Val 9 7,43 3,62 2,25 1,01; 1,13
Aib 10 8,15 1,56
3,66,
Gly 11 8,31
3,94
Leu 12 8,08 4,46 1,59 1,94 1,60 Ηδ 0,93 Aib 13 8,35 1,54 1,61
Pro 14 4,38 1,81 2,32 1,98; 2,07 Ηδ3,73; 3,88 Val 15 7,64 3,74 2,33 0,98; 1,07
Aib 16 7,60 - 1,51
Aib 17 7,80 - 1,54
Gin 18 7,78 4,02 2,25 2,43; 2,65 NH26,75; 7,43 Gin 19 7,88 4,18 2,02 2,19; 2,32 NH26,60 ; 7,32 Pho 20 7,31 4,15 2,73; 2,93 CH23,61;
„0
Tableau 5: Déplacements chimiques de 13C pour le composé 6 dans CD3OH à 298K
Résidus N Ca Autre
SD12 - - - - Ctrazole 121,3
Aib 1 - 22,9 ; 27,6 CO 173,4
Pro2 - 64,0 27,8 25,3 C547,2; CO 173,4
Aib 3 127,4 52,4 22,1; 25,9 CO 176,3
Ala4 116,5 52,5 15,7 CO 175,5
Aib 5 127,5 56,0 21,7; 25,7 CO 176,5
Ala6 115,2 52,4 15,7 CO 173,4
Gin 7 116,6 56,6 25,9 31,3 NH2106,0; CO(l) 176,0; CO 174,3
Aib 8 127,4 56,1 21,7; 25,9 CO 176,8
18,2;
Val 9 113,6 64,2 29,3 CO 173,9
19,4
Aib 10 129,7 56,2 21,7; 25,5 CO 177,7
Gly 11 100,0 43,7 CO 171,4
Leu 12 117,9 52,6 40,3 24,3 C519,9, 22,2; CO 173,7
Aib 13 132,8 56,7 21,8; 25,2 CO 174,5
Pro 14 63,3 28,7 25,7 C549,2; CO 175,2
18,0;
Val 15 115,2 62,9 29,2 CO 174,1
18,8
Aib 16 129,1 56,1 21,8; 25,9 CO 176,3
Aib 17 124,3 56,3 21,8; 26,0 CO 177,4
Gin 18 113,3 55,6 26,7 31,9 NH2106,0; CO 174,2
Gin 19 115,3 54,3 26,8 31,6 NH2106,0; CO 172,7
Pho 20 119,4 53,2 36,8 CH263,5
Tableau 6: Déplacements chimiques de ^ pour le composé 7 dans CD3OH à 29E
Résidus HN Ha Ηβ Ηγ Autre
SD13 - - - - CHtrazole 8,51
Aib 1 - - 1,91; 2,08
Pro2 - 4,44 2,27 1,88 Ηδ2,58, 3,26
Aib 3 7,99 - 1,60
Ala4 7,64 1,48
Aib 5 7,72 - 1,53
Ala6 7,74 4,06 1,53
2,14,
Gin 7 7,98 2,35;2,49 NH26,75; 7,43
2,26
Aib 8 7,96 1,58
Val 9 7,42 3,61 2,24 1,01; 1,13
Aib 10 8,15 1,55
3,66,
Gly 11 8,31
3,94
Leu 12 8,07 4,45 1,59; 1,94 1,59 Ηδ 0,94
1,54,
Aib 13 8,36
1,62
Pro 14 4,39 1,81; 2,32 1,99; 2,06 Ηδ3,73; 3,87
Val 15 7,63 3,73 2,34 0,98, 1,07
Aib 16 7,59 - 1,54
Aib 17 7,80 - 1,54
Gin 18 7,78 4,02 2,25 2,43; 2,62 NH26,75; 7,43
Gin 19 7,87 4,17 2,02 2,20; 2,33 NH26,60 ; 7,32
Pho 20 7,31 4,15 2,73; 2,94 CH23,61
_
Tableau 7: Déplacements chimiques de 13C pour le composé 7 dans CD3OH à 298 K
Résidus N Ca Autre
SD13 - - - -
Aib 1 - - 22,8; 27,6 CO
Pro2 - 63,9 27,7 25,4 C547,2; CO 173,2
Aib 3 129,9 57,7 22,1; 25,9 CO 176,2
Ala4 116,4 52,6 15,7 CO 176,5
Aib 5 127,4 56,0 21,7; 25,7 CO 176,5
Ala6 115,2 52,4 15,7 CO 173,4
Gin 7 116,5 56,7 25,9 31,3 NH2106,0; CO(l) 176,0; CO 174,3
Aib 8 127,2 56,1 21,7; 25,9 CO 176,8
Val 9 113,5 64,2 29,2 18,3; 19,4 CO 173,9
Aib 10 129,8 56,2 21,7; 25,5 CO 177,7
Gly 11 99,8 43,7 CO 171,4
Leu 12 117,8 52,6 40,2 24,3 C519,9, 22,0 CO 173,7
Aib 13 132,9 56,7 21,8; 25,2 CO 174,5
Pro 14 - 63,3 28,7 25,7 C549,2; CO 175,2
Val 15 115,2 63,0 29,2 18,1; 18,9 CO 174,1
Aib 16 129,2 56,1 21,8; 25,9 CO 176,3
Aib 17 124,3 56,3 21,8; 26,0 CO 177,4
Gin 18 113,2 55,6 26,7 31,9 NH2106,0; CO 174,2
Gin 19 115,2 54,3 26,7 31,6 NH2106,0; CO 172,7
Pho 20 119,2 53,1 36,7 CH263,5
Tableau 8 : Constantes de couplage 3J(HN,Ha) de l'alaméthicine, du composé 6 et du composé 7 dans Hz (o: chevauchement)
Résidus Alaméthicine 6 7
Ala4 5,6 5,0 5,3
Ala6 4,4 4,2 3,8
Gin 7 4,9 5,3 o
Val 9 5,4 o 5,4
Leu 12 7,7 7,8 7,7
Val 15 7,9 8,0 7,6
Gin 18 5,5 5,7 5,4
Gin 19 7,2 7,3 7,2
Pho 20 9,1 9,0 9,0

Claims

REVEN DICATIONS
1. Méthode pour améliorer la stabilité d'un composé portant au moins une fonction aminé et sa capacité à traverser les membranes cellulaires, ladite méthode consistant à fixer sur au moins une fonction aminé dudit composé, un motif de formule (I) :
Figure imgf000032_0001
(I),
dans laquelle :
- Ri est choisi parmi :
- un groupe phényle substitué par un à trois substituants identiques ou différents choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome de fluor et les groupes -CF3 ou -OCF3 et les groupes biphényle, pyrènyle, naphtyle, et phénanthrènyle, éventuellement substitués par un substituant choisi parmi - OCHs, l'atome de fluor, -CF3 ou -OCFs,
- R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle Ri est choisi parmi les groupes :
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0002
Figure imgf000033_0003
ou à la formule (Ib)
Figure imgf000034_0001
(Ib)
dans lesquelles R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle ledit composé portant au moins une fonction aminé est choisi parmi un peptide, un pseudopeptide ou un composé à activité thérapeutique portant au moins une fonction aminé,
ledit motif étant fixé sur :
- au moins une fonction aminé dudit composé à activité thérapeutique ou dudit pseudopeptide, ou
- sur la fonction aminé de l'acide aminé à l'extrémité N-terminale dudit peptide ou, lorsque ledit peptide comporte au moins une lysine, sur une fonction aminé de la chaîne latérale de ladite au moins une lysine.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour améliorer la stabilité d'un peptide et sa capacité à traverser la membrane cellulaire, caractérisée en ce que le motif de formule I ou de formule (la) ou (Ib) est fixé à la fonction aminé de l'acide aminé placé à l'extrémité N-terminale ou, lorsque ledit peptide comporte au moins une lysine, à la fonction aminé de la chaîne latérale de ladite au moins une lysine.
6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle ledit motif remplace l'acide aminé en position N-terminale.
7. Analogue d'un composé portant au moins une fonction aminé, notamment d'un peptide, d'un pseudopeptide ou d'un composé à activité thérapeutique portant au moins une fonction aminé, ledit analogue comportant au moins un motif de formule I :
Figure imgf000035_0001
identiques ou différents choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome de fluor et les groupes -CF3 ou -OCF3 et, les groupes biphényle, pyrènyle, naphtyle, et phénanthrènyle, éventuellement substitués par un substituant choisi parmi - OCHs, l'atome de fluor, -CF3 ou -OCFs
- R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle,
ledit motif étant fixé sur au moins une fonction aminé dudit composé, notamment, ledit motif étant fixé sur :
- au moins une fonction aminé dudit composé à activité thérapeutique ou dudit pseudopeptide, ou
- sur la fonction aminé de l'acide aminé à l'extrémité N-terminale dudit peptide ou, lorsque ledit peptide comporte au moins une lysine, sur une fonction aminé de la chaîne latérale de ladite au moins une lysine.
8. Analogue selon la revendication 7 d'un peptide, représenté par la formule II
Figure imgf000035_0002
(Π)
dans laquelle les substituants Ri, R2, et R3 sont respectivement définis tels que la revendication 7.
9. Analogue selon la revendication 8 caractérisé en ce que le peptide est un peptaïbol .
10. Analogue selon la revendication 9 caractérisé en ce que le peptaïbol est une alaméthicine.
11. Analogue de l'alaméthicine selon la revendication 10, répondant à la formule (Ha)
Figure imgf000036_0001
(iib)
dans lesquelles :
- R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi un hydrogène et un méthyle, et
- Pepl est le peptide de séquence SEQ ID NO : 3 PUAUAQUVUGLUPVUUEQFol ou le peptide de séquence SEQ ID NO : 4 PUAUAQUVUGLUPVUUQQFol.
12. Méthode de préparation d'un analogue d'un composé portant au moins une fonction aminé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, comprenant :
(i) la formation par une réaction de cycloaddition azide-alcyne catalysée par du cuivre entre un composé de formule A
Figure imgf000037_0001
(A)
dans laquelle R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle,
et un composé de formule B
R1— ΪΞΞΞΞΞ (B)
- dans laquelle Ri est choisi parmi :
- un groupe phényle substitué par un à trois substituants identiques ou différents choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome de fluor et les groupes -CF3 ou -OCF3 et, les groupes biphényle, pyrènyle, naphtyle, et phénanthrènyle, pour obtenir un composé de formule III
Figure imgf000037_0002
(III)
dans laquelle
- Ri est choisi parmi :
- un groupe phényle substitué par un à trois substituants identiques ou différents choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome de fluor et les groupes -CF3 ou -OCF3 et, les groupes biphényle, pyrènyle, naphtyle, et phénanthrènyle, éventuellement substitués par un substituant choisi parmi - OCHs, l'atome de fluor, -CF3 ou -OCFs,
- R2 et R3 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi l'atome d'hydrogène et les groupes (C1-C4) alkyle, notamment un groupe méthyle, - Re est le groupe hydroxyle ou un chlore,
(ii) la réaction, éventuellement en présence d'au moins un agent couplage, entre un composé de formule III obtenue dans l'étape (i) et fonction aminé dudit composé pour obtenir un analogue dudit composé.
PCT/EP2016/073002 2015-09-28 2016-09-27 Méthode pour améliorer la capacité d'un composé à traverser les membranes WO2017055286A1 (fr)

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