WO2001055294A1 - Dispositif, auxiliaire, et procede de transfert moleculaire - Google Patents

Dispositif, auxiliaire, et procede de transfert moleculaire Download PDF

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WO2001055294A1
WO2001055294A1 PCT/JP2001/000565 JP0100565W WO0155294A1 WO 2001055294 A1 WO2001055294 A1 WO 2001055294A1 JP 0100565 W JP0100565 W JP 0100565W WO 0155294 A1 WO0155294 A1 WO 0155294A1
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molecule
voltage
cell
cells
molecules
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PCT/JP2001/000565
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshitaka Sakamoto
Masafumi Koide
Juichiro Nakashima
Susumu Satoh
Sousuke Miyoshi
Akiko Suzuki
Hiroyuki Arakawa
Hiroshi Marusawa
Original Assignee
The Mollennium Laboratories
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Publication date
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Priority to AU2001228841A priority patent/AU2001228841A1/en
Priority to EP01946884A priority patent/EP1254951B1/en
Priority to US10/182,262 priority patent/US7341864B2/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion

Definitions

  • the present invention relates to a molecule introduction device for introducing molecules such as genes into cells in the fields of medicine, biology, and the like, an auxiliary tool for the molecule introduction device, and a molecule introduction method.
  • gene transfer methods include a liposome method, a virus method, a calcium phosphate method, a direct injection method such as a gene gun, and an electroporation method, which is an electroporation method.
  • a rectangular DC pulse or exponential decay pulse is used.
  • the liposome method, the virus method, the calcium phosphate method, the gene gun method, and the electrophoresis method as the conventional gene transfer methods described above cannot be said to produce harmless and stable gene transfer in living organisms. There was a problem.
  • a rectangular DC pulse or an exponential decay pulse is used, so that damage to tissue cells during gene transfer is inevitable.
  • the molecule introduction device disclosed in the above-mentioned Japanese Patent No. 27399778 A method in which an RF high-frequency current pulse is applied to a solution.
  • the current (number of electrons) flowing into the solution becomes large, and cell damage occurs.
  • the electric power is reduced, the ability of molecules such as cells to vibrate is reduced.
  • the present invention has been made in view of the above points, and is useful in animals, plants, and other organisms without any damage to living organisms, cultured tissue-adherent cells, and suspended cells, and reliably ensures that genes and other molecules are present. Is introduced into cells to bring about expression of a protein or activity. Disclosure of the invention
  • a kinetic energy larger than a binding energy between molecules is imparted to a molecule to be introduced into a cell.
  • molecules can be safely introduced into cells without forming perforations or the like in the cells.
  • the inventors of the present application have made long-term studies on how to impart large kinetic energy to molecules, and have found the following means.
  • the present invention targets an internal tissue or cell to form an electrical, magnetic or sonic field. Then, it excites the resonance motion of the molecule and the repetitive depolarization of the reversible polarity reversal of the cell membrane, thereby allowing the molecule to pass through the membrane inside and outside the cell. In other words, if the negatively charged cell membrane reverses its polarity, the mutual repulsion with the similarly negatively charged molecule disappears and the molecules attract each other. As a result, transfer of molecules such as genes into cells is induced.
  • only a single spike may be discharged, and only the first leg of the ascending leg and the descending leg of the spike need to cause only one vibration.
  • All subsequent oscillations are sympathetic phenomena of resonant circuits, including biological systems. Therefore, all oscillating reactions are secondary phenomena associated with a single excitation, and the output of an oscillating wave (high frequency) is not necessarily required.
  • the mechanism by which the introduced molecule moves into the cell is as follows. Regardless of the instantaneous excitation at any high voltage, all molecular species have different natural vibration characteristics defined by molecular weight, chargeability and charged site or three-dimensional structure.
  • the electrical damping oscillation following the instantaneous stimulation is observed as the sum of the resonance motion of the electrons and molecules contained in the introduction device and the in vivo circuit, and reflects the event that the molecule enters the cell. is there.
  • a pebble is dropped on a still water surface to obtain the vibration of the liquid surface
  • the high frequency method is equivalent to vibrating the water surface by completely removing the liquid.
  • any liquid will have a vibration mode appropriate to its capacity and its own physical properties.
  • the liquid is separated, large vibrations cannot be obtained because the separation itself gives an inappropriate fluctuation to the liquid surface.
  • dropping pebbles will result in less energy loss than oar means.
  • the method of the present invention hits the tuning fork to obtain a resonance sound, whereas in the case of high-frequency stimulation, the tuning fork is finely shaken. Obviously, the tuning of the tuning fork gives a better resonance.
  • the first to seventeenth inventions are related to a molecule introduction device, and the first invention is an electric field, a magnetic field, or a sonic The field is formed so that the molecule can pass through the membrane into the cell.
  • the second invention forms an electric field, a magnetic field, or a sonic field by a high-voltage of instantaneous targeting a living tissue or a cell, and excites a free resonance circuit including the living tissue or the cell.
  • a sympathetic movement between the constituent molecules of the cell and the molecule to be introduced is caused to introduce the molecule into the cell.
  • the third invention is a voltage generating means for generating a voltage, and a voltage generated by the voltage generating means to generate an electric field at a predetermined site in a body, and a molecule disposed outside a living tissue or a cell.
  • a voltage applying means having a high impedance for introducing the DNA into the cells.
  • the voltage applying means constitutes a free resonance circuit including a predetermined site in the body.
  • the voltage applying means is configured such that the electrode generates an electric field around a living tissue or a cell in a body through a highly insulating portion. .
  • the voltage generation means includes: a power supply means for supplying power; a booster for supplying a high voltage to the voltage application means by supplying power from the power supply means.
  • the power supply means includes a power supply, and a power adjustment circuit that receives power from the power supply and outputs control power.
  • the power adjustment circuit supplies predetermined power to the boosting means and the switching control means, and controls the supplied voltage or current to be fixed or variable. It is composed.
  • a molecule introduction device characterized by the above-mentioned.
  • the boosting means includes a low-voltage part driven by the opening and closing means, and a high-pressure part constituting a part of the voltage applying means. It is configured to boost the voltage to a predetermined voltage based on a boost ratio set in advance with the high voltage unit.
  • the opening / closing control means outputs a variable frequency control signal to control the driving of the opening / closing means.
  • the opening / closing means is an opening / closing control means.
  • the power supply to the booster is connected and disconnected based on the control signal of the stage.
  • the voltage applying means includes a plurality of electrodes and a high insulation portion, and the electrodes apply an electric field to the living tissue or cells in the body via the high insulation portion. It is configured to be generated around.
  • the boosting means is a transformer or a piezoelectric element that generates a high voltage based on a piezoelectric effect.
  • the voltage applying means is configured to have a variable capacitance structure or a variable reactance structure that actively varies the resonance characteristic by the distributed capacitance.
  • the voltage applying means includes a spark gap or a discharge tube in series or parallel with the boosting means.
  • the high insulation portion of the voltage applying means is a high insulation shield disposed close to the electrode or a high insulation coating covering the electrode. It has a certain configuration.
  • the electrode is made of a conductive material containing a metal, a ceramic, or an organic material.
  • an eighteenth invention is based on the first invention, wherein the opening / closing control means is configured to be capable of outputting a single-phase AC, a three-phase AC, a multiphase AC, a plurality of frequencies or a composite waveform. It is.
  • the boosting means is configured to be capable of outputting a positive voltage side burst or a negative voltage side burst or a combination of both bursts, and a plurality of the boosting means are provided, and a potential difference between a plurality of electrodes is provided. It is configured to cause
  • the nineteenth to thirtieth inventions are related to a method for introducing a molecule, and the nineteenth invention is directed to a living tissue or a cell by applying a voltage to an electric field, a magnetic field or a magnetic field. After the sonic field is formed, the molecules are passed through the membrane into the cells.
  • the twenty-first invention provides a free resonance circuit that forms an electric field, a magnetic field, or a sonic field by a high-voltage instantaneously targeting a living tissue or cell, and includes a living tissue or cell.
  • a free resonance circuit that forms an electric field, a magnetic field, or a sonic field by a high-voltage instantaneously targeting a living tissue or cell, and includes a living tissue or cell.
  • a high voltage is repeatedly applied to the surrounding of the living tissue or cell, and a small current and a high voltage are applied. It is configured to introduce molecules into cells under the environment.
  • a high voltage is repeatedly applied around the living tissue or the cell, and a small current and a high voltage are applied.
  • a free resonance circuit including a predetermined portion of a living tissue or a cell is formed, and a molecule is introduced into the cell.
  • a high voltage is repeatedly applied from the electrodes to the surroundings of the living tissue or cells via the high insulating portion.
  • a free resonance circuit including a predetermined part of a living tissue or a cell is formed under an environment of a small current and a high voltage, and a molecule is introduced into the cell.
  • a twenty-fourth invention is the invention according to the twenty-second or twenty-third invention, wherein the low-current and high-voltage environment comprises: a power supply means for supplying power; and a high-voltage environment supplied with power from the power supply means.
  • Switching means for disconnecting and supplying power from the power supply means to the boosting means to generate a high voltage in the boosting means; switching control means for controlling connection and disconnection of the switching means;
  • Molecular introduction comprising a voltage application means for receiving a high voltage generated by the boosting means, generating an electric field at a predetermined site in the body, and introducing molecules arranged outside the living tissue or cells into the cells. It is constituted by a device.
  • a twenty-fifth invention is configured such that, in any one of the nineteenth to twenty-third inventions, the molecule is a low molecular compound or a cell molecule containing a polynucleotide, a protein, a virus, or various drugs. .
  • a twenty-sixth invention is the invention according to any one of the nineteenth to twenty-third inventions, wherein the living tissue is an animal or plant tissue, and the cell is an animal, plant or microorganism cell, or an animal or plant. Alternatively, it is configured to be a cell cloned from a microorganism.
  • a twenty-seventh invention is based on the twenty-fourth invention, wherein the molecules pass through the membrane. It is adjusted by the applied voltage, resonance constant or fluctuation of the electrode position.
  • a twenty-eighth invention is the invention according to any one of the ninth to twenty-third inventions, wherein the molecule is a surfactant such as saponin, digitonin, dimethyl sulfoxide, ionophore, lipid, or ceramic. , Albumin, glycerin, gelatin or serum, or a solution containing molecules that control osmotic pressure or ion balance inside and outside cells.
  • the twentieth invention is the invention according to any one of the ninth to twenty-third inventions, wherein the molecule is developed into an ointment, a cream, a gel-like base material or an aqueous solution for injection, and is applied to a body surface. It is configured to be attached to the surface or injected into the body.
  • the molecule is developed in a cell culture solution or polyethylene glycol and permeated into a cell.
  • the thirty-first and thirty-second inventions are inventions relating to an auxiliary tool for the above-described molecule introduction device, and the thirty-first invention is a container body having predetermined dielectric properties, and at least a part of the container body. And a concave portion that is formed at the center and concentrates the electric field.
  • a thirty-second invention is an auxiliary tool arranged at a predetermined part of a living body, wherein the auxiliary part is formed so that an electric field is concentrated at a predetermined part in the body. That is, in general, a molecular transduction apparatus, particularly, a gene transfection apparatus based on the electric transfection method is required not to damage target tissues or cells. If the gene transfer device causes cell destruction, the eligibility of the device itself is compromised. The cause of cell destruction is often excessive power supply to target cells. Therefore, it is imperative that the gene transfer device avoid cell destruction by quickly neutralizing the saturation storage power before cell destruction.
  • a desired gene is previously introduced into a predetermined site in the body by injection or the like. Then, a sufficiently boosted voltage is repeatedly and intermittently applied from the high-impedance high-voltage power supply to the predetermined portion.
  • an instantaneous high voltage that is a single pulse is generated intermittently.
  • This The application of the instantaneous high voltage excites the electric free resonance circuit formed by the device itself and the living body.
  • the constituents of the resonance circuit and the electrons and charged molecules cause damped oscillation.
  • the electrode is disposed in a non-contact state with a living tissue or a cell and a molecule such as an outer gene via a high insulator.
  • a voltage is applied to the molecules and the like between the electrodes.
  • the surrounding cell tissue and the introduced gene are also incorporated into the free resonance circuit of the surrounding cells, and exhibit the unique resonance characteristics of each molecule to vibrate freely.
  • Genes distributed in the vicinity of the cell membrane are in the direction of the reverse electric field when the same instantaneous electric field as the electric charge that they are charged is applied, and in the forward electric field side when the reverse electric field is applied at the next instant.
  • an accelerated relative movement occurs between the gene and the molecule of the cell membrane, and the gene transits through the membrane. Brought.
  • the introduced molecules can avalanche pass through the cell membrane or cell wall due to a pobbing phenomenon in which electron resonance interaction in a high electric field environment excites peripheral molecules at an accelerated rate.
  • a DC pulse was conventionally supplied in a solution, and a gene was introduced while a current was flowing.
  • the present invention uses a high-impedance high-voltage power supply and a high-insulation electrode, although a high electric field is generated, so that almost current flows through living tissues or cells to be introduced, thereby ensuring safety.
  • the current was shifted by forming a magnetic field, and electron spin was generated.
  • the resonance of molecules such as genes may be controlled.
  • the double helix structure of DNA can be relaxed to introduce genes such as genes into cells.
  • molecules such as genes it becomes possible to incorporate molecules such as genes into the genome.
  • the present invention is not limited to free resonance, and various periodic vibrations such as Fourier waveform synthesis may be applied. In this case, resonance of various tissue cells can be caused.
  • the introduction probability of a gene into a cell is drastically improved compared with the conventional method of applying only a direct current
  • the electrodes and the molecules are in a non-contact state, a wide range of applications can be realized.
  • the power adjusting circuit since the power adjusting circuit is provided, it is possible to generate an instantaneous voltage or the like appropriate for a molecule to be introduced. As a result, it is possible to ensure that the molecules pass through the membrane.
  • the power adjustment circuit controls the current or the voltage, it is possible to more accurately generate an instantaneous voltage or the like appropriate for a molecule to be introduced.
  • the opening / closing control means outputs a control signal with a variable frequency, it is possible to adjust the voltage application cycle to match the molecules to be introduced.
  • the voltage applying means is configured to have a variable capacitance structure or a variable reactance structure, it is possible to generate a resonance circuit that matches the molecules to be introduced.
  • the voltage applying means includes the spark gap or the discharge tube, a stable instantaneous voltage or the like can be generated.
  • the electric field vector can be concentrated at a predetermined position, the molecules can be more reliably introduced.
  • FIG. 1 is an electric circuit diagram showing a molecule introduction device.
  • FIG. 2 is a state diagram schematically showing the passage of a gene through a cell membrane.
  • FIG. 3 is a waveform diagram showing an excitation waveform of the step-up transformer.
  • FIG. 4 is a waveform diagram of an instantaneous voltage and an attenuated voltage generated on the secondary winding of the step-up transformer.
  • FIG. 5 is a voltage waveform diagram showing the time of cell resonance.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view illustrating the electrode probe according to the second embodiment.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view illustrating an electrode probe according to the third embodiment.
  • FIG. 8 is an electric circuit diagram showing the molecule introduction device according to the fourth embodiment.
  • FIG. 9 is an electric circuit diagram showing a molecule introduction device according to the fifth embodiment.
  • FIG. 10 is an arrangement diagram showing the arrangement of the electrode probes of the fifth embodiment.
  • FIG. 11 is a perspective view showing a container used in the molecule introduction device according to the sixth embodiment.
  • FIG. 12 is a cross-sectional view taken along the line IX-X of FIG. 1 showing a modified example of the concave portion in the container of the sixth embodiment.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view taken along the line IX-X of FIG. 1 showing another modified example of the concave portion in the container of the sixth embodiment.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view taken along the line XX of FIG. 11 showing another modified example of the concave portion in the container of the sixth embodiment.
  • FIG. 15 is a diagram showing an auxiliary tool used for the molecule introduction device according to the seventh embodiment.
  • FIG. 16 is a cross-sectional view showing an auxiliary tool used for the molecule introduction device according to the eighth embodiment.
  • FIG. 17 is a perspective view showing an auxiliary tool according to the eighth embodiment.
  • FIG. 18 is a photomicrograph of chicken thigh muscle showing Example 4 in Embodiment 1.
  • FIG. 19 shows the test results of Example 1 in Embodiment 1, and the present molecule introduction device
  • FIG. 3 is an absorption diagram of a use group (GCS) to which is applied.
  • GCS use group
  • FIG. 20 shows the test results of Example 1 in Embodiment 1, and is an absorption diagram of an unused group (CTL) to which the present molecule introduction device is not applied.
  • CTL unused group
  • a molecule introduction device 1 of the present embodiment is a gene introduction device that introduces a gene that is a molecule into cells in a body, and includes a voltage generation unit 11 and a voltage application unit 12. ing. As shown in FIG. 2, this molecule introduction device 1 is based on the premise that the gene 2 to be introduced is present in a living body in advance by injection or the like.
  • the voltage generating means 11 includes a power supply circuit 20 as a power supply means, a step-up transformer 30 as a step-up means and a transformer, a switching transistor 22 as an opening / closing means, A signal control circuit 40 as control means.
  • the power supply circuit 20 includes a DC power supply 21, and both ends of the power supply 21 are connected to both ends of the primary winding 31 of the step-up transformer 30.
  • the power supply circuit 20 is configured to supply constant DC power from the power supply 21 to the step-up transformer 30.
  • the switching transistor 22 is configured to supply and cut off power from the power supply circuit 20 to the primary winding 31 of the step-up transformer 30. That is, the switching transistor 22 disconnects and supplies power to the step-up transformer 30.
  • the switching transistor 22 is connected between the negative side of the power supply 21 and the primary winding 31 of the step-up transformer 30, and the collector is connected to the primary winding 31 of the step-up transformer 30. , Emmits are grounded.
  • the signal control circuit 40 includes a frequency transmission circuit 41 and a waveform shaping circuit 42. ing.
  • the frequency transmission circuit 41 is configured to output a control signal of a predetermined frequency set in advance.
  • the waveform shaping circuit 42 is configured to shape the control signal of the frequency transmission circuit 41 into a predetermined waveform and output a control signal.
  • the waveform shaping circuit 42 is connected to the base of the switching transistor 22 and is configured to turn on and off the switching transistor 22 at a predetermined timing.
  • the step-up transformer 30 includes a primary winding 31 of a low-voltage section and a secondary winding 32 of a high-voltage section.
  • the step-up transformer 30 generates a predetermined high voltage on the secondary winding 32 based on a step-up ratio determined by a winding ratio between the primary winding 31 and the secondary winding 32. It is configured to be.
  • the step-up transformer 30 excites the primary winding 31 and stores a predetermined electric energy A in the primary winding 31.
  • the switching transistor 22 is turned off, the stored electric energy is released.
  • the secondary winding 32 of the step-up transformer 30 induces a swaying motion of electrons through electric field fluctuations, and the instantaneous voltage and the alternating voltage of the residual damped oscillating wave of raw amplitude. B is induced.
  • the generation of an instantaneous high voltage that is a single pulse induces the alternating voltage B of the sinusoidal attenuation wave.
  • the voltage applying means 12 includes a pair of electrode probes 50, 50.
  • the two electrode probes 50, 50 are connected to the secondary winding 32 of the step-up transformer 30 by wirings 60, 60. It is configured to be connected to each end.
  • a current limiting resistor 61 for overcurrent limiting and a capacitor 62 are connected in series to each of the wires 60.
  • the electrode probe 50 includes a cylindrical electrode tube 51 and a tip electrode 52 housed inside the electrode tube 51 and connected to the wiring 60.
  • the inside of the electrode tube 51 is filled with a filler 53 of an insulating material such as silicon.
  • the electrode probe 50 includes a high insulating coating 63. That is, the electrode tube 51 is covered with the high insulation coating 63 having high insulation properties. Since the electrode probe 50 is covered with the high insulation coating 63, it functions as an equivalent capacitor formed according to the dielectric constant.
  • the pair of electrode probes 50 and 50 are set at a predetermined site of a living body, that is, are set in a non-contact state with a predetermined cell 3.
  • the pair of electrode probes 50 and 50 are configured to apply a high-voltage flashing voltage near a predetermined cell 3.
  • the voltage applying means 12 constitutes an external resonance circuit including the living body, and when the pair of electrode probes 50, 50 contact and energize the living tissue, the voltage applying means 12 reacts to the external resonance circuit including the living body. Acts as a differentiator and supplies a large trigger voltage to the external resonance circuit.
  • the gene 2 to be introduced is previously injected into a living body by means such as injection. Thereafter, a pair of electrode probes 50, 50 is immobilized on the organism, targeting the cells 3 into which the gene 2 is introduced. Subsequently, DC power is supplied from the power supply 21 to the primary winding 31 of the step-up transformer 30, while a predetermined control signal is output from the frequency transmission circuit 41. This control signal is shaped by the waveform shaping circuit 42 and outputs a predetermined control signal to the base of the switching transistor 22.
  • the external resonance circuit including the living body is excited by the instantaneous voltage as a trigger voltage and causes resonance. Then, at the time of the resonance of the cell 3, as shown in FIG. 5, a voltage fluctuation C of the amplitude modulation waveform which is the sum of the resonance dynamics of the electrons and the charged molecules following the trigger one voltage is observed.
  • the biological circuit centering on the point of application of the voltage forms an electric free resonance circuit, and a sine wave damped oscillation is induced.
  • Surrounding cells 3 and gene 2 are also incorporated in the free resonance circuit, Vibrates synchronously.
  • the gene 2 near the cell membrane 3a moves to the opposite electric field side when the same electric field as the electric field charged by itself is applied, and the reverse electric field is applied. Then, it moves to the electric field side where neutralization is possible. Then, as a result of the repetition of the continuous movement based on the natural resonance characteristic and the reversible reversal of the polarity of the cell membrane 3a, the gene 2 causes an accelerating behavior. As a result, the gene 2 passes through the cell membrane 3a and collides with and diffuses with molecules in the cell 3 to become a part of the structure of the nuclear gene 5 of the cell nucleus 4 and exhibit a desired effect.
  • the molecular transduction device 1 particularly, the gene transduction device using the electric transduction method, is required not to damage the target body tissue or cells 3. If the gene transfer device causes the destruction of cells 3 and tissues in the body, the eligibility of the device itself is lost. The cause of destruction of the cells 3 and internal tissues is often an excessive amount of power supplied to the target cells 3. Therefore, it is important for the gene transfer apparatus to avoid the destruction of the cells 3 and the like by quickly neutralizing the saturation storage power before the destruction of the cells 3 and the like.
  • a desired gene 2 is previously introduced into a predetermined site in the body by injection or the like. Then, the boosted voltage is intermittently and repeatedly applied to the above-described predetermined portion from the boosting transformer 30 which is a high-impedance high-voltage power supply (see FIG. 4). By applying this voltage, the biological circuit centering on the point of application forms an electric free resonance circuit and induces molecular damped oscillation.
  • the surrounding cells 3 and the introduced gene 2 are also incorporated in the free resonance circuit, and oscillate in synchronization with the inherent resonance characteristic of the gene 2.
  • the gene 2 present near the cell membrane 3a receives the reverse electric field in the opposite electric field direction and the next instant when the same instantaneous electric field as the electric charge charged itself is applied. When this happens, it is subjected to dynamic momentum based on Faraday's law toward the forward electric field.
  • the probability of introducing gene 2 into cells 3 is dramatically improved as compared to the conventional method of applying only direct current or the RF method, and the destruction of the target site and surrounding cells 3 is reliably prevented. Can be.
  • the current may be shifted by forming a magnetic field to generate an electron spin, or the resonance of a molecule such as the gene 2 may be controlled.
  • the double helix structure of DNA can be relaxed to introduce molecules such as gene 2 into cells 3.
  • molecules such as gene 2 it becomes possible to integrate molecules such as gene 2 into the genome.
  • vibrations such as Fourier waveform synthesis are not limited to free resonance.
  • resonance of various body tissues and cells 3 can be caused.
  • the introduction of molecules may be advanced while observing appropriate resonance conditions.
  • the signal control circuit 40 outputs a control signal with a variable frequency, it is possible to adjust the voltage application cycle to match the gene 2 to be introduced.
  • the frequency of the application of the high voltage is preferably from 10 Hz to 100 Hz
  • the duration of the application of the alternating voltage is preferably from 10 seconds to 10 minutes. The application for 10 seconds to 10 minutes is repeated.
  • the voltage between the pair of electrode probes 50 and 50 is set at ⁇ 10,000 volts to 1,000,000 volts, and the impedance of the voltage applying means 12 is n X 101 G
  • the current flowing between the pair of electrode probes 50 and 50, that is, the current flowing through the cell 3 and the like is 1 microamp or less. Therefore, the environment around the cell 3 is a low-current environment where almost no current flows and a high-voltage environment is formed.
  • the duty ratio (t / T), which is the ratio of the off time t to the time T of one cycle, is preferably from 0.03 to 0.4.
  • the transfection of the GFP gene was tested using chickens and bifidobacteria two days after hatching. A high voltage of ⁇ 150,000 volts was repeatedly applied between the pair of electrode probes 50.
  • the high voltage was applied for 30 seconds to 2 minutes.
  • the high voltage was applied in a plastic dish for 3 seconds to 60 seconds. At this time, a twitch phenomenon was observed in the chicken thigh muscle, and depolarization of muscle cells was evident.
  • the used group (GCS) to which the present molecule introduction device 1 was applied was compared with the unused group (CTL) to which the present molecule introduction device 1 was not applied.
  • CTL unused group
  • yogurt supernatant emitting green fluorescence was observed, whereas in CTL, no supernatant fluorescence was observed.
  • a specific energy absorption range of 340 nm to 400 nm distributed in the GCS group was confirmed by absorption spectrum analysis.
  • Figures 19 and 20 show that GCS and CTL bifidobacteria were shake-cultured in commercial milk at 37 ° C for 72 hours, and then centrifuged at 300,000 g for 20 minutes. 1 shows the results of obtaining the culture supernatant of Example 1. When the supernatant was injected into the quartz cutout and spectrophotometrically performed, the absorbance between 340 nm and 400 nm was apparent only in the GC S group, as shown in Figure 19. Met.
  • Example 2 The cells were precipitated in a centrifuge tube, suspended by adding a small amount of a high-concentration GFP plasmid solution (20 ⁇ -g), and a high electric field was applied by the above-described molecule introduction device 1.
  • the frequency of application of the high voltage ( ⁇ 150,000 volts) in the voltage applying means 12 was set to 80 Hz to 800 Hz, and the voltage was applied for 2 minutes.
  • an anti-cyclin B1 mouse monoclonal antibody was injected into the thigh muscle of chickens to try to introduce protein molecules into the cells.
  • a high voltage of ⁇ 250,000 V was applied at 60 Hz for 1 minute around the ground point potential of the fixture of the specimen to excite the resonance circuit. .
  • the thigh muscle was fixed in formalin to prepare a barrafin section. Thereafter, the distribution of the anti-cyclin B1 antibody introduced into the nucleus was confirmed by a peroxidase color reaction through the binding of the anti-mouse IgG secondary antibody and streptavidin-biotin. This proved that the antibody protein migrated into the cell by resonance excitation, and then accumulated in the cell nucleus, the localization site of the target molecule, cyclin B1.
  • the chicken thigh muscle 2 days after hatching was injected with IgG labeled with FITC, and between electrode probes 50 and 50, ⁇ 25% centered on the ground potential of the fixture of the specimen.
  • a high voltage of 10,000 V was applied at 150 Hz for 1 minute to excite the resonance circuit.
  • the thigh muscle was rapidly frozen and frozen sections were prepared. As shown in FIG. 18, a wide distribution of FH fluorescence was observed in the skeletal muscle cells under a fluorescence microscope.
  • FIG. 18 shows skeletal muscle into which the RTC-labeled antibody protein has been introduced. According to the superimposed image of the cell contour and FITC fluorescence by the Nomarski method, no fluorescence is observed outside the cell, which is the background, and green fluorescence is clearly visible in almost all muscle cell cytoplasms.
  • Embodiment 2
  • FIG. 6 shows another embodiment of the electrode probe 50.
  • the electrode probe 50 of FIG. 6 is of a variable capacitance type, and includes a tip electrode 52, a reactance section 54, and a capacitor section 55 inside a cylindrical electrode tube 51. .
  • the tip electrode 52 is housed and fixed at the tip of the electrode tube 51.
  • One end of the reactance section 54 is connected to the tip electrode 52.
  • the capacitor unit 55 corresponds to the capacitor 62 of the first embodiment, and includes a fixed electrode 55a and a movable electrode 55b. Then, the fixed electrode 55 a is connected to the reactance part 54. Have been.
  • the movable electrode 55 b is connected to a wiring 60 via a screw portion 56. The screw portion 56 is screwed to the base end of the electrode tube 51.
  • the electrode tube 51 is covered with a highly insulating coating 63.
  • FIG. 7 shows still another embodiment of the electrode probe 50.
  • the electrode probe 50 of FIG. 7 is of a variable reactance type, and has a cylindrical electrode tube.
  • a tip electrode 52 is provided with a tip electrode 52, a capacitor section 55, and a reactance section 54.
  • the tip electrode 52 is housed and fixed at the tip of the electrode tube 51.
  • the capacitor section 55 includes two fixed electrodes 55c and 55c. One fixed electrode 55c is connected to the tip electrode 52, and the other fixed electrode 55c is connected to the reaction unit 54.
  • the reactance section 54 includes a coil 54a and a collecting piece 54b in contact with the coil.
  • the coil 54 a is connected to the fixed electrode 55 c of the capacitor unit 55.
  • the collecting piece 54 b is connected to a wiring 60 via a screw portion 56.
  • the screw portion 56 is screwed to the base end of the electrode tube 51.
  • the electrode tube 51 is covered with a highly insulating coating 63.
  • FIG. 8 shows another embodiment of the power supply circuit 20.
  • the power supply circuit 20 of FIG. 8 includes a power adjustment circuit 70. That is, the power adjustment circuit 70 is configured to adjust the power supplied from the power supply 21 to a predetermined control power. Then, the power adjusting circuit 70 controls the boost transformer 30 and the signal control circuit 40 so that the control power is output to the primary winding 31 of the boost transformer 30 and the frequency transmission circuit 41 of the signal control circuit 40. Connected to circuit 40.
  • the control power corresponding to the gene 2 or the cell 3 or the like introduced by the power adjustment circuit 70 is generated. That is, the power adjustment circuit 70 adjusts the current or voltage of the power supply 21.
  • Embodiment 5-FIGS. 9 and 10 show another embodiment of the molecule introduction device 1.
  • the molecule introduction device 1 includes a plurality of pairs of electrode probes 50a, 50b, 50c,-. Specifically, the molecule introduction device 1 includes three pairs of electrode probes 50a, 50b, and 50c.
  • the voltage generating means 11 includes three boosting transformers 30a, 30b, and 30c.
  • the power supply circuit 20 of the voltage generating means 11 includes a first power supply 21a and a second power supply 21b, and the positive side of the second power supply 21b is connected to each of the step-up transformers 30a, 30b. b, 30c are connected to one end.
  • the voltage generating means 11 includes three switches 24, and each switch 24 is constituted by two switching transistors 22a and 22b.
  • the two switching transistors 22a and 22b of each switch 24 are connected to the collector and the emitter, and the signal control circuit 40 is connected to the base. You.
  • the collector of the first switching transistor 22a of each switch 24 is connected to the positive side of the first power supply 21a, and the emitter of the second switching transistor 22b is connected to the second power supply 21b. Is connected to the negative side.
  • One end of each of the step-up transformers 30a, 30b, 30c is connected between the collector and the emitter of the two switching transistors 22a, 22b of each switch 24.
  • the signal control circuit 40 is configured to be able to output a single-phase alternating current, a three-phase alternating current, a multi-phase alternating current, a plurality of frequencies, or a composite waveform to each of the switching transistors 22a, 22b,.
  • the six electrode probes 50a, 50b, 50c,... are arranged radially with respect to the cell 3 into which the gene is to be introduced, as shown in FIG. Then, a predetermined potential difference is generated between the paired electrode probes 50a, 50b, and 50c.
  • the voltage between the three pairs of electrode probes 50a, 50b, 50c may be made different by the boosting of the boosting transformers 30a, 30b, 30c. Further, a voltage is applied to the gene 2 and the like from different directions by the switching operation of the switching transistors 22a, 22b,....
  • Embodiment 6-FIG. 11 shows a container 70 that is an auxiliary tool for introducing a gene into cells using the molecule introduction device 1.
  • the container 70 stores a cell solution, is formed of a material having a predetermined dielectric property, and has a bowl-shaped body 71 and a lid 7 that closes an upper opening of the body 71. It is composed of two.
  • the cover 72 has an air hole 73 as an opening for venting.
  • Examples of the material of the container 70 include glass, ceramics, and polymer materials (polyethylene, polycarbonate, Teflon, etc.).
  • a concave portion 74 is formed inside the main body 71 so that a strong electric field is generated in the concave portion 74. Further, in the main body 71, an insulating portion and a conductive portion are formed so that a strong electric field is generated in the concave portion 74.
  • the gene to be introduced into the cells is injected into the main body 71 together with the cell solution, and the main body 71 is closed by the lid 72. At that time, the air inside the main body 71 is exhausted from the air holes 73. Then, the cells in the cell solution of the main body 71 are concentrated in the concave portion 74.
  • a high voltage is applied to the inside of the container 70 by the electrode probes 50, 50 of the first embodiment.
  • the electric field concentrates on the concave portion 74 having a high cell density, and the electric field becomes stronger, so that the resonance of genes and the like in the periphery of more cells increases, and the gene 2 is smoothly transferred to the cells 3. be introduced.
  • the main body 71 and the lid 72 may be integrated. Further, the concave portion 74 may be formed on at least a part of the inner surface or the outer surface of the main body 71 or the lid 72.
  • the concave portion 74 of the main body 71 of the container 70 may be formed in various shapes as shown in FIGS.
  • the concave portion 74 may be formed in a spiral shape that spirals from the center to the outside. Further, the concave portion 74 may be a plurality of concentric circles.
  • the concave portions 74 may be formed in a lattice shape. Further, as shown in FIG. 14, the concave portion 74 may be formed in a wavy line shape to further extend the entire length of the concave portion 74, or may be a plurality of wavy line concave portions.
  • Embodiment 7 —
  • FIG. 15 shows an auxiliary tool 80 for introducing a gene into a cell using the molecule introduction device 1.
  • the auxiliary tool 80 is adapted to generate a strong electric field at a predetermined site in the body.
  • the auxiliary tool 80 is formed on a soft adhesive plate having predetermined dielectric properties.
  • the assisting tool 80 is configured such that, for example, a linear conductor is formed in a net shape, and is bonded to the insulating surface and the surface of the human body 90.
  • the auxiliary tool 80 is adhered to the surface of the human body 90. Thereafter, for example, a high voltage is applied to a predetermined part of the body by the electrode probes 50 and 50 of the first embodiment. At this time, the electric field is concentrated on a predetermined portion by the auxiliary tool 80, and the electric field is strengthened. Therefore, the resonance amplitude of the gene 2 and the like is increased, and the gene 2 is smoothly introduced into the cell 3.
  • FIG. 16 shows another embodiment of an auxiliary tool 80 for introducing a gene into a cell using the molecule introduction device 1.
  • the auxiliary tool 80 is formed in a sheath shape by forming a linear conductor 81 in a net shape.
  • the auxiliary tool 80 is, for example, introduced and placed inside the blood vessel 91 via an insulating sheath.
  • the material of the auxiliary tool 80 include glass, ceramics, and polymer materials (polyethylene, polycarbonate, Teflon, etc.).
  • the assisting device 80 is inserted into the blood vessel 91, and the gene 2 is injected into the body.
  • the auxiliary device 80 and the gene 2 developed on a substrate such as a gel may be integrated. Thereafter, for example, a high voltage is applied to a predetermined part of the body by the electrode probes 50 and 50 of the first embodiment. At this time, the electric field is concentrated on a predetermined portion by the conductor 81 of the assisting tool 80, and the electric field is strengthened.
  • the step-up means uses the step-up transformer 30 which is a transformer, but a piezoelectric element utilizing a piezoelectric effect may be used.
  • the piezoelectric element is configured to generate a predetermined instantaneous high voltage by applying distortion.
  • the voltage applying means 12 applies the instantaneous high voltage.
  • an alternating voltage may be applied, and the instantaneous high voltage and the alternating voltage are superimposed.
  • a voltage may be applied.
  • the voltage applying means 12 may include a spark gap or a discharge tube in series or parallel with the boosting means.
  • the high insulation portion of the voltage applying means 12 may be a high insulation shield placed close to the electrode 52.
  • the electrode probe 50 may be made of a conductive material containing a metal, a ceramic, or an organic material.
  • the passage of molecules through the membrane may be adjusted by changing the resonance characteristics by changing the applied voltage, resonance constant, or electrode position.
  • a phantom (simulated living tissue) may be applied to visualize the electric field formed between the electrode probes 50 and 50.
  • a discharge sensor may be used to measure the strength of the electric field formed between the electrode probes 50 and 50.
  • the assisting tool 80 is not limited to the embodiment, and it is sufficient that the insulating portion and the conductive portion are formed.
  • the assisting device 80 may be configured to generate a strong electric field at a predetermined portion.
  • the molecule to be introduced may be a low molecular weight compound containing a polynucleotide, a protein, a virus, various drugs, or a heterologous or homologous cell molecule.
  • polynucleotide examples include DNA, RNA, and a polynucleotide derivative.
  • proteins examples include analog proteins, physiologically active proteins, receptors for physiologically active substances, antigens, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antibody-like synthetic molecules, caged molecules, and the like.
  • Examples of the low-molecular compound containing the above-mentioned various drugs include a pile cancer drug, an antibiotic, an immunosuppressant, a coloring matter, and a fluorescent substance.
  • Substances that promote the introduction of the molecules to be introduced include electrons, electron spin probe molecules, membrane potential probe molecules, optical probe molecules, anesthetics, chlorpromazines, antibiotics such as polymyxin B, and cell adhesion such as fibronectin.
  • Examples include molecules, proteins, riboproteins, peptides, amino acids, and the like.
  • the living tissue may be an animal or plant tissue
  • the cell 3 may be an animal, plant or microorganism cell, or a cell cloned from an animal, plant or microorganism.
  • Examples of the above animals include protozoa, insects, invertebrates, vertebrates, humans, living hermaphrodite organisms having a reproductive organ, and the like.
  • microorganism examples include a virus, a bacterium, and a mold.
  • cells derived from the above organisms include fertilized eggs, spermatozoa, ova, primordial germ cells, blast cysts, cell lineages, various stem cells including ES cells and projector cells, plant seeds, callus, etc.
  • the cloned cells include, for example, primary culture cells, passage culture cells And the like.
  • the molecule may be a surfactant such as saponin, digitonin, dimethyl sulfoxide, at least one of ionophore, lipid, ceramide, albumin, glycerin, gelatin or serum, or an osmotic pressure or ionic pressure inside or outside a cell. It may be prepared with a liquid containing a molecule for controlling the impedance.
  • a surfactant such as saponin, digitonin, dimethyl sulfoxide, at least one of ionophore, lipid, ceramide, albumin, glycerin, gelatin or serum, or an osmotic pressure or ionic pressure inside or outside a cell.
  • the molecule may be developed in an ointment, cream, gel base or water for injection, and applied to the body surface, pasted on the body surface, or injected into the body.
  • the present invention may be applied to cell fusion. That is, in general, cell fusion is performed by using polyethylene glycol to fuse cells. In the case of cells having a cell wall, the treatment is performed after protoplast treatment. However, polyethylene glycol is cytotoxic and hinders the improvement of fusion efficiency. Therefore, the cell membrane is vibrated by applying the molecule introduction device of the present invention. This results in cell fusion without the use of polyethylene glycol.
  • the present invention may, of course, be applied to breeding and genetically modified plants. Genetically modified plants are created in the following process.
  • a gene is introduced into cultured plant cells using an adenovirus or particle gun.
  • cells into which the gene has been introduced are selected, and the cells are tissue-cultured to differentiate individual plants.
  • the gene introduction apparatus of the present invention is applied, and the gene is introduced into the whole seed using a gene symphonizer.
  • the process of tissue culture can be omitted, and a new method for producing a genetically modified plant that does not select plant species is possible.
  • the gene is introduced into a plant using an agrobacterium vector, a particle gun, or an electrophoresis method.
  • an agrobacterium vector unlike animal cells, since they have cell walls, the efficiency of gene transfer into plant cells is low, and it has been indispensable to induce protoplasts or callus that degrades the cell walls.
  • the present invention Oscillates both the cell wall and the cell membrane, allowing gene transfer without protoplasting or callus induction.
  • the present invention is a method for gene transfer into plant cells having high gene transfer efficiency because of low cell impairment. Industrial applicability
  • the molecule introduction device and the molecule introduction method according to the present invention are useful for introducing molecules into cells, and include gene therapy, regenerative therapy, drug introduction into target tissues or target cells, animal and plant breeding, It is suitable for transgenics, creation of genetically modified organisms, cell fusion and artificial substance synthesis.

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Description

明 細 書 分子導入装置、 分子導入装置用の補助具及び分子導入方法 技術分野
本発明は、 医学及び生物学等の分野において、 遺伝子等の分子を細胞内に導 入する分子導入装置、 該分子導入装置用の補助具及び分子導入方法に関するもの である。 背景技術
近年、 遺伝子治療が脚光を浴びてきている。 ところが、 未だ遺伝子を確実に 生体内へ導入する方法は確立していない。 現在、 遺伝子導入方法には、 リポゾ一 ム法、 ウィルス法、 リン酸カルシウム法、 ジーンガンなどの直接注入法及び電気 穿孔法であるエレク ト口ポレーシヨン法 （electroporation ) がある。 電気的方法 においては、 矩形直流パルス又は指数関数減衰パルスを用いている。
上記電気穿孔法を適用している分子導入装置には、 日本特許第 2 7 3 9 9 7 8号公報に開示されているものがある。 この分子導入装置は、 複数の生体粒子を 溶液中の電極の間に配置し、 パルス高周波の振動電界を上記電極の間に印加し、 上記生体粒子のポレーション又は透過を行うものである。 一解決課題一
上述した従来の遺伝子導入方法としてのリポゾーム法、 ウィルス法、 リン酸 カルシウム法、 ジーンガン及びエレク トロボレ一シヨン法は、 何れにおいても生 体に無害で且つ安定した遺伝子導入をもたらすものとはいえないという問題があ つた。
電気的方法においては、 矩形直流パルス又は指数関数減衰パルスを用いるた め、 遺伝子の導入時に組織細胞の障害が避けられない。 また、 この電気的方法で は、目的とした細胞又は組織全体に確実に遺伝子を導入させることが困難である。
また、 上記日本特許第 2 7 3 9 9 7 8号公報に開示された分子導入装置は、 ： R F高周波電流パルスを溶液中に通電する方法である。 この場合、 溶液中に流入 する電流 （電子の数） が大きくなるため、 細胞傷害が生ずる。 この細胞傷害を防 止するためには、 通電電力を低下させる必要がある。 しかし、 この通電電力を低 下させると、 細胞等の分子の振動能力が低下する。 この結果、 分子を細胞内へ確 実に導入させることができないという問題があった。 本発明は、 斯かる点に鑑みてなされたものであり、 動植物やその他の生物に おいて、 生体、 培養組織接着細胞及び浮遊細胞の何れにおいても、 傷害がなく且 つ確実に遺伝子等の分子を細胞内に導入し、 蛋白又は活性の発現をもたらすこと を目的とするものである。 発明の開示
本発明は、 分子間の結合エネルギーよりも大きい運動エネルギーを、 細胞へ 導入させる分子に付与するようにしたものである。 この結果、 細胞に穿孔等を形 成することなく、 分子を安全に細胞内に導入させることができる。
本願発明者らは、 大きい運動エネルギーを如何にして分子に付与するかに関 し、 永年鋭意研究をした結果、 下記の手段を見出したものである。 本発明は、 体 内組織又は細胞を標的に、 電気的フィールド、 磁気的フィールド又は音波的フィ 一ルドを形成する。 そして、 分子の共鳴運動と、 細胞膜の可逆的な極性反転の反 復脱分極とを励起させ、細胞内外における分子の膜通過を可能とする。すなわち、 電気的には負の荷電をもつ細胞膜が正に極性反転すれば、 同じく負に帯電した分 子との相互反発が消失して互いに吸引し合う。 この結果、 遺伝子等の分子の細胞 内への移行が惹起される。 更に詳述すると、 本発明において、 放電されるのは、 例えば、 シングルスパ ィクのみでよく、 スパイクの上行脚と下行脚が最初の 1振動をもたらすのみでよ い。 その後の全ての振動は、 生体系を含んだ共振回路の交響反応現象である。 し たがって、 全ての振動反応は、 単回の励起に伴う二次現象であり、 振動波 （高周 波） の出力は、 必ずしも必要としない。 導入する分子が細胞内に移行する仕組みは、 次の通りである。 どの様な高電 圧の瞬発励起であっても、 全ての分子種は、 分子量、 帯電性と帯電部位又は立体 構造などによって規定される固有振動特性がそれそれ異なる。 このために、 分子 の共鳴振動の位相偏差と、 分子の相対運動におけるモーメン卜の減衰偏移とが生 じる。 時には、 分子対分子が離反し合ったり、 衝突しあう現象が出現する。 した がって、導入する分子と細胞膜の構成分子とは、衝突と離反を繰り返す。そして、 細胞膜の立体構造が歪んだ瞬間などに、 分子が細胞内へ進入する機会を得る。
この瞬発刺激に引き続く電気的減衰振動は、 導入装置と生体内回路に包含さ れる電子や分子の共鳴運動の総和として観察されるものであり、 分子が細胞内へ 進入する事象を反映するものである。
また、 本発明は、 静水面に小石を落として液面の振動を得るのに対し、 高周 波法は、 オールで液体を捌いて水面を振動させることに相当する。 石を落とす場 合は、 オイルであれ、 水であれ、 何れの液体もその容量と液体自身の物性に適切 な振動様式を来す。 これに対し、 液体を捌く場合には、 捌くこと自体が液面に不 適切な動揺を与えるため、 大きな振動が得られない。 同振幅の振動を得るために は、 明らかに、 小石を落とす方がオールによる手段よりもエネルギー損失が少な い。 例えば、 音の場合は、 本発明の方法では、 音叉をたたいて共鳴音を得るのに 対し、 高周波刺激では、 音叉を細かく揺すっていることに相当する。 明らかに、 音叉をたたいた方がきれいな共鳴が得られる。
そこで、 本発明では、 瞬発の高電圧を利用することを 1つ態様としている。 詳述すると、 第 1〜第 1 7の発明は、 分子導入装置に関する発明であって、 第 1の発明は、生体組織又は細胞を標的に、電圧印加によって電気的フィールド、 磁気的フィールド又は音波的フィールドを形成し、 細胞内への分子の膜通過を可 能とする構成としている。
また、 第 2の発明は、 生体組織又は細胞を標的に、 瞬発の高電圧による電気 的フィールド、 磁気的フィールド又は音波的フィールドを形成し、 生体組織又は 細胞を含んだ自由共振回路を励起して、 細胞の構成分子と導入する分子との交響 運動を生起させ、 上記分子を細胞内へ導入させる構成としている。 また、 第 3の発明は、 電圧を発生する電圧発生手段と、 該電圧発生手段が発 生する電圧を受けて体内の所定部位に電界を発生させ、 生体組織又は細胞の外側 に配置された分子を細胞内に導入するための高ィンピーダンス化された電圧印加 手段とを備えた構成としている。
また、 第 4の発明は、 上記第 3の発明において、 電圧印加手段が、 体内の所 定部位を含む自由共振回路を構成する構成としている。
また、 第 5の発明は、 上記第 3の発明において、 電圧印加手段は、 電極が高 絶縁部を介して電界を体内の生体組織又は細胞の周辺に発生させるように構成さ れたものである。
また、 第 6の発明は、 上記第 3の発明において、 電圧発生手段が、 電力を供 給する電力供給手段と、 該電力供給手段から電力供給されて高電圧を電圧印加手 段に供給する昇圧手段と、 上記電力供給手段から昇圧手段への電力供給を断接し て、 電圧印加手段に供給する電圧を昇圧手段に発生させる開閉手段と、 該開閉手 段の断接を制御する開閉制御手段とを備えた構成としている。
また、 第 7の発明は、 上記第 6の発明において、 電力供給手段が、 電源と、 該電源から電力を受けて制御電力を出力する電力調整回路とを備えた構成として いる。
また、 第 8の発明は、 上記第 7の発明において、 電力調整回路が、 昇圧手段 と開閉制御手段とに所定の電力を供給すると共に、 供給する電圧又は電流を固定 又は可変に制御するように構成されたものである。
ことを特徴とする分子導入装置。
また、 第 9の発明は、 上記第 6の発明において、 昇圧手段が、 開閉手段によ つて駆動する低圧部と、 電圧印加手段の一部を構成する高圧部とを備え、 上記低 圧部と高圧部との間に予め設定された昇圧比に基づいて所定電圧に昇圧させるよ うに構成されたものである。
また、 第 1 0の発明は、 上記第 6の発明において、 開閉制御手段が、 周波数 可変の制御信号を出力して開閉手段の駆動を制御するように構成されたものであ る。
また、 第 1 1の発明は、 上記第 6の発明において、 開閉手段が、 開閉制御手 段の制御信号に基づき昇圧手段への供給電力を断接するように構成されたもので ある。
また、 第 1 2の発明は、 上記第 6の発明において、 電圧印加手段が、 複数の 電極と高絶縁部とを備え、 該電極が高絶縁部を介して電界を体内の生体組織又は 細胞の周辺に発生させるように構成されたものである。
また、 第 1 3の発明は、 上記第 6の発明において、 昇圧手段が、 変圧器、 又 は圧電効果に基づいて高電圧を発生する圧電素子である構成としている。
また、 第 1 4の発明は、 上記第 3の発明において、 電圧印加手段が、 分布容 量による共振特性を能動的に可変する可変容量構造又は可変リァク夕ンス構造に 構成されたものである。
また、 第 1 5の発明は、 上記第 3の発明において、 電圧印加手段が、 昇圧手 段と直列又は並列にスパークギヤップ又は放電管を備えた構成としている。
また、 第 1 6の発明は、 上記第 5又は 1 2の発明において、 電圧印加手段の 高絶縁部が、 電極に近接して配置される高絶縁遮蔽物又は電極を被覆する高絶縁 被覆物である構成としている。
また、 第 1 7の発明は、 上記第 5又は 1 2の発明において、 電極が、 金属、 セラミックス又は有機物質を含む電導物質によって構成されたものである。
また、 第 1 8の発明は、 上記第 1 2の発明において、 開閉制御手段が、 単相 交流様、 三相交流様、 多相交流様、 複数周波又は合成波形を出力可能に構成され たものである。
たものである。 更に、 昇圧手段が、 正電圧側バース ト若しくは負電圧側バースト 又は該両バーストを組み合わせ電圧を出力可能に構成されると共に、 上記昇圧手 段が、 複数設けられ、 複数の電極の間に電位差を生じさせるように構成されてい る。 一方、 第 1 9〜第 3 0の発明は、 分子導入方法に関する発明であって、 第 1 9の発明は、生体組織または細胞を標的に、電圧印加によって電気的フィールド、 磁気的フィ一ルド又は音波的フィールドを形成した後、 分子を細胞内へ膜通過さ せる構成としている。 また、 第 2 0の発明は、 生体組織又は細胞を標的に、 瞬発の高電圧による電 気的フィールド、 磁気的フィールド又は音波的フィールドを形成し、 生体組織又 は細胞を含んだ自由共振回路を励起して、 細胞の構成分子と導入する分子との交 響運動を生起させ、 上記分子を細胞内へ導入する構成としている。
また、 第 2 1の発明は、 生体組織又は細胞の周辺に細胞内に導入する分子を 分布させた後、 該生体組織又は細胞の周辺に高電圧を繰り返し印加し、 微電流且 つ高電圧の環境下において分子を細胞内に導入する構成としている。
また、 第 2 2の発明は、 生体組織又は細胞の周辺に細胞内に導入する分子を 分布させた後、 該生体組織又は細胞の周辺に高電圧を繰り返し印加し、 微電流且 つ高電圧の環境下において生体組織又は細胞の所定部位を含む自由共振回路を形 成し、 分子を細胞内に導入する構成としている。
また、 第 2 3の発明は、 生体組織又は細胞の周辺に細胞内に導入する分子を 分布させた後、 電極から高絶縁部を介して上記生体組織又は細胞の周辺に高電圧 を繰り返し印加し、 微電流且つ高電圧の環境下において生体組織又は細胞の所定 部位を含む自由共振回路を形成し、 分子を細胞内に導入する構成としている。
また、 第 2 4の発明は、 上記第 2 2又は 2 3の発明において、 微電流且つ高 電圧の環境は、 電力を供給する電力供給手段と、 該電力供給手段から電力供給さ れて高電圧を発生させる昇圧手段と、 上記電力供給手段から昇圧手段への電力供 給を断接して昇圧手段に高電圧を発生させる開閉手段と、 該開閉手段の断接を制 御する開閉制御手段と、 上記昇圧手段が発生する高電圧を受けて体内の所定部位 に電界を発生させ、 生体組織又は細胞の外側に配置された分子を細胞内に導入す るための電圧印加手段とを備えた分子導入装置によって構成したものである。
また、 第 2 5の発明は、 上記第 1 9 ~ 2 3の何れか 1の発明において、 分子 が、 ポリヌクレオチド、 蛋白質、 ウィルス、 各種薬剤を含む低分子化合物又は細 胞分子である構成としている。
また、 第 2 6の発明は、 上記第 1 9〜2 3の何れか 1の発明において、 生体 組織が、 動物又は植物の組織であり、 細胞が、 動物、 植物若しくは微生物の細胞 又は動物、 植物若しくは微生物からクローンした細胞である構成としている。
また、 第 2 7の発明は、 上記第 2 4の発明において、 分子の膜通過が、 投入 する印加電圧、 共振定数又は電極位置の変動により調整される構成としている。 また、 第 2 8の発明は、 上記第 1 9〜2 3の何れか 1の発明において、 分子 が、 サポニン、 ジギトニン、 ジメチルスルフオキサイ ドなどの界面活性剤、 ィォ ノフォア、 リピヅ ド、 セラミ ド、 アルブミン、 グリセリン、 ゼラチン若しくは血 清の少なくとも一つ、 又は細胞内外の浸透圧若しくはイオンバランスを制御する 分子を含有した液で調製される構成としている。
また、第 2 9の発明は、 上記第 1 9〜2 3の何れ 1の発明において、分子が、 軟膏、 クリーム、 ゲル状の基材又は注射用水溶液に展開し、 体表面への塗布、 体 表面への貼付又は体内への注入が行われる構成としている。
また、 第 3 0の発明は、 上記第 1 9〜2 3の何れか 1の発明において、 分子 が、 細胞培養液又はポリエチレングリコールに展開して細胞内へ膜透過させる構 成としている。 更に、 第 3 1及び第 3 2の発明は、 上記分子導入装置の補助具に関する発明 であって、 第 3 1の発明は、 所定の誘電特性を有する容器本体と、 該容器本体の 少なくとも一部に形成されて電界を集中させる凹部とを備えた構成としている。
また、 第 3 2の発明は、 生体の所定部位に配置される補助具であって、 体内 の所定部位に電界が集中するように電導部が形成された構成としている。 つまり、 一般に、 分子導入装置、 特に、 電気的導入法の遺伝子導入装置にお いては、 対象組織や細胞を傷害しないことが求められる。 遺伝子導入装置が、 細 胞組織の破壊を招けば、装置自体の適格性が損なわれる。細胞破壊を招く原因は、 対象細胞に対する供給電力量が過剰であることが多い。 したがって、 遺伝子導入 装置は、 細胞破壊の前に速やかに飽和蓄積電力を中和することによって、 細胞破 壊を回避することが肝要である。
この回避方法としては、 次の方法がある。 先ず、 体内の所定部位には、 予め 注射等により所望の遺伝子を導入しておく。 そして、 ハイインピーダンスの高圧 電源より、 充分に昇圧された電圧を上記所定部位に間欠的に繰り返し印加する。
つまり、 シングルパルスである瞬発的な高電圧を間欠的に発生させる。 この 瞬発の高電圧の印加によって、 装置自身と生体によって形成される電気的自由共 振回路が励起される。 そして、 この共振回路の構成成分で且つ電子や電荷を帯び た分子は、 減衰振動を起こす。
特に、 本発明では、 電極が高絶縁物を介して生体組織又は細胞と外側の遺伝 子等の分子とに非接触状態で配置されている。 換言すれば、 高絶縁部で被覆され た電極を生体組織又は細胞内に挿入しても電流が流れず、 安全である。 そして、 上記電極の間で分子等に電圧を印加する。
その際、 周辺の細胞組織及び導入された遺伝子も周辺細胞の自由共振回路内 に組み込まれ、 各分子の固有の共振特性を発揮して自由減衰振動する。 細胞膜の 近傍に分布する遺伝子は、 自らが帯電している電荷と同一の瞬発電界が与えられ たときには、 逆電界方向に、 また、 次の瞬時に逆電界が与えられたときには、 順 電界側に向けてファラデーの法則に基づく力学的モーメン卜を受ける。 そして、 自由減衰振動による遺伝子の連続運動と、 細胞膜の可逆的な極性反転の反復との 結果、 遺伝子と細胞膜の分子との間には、 加速度的な相対運動が生起し、 遺伝子 の膜通過がもたらされる。
この結果、 従来の電極の間の溶液に直流のみを印加する方法に比べて遺伝子 の細胞内への導入確率は飛躍的に向上すると共に、 対象部位と周辺の細胞の破壊 を確実に防止することができる。
細胞膜及び細胞壁の構造によって、 その厚さを考慮したとき、 その膜及び壁 に印加される電圧から、 薄膜間電子障壁を電子がすり抜ける トンネル効果も発揮 される。
また、 高電界環境下における電子共鳴相互作用が周辺分子を加速度的に励起 するポッビング現象によって、 導入する分子が雪崩的に細胞膜又は細胞壁を通過 することもできる。
特に、 後者は、 従来、 直流パルスを溶液中で供給し、 電流を流しながら遺伝 子を導入していた。 本発明は、 高電界は発生させるものの、 ハイインピーダンス の高圧電源及び高絶縁電極を用いるため、 導入する生体組織又は細胞に殆ど電流 が流れす、 安全性を確保することができる。
また、 磁場を形成することにより電流を偏移させ、 電子スピンを生起させた り、 遺伝子等の分子の共振を制御するようにしてもよい。
また、 一層、 強力な磁場を形成した場合、 D N Aの二重螺旋構造を緩めて遺 伝子等の分子を細胞内に導入させることができる。 また、 遺伝子等の分子をゲノ ム内に組み込むことも可能となる。
また、 単に自由共振に限られず、 フーリエ波形合成などの多様な周期性の振 動を付与するようにしてもよい。 この場合、 様々な組織細胞の共振を生じさせる ことができる。
また、 抵抗値や電極の形状及びサイズを変更することにより、 適切な共振条 件を観察しつつ分子の導入を進めるようにしてもよい。 一発明の効果一
本発明によれば、 従来の直流のみを印加する方法に比べて遺伝子の細胞内へ の導入確率は飛躍的に向上すると共に、 対象部位と周辺の細胞の破壊を確実に防 止することができる。
特に、 電極と分子等とが非接触の状態であるので、 広範囲の適用を可能とす ることができる。
また、 第 7の発明によれば、 電力調整回路を設けているので、 導入する分子 などに適切な瞬発電圧等を生成することができる。 この結果、 分子の膜通過を確 実に行わせることができる。
また、 第 8の発明によれば、 電力調整回路が電流又は電圧を制御するので、 導入する分子などに適切な瞬発電圧等をより精度よく生成することができる。
また、 第 1 0の発明によれば、 開閉制御手段が周波数可変の制御信号を出力 するので、導入する分子などに合致した電圧印加の周期に調整することができる。
また、 第 1 4の発明によれば、 電圧印加手段を可変容量構造又は可変リアク 夕ンス構造に構成されているので、 導入する分子などに合致した共振回路を生成 することができる。
また、 第 1 5の発明によれば、 電圧印加手段がスパークギャップ又は放電管 を備えているので、 安定した瞬発電圧等を生成することができる。
また、 第 1 6の発明によれば、 3つ以上の電極の間で異なる電位差を生じさ せることができるので、 導入する各種の分子に合わせた瞬発電圧等を生成するこ とができる。
また、 第 3 1及び第 3 2の発明によれば、 電界ベク トルを所定箇所に集中さ せることができるので、 分子の導入をより確実に行わせることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 分子導入装置を示す電気回路図である。
図 2は、 遺伝子の細胞膜通過を概略的に示す状態図である。
図 3は、 昇圧トランスの励磁波形を示す波形図である。
図 4は、 昇圧トランスの二次側卷線に生ずる瞬発電圧及び減衰電圧の波形図 である。
図 5は、 細胞の共振時を示す電圧波形図である。
図 6は、 実施形態 2の電極プローブを示す断面図である。
図 7は、 実施形態 3の電極プローブを示す断面図である。
図 8は、 実施形態 4の分子導入装置を示す電気回路図である。
図 9は、 実施形態 5の分子導入装置を示す電気回路図である。
図 1 0は、 実施形態 5の電極プローブの配置を示す配置図である。
図 1 1は、 実施形態 6の分子導入装置に用いる容器を示す斜視図である。 図 1 2は、 実施形態 6の容器における凹部の変形例を示す図 1 I X— X線に おける断面図である。
図 1 3は、 実施形態 6の容器における凹部の他の変形例を示す図 1 I X— X 線における断面図である。
図 1 4は、 実施形態 6の容器における凹部の他の変形例を示す図 1 1 X— X 線における断面図である。
図 1 5は、 実施形態 7の分子導入装置に用いる補助具を示す図である。
図 1 6は、 実施形態 8の分子導入装置に用いる補助具を示す断面図である。 図 1 7は、 実施形態 8の補助具を示す斜視図である。
図 1 8は、実施形態 1における実施例 4を示す鶏大腿筋の顕微鏡写真である。 図 1 9は、 実施形態 1における実施例 1の試験結果を示し、 本分子導入装置 を適用した使用群 （G C S ) の吸光図である。
図 2 0は、 実施形態 1における実施例 1の試験結果を示し、 本分子導入装置 を適用しない未使用群 （C T L ) の吸光図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。
一実施形態 1 一
図 1に示すように、 本実施形態の分子導入装置 1は、 体内の細胞に分子であ る遺伝子を導入する遺伝子導入装置であって、 電圧発生手段 1 1 と電圧印加手段 1 2とを備えている。 この分子導入装置 1は、 図 2に示すように、 導入する遺伝 子 2を予め注射等の手段により生体内に存在させていることを前提としている。
通常、 遺伝子 2を単に体内に注入するのみでは、 細胞 3の細胞膜 3 aによつ て遺伝子 2の細胞 3内への侵入が拒まれる。 従って、 注入した遺伝子 2は、 細胞 3内及び細胞核 4内に移行することができない。 この結果、 遺伝子 2の注入によ つて期待すべき変化は発現しない。
上記電圧発生手段 1 1は、 電力供給手段である電力供給回路 2 0と、 昇圧手 段であって変圧器である昇圧トランス 3 0と、 開閉手段であるスィツチングトラ ンジス夕 2 2と、 開閉制御手段である信号制御回路 4 0とを備えている。
上記電力供給回路 2 0は、 直流の電源 2 1を備え、 該電源 2 1の両端が昇圧 トランス 3 0の一次側卷線 3 1の両端に接続されている。 上記電力供給回路 2 0 は、 電源 2 1から一定の直流電力を昇圧トランス 3 0に供給するように構成され ている。
上記スィツチングトランジスタ 2 2は、 電力供給回路 2 0から昇圧トランス 3 0の一次側卷線 3 1への電力の供給及び遮断を行うように構成されている。 つ まり、 上記スイッチングトランジスタ 2 2は、 昇圧トランス 3 0への電力供給を 断接する。 上記スィツチングトランジスタ 2 2は、 電源 2 1の負側と昇圧トラン ス 3 0の一次側巻線 3 1 との間に接続され、 コレクタが昇圧トランス 3 0の一次 側卷線 3 1に接続され、 ェミツ夕が接地されている。
上記信号制御回路 4 0は、 周波数発信回路 4 1 と波形成形回路 4 2とを備え ている。 該周波数発信回路 4 1は、 予め設定された所定周波数の制御信号を出力 するように構成されている。 上記波形成形回路 4 2は、 周波数発信回路 4 1の制 御信号を所定波形に成形して制御信号を出力するように構成されている。そして、 該波形成形回路 4 2は、 スイッチングトランジスタ 2 2のベースに接続され、 該 スイッチングトランジスタ 2 2を所定夕ィ ミングでオン及びオフさせるように構 成されている。
上記昇圧トランス 3 0は、 低圧部の一次側卷線 3 1 と高圧部の二次側巻線 3 2とを備えている。 そして、 該昇圧トランス 3 0は、 一次側卷線 3 1 と二次側巻 線 3 2との巻線比で定まる昇圧比に基づいて二次側卷線 3 2に所定の高電圧を発 生させるように構成されている。
上記昇圧トランス 3 0は、 図 3に示すように、 スイッチングトランジスタ 2 2のオン状態において、 一次側卷線 3 1が励磁され、 該一次側巻線 3 1に所定の 電気エネルギー Aを蓄える。 一方、 上記スィ ツチングトランジスタ 2 2がオフす ると、 蓄えられた電気エネルギーを放出する。 そして、 図 4に示すように、 昇圧 トランス 3 0の二次側卷線 3 2には、 電界変動を介して電子の揺れ動きが誘起さ れ、 瞬発電圧と生振幅の残留減衰振動波の交番電圧 Bが誘起される。
つまり、 シングルパルスである瞬発的な高電圧の発生によって、 正弦減衰波 の交番電圧 Bが誘起される。
上記電圧印加手段 1 2は、 一対の電極プローブ 5 0 , 5 0を備え、 該両電極 プローブ 5 0 , 5 0が配線 6 0， 6 0によって昇圧トランス 3 0の二次側巻線 3 2の各端に接続されて構成されている。 上記各配線 6 0には、 過電流制限を行う 限流抵抗 6 1 とコンデンサ 6 2が直列に接続されている。
上記電極プローブ 5 0は、 筒状の電極筒 5 1と、 該電極筒 5 1の内部に収納 され、 上記配線 6 0が接続された電極である先端電極 5 2とを備えている。 上記 電極筒 5 1の内部には、シリコンなどの絶縁材料の充填材 5 3が充填されている。 更に、 上記電極プローブ 5 0は、 高絶縁被覆物 6 3を備えている。 つまり、 上記 電極筒 5 1は、 高絶縁性を有する高絶縁被覆物 6 3で被覆されている。 該電極プ ロープ 5 0は、 高絶縁被覆物 6 3で被覆されているので、 誘電率に従って構成さ れる等価コンデンサとして機能する。 上記一対の電極プローブ 5 0， 5 0は、 生体の所定部位に設置され、 つまり、 所定の細胞 3と非接触状態で配置される。上記一対の電極プローブ 5 0 , 5 0は、 所定の細胞 3の付近に高圧の瞬発電圧を印加するように構成されている。そして、 上記電圧印加手段 1 2は、 生体を含めた外部共振回路を構成し、 一対の電極プロ —ブ 5 0， 5 0が生体組織に接触通電した際、 生体を含めた外部共振回路に対し て微分器として働き、 外部共振回路に大きなトリガ一電圧を供給する。 一遺伝子 2の導入方法一
次に、 上述した分子導入装置による遺伝子 2の導入方法について説明する。 先ず、 導入する遺伝子 2を予め注射等の手段により生体内に注入する。 その 後、 上記遺伝子 2を導入する細胞 3を目標に一対の電極プローブ 5 0， 5 0を生 体に対して固定する。 続いて、 昇圧トランス 3 0の一次側卷線 3 1に電源 2 1か ら直流電力を供給する一方、 周波数発信回路 4 1から所定の制御信号を出力させ る。 この制御信号は、 波形成形回路 4 2によって波形が成形され、 スイッチング トランジスタ 2 2のベースに所定の制御信号を出力する。
上記スィヅチングトランジスタ 2 2が制御信号によってオン状態になると、 昇圧トランス 3 0の一次側卷線 3 1に所定の電気エネルギーが蓄えられる （図 3 参照）。 その後、 上記スイ ッチングトランジスタ 2 2が制御信号によってオフす ると、 一次側卷線 3 1に蓄えられた電気エネルギーを放出する。 その際、 図 4に 示すように、 昇圧トランス 3 0の二次側卷線 3 2には、 急峻な高電圧と共に、 減 衰振動波を伴う励起電圧 Bが誘起される。
この急峻な高電圧は、 一対の電極プローブ 5 0， 5 0の間に作用し、 電圧印 加手段 1 2は、 生体を含めた外部共振回路を形成する。 この生体を含めた外部共 振回路は、 瞬発電圧をトリガー電圧として励起され、 共振を起こす。 そして、 細 胞 3の共振時において、 図 5に示すように、 トリガ一電圧に引き続く電子と荷電 分子の共振動態の総和である振幅変調波形の電圧変動 Cが観察される。
この出力電圧によって生体に刺激を与えることにより、 電圧の印加点を中心 とした生体回路は、 電気的自由共振回路を形成し、 正弦波の減衰振動が誘起され る。 周辺の細胞 3及び遺伝子 2も自由共振回路内に組み込まれ、 固有共振特性に 同期して振動する。
この結果、 図 2に示すように、 細胞膜 3 aの近傍にある遺伝子 2は、 自らが 帯電している電界と同一電界が与えられたときには逆電界側に移動し、 また、 逆 電界が与えられたときには中和できる電界側に移動する。 そして、 固有共振特性 に基づく連続運動と細胞膜 3 aの可逆的な極性反転の反復の結果、 遺伝子 2は加 速度的な振る舞いを起こす。 この結果、 上記遺伝子 2は、 細胞膜 3 aを通過し、 細胞 3内の分子との衝突と拡散により、 細胞核 4の核内遺伝子 5の構成の一部と なり所望の効果を示す。
つまり、 一般に、 分子導入装置 1、 特に、 電気的導入法の遺伝子導入装置に おいては、 対象の体内組織や細胞 3を傷害しないことが求められる。 遺伝子導入 装置は、 細胞 3や体内組織の破壊を招けば、 装置自体の適格性が損なわれる。 細 胞 3や体内組織の破壊を招く原因は、 対象とする細胞 3に対する供給電力量が過 剰であることが多い。 したがって、 遺伝子導入装置は、 細胞 3等の破壊の前に速 やかに飽和蓄積電力を中和することによって、 細胞 3等の破壊を回避することが 肝要である。
この回避方法としては、 上述したように、 先ず、 体内の所定部位には、 予め 注射等により所望の遺伝子 2を導入しておく。 そして、 ハイインピーダンスの高 圧電源である昇圧トランス 3 0より、 昇圧された電圧を上記所定部位に間欠的に 繰り返し印加する （図 4参照）。 この電圧の印加によって、 印加点を中心とした 生体回路は、 電気的自由共振回路を形成し、 分子減衰振動が誘起される。
周辺の細胞 3及び導入された遺伝子 2も自由共振回路内に組み込まれ、 遺伝 子 2の固有の共振特性に同期して振動する。 すなわち、 細胞膜 3 aの近傍に存在 する遺伝子 2は、 自らが帯電している電荷と同一の瞬発電界が与えられたときに は、 逆電界方向に、 また、 次の瞬時に逆電界が与えられたときには、 順電界側に 向けてファラデ一の法則に基づく力学的モ一メントを受ける。
この瞬時に極大を形成する分子振動は、 遺伝子 2の固有振動特性に基づいて 収斂することになる。 しかし、 遺伝子 2が完全静止する前に、 次の瞬時の電界刺 激が印加されるときには、 新たな極大の分子振動を開始する。 細胞膜 3 aを構成 する分子群も同様の期序による振動を励起される。 これにくわえて、 細胞膜 3 a においては、 電位に依存する電流チャンネルが開閉するため、 膜電位が変換され ることにもなる。 固有共振特性に従つた遺伝子 2の連続振動と細胞膜 3 aの脱分 極の反復の結果、 遺伝子 2は、 加速度的運動を伴なつた振る舞いを生起し、 細胞 膜 3 aを通過する。
この結果、 従来の直流のみを印加する方法や R F法に比べて遺伝子 2の細胞 3内への導入確率は飛躍的に向上すると共に、 対象部位と周辺の細胞 3の破壊を 確実に防止することができる。
また、 磁場を形成することにより電流を偏移させ、 電子スピンを生起させた り、 遺伝子 2等の分子の共振を制御するようにしてもよい。
また、 一層、 強力な磁場を形成した場合、 D N Aの二重螺旋構造を緩めて遺 伝子 2等の分子を細胞 3内に導入させることができる。 また、 遺伝子 2等の分子 をゲノム内に組み込むことも可能となる。
また、 単に自由共振に限られず、 フーリエ波形合成などの多様な振動を付与 するようにしてもよい。 この場合、 様々な体内組織や細胞 3の共振を生じさせる ことができる。
また、 共振条件やや電極 5 2又は電極プローブ 5 0の形状及びサイズを変更 することにより、 適切な共振条件を観察しつつ分子の導入を進めるようにしても よい。
また、 上記信号制御回路 4 0が周波数可変の制御信号を出力するので、 導入 する遺伝子 2に合致した電圧印加の周期に調整することができる。
一方、 上記高電圧の印加の周波数は、 1 0 Hz 〜 1 0 0 0 Hz が好ましく、 交番電圧を印加する継続時間は、 1 0秒〜 1 0分が好ましい。 そして、 この 1 0 秒〜 1 0分の印加を繰り返し行う。
また、 上記一対の電極プローブ 5 0 , 5 0の間の電圧は、 ± 1万ボルト〜土 1 0 0万ボルトに設定され、 電圧印加手段 1 2のインビ一ダンスは、 n X 1 0 1 G オーム以上であり、 一対の電極プローブ 5 0 , 5 0の間に流れる電流、 つまり、 細胞 3等に流れる電流は、 1マイクロアンペア以下である。 したがって、 細胞 3 の周辺は、電流が殆ど流れない微電流の環境で、且つ高電圧の環境が形成される。
尚、 上記スイ ッチングトランジスタ 2 2がオフした後、 次にオフするまでの 1サイクルの時間 Tに対するオフ時間 tの比であるデューティ比 （ t/T) は、 0. 03〜 0. 4が好ましい。
—実施例 1一
孵化した後 2日目の鶏とビフィズス菌を用いて GF P遺伝子の導入発現を試 みた。 一対の電極プローブ 5 0の間には、 ± 1 5万ボルトの高電圧を繰り返して 印加することとした。
GFP遺伝子を鶏の大腿筋に注射した後、 30秒〜 2分の間、 上記高電圧を 印加した。 また、 ビフィズス菌の場合は、 プラスチック皿内で 3◦秒〜 60秒の 間、 上記高電圧を印加した。 このとき、 鶏の大腿筋には、 単収縮現象 （twitch 現 象） が観察され、 筋細胞の脱分極が明らかであった。
導入処置後の鶏及びビフィズス菌の増殖能力に異常は認められなかった。 ま た、 GFP遺伝子の導入後の 5日目において、 鶏では、 正常な大腿筋の発育と均 一且つ高レベルの GF P発現が認められた。
また、 GFP遺伝子の導入後、 3日目において、 本分子導入装置 1を適用し た使用群 （GC S) と本分子導入装置 1を適用しない未使用群 （C T L) とを比 較した。 GC Sでは、 緑色蛍光を発生するヨーグルト上清がみられたのに対し、 CTLでは、 上清の蛍光が認められなかった。 更に、 吸光スペク トル解析によつ て、 G C S群には、 図 1 9に示すように、 特異的な 340 nm〜 400 nmに分 布するエネルギー吸収域を確認した。
この図 1 9及び図 2 0は、 G C Sと CT Lのビフィズス菌を市販の牛乳中で 37°Cにおいて、 72時間振とう培養後、 3 00 0 g にて 2 0分間、 遠心分離 して両者の培養上清を得た結果を示している。 石英キュぺッ ト内に上清を注入し て分光光度計にてスぺク トロスコピーを行ったところ、 GC S群にのみ、 図 1 9 に示すように、 340 nm〜 400 nmの吸光が明らかであった。
一方、 図 20に示すように、 C T L群には、 G C S群の如く特異的なエネル ギー吸収域は確認できなかった。
—実施例 2— 細胞を遠心チューブ内で沈殿させ、 少量の高濃度 G F Pプラスミ ド液 （ 2 0 μ- g ) を添加して懸濁させ、 上述した分子導入装置 1によって高電界を作用させ た。 電圧印加手段 1 2における高電圧 （± 1 5万ボルト） の印加の周波数は、 8 0 Hz〜 8 0 0 Hzとし、 2分の間電圧を印加させた。
この場合、 G F Pの発現が確認された。 この G F Pの発現は、 Hela細胞と PC12細胞を用い、 2回の実験を行い、 それそれ再現性が確認された。 また、 こ の場合、 上記高電圧印加の周波数は、 1 6 0 Hzが最も高効率であった。 一実施例 3—
1 0 0 // g ( 1 g / 1 ) の/? - Gal発現プラスミ ドをマウス大腿筋に数力 所に渡り筋注した。 その後、 右足には、 下記の条件で瞬発の高電圧を印加し、 左 足には、 高電圧を印加しなかった。
条件① ± 1 5万 Vの瞬発高電圧を 1 6 0 Hzの周波数で 5分間印加し、 続 けて、 1 0 0 Vの瞬発高電圧を 8 0 Hzの周波数で 5分間印加した。
条件② ± 1 5万 Vの瞬発高電圧を 2 0 0 Hzの周波数で 5分間印加し、 続 けて、 1 0 0 Vの瞬発高電圧を 3 0 0 Hzの周波数で 5分間印加した。
4日後、 マウス大腿筋より組織切片を採取し、 X -Galによる染色を行った。 結果は、 Gal陽性細胞、 すなわち緑色染色細胞が検出され、 筋肉組織への 遺伝子の導入が確認された。 遺伝子の導入効率は、 条件②が高効率であった。
一実施例 4一
孵化後 1日の鶏の大腿筋に、 抗サイクリン B1 マウスモノクローナル抗体を 注入し、 蛋白分子の細胞内への導入を試みた。 一対の電極プローブ 5 0， 5 0の 間には、試験体の固定具の接地点電位を中心として ± 2 5万 Vの高電圧を 6 0 Hz にて 1分間印加して共振回路を励起した。
このとき、 電極プローブ 5 0では、 生体組織の空間分布様式により、 空間窒 素プラズマの生成、 空間唸り音や電界観察用オシロスコ一プ上の減衰波の形状と 周期に多様な変動がみられた。 この事実から、 本発明によれば、 装置外部におい て、 電界内に分布する電子やイオン化元素、 また、 組織や種々の分子自体の振動 が瞬発電圧以後の電圧波形を構成することが明らかであった。 すなわち、 図 4及 び図 5に示す減衰波は、 装置内外を包含して形成される自由共振回路において、 電荷を有する分子群の減衰振動を観察した。
遺伝子を導入した後、 2 6時間後に、 大腿筋をホルマリン固定して、 バラフ イ ン切片を作成した。 その後、 抗マウス IgG 二次抗体とス トレプトアビジン一 ビォチン結合を介して、 ペルォキシダーゼ発色反応により抗サイクリン B1 抗体 の核内への導入分布を確認した。 これにより、 抗体蛋白が共振励起により細胞内 へ移行した後、 標的分子であるサイクリン B1 の局在部位である細胞核へ集積し たことが証明された。
更に、 孵化後 2日の鶏大腿筋には、 FITC でラベルされた IgG を注入し、 電 極プローブ 5 0， 5 0の間に、 試験体の固定具の接地点電位を中心として ± 2 5 万 Vの高電圧を 1 5 0 Hzにて 1分間印加して共振回路を励起した。 5分後に、 大腿筋を急速冷凍し、 凍結切片を作成したところ、 図 1 8に示すように、 蛍光顕 微鏡下にて骨格筋細胞内に広範な FH 蛍光の分布を認めた。
この図 1 8は、 RTC ラベルされた抗体蛋白を導入された骨格筋を示してい る。 ノマルスキー法による細胞輪郭と FITC 蛍光の重ね合わせ画像によれば、 背 景である細胞外には蛍光を認めず、 殆ど全ての筋肉細胞内細胞質に緑色蛍光が明 暸である。 一実施形態 2—
図 6は、 電極プローブ 5 0の他の実施形態を示している。
この図 6の電極プローブ 5 0は、 可変容量型であり、 筒状の電極筒 5 1の内 部内に先端電極 5 2とリアクタンス部 5 4とコンデンサ部 5 5 とを備えて構成さ れている。
上記先端電極 5 2は、 電極筒 5 1の先端部に収納固定されている。 上記リア クタンス部 5 4の一端は先端電極 5 2に接続されている。 上記コンデンサ部 5 5 は、 実施形態 1のコンデンサ 6 2に相当し、 固定電極 5 5 aと可動電極 5 5 bと より構成されている。 そして、 上記固定電極 5 5 aはリアクタンス部 5 4に接続 されている。 一方、 上記可動電極 5 5 bは、 ネジ部 5 6を介して配線 6 0が接続 されている。 該ネジ部 5 6は、 電極筒 5 1の基端部にねじ嵌合されている。
したがって、 上記電極筒 5 1を配線 6 0に対して回転させると、 固定電極 5 5 aと可動電極 5 5 bとギャップが変化し、コンデンサ部 5 5の容量が変化する。 この結果、 装置内部の共振特性が変化する。 尚、 上記電極筒 5 1は高絶縁被覆物 6 3で被覆されている。
この結果、 導入する遺伝子 2等の分子振動に有効な過渡的電圧と生振幅の残 留減衰振動波の高電圧 Bを生成することができる。 一実施形態 3—
図 7は、 更に電極プロ一ブ 5 0の他の実施形態を示している。
この図 7の電極プローブ 5 0は、 可変リアクタンス型であり、 筒状の電極筒
5 1の内部内に先端電極 5 2とコンデンサ部 5 5とリアクタンス部 5 4とを備え て構成されている。
上記先端電極 5 2は、 電極筒 5 1の先端部に収納固定されている。 上記コン デンサ部 5 5は、 2つの固定電極 5 5 c , 5 5 cより構成されている。 1つの固 定電極 5 5 cは、 先端電極 5 2に接続され、 他の固定電極 5 5 cは、 リアク夕ン ス部 5 4が接続されている。
上記リアクタンス部 5 4は、 コイル 5 4 aと該コイルに接する集導片 5 4 b とより構成されている。 上記コイル 5 4 aは、 コンデンサ部 5 5の固定電極 5 5 cに接続されている。 上記集導片 5 4 bは、 ネジ部 5 6を介して配線 6 0が接続 されている。 該ネジ部 5 6は、 電極筒 5 1の基端部にねじ嵌合されている。
したがって、 上記電極筒 5 1を配線 6 0に対して回転させると、 コイル 5 4 aと集導片 5 4 bとの接触位置が変化し、 リアクタンス部 5 4のィンダク夕ンス が変化する。 この結果、 装置内部の共振特性が変化する。 尚、 上記電極筒 5 1は 高絶縁被覆物 6 3で被覆されている。
この結果、 導入する遺伝子 2等の分子振動に有効な高電圧 Bを調整すること ができる。 一実施形態 4—
図 8は、 電力供給回路 2 0の他の実施形態を示している。
この図 8の電力供給回路 2 0は、 電力調整回路 7 0を備えたものである。 つ まり、 上記電力調整回路 7 0は、 電源 2 1より供給される電力を所定の制御電力 に調整するように構成されている。 そして、 該電力調整回路 7 0は、 制御電力を 昇圧トランス 3 0の一次側卷線 3 1 と、 信号制御回路 4 0の周波数発信回路 4 1 に出力するように該昇圧トランス 3 0と信号制御回路 4 0に接続されている。
したがって、 本実施形態では、 上記電力調整回路 7 0が導入する遺伝子 2又 は細胞 3等に対応した制御電力を生成する。 つまり、 上記電力調整回路 7 0が電 源 2 1の電流又は電圧を調整することになる。
したがって、 上記電力調整回路 7 0を設けているので、 導入する遺伝子 2な どに合致した瞬発高電圧 Bを生成することができる。 この結果、 遺伝子 2の膜通 過を確実に行わせることができる。 特に、 上記電力調整回路 7 0が電流及び電圧 を制御するので、 導入する遺伝子 2などの分子振動に有効な高電圧 Bをより精度 よく生成することができる。 一実施形態 5 - 図 9及び図 1 0は、 分子導入装置 1の他の実施形態を示している。
この分子導入装置 1は、 複数対の電極プローブ 5 0 a， 5 0 b , 5 0 c , - を備えている。 具体的に、 上記分子導入装置 1は、 3対の電極プローブ 5 0 a， 5 0 b , 5 0 cを備えている。 そして、 電圧発生手段 1 1は、 3つの昇圧トラン ス 3 0 a , 3 0 b , 3 0 cを備えている。
上記電圧発生手段 1 1の電力供給回路 2 0は、 第 1電源 2 1 aと第 2電源 2 1 bとを備え、 該第 2電源 2 1 bの正側が各昇圧トランス 3 0 a， 3 0 b， 3 0 cの一端に接続されている。
また、 上記電圧発生手段 1 1は、 3つのスィツチ 2 4を備え、 該各スィ ツチ 2 4は、 2つのスイッチングトランジスタ 2 2 a , 2 2 bより構成されている。 該各スィッチ 2 4の 2つのスイッチングトランジスタ 2 2 a , 2 2 bは、 コレク 夕とエミッ夕とが接続されると共に、 ベースに信号制御回路 4 0が接続されてい る。
上記各スィ ツチ 24の第 1スィツチングトランジスタ 22 aのコレクタは、 第 1電源 2 1 aの正側に接続され、 第 2スイッチングトラジス夕 2 2 bのェミツ 夕は、 第 2電源 2 1 bの負側に接続されている。 そして、 上記各スィツチ 24の 2つのスィ ツチングトランジスタ 2 2 a , 2 2 bにおけるコレクタとエミッ夕と の間には、 各昇圧トランス 30 a， 30 b, 30 cの一端が接続されている。
上記信号制御回路 40は、 単相交流様、 三相交流様、 多相交流様、 複数周波 又は合成波形を各スイッチングトランジスタ 2 2 a， 2 2 b, …に出力可能に構 成されている。
したがって、 上記各スィツチ 24の第 1スィツチングトランジス夕 22 aが オンすると、 第 1電源 2 1 aによって各昇圧トランス 30 a， 30 b, 30 cの 一次側卷線 3 1に正の電流が流れ、 該第 1スイッチングトランジスタ 2 2 aがォ フすると、 各昇圧トランス 30 a， 30 b, 30 cの二次側巻線 32に正電圧バ 一ストが生じる。
また、 上記各スィツチ 24の第 2スイッチングトランジスタ 2 2 bがオンす ると、 第 2電源 2 1 bによって各昇圧トランス 30 a, 30 b, 30 cの一次側 巻線 3 1に負の電流が流れ、 該第 2スイ ッチングトランジスタ 22 bがオフする と、 各昇圧トランス 30 a, 30 b, 30 cの二次側卷線 32に負電圧バース ト が生じる。
一方、 上記 6つの電極プロ一ブ 50 a， 5 0 b， 50 c， …は、 図 1 0に示 すように、 遺伝子を導入する細胞 3に対して放射状に配置されている。 そして、 対となる電極プローブ 50 a, 50 b, 50 cの間に所定の電位差が生じる。
したがって、 上記各昇圧トランス 30 a, 30 b, 30 cの昇圧によって 3 対の電極プローブ 50 a , 5 0 b, 5 0 cの間の電圧を異なるようにしてもよい。 また、 上記各スイッチングトランジスタ 22 a， 22 b, …のスイッチング動作 によって遺伝子 2などに異なる方向から電圧が印加されることになる。
この結果、 3つの瞬発高電圧べク トルが合成された瞬発高電圧を形成して、 遺伝子などに有効な共振を励起させることができる。 その他の構成、 作用及び効 果は、 実施形態 1と同様である。 尚、 本実施形態においては、 3対の電極プロ一ブ 5 0 a , 5 0 b , 5 0 cと 3つのスィッチ 2 4を備えたが、 実施形態 1に対応して、 1対の電極プローブ 5 0 aと 1つのスィッチ 2 4を設けるようにしてもよい。 これによつて正電圧バー スト又は負電圧バーストを生じさせることができる。 一実施形態 6 - 図 1 1は、 分子導入装置 1を用いて遺伝子を細胞に導入するための補助具で ある容器 7 0を示している。
上記容器 7 0は、 細胞溶液を収納するものであって、 所定の誘電特性を有す る材料で形成され、 碗状の本体 7 1と、 該本体 7 1の上部開口を閉鎖する蓋体 7 2とより構成されている。 そして、 該蓋体 7 2には、 抜気用の開口である空気孔 7 3が形成されている。
上記容器 7 0の材料としては、 ガラス、 セラミックス、 高分子材料 （ポリエ チレン、 ポリカボネート、 テフロン等） が挙げられる。
上記本体 7 1の内部には、 凹部 7 4が形成され、 該凹部 7 4に強い電界が生 じるように構成されている。 更に、 上記本体 7 1は、 凹部 7 4に強い電界が生じ るように絶縁部と導電部とが形成されている。
つまり、上記本体 7 1に細胞溶液と共に、該細胞に導入する遺伝子を注入し、 蓋体 7 2によって本体 7 1を閉鎖する。 その際、 本体 7 1の内部空気は空気孔 7 3から排出される。 そして、 上記本体 7 1の細胞溶液中の細胞は、 凹部 7 4に集 中することになる。
その後、 例えば、 実施形態 1の電極プローブ 5 0 , 5 0によって容器 7 0の 内部に高電圧を印加する。 その際、 本体 7 1において、 細胞密度の高い凹部 7 4 に電界が集中して該電界が強くなるので、 より多くの細胞周辺における遺伝子等 の共振が大きくなり、 スムーズに遺伝子 2が細胞 3に導入される。
尚、 上記容器 7 0は、 本体 7 1 と蓋体 7 2とが一体物であってもよい。 また、 上記凹部 7 4は、 本体 7 1又は蓋体 7 2の内面又は外面の少なくとも一部に形成 されておいればよい。 一変形例一
上記容器 7 0の本体 7 1の凹部 7 4は、 図 1 2から図 1 4に示すように、 各 種の形状に形成してもよい。
つまり、 図 1 2に示すように、 上記凹部 7 4は、 中央部から外側に向かって 渦巻状に旋回する螺旋状に形成してもよい。 また、 上記凹部 7 4は、 複数の同心 円であってもよい。
また、 図 1 3に示すように、 上記凹部 7 4は、 格子状に形成してもよい。 また、 図 1 4に示すように、 上記凹部 7 4は、 波線状に形成し、 凹部 7 4の 全長さをより延長したり、 複数の波線凹部としてもよい。 一実施形態 7—
図 1 5は、 分子導入装置 1を用いて遺伝子を細胞に導入するための補助具 8 0を示している。
上記補助具 8 0は、 体内の所定部位に強い電界を生じさせるようにしたもの である。 該補助具 8 0は、 所定の誘電特性を有する軟性の接着プレートに形成さ れている。 そして、 上記補助具 8 0は、 例えば、 線状の導電体が網状に形成され、 絶縁面と人体 9 0の表面に接着されるように構成されている。
したがって、 遺伝子 2を体内に注入した後、 上記補助具 8 0を人体 9 0の表 面に接着する。 その後、 例えば、 実施形態 1の電極プローブ 5 0， 5 0によって 体内の所定部位に高電圧を印加する。 その際、 補助具 8 0によって所定部分に電 界が集中して該電界が強くなるので、 遺伝子 2などの共振振幅が大きくなり、 遺 伝子 2が細胞 3にスムーズに導入する。
—実施形態 8 - 図 1 6は、 分子導入装置 1を用いて遺伝子を細胞に導入するための補助具 8 0の他の実施形態を示している。
上記補助具 8 0は、 図 1 7に示すように、 線状の導電体 8 1を網状に形成し て鞘状に形成されている。 該補助具 8 0は、 例えば、 血管 9 1の内部に絶縁鞘を 介して導入配置される。 上記補助具 8 0の材料としては、 ガラス、 セラミックス、 高分子材料 （ポリ エチレン、 ポリカポネ一ト、 テフロン等） が挙げられる。
したがって、 上記補助具 8 0を血管 9 1内に挿入すると共に、 遺伝子 2を体 内に注入する。 または、 補助具 8 0とゲルなどの基質に展開した遺伝子 2を一体 化してもよい。 その後、 例えば、 実施形態 1の電極プローブ 5 0， 5 0によって 体内の所定部位に高電圧を印加する。 その際、 補助具 8 0の導電体 8 1によって 所定部分に電界が集中して該電界が強くなるので、 遺伝子 2などの共振振幅が大 きくなり、 遺伝子 2が細胞 3にスムーズに導入する。
—その他の実施形態—
上記各実施形態において、 昇圧手段は、 変圧器である昇圧トランス 3 0を用 いたが、圧電効果を利用した圧電素子を用いてもよい。その際、上記圧電素子は、 歪みを加えて所定の瞬発高電圧を発生させるように構成する。
また、 本各実施形態は、 電圧印加手段 1 2が瞬発の高電圧を印加するように したが、 交番電圧を印加するようにしてもよく、 また、 瞬発の高電圧と交番電圧 とを重畳した電圧を印加するようにしてもよい。
また、 上記電圧印加手段 1 2は、 昇圧手段と直列又は並列にスパークギヤッ プ又は放電管を備えていてもよい。
また、 上記電圧印加手段 1 2の高絶縁部は、 電極 5 2に近接して配置される 高絶縁遮蔽物であってもよい。
また、 上記電極プローブ 5 0は、 金属、 セラミックス又は有機物質を含む電 導物質によって構成されていてもよい。
また、 分子の膜通過は、 投入する印加電圧、 共振定数又は電極位置の変動に より、 共振特性を変化させて調整するようにしてもよい。
また、 上記各実施形態において、 電極プローブ 5 0 , 5 0の間に形成される 電界を可視化するために、 ファン トム （模擬生体組織） を適用するようにしても よい。
また、 上記各実施形態において、 電極プローブ 5 0 , 5 0の間に形成される 電界の強度を測定するために、 放電センサを用いるようにしてもよい。 また、 補助具 8 0は、 実施形態に限定されず、 絶縁部と導電部とが形成され ておればよく、 要するに、 所定部位に強い電界が形成されるように構成されてお ればよい。 一方、 導入する分子は、 ポリヌクレオチド、 蛋白質、 ウィルス、 各種薬剤を 含む低分子化合物又は異種若しくは同種の細胞分子であってもよい。
上記ポリヌクレオチドとしては、 例えば、 D N A、 R N A、 ポリヌクレオチ ド誘導体などが挙げられる。
これらの具体例としては、 C D N A、 ゲノム D N A、 遺伝子発現べクタ一、 デコイ核酸などが挙げられる。
上記蛋白質としては、 例えば、 アナログ蛋白質、 生理的活性蛋白質、 生理的 活性物質のレセプ夕一、 抗原、 モノクローナル抗体、 ポリクローナル抗体、 抗体 様合成分子、 ケージド分子などが挙げられる。
上記各種薬剤を含む低分子化合物としては、 例えば、 杭がん剤、 抗生物質、 免疫抑制剤、 色素物質、 発光蛍光物質などが挙げられる。
また、 上記導入する分子の導入を促進する物質としては、 電子、 電子スピン プローブ分子、 膜電位プローブ分子、 光学プローブ分子、 麻酔薬、 クロルプロマ ジン類、ポリミキシン Bなどの抗生物質、 フィブロネクチンなどの細胞接着分子、 蛋白、 リボ蛋白、 ペプチド、 アミノ酸などが挙げられる。
また、 生体組織は、 動物又は植物の組織であってもよく、 細胞 3は、 動物、 植物若しくは微生物の細胞又は動物、 植物若しくは微生物からクローンした細胞 であってもよい。
上記動物としては、 例えば、 原虫、 昆虫、 無脊椎動物、 脊椎動物、 ヒト、 生 殖器を有する生体の雌雄同体生物などが挙げられる。
上記微生物としては、 例えば、 ウィルス、 細菌、 カビなどが挙げられる。 上記生物由来の細胞としては、 例えば、 受精卵、 精子、 卵子、 始原生殖細胞、 ブラストシス ト、 細胞種系統、 E S細胞を含む各種幹細胞及びプロジェ二ター細 胞、 植物の種子、 カルスなどが挙げられる。
上記クローン化された細胞としては、 例えば、 初代培養細胞、 経代培養細胞 などが挙げられる。
また、 分子は、 サポニン、 ジギトニン、 ジメチルスルフオキサイ ドなどの界 面活性剤、 ィオノフォア、 リピッ ド、 セラミ ド、 アルブミン、 グリセリン、 ゼラ チン若しくは血清の少なくとも一つ、 又は細胞内外の浸透圧若しくはイオンバラ ンスを制御する分子を含有した液で調製されていてもよい。
また、 分子は、 軟膏、 クリーム、 ゲル状の基材又は注射用水に展開し、 体表 面への塗布、 体表面への貼付又は体内への注入が行われるようにしてもよい。
また、 本発明は、 細胞融合に適用してもよいことは勿論である。 つまり、 通 常、 細胞融合は、 ポリエチレングリコールを用いて細胞間の融合を行う。 また、 細胞壁を有する細胞では、 プロ トプラスト化処理した後に行う。 しかし、 ポリエ チレングリコールには、細胞毒性があり融合効率の向上に支障をきたす。そこで、 本発明の分子導入装置を適用し、 細胞膜を振動させる。 この結果、 ポリエチレン グリコールを使用することなく細胞融合が行われる。
また、 本発明は、 品種改良及び遺伝子組換え植物に適用してもよいことは勿 論である。 遺伝子組換え植物の作成は、 以下の過程で行われる。
先ず、 培養植物細胞に対しアデノウィルスやパーティクルガンを用いて遺伝 子を導入する。 次に、 遺伝子が導入された細胞を選別し、 その細胞を組織培養し て個体の植物をへと分化をさせる。
しかし、 植物の遺伝子組換えは、 先に述べた培養細胞の確立と、 細胞から個 体への組織培養法の確立が必須であるために、 全ての植物に遺伝子組換えが可能 なわけではない。 タバコゃィネといった比較的遺伝子操作が容易に行える植物以 外は、 遺伝子組換えが現段階では困難である。
そこで、 本発明の分子導入装置を適用し、 ジーンシンフォナイザーを用いて 種子全体に遺伝子を導入する。この結果、組織培養の過程を省略することができ、 また、 植物種を選ばない新しい遺伝子組換え植物作成法が可能である。
通常植物への遺伝子導入は、 ァグロパクテリゥム ベクタ一、 パーティクル ガン又はエレク トロボレイシヨン法を用いる。 しかし、 動物細胞とは異なり、 細 胞壁を持つことから植物細胞内への遺伝子導入効率が低く、 この細胞壁を分解す るプロ トプラスト化又はカルスを誘導させることが不可欠とされてきた。 本発明 は、 細胞壁、 細胞膜ともに振動させるので、 プロ トプラス ト化やカルス誘導を行 なうことなく遺伝子の導入が可能になる。 また、 本発明は、 細胞に対する障害性 が低いことから、 遺伝子導入効率の高い植物細胞へ遺伝子導入方法になる。 産業上の利用可能性
以上のように、 本発明による分子導入装置及び分子導入方法は、 分子を細胞 に導入する場合に有用であり、 遺伝子治療、 再生治療、 標的組織又は標的細胞へ の薬物導入、 動植物の品種改良、 トランスジエニック、遺伝子組換え生物の作成、 細胞融合及び人為的物質合成などに適している。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 生体組織又は細胞を標的に、 電圧印加によって電気的フィールド、 磁気的フ ィ一ルド又は音波的フィールドを形成し、 細胞内への分子の膜通過を可能とする ことを特徴とする分子導入装置。
2 . 生体組織又は細胞を標的に、 瞬発の高電圧による電気的フィールド、 磁気的 フィールド又は音波的フィールドを形成し、 生体組織又は細胞を含んだ自由共振 回路を励起して、 細胞の構成分子と導入する分子との交響運動を生起させ、 上記 分子を細胞内へ導入させる
ことを特徴とする分子導入装置。
3 . 電圧を発生する電圧発生手段と、
該電圧発生手段が発生する電圧を受けて体内の所定部位に電界を発生させ、 生体組織又は細胞の外側に配置された分子を細胞内に導入するための高ィンビ一 ダンス化された電圧印加手段とを備えている
ことを特徴とする分子導入装置。
4 . 請求項 3において、
電圧印加手段は、 体内の所定部位を含む自由共振回路を構成する
ことを特徴とする分子導入装置。
5 . 請求項 3において、
電圧印加手段は、 電極が高絶縁部を介して電界を体内の生体組織又は細胞の 周辺に発生させるように構成されている
ことを特徴とする分子導入装置。
6 . 請求項 3において、
電圧発生手段は、 電力を供給する電力供給手段と、 該電力供給手段から電力 供給されて高電圧を電圧印加手段に供給する昇圧手段と、 上記電力供給手段から 昇圧手段への電力供給を断接して、 電圧印加手段に供給する電圧を昇圧手段に発 生させる開閉手段と、 該閧閉手段の断接を制御する開閉制御手段とを備えている ことを特徴とする分子導入装置。
7 . 請求項 6において、
電力供給手段は、 電源と、 該電源から電力を受けて制御電力を出力する電力 調整回路とを備えている
ことを特徴とする分子導入装置。
8 . 請求項 7において、
電力調整回路は、昇圧手段と開閉制御手段とに所定の電力を供給すると共に、 供給する電圧又は電流を固定又は可変に制御するように構成されている ことを特徴とする分子導入装置。
9 . 請求項 6において、
昇圧手段は、 開閉手段によって駆動する低圧部と、 電圧印加手段の一部を構 成する高圧部とを備え、 上記低圧部と高圧部との間に予め設定された昇圧比に基 づいて所定電圧に昇圧させるように構成されている
ことを特徴とする分子導入装置。
1 0 . 請求項 6において、
開閉制御手段は、 周波数可変の制御信号を出力して開閉手段の駆動を制御す るように構成されている
ことを特徴とする分子導入装置。
1 1 . 請求項 6において、
開閉手段は、 開閉制御手段の制御信号に基づき昇圧手段への供給電力を断接 するように構成されている とを特徴とする分子導入装置。
1 2 . 請求項 6において、
電圧印加手段は、 複数の電極と高絶縁部とを備え、 該電極が高絶縁部を介し て電界を体内の生体組織又は細胞の周辺に発生させるように構成されている ことを特徴とする分子導入装置。
1 3 . 請求項 6において、
昇圧手段は、 変圧器、 又は圧電効果に基づいて高電圧を発生する圧電素子で ある
ことを特徴とする分子導入装置。
1 4 . 請求項 3において、
電圧印加手段は、 分布容量による共振特性を能動的に可変する可変容量構造 又は可変リアクタンス構造に構成されている
ことを特徴とする分子導入装置。
1 5 . 請求項 3において、
電圧印加手段は、 昇圧手段と直列又は並列にスパークギヤップ又は放電管を 備えている
ことを特徴とする分子導入装置。
1 6 . 請求項 5又は 1 2において、
電圧印加手段の高絶縁部は、 電極に近接して配置される高絶縁遮蔽物又は電 極を被覆する高絶縁被覆物である
ことを特徴とする分子導入装置。
1 7 . 請求項 5又は 1 2において、
電極は、 金属、 セラミックス又は有機物質を含む電導物質によって構成され ている
ことを特徴とする分子導入装置。
1 8 . 請求項 1 2において、
開閉制御手段は、 単相交流様、 三相交流様、 多相交流様、 複数周波又は合成 波形を出力可能に構成される一方、
昇圧手段は、 正電圧側バース ト若しくは負電圧側バース ト又は該両バース ト を組み合わせ電圧を出力可能に構成されると共に、
上記昇圧手段は、 複数設けられ、 複数の電極の間に電位差を生じさせるよう に構成されている
ことを特徴とする分子導入装置。
1 9 . 生体組織または細胞を標的に、 電圧印加によって電気的フィールド、 磁気 的フィールド又は音波的フィールドを形成した後、 分子を細胞内へ膜通過させる ことを特徴とする分子導入方法。
2 0 . 生体組織又は細胞を標的に、 瞬発の高電圧による電気的フィール ド、 磁気 的フィールド又は音波的フィールドを形成し、 生体組織又は細胞を含んだ自由共 振回路を励起して、 細胞の構成分子と導入する分子との交響運動を生起させ、 上 記分子を細胞内へ導入する
ことを特徴とする分子導入方法。
2 1 . 生体組織又は細胞の周辺に細胞内に導入する分子を分布させた後、 該生体 組織又は細胞の周辺に高電圧を繰り返し印加し、 微電流且つ高電圧の環境下にお いて分子を細胞内に導入する
ことを特徴とする分子導入方法。
2 2 . 生体組織又は細胞の周辺に細胞内に導入する分子を分布させた後、 該生体 組織又は細胞の周辺に高電圧を繰り返し印加し、 微電流且つ高電圧の環境下にお いて生体組織又は細胞の所定部位を含む自由共振回路を形成し、 分子を細胞内に 導入する
ことを特徴とする分子導入方法。
2 3 . 生体組織又は細胞の周辺に細胞内に導入する分子を分布させた後、 電極か ら高絶縁部を介して上記生体組織又は細胞の周辺に高電圧を繰り返し印加し、 微 電流且つ高電圧の環境下において生体組織又は細胞の所定部位を含む自由共振回 路を形成し、 分子を細胞内に導入する
ことを特徴とする分子導入方法。
2 4 . 請求項 2 1、 2 2又は 2 3において、
微電流且つ高電圧の環境は、 電力を供給する電力供給手段と、 該電力供給手 段から電力供給されて高電圧を発生させる昇圧手段と、 上記電力供給手段から昇 圧手段への電力供給を断接して昇圧手段に高電圧を発生させる開閉手段と、 該開 閉手段の断接を制御する開閉制御手段と、 上記昇圧手段が発生する高電圧を受け て体内の所定部位に電界を発生させ、 生体組織又は細胞の外側に配置された分子 を細胞内に導入するための電圧印加手段とを備えた分子導入装置によって構成す る
ことを特徴とする分子導入方法。
2 5 . 請求項 1 9〜2 3の何れか 1項において、
分子は、 ポリヌクレオチド、 蛋白質、 ウィルス、 各種薬剤を含む低分子化合 物又は細胞分子である
ことを特徴とする分子導入方法。
2 6 . 請求項 1 9〜2 3の何れか 1項において、
生体組織は、 動物又は植物の組織であり、
細胞は、 動物、 植物若しくは微生物の細胞又は動物、 植物若しくは微生物か らクローンした細胞である とを特徴とする分子導入方法。
2 7 . 請求項 2 4において、
分子の膜通過は、 投入する印加電圧、 共振定数又は電極位置の変動により調 整する
ことを特徴とする分子導入方法。
2 8 . 請求項 1 9 ~ 2 3の何れか 1項において、
分子は、 サポニン、 ジギトニン、 ジメチルスルフオキサイ ドなどの界面活性 剤、 ィオノフォア、 リピッ ド、 セラミ ド、 アルブミン、 グリセリン、 ゼラチン若 しくは血清の少なくとも一つ、 又は細胞内外の浸透圧若しくはイオンバランスを 制御する分子を含有した液で調製されている
ことを特徴とする分子導入方法。
2 9 . 請求項 1 9〜2 3の何れか 1項において、
分子は、 軟膏、 クリーム、 ゲル状の基材又は注射用水溶液に展開し、 体表面 への塗布、 体表面への貼付又は体内への注入が行われる
ことを特徴とする分子導入方法。
3 0 . 請求項 1 9〜2 3の何れか 1項において、
分子は、 細胞培養液又はポリエチレングリコールに展開して細胞内へ膜透過 させる
ことを特徴とする分子導入方法。
3 1 . 所定の誘電特性を有する容器本体と、
該容器本体の少なくとも一部に形成されて電界を集中させる凹部とを備えて いる
ことを特徴とする分子導入装置用の補助具。
3 2 . 生体の所定部位に配置される補助具であって、
体内の所定部位に電界が集中するように電導部が形成されている ことを特徴とする分子導入装置用の補助具。
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